(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-13
(45)【発行日】2022-12-21
(54)【発明の名称】細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/074 20100101AFI20221214BHJP
C12N 5/095 20100101ALI20221214BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20221214BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20221214BHJP
【ＦＩ】
C12N5/074
C12N5/095
C12Q1/04
A01K67/027
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019504632
(86)(22)【出願日】2018-03-07
(86)【国際出願番号】 JP2018008735
(87)【国際公開番号】W WO2018164174
(87)【国際公開日】2018-09-13
【審査請求日】2021-02-17
(31)【優先権主張番号】P 2017042659
(32)【優先日】2017-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000125381
【氏名又は名称】学校法人藤田学園
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】佐谷 秀行
(72)【発明者】
【氏名】有馬 好美
(72)【発明者】
【氏名】千場 隆
(72)【発明者】
【氏名】春日 章良
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２０６７３５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Cancer Res., 2016, Vol.76, Issue 14 Suppl., Abstract No.4255
【文献】第７４回日本癌学会学術総会抄録集, 2015, P-1042
【文献】第３６回日本分子生物学会年会プログラム・要旨集, 2013, 3P-0865
【文献】Oncogene, 2014, Vol.33, pp.440-448
【文献】Oncogene, 2010, Vol.29, pp.5687-5699
【文献】Genes Dev., 2001, Vol.15, pp.3249-3262
【文献】Genes Dev., 2003, Vol.17, pp.3112-3126
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ０１Ｋ ６７／０２－６７／０２７；６７／０３３
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損し、ＥｐＣＡＭ及びＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ－１（Ｓｃａ－１）を発現しており、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の５０％以上がＳｃａ－１陽性である、成体由来上皮系組織幹細胞集団。
【請求項2】
Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項3】
Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃ（ＳＰＣ）又はＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ ｆａｍｉｌｙ １Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＣＣ１０）を発現している、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項4】
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ（Ｌｙ６Ｄ）を発現している、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項5】
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９（ＣＫ１９）を発現している、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項6】
前記癌抑制遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項7】
少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現している、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項8】
前記癌遺伝子が、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子又はＲＯＳ１融合遺伝子である、請求項７に記載の細胞集団。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞集団を３次元培養する工程を含む、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物の製造方法。
【請求項10】
請求項９に記載の製造方法で製造された、細胞培養物。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞集団又は請求項１０に記載の細胞培養物由来の細胞を含む、オルガノイド。
【請求項12】
被験物質の存在下で、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞集団を培養する工程と、前記細胞集団の形質を評価する工程と、を備える、
細胞形質の変換剤のスクリーニング方法。
【請求項13】
被験物質の存在下で、請求項７若しくは８に記載の細胞集団、
請求項７若しくは８に記載の細胞集団を３次元培養する工程を含む製造方法により製造された、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物由来の細胞又は
請求項７若しくは８に記載の細胞集団若しくは請求項７若しくは８に記載の細胞集団を３次元培養する工程を含む製造方法により製造された、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物由来の細胞を含む、オルガノイド
を培養する工程と、
前記細胞又は前記オルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、
抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項14】
請求項７若しくは８に記載の細胞集団、請求項７若しくは８に記載の細胞集団を３次元培養する工程を含む製造方法により製造された、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物由来の細胞又は
請求項７若しくは８に記載の細胞集団若しくは請求項７若しくは８に記載の細胞集団を３次元培養する工程を含む製造方法により製造された、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物由来の細胞を含む、オルガノイド
を非ヒト動物に移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法。
【請求項15】
前記非ヒト動物が、免疫系が正常な非ヒト動物である、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項16】
請求項１４又は１５に記載の製造方法で製造された、担癌モデル非ヒト動物。
【請求項17】
請求項１６に記載の担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、
被験物質の評価方法。
【請求項18】
前記被験物質が、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせである、請求項１７に記載の評価方法。
【請求項19】
請求項１６に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位に形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
【請求項20】
請求項１６に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位以外に新たに形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞及びその使用に関する。より具体的には、成体由来上皮系組織幹細胞、細胞培養物の製造方法、細胞培養物、オルガノイド、細胞形質の変換剤のスクリーニング方法、抗癌剤のスクリーニング方法、担癌モデル非ヒト動物の製造方法、担癌モデル非ヒト動物、被験物質の評価方法、癌幹細胞の製造方法、癌幹細胞及び癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法に関する。本願は、２０１７年３月７日に、日本に出願された特願２０１７－０４２６５９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
例えば、肺癌は、代表的な難治性癌の１つである。近年、ヒトサンプルを用いた肺癌の大規模な遺伝子解析によって、肺癌に関連する様々な遺伝子変異が見出されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【0003】
肺癌の治療に分子標的薬を使用する場合、特定の遺伝子変異を検出し、適切な治療薬を選択することが有効であることが明らかとなっている。しかしながら、近年見出された、様々な遺伝子変異と癌の治療薬の効果との関連は十分に解明されているとはいえない。特定の遺伝子変異を有する癌に対する治療薬の効果を明らかにするためには、その遺伝子変異を有する担癌動物モデルを作製し、治療薬の効果を評価する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Collisson E. A., et al., Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma, Nature 511 (7511), 543-550, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
現在、担癌動物モデルとしては、異種移植マウスモデル、遺伝子改変マウスモデル、同種移植マウスモデル等が知られている。
【0006】
異種移植マウスモデルとは、免疫不全マウスにヒト由来癌細胞を移植したモデルである。異種移植マウスモデルでは、癌細胞と癌周辺細胞の動物種が異なっているため、それらの相互作用を完全に再現することができない。また、宿主が免疫不全マウスであるため、免疫系が関わる現象を評価することが困難である。
【0007】
遺伝子改変マウスモデルは、作製に長期間を必要とする。また、それぞれ異なる複数の変異を有する複数の細胞からなる腫瘍モデルの作製は困難である。このため、近年見出された多様な遺伝子変異に対応する多様な担癌動物モデルを作製することが困難である。
【0008】
一方、同種移植マウスモデルは、マウス由来癌細胞を免疫系が正常な同系マウスに移植したモデルである。同種移植マウスモデルは、簡便に作製することができ、腫瘍と免疫細胞との相互作用を研究することも可能である。しかしながら、マウス由来の癌細胞株が極めて少なく、また、生体に存在する細胞であって、近年見出された多様な遺伝子変異に対応する多様なモデル細胞の作製方法はなく、多様な遺伝子変異を有する細胞モデル、モデル非ヒト動物を作製することが困難であった。
【0009】
このような背景のもと、本発明は、多様な遺伝子変異を持つ癌細胞を有し免疫系が正常な担癌動物モデルを、容易に作製する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は以下の態様を含む。
［１］少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、成体由来上皮系組織幹細胞。
［２］Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－である、［１］に記載の細胞。
［３］ＥｐＣＡＭ及びＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ－１（Ｓｃａ－１）を発現しているか、又は、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃ（ＳＰＣ）及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ ｆａｍｉｌｙ １Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＣＣ１０）を発現している、［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ（Ｌｙ６Ｄ）を発現している、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞。
［５］Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９（ＣＫ１９）を発現している、［１］又は［２］に記載の細胞。
［６］前記癌抑制遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群より選択される、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞。
［７］少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現している、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞。
［８］前記癌遺伝子が、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子又はＲＯＳ１融合遺伝子である、［７］に記載の細胞。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の細胞を３次元培養する工程を含む、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物の製造方法。
［１０］［９］に記載の製造方法で製造された、細胞培養物。
［１１］［１］～［８］のいずれかに記載の細胞又は［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞を含む、オルガノイド。
［１２］被験物質の存在下で、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞を培養する工程と、前記細胞の形質を評価する工程と、を備える、細胞形質の変換剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下で、［６］～［８］のいずれかに記載の細胞、［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞又は［１１］に記載のオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又は前記オルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
［１４］［７］若しくは［８］に記載の細胞、［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞又は［１１］に記載のオルガノイドを非ヒト動物に移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法。
［１５］前記非ヒト動物が、免疫系が正常な非ヒト動物である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］［１４］又は［１５］に記載の製造方法で製造された、担癌モデル非ヒト動物。
［１７］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法。
［１８］前記被験物質が、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせである、［１７］に記載の評価方法。
［１９］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位に形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
［２０］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位に形成された腫瘍より樹立した癌幹細胞。
［２１］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位以外に新たに形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
［２２］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位以外に新たに形成された腫瘍より樹立した癌幹細胞。
［２３］被験物質の存在下で、［２０］又は［２２］に記載の癌幹細胞を培養する工程と、前記癌幹細胞の増殖を測定する工程と、を備える、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法。
［１］少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、成体由来上皮系組織幹細胞。
［２］Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－である、［１］に記載の細胞。
［３］ＥｐＣＡＭ及びＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ－１（Ｓｃａ－１）を発現しているか、又は、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃ（ＳＰＣ）及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ ｆａｍｉｌｙ １Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＣＣ１０）を発現している、［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ（Ｌｙ６Ｄ）を発現している、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞。
［５］Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９（ＣＫ１９）を発現している、［１］又は［２］に記載の細胞。
［６］前記癌抑制遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群より選択される、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞。
［７］少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現している、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞。
［８］前記癌遺伝子が、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子又はＲＯＳ１融合遺伝子である、［７］に記載の細胞。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の細胞を３次元培養する工程を含む、成体由来上皮系組織幹細胞を５０％以上含む細胞培養物の製造方法。
［１０］［９］に記載の製造方法で製造された、細胞培養物。
［１１］［１］～［８］のいずれかに記載の細胞又は［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞を含む、オルガノイド。
［１２］被験物質の存在下で、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞を培養する工程と、前記細胞の形質を評価する工程と、を備える、細胞形質の変換剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下で、［６］～［８］のいずれかに記載の細胞、［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞又は［１１］に記載のオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又は前記オルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
［１４］［７］若しくは［８］に記載の細胞、［１０］に記載の細胞培養物由来の細胞又は［１１］に記載のオルガノイドを非ヒト動物に移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法。
［１５］前記非ヒト動物が、免疫系が正常な非ヒト動物である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］［１４］又は［１５］に記載の製造方法で製造された、担癌モデル非ヒト動物。
［１７］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法。
［１８］前記被験物質が、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせである、［１７］に記載の評価方法。
［１９］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位に形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
［２０］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位に形成された腫瘍より樹立した癌幹細胞。
［２１］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位以外に新たに形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法。
［２２］［１６］に記載の担癌モデル非ヒト動物の移植部位以外に新たに形成された腫瘍より樹立した癌幹細胞。
［２３］被験物質の存在下で、［２０］又は［２２］に記載の癌幹細胞を培養する工程と、前記癌幹細胞の増殖を測定する工程と、を備える、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法。
【0011】
本発明は以下の態様を含むということもできる。
［Ｐ１］少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、気管支肺胞幹細胞。
［Ｐ２］Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）及びＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ－１（Ｓｃａ－１）を発現しているか、又は、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃ（ＳＰＣ）及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ ｆａｍｉｌｙ １Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＣＣ１０）を発現している、［Ｐ１］に記載の細胞。
［Ｐ３］前記癌抑制遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群より選択される、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の細胞。
［Ｐ４］少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現している、［Ｐ１］～［Ｐ３］のいずれかに記載の細胞。
［Ｐ５］前記癌遺伝子が、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子又はＲＯＳ１融合遺伝子である、［Ｐ４］に記載の細胞。
［Ｐ６］［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の細胞を含む、オルガノイド。
［Ｐ７］被験物質の存在下で、［Ｐ４］若しくは［Ｐ５］に記載の細胞又は［Ｐ６］に記載のオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又は前記オルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
［Ｐ８］［Ｐ４］若しくは［Ｐ５］に記載の細胞又は［Ｐ６］に記載のオルガノイドを非ヒト動物に移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法。
［Ｐ９］前記非ヒト動物が、免疫系が正常な非ヒト動物である、［Ｐ８］に記載の製造方法。
［Ｐ１０］［Ｐ８］又は［Ｐ９］に記載の製造方法で製造された、担癌モデル非ヒト動物。
［Ｐ１１］［Ｐ１０］に記載の担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法。
［Ｐ１２］前記被験物質が、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせである、［Ｐ１１］に記載の評価方法。
［Ｐ１］少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、気管支肺胞幹細胞。
［Ｐ２］Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）及びＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ－１（Ｓｃａ－１）を発現しているか、又は、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃ（ＳＰＣ）及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ ｆａｍｉｌｙ １Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＣＣ１０）を発現している、［Ｐ１］に記載の細胞。
［Ｐ３］前記癌抑制遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群より選択される、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の細胞。
［Ｐ４］少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現している、［Ｐ１］～［Ｐ３］のいずれかに記載の細胞。
［Ｐ５］前記癌遺伝子が、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子又はＲＯＳ１融合遺伝子である、［Ｐ４］に記載の細胞。
［Ｐ６］［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の細胞を含む、オルガノイド。
［Ｐ７］被験物質の存在下で、［Ｐ４］若しくは［Ｐ５］に記載の細胞又は［Ｐ６］に記載のオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又は前記オルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
［Ｐ８］［Ｐ４］若しくは［Ｐ５］に記載の細胞又は［Ｐ６］に記載のオルガノイドを非ヒト動物に移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法。
［Ｐ９］前記非ヒト動物が、免疫系が正常な非ヒト動物である、［Ｐ８］に記載の製造方法。
［Ｐ１０］［Ｐ８］又は［Ｐ９］に記載の製造方法で製造された、担癌モデル非ヒト動物。
［Ｐ１１］［Ｐ１０］に記載の担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法。
［Ｐ１２］前記被験物質が、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせである、［Ｐ１１］に記載の評価方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、多様な遺伝子変異を持つ癌細胞を有し免疫系が正常な担癌動物モデルを、容易に作製する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実験例２において、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞をソーティングした際のフローサイトメトリーのデータである。
【図2】（ａ）～（ｃ）は、実験例３において、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を３次元培養した様子を経時的に示す写真である。
【図3】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３において、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の培養が進むにつれて形成されたオルガノイドの写真である。
【図4】（ａ）は、実験例５において、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養（ｐｒｉｍａｒｙ）、２継代目（１回継代、ｐ１）、３継代目（２回継代、ｐ２）の各細胞のＥｐＣＡＭとＳｃａ－１の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果をまとめたグラフである。
【図5】（ａ）～（ｄ）は、実験例６において、培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を蛍光免疫組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図6】実験例７で作製したレトロウイルスベクタープラスミドの構造を示す図である。
【図7】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８において、癌遺伝子であるＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を３次元培養した結果形成されたオルガノイドの一例を示す写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例８において、癌遺伝子であるＥＭＬ４－ＡＬＫを導入した肺細胞を３次元培養した結果形成されたオルガノイドの一例を示す写真である。（ａ）及び（ｃ）は明視野における顕微鏡写真であり、（ｂ）及び（ｄ）は蛍光顕微鏡写真である。
【図8】（ａ）～（ｄ）は、実験例９における免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
【図9】（ａ）～（ｄ）は、実験例１０における免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
【図10】（ａ）～（ｄ）は、実験例１１における免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
【図11】実験例１４における担癌モデルマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図12】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５において、野生型マウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と３継代目の各細胞のＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例１５において、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と２継代目の各細胞のＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。
【図13】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５において、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞に、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫを導入した各細胞のＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。
【図14】（ａ）は、実験例２１において、癌遺伝子を導入した胆管上皮細胞を移植したマウスの肝臓の写真である。（ｂ）は、（ａ）に示すマウスから摘出した肝臓の写真である。（ｃ）は、（ｂ）に示す肝臓におけるＧＦＰの蛍光を検出した結果を示す写真である。
【図15】（ａ）は、実験例２１において、癌遺伝子を導入した胆嚢上皮細胞を移植したマウスの肝臓の写真である。（ｂ）は、（ａ）に示すマウスから摘出した肝臓の写真である。（ｃ）は、（ｂ）に示す肝臓におけるＧＦＰの蛍光を検出した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［細胞］
１実施形態において、本発明は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、培養上皮細胞を提供する。本実施形態の培養上皮細胞は、成体（ａｄｕｌｔ）由来上皮系組織幹細胞であってもよい。
１実施形態において、本発明は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した、培養上皮細胞を提供する。本実施形態の培養上皮細胞は、成体（ａｄｕｌｔ）由来上皮系組織幹細胞であってもよい。
【0015】
本実施形態の細胞は、動物組織の上皮由来であれば特に制限されないが、例えば気管支肺胞幹細胞（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＢＡＳＣ）であってもよいし、例えば胆管上皮細胞であってもよいし、例えば胆嚢上皮細胞であってもよい。また本実施形態の細胞は消化管上皮細胞を除く上皮細胞であってもよい。
【0016】
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の細胞に任意の癌遺伝子を導入し、免疫系が正常な同種の非ヒト動物に移植することにより、担癌非ヒト動物モデルを容易に作製することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の細胞は、任意の癌遺伝子を導入する宿主細胞として有用である。
【0017】
本実施形態の細胞は、ヒト由来の細胞であってもよく、非ヒト動物由来の細胞であってもよい。非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。また、本実施形態の細胞は、肺由来の細胞であることが好ましい。
【0018】
本実施形態の細胞は、ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－であることが好ましい。実施例において後述するように、肺、胆嚢、胆管等の組織からＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－を回収して３次元培養することにより、本実施形態の細胞を得ることができる。
【0019】
本実施形態の細胞は、ＥｐＣＡＭ及びＳｃａ－１を発現していてもよいし、ＳＰＣ及びＣＣ１０を発現していてもよい。実施例において後述するように、本実施形態の細胞は、幹細胞性を高く維持した気管支肺胞幹細胞であってもよい。ＥｐＣＡＭとＳｃａ－１との共発現、又は、ＳＰＣとＣＣ１０との共発現はＢＡＳＣのマーカーである。すなわち、ＥｐＣＡＭ＋Ｓｃａ－１＋細胞、又は、ＳＰＣ＋ＣＣ１０＋細胞はＢＡＳＣである。
【0020】
本実施形態の細胞は、ＥｐＣＡＭ＋Ｓｃａ－１＋ＳＰＣ＋細胞であってもよいし、ＥｐＣＡＭ＋Ｓｃａ－１＋ＣＣ１０＋細胞であってもよいし、ＥｐＣＡＭ＋ＳＰＣ＋ＣＣ１０＋細胞であってもよいし、Ｓｃａ－１＋ＳＰＣ＋ＣＣ１０＋細胞であってもよいし、ＥｐＣＡＭ＋Ｓｃａ－１＋ＳＰＣ＋ＣＣ１０＋細胞であってもよい。
【0021】
なお、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００２３４５．２であり、マウスＥｐＣＡＭタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿０３２５５８．２である。また、マウスＳｃａ－１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００１２５８３４５．１である。上記以外の動物種の細胞を用いる場合には、これらのホモログを発現している細胞を用いればよい。
【0022】
また、ヒトＳＰＣタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００１１６５８２８．１、ＮＰ＿００１３０４７０７．１、ＮＰ＿００１３０４７０８．１等であり、マウスＳＰＣタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿０３５４８９．２である。また、ヒトＣＣ１０タンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００３３４８．１であり、マウスＣＣ１０タンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿０３５８１１．１である。上記以外の動物種の細胞を用いる場合には、これらのホモログを発現している細胞を用いればよい。
【0023】
また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞はＬｙ６Ｄを発現していてもよい。また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞はＣＫ１９を発現していてもよい。
【0024】
ヒトＬｙ６Ｄタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００３６８６．１等であり、マウスＬｙ６Ｄタンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿０３４８７２．１等である。また、ヒトＣＫ１９タンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿００２２６７．２等であり、マウスＣＫ１９タンパク質のＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＰ＿０３２４９７．１等である。上記以外の動物種の細胞を用いる場合には、これらのホモログを発現している細胞を用いればよい。
【0025】
本実施形態の細胞において、癌抑制遺伝子としては、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３、ＰＴＥＮ等が挙げられる。
【0026】
本実施形態の細胞は、上記の癌抑制遺伝子が破壊された非ヒト動物から調製してもよい。あるいは、ＥｐＣＡＭ及びＳｃａ－１を発現している細胞、ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３１－ＣＤ４５－細胞、すなわち、ＥｐＣＡＭを発現しており、ＣＤ３１及びＣＤ４５を発現していない細胞、Ｌｙ６Ｄを発現している細胞、ＣＫ１９を発現している細胞等を、フローサイトメトリー、抗体修飾磁気ビーズ及びマグネティックスタンドを用いた方法等により分離した後、ゲノム編集、ｓｈＲＮＡ発現ベクターの導入等により、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損させてもよい。本明細書において、遺伝子を欠損させるとは、対象遺伝子の少なくとも一部を欠損させること、又は対象遺伝子の発現を低下させること等により、対象遺伝子の機能を低下又は欠損させることを意味する。
【0027】
実施例において後述するように、本実施形態の細胞は、無血清培地中で３次元培養することにより、幹細胞性を高く維持した状態の、気管支肺胞幹細胞（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＢＡＳＣ）、胆管上皮細胞、胆嚢上皮細胞を豊富に含む状態で維持することができ、様々な形態のオルガノイドを形成することができる。３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
【0028】
したがって、１実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞を３次元培養する工程を含む、上皮幹細胞を５０％以上含む細胞培養物の製造方法を提供するものであるということもできる。また、本発明は、上皮幹細胞を５０％以上含む細胞培養物を提供する。ここで、上皮幹細胞は、成体由来上皮系組織幹細胞であってもよい。
【0029】
本実施形態の細胞は、少なくとも１つの癌遺伝子を更に発現していてもよい。実施例において後述するように、癌遺伝子を導入した本実施形態の細胞を動物に移植することにより、腫瘍を形成させることができる。
【0030】
本実施形態の細胞に導入する癌遺伝子としては、特に限定されず、近年見出された様々な遺伝子変異を有する癌関連遺伝子を使用することができる。より具体的には、変異ＫＲＡＳ遺伝子、変異ＥＧＦＲ遺伝子、ＡＬＫ融合遺伝子、ＲＯＳ１融合遺伝子等が挙げられる。
【0031】
変異ＫＲＡＳ遺伝子としては、例えば、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ等が挙げられる。ＡＬＫ融合遺伝子としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ等が挙げられる。
【0032】
実施例において後述するように、癌遺伝子を導入した後の本実施形態の細胞は、無血清培地を用いて３次元培養することにより維持することができる。
【0033】
したがって、１実施形態において、本発明は、癌遺伝子を導入した後の上記実施形態の細胞を３次元培養する工程を含む、上皮幹細胞を５０％以上含む細胞培養物の製造方法を提供するものであるということもできる。また、本発明は、上皮幹細胞を５０％以上含む細胞培養物を提供する。ここで、上皮幹細胞は、成体由来上皮系組織幹細胞であってもよい。
【0034】
また、癌遺伝子を導入した後の本実施形態の細胞も、様々な形態のオルガノイドを形成することができる。したがって、本実施形態の細胞はオルガノイドであってもよい。本明細書において、オルガノイドとは、細胞を３次元培養することにより得られた臓器様組織を意味する。また、本明細書では、本実施形態の細胞を培養して得られた細胞塊もオルガノイドに含めるものとする。
【0035】
［細胞形質の変換剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した細胞、上述した細胞培養物由来の細胞又は上述したオルガノイドを培養する工程と、前記細胞の形質を評価する工程と、を備える、細胞形質の変換剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法において、細胞又はオルガノイドは、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、癌遺伝子が導入されていない細胞又はオルガノイドであってもよい。
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した細胞、上述した細胞培養物由来の細胞又は上述したオルガノイドを培養する工程と、前記細胞の形質を評価する工程と、を備える、細胞形質の変換剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法において、細胞又はオルガノイドは、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、癌遺伝子が導入されていない細胞又はオルガノイドであってもよい。
【0036】
本実施形態のスクリーニング方法において評価する細胞の形質としては、分化及び脱分化が挙げられる。細胞の分化及び脱分化は、例えば、顕微鏡観察、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現を測定すること等により評価することができる。
【0037】
また、細胞形質の変換剤としては、分化誘導剤、脱分化誘導剤、分化抑制剤、脱分化誘導剤等が挙げられる。
【0038】
［抗癌剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で上述した細胞、上述した細胞培養物由来の細胞又はオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又はオルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。ここで、上述した細胞又はオルガノイドとは、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している若しくは癌遺伝子を発現していない、培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドである。上述したように、培養上皮細胞としては、気管支肺胞幹細胞、胆管上皮細胞、胆嚢上皮細胞等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で上述した細胞、上述した細胞培養物由来の細胞又はオルガノイドを培養する工程と、前記細胞又はオルガノイドの増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。ここで、上述した細胞又はオルガノイドとは、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している若しくは癌遺伝子を発現していない、培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドである。上述したように、培養上皮細胞としては、気管支肺胞幹細胞、胆管上皮細胞、胆嚢上皮細胞等が挙げられる。
【0039】
本実施形態の方法によりスクリーニングされる抗癌剤は、癌幹細胞に有効な抗癌剤であるということもできる。
【0040】
本実施形態のスクリーニング方法において、癌遺伝子としては特に限定されず、上述したものと同様のものが挙げられる。
【0041】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ等の化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。具体的には、被験物質を、上述した細胞の培地に添加し、細胞の増殖に対する影響を検討することが挙げられる。より具体的には、例えば、ウェルプレートに細胞を播種し、化合物ライブラリの存在下で１～３０日間程度培養する。培養は、例えば、無血清培地を用いた３次元培養により行ってもよいし、血清を含む培地を用いた通常の培養により行ってもよい。
【0042】
その後、例えばテトラゾリウム塩の還元による発色により、生細胞数を測定することにより、細胞又はオルガノイドの増殖を測定する。細胞又はオルガノイドの増殖を抑制する化合物は、抗癌剤の候補である。テトラゾリウム塩としては、市販の３－［４，５－ジメチルチアゾル－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）等を利用することができる。
【0043】
本実施形態のスクリーニング方法により、近年見出された様々な遺伝子変異を有する癌を効果的に治療することができる抗癌剤を迅速にスクリーニングすることが可能となる。
【0044】
［担癌モデル非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドが移植された、担癌モデル非ヒト動物を提供する。本発明はまた、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドを移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。上述したように、培養上皮細胞としては、気管支肺胞幹細胞、胆管上皮細胞、胆嚢上皮細胞等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドが移植された、担癌モデル非ヒト動物を提供する。本発明はまた、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損しており、少なくとも１つの癌遺伝子を発現している培養上皮細胞又は当該細胞を培養して得られたオルガノイドを移植する工程を備える、担癌モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。上述したように、培養上皮細胞としては、気管支肺胞幹細胞、胆管上皮細胞、胆嚢上皮細胞等が挙げられる。
【0045】
従来の同種移植マウスモデルは、マウス由来の癌細胞株が極めて少ないことから、多様な遺伝子変異に対応する多様なモデルを作製することが困難であった。
【0046】
これに対し、本実施形態の担癌モデル非ヒト動物によれば、任意の癌遺伝子を導入した細胞を用いて迅速かつ容易に多様な担癌モデル非ヒト動物を作製することができる。このため、本実施形態の担癌モデル非ヒト動物を解析することにより、近年見出された様々な遺伝子変異を有する癌の性状を明らかにし、治療法を開発することができる。
【0047】
非ヒト動物への細胞の移植においては、上述したオルガノイドを移植してもよいし、オルガノイドを形成している細胞を単一細胞に分散させた後に移植してもよい。
【0048】
また、移植箇所としては特に限定されず、皮下、腎被膜下、肺、尾静脈、腹腔内、心腔内、肝臓等が挙げられる。
【0049】
また、非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。
【0050】
本実施形態の担癌モデル非ヒト動物は、免疫不全非ヒト動物であってもよいし、免疫系が正常な非ヒト動物であってもよい。免疫系が正常な非ヒト動物を使用した場合には、癌細胞、免疫細胞及び腫瘍周辺の組織との相互作用を解析することができる。近年、癌細胞を標的とした治療薬以外にも、腫瘍血管形成や腫瘍免疫等を標的とした治療薬が開発され、癌の治療薬は多様化している。このため、本実施形態の担癌モデル非ヒト動物はこのような治療薬の開発や評価にも有用である。
【0051】
実施例において示すように、本実施形態の担癌モデル非ヒト動物によれば、ヒトの肺癌組織を病理学的に反映した腺構造を形成することもできる。このため、例えば、肺癌の治療方法を開発するのに好適に用いることができる。
【0052】
［被験物質の評価方法］
１実施形態において、本発明は、上述した担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述した担癌モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、前記担癌モデル非ヒト動物の予後を評価する工程と、を備える、被験物質の評価方法を提供する。
【0053】
上述したように、担癌モデル非ヒト動物としては、免疫系が正常な非ヒト動物を用いることができる。したがって、本実施形態の評価方法により、様々な遺伝子変異を持つ癌細胞と免疫細胞との相互作用を評価することができる。
【0054】
上述したように、従来の担癌動物モデルでは、宿主が免疫不全であったり、作製が困難であること等により、例えば、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせの効果を評価することは困難であった。これに対し、本実施形態の評価方法によれば、被験物質として、抗癌剤及び免疫作動薬の組み合わせを用いることもできる。
【0055】
抗癌剤としては、特に制限されず、既存の薬剤又は将来開発される薬剤を用いることができる。具体的には、例えば、ゲムシタビン、ペメトレキセド等の代謝拮抗薬；ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ、アレクチニブ等の分子標的薬等が挙げられる。
【0056】
また、免疫作動薬としては、特に制限されず、既存の又は将来開発される薬剤を用いることができる。具体的には、例えば、イミキモド、レシキモド等のＴＬＲ作動薬；ニボルマブ、イピリムマブ、ペンブロリズマブ等の免疫チェックポイント阻害薬等が挙げられる。
【0057】
被験物質の投与は経口投与により行ってもよいし、静脈内注射、腹腔内注射、吸入、皮膚への貼付等により行ってもよい。
【0058】
本実施形態の評価方法において、予後の評価としては、特に限定されず、例えば、腫瘍組織の大きさ、癌の転移の評価、体重の変化、生存率、蛍光イメージング画像、発光イメージング画像等を評価することが挙げられる。
【0059】
対照物質を投与した場合と比較して、被験物質を投与した場合に担癌モデル非ヒト動物の予後が改善した場合には、被験物質は癌の治療薬として有効であると判断することができる。したがって、本実施形態の評価方法は、癌の治療薬のスクリーニング方法であるということもできる。
【0060】
［癌幹細胞の製造方法及び癌幹細胞］
１実施形態において、本発明は、上述した担癌モデル非ヒト動物において、上述した細胞又はオルガノイドの移植部位に形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述した担癌モデル非ヒト動物において、上述した細胞又はオルガノイドの移植部位に形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法を提供する。
【0061】
本実施形態の製造方法により、幹細胞性を高く維持した状態の癌細胞、すなわち癌幹細胞を、高い割合で含む細胞集団を製造することができる。本実施形態の製造方法は、癌幹細胞の濃縮方法であるということもできる。
【0062】
３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
【0063】
１実施形態において、本発明は、上記の製造方法により樹立した癌幹細胞を提供する。本実施形態の癌幹細胞は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損し、多様な癌遺伝子を発現した癌幹細胞である。したがって、自然に発生する癌幹細胞とは、発現するマーカータンパク質の組み合わせ、エピジェネティックな変化等に相違が存在すると考えられる。しかしながら、このようなマーカータンパク質の組み合わせやエピジェネティックな変化を特定することは困難である。
【0064】
１実施形態において、本発明は、上述した担癌モデル非ヒト動物において、上述した細胞又はオルガノイドの移植部位以外に新たに形成された腫瘍由来の細胞を３次元培養する工程を備える、癌幹細胞の製造方法を提供する。
【0065】
本実施形態の製造方法により、原発巣から転移した腫瘍由来の癌幹細胞を製造することができる。３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
【0066】
１実施形態において、本発明は、上記の製造方法により樹立した癌幹細胞を提供する。本実施形態の癌幹細胞は、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損し、多様な癌遺伝子を発現した癌幹細胞であり、更に原発巣から転移した履歴を有する癌幹細胞である。したがって、自然に発生する癌幹細胞とは、発現するマーカータンパク質の組み合わせ、エピジェネティックな変化等に相違が存在すると考えられる。しかしながら、このようなマーカータンパク質の組み合わせやエピジェネティックな変化を特定することは困難である。
【0067】
［癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した癌幹細胞を培養する工程と、前記癌幹細胞の増殖を測定する工程と、を備える、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した癌幹細胞を培養する工程と、前記癌幹細胞の増殖を測定する工程と、を備える、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【0068】
本実施形態のスクリーニング方法における癌幹細胞は、上述した担癌モデル非ヒト動物において、上述した細胞又はオルガノイドの移植部位に形成された腫瘍、又は移植部位以外に新たに形成された腫瘍に由来する癌幹細胞である。
【0069】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、上述したものと同様であり、例えば、化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。また、細胞の増殖の測定も上述したものと同様に行うことができ、例えば、テトラゾリウム塩の還元による発色により測定することができる。
【実施例】
【0070】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【0071】
［実験例１］
（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウス肺細胞の分離）
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＮＣＩ－Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ)より入手）から肺細胞を分離した。具体的には、まず、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、マウス１匹あたり０．３ｍＬのペントバルビタール（最終濃度７．２ｍｇ／ｍＬ、共立製薬、ｃａｔ．ｎｏ．ＳＯＭ０２－ＹＡ１３１２）を腹腔内注射して麻酔した。
（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウス肺細胞の分離）
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＮＣＩ－Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ)より入手）から肺細胞を分離した。具体的には、まず、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、マウス１匹あたり０．３ｍＬのペントバルビタール（最終濃度７．２ｍｇ／ｍＬ、共立製薬、ｃａｔ．ｎｏ．ＳＯＭ０２－ＹＡ１３１２）を腹腔内注射して麻酔した。
【0072】
続いて、マウスを仰臥位に固定し、皮膚を下腹部から顎部まで正中切開し、左右に皮膚を剥離した。続いて、顎下腺を除去し、気管周囲筋群を切開して気管を露出させた。続いて、腹膜を正中及び肋骨弓に沿ってＴ字に切開し、腹部大動脈と下大静脈を露出させた。続いて、左右頸動脈、腹部大動脈及び下大静脈を切断し、十分に瀉血した。
【0073】
続いて、横隔膜と胸郭を除去して肺と心臓を露出させ、左心室に切れ込みを入れ、シリンジと２３ゲージの針を用いて予め冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を右心室から１５ｍＬ注入し、肺内の血液を洗い流した。
【0074】
続いて、２２ゲージの静脈留置針を気管に刺入し、シリンジを用いてコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬ、ロシュ社、ｃａｔ．ｎｏ．１１０９７１１３００１）を１．５ｍＬ肺内に注入した後、素早くシリンジを交換してアガロース（最終濃度０．５％、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．０２４６８－９５）を０．５ｍＬ注入した。
【0075】
続いて、肺の上に氷を置いてアガロースを固め、２分後、氷を除去して各肺葉を摘出し、コラゲナーゼ／ディスパーゼを入れたコニカルチューブへ移し、３７℃の恒温槽中に１０分間静置した。
【0076】
続いて、酵素処理した肺組織をハサミで細切した後、再びコラゲナーゼ／ディスパーゼを入れたコニカルチューブへ移し、３７℃で４５分間振盪した。続いて、溶液中にＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、シグマ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１Ｇ）を加えて１０００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングし、１００μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３６０）を通した。続いて、２００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去した後、赤血球溶血緩衝液を１０ｍＬ加え、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通した。続いて、２００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去した後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ＰＢＳ（洗浄バッファー）中に懸濁し、肺細胞を得た。
【0077】
［実験例２］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の分離）
実験例１で調製した肺細胞から、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）を用いて、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞をソーティングして分離した。なお、ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカーであり、ＣＤ４５は汎血球マーカーであり、ＥｐＣＡＭは肺上皮細胞のマーカーである。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の分離）
実験例１で調製した肺細胞から、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）を用いて、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞をソーティングして分離した。なお、ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカーであり、ＣＤ４５は汎血球マーカーであり、ＥｐＣＡＭは肺上皮細胞のマーカーである。
【0078】
抗体及び色素としては、以下のものを使用した。Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗マウスＣＤ３１ラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１０２４０８）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４５ラットモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１２－０４５１－８３）、ＰＥ標識ラットイムノグロブリンＧ２ｂ（ＩｇＧ２ｂ）アイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１２－４０３１－８３）、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）ラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１１８２４１）、ＡＰＣ標識ラットＩｇＧ２ａκアイソタイプコントロール（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．４００５１２）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（シグマ社、ｎｏ．Ｐ４１７０－１０ＭＧ）。
【0079】
図１は、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞をソーティングした際のフローサイトメトリーのデータである。図中の四角で囲まれた領域の細胞を回収した。
【0080】
［実験例３］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の培養）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の培養）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
【0081】
基本培地として、無血清培地である、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）、１×Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１２５８７－０１０）、ＨＥＰＥＳ（最終濃度１５ｍＭ、ギブコ社、ｎｏ．１５６３０－０８０）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック社、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ－１００－１５）、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ、バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．７５２２４０）、ＲＯＣＫ阻害剤（用事調製、最終濃度１０μＭ、メルクミリポア社、ｃａｔ．ｎｏ．６８８０００－１ＭＧ）を使用した。
【0082】
実験例２で分離した細胞の細胞数をカウントした後、６００×ｇ、４℃で３分間遠心した。続いて、得られた細胞ペレットに、ペニシリン（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、ストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、アンホテリシンＢ（最終濃度０．２５μｇ／ｍＬ、ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５２４０－０６２）を加えた基本培地を加え、細胞密度が５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁した。
【0083】
続いて、１つのインサートにつき２００μＬの細胞懸濁液を播種し、インサート下のウェルに４００μＬの抗菌薬入り基本培地を加え３次元培養した。２～３日おきに抗菌薬を加えない基本培地で培地交換を行った。
【0084】
図２（ａ）～（ｃ）は、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を３次元培養した様子を経時的に示す写真である。図２（ａ）は培養開始から２日後の写真であり、図２（ｂ）は培養開始から７日後の写真であり、図２（ｃ）は培養開始から１４日後の写真である。また、図３（ａ）及び（ｂ）は、培養が進むにつれて形成されたオルガノイドの写真である。図３（ａ）及び（ｂ）中、スケールバーは１００μｍを示す。図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を３次元培養することにより、様々な形態のオルガノイドが形成された。
【0085】
［実験例４］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の継代）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の継代）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
【0086】
続いて、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0087】
続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５４００－０５４）を５００μＬ加え、２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置した。
【0088】
その後、再度２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置し、Ｔｒｙｐｓｉｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ、ロンザ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＣ－５００２）を５００μＬ加えた。
【0089】
続いて、１．５ｍＬチューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、細胞ペレットを得た。続いて、得られた細胞ペレットを基本培地で懸濁し、１つのインサートにつき２００μＬの細胞懸濁液を播種し、インサート下のウェルに４００μＬの基本培地を加え３次元培養した。２～３日おきに基本培地で培地交換を行った。
【0090】
［実験例５］
（気管支肺胞幹細胞（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＢＡＳＣ）の解析）
実験例３及び４で培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養、２継代目、３継代目をそれぞれフローサイトメーターで解析した。
（気管支肺胞幹細胞（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＢＡＳＣ）の解析）
実験例３及び４で培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養、２継代目、３継代目をそれぞれフローサイトメーターで解析した。
【0091】
抗体及び色素としては、以下のものを使用した。ＰＥ標識抗マウスＳｃａ－１抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１０８１０７）、ＰＥ標識ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１２－４０３１－８３）、ＡＰＣ標識抗マウスＥｐＣＡＭラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１１８２４１）、ＡＰＣ標識ラットＩｇＧ２ａκアイソタイプコントロール（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．４００５１２）、ＰＩ（シグマ社、ｎｏ．Ｐ４１７０－１０ＭＧ）。
【0092】
図４（ａ）は、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養（ｐｒｉｍａｒｙ）、２継代目（１回継代、ｐ１）、３継代目（２回継代、ｐ２）の各細胞を、ＰＩ－ＣＤ３１－ＣＤ４５－集団又はＰＩ－集団に限定してＥｐＣＡＭとＳｃａ－１の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。図４（ｂ）は、図４（ａ）の結果をまとめたグラフである。
【0093】
その結果、無血清培地を用いた３次元培養によってＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の継代を進めるにつれて、ＥｐＣＡＭとＳｃａ－１を共発現する気管支肺胞幹細胞（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＢＡＳＣ）が有意に増加することが明らかとなった。
【0094】
［実験例６］
（培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の固定及び蛍光免疫組織染色）
実験例３及び４と同様にして培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を固定し、蛍光免疫組織染色を行った。まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。続いて、先端をカットした１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、ｉＰＧｅｌｌ（ジェノスタッフ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＧ２０－１）を用いてコロニーをゲル中に包埋した。
（培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の固定及び蛍光免疫組織染色）
実験例３及び４と同様にして培養したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を固定し、蛍光免疫組織染色を行った。まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。続いて、先端をカットした１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、ｉＰＧｅｌｌ（ジェノスタッフ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＧ２０－１）を用いてコロニーをゲル中に包埋した。
【0095】
続いて、コロニーを包埋したゲルを４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．０９１５４－８５）に浸し、細胞を固定した。続いて、パラフィン包埋ブロックを作製し、薄切切片を作製した。続いて薄切切片をスライドグラスに貼り付けた。続いて、キシレンで脱パラフィンを行い、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で加熱処理することにより抗原の賦活化を行った。続いて、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳでブロッキングを行った。続いて、１次抗体として、ウサギ抗ＳＰＣポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｃａｔ．ｎｏ．ｓｃ－１３９７９）、ヤギ抗ＣＣ１０モノクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｃａｔ．ｎｏ．ｓｃ－９７７２）を４℃で一晩反応させた。続いて、２次抗体として、ヤギ抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８抗体（ライフテクノロジーズ社、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１１０３４）と、ロバ抗ヤギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４抗体（ライフテクノロジーズ社、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１１０３４）を室温で３０分間反応させ、ＶＥＣＴＡＳＩＥＬＤ ＭＯＵＮＴＩＮＧ ＭＥＤＩＵＭ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ベクター社、ｃａｔ．ｎｏ．Ｈ－１２００）を用いて封入した。
【0096】
図５（ａ）～（ｄ）は、蛍光免疫組織染色した細胞の蛍光顕微鏡写真である。図５（ａ）はＤＡＰＩにより染色された核を観察した蛍光顕微鏡写真である。図５（ｂ）は、ＳＰＣの局在を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ｃ）は、ＣＣ１０の局在を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ｄ）は、図５（ａ）～（ｃ）をマージした写真である。図５（ａ）～（ｄ）中、スケールバーは１００μｍを示す。その結果、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を培養した細胞集団に、ＳＰＣ及びＣＣ１０を発現する細胞が含まれることが明らかとなった。上述したように、ＳＰＣ及びＣＣ１０はＢＡＳＣのマーカーである。したがって、この結果は、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞がＢＡＳＣを含むことを更に支持するものである。
【0097】
［実験例７］
（癌遺伝子を発現するレトロウイルスの作製）
癌遺伝子である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ及びＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を発現するレトロウイルスを作製した。具体的には、まず、パッケージング細胞であるＧＰ２－２９３細胞を１０ｃｍの培養皿２枚にそれぞれ４×１０６個／ｄｉｓｈの細胞密度で播種した。続いて、４～６時間後、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＭＸｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｖ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ又はｐＭＸｓ－ＥＭＬ４－ＡＬＫ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ）及びｐＶＳＶ－Ｇを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（プロメガ社、ｃａｔ．ｎｏ．Ｅ２３１２）を用いてＧＰ２－２９３細胞にトランスフェクションした。翌日、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．０８４５９－６４）に培地交換を行った。図４にレトロウイルスベクタープラスミドの構造を示す。図６に示すように、癌遺伝子である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の下流にｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ（ＩＲＥＳ）配列をはさんでＥＧＦＰ遺伝子が連結されていた。
（癌遺伝子を発現するレトロウイルスの作製）
癌遺伝子である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ及びＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を発現するレトロウイルスを作製した。具体的には、まず、パッケージング細胞であるＧＰ２－２９３細胞を１０ｃｍの培養皿２枚にそれぞれ４×１０６個／ｄｉｓｈの細胞密度で播種した。続いて、４～６時間後、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＭＸｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｖ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ又はｐＭＸｓ－ＥＭＬ４－ＡＬＫ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ）及びｐＶＳＶ－Ｇを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（プロメガ社、ｃａｔ．ｎｏ．Ｅ２３１２）を用いてＧＰ２－２９３細胞にトランスフェクションした。翌日、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．０８４５９－６４）に培地交換を行った。図４にレトロウイルスベクタープラスミドの構造を示す。図６に示すように、癌遺伝子である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の下流にｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ（ＩＲＥＳ）配列をはさんでＥＧＦＰ遺伝子が連結されていた。
【0098】
続いて、トランスフェクションから３日目、培地を０．４５μｍフィルター（イワキ、ｃａｔ．ｎｏ．２０５３－０２５）を通して５０ｍＬチューブに回収し、４℃、２３，０００×ｇで６～７時間遠心し、レトロウイルスのペレットを得た。続いて、上清を除去し、ウイルスのペレットを基本培地（ＲＯＣＫ阻害剤を含まないもの）中に懸濁し、１．５ｍＬチューブに移して－８０℃で保存した。
【0099】
［実験例８］
（肺細胞への癌遺伝子導入）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
（肺細胞への癌遺伝子導入）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
【0100】
続いて、３～４継代したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を、実験例４と同様の方法で細胞ペレットにした。続いて、得られた細胞ペレットに、実験例７で作製したウイルス液を解凍したもの２００μＬ、ＲＯＣＫ阻害剤（最終濃度１０ｍＭ）及びプロタミン（最終濃度１０μｇ／ｍＬ、シグマ社）を加え、１×１０５個／２００μＬとなるように懸濁した。続いて、１つのインサートにつき２００μＬの細胞懸濁液を播種し、インサート下のウェルに４００μＬの基本培地を加えて３次元培養した。３日後に基本培地で培地交換を行い、以後は２～３日おきに培地交換を行った。
【0101】
ウイルス感染から１２～１４日後、実験例４と同様の方法で細胞ペレットを得た。続いて、細胞ペレットを、ＰＩ（最終濃度０．１μｇ／ｍＬ）を加えた洗浄バッファーで懸濁し、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）でＧＦＰ陽性細胞を分離した。
【0102】
分離した細胞を基本培地２００μＬに懸濁し、インサート上に播種した。インサート下のウェルにも４００μＬの基本培地を加えて３次元培養し、２～３日おきに培地交換を行った。細胞のコロニーは１週間程度でコンフルエントになった。コンフルエントになった細胞を、実験例４と同様の方法で継代した。
【0103】
図７（ａ）及び（ｂ）は、癌遺伝子であるＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を３次元培養した結果形成されたオルガノイドの一例を示す写真である。図７（ａ）は明視野における写真であり、図７（ｂ）は図７（ａ）と同じ視野においてＧＦＰの蛍光を観察した写真である。
【0104】
図７（ｃ）及び（ｄ）は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を導入した肺細胞を３次元培養した結果形成されたオルガノイドの一例を示す写真である。図７（ｃ）は明視野における写真であり、図７（ｄ）は図７（ｃ）と同じ視野においてＧＦＰの蛍光を観察した写真である。
【0105】
［実験例９］
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（皮下））
実験例８で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（皮下））
実験例８で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0106】
続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５４００－０５４）を５００μＬ加え、２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置した。
【0107】
その後、再度２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置し、Ｔｒｙｐｓｉｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ、ロンザ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＣ－５００２）を５００μＬ加えた。
【0108】
続いて、１．５ｍＬチューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、細胞ペレットを得た。続いて、得られた細胞ペレットをＰＢＳで懸濁した。これに、あらかじめ氷上で溶解させておいたマトリゲルを１：１で混合し、５×１０５個／１００μＬとなるように調整した。続いて、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの背部を剃毛し、左右１箇所ずつ、１００μＬの細胞懸濁液を皮下注射した。
【0109】
細胞移植から３週間飼育後、腫瘍の形成が認められ、担癌モデルマウスが得られた。続いて、担癌モデルマウスから腫瘍を摘出し、免疫組織化学染色により解析した。
【0110】
具体的にはまず、摘出した腫瘍組織を４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．０９１５４－８５）で固定した。続いて、パラフィン包埋ブロックを作製し、薄切切片を作製した。続いて薄切切片をスライドグラスに貼り付けた。続いて、キシレンで脱パラフィンを行い、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で加熱処理することにより抗原の賦活化を行った。続いて、３％過酸化水素／ＰＢＳに浸漬することにより内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。続いて、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳでブロッキングを行った。
【0111】
続いて、１次抗体として、ウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｃａｔ．ｎｏ．ｓｃ－８３３４）、又はウサギ抗ＴＴＦ－１モノクローナル抗体（アブカム社、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ７６０１３）を４℃で一晩反応させた。Ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１（ＴＴＦ－１）は、甲状腺と肺の発生に関与する転写因子であり、肺腺癌のマーカーでもある。
【0112】
続いて、２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ベクター社、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＫ－６１０１）を室温で３０分間反応させた。
【0113】
続いて、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ（ベクター社、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＫ－６１０１）を室温で３０分間反応させた後、ＩｍｍＰＡＣＴ ＤＡＢ（ベクター社、ｃａｔ．ｎｏ．ＳＫ－４１０５）を反応させ、発色させた。
【0114】
図８（ａ）は腫瘍組織の薄切切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。また、図８（ｂ）は図８（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。その結果、癌遺伝子を導入した肺細胞は、皮下環境においても、ａｃｉｎａｒ型腫瘍、ｐａｐｉｌｌａｒｙ型腫瘍等のヒト肺腺癌でよく観察される分化型腺癌の組織型の腫瘍を形成したことが明らかとなった。これらの腫瘍は従来の技術による移植肺癌モデルでは観察が極めて難しい組織型である。この結果から、よりヒトに近い担癌モデル非ヒト動物を作製する手法として、本実験例の方法が顕著に優位であることが明らかとなった。
【0115】
また、図８（ｃ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真であり、図８（ｄ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＴＴＦ－１抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真である。その結果、肺の分化マーカー及び肺腺癌マーカーであるＴＴＦ－１の発現が陽性であることが明らかとなった。
【0116】
［実験例１０］
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（腎被膜下））
実験例８で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎被膜下に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（腎被膜下））
実験例８で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎被膜下に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0117】
続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５４００－０５４）を５００μＬ加え、２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置した。
【0118】
その後、再度２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置し、Ｔｒｙｐｓｉｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ、ロンザ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＣ－５００２）を５００μＬ加えた。
【0119】
続いて、１．５ｍＬチューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、細胞ペレットを得た。続いて、得られた細胞ペレットをＰＢＳで懸濁した。続いて、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを麻酔下にて背部を剃毛し、背部皮膚を切開し、腎臓を体表に牽引・露出させ、２７ゲージの針を下極から上極方向に刺入した。続いて、一旦針を抜去し、２００μＬチップで細胞懸濁液１０μＬを上極の腎被膜下に注入した。この操作を両腎に行った後、腹膜、皮膚を縫合した。
【0120】
細胞移植から５週間飼育後、腫瘍の形成が認められ、担癌モデルマウスが得られた。続いて、担癌モデルマウスから腫瘍を摘出し、実験例９と同様にして免疫組織化学染色により解析した。
【0121】
図９（ａ）は腫瘍組織の薄切切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。また、図９（ｂ）は図９（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。その結果、癌遺伝子を導入した肺細胞は、腎被膜下環境においても、粘液産生性のａｃｉｎａｒ型腫瘍と呼ばれるヒト肺腺癌でよく観察される組織型の腫瘍を形成したことが明らかとなった。
【0122】
また、図９（ｃ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真であり、図９（ｄ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＴＴＦ－１抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真である。その結果、肺の分化マーカー及び肺腺癌マーカーであるＴＴＦ－１の発現が陽性であることが明らかとなった。
【0123】
［実験例１１］
（融合遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（皮下））
実験例８で作製した、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を導入した肺細胞を実験例９と同様にして野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に移植した。
（融合遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（皮下））
実験例８で作製した、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を導入した肺細胞を実験例９と同様にして野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に移植した。
【0124】
細胞移植から５週間飼育後、腫瘍の形成が認められ、担癌モデルマウスが得られた。続いて、担癌モデルマウスから腫瘍を摘出し、実験例９と同様にして免疫組織化学染色により解析した。
【0125】
図１０（ａ）は腫瘍組織の薄切切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。また、図１０（ｂ）は図１０（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。その結果、癌遺伝子を導入した肺細胞は、皮下環境においても、粘液産生性のａｃｉｎａｒ型腫瘍と呼ばれるヒト肺腺癌でよく観察される組織型の腫瘍を形成したことが明らかとなった。
【0126】
また、図１０（ｃ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真であり、図１０（ｄ）は、腫瘍組織の薄切切片を抗ＴＴＦ－１抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真である。その結果、肺の分化マーカー及び肺腺癌マーカーであるＴＴＦ－１の発現が陽性であることが明らかとなった。
【0127】
［実験例１２］
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（肺））
実験例８で作製した、癌遺伝子を導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺に移植して担癌モデルマウスを作製し、腫瘍組織を免疫組織化学的に解析した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスには、細胞移植の１０～１４日前に、ブレオマイシン０．０２５Ｕを経気道的に投与した。
（癌遺伝子を導入した肺細胞のマウスへの移植（肺））
実験例８で作製した、癌遺伝子を導入した肺細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺に移植して担癌モデルマウスを作製し、腫瘍組織を免疫組織化学的に解析した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスには、細胞移植の１０～１４日前に、ブレオマイシン０．０２５Ｕを経気道的に投与した。
【0128】
その結果、癌遺伝子を導入した肺細胞を肺に移植した場合においても、実験例９～１１と同様の結果が得られた。すなわち、ａｃｉｎａｒ型腫瘍、ｐａｐｉｌｌａｒｙ型腫瘍等のヒト肺腺癌でよく観察される組織型の腫瘍が観察され、肺の分化マーカー及び肺腺癌マーカーであるＴＴＦ－１の発現が陽性であることが明らかとなった。
【0129】
［実験例１３］
（癌抑制遺伝子が正常な細胞に癌遺伝子を導入した肺細胞の検討）
野生型のＣ５７ＢＬ６／ＪマウスからＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を分離した点以外は実験例２～４、８と同様にして細胞を培養し、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した。しかしながら、癌抑制遺伝子が正常なマウスからＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を分離し、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞は、増殖しなかったため、細胞株の樹立及びマウスへの移植は行えなかった。
（癌抑制遺伝子が正常な細胞に癌遺伝子を導入した肺細胞の検討）
野生型のＣ５７ＢＬ６／ＪマウスからＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を分離した点以外は実験例２～４、８と同様にして細胞を培養し、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した。しかしながら、癌抑制遺伝子が正常なマウスからＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞を分離し、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した肺細胞は、増殖しなかったため、細胞株の樹立及びマウスへの移植は行えなかった。
【0130】
この結果は、担癌モデルマウスを作製するためには、癌抑制遺伝子が欠損した細胞に癌遺伝子を導入して移植する必要があることを示す。
【0131】
［実験例１４］
（担癌モデルマウスを用いたクリゾチニブ治療実験）
実験例８で作製した、癌遺伝子であるＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を導入した肺細胞を、胸腺欠損マウスの背部皮下に移植し、担癌モデルマウスを作製した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
（担癌モデルマウスを用いたクリゾチニブ治療実験）
実験例８で作製した、癌遺伝子であるＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を導入した肺細胞を、胸腺欠損マウスの背部皮下に移植し、担癌モデルマウスを作製した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0132】
続いて、１．５ｍＬチューブを３７℃の恒温槽に浸して２０分間静置し、ゲルを溶解させた。続いて、チューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５４００－０５４）を５００μＬ加え、２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置した。
【0133】
その後、再度２００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に浸して１０分間静置し、Ｔｒｙｐｓｉｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ、ロンザ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＣ－５００２）を５００μＬ加えた。
【0134】
続いて、１．５ｍＬチューブを６００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去し、細胞ペレットを得た。続いて、得られた細胞ペレットをＰＢＳで懸濁した。これに、あらかじめ氷上で溶解させておいたマトリゲルを１：１で混合し、５×１０６個／１００μＬとなるように調整した。
【0135】
続いて、胸腺欠損マウスの背部皮下に１箇所ずつ、１００μＬの細胞懸濁液を皮下注射した。
【0136】
続いて、細胞移植から２８日飼育後、腫瘍の形成が認められ、担癌モデルマウスが得られた。続いて、腫瘍形成が確認できた個体に抗癌剤の一種であるクリゾチニブ（１５０ｍｇ／ｋｇ、ファイザー社）を１４日間連続で経口投与した。また、対照として、メチルセルロース（和光、ｃａｔ．ｎｏ．１３１－１７８１１）を１４日間連続で経口投与した群も用意した。各群のマウスの腫瘍体積を継時的に測定した。
【0137】
図１１は、各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図１１中、グラフは平均値±標準誤差を示す。また、横軸はクリゾニチブ又はメチルセルロースの投与開始からの時間（日）を示す。また、「＊」はスチューデントのｔ検定によりＰ＜０．０５で有意差が存在することを示す。その結果、クリゾチニブ投与群では有意に腫瘍増殖が抑制されたことが明らかとなった。
【0138】
［実験例１５］
（肺細胞におけるＳｃａ－１とＬｙ６Ｄ発現の解析）
野生型マウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と３継代目の細胞、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と２継代目の細胞、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫを導入した肺細胞をそれぞれフローサイトメーターで解析した。いずれの細胞も無血清培地を用いて３次元培養した。
（肺細胞におけるＳｃａ－１とＬｙ６Ｄ発現の解析）
野生型マウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と３継代目の細胞、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と２継代目の細胞、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫを導入した肺細胞をそれぞれフローサイトメーターで解析した。いずれの細胞も無血清培地を用いて３次元培養した。
【0139】
抗体、色素としては、以下のものを使用した。ＰＥ－Ｃｙ７標識抗マウスＳｃａ－１抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１２２５１３）、ＰＥ－Ｃｙ７標識ラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（バイオレジェンド社、、ｃａｔ．ｎｏ．４００５２１）、ＰＥ標識抗マウスＬｙ６Ｄ抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１３８６０３）、ＰＥ標識ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール、ＡＰＣ標識抗マウスＥｐＣＡＭラットモノクローナル抗体、ＡＰＣ標識ラットＩｇＧ２ａκアイソタイプコントロール、ＰＩ（シグマ社、ｎｏ．Ｐ４１７０－１０ＭＧ）。
【0140】
図１２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、野生型マウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と３継代目の各細胞を、ＰＩ－ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋集団又はＰＩ－ＥｐＣＡＭ＋集団に限定してＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。
【0141】
図１２（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞の初代培養と２継代目の各細胞を、ＰＩ－ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋集団又はＰＩ－ＥｐＣＡＭ＋集団に限定してＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。
【0142】
図１３（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋肺細胞に、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ又はＥＭＬ４－ＡＬＫを導入した各細胞を、ＰＩ－ＥｐＣＡＭ＋集団に限定してＳｃａ－１とＬｙ６Ｄの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。
【0143】
その結果、無血清培地を用いた３次元培養により、Ｌｙ６ＤもＳｃａ－１と同様に発現が増加し、癌遺伝子導入後もその発現が維持されていることが明らかとなった。
【0144】
［実験例１６］
（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウスの肝臓、胆嚢、肝外胆管の組織及び細胞分離）
肺以外の組織から、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した培養上皮細胞を調製した。具体的には、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウスから、肝臓、胆嚢、肝外胆管を分離した。
（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウスの肝臓、胆嚢、肝外胆管の組織及び細胞分離）
肺以外の組織から、少なくとも１つの癌抑制遺伝子を欠損した培養上皮細胞を調製した。具体的には、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－マウスから、肝臓、胆嚢、肝外胆管を分離した。
【0145】
まず、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、マウス１匹あたり０．３ｍＬのペントバルビタール（最終濃度７．２ｍｇ／ｍＬ、共立製薬、ｃａｔ．ｎｏ．ＳＯＭ０２－ＹＡ１３１２）を腹腔内注射して麻酔した。
【0146】
続いて、マウスを仰臥位に固定し、皮膚を下腹部から心窩部まで正中切開し、左右に皮膚を剥離した。続いて、腹膜を正中及び肋骨弓に沿ってＴ字に切開し、肝臓を露出し、横隔膜に付着している肝鎌状間膜を切離した。続いて、肝臓を横隔膜側へ脱転し、胃、十二指腸、肝十二指腸間膜を露出した。続いて、肝十二指腸間膜内にある肝外胆管を露出し、膵臓上縁から肝門部までの肝外胆管を摘出した。続いて、胆嚢を胆嚢管まで剥離・露出し胆嚢を摘出した。続いて、下大動静脈、横隔膜下の上大動静脈を切断し、肝右葉、中葉、方形葉、左外側葉をまとめて肝臓を摘出した。
【0147】
続いて、摘出した肝臓、胆嚢、肝外胆管を、それぞれ剪刀で細切した後、コラゲナーゼＤ（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ、ロシュ社、ｃａｔ．ｎｏ．１１０８８８６６００１）、ディスパーゼＩＩ（最終濃度０．１２５ｍｇ／ｍＬ、サーモフィッシャー社、ｃａｔ．ｎｏ．１７１０５０４１）、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１００ＭＧ）を添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を入れたコニカルチューブへ移し、３７℃で４５分間振盪した。
【0148】
続いて、１００μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３６０）を通した後、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通した。
【0149】
続いて、３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１００ＭＧ）を入れたＴｒｉｐＬＥＴＭ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１２６０４０２１）１０ｍＬを入れ、３７℃で５分間振盪した。続いて、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通した。続いて、３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１００ＭＧ）を入れた赤血球溶血緩衝液を１０ｍＬ加え、５分間、４℃で静置した。
【0150】
続いて、３００×ｇで５分間遠心した。続いて、上清を除去した後、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１００ＭＧ）、Ｙ２７６３２（最終濃度１０μＭ、ミルテニーバイオテク社、ｃａｔ．ｎｏ．１３０－１０６－５３８）、ペニシリン（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、ストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、アンホテリシンＢ（最終濃度０．２５μｇ／ｍＬ、ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５２４０－０６２）を入れた１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ（洗浄バッファー）で懸濁し、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通し、肝臓、胆嚢、肝外胆管に由来する細胞をそれぞれ得た。
【0151】
［実験例１７］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の分離）
実験例１６で調製した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞から、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）を用いて、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及びＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆嚢上皮細胞をそれぞれ分離した。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の分離）
実験例１６で調製した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞から、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）を用いて、ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及びＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆嚢上皮細胞をそれぞれ分離した。
【0152】
抗体及び色素としては、以下のものを使用した。ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３１ラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１０２４０６）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４５ラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１０３１０８）、ＦＩＴＣ標識ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．４００５０５）、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）ラットモノクローナル抗体（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．１１８２１４）、ＡＰＣ標識ラットＩｇＧ２ａκアイソタイプコントロール（バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．４００５１２）、ＰＩ（シグマ社、ｎｏ．Ｐ４１７０－１０ＭＧ）。
【0153】
［実験例１８］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の培養）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分静置してゲル化させた。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の培養）
あらかじめ５０μＬのマトリゲル（コーニング社、ｃａｔ．ｎｏ．３５６２３０）を０．４μｍセルカルチャーインサート（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５３０９５）に入れ、３７℃で３０分静置してゲル化させた。
【0154】
基本培地として、無血清培地である、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ、バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．５９６４０２）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック社、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ－１００－１５）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ、バイオレジェンド社、ｃａｔ．ｎｏ．５５９３０２）、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ １（最終濃度０．５μｇ／ｍＬ、ミルテニーバイオテク社、ｃａｔ．ｎｏ．１３０－１０５－７９９）、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（最終濃度１０ｍＭ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．Ｎ０６３６－１００Ｇ）、１×Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１２５８７－０１０）、Ｙ２７６３２（最終濃度１０μＭ、ミルテニーバイオテク社、ｃａｔ．ｎｏ．１３０－１０６－５３８）を使用した。
【0155】
実験例１７で分離した細胞の細胞数をカウントした後、６００×ｇ、５分間遠心した。続いて、得られた細胞ペレットを基本培地中で懸濁し、５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁した。
【0156】
続いて、１つのインサートにつき２００μＬの細胞懸濁液を播種し、インサート下のウェルに４００μＬの基本培地を加え３次元培養した。２～３日おきに基本培地で培地交換を行った。
【0157】
［実験例１９］
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の継代）
コンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加え、１０００μＬピペットで撹拌、ピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の継代）
コンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加え、１０００μＬピペットで撹拌、ピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0158】
続いて、チューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、ＴｒｉｐＬＥＴＭ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１２６０４０２１）を１ｍｌ加え、１０００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に５分間静置した。
【0159】
続いて、再度１０００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通した。続いて、チューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、１０００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加えた。
【0160】
続いて、チューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、２×１０４個の細胞ペレットあたり１００μＬのマトリゲルを加えて懸濁し、インサートに細胞懸濁液を播種し、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。続いて、インサート下のウェルに５００μＬの基本培地を加えて３次元培養した。２～３日おきに基本培地で培地交換を行った。
【0161】
［実験例２０］
（胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞への癌遺伝子導入）
あらかじめ５０μＬのマトリゲルを０．４μｍセルカルチャーインサートに入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
（胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞への癌遺伝子導入）
あらかじめ５０μＬのマトリゲルを０．４μｍセルカルチャーインサートに入れ、３７℃で３０分間静置してゲル化させた。
【0162】
続いて、３～４継代したＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆管上皮細胞及びＣＤ３１－ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋胆嚢上皮細胞を、継代する際と同様の手技でそれぞれ細胞ペレットにした。
【0163】
続いて、実験例７で作製したウイルス液を解凍したものを添加し、２×１０４個／２００μＬとなるように懸濁した。続いて、１つのインサートにつき２００μＬの細胞懸濁液を播種し、インサート下のウェルに４００μＬの基本培地を加えて３次元培養した。３日後に基本培地で培地交換を行い、７日後に継代を行った。
【0164】
ウイルス感染から１４日後、継代する際と同様の手技で細胞ペレットを得た。続いて、細胞ペレットをＰＩ（最終濃度０．１μｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ－アルドリッチ社、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＮ２５－１００ＭＧ）、Ｙ２７６３２（最終濃度１０μＭ、ミルテニーバイオテク社、ｃａｔ．ｎｏ．１３０－１０６－５３８）、ペニシリン（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、ストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク、ｃａｔ．ｎｏ．２６２５３－８４）、アンホテリシンＢ（最終濃度０．２５μｇ／ｍＬ、ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１５２４０－０６２）を入れた洗浄バッファーで懸濁し、フローサイトメーター（型式「ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマンコールター社）でＧＦＰ陽性細胞を分離した。
【0165】
分離した細胞をマトリゲルに懸濁し、インサート上に播種した。インサート下のウェルに５００μＬの基本培地を加えて３次元培養し、２～３日おきに培地交換を行った。細胞のコロニーは１週間程度でコンフルエントになった。近フル塩とになった細胞を、
実験例１９と同様の方法で継代した。
実験例１９と同様の方法で継代した。
【0166】
［実験例２１］
（癌遺伝子を導入した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の移植（肝内））
実験例２０で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞を、それぞれ野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの肝内に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
（癌遺伝子を導入した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞の移植（肝内））
実験例２０で作製した、癌遺伝子ＫＲＡＳＧ１２Ｖを導入した胆管上皮細胞及び胆嚢上皮細胞を、それぞれ野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの肝内に移植した。具体的には、まず、細胞がコンフルエントに至ったインサートの培地を除去し、３００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加え、１０００μＬピペットで撹拌及びピペッティングしてゲルを崩し、１．５ｍＬチューブにコロニーを回収した。
【0167】
続いて、１．５ｍＬチューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、ＴｒｉｐＬＥＴＭ（ギブコ社、ｃａｔ．ｎｏ．１２６０４０２１）を１ｍＬ加え、１０００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして３７℃の恒温槽に５分間静置した。
【0168】
続いて、再度１０００μＬピペットで５０～６０回ピペッティングして、４０μｍのセルストレイナー（ファルコン社、ｃａｔ．ｎｏ．３５２３４０）を通した。続いて、チューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、１０００μＬのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｗｉｔｈ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光、ｃａｔ．ｎｏ．０４８－２９７８５）を加えた。続いて、チューブを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、５×１０４個の細胞ペレットあたり５０μＬのマトリゲルを加えて懸濁し、４℃で静置した。
【0169】
続いて、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに対して、メデトミジン０．０３ｍｇ／ｍＬ、ミダゾラム０．４ｍｇ／ｍＬ及びブトルファノール０．５ｍｇ／ｍＬを含む麻酔液をマウス体重（ｇ）あたり１０μＬ腹腔内注射し麻酔した。
【0170】
続いて、腹側正中皮膚を約１ｃｍ切開し、肝直上の腹膜を切開し、肝左外側葉を腹腔外へ引き出した。続いて、２９Ｇ注射針付きシリンジを刺入し、準備しておいたマトリゲル５０μＬと懸濁した細胞を注入した。注入後、圧迫止血を行った。続いて、肝を腹腔内に戻し、腹膜を１針、皮膚を２針縫合し閉創した。
【0171】
細胞移植から２８日飼育後、各マウスを安楽死させて肝臓を露出させ、観察した。図１４（ａ）は、癌遺伝子を導入した胆管上皮細胞を移植したマウスの肝臓の写真である。その結果、肝臓に腫瘍が形成されたことが確認された。図１４（ａ）中矢印は腫瘍が形成された部位を示す。
【0172】
【0173】
【0174】
【0175】
以上の結果から、癌遺伝子を導入した胆管上皮細胞を野生型のマウスに移植することにより、担癌モデルを作製することができることが明らかとなった。
【0176】
また、癌遺伝子を導入した胆嚢上皮細胞を野生型のマウスに移植することによっても、担癌モデルを作製することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0177】
本発明によれば、多様な遺伝子変異を持つ癌細胞を作製することができ、更に免疫系が正常な担癌動物モデルを、容易に作製する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
