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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-13
(45)【発行日】2022-12-21
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20221214BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20221214BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221214BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221214BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221214BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20221214BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20221214BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20221214BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/09
C12N5/10
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
C12N15/113 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021512982
(86)(22)【出願日】2019-01-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-02
(86)【国際出願番号】 CN2019072285
(87)【国際公開番号】W WO2019214290
(87)【国際公開日】2019-11-14
【審査請求日】2020-11-17
(31)【優先権主張番号】201810436500.8
(32)【優先日】2018-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520434927
【氏名又は名称】河北森朗生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】李 建強
(72)【発明者】
【氏名】王 慶龍
(72)【発明者】
【氏名】王 琳
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】J.Immunol.,2009,182(12),p.8118-8124
【文献】BMC Cancer,2017,17(1):551,p.1-17
【文献】医学のあゆみ，2013年，Vol.244, No.9，p.854-860
【文献】BMC Cancer，2017年，Vol.17, No.551，p.1-17
【文献】医学のあゆみ，2012年，Vol.243, No.6，p.543-544
【文献】BoneKEy-Osteovision，2006年，Vol.3, No.8，p.5-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
Ｃ１２Ｎ ５／０９
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １５／８６７
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡを腫瘍細胞に導入して、ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞を得て、前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞をγδ Ｔ細胞培養系に加え、培養して培養系を得るステップ１）と、キメラ抗原受容体を発現するベクターを前記培養系に加え、培養してＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップ２）と、
を含む、ことを特徴とするＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法。
【請求項2】
前記ステップ１）において、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ２）において、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加える、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ステップ２）において、前記キメラ抗原受容体を発現するベクターは、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法に従って生産したＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を含む、腫瘍を免疫して治療するための医薬。
【請求項6】
レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション率を向上させるために使用される、活性成分がＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞である製品であって、
前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡを腫瘍細胞に導入して得られたものである、製品。
【請求項7】
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記腫瘍細胞は慢性骨髄性白血病細胞系である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記慢性骨髄性白血病細胞系はＫ５６２細胞である、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである、ことを特徴とする請求項６に記載の製品。
【請求項11】
前記腫瘍細胞は慢性骨髄性白血病細胞系である、ことを特徴とする請求項６に記載の製品。
【請求項12】
前記慢性骨髄性白血病細胞系はＫ５６２細胞である、ことを特徴とする請求項１１に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
養子細胞免疫療法は、体外培養、活性化、遺伝子修飾された自家または他家免疫細胞を患者に返送して抗腫瘍活性を発揮させるために用いることである。キメラ抗原受容体（ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）で修飾されたＴ細胞治療技術（ＣＡＲ－Ｔ技術）は、遺伝子工学技術により免疫エフェクター細胞を修飾することで、修飾された細胞が抗原を発現する標的細胞を特異的に認識して殺傷でき、腫瘍細胞を特異的に除去するという目的を達成する。Ｂリンパ球の表面マーカーＣＤ１９分子を特異的に標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂリンパ球悪性腫瘍の治療における治療効果が最も顕著であり、再発すると治療しにくいＢ系急性リンパ球白血病患者の９０％を完全に緩和することができる。現在、ＣＤ１９抗原に対するＣＡＲ－Ｔ細胞によるＢリンパ球性腫瘍の治療は、極めて高い短期的な治療効果を有するが、一部の患者は、治療が完全に緩和された後にも再発する。再発の１つの重要な原因は、注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞が有効な抗原の刺激に欠け、患者体内の数が減少しつつあり、長期的な抗腫瘍活性を保持することができないためである。
【0003】
従来のＣＡＲ－Ｔ技術は、αβ Ｔ細胞の天然活性に基づいて設計されたものであり、一般的に修飾するエフェクター細胞はαβ Ｔ細胞である。αβ Ｔ細胞が他家に導入されると、重篤な移植片対宿主病を引き起こすため、現在のＣＡＲ－Ｔ治療技術は、自家細胞治療を主とすることが多く、臨床応用の柔軟性を大きく制限し、治療コストを大きく向上させる。一方、γδ Ｔ細胞は重篤な移植片対宿主病を引き起こさないため、汎用型ＣＡＲ－Ｔ製品の開発のより良好な選択である。
【0004】
αβ Ｔ細胞により媒介されたのは適応免疫応答であり、効果的に活性化して対応する免疫学的機能を発揮するためにリンパ球の再循環を完了する必要がある。一方、γδ Ｔ細胞により媒介されたのは天然免疫応答であり、抗原抗体が反応する部位で免疫学的効果を即時に発揮することができるため、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の潜在的な抗腫瘍作用は、より直接かつより迅速であり、腫瘍部位の局所的な注射により腫瘍を除去し、オフターゲット効果による強い有害反応を回避することができる。また、αβ Ｔ細胞は、多様性のαβ ＴＣＲを用いて主要組織適合複合体（ＭＨＣ）により提示された抗原の短いペプチドを認識する。天然の場合、１つの特定のＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識するαβ Ｔ細胞の数は非常に少ないため、特定の抗原に対する免疫応答能力を発揮するために数量的な増幅が必要となる。一方、γδ Ｔ細胞は数が少ないＴリンパ球のサブクラスであり、多くのγδ ＴＣＲは非ペプチド化合物を認識し、ＭＨＣの提示が不要である。αβ ＴＣＲ可変領域の多様性の構成と異なり、γδ ＴＣＲの可変領域の多様性は非常に限られているため、αβ Ｔ細胞の総数がγδ Ｔ細胞よりも遥かに多いが、１つの特定の化合物または抗原に対して認識能力を持つ特定のＴ細胞の数を比較すると、γδ Ｔ細胞はαβ Ｔ細胞よりも高い。
【0005】
ヒトおよび他の霊長類動物のγδ Ｔ細胞は、主にＶδ１およびＶγ９δ２という２つのサブクラスを含み、それぞれ表面に発現するＴＣＲの種類を表す。Ｖδ１は組織に分布され、末梢のγδ Ｔ細胞は主にＶγ９δ２のサブクラスである。２種類の細胞の抗原認識モードは全く異なり、Ｖδ１ ＴＣＲが認識する抗原の種類は、現在、争議があり、Ｖγ９δ２ ＴＣＲが自体または外因性の小分子リン酸化抗原を認識し、例えば、ＨＭＢＰＰ（細菌由来）、ＩＰＰ（ヒト由来）、およびＢｒＨＰＰ（人工合成）（Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｗ．ａｎｄ Ｎ．Ｌ．Ｌｅｔｖｉｎ，２００３．５（６）：ｐ．４９１～８；Ｅｂｅｒｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００３．５４４（１～３）：ｐ．４～１０；Ｋａｂｅｌｉｔｚ，Ｄ．，Ｄ．Ｗｅｓｃｈ，ａｎｄ Ｗ．Ｈｅ，２００７．６７（１）：ｐ．５～８；Ｓｉｒｅｃｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，２００１．３１（５）：ｐ．１６２８～３５）を認識する。Ａｍｉｎｏ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ化合物類の薬剤Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（Ｚｏｌ、ゾメタ）およびＰａｍｉｄｏｒｎａｔｅは、ＦＰＰシンターゼ（ＦＰＰＳ）を抑制することができ、ＨＭＧ－ＣｏＡの代謝経路を阻害し、下流生成物ＩＰＰが体内または細胞内に凝集するため、体内または体外でＶγ９δ２ Ｔ細胞を効果的に刺激して活性化させることができる（Ｋｕｎｚｍａｎｎ，Ｖ．ａｎｄＭ．Ｗｉｌｈｅｌｍ，２００５．４６（５）：ｐ．６７１～８０）。
【0006】
γδ Ｔ細胞は、有する天然活性によりＣＡＲ－Ｔ細胞治療の優れたベクターとなるが、細胞含有量が低く、体外での大規模増殖技術の困難度が大きく、トランスフェクション率が低い等の制限により、今まで、ＣＡＲで修飾されたγδ Ｔ細胞が臨床的に成功して適用されたという報告は未だにない。固相ａｎｔｉ－ｐａｎ ＴＣＲ γδ抗体の増殖、またはＩＰＰ／ＨＭＢＰＰ／ＺＯＬを用いてＶγ９δ２ Ｔ細胞を選択的に増殖することを含む従来のγδ Ｔ細胞体外増殖技術は、いずれも末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から増殖し、γδ Ｔ細胞の占有する割合が低いため、遺伝子トランスフェクションは他の無関係細胞により干渉されてトランスフェクション率は低くなる。また、ＰＢＭＣから増殖される最終製品は純度が低く、αβ Ｔ細胞が混在しやすく、汎用型ＣＡＲ－Ｔ製品の開発に不利である。γδ Ｔ細胞を選別精製することは以上の問題を解決できるが、他の細胞の補助が欠け、活性化および増殖効率は大きく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明が解決しようとする技術的問題は、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を大規模に生産して臨床的な腫瘍の免疫治療に用いることを実現するために、γδ Ｔ細胞の増殖効率をどのように向上させるかである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、まず、γδ Ｔ細胞の増殖方法を提供する。
【0009】
本発明に係るγδ Ｔ細胞の増殖方法は、γδ Ｔ細胞培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞を加えるステップを含む。
【0010】
上記方法において、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である。
【0011】
更に、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は３：１である。
【0012】
上記方法は、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～１０００）ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを含む。
【0013】
更に、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、３日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～３００）ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを含む。
【0014】
更に、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、３日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を２００ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを含む。
【0015】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法を更に提供する。
【0016】
本発明に係るＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法は、キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養し、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップと、前記培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞が含まれるステップとを含む。
【0017】
上記方法において、前記キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養する方法は、
１）ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞をγδ Ｔ細胞培養系に加え、培養して培養系を得るステップと、
２）キメラ抗原受容体を発現するベクターを前記培養系に加え、培養して前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップと、
を含む。
１）ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞をγδ Ｔ細胞培養系に加え、培養して培養系を得るステップと、
２）キメラ抗原受容体を発現するベクターを前記培養系に加え、培養して前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップと、
を含む。
【0018】
上記方法において、前記１）において、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である。
【0019】
更に、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は３：１である。
【0020】
上記方法において、前記１）において、前記培養の条件は、３７℃、５％のＣＯ２で２日間培養することである。
【0021】
上記方法において、前記１）において、前記γδ Ｔ細胞培養系は、ＴｅｘＭＡＣＳ培地およびヒト組み換えＩＬ－２で構成され、前記ヒト組み換えＩＬ－２のγδ Ｔ細胞培養系における濃度は２００Ｕ／ｍｌである。
【0022】
上記方法において、前記２）において、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～１０００）ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを更に含む。
【0023】
更に、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～３００）ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを更に含む。
【0024】
更に、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップと、ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を２００ＩＵ／ｍＬとすることであるステップとを更に含む。
【0025】
上記方法において、前記２）において、前記培養の条件は、３７℃、５％のＣＯ２で１０～１４日間培養することである。
【0026】
上記方法において、前記２）において、前記キメラ抗原受容体を発現するベクターは、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターである。
【0027】
前記キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを前記培養系に加える前に、包装のステップを更に含む。前記包装の方法は、具体的に、以下のステップに従って行うことができる。２－１）細胞シャーレ毎に４．５×１０６個の２９３ＦＴ細胞および９ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を加え、均一に混合し、細胞インキュベータで培養する。２－２）培養してから２日目に、５００μＬのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標） ｂｕｆｆｅｒ、６μｇのキメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクター、３μｇのｐｓＰＡＸ２、および１．５μｇのｐＭＤ２．Ｇという試薬をシャーレ毎に加え、均一に混合した後、系にｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）を加え、２５μＬ／１０ｃｍのシャーレで再び均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置し、混合液を得る。２－３）ウイルスを包装するための２９３ＦＴ細胞を細胞インキュベータから取り出し、混合液をシャーレ毎に平均に入れ、均一に混合し、細胞インキュベータに入れて培養し続ける。４ｈ培養した後、古い培地を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、更に１０％（体積分率）のＦＢＳを含むＤＭＥＭ完全培地を加え、細胞インキュベータに入れて培養する。２－４）４８～７２ｈ培養した後、培養上清を収集してウイルス原液とし、収集したウイルス原液を遠心管に濾過し、遠心して上清液を捨て、沈殿にＤＭＥＭ完全培地（加える培地とウイルス原液との体積比は１：５００である）を加えてウイルス粒子を再懸濁し、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルス粒子を得る。
【0028】
前記キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを前記培養系に加えた後、遠心のステップを更に含む。
【0029】
前記遠心の条件は、具体的に、３５℃、２０００ｒｐｍで２ｈ遠心することである。
【0030】
更に、前記キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターは、キメラ抗原受容体のコード遺伝子をレンチウイルス発現ベクターのマルチプルクローニング部位の間に挿入して得られたものである。前記レンチウイルス発現ベクターは本分野でよく使用されるものであれば良い。
【0031】
更に、前記レンチウイルス発現ベクターはＳｅｎｌ＿ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１である。前記キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターは、キメラ抗原受容体のコード遺伝子をレンチウイルスベクターＳｅｎｌ＿ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１のＰａｃＩとＳｐｅＩとの酵素切断部位の間に挿入して得られたベクターである。
【0032】
前記Ｓｅｎｌ＿ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１ベクターは、元のプラスミドのクローニング部位の両側に酵素切断部位ＰａｃＩおよびＳｐｅＩを追加した後に得られたベクターであり、元のプラスミドの名称はＬＶ－ｐＲＲＬＥＦ１．ＷＰＲＥ（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入される）である。
【0033】
上記方法において、前記キメラ抗原受容体の標的とする腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＩＧＦ１Ｒおよび／またはＬ１ＣＡＭを含んでもよいが、これらに限定されない。
【0034】
本発明の具体的な実施例において、前記キメラ抗原受容体は腫瘍抗原ＣＤ２２を標的とし、前記腫瘍抗原ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体のアミノ酸配列は配列表における配列３であり、コード遺伝子配列は配列表における配列４である。
【0035】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、腫瘍を免疫して治療する方法を更に提供する。
【0036】
本発明に係る腫瘍を免疫して治療する方法は、
（１）上記方法に従ってＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産するステップと、
（２）前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を腫瘍患者の体内に返送し、前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞により前記腫瘍患者の体内の腫瘍細胞を認識して殺傷し、更に腫瘍を免疫して治療するという目的を実現するステップと、
を含む。
（１）上記方法に従ってＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産するステップと、
（２）前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を腫瘍患者の体内に返送し、前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞により前記腫瘍患者の体内の腫瘍細胞を認識して殺傷し、更に腫瘍を免疫して治療するという目的を実現するステップと、
を含む。
【0037】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、最後に製品を更に提供する。
【0038】
本発明に係る製品の活性成分は、ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞であり、
前記製品の機能は、
Ｂ１）γδ Ｔ細胞の増殖を促進することと、
Ｂ２）γδ Ｔ細胞の分化を促進することと、
Ｂ３）ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産することと、
Ｂ４）レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション率を向上させることと、
Ｂ５）腫瘍を免疫して治療することと、
のいずれかである。
前記製品の機能は、
Ｂ１）γδ Ｔ細胞の増殖を促進することと、
Ｂ２）γδ Ｔ細胞の分化を促進することと、
Ｂ３）ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産することと、
Ｂ４）レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション率を向上させることと、
Ｂ５）腫瘍を免疫して治療することと、
のいずれかである。
【0039】
上記方法または製品において、前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質を腫瘍細胞に導入して得られたものである。
【0040】
更に、前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、レンチウイルスベクターにより腫瘍細胞に導入される。
【0041】
更に、前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡである。
【0042】
本発明の具体的な実施例において、前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、
前記一本鎖ＲＮＡは配列表の配列２に示すとおりであり、前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである。前記一本鎖ＲＮＡのコード遺伝子配列は配列表の配列１に示すとおりである。
前記一本鎖ＲＮＡは配列表の配列２に示すとおりであり、前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである。前記一本鎖ＲＮＡのコード遺伝子配列は配列表の配列１に示すとおりである。
【0043】
上記方法または製品において、前記腫瘍細胞はよく見られる腫瘍細胞であり、例えば、慢性骨髄性白血病細胞系である。本発明において、前記腫瘍細胞は、具体的に、Ｋ５６２細胞である。
【0044】
上記方法または製品において、前記γδ Ｔ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。前記γδ Ｔ細胞はＰＢＭＣから選別されたγδ陽性Ｔ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】Ｕ６－ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡレンチウイルスのプラスミド構造図である。
【図2】Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔで腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ、Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢ細胞、および野生型Ｋ５６２細胞内のＦＰＰＳとハウスキーピング遺伝子β－ｔｕｂｕｌｉｎのタンパク質発現レベルを検出する図である。
【図3】γδ Ｔ細胞の選別前後のγδ Ｔ細胞がＣＤ３＋細胞を占有する百分率である。
【図4】Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳがγδ Ｔ細胞の体外分化を刺激する図であり、ＣＦＳＥでＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ、Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢおよびＫ５６２細胞をそれぞれマーキングし、それぞれ選別後のγδ陽性Ｔ細胞およびγδ陰性Ｔ細胞と混合し、γδ Ｔ細胞とＫ５６２細胞との個数比はいずれも３：１であり、Ｋ５６２グループに１０μＭのＺｏｌｅｄｒｏｎａｔｅを陽性対照として加え、７２時間培養した後、フローサイトメータで異なるグループの細胞ＣＦＳＥの蛍光強度（横軸）を検出する。
【図5】Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳとの共培養により、選別されたγδ Ｔ細胞を大量に増殖させる図であり、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ、Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢ、およびＫ５６２細胞は、それぞれ選別後のγδ陽性Ｔ細胞と混合して培養し、異なる時間の細胞数を計数する。γδ陽性Ｔ細胞とＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳまたはＫ５６２－ｓｈＳＲＢまたはＫ５６２細胞との個数比はいずれも５：１であり、Ｋ５６２グループに１０μＭのＺｏｌｅｄｒｏｎａｔｅを陽性対照として加える。
【図6】ＣＡＲ配列を持つレンチウイルスのプラスミド構造図である。
【図7】Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳと選別されたγδ Ｔ細胞とを共培養することにより、ＣＡＲのトランスフェクション効率を著しく向上させることができる図である。
【図8】Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳとの共培養により生産されたＣＡＲ＋γδ Ｔ細胞は、ＣＤ２２を発現する細胞に対して特異的に応答し、より多くのＩＦＮ－γを分泌し、より多くのＣＤ１３７を細胞表面に発現する図である。
【図9】Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳとの共培養により生産されたＣＡＲ＋γδ Ｔ細胞は、ＣＤ２２の腫瘍細胞を特異的に分解して発現することができる図である。
【発明を実施するための形態】
【0046】
下記実施例に使用される実験方法は、特に断りのない限り、いずれも通常の方法である。
【0047】
下記実施例に使用される材料、試薬等は、特に断りのない限り、いずれも商業的に入手可能である。
【0048】
実施例１、γδ Ｔ細胞の増殖方法
【0049】
一、ＦＰＰＳ発現量が低下したＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ腫瘍細胞系の構築
【0050】
１、レンチウイルスの組み換えプラスミドの構築
（１）組み換えプラスミドの調製
Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．のＶｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒシステムのＵ６－ｂａｓｅｄｓｈＲＮＡ構築システムを用いてレンチウイルスの組み換えプラスミドを構築した。具体的なステップは以下のとおりであった。
（１）組み換えプラスミドの調製
Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．のＶｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒシステムのＵ６－ｂａｓｅｄｓｈＲＮＡ構築システムを用いてレンチウイルスの組み換えプラスミドを構築した。具体的なステップは以下のとおりであった。
【0051】
ＦＰＰＳを標的とする特異的なｓｈＲＮＡコード配列（ｓｈＦＰＰＳ）を設計して合成して実験グループとした。
ＣＣＴＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴＡＡＣＣＴＴＡＧＧ（配列１）
（ただし、中間に太らせた６ｂｐ配列はステムループ配列であり、その左側の２１ｂｐはセンス配列であり、右側の２１ｂｐ配列はアンチセンス配列である。）
それと同時に、以下のようなＳｃｒａｍｂｌｅ－ｓｈＲＮＡコード配列（ｓｈＳＲＢ）を合成して陰性対照グループとした。
ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧ（配列５）
（ただし、中間に太らせた６ｂｐ配列はステムループ配列であり、その左側の２１ｂｐはセンス配列であり、右側の２１ｂｐ配列はアンチセンス配列である。）
ＣＣＴＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴＡＡＣＣＴＴＡＧＧ（配列１）
（ただし、中間に太らせた６ｂｐ配列はステムループ配列であり、その左側の２１ｂｐはセンス配列であり、右側の２１ｂｐ配列はアンチセンス配列である。）
それと同時に、以下のようなＳｃｒａｍｂｌｅ－ｓｈＲＮＡコード配列（ｓｈＳＲＢ）を合成して陰性対照グループとした。
ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧ（配列５）
（ただし、中間に太らせた６ｂｐ配列はステムループ配列であり、その左側の２１ｂｐはセンス配列であり、右側の２１ｂｐ配列はアンチセンス配列である。）
【0052】
以上のｓｈＲＮＡコード配列をそれぞれ合成し、それぞれをＵ６－Ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎレンチウイルスプラスミド（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入され、カタログ番号ＬＶ－ＳＧＦＰ－０１０２）におけるＵ６プロモーターの下方にクローニングし、組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ取得した。また、組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢにＮｅｕｍｙｃｉｎｅ抵抗遺伝子を導入し、陽性細胞の選別に用いた。組み換えプラスミドの構造は図１に示すとおりであった。
【0053】
（２）組み換えプラスミドの同定
Ｕ６プロモーターのユニバーサルプライマーを用いて組み換えプラスミドを同定し、ＰＣＲ同定が正しい組み換えプラスミドに対して配列決定検証を行った。ｓｈＦＰＰＳ二本鎖ＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドをレンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳと命名し、ｓｈＳＲＢ二本鎖ＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドをレンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＳＲＢと命名した。レンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳが発現するｓｈＦＰＰＳのＲＮＡ配列は、
ＣＣＵＡＡＧＧＵＵＡＡＧＵＣＧＣＣＣＵＣＧＣＵＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＵＵＡＡＣＣＵＵＡＧＧ（配列２）
であり、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりであった。
Ｕ６プロモーターのユニバーサルプライマーを用いて組み換えプラスミドを同定し、ＰＣＲ同定が正しい組み換えプラスミドに対して配列決定検証を行った。ｓｈＦＰＰＳ二本鎖ＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドをレンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳと命名し、ｓｈＳＲＢ二本鎖ＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドをレンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＳＲＢと命名した。レンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳが発現するｓｈＦＰＰＳのＲＮＡ配列は、
ＣＣＵＡＡＧＧＵＵＡＡＧＵＣＧＣＣＣＵＣＧＣＵＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＵＵＡＡＣＣＵＵＡＧＧ（配列２）
であり、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりであった。
【0054】
２、レンチウイルスの組み換えプラスミドの包装
レンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ包装し、レンチウイルス粒子ｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ得た。具体的なステップは以下のとおりであった。
レンチウイルスの組み換えプラスミドｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ包装し、レンチウイルス粒子ｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ得た。具体的なステップは以下のとおりであった。
【0055】
（１）８０％～９０％まで成長した２９３ＦＴ細胞培養用フラスコ（Ｔ１７５）を３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータから取り出し、消化後に細胞を収集して洗浄し、１０ｃｍの細胞シャーレ毎に４．５×１０６個の細胞および９ｍＬのＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入され、製品のカタログ番号１１９６５－０８４）を加え、均一に軽く振って、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに入れて培養した。
【0056】
（２）培養してから２日目に、５００μＬのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標） ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社から購入され、製品のカタログ番号Ｂ１６１１１６）、６μｇのレンチウイルスの組み換えプラスミド、３μｇのｐｓＰＡＸ２（武漢▲ミャオ▼霊バイオテクノロジー有限公司から購入され、製品のカタログ番号Ｐ０２６）、および１．５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（広州ｇｅｎｅｓｅｅｄバイオテクノロジー股フン有限公司から購入され、製品のカタログ番号１６１２２０Ｌ０８）という試薬をシャーレ毎に加え、均一に混合した後、系にｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社から購入され、製品のカタログ番号１１４－１５）を更に加え、２５μＬ／１０ｃｍのシャーレで再び均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置し、混合液を得た。
【0057】
（３）ウイルスを包装するための２９３ＦＴ細胞を３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータから取り出し、混合液をシャーレ毎に平均に入れ、均一に軽く振って、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに入れて培養し続けた。４ｈ培養した後、古い培地を捨て、５ｍＬの予熱したＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、新鮮な予熱した１０％（体積分率）のＦＢＳを含む９ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を更に加え、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに入れて培養した。
【0058】
（４）４８～７２ｈ培養し続けた後、培養上清を収集してウイルス原液とし、収集したウイルス原液を０．４５μｍのフィルタで５０ｍＬの遠心管に濾過し、４℃、１８５００ｇで２ｈ高速遠心した。上清液を捨て、沈殿にＤＭＥＭ完全培地（加える培地とウイルス原液との体積比は１：５００である）を加えてウイルス粒子を再懸濁し、ウイルス濃縮液となった。
【0059】
（５）ウイルス濃縮液を２００μＬ／チューブで分注し、また、１０μＬを残してウイルス力価試験を行った。分注した濃縮液を－８０℃の冷蔵庫に置いて保存した。
【0060】
３、レンチウイルス粒子の標的細胞へのトランスフェクション
レンチウイルス粒子ｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ標的細胞にトランスフェクションし、腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳおよび対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢをそれぞれ得た。具体的なステップは以下のとおりであった。
レンチウイルス粒子ｓｈＦＰＰＳおよびｓｈＳＲＢをそれぞれ標的細胞にトランスフェクションし、腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳおよび対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢをそれぞれ得た。具体的なステップは以下のとおりであった。
【0061】
（１）Ｋ５６２細胞を３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータから取り出し、３×１０５／５００μＬ培地／ウェルで２４ウェルプレートに敷き、合計１２ウェルに敷き、培地はＲＰＭＩ１６４０（ｇｉｂｃｏ社から購入され、製品のカタログ番号２２４００－０８９）＋１０％（体積分率）のＦＢＳ（ＥｘｃｅｌｌＢｉｏ社から購入され、製品のカタログ番号ＦＮＤ５００）であった。
【0062】
（２）１２個のウェルから６ウェルを実験グループとして選択してレンチウイルストランスフェクションを行い、残りの６ウェルを対照グループとした。実験グループは、ウェル毎に１‰のＰｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社から購入され、製品のカタログ番号Ｐ３３６９－１０Ｇ）および５μＬのｓｈＦＰＰＳウイルス濃縮液を加え、操作台で「文字８」を描き、均一に軽く混合した。対照グループに５μＬのｓｈＳＲＢウイルス濃縮液を加えた。
【0063】
（３）遠心機を３５℃に予熱し、ウイルス濃縮液が加えられたＫ５６２細胞を遠心機に移して遠心し、遠心パラメータを２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、上昇４降下４、２ｈとし、遠心が終了した後、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに入れて培養し続けた。
【0064】
（４）４８ｈ培養した後、実験グループおよび対照グループを、それぞれ低濃度４００μｇ／ｍＬ、中濃度８００μｇ／ｍＬ、高濃度１２００μｇ／ｍＬという３つの勾配でＧ４１８を加え、それぞれに２つのウェルを設けた。
【0065】
（５）培地の色および細胞の成長状況に応じ、３～５日間毎に対応する選別培地を１回交換した。対照ウェルの細胞が全て死滅したまでになっても対応する実験グループに生細胞が依然として存在する場合、生細胞を収集して拡大培養した。
【0066】
結果により、Ｋ５６２細胞のＧ４１８の最適な選別濃度は８００μｇ／ｍＬであることが示された。拡大培養された細胞は、レンチウイルス粒子ｓｈＦＰＰＳまたはｓｈＳＲＢに感染したＫ５６２細胞であった。
【0067】
４、ｓｈＦＰＰＳに感染した細胞ＦＰＰＳのタンパク質発現レベルの変化の検出
１．５×１０６個のＧ４１８で選別されたＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳおよびＫ５６２－ｓｈＳＲＢ腫瘍細胞、および野生型Ｋ５６２細胞を取り、遠心した後、５０μＬの細胞分解液を加えて細胞を分解し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔでＦＰＰＳのタンパク質発現レベルの変化を検出した。ＦＰＰＳのタンパク質を検出する抗体はＡｂｇｅｎｔ社のウサギ抗ヒトＦＰＰＳのポリクローナル抗体（動物番号ＲＢ４７８６）であり、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質β－ｔｕｂｕｌｉｎを検出する抗体は、ＢＤ社のマウス抗ヒトモノクローナル抗体（クローン番号５Ｈ１）であった。
１．５×１０６個のＧ４１８で選別されたＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳおよびＫ５６２－ｓｈＳＲＢ腫瘍細胞、および野生型Ｋ５６２細胞を取り、遠心した後、５０μＬの細胞分解液を加えて細胞を分解し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔでＦＰＰＳのタンパク質発現レベルの変化を検出した。ＦＰＰＳのタンパク質を検出する抗体はＡｂｇｅｎｔ社のウサギ抗ヒトＦＰＰＳのポリクローナル抗体（動物番号ＲＢ４７８６）であり、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質β－ｔｕｂｕｌｉｎを検出する抗体は、ＢＤ社のマウス抗ヒトモノクローナル抗体（クローン番号５Ｈ１）であった。
【0068】
結果は図２に示すとおりであった。図から見られるように、Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢ細胞のＦＰＰＳの発現レベルは野生型Ｋ５６２細胞と有意差がなく、ｓｈＦＰＰＳを発現するＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞のＦＰＰＳの発現レベルは野生型Ｋ５６２細胞と比べて著しく低下した。
【0069】
二、γδ Ｔ細胞の体外増殖方法
【0070】
１、γδ Ｔ細胞の選別
新鮮な分離された成人の末梢血または臍帯血由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を取り、γδ Ｔ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０９２－８９２）を用いてキットの明細書における操作に従ってＰＢＭＣからγδ Ｔ細胞を選別し、γδ陽性Ｔ細胞を取得し、残りの細胞はγδ陰性Ｔ細胞であった。選別されたγδ陽性Ｔ細胞におけるγδ Ｔ細胞の陽性百分率＞９０％（図３）であった。
新鮮な分離された成人の末梢血または臍帯血由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を取り、γδ Ｔ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０９２－８９２）を用いてキットの明細書における操作に従ってＰＢＭＣからγδ Ｔ細胞を選別し、γδ陽性Ｔ細胞を取得し、残りの細胞はγδ陰性Ｔ細胞であった。選別されたγδ陽性Ｔ細胞におけるγδ Ｔ細胞の陽性百分率＞９０％（図３）であった。
【0071】
２、ＣＦＳＥによるγδ Ｔ細胞のマーキング
ＣＦＳＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入され、製品のカタログ番号４２３８０１）が入れられた遠心管に３６μＬのＤＭＳＯを加え、その最終濃度を５ｍＭとし、繰り返しピペッティングしてそれを十分に均一に混合させ、対応体積のＰＢＳを加え、ＣＦＳＥ溶液の最終濃度を５μＭとし、ＣＦＳＥ作動液を得た。１×１０７～１×１０８個のγδ Ｔ細胞（ステップ１におけるγδ陽性Ｔ細胞またはγδ陰性Ｔ細胞）を５μＬのＣＦＳＥ作動液に入れ、室温または３７℃にて暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、１０％（体積分率）のＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＬ－２を含む５倍体積のＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、品番１３０－０９７－１９６）を加え、染色を終了した。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、細胞を収集し、予熱したＴｅｘＭＡＣＳ培地を用いて細胞を再懸濁し、室温または３７℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、予熱した培地を用いて細胞を２回洗浄し、ＣＦＳＥによる染色が成功したか否かをフローサイトメトリー法により検出し、ＣＥＳＥによるマーキングが成功したγδ Ｔ細胞を下記実験に用いた。
ＣＦＳＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入され、製品のカタログ番号４２３８０１）が入れられた遠心管に３６μＬのＤＭＳＯを加え、その最終濃度を５ｍＭとし、繰り返しピペッティングしてそれを十分に均一に混合させ、対応体積のＰＢＳを加え、ＣＦＳＥ溶液の最終濃度を５μＭとし、ＣＦＳＥ作動液を得た。１×１０７～１×１０８個のγδ Ｔ細胞（ステップ１におけるγδ陽性Ｔ細胞またはγδ陰性Ｔ細胞）を５μＬのＣＦＳＥ作動液に入れ、室温または３７℃にて暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、１０％（体積分率）のＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＬ－２を含む５倍体積のＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、品番１３０－０９７－１９６）を加え、染色を終了した。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、細胞を収集し、予熱したＴｅｘＭＡＣＳ培地を用いて細胞を再懸濁し、室温または３７℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、予熱した培地を用いて細胞を２回洗浄し、ＣＦＳＥによる染色が成功したか否かをフローサイトメトリー法により検出し、ＣＥＳＥによるマーキングが成功したγδ Ｔ細胞を下記実験に用いた。
【0072】
３、ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陽性Ｔ細胞懸濁液と腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ懸濁液とを体積比３：１の割合で均一に混合し（γδ陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳとの個数比は３：１である）、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、実験グループの細胞（γδ陽性Ｔ細胞）を得た。
【0073】
ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陰性Ｔ細胞懸濁液と腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ懸濁液とを体積比３：１の割合で均一に混合し（γδ陰性Ｔ細胞と腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳとの個数比は３：１である）、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、実験グループの細胞（γδ陰性Ｔ細胞）を得た。
【0074】
ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陽性Ｔ細胞懸濁液と対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢ懸濁液とを体積比３：１の割合で均一に混合し（γδ陽性Ｔ細胞と対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢとの個数比は３：１である）、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、陰性対照グループの細胞（γδ陽性Ｔ細胞）を得た。
【0075】
ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陰性Ｔ細胞懸濁液と対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢ懸濁液とを体積比３：１の割合で均一に混合し（γδ陰性Ｔ細胞と対照細胞Ｋ５６２－ｓｈＳＲＢとの個数比は３：１である）、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、陰性対照グループの細胞（γδ陰性Ｔ細胞）を得た。
【0076】
ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陽性Ｔ細胞懸濁液と野生型細胞Ｋ５６２懸濁液とＦＰＰＳの阻害剤ゾメタ（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ、ＺＯＬ）（ロシュ社）とを均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、陽性対照グループの細胞（γδ陽性Ｔ細胞）を得た。ここで、ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陽性Ｔ細胞とＫ５６２細胞との数の比は３：１であり、Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅの培養系における最終濃度は５μＭであった。
【0077】
ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陰性Ｔ細胞懸濁液と野生型細胞Ｋ５６２懸濁液とＦＰＰＳの阻害剤ゾメタ（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ、ＺＯＬ）（ロシュ社）とを均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで７２時間培養し、陽性対照グループの細胞（γδ陰性Ｔ細胞）を得た。ここで、ＣＦＳＥでマーキングされたγδ陰性Ｔ細胞とＫ５６２細胞との数の比は３：１であり、Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅの培養系における最終濃度は５μＭであった。
【0078】
４、実験グループの細胞、陰性対照グループの細胞、および陽性対照グループの細胞をそれぞれ取り、ＣＦＳＥの蛍光レベルをフローサイトメトリー法により検出した。具体的なステップは以下のとおりであった。２×１０５個の実験グループの細胞、陰性対照グループの細胞、および陽性対照グループの細胞をそれぞれ取り、３グループの細胞にそれぞれ１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ（２％のＦＢＳのＰＢＳ）を加えて遠心し、遠心パラメータを２０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、室温とし、遠心が終了した後、上清を捨て、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ（２％のＦＢＳのＰＢＳ）で細胞を再懸濁し、３グループの細胞のＣＦＳＥの蛍光レベルを装置で測定した。
【0079】
結果は図４に示すとおりであった。図から見られるように、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞は、選別されたγδ Ｔ細胞の分化を効果的に促進することができた。
【0080】
５、各グループの細胞を培養し続け、細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、拡大培養し、３日間毎にＩＬ－２を培養系に１回補充し、その培養系における最終濃度を２００ＩＵ／ｍＬとした。
【0081】
６、細胞を１０～１４日目まで培養すると、２００μＬの細胞懸濁液を取ってＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ計数を行い、後続の細胞同定、選別および機能試験を行った。
【0082】
Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ計数の具体的なステップは以下のとおりであった。十分に分散させた細胞懸濁液を１０μＬ取り、ＰＢＳを加えて適当な倍数に希釈し、希釈後の細胞懸濁液に１０μＬのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ（Ｇｉｂｃｏ、品番１５２５０－０６１）を加えて染色し、ピペットで均一にピペッティングし、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅで染色された細胞懸濁液を１０μＬ吸ってスライドガラスが覆われた血球計数板にピペッティングし、１００倍の倒立顕微鏡で観察し、生細胞は染色されず、死細胞は青色に染色され、４つの大きな格子内の細胞総数を計数し、更に４で割り、希釈倍数を乗じ、１０４を乗じ、最後に細胞懸濁液の総体積を乗じることで、細胞総数を得た。
【0083】
γδ Ｔ細胞をフローサイトメータで同定する具体的なステップは以下のとおりであった。（１～２）×１０５個の実験グループの細胞、陰性対照グループの細胞、および陽性対照グループの細胞をそれぞれ取り、それぞれ３グループの細胞懸濁液にビオチンでマーキングされた２μＬのγδ Ｔ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３１２０４）を加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ（２％のＦＢＳのＰＢＳ）を加えて再懸濁し、遠心して洗浄し、２μＬのＣＤ３－ＡＰＣ（ＢＤ、５５５３３５）、αβ－ＰＥ／ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０６７２０）、ＳＡ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２０４）、および７ＡＡＤ－ＰＥＲＣＰ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００－６９９３－５０）を更に加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、遠心して洗浄し、２００μＬのＢｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入される）で検出し、ＦｌｏｗＪｏで３グループの細胞のγδ Ｔの割合を分析した。
【0084】
結果は図５に示すとおりであった。図から見られるように、１４日間拡大培養した後、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系の刺激で選別されたγδ Ｔ細胞は１００倍以上増殖することができた。腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳがγδ Ｔ細胞の増殖を促進し、γδ Ｔ細胞の増殖効率を向上させることができた。
【0085】
実施例２、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法
【0086】
一、ＣＡＲ２２レンチウイルス粒子の調製
【0087】
本発明は、ＣＡＲ構造を用いてγδ Ｔ細胞に対して遺伝子修飾を行い、ＣＡＲ構造は、アミノ基端側からカルボキシ基端側まで、順に、ＳｃＦｖ（ＣＤ２２）－Ｈｉｎｇｅ（ＣＤ８）－ＴＭ（ＣＤ８）－ＣＤ１３７－ＣＤ３ζであり、即ち、アミノ基端側からカルボキシ基端側まで、順に、ＣＤ２２モノクローナル抗体（クローン番号Ｍ９７１）由来の一本鎖可変領域、ＣＤ８ａヒンジ領域および膜貫通領域、ＣＤ１３７信号ドメインおよびＣＤ３ζ鎖細胞内領域であった。そのアミノ酸配列は配列表の配列３に示すとおりであり、ヌクレオチド配列は配列表の配列４に示すとおりであった。配列４に示すＤＮＡ分子をＳｅｎｌ＿ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１ベクター（Ｓｅｎｌ＿ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１ベクターは、元のプラスミドのクローニング部位の両側に酵素切断部位ＰａｃＩおよびＳｐｅＩを追加した後に得られたベクターであり、元のプラスミドの名称はＬＶ－ｐＲＲＬＥＦ１．ＷＰＲＥであり、Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から提供され、契約番号はＳ１００２０７９である）の酵素切断部位ＰａｃＩとＳｐｅＩとの間に挿入し、ＣＡＲ２２レンチウイルスベクターを得た。
【0088】
実施例１のステップ一の２における方法に従い、ＣＡＲ２２レンチウイルスベクターを包装し、ＣＡＲ２２レンチウイルス粒子を得た。
【0089】
二、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の調製
【0090】
１、γδ Ｔ細胞の分離および選別（Ｄａｙ０）
５０～１００ｍＬの健康な成人の静脈血を無菌採取し、密度勾配遠心法により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を取得した。γδ Ｔ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０９２－８９２）を用いてＰＢＭＣからγδ Ｔ細胞を選別し、γδ Ｔ細胞を取得した。
５０～１００ｍＬの健康な成人の静脈血を無菌採取し、密度勾配遠心法により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を取得した。γδ Ｔ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０９２－８９２）を用いてＰＢＭＣからγδ Ｔ細胞を選別し、γδ Ｔ細胞を取得した。
【0091】
２、γδ Ｔ細胞の培養
ステップ１で選別されたγδ Ｔ細胞を、２００Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＬ－２を含むＴｅｘＭＡＣＳ培地で再懸濁し、γδ Ｔ細胞培養系を取得し、培養系構成によって、以下のような各グループに分けて培養した。
ステップ１で選別されたγδ Ｔ細胞を、２００Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＬ－２を含むＴｅｘＭＡＣＳ培地で再懸濁し、γδ Ｔ細胞培養系を取得し、培養系構成によって、以下のような各グループに分けて培養した。
【0092】
Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳグループ：γδ Ｔ細胞培養系にＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞を加え、γδ Ｔ細胞とＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞との個数比は３：１であった。
【0093】
Ｋ５６２＋ＺＯＬグループ：γδ Ｔ細胞培養系にＫ５６２細胞およびＺＯＬを加え、γδ Ｔ細胞とＫ５６２細胞との個数比は３：１であり、ＺＯＬの培養系における最終濃度は１０μＭであった。
【0094】
ＰＢＭＣ＋ＺＯＬグループ：ＰＢＭＣ細胞にＺＯＬを加え、ＺＯＬの培養系における最終濃度は１０μＭであった。
【0095】
５×１０５個のγδ Ｔ細胞／５００μＬ培地／ウェルで２４ウェルプレートに敷き、３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータに置いて２日間培養した。
【0096】
３、レンチウイルスの細胞へのトランスフェクション（Ｄａｙ２）
２日間培養した後、ＣＡＲ２２レンチウイルス粒子を各グループの細胞にそれぞれトランスフェクションした。具体的なトランスフェクションステップは以下のとおりであった。２４ウェルプレートを事前にインキュベータ内から取り出し、ウェル毎に１‰のＰｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇａｍａ社から購入され、製品のカタログ番号Ｐ３３６９－１０Ｇ）および５μＬＣＡＲ２２レンチウイルス粒子溶液を加え、操作台で「文字８」を描き、ピペットでピペッティングして均一に混合させた。３５℃、２０００ｒｐｍで２ｈ遠心した。遠心が終了した後、２４ウェルプレートを遠心機から取り出し、３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータに移して培養し続けた。
２日間培養した後、ＣＡＲ２２レンチウイルス粒子を各グループの細胞にそれぞれトランスフェクションした。具体的なトランスフェクションステップは以下のとおりであった。２４ウェルプレートを事前にインキュベータ内から取り出し、ウェル毎に１‰のＰｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇａｍａ社から購入され、製品のカタログ番号Ｐ３３６９－１０Ｇ）および５μＬＣＡＲ２２レンチウイルス粒子溶液を加え、操作台で「文字８」を描き、ピペットでピペッティングして均一に混合させた。３５℃、２０００ｒｐｍで２ｈ遠心した。遠心が終了した後、２４ウェルプレートを遠心機から取り出し、３７℃、５％のＣＯ２の細胞インキュベータに移して培養し続けた。
【0097】
４、拡大培養（Ｄａｙ３～１４）
３日間培養した時に半分の液を交換し、２４ウェルプレートをインキュベータから取り出し、ウェル毎に半分の上清液を吸い出し、半分のＤＭＥＭ完全培地を補充し、培養し続けた。細胞濃度が（１．５～２）×１０６／ｍｌに達した状態で、他のフラスコまたは袋に移し、２日おきに２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を１回追加した。細胞を１０～１４日目に培養した時、２００μＬの細胞懸濁液を取ってＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ計数を行い、後続の細胞同定、選別、および機能試験を行った。
３日間培養した時に半分の液を交換し、２４ウェルプレートをインキュベータから取り出し、ウェル毎に半分の上清液を吸い出し、半分のＤＭＥＭ完全培地を補充し、培養し続けた。細胞濃度が（１．５～２）×１０６／ｍｌに達した状態で、他のフラスコまたは袋に移し、２日おきに２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を１回追加した。細胞を１０～１４日目に培養した時、２００μＬの細胞懸濁液を取ってＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ計数を行い、後続の細胞同定、選別、および機能試験を行った。
【0098】
三、フローサイトメータによるＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の検出
１、ビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃの調製
１、ビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃの調製
【0099】
１００μｇの精製ＣＤ２２－Ｆｃタンパク質粉末（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入され、品番１１９５８－Ｈ０２Ｈ）を取り、ｐＨ７．２のＰＢＳで再懸濁し、その最終濃度を（０．５～１）μｇ／μＬとし、純度＞９９．９％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で適量のビオチン（ＵＳ Ｅｖｅｒｂｒｉｇｈｔ Ｉｎｃ．から購入され、品番Ｂ５０２６－１）を溶解して２ｍＭのビオチン懸濁液に調製し、ＣＤ２２－Ｆｃタンパク質：ビオチン＝１：１０のモル比で両者を均一に混合し、室温で１時間静置し、１５分間おきに１回均一に混合し、脱塩カラムで脱塩し（操作ステップは脱塩カラムの明細書を参照）、体積によって、ＰＤ－１０（米国ＧＥ社から購入され、品番１７－０８５１－０１）を選択してもよいし、Ｇ－２５脱塩カラム（米国ＧＥ社から購入され、品番２８－９１８０－０４）を選択してもよく、ビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを得た。
【0100】
２、フローサイトメータによる細胞表面ＣＡＲ（ＣＤ２２）の発現レベルの検出
レンチウイルスをトランスフェクションした後の４８～７２時間に、各グループの細胞を取ってトランスフェクション効率（トランスフェクション効率はＣＤ２２－Ｆｃの陽性とマーキングされたγδ Ｔ細胞の全てのγδ Ｔ細胞における百分率である）を検出した。具体的なステップは以下のとおりであった。管毎に（１～２）×１０５個の細胞を入れ、１μＬのビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、１ｍＬの（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて再懸濁し、遠心して洗浄した。更に、ＳＡ－ＰＥ、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－ＶｉｏＢｌｕｅ、および７ＡＡＤ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入される）を加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、遠心して洗浄し、２００μＬのＢｕｆｆｅｒで再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメータで検出し、ＦｌｏｗＪｏでＣＡＲ（ＣＤ２２）の発現レベルを分析した。
レンチウイルスをトランスフェクションした後の４８～７２時間に、各グループの細胞を取ってトランスフェクション効率（トランスフェクション効率はＣＤ２２－Ｆｃの陽性とマーキングされたγδ Ｔ細胞の全てのγδ Ｔ細胞における百分率である）を検出した。具体的なステップは以下のとおりであった。管毎に（１～２）×１０５個の細胞を入れ、１μＬのビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、１ｍＬの（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて再懸濁し、遠心して洗浄した。更に、ＳＡ－ＰＥ、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－ＶｉｏＢｌｕｅ、および７ＡＡＤ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入される）を加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、遠心して洗浄し、２００μＬのＢｕｆｆｅｒで再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメータで検出し、ＦｌｏｗＪｏでＣＡＲ（ＣＤ２２）の発現レベルを分析した。
【0101】
検出結果は図７に示すとおりであった。図から見られるように、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳグループのトランスフェクション効率はＫ５６２＋ＺＯＬグループおよびＰＢＭＣ＋ＺＯＬグループよりも著しく高かった。腫瘍細胞Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳは、レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション効率を向上させることができることを意味した。
【0102】
四、ＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞の選別精製
上記方法で７～１０日間培養したＣＡＲ２２で修飾されたγδ Ｔ細胞を選別して精製し、精製後のＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を得た。具体的なステップは以下のとおりであった。７～１０日間培養したＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を収集し、上清を遠心して捨て、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に８０μＬの緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）および５μＬのビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加える割合で緩衝液およびビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加え、４～８℃にて暗所で１５ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に１～２ｍＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、遠心して洗浄し、洗浄した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に８０μＬの緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）および１０μＬのＳＡ磁気ビーズを加える割合で緩衝液およびＳＡ磁気ビーズを加え、均一に混合し、４～８℃にて暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に１～２ｍＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、遠心して洗浄し、１×１０８個の細胞毎に５００μＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、ピペッティングして細胞沈殿層を均一に混合し、磁気分離カラムでＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を選別し、滴下した細胞懸濁液は選別されたＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞であり、それをＣＡＲ－γδ Ｔｃｅｌｌｓと記し、磁気カラム中の細胞はＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞であり、それをＣＡＲ＋γδ Ｔｃｅｌｌｓと記した。得られた陽性細胞を収集して選別して計数し、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー法により検出し、残りの細胞を培養し続けたまたは後続の機能試験に直接用いた。
上記方法で７～１０日間培養したＣＡＲ２２で修飾されたγδ Ｔ細胞を選別して精製し、精製後のＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を得た。具体的なステップは以下のとおりであった。７～１０日間培養したＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を収集し、上清を遠心して捨て、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に８０μＬの緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）および５μＬのビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加える割合で緩衝液およびビオチンでマーキングされたＣＤ２２－Ｆｃを加え、４～８℃にて暗所で１５ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に１～２ｍＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、遠心して洗浄し、洗浄した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に８０μＬの緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）および１０μＬのＳＡ磁気ビーズを加える割合で緩衝液およびＳＡ磁気ビーズを加え、均一に混合し、４～８℃にて暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、１×１０７個のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞毎に１～２ｍＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、遠心して洗浄し、１×１０８個の細胞毎に５００μＬの緩衝液を加える割合で緩衝液を加え、ピペッティングして細胞沈殿層を均一に混合し、磁気分離カラムでＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を選別し、滴下した細胞懸濁液は選別されたＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞であり、それをＣＡＲ－γδ Ｔｃｅｌｌｓと記し、磁気カラム中の細胞はＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞であり、それをＣＡＲ＋γδ Ｔｃｅｌｌｓと記した。得られた陽性細胞を収集して選別して計数し、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー法により検出し、残りの細胞を培養し続けたまたは後続の機能試験に直接用いた。
【0103】
五、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の体外機能試験
１、標的細胞株の確立
１、標的細胞株の確立
【0104】
（１）Ｋ５６２－ＣＤ２２細胞
特異的抗原ＣＤ２２を発現する腫瘍細胞株を構築するために、健康者のＰＢＭＣからクローニングしてＣＤ２２全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ＿００１７７１．３）を取得し、ＣＤ２２全長ｃＤＮＡ配列を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を持つＵ６－Ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎレンチウイルスプラスミド（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入され）に挿入し、レンチウイルスプラスミドを得た。実施例１のステップ一の２および３における方法に従い、レンチウイルスプラスミドを包装してＫ５６２細胞にトランスフェクションし、選別により純度が高いＫ５６２－ＣＤ２２細胞を得た。
特異的抗原ＣＤ２２を発現する腫瘍細胞株を構築するために、健康者のＰＢＭＣからクローニングしてＣＤ２２全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ＿００１７７１．３）を取得し、ＣＤ２２全長ｃＤＮＡ配列を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を持つＵ６－Ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎレンチウイルスプラスミド（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入され）に挿入し、レンチウイルスプラスミドを得た。実施例１のステップ一の２および３における方法に従い、レンチウイルスプラスミドを包装してＫ５６２細胞にトランスフェクションし、選別により純度が高いＫ５６２－ＣＤ２２細胞を得た。
【0105】
（２）Ｋ５６２－ＣＤ１９細胞
特異的抗原ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株を構築するために、健康者のＰＢＭＣからクローニングしてＣＤ１９全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ＿００１７７０．５）を取得し、ＣＤ１９全長ｃＤＮＡ配列を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を持つＵ６－Ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎレンチウイルスプラスミド（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入される）に挿入し、レンチウイルスプラスミドを得た。実施例１のステップ一の２および３における方法に従い、レンチウイルスプラスミドを包装してＫ５６２細胞にトランスフェクションし、選別により純度が高いＫ５６２－ＣＤ１９細胞を陰性対照として得た。
特異的抗原ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株を構築するために、健康者のＰＢＭＣからクローニングしてＣＤ１９全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ＿００１７７０．５）を取得し、ＣＤ１９全長ｃＤＮＡ配列を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を持つＵ６－Ｂａｓｅｄ ｓｈＲＮＡ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎレンチウイルスプラスミド（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から購入される）に挿入し、レンチウイルスプラスミドを得た。実施例１のステップ一の２および３における方法に従い、レンチウイルスプラスミドを包装してＫ５６２細胞にトランスフェクションし、選別により純度が高いＫ５６２－ＣＤ１９細胞を陰性対照として得た。
【0106】
（３）ＬＣＬ細胞
ＬＣＬ細胞は、ＥＢウイルスが健康な成人の末梢Ｂ細胞に感染して得られた不死化細胞系であり、細胞表面にＣＤ２２抗原を発現する。具体的な調製方法は以下のとおりであった。Ｂ９５．８細胞（中国科学院セルバンクから購入される）をＴ７５ｃｍ２の細胞培養用フラスコに接種し、濃度が３×１０５個／ｍｌであり、培地はＲＰＭＩ１６４０（ｇｉｂｃｏから購入され、製品のカタログ番号２２４００－０８８）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏから購入され、製品のカタログ番号１００９９１４１）である。３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで４８ｈ培養した後、１×１０６個／ｍｌの濃度で細胞を再接種し、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡ（ｃａｙｍａｎから購入され、製品のカタログ番号１６５６１－２９－８）を加えて細胞を処理した。１ｈ後、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で細胞を３回洗浄し、ＴＰＡを除去した。得られた細胞を１×１０６個／ｍｌの濃度で再び接種し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで９６ｈ培養し、培養液を５０ｍＬの遠心管に収集し、４℃、６００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、得られた上清を０．４５μｍのフィルタで濾過し、濾液はＥＢＶウイルス懸濁液であった。密度勾配遠心法により取得された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対してＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０５０－１０１）選別を行った。得られたＣＤ３－細胞はＢ細胞であり、３×１０５個／ｍｌの濃度で培養用フラスコに接種し、１／１０体積のＥＢＶウイルス懸濁液を加えた。ＥＢＶウイルスで感染してから１週間後に、細胞クラスター、すなわち形質転換が成功したＬＣＬ細胞が倒立顕微鏡で見られた。時間の経過につれ、細胞クラスターはますます大きくなり、細胞数および培地の色に応じて増殖および凍結保存を行うことができた。
ＬＣＬ細胞は、ＥＢウイルスが健康な成人の末梢Ｂ細胞に感染して得られた不死化細胞系であり、細胞表面にＣＤ２２抗原を発現する。具体的な調製方法は以下のとおりであった。Ｂ９５．８細胞（中国科学院セルバンクから購入される）をＴ７５ｃｍ２の細胞培養用フラスコに接種し、濃度が３×１０５個／ｍｌであり、培地はＲＰＭＩ１６４０（ｇｉｂｃｏから購入され、製品のカタログ番号２２４００－０８８）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏから購入され、製品のカタログ番号１００９９１４１）である。３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで４８ｈ培養した後、１×１０６個／ｍｌの濃度で細胞を再接種し、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡ（ｃａｙｍａｎから購入され、製品のカタログ番号１６５６１－２９－８）を加えて細胞を処理した。１ｈ後、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で細胞を３回洗浄し、ＴＰＡを除去した。得られた細胞を１×１０６個／ｍｌの濃度で再び接種し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで９６ｈ培養し、培養液を５０ｍＬの遠心管に収集し、４℃、６００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、得られた上清を０．４５μｍのフィルタで濾過し、濾液はＥＢＶウイルス懸濁液であった。密度勾配遠心法により取得された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対してＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、製品のカタログ番号１３０－０５０－１０１）選別を行った。得られたＣＤ３－細胞はＢ細胞であり、３×１０５個／ｍｌの濃度で培養用フラスコに接種し、１／１０体積のＥＢＶウイルス懸濁液を加えた。ＥＢＶウイルスで感染してから１週間後に、細胞クラスター、すなわち形質転換が成功したＬＣＬ細胞が倒立顕微鏡で見られた。時間の経過につれ、細胞クラスターはますます大きくなり、細胞数および培地の色に応じて増殖および凍結保存を行うことができた。
【0107】
２、フローサイトメータによるサイトカインＩＦＮ－γおよび表面のＣＤ１３７の発現レベルの測定
ステップ１で得られた標的細胞株を、ウェル毎に１×１０４の数で９６ウェルのＵ型底細胞培養プレートに入れ、その後、エフェクター細胞（ＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞）：標的細胞がそれぞれ１０：１、３：１、１：１である割合で対応数の選別精製されたＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を対応する各ウェルにそれぞれ入れ、エフェクター細胞および標的細胞のブランクウェルをそれぞれ設け、ＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞を対照のエフェクター細胞とし、同じ検出を設けた。その後、細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて４時間培養し、細胞懸濁液を吸い出し、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、２μＬのＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４－ＰＥ．Ｃｙ７、ＣＤ８－ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ１３７－ＰＥ（ＢＤ社、クローン番号４Ｂ４－１）をそれぞれ加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、洗浄した後、ＢＤ社の細胞内染色キット（品番５５４７１４）を用い、染色方法は明細書を参照した。対応する試薬が細胞膜を貫通した後、５μＬのマウス抗ヒトＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ＢＤ社、クローン番号がＢ２７である）を加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートした後に洗浄し、洗浄後、ＩＦＮ－γおよびＣＤ１３７の発現レベルをフローサイトメータにより検出した。
ステップ１で得られた標的細胞株を、ウェル毎に１×１０４の数で９６ウェルのＵ型底細胞培養プレートに入れ、その後、エフェクター細胞（ＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞）：標的細胞がそれぞれ１０：１、３：１、１：１である割合で対応数の選別精製されたＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞を対応する各ウェルにそれぞれ入れ、エフェクター細胞および標的細胞のブランクウェルをそれぞれ設け、ＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞を対照のエフェクター細胞とし、同じ検出を設けた。その後、細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて４時間培養し、細胞懸濁液を吸い出し、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、２μＬのＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４－ＰＥ．Ｃｙ７、ＣＤ８－ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ１３７－ＰＥ（ＢＤ社、クローン番号４Ｂ４－１）をそれぞれ加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、洗浄した後、ＢＤ社の細胞内染色キット（品番５５４７１４）を用い、染色方法は明細書を参照した。対応する試薬が細胞膜を貫通した後、５μＬのマウス抗ヒトＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ＢＤ社、クローン番号がＢ２７である）を加え、４～８℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートした後に洗浄し、洗浄後、ＩＦＮ－γおよびＣＤ１３７の発現レベルをフローサイトメータにより検出した。
【0108】
検出結果は図８に示すとおりであった。図から見られるように、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞とγδ Ｔ細胞とを共培養して生産したＣＡＲ＋γδ Ｔ細胞はＣＤ２２を発現する腫瘍細胞に対して特異的に応答し、より多くのＩＦＮ－γを分泌し、より多くのＣＤ１３７を細胞表面に発現した。
【0109】
３、フローサイトメータによるＣＡＲ－γδ Ｔの特異的殺傷活性の測定
実施例１のステップ二の２における方法に従い、ステップ１における各標的細胞株に対してＣＦＳＥによるマーキングを行い、室温または３７℃にて暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、１０％（体積分率）のＦＢＳを含む５倍体積の培地を加え、染色を終了した。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、遠心後に細胞を再懸濁し、室温または３７℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、細胞を２回洗浄し、再懸濁後に使用に備えた。９６ウェル細胞培養プレートで、ウェル毎に１×１０４個のＣＦＳＥでマーキングされた標的細胞を入れ、その後、エフェクター細胞（ＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞）：標的細胞がそれぞれ１０：１、３：１、１：１である割合で対応数の選別精製されたＣＡＲ－γδ Ｔ陽性細胞を対応する各ウェルにそれぞれ入れ、エフェクター細胞および標的細胞のブランクウェルをそれぞれ設け、ＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞を対照のエフェクター細胞とし、同じ検出を設けた。その後、細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて４時間共培養し、細胞懸濁液を吸い出し、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、５μＬの７－ＡＡＤを加え、暗所で１０ｍｉｎインキュベートして洗浄し、洗浄後に、殺傷率をフローサイトメータにより検出し、殺傷率は殺傷された標的細胞（ＣＦＳＥ＋７ＡＡＤ＋）が全ての標的細胞（ＣＳＦＥ＋）を占有する百分率であった。
実施例１のステップ二の２における方法に従い、ステップ１における各標的細胞株に対してＣＦＳＥによるマーキングを行い、室温または３７℃にて暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、１０％（体積分率）のＦＢＳを含む５倍体積の培地を加え、染色を終了した。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、遠心後に細胞を再懸濁し、室温または３７℃にて暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、細胞を２回洗浄し、再懸濁後に使用に備えた。９６ウェル細胞培養プレートで、ウェル毎に１×１０４個のＣＦＳＥでマーキングされた標的細胞を入れ、その後、エフェクター細胞（ＣＡＲ－γδ陽性Ｔ細胞）：標的細胞がそれぞれ１０：１、３：１、１：１である割合で対応数の選別精製されたＣＡＲ－γδ Ｔ陽性細胞を対応する各ウェルにそれぞれ入れ、エフェクター細胞および標的細胞のブランクウェルをそれぞれ設け、ＣＡＲ－γδ陰性Ｔ細胞を対照のエフェクター細胞とし、同じ検出を設けた。その後、細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて４時間共培養し、細胞懸濁液を吸い出し、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、５μＬの７－ＡＡＤを加え、暗所で１０ｍｉｎインキュベートして洗浄し、洗浄後に、殺傷率をフローサイトメータにより検出し、殺傷率は殺傷された標的細胞（ＣＦＳＥ＋７ＡＡＤ＋）が全ての標的細胞（ＣＳＦＥ＋）を占有する百分率であった。
【0110】
結果は図９に示すとおりであった。図から見られるように、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞とγδ Ｔ細胞とを共培養して生産したＣＡＲ＋γδ Ｔ細胞は、ＣＤ２２の腫瘍細胞を特異的に分解して発現することができた。
【0111】
（付記１）
γδ Ｔ細胞培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞を加えるステップを含む、γδ Ｔ細胞の増殖方法。
γδ Ｔ細胞培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞を加えるステップを含む、γδ Ｔ細胞の増殖方法。
【0112】
（付記２）
前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である、ことを特徴とする付記１に記載の方法。
前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である、ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【0113】
（付記３）
培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップを更に含む、ことを特徴とする付記１に記載の方法。
培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加えるステップを更に含む、ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【0114】
（付記４）
ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～１０００）ＩＵ／ｍＬとすることである、ことを特徴とする付記３に記載の方法。
ＩＬ－２を加える時の標準は、前記ＩＬ－２の前記培養系における最終濃度を（１００～１０００）ＩＵ／ｍＬとすることである、ことを特徴とする付記３に記載の方法。
【0115】
（付記５）
キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養し、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップと、前記培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞が含まれるステップとを含む、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法。
キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養し、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップと、前記培養系にＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞が含まれるステップとを含む、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産する方法。
【0116】
（付記６）
前記キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養する方法は、
ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞をγδ Ｔ細胞培養系に加え、培養して培養系を得るステップ１）と、
キメラ抗原受容体を発現するベクターを前記培養系に加え、培養して前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップ２）と、
を含む、ことを特徴とする付記５に記載の方法。
前記キメラ抗原受容体を発現するベクターとγδ Ｔ細胞とを共培養する方法は、
ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞をγδ Ｔ細胞培養系に加え、培養して培養系を得るステップ１）と、
キメラ抗原受容体を発現するベクターを前記培養系に加え、培養して前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を得るステップ２）と、
を含む、ことを特徴とする付記５に記載の方法。
【0117】
（付記７）
前記ステップ１）において、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
前記ステップ１）において、前記γδ Ｔ細胞と前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞との個数比は（１～１０）：１である、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
【0118】
（付記８）
前記ステップ２）において、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加える、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
前記ステップ２）において、培養系内の細胞濃度が（１．５～２）×１０６個／ｍｌに達すると、２～４日毎にＩＬ－２を前記培養系に１回加える、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
【0119】
（付記９）
前記ステップ２）において、前記キメラ抗原受容体を発現するベクターは、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターである、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
前記ステップ２）において、前記キメラ抗原受容体を発現するベクターは、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターである、ことを特徴とする付記６に記載の方法。
【0120】
（付記１０）
付記５～９のいずれか１つに記載の方法に従ってＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産するステップ（１）と、
前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を腫瘍患者の体内に返送し、前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞により前記腫瘍患者の体内の腫瘍細胞を認識して殺傷し、更に腫瘍を免疫して治療するという目的を実現するステップ（２）と、
を含む、腫瘍を免疫して治療する方法。
付記５～９のいずれか１つに記載の方法に従ってＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産するステップ（１）と、
前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を腫瘍患者の体内に返送し、前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞により前記腫瘍患者の体内の腫瘍細胞を認識して殺傷し、更に腫瘍を免疫して治療するという目的を実現するステップ（２）と、
を含む、腫瘍を免疫して治療する方法。
【0121】
（付記１１）
活性成分は、ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞である製品であって、
前記製品の機能は、
Ｂ１）γδ Ｔ細胞の増殖を促進することと、
Ｂ２）γδ Ｔ細胞の分化を促進することと、
Ｂ３）ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産することと、
Ｂ４）レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション率を向上させることと、
Ｂ５）腫瘍を免疫して治療することと、
のいずれかである、製品。
活性成分は、ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞である製品であって、
前記製品の機能は、
Ｂ１）γδ Ｔ細胞の増殖を促進することと、
Ｂ２）γδ Ｔ細胞の分化を促進することと、
Ｂ３）ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を生産することと、
Ｂ４）レンチウイルスのγδ Ｔ細胞に対するトランスフェクション率を向上させることと、
Ｂ５）腫瘍を免疫して治療することと、
のいずれかである、製品。
【0122】
（付記１２）
前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質を腫瘍細胞に導入して得られたものである、ことを特徴とする付記１～１０のいずれか１つに記載の方法または付記１１に記載の製品。
前記ＦＰＰＳ発現量および／または活性が低下した腫瘍細胞は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質を腫瘍細胞に導入して得られたものである、ことを特徴とする付記１～１０のいずれか１つに記載の方法または付記１１に記載の製品。
【0123】
（付記１３）
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、レンチウイルスベクターにより腫瘍細胞に導入される、ことを特徴とする付記１２に記載の方法または製品。
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、レンチウイルスベクターにより腫瘍細胞に導入される、ことを特徴とする付記１２に記載の方法または製品。
【0124】
（付記１４）
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡである、ことを特徴とする付記１２に記載の方法または製品。
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制する物質は、ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡである、ことを特徴とする付記１２に記載の方法または製品。
【0125】
（付記１５）
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、
前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである、ことを特徴とする付記１４に記載の方法または製品。
前記ＦＰＰＳコード遺伝子の発現を抑制するｓｈＲＮＡは、ステムＩ、ループ、およびステムＩＩで形成されたステムループ構造の一本鎖ＲＮＡであり、
前記ステムＩの配列は配列表の配列２の１番目～２１番目に示すとおりであり、前記ループの配列は配列表の配列２の２２番目～２７番目に示すとおりであり、前記ステムＩＩの配列は配列表の配列２の２８番目～４８番目に示すとおりである、ことを特徴とする付記１４に記載の方法または製品。
【0126】
（付記１６）
前記腫瘍細胞は慢性骨髄性白血病細胞系である、ことを特徴とする付記１～１０のいずれか１つに記載の方法または付記１１に記載の製品。
前記腫瘍細胞は慢性骨髄性白血病細胞系である、ことを特徴とする付記１～１０のいずれか１つに記載の方法または付記１１に記載の製品。
【0127】
（付記１７）
前記慢性骨髄性白血病細胞系はＫ５６２細胞である、ことを特徴とする付記１６に記載の方法または製品。
前記慢性骨髄性白血病細胞系はＫ５６２細胞である、ことを特徴とする付記１６に記載の方法または製品。
【産業上の利用可能性】
【0128】
従来技術の欠陥を克服するために、本発明は、全く新しいγδ Ｔ細胞の増殖形態を提供し、該形態は具体的に以下のとおりである。ＦＰＰシンターゼ（ＦＰＰＳｙｎｔｈａｓｅ、ＦＰＰＳ）を標的とするｓｈＦＰＰＳを、レンチウイルスベクターによりＫ５６２細胞にトランスフェクションし、Ｋ５６２細胞におけるＦＰＰＳの発現量を低減し、ＦＰＰＳ発現量が低下したＫ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系を構築する。本発明は、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系をγδ Ｔ細胞培養系に加えてγδ Ｔ細胞と共培養し、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系が精製されたＶγ９δ２ Ｔ細胞の体外分化および増殖を直接刺激できることを見出した。本発明は、更に、キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系を含むγδ Ｔ細胞培養系に加えて共培養し、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系がＣＡＲ遺伝子のトランスフェクション効率を効果的に向上させ、更にＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の調製効率を向上させることができることを見出した。上記実験結果により、Ｋ５６２－ｓｈＦＰＰＳ細胞系はγδ Ｔ細胞の体外増殖能力およびＣＡＲ遺伝子のトランスフェクション効率を効果的に向上させることができ、本発明に係る形態は、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の大規模生産という技術的ボトルネックを効果的に解決し、良好な応用の見通しを有していることが示されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】