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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-14
(45)【発行日】2022-12-22
(54)【発明の名称】液滴及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/90 20060101AFI20221215BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20221215BHJP
C12N 15/61 20060101ALN20221215BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20221215BHJP
【ＦＩ】
C12N9/90 ZNA
C07K19/00
C12N15/61
C12N15/62 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022502960
(86)(22)【出願日】2021-06-04
(86)【国際出願番号】 JP2021021437
(87)【国際公開番号】W WO2021251306
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2022-01-17
(31)【優先権主張番号】P 2020100517
(32)【優先日】2020-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(73)【特許権者】
【識別番号】304020292
【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学
(73)【特許権者】
【識別番号】503092180
【氏名又は名称】学校法人関西学院
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】奥村 正樹
(72)【発明者】
【氏名】松▲崎▼ 元紀
(72)【発明者】
【氏名】稲葉 謙次
(72)【発明者】
【氏名】齋尾 智英
(72)【発明者】
【氏名】金村 進吾
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００１／００３４０５０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Journal of Molecular Biology，2020年02月19日，Vol.432，p.2141-2163
【文献】Journal of Alzheimer's Disease，2014年，Vol.38，p.601-609
【文献】The Protein Journal，2020年05月29日，Vol.39，p.366-376
【文献】Nat Rev Mol Cell Biol.，2017年，Vol.18, No.5，p.285-298
【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2014年，Vol.289, No.39，p.27004-27018
【文献】奥村正樹，液液相分離する小胞体内シャペロンの発見、機能、制御機構，日本生化学会大会講演要旨集，2020年09月14日，Vol.93, 1S09e-02
【文献】ChemBioChem，2014年，Vol.15，pp.1599-1606
【文献】生物工学会誌，2020年05月25日，Vol.98, No.5，pp.251-254
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／６１
Ｃ１２Ｎ １５／６２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質の集合体を含む液滴であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメイン及びカルシウム結合領域を含む、液滴（ただし、ＰＤＩを含むＴａｕの液滴及びＳ－ニトロシル化ＰＤＩを含むＴａｕの液滴を除く）。
【請求項2】
前記タンパク質が２つ以上のチオレドキシン様ドメインを有し、該２つ以上のチオレドキシン様ドメインのうち少なくとも２つが、リンカーを介して互いに結合しており、該リンカーがセリン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、リシン及びチロシンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の液滴。
【請求項3】
前記タンパク質が二量体以上である、請求項１又は２に記載の液滴。
【請求項4】
前記ＰＤＩファミリータンパク質がＰ５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の液滴。
【請求項5】
カルシウムイオンの存在下で、タンパク質を集合させる工程を含む、液滴の製造方法であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質であり、チオレドキシン様ドメインを含み、該タンパク質が、さらにカルシウム結合領域を有する、方法。
【請求項6】
前記タンパク質が２つ以上のチオレドキシン様ドメインを有し、該２つ以上のチオレドキシン様ドメインのうち少なくとも２つが、リンカーを介して互いに結合しており、該リンカーがセリン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、リシン及びチロシンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＰＤＩファミリータンパク質が二量体以上である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＤＩファミリータンパク質がＰ５である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年６月９日に出願された、日本国特許出願第２０２０－１００５１７号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、液滴及びその製造方法に関する。
本出願は、２０２０年６月９日に出願された、日本国特許出願第２０２０－１００５１７号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、液滴及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
液滴（ドロプレット）は、連続酵素反応など多段階反応場として知られつつあるが、その構成因子は天然変性蛋白質という天然に構造不定形蛋白質に対し、RNA, DNA, ATPなどによるセカンドメッセンジャーの添加によって形成されることが知られている。液滴を形成する代表例であるFUSは構造を持たない配列が繰り返し現れる低複雑性ドメイン(Low Complexity domain: LCドメイン)が液滴のコアを成すものとして知られている。この液滴の形成・解離を制御する因子として、シャペロンが知られ、液滴内に含まれることも報告がある。シャペロンとは蛋白質の凝集を制御する蛋白質群の総称である。しかし、シャペロンかつ酵素としての機能があるタンパク質が単独で液滴を形成する例はない。シャペロンかつ酵素の二つ以上の機能を付与したタンパク質のドメインとしてチオレドキシンが知られる。チオレドキシンとは、低分子量の酸化還元タンパク質であり、他のタンパク質のシステイン残基が形成するジスルフィド結合の還元・切断を促進することで様々な生命反応において重要な役割を果たすことが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Science, 360(6391), 922-927 (2018)
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108(11), 4334-4339（2011）
【文献】Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 18(5), 285-298 (2017)
【文献】Cell, 149(4), 753-767 (2012)
【文献】Cell, 149(4), 768-779 (2012)
【文献】Int. J. Biol. Macromol., 10(PtA), 10-18(2018)
【文献】J. Biol. Chem. ;289(39):27004-18 (2014)
【文献】Structure, 29, 1-14 (2021)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、これまでシャペロンおよび酵素機能を持つタンパク質が単独で液滴を形成することが知られていなかったので、その液滴の調製技術を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
かかる状況の下、本発明者らは、鋭意検討した結果、１つ以上のチオレドキシン様ドメインを含むタンパク質を用いることにより、液滴を作製できることを見出した。かかる新たな知見に基づき、本発明者らは、液滴を形成させるための因子、チオレドキシン様ドメインを含むタンパク質の好ましい構造等の条件を検討し、本発明を完成させた。
【0006】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．タンパク質の集合体を含む液滴であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメインを含む、液滴。
項１．タンパク質の集合体を含む液滴であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメインを含む、液滴。
【0007】
項２．前記タンパク質が、カルシウム結合領域を有する、項１に記載の液滴。
【0008】
項３．前記タンパク質が２つ以上のチオレドキシン様ドメインを有し、該２つ以上のチオレドキシン様ドメインのうち少なくとも２つが、リンカーを介して互いに結合しており、該リンカーがセリン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、リシン及びチロシンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含む、項１又は２に記載の液滴。
【0009】
項４．前記タンパク質が二量体以上である、項１～３のいずれか一項に記載の液滴。
【0010】
項５．前記ＰＤＩファミリータンパク質がＰ５である、項２～４のいずれか一項に記載の液滴。
【0011】
項６．カルシウムイオンの存在下で、タンパク質を集合させる工程を含む、液滴の製造方法であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、チオレドキシン様ドメインを含み、該タンパク質が、さらにカルシウム結合領域を有する、方法。
【0012】
項７．前記２つ以上のチオレドキシン様ドメインのうち少なくとも２つが、リンカーを介して互いに結合しており、該リンカーがセリン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、リシン及びチロシンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含む、項６に記載の方法。
【0013】
項８．前記ＰＤＩファミリータンパク質が二量体以上である、項６又は７に記載の方法。
【0014】
項９．前記ＰＤＩファミリータンパク質がＰ５である、項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、これまで液滴を形成することが知られていなかったタンパク質を用いて液滴を調製することができる。後述するように、典型的には、液滴においてはその構成タンパク質が流動性を有しつつ互いに接触し得る距離で相互作用しており、従って、例えば、反応原料となる物質を加えた場合、当該物質は液滴の構成タンパク質の間に入り込み、当該構成タンパク質が有するチオレドキシン付近に濃縮され得る。従って、本発明の液滴は、チオレドキシン等の酵素反応や脱凝集反応、不良タンパク質の保管といった反応場として用いること等に有用である。従来、チオレドキシン活性を有するタンパク質が単独で液滴を形成する例はなかったため、本発明は酵素反応や脱凝集反応に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】左上は精製蛋白質のＳＤＳ―ＰＡＧＥ結果を示し、高純度精製品であることを示す。右は使用したＰＤＩファミリーのチオレドキシン様ドメインの構成とＳＳ交換活性部位を示す。左下はＤＬＳによる粒子径の変化を示す。ＰＤＩファミリーの中でＰ５がカルシウム依存的に会合する。
【図2】左は、図１の粒子径の長軸を５０００ｎｍまでスケールアップした図。３ｍＭカルシウム存在下でＰ５は４５００ｎｍ程度の会合体を形成する。右図では、左図で作成した会合体にＥＤＴＡを滴定した結果を示す。滴定とともに、Ｐ５会合体が非会合体へと戻り、可逆性があることを意味する。
【図3】位相差顕微鏡によりＰ５の会合体は球形であると分かる。時間変化とともに、球形会合体同士、融合し、球形会合体が大きく成長する。
【図4】図は、蛍光顕微鏡イメージ、位相差顕微鏡イメージ、の重ね合わせの結果を示す。強いレーザーを当てることで、一旦蛍光退色した球形集合体が時間変化ととともに、蛍光回復する。下図は蛍光回復の解析の結果であり、約１９秒のhalf timeであることがわかる。このＦＲＡＰ実験により、球形会合体は液滴であることを裏付ける。
【図5】カルシウムとＰ５の各濃度における混合後、遠心し、上清画分の濃度を示す。
【図6】Ｐ５のカルシウム結合領域をＩＴＣ測定により決定。上に、Ｐ５の各種変異体を示しており、下に、各々の変異体とカルシウムとのＩＴＣ実験結果を示す。上向きの熱量が結合による熱量を示しており、Ｃ末端に位置する構造不定形領域がカルシウム結合領域であるとわかった。
【図7】屈折率を測定できる蛍光顕微鏡を用いた液滴のリアルタイム観察を示す。真ん中は液滴同士の融合しようとする瞬間を捉えた画像を示す。また液滴表面が比較的ラフであることから、流動性が高いことを意味する。
【図8】液滴内部に各種酵素・シャペロンおよびグルタチオンが濃縮出来ることを示す。図は屈折率(RI)で液滴であることを裏付け、蛍光標識した各種酵素・シャペロン、グルタチオンで局在を表す。小胞体内局在酵素・シャペロンであるERp46, ERp72, ERp57, ERp44は液滴内部に濃縮されやすいが、PDIは液滴内部に入りにくいことを示す。また、mCherry-ERp57とGFP-ERp72を使用することで、液滴内部に少なくとも二種の酵素・シャペロンを濃縮できることを示す。また、ATTO532標識したグルタチオンも本液滴内部に濃縮できる。
【図9】液滴形成におけるpH依存性を示す。pH 7.4以下が液滴形成に好ましい。
【図10】液滴形成における温度依存性を示す。低温の方が液滴形成に好ましい。
【図11】液滴形成におけるP5のドメインの重要性を示す。全長P5が液滴形成に好ましい。
【図12】Ｐ５の新規構造。各チオレドキシン様ドメイン間は比較的可動性が高い。また溶液中で二量体を形成する。
【図13】上で、Ｐ５の二量体形成は結晶構造から、最初のa0ドメイン中の4番目のαヘリックに位置するロイシンジッパーモチーフを駆動力としていることがわかる。したがって、この部位をアラニンに置換すると、溶液中で単量体となる（下図）。
【図14】位相差顕微鏡によりＰ５単量体の会合体は野生型と同様に、液滴を形成できることを示す。
【図15】Ｐ５液滴によるグルタチオン濃縮。グルタチオンの分離には、逆相ＨＰＬＣを用いた。液滴形成後は殆ど全てグルタチオンが消失したことがわかる。
【図16】Ｐ５液滴による基質酸化的フォールディング触媒。基質のフォールディング状態には、逆相ＨＰＬＣを用いた。液滴形成後は酸化的フォールディング反応直後殆ど全て還元変性基質が消失したことがわかる。
【図17】Ｐ５液滴に対する有機溶媒の適用例。v/vで各種添加し、位相差顕微鏡で観察した。
【図19】液滴内部への取り込み程度を示す。GFPで蛍光標識した各種PDIファミリーを作成し、その取り込み具合を評価した結果、PDIは取りこみ難く、ERp46は取り込み易いことがわかる。
【図20】各種生物のＰ５のアミノ酸配列を示す。
【図21】液滴がアミロイド線維形成を抑制することを示す。縦軸は蛍光強度を示しており、アミロイド線維を特異的に検出するチオフラビンTを用いた実験であり、液滴を加えるとアミロイド線維が抑制されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明において、「タンパク質（タンパク）」は、アミノ酸がペプチド結合より重合したポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。
【0018】
液滴
本発明は、タンパク質の集合体を含む液滴であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメインを含む、液滴を提供する。
本発明は、タンパク質の集合体を含む液滴であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメインを含む、液滴を提供する。
【0019】
液滴（ドロプレット）とは、タンパク質が液液相分離している略球状の集合体であり、かつ熱変性等による不定形の凝集体とは異なり、前記タンパク質の集合が可逆性を有するものを示す。タンパク質が集合して液滴を形成する際、任意選択で核酸（例えば、DNA,RNA）、crowder（例えば、ficol, グリセロール）等のタンパク質以外の物質と組み合わさって液滴を形成してもよい。また、温度変化やpH変化によっても液滴形成する。
【0020】
本発明において、集合とは、タンパク質が集積することを意味する。典型的な実施形態において、液滴の形成は、分子レベルにおける分子の集合による液滴形成と、当該液滴の融合による顕微鏡で観察され得るレベルでの液滴成長により生じる。
【0021】
また前述のように、集合は、熱変性や化学変性などによるタンパク質の不定形の凝集体等と異なり、タンパク質の可逆性を有する集積である。従って、周辺環境における条件（集合を促進する因子の濃度、温度、ｐＨ、crowderによる排除体積効果等）を調整することによりタンパク質の集合による液滴の形成及び液滴を構成するタンパク質の解離による液滴の崩壊を制御することができる。
【0022】
また、典型的には、液滴を形成した状態では、タンパク質は互いに接触し得る距離で相互作用しているものの、凝集体とは異なり、流動性を有する。従って、タンパク質の分散体、液滴、凝集体は、物質の３状態（気体、液体、固体）に例えられることもある。具体的には、水溶液中にタンパク質が分散している状態は気体に例えられ、タンパク質等の構成成分が流動性を有する液滴は液体に例えられ、構成成分間の相互作用が強く流動性を有さない凝集体は固体に例えられる。また、水と油が混ざり合わずに、液液相分離するように、生物学的相分離はタンパク質を介して液滴形成する様子をいう。上記のように、本発明の主題である「液滴」とは、水、有機溶媒といった液体の粒子であったり、脂質二重膜等の膜で液体を包みこんでなる粒子ではなく、タンパク質が可逆的に集合して塊となったものを意図している。そのため可逆的なタンパク質の集合体である液滴は、酵素基質反応の多段階反応や効率的な化学的反応場としての報告がされつつあり、スーパーエンハンサーとしての使用用途がある。
【0023】
本発明においてチオレドキシン様ドメインを有するタンパク質としては、ＰＤＩ（Protein Disulfide Isomerase）ファミリータンパク質、人工タンパク質が挙げられる。これらは１種単独で用いても組合せて用いてもよい。ＰＤＩファミリータンパク質としては、例えば、ＰＤＩ、ＥＲｐ４６、ＥＲｐ７２、Ｐ５等が挙げられ、Ｐ５等が好ましい。人工タンパク質としては、例えば、ＰＤＩファミリータンパク質の改変体等が挙げられる。チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質は、全ての生物に存在し、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、酵母等の微生物に由来するもの等が挙げられる。
【0024】
前記チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質としては、シャペロン機能を有するものが好ましい。シャペロン機能とは、タンパク質の適切なフォールディングを補助する機能であり、シャペロン機能を有するタンパク質を用いることで、タンパク質の不可逆的な凝集を抑制し、可逆的な集合を促進することが期待できるため好ましい。また、従来、酵素活性及びシャペロン機能を共に有するタンパク質で液滴を形成できることは報告が無かったため、かかる点でも本発明は有用である。
【0025】
典型的な実施形態において、前記タンパク質としては１つ以上のチオレドキシン様ドメインを有するものが好ましい。タンパク質１つあたりのチオレドキシン様ドメインの数の下限は限定されないが、１つ以上が好ましく、２つ以上がより好ましい。タンパク質１つあたりのチオレドキシン様ドメインの数の上限も限定されないが、７つ以下が好ましく、６つ以下がより好ましく、５つ以下がより好ましく、４つ以下がより好ましい。タンパク質１つあたりのチオレドキシン様ドメインの数の範囲も限定されないが、
本発明において、チオレドキシン様ドメインとは、全ての生物に存在する酸化還元反応など様々な生命反応において重要な役割を担っている。本発明において、チオレドキシン様ドメインの分子量は、例えば、約10～15kDaであり、典型的には、13KDa程度である。酸化還元活性CxxCモチーフをもつチオレドキシン様ドメインはそのモチーフを介して直接ターゲット分子の酸化還元反応を触媒でき、酸化還元活性CxxCモチーフをもたないチオレドキシン様ドメインは基質認識などに関わる。ジスルフィド結合の還元・切断の活性は、例えば、非特許文献７に記載の方法により測定することができる。
本発明において、チオレドキシン様ドメインとは、全ての生物に存在する酸化還元反応など様々な生命反応において重要な役割を担っている。本発明において、チオレドキシン様ドメインの分子量は、例えば、約10～15kDaであり、典型的には、13KDa程度である。酸化還元活性CxxCモチーフをもつチオレドキシン様ドメインはそのモチーフを介して直接ターゲット分子の酸化還元反応を触媒でき、酸化還元活性CxxCモチーフをもたないチオレドキシン様ドメインは基質認識などに関わる。ジスルフィド結合の還元・切断の活性は、例えば、非特許文献７に記載の方法により測定することができる。
【0026】
ジスルフィド結合の還元・切断の活性を有するチオレドキシン様ドメインとしては、例えば、ＰＤＩファミリータンパク質であるＰ５におけるａ０ドメイン、ａドメイン等が挙げられる。また、ジスルフィド結合の還元・切断の活性を有するチオレドキシン様ドメインとしては図２０に示すようにＣＧＨＣのアミノ酸配列を有するものが好ましい。ａ０ドメインのアミノ酸配列としては、図２０（のアミノ酸配列）に示す各種生物のいずれかのａ０ドメインのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。ａドメインのアミノ酸配列としては、図２０（のアミノ酸配列）に示す各種生物のいずれかのａドメインのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。液滴を構成するタンパク質がチオレドキシン様ドメインとして、前述した、図２０に示すａ０ドメインのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列からなるものを有する場合、アミノ酸が付加、置換又は欠損する場所としては、複数種類の生物種で保存されているアミノ酸以外（例えば、図２０に示す７種のうち４種以上、５種以上、６種以上又は７種全て）で保存されているアミノ酸以外）の場所が好ましい。液滴を構成するタンパク質がチオレドキシン様ドメインとして、前述した、図２０に示すａドメインのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列からなるものを有する場合、アミノ酸が付加、置換又は欠損する場所としては、複数種類の生物種で保存されているアミノ酸以外（例えば、図２０に示す７種のうち４種以上、５種以上、６種以上又は７種全て）で保存されているアミノ酸以外）の場所が好ましい。
【0027】
ジスルフィド結合の還元・切断の活性を有さないチオレドキシン様ドメインとしては、例えば、Ｐ５におけるｂドメイン等が挙げられる。ｂドメインのアミノ酸配列としては、図２０（のアミノ酸配列）に示す各種生物のいずれかのｂドメインのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。液滴を構成するタンパク質がチオレドキシン様ドメインとして、前述した、図２０に示すｂドメインのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列からなるものを有する場合、アミノ酸が付加、置換又は欠損する場所としては、複数種類の生物種で保存されているアミノ酸以外（例えば、図２０に示す７種のうち４種以上、５種以上、６種以上又は７種全て）で保存されているアミノ酸以外）の場所が好ましい。
【0028】
また、本発明において前記チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質は、集合を促進する因子が結合し得る領域（集合促進因子結合領域）を有することが好ましい。集合促進因子としては、カルシウムイオン、他の金属イオン等が挙げられ、カルシウムイオン等が好ましい。ここで、集合促進因子結合領域とはEやDの配列を含み、集合促進因子を結合し得る領域を意味する。集合促進因子結合領域は、本発明のタンパク質におけるチオレドキシン様ドメイン等とは別の領域に存在してもよいし、チオレドキシン様ドメイン等の一部に含まれていてもよく、その両方でもよい。
【0029】
集合促進因子がカルシウムイオンである場合、集合促進因子結合領域をカルシウム結合領域と示すことがある。カルシウム結合領域は、ＥＦ－ｈａｎｄドメインのようにドメインを形成していてもよい。カルシウム結合領域としては、例えば、Ｐ５におけるカルシウム結合領域等が挙げられる。
Ｐ５におけるカルシウム結合領域のアミノ酸配列としては、図２０に示すアミノ酸配列におけるカルシウム結合領域部分、より具体的には
PTIVEREPWDGRDGELPVEDDIDLSDVELDDLGKDEL（配列番号１）、PTITPREPWDGKDGELPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号２）、PKIHAVEPWDGKDGELPVEDDIDLSDVDLDDIWDKDEL（配列番号３）、PTISTREPWDGKDGELPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号４）、PAISVRDPWDGQDGVLPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号５）、PKIHTVEAWDGKDGVLPVEDDIDLSDVDLDDLDKDEL（配列番号６）、PKINTVQAWDGKDGELPMEDDIDLSDVDLDDLEKDEL（配列番号７）のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。液滴を構成するタンパク質がカルシウム結合領域として、上記配列番号１～７のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列からなるものを有する場合、アミノ酸が付加、置換又は欠損する場所としては、複数種類の生物種で保存されているアミノ酸以外（例えば、図２０に示す７種のうち４種以上、５種以上、６種以上又は７種全て）で保存されているアミノ酸以外）の場所が好ましい。
Ｐ５におけるカルシウム結合領域のアミノ酸配列としては、図２０に示すアミノ酸配列におけるカルシウム結合領域部分、より具体的には
PTIVEREPWDGRDGELPVEDDIDLSDVELDDLGKDEL（配列番号１）、PTITPREPWDGKDGELPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号２）、PKIHAVEPWDGKDGELPVEDDIDLSDVDLDDIWDKDEL（配列番号３）、PTISTREPWDGKDGELPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号４）、PAISVRDPWDGQDGVLPVEDDIDLSDVELDDLEKDEL（配列番号５）、PKIHTVEAWDGKDGVLPVEDDIDLSDVDLDDLDKDEL（配列番号６）、PKINTVQAWDGKDGELPMEDDIDLSDVDLDDLEKDEL（配列番号７）のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。液滴を構成するタンパク質がカルシウム結合領域として、上記配列番号１～７のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列からなるものを有する場合、アミノ酸が付加、置換又は欠損する場所としては、複数種類の生物種で保存されているアミノ酸以外（例えば、図２０に示す７種のうち４種以上、５種以上、６種以上又は７種全て）で保存されているアミノ酸以外）の場所が好ましい。
【0030】
本発明においては、集合促進因子結合領域（カルシウム結合領域等）がチオレドキシン様ドメインのいずれかの一部に含まれていてもよいが、チオレドキシン様ドメイン以外に集合促進因子結合領域を有していることが好ましい。本発明においては、液滴を構成するタンパク質としては、ジスルフィド結合の還元・切断の活性を有するチオレドキシン様ドメインを２つ、ジスルフィド結合の還元・切断の活性を有さないチオレドキシン様ドメインを１つ及び集合促進因子結合領域を１つ有するものが好ましい。
【0031】
また、本発明においては、チオレドキシン様ドメインとチオレドキシン様ドメインとの間、集合促進因子結合領域と集合促進因子結合領域との間、チオレドキシン様ドメインと集合促進因子結合領域との間等にリンカー配列を有することが好ましい。またリンカーがセリン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、リシン及びチロシンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含むことが好ましい。これらのアミノ酸残基は立体障害となりにくいため、当該リンカーを介して結合された各ドメインがフレキシブルに動くことができ、液滴形成に適した配置を取りやすくなるため好ましい。また、本発明において、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質がリンカー配列を有する場合、当該リンカー配列は一定の長さを有することが好ましい。当該リンカー配列は一定の長さを有することでチオレドキシン様ドメインの溶解性が低下し、液滴形成に対し好適に寄与していることが予想される。従って、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質がリンカー配列を有する場合、少なくとも１個のリンカー配列（例えば、後述するａ０ドメインとａドメインとの間のリンカー配列、ｂドメインとカルシウム結合領域との間のリンカー配列等）は、５アミノ酸以上であることが好ましく、２５アミノ酸以上であることがさらに好ましい。また、各リンカー配列の長さの上限は特に限定されないが、例えば、５０アミノ酸以下であることが好ましい。
【0032】
また、液滴を構成するタンパク質としては、上記ドメインを有するタンパク質に小胞体局在のためのシグナル配列を融合させてもよい。シグナル配列としては、図２０にsignal sequenceとして示すアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列等が挙げられる。
【0033】
液滴を構成するタンパク質としてＰ５又はその改変体を用いる場合、ａ０ドメイン、ａドメイン及びｂドメインを全て含むものが好ましい。また、かかるタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、図２０に示す各種生物のいずれかの、ａ０ドメイン、ａドメイン、ｂドメイン及びカルシウム結合領域のアミノ酸配列を有するもの（かかるアミノ酸配列としては、好ましくは、さらにａ０ドメインとａドメインとの間のリンカー配列、ａドメインとｂドメインとの間のリンカー配列及びｂドメインとカルシウム結合領域との間のリンカー配列を有するもの、上記リンカー配列に加え、シグナル配列も有するもの等も挙げられる）、当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。アミノ酸が上記基準となるアミノ酸から付加、置換又は欠損している場合、その位置としては、例えば、前述の位置等が挙げられる。また、液滴を構成するタンパク質としては、図２０に示す各種生物のいずれかのＰ５のアミノ酸配列を有するもの、当該アミノ酸配列において１個以上（例えば、１～５個、１～３個、１～２個）のアミノ酸が付加、置換又は欠損したアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。
【0034】
また、本発明においては、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質は、単量体でもよいが、二量体以上（二量体、三量体、四量体又はそれより大きいもの）を形成することが好ましい。本明細書において二量体以上を形成しているタンパク質を総称して、多量体と示すこともある。本発明においては、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質はこれらの単量体及び多量体から選択される２種類以上の混合物であってもよい。
【0035】
また、本発明においては、液滴を構成するタンパク質は、構造不定形の領域を有し、当該構造不定形領域のＮおよびＣ末端にうち少なくとも１つのチオレドキシン結合領域であるような構造を有することが好ましい。また、本発明においては、タンパク質の単量体１つあたりカルシウム結合部位が１箇所存在することが好ましい。特に構造不定形の領域にカルシウムが結合するのが好ましい。本発明の液滴を構成するタンパク質は、上記３つの特徴をいずれも有している構造が好ましい。
【0036】
本発明の典型的な実施形態において、液適は略球形の形態を有する。また、本発明の一実施形態において、液適は、平均粒子径が５０ｎｍ以上であることが好ましい。本発明においては液適同士が融合し得ることもあり、液適の平均粒子径の上限は限定されないが、例えば、２０μｍ以下であることが好ましい。かかる実施形態において、平均粒子径は動的光散乱装置を用いて測定することができ、より具体的には、後述する実施例に記載する方法により測定することができる。
【0037】
本発明において液滴は、水性又は有機性の液体中に分散した状態で得ることができる。したがって、本発明は、液滴の分散液も提供する。本発明の液滴の分散液は、典型的には、ゲル状の性状を示す。本発明の液滴の分散液の上限は特に限定されないが、１０以下が好ましく、９以下がより好ましく、７．４以下がさらに好ましい。本発明の液滴の分散液においてｐＨの範囲は特に限定されないが、例えば、２～１０が好ましく、５～９がより好ましく、６～７．４がさらに好ましい。
【0038】
液滴の製造方法
本発明は、集合促進因子の存在下で、タンパク質を集合させる工程を含む、液滴の製造方法であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、チオレドキシン様ドメインを含む、方法を提供する。集合促進因子、チオレドキシン様ドメインを含むタンパク質等については前述の通りである。
本発明は、集合促進因子の存在下で、タンパク質を集合させる工程を含む、液滴の製造方法であって、該タンパク質がＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、チオレドキシン様ドメインを含む、方法を提供する。集合促進因子、チオレドキシン様ドメインを含むタンパク質等については前述の通りである。
【0039】
本発明の方法は、集合促進因子の存在下で、タンパク質を集合させる工程を含む。典型的な実施形態においては、当該工程は、集合促進因子とタンパク質とを混合させることにより行われる。また、当該工程は、通常、水性又は有機性の液体、好ましくは水性の液体中で行う。水性の液体としては、水、エタノール、メタノール、トリフルオロエタノール等が挙げられる。有機性の液体としては、ホルムアミド、エチレングリコール等が挙げられる。これらの液体は、１種単独で又は２種以上を混合して使用することができる。例えば、水に対し、エタノール、メタノール、トリフルオロエタノールからなる群より選択される少なくとも１種を混合して用いることができる。かかる実施形態において、エタノール、メタノール、トリフルオロエタノールからなる群より選択される少なくとも１種の親水性液体の配合割合（ｖ／ｖ）は、水と当該親水性液体との混合液の容量を基準にして、例えば、１５％以下、好ましくは１３％以下、より好ましくは１０％以下で設定できる。かかる実施形態において、上記親水性液体の配合割合は、水と当該親水性液体との混合液の容量を基準にして、例えば、１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上で設定できる。当該工程を液体中で行う場合、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質及び集合促進因子以外の成分を当該液体に添加してもよい。チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質及び集合促進因子以外の成分としては、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン等のｐＨ調整剤、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤等が挙げられる。これらの成分は１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0040】
チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質の使用量としては特に限定されないが、例えば、当該工程を液体中で行う場合、５μＭ以上が好ましく、２０μＭ以上がより好ましい。集合促進因子の使用量も特に限定されないが、当該工程を液体中で行う場合、５００～μＭが好ましく、４ｍＭ以上がより好ましい。
【0041】
当該工程においてｐＨの上限は特に限定されないが、１０以下が好ましく、９以下がより好ましく、７．４以下がさらに好ましい。当該工程においてｐＨの範囲は特に限定されないが、例えば、２～１０が好ましく、５～９がより好ましく、６～７．４がさらに好ましい。当該工程を行う際の温度も特に限定されないが、例えば、０～７０℃が好ましく、０～２０℃がより好ましい。当該工程を行う時間も特に限定されないが、例えば、１分以上が好ましく、１０～６０分がより好ましい。当該工程を行うことにより、チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質が集合促進因子の働きにより集合し、液滴が形成される。
【0042】
本発明の方法においては、さらに、得られた液滴を回収する工程を行ってもよい。自体公知の方法（濾過、遠心分離、クロマトグラフィー等）を適宜用いることができる。
【実施例】
【0043】
試験例１
大腸菌発現用ｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素ＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイト間に、Ｈｉｓ×６タグを付加した組換えＰ５の塩基配列を挿入し、プラスミドを作製した。Ｐ５プラスミドをコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換後、ＬＡ寒天培地（ＬＢ寒天培地＋５０ｍｇ／Ｌアンピシリン）で一晩、３７℃で培養した。寒天培地からシングルコロニーをピックアップし、１００ｍＬ ＬＡ培地（１００ｍＬ ＬＢ培地＋５ｍｇアンピシリン）に植菌後、一晩、３７℃で振とう培養した。２Ｌ ＬＢ培地に１００ｍｇアンピシリン、前培養液を２０ｍＬ加え、４時間、３７℃で振とう培養した。４時間（ＯＤ＝０．５程度）後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるように加え、さらに４時間、３７℃で振とう培養した。４時間後、遠心分離し（５０００×ｇ，１０分，４℃）、集菌した。菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶菌後、ホモジナイザーで破砕した。破砕溶液を遠心分離し（１２０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）、さらに上清を超遠心分離し（３８０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）、上清を回収した。上清に緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化済みのＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、１時間、４℃で撹拌した。１時間後、オープンカラムにかけ、４０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で２回洗浄し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で５回溶出した。溶出した試料を１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μＬまで濃縮した。濃縮した試料をＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ）を利用した強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ １０／１００ＧＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ精製した。その際、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１ｍＭ ＥＤＴＡ）、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。溶出した試料を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２５０μＬまで濃縮した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。その際、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。溶出した試料を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μＬまで濃縮し、ＢＣＡ法により濃度定量し、高純度精製品を得た（図１）。
高純度精製品である、Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によって見出した（図１）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５０μＭタンパク質濃度で行った。カルシウムのキレート剤であるＥＤＴＡをカルシウム依存的なＰ５会合状態に滴定すると、非会合状態Ｐ５への変換される（図２）。以上の結果からＰ５はカルシウム依存的に可逆的に集合できる。
大腸菌発現用ｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素ＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイト間に、Ｈｉｓ×６タグを付加した組換えＰ５の塩基配列を挿入し、プラスミドを作製した。Ｐ５プラスミドをコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換後、ＬＡ寒天培地（ＬＢ寒天培地＋５０ｍｇ／Ｌアンピシリン）で一晩、３７℃で培養した。寒天培地からシングルコロニーをピックアップし、１００ｍＬ ＬＡ培地（１００ｍＬ ＬＢ培地＋５ｍｇアンピシリン）に植菌後、一晩、３７℃で振とう培養した。２Ｌ ＬＢ培地に１００ｍｇアンピシリン、前培養液を２０ｍＬ加え、４時間、３７℃で振とう培養した。４時間（ＯＤ＝０．５程度）後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるように加え、さらに４時間、３７℃で振とう培養した。４時間後、遠心分離し（５０００×ｇ，１０分，４℃）、集菌した。菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶菌後、ホモジナイザーで破砕した。破砕溶液を遠心分離し（１２０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）、さらに上清を超遠心分離し（３８０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）、上清を回収した。上清に緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化済みのＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、１時間、４℃で撹拌した。１時間後、オープンカラムにかけ、４０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で２回洗浄し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で５回溶出した。溶出した試料を１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μＬまで濃縮した。濃縮した試料をＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ）を利用した強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ １０／１００ＧＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ精製した。その際、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１ｍＭ ＥＤＴＡ）、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。溶出した試料を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２５０μＬまで濃縮した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。その際、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。溶出した試料を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認後、Ｐ５の溶出画分をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μＬまで濃縮し、ＢＣＡ法により濃度定量し、高純度精製品を得た（図１）。
高純度精製品である、Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によって見出した（図１）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５０μＭタンパク質濃度で行った。カルシウムのキレート剤であるＥＤＴＡをカルシウム依存的なＰ５会合状態に滴定すると、非会合状態Ｐ５への変換される（図２）。以上の結果からＰ５はカルシウム依存的に可逆的に集合できる。
【0044】
試験例２．
上記試験例１のカルシウム依存的なＰ５の会合体を、対物レンズＵＣＰＬＦＬＮ ２０×ＰＨ（ＮＡ０．７）を装着した共焦点レーザー走査型生物顕微鏡（ＦＶ１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ）で位相差観察した。カルシウム依存的なＰ５会合体はほぼ真球状の粒子として観察された。時間経過とともに会合体同士が融合する様子も観察され、会合体が成長することが示された（図３）。
上記試験例１のカルシウム依存的なＰ５の会合体を、対物レンズＵＣＰＬＦＬＮ ２０×ＰＨ（ＮＡ０．７）を装着した共焦点レーザー走査型生物顕微鏡（ＦＶ１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ）で位相差観察した。カルシウム依存的なＰ５会合体はほぼ真球状の粒子として観察された。時間経過とともに会合体同士が融合する様子も観察され、会合体が成長することが示された（図３）。
【0045】
試験例３．
通常の凝集体と異なり、液滴は流動性を持つため、内外で物質の出入りが生じている。光褪色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）は液滴様の会合体について物質特性や関連する分子輸送ダイナミクスを調べるための一般的な方法とされる（Ｂｒａｃｈａ ２０１９ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。そこで、カルシウム依存的なＰ５会合体が液滴かどうかを検証するため、ＦＲＡＰ実験を行った。このとき、上記試験例１と同様の組成に加えて、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）を融合させたＰ５（ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５）を共存させた試料を調製し（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０μＭ Ｐ５、４μＭ ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５）、試験例２と同様に観察した（図４）。ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５は５５９ｎｍのレーザーで励起し、位相差および蛍光画像を取得した。上図で示すように、位相差画像で観察されるＰ５会合体にｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５の蛍光が確認され、Ｐ５会合体にｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が取り込まれていることが示された。その後、会合体を光退色させたところ、会合体の蛍光が時間変化とともに回復することを確認した（図４、下図。測定は３回行い、いずれも同様の結果が得られた。図４左下図にはそれらのうち１回分のグラフを示す。統計的解析結果を図４右下図に示す）。この結果は、会合体内部で退色したｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が排出され、新たに外部から無傷なｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が流入したことを示しており、カルシウム依存的なＰ５会合体が流動性を持つ液滴であることを裏付ける。
通常の凝集体と異なり、液滴は流動性を持つため、内外で物質の出入りが生じている。光褪色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）は液滴様の会合体について物質特性や関連する分子輸送ダイナミクスを調べるための一般的な方法とされる（Ｂｒａｃｈａ ２０１９ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。そこで、カルシウム依存的なＰ５会合体が液滴かどうかを検証するため、ＦＲＡＰ実験を行った。このとき、上記試験例１と同様の組成に加えて、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）を融合させたＰ５（ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５）を共存させた試料を調製し（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０μＭ Ｐ５、４μＭ ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５）、試験例２と同様に観察した（図４）。ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５は５５９ｎｍのレーザーで励起し、位相差および蛍光画像を取得した。上図で示すように、位相差画像で観察されるＰ５会合体にｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５の蛍光が確認され、Ｐ５会合体にｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が取り込まれていることが示された。その後、会合体を光退色させたところ、会合体の蛍光が時間変化とともに回復することを確認した（図４、下図。測定は３回行い、いずれも同様の結果が得られた。図４左下図にはそれらのうち１回分のグラフを示す。統計的解析結果を図４右下図に示す）。この結果は、会合体内部で退色したｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が排出され、新たに外部から無傷なｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ５が流入したことを示しており、カルシウム依存的なＰ５会合体が流動性を持つ液滴であることを裏付ける。
【0046】
試験例４．
液滴形成の最適条件を検証するため、カルシウムとＰ５濃度の条件を検索した。試験例１に記載の方法により得られる液滴でないＰ５の溶液（５～１００ μＭ Ｐ５）とカルシウム溶液とを各濃度で混合し１０分静置し、その後１５０００ｇ、４度、３０分の遠心分離によって液滴を沈殿に分画し、上清画分の濃度を検量した。その結果、Ｐ５が液滴を形成するためには臨界濃度が２０μＭであり、カルシウムは４ｍＭ以上が適切であることを示した（図５）。
液滴形成の最適条件を検証するため、カルシウムとＰ５濃度の条件を検索した。試験例１に記載の方法により得られる液滴でないＰ５の溶液（５～１００ μＭ Ｐ５）とカルシウム溶液とを各濃度で混合し１０分静置し、その後１５０００ｇ、４度、３０分の遠心分離によって液滴を沈殿に分画し、上清画分の濃度を検量した。その結果、Ｐ５が液滴を形成するためには臨界濃度が２０μＭであり、カルシウムは４ｍＭ以上が適切であることを示した（図５）。
【0047】
試験例５．
カルシウム結合領域を同定するために、Ｐ５の各種変異体を作製し、等温滴定型熱量計ＩＴＣにより、相互作用解析を行った。Ｐ５のカルシウム結合部位を特定するため、Ｐ５の各種変異体を図６のように作成し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５の条件で、ＩＴＣ実験を行った。その結果、Ｃ末端に位置する構造不定形領域にカルシウムが結合することを見出した（図６）。
カルシウム結合領域を同定するために、Ｐ５の各種変異体を作製し、等温滴定型熱量計ＩＴＣにより、相互作用解析を行った。Ｐ５のカルシウム結合部位を特定するため、Ｐ５の各種変異体を図６のように作成し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５の条件で、ＩＴＣ実験を行った。その結果、Ｃ末端に位置する構造不定形領域にカルシウムが結合することを見出した（図６）。
【0048】
試験例６．
液滴形成をリアルタイム観察するために、tomocube (http://www.tomocube.com/)を用い、屈折率を測定した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２の条件で、Ｐ５ ５０μＭ、４ｍＭ ＣａＣｌ２を添加する以外、試験例１と同様にしてＰ５の会合体を調製し、ＣａＣｌ２の添加後１０分以内に測定を開始した。図７に、測定開始直後（図７左）、測定開始約１２秒後（図７真ん中）、約１４秒後（図７右）の画像を示す。その結果、真ん中の図は液滴同士の融合しようとする瞬間を捉えた画像を示す。また液滴表面が比較的ラフであることから、流動性が高いことを意味する（図７）。
液滴形成をリアルタイム観察するために、tomocube (http://www.tomocube.com/)を用い、屈折率を測定した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２の条件で、Ｐ５ ５０μＭ、４ｍＭ ＣａＣｌ２を添加する以外、試験例１と同様にしてＰ５の会合体を調製し、ＣａＣｌ２の添加後１０分以内に測定を開始した。図７に、測定開始直後（図７左）、測定開始約１２秒後（図７真ん中）、約１４秒後（図７右）の画像を示す。その結果、真ん中の図は液滴同士の融合しようとする瞬間を捉えた画像を示す。また液滴表面が比較的ラフであることから、流動性が高いことを意味する（図７）。
【0049】
試験例７．
液滴内部に各種酵素・シャペロンおよびグルタチオンが濃縮出来るかを検証するため、tomocubeで屈折率と蛍光観察により評価した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２の条件で、Ｐ５ ５０μＭ、４ｍＭ ＣａＣｌ２を添加する以外、試験例１と同様にしてＰ５の会合体を調製し、ＣａＣｌ２の添加後、１０分以内に測定した。また、ＧＦＰ融合した各種酵素・シャペロン、蛍光標識したグルタチオンは５μＭ添加した。図は屈折率(RI)で液滴であることを裏付け、蛍光標識した各種酵素・シャペロン、グルタチオンで局在を表す。小胞体内局在酵素・シャペロンであるERp46, ERp72, ERp57, ERp44は液滴内部に濃縮されやすいが、PDIは液滴内部に入りにくいことを示す。また、mCherry-ERp57とGFP-ERp72を使用することで、液滴内部に少なくとも二種の酵素・シャペロンを濃縮できることを示す。また、ATTO532標識したグルタチオンも本液滴内部に濃縮できる（図８）。当該図８に示すようにPDIのみdroplet内部への取り込みを嫌うが、その他PDI familyを濃縮できる。従って、他の酵素を濃縮でき、酵素を使った産業への応用が期待される。
液滴内部に各種酵素・シャペロンおよびグルタチオンが濃縮出来るかを検証するため、tomocubeで屈折率と蛍光観察により評価した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２の条件で、Ｐ５ ５０μＭ、４ｍＭ ＣａＣｌ２を添加する以外、試験例１と同様にしてＰ５の会合体を調製し、ＣａＣｌ２の添加後、１０分以内に測定した。また、ＧＦＰ融合した各種酵素・シャペロン、蛍光標識したグルタチオンは５μＭ添加した。図は屈折率(RI)で液滴であることを裏付け、蛍光標識した各種酵素・シャペロン、グルタチオンで局在を表す。小胞体内局在酵素・シャペロンであるERp46, ERp72, ERp57, ERp44は液滴内部に濃縮されやすいが、PDIは液滴内部に入りにくいことを示す。また、mCherry-ERp57とGFP-ERp72を使用することで、液滴内部に少なくとも二種の酵素・シャペロンを濃縮できることを示す。また、ATTO532標識したグルタチオンも本液滴内部に濃縮できる（図８）。当該図８に示すようにPDIのみdroplet内部への取り込みを嫌うが、その他PDI familyを濃縮できる。従って、他の酵素を濃縮でき、酵素を使った産業への応用が期待される。
【0050】
試験例８．
Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により、Ｐ５液滴形成のpH依存性を評価した（図９）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．７、７．０、７．４、７．６、７．８又は８．０、５０μＭタンパク質濃度で行った。図９に記載のように、ｐＨ 7.4以下が液滴形成に好ましい。
Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により、Ｐ５液滴形成のpH依存性を評価した（図９）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．７、７．０、７．４、７．６、７．８又は８．０、５０μＭタンパク質濃度で行った。図９に記載のように、ｐＨ 7.4以下が液滴形成に好ましい。
【0051】
試験例９．
Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により、Ｐ５液滴形成の温度依存性を評価した（図１０）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０μＭタンパク質濃度で行い、１０℃、２０℃又は３０℃で行う以外、試験例１と同様にしてカルシウム滴定を行った。図１０に示すように低温の方が液滴形成に好ましい。
Ｐ５にカルシウムを滴定し、Ｐ５がカルシウム滴定に応じて会合することを粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により、Ｐ５液滴形成の温度依存性を評価した（図１０）。Ｐ５タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０μＭタンパク質濃度で行い、１０℃、２０℃又は３０℃で行う以外、試験例１と同様にしてカルシウム滴定を行った。図１０に示すように低温の方が液滴形成に好ましい。
【0052】
試験例１０．
滴定形成に必要なＰ５内部の領域を同定するため、図１１に記載の各変異体Ｐ５を作成し、粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により機能部位の評価を行った（図１１）。Ｐ５および変異体タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５０μＭタンパク質濃度で用いる以外、試験例１と同様にしてカルシウム滴定を行った。図１１に示すように全長P5が液滴形成に好ましい。
滴定形成に必要なＰ５内部の領域を同定するため、図１１に記載の各変異体Ｐ５を作成し、粒子径を評価できる動的光散乱装置Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）により機能部位の評価を行った（図１１）。Ｐ５および変異体タンパク質溶液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５０μＭタンパク質濃度で用いる以外、試験例１と同様にしてカルシウム滴定を行った。図１１に示すように全長P5が液滴形成に好ましい。
【0053】
試験例１１．
25 μM Aβ４０(アミロイドベータ１－４０、株式会社ペプチド研究所)のアミロイド線維形成は、攪拌機能がある蛍光プレートリーダー(SH-9000Lab, Corona Electric)を用いて、検出した。具体的には、チオフラビンT 2.5 μＭ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む水溶液（ｐＨ７．２）にAβ４０を２５μＭとなるよう添加した。チオフラビンTは線維検出出来る蛍光分子であり、図２１のようにアミロイド線維の進行を確認することが出来る（図２１「only Aβ40」）。一方、チオフラビンT 2.5 μM及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む水溶液（ｐＨ７．２）にＰ５を５０μＭとなるように添加し、Ｃａ２+を４ ｍＭとなるように添加したものにAβ４０を２５μＭとなるよう添加した際、アミロイド線維形成は完全に抑制された（図２１「only Aβ40+P5 droplet」）。本条件ではＰ５は液滴を形成するため、液滴がアミロイド線維形成を抑制するシャペロンとして働くことがわかる。
25 μM Aβ４０(アミロイドベータ１－４０、株式会社ペプチド研究所)のアミロイド線維形成は、攪拌機能がある蛍光プレートリーダー(SH-9000Lab, Corona Electric)を用いて、検出した。具体的には、チオフラビンT 2.5 μＭ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む水溶液（ｐＨ７．２）にAβ４０を２５μＭとなるよう添加した。チオフラビンTは線維検出出来る蛍光分子であり、図２１のようにアミロイド線維の進行を確認することが出来る（図２１「only Aβ40」）。一方、チオフラビンT 2.5 μM及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む水溶液（ｐＨ７．２）にＰ５を５０μＭとなるように添加し、Ｃａ２+を４ ｍＭとなるように添加したものにAβ４０を２５μＭとなるよう添加した際、アミロイド線維形成は完全に抑制された（図２１「only Aβ40+P5 droplet」）。本条件ではＰ５は液滴を形成するため、液滴がアミロイド線維形成を抑制するシャペロンとして働くことがわかる。
【0054】
試験例１２．カルシウムが結合しないＰ５の構造情報を抽出するために、Ｘ線小角散乱法とＸ線結晶構造解析によってＰ５全長構造を決定した（図１２）。Ｐ５全長構造の決定は、非特許文献８に記載の方法に従い行った。液滴でないＰ５を調製するため、測定直前に、試験例１に記載の方法で得られたＰ５の溶液を緩衝液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）でゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。溶出した試料をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ，１００００：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、濃度３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。液滴でないＰ５のＸ線小角散乱（ｓｍａｌｌ ａｎｇｌｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＡＸＳ）実験は、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ４５ＸＵにて、検出器ＰＩＬＡＴＵＳ ３Ｘ ２Ｍ （ＤＥＣＴＲＩＳ）、Ｘ線波長１．０Å、Ｘ線露光時間１秒×２０、カメラ長２．０ｍ、温度２０．２℃の条件下で行い、それぞれの散乱パターンが得られた。散乱パターンのギニエ近似により慣性半径が算出され、ＧＮＯＭソフトウェアにより距離分布関数が得られた。これらのデータをもとにＧＡＪＯＥソフトウェアにより、液滴でないＰ５の分子構造を構築した。その結果、各チオレドキシン様ドメイン間は柔軟性に富んでいる点と、二量体を形成していることを示した。二量体形成領域は結晶構造より、ロイシンジッパーモチーフを呈しており、この部位をアラニンに置換することにより、単量体へのＰ５変異体を作製可能である（図１３）。尚、この単量体Ｐ５変異体も、野生型よりも液滴形成能は落ちるものの、液滴を形成する能力を有する（図１４）。
【0055】
試験例１３．Ｐ５液滴が低分子であるグルタチオンを濃縮できるのかを検証するため、試験例１に記載の方法により得られる５００μＭの液滴でないＰ５の溶液（終濃度５０ μＭ Ｐ５）に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，４ｍＭ Ｃａ，［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］＝［１ｍＭ］／［０．２ｍＭ］を１：９の割合（モル比）で混合し、終濃度Ｐ５を５０μＭとし、３０分１０度で静置し、９００ｇ１５分、４度で遠心分離し、上清のグルタチオン濃度を検出した。その結果、液滴を形成する前と比べ、殆ど全てのグルタチオンが消失し、液滴に取り込まれたことから、グルタチオンがＰ５中に濃縮されたことがわかる（図１５）。
【0056】
試験例１４．Ｐ５液滴中でのフォールディング触媒を検証するため、基質としてＢＰＴＩ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を採用した。液滴を形成していないＰ５はＢＰＴＩの酸化的フォールディングを触媒する（図１６左図）。一方、５００μＭ 液滴でないＰ５に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，５０μＭ Ｐ５，４ｍＭ Ｃａ，［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］＝［１ｍＭ］／［０．２ｍＭ］を１：９の割合で混合し、終濃度Ｐ５を５０μＭとし、１０分３７度で静置し液滴を形成させたのちに、基質ＢＰＴＩ３０μＭを加え、液滴を形成させた条件では、１分でＢＰＴＩの酸化的フォールディングが進行せずに、液滴に取り込まれたことがわかる（図１６右図）。これはＰ５液滴が変性基質を濃縮し、保管する役割があることを意味する。また、反応液を２０ｍＭ Ｎエチルマレイミドを添加することで反応を停止し、ＢＰＴＩ抗体で検出した結果、ＢＰＴＩのダイマー、トライマーと思われる泳動バンドが観察された。チオレドキシン様ドメインを有するタンパク質の液滴にグルタチオンが濃縮されているという特殊な状況により、かかる反応が生じたものと考えられる。
【0057】
試験例１５．有機溶媒によるＰ５液滴への影響を調べるため、試験例２で得られたＰ５液滴に、５％ｖ／ｖのメタノール、エタノール又はトリフルオロエタノールを加え、位相差顕微鏡で観察した。ｖ／ｖで５％程度の有機溶媒の添加ではＰ５液滴は形状を保持する（図１７）。尚、本試験例ではＰ５を用いて液滴を製造したが、液滴Ｐ５を形成後ＧＦＰ－ＰＤＩファミリーを添加し、内部に内包できる性質があることから、Ｐ５以外の、ＰＤＩファミリータンパク質及び／又は人工タンパク質であり、かつチオレドキシン様ドメインを有するタンパク質でも液滴を製造し得るものと考えられる。
【0058】
試験例１６．Ｐ５液滴へのタンパク質の取り込みを調べるため、試験例１と同様にして得られた、蛍光タンパク質ＧＦＰと融合させたＰＤＩファミリータンパク質とＰ５との混合溶液（モル比１：５）を調製し、カルシウム添加によって液滴形成させた後に１５０００ｘｇ・１５分遠心することにより、凝縮層（液滴内に相当）と希薄層（液滴外に相当）に分離した。液滴形成前の４８８ｎｍ吸光度と，液滴形成・遠心分離後の希薄層の４８８ｎｍ吸光度を計測することによって、液滴内部に取り込まれたＧＦＰ融合タンパク質の割合を算出した。結果を図１８、１９に示す。試験の結果、ＧＦＰを融合したＰＤＩファミリータンパク質が２割程度Ｐ５ ｄｒｏｐｌｅｔに取り込まれることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0059】
酵素液滴（酵素タンパク質により構成される液適）等の液滴は、バイオ医薬、美容業界、工業用酵素、食品業界（アルコール飲料業界等）での応用が期待できる。より具体的には、例えば、液滴の技術は、インスリン、免疫グロブリンなどジルフィド含有蛋白質製剤の品質管理、ジスルフィド結合の修復(毛髪のリペアなど)、酸化還元分子GSHの濃縮、deliverでの使用、Parkinson病、糖尿病などの治療での使用、シャペロン濃縮による神経変性疾患への応用等が期待できる。本発明により提供される新規の液滴は、上記の分野において応用しうるものであるため、産業上非常に有用なものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】