(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-14
(45)【発行日】2022-12-22
(54)【発明の名称】ナトリウム－水素交換体３阻害剤化合物
(51)【国際特許分類】
C07D 217/14 20060101AFI20221215BHJP
A61K 31/472 20060101ALI20221215BHJP
C07D 409/12 20060101ALI20221215BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20221215BHJP
A61P 5/18 20060101ALI20221215BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20221215BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20221215BHJP
【ＦＩ】
C07D217/14 CSP
A61K31/472
C07D409/12
A61K31/496
A61P5/18
A61P9/12
A61P9/04
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021565751
(86)(22)【出願日】2020-05-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-06
(86)【国際出願番号】 US2020031999
(87)【国際公開番号】W WO2020231770
(87)【国際公開日】2020-11-19
【審査請求日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】62/848,652
(32)【優先日】2019-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(72)【発明者】
【氏名】ガバーディナス，コスタス
(72)【発明者】
【氏名】ジャダブ，プラバカル
(72)【発明者】
【氏名】ワン，シャオジュン
(72)【発明者】
【氏名】ウェッテロー，ジョン ロウリー
【審査官】高橋 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１６７７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５２１３０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０３４８８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Biochimica et Biophysica Acta，2008年，1778，811-823
【文献】J Am Soc Nephrol，2015年，26，1138-1149
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ２１７／１４
Ａ６１Ｋ ３１／４７２
Ｃ０７Ｄ ４０９／１２
Ａ６１Ｋ ３１／４９６
Ａ６１Ｐ ５／１８
Ａ６１Ｐ ９／１２
Ａ６１Ｐ ９／０４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式：【化1】
【請求項2】
両方のＲがＣ（Ｏ）ＮＨ２である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
前記化合物が、【化2】
【請求項4】
前記化合物が、【化3】
【請求項5】
前記化合物が、【化4】
【請求項6】
【化5】
【請求項7】
【化6】
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、哺乳動物における慢性腎臓病、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、高血圧および心血管疾患からなる群から選択される疾患の治療剤。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩と、式：【化7】
【請求項10】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８または９に記載の治療剤。
【請求項11】
前記哺乳動物がイヌである、請求項８または９に記載の治療剤。
【請求項12】
前記哺乳動物がネコである、請求項８または９に記載の治療剤。
【請求項13】
慢性腎臓病、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、高血圧または心血管疾患の治療剤の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項14】
式：【化8】
【請求項15】
請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩と同時に、別個にまたは逐次的に組み合わせた使用のための、式：【化9】
【請求項16】
請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項17】
式：【化10】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本発明は、新規のナトリウム－水素交換体３（ＮＨＥ３）阻害剤化合物、化合物を含む医薬組成物、ならびにナトリウムおよび／またはリン酸塩レベルの上昇に関連するある特定の疾患の処置のための化合物の使用に関する。本発明はさらに、ある特定のナトリウム依存性リン酸共輸送体（ＮＰＴ２ｂ）阻害剤と組み合わせた新規のＮＨＥ３化合物の使用に関する。
【0002】
ＮＨＥ３は、哺乳類の小腸、結腸、胆嚢、腎近位尿細管、ヘンレループの太い脚と細い脚に存在する上皮ナトリウム－水素交換体である。腸では、ＮＨＥ３調節は消化の一環として急激に起こり、食後すぐに阻害される。ＮＨＥ３ヌルマウスは、ナトリウム－流体バランスが乱れていることを示し、体積の恒常性を維持する上でのＮＨＥ３の役割を強調しており、ＮＨＥ３が腸のナトリウム摂取の主な原因であることを示している。さらに、最近のインビボ研究では、ＮＨＥ３阻害が腸のリン酸塩吸収の減少を引き起こすことが示された（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．－Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００４，４４７：５４９－５６５、Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．，２０１８，１０，１－１７）。
【0003】
西洋型食生活に遍在するナトリウムの過剰摂取は、高血圧の症状と強く関連しており、一方これは心血管疾患と腎臓病のリスクの増加と関連している。ナトリウム摂取量の最適レベルを維持することは、血圧を管理し、心血管疾患および腎臓疾患を予防するのに役立つ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ． Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２０１５，６５ （１０），１０４２－１０５０）。
【0004】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）および末期腎疾患（ＥＳＲＤ）における腎クリアランスの低下は、リン酸負荷の増加につながり、腎二次性副甲状腺機能亢進症を促進し、最終的に高リン血症を引き起こす可能性がある（Ｗｏｌｆ Ｍ．，Ｊ．Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０１０，２１，１４２７－１４３５）。ＣＫＤは、ヒトだけでなく、成猫および成犬の高リン血症の最も一般的な原因でもある（Ｋｉｄｄｅｒ、Ａ．、ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄ．Ｓｕｒ． ２００９、１１、９１３－９２４）。高リン血症の十分に立証された結果は心血管疾患（ＣＶＤ）であり、これは血管および心臓弁の石灰化、左心室肥大、心不全、不整脈および心臓突然死として現れる可能性があるｄｅａｔｈ （Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０１７，２１（Ｓ１），Ｓ５３－Ｓ６３）。リン酸塩負荷の増加に起因する続発性副甲状腺機能亢進症も、骨疾患につながる可能性がある（Ｙｕｅｎ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｍ． Ｊ．，２０１６，２０（３），１５－１２７）。
【0005】
食事によるリン酸塩制限とリン酸塩吸収阻害剤の使用により腸のリン酸塩吸収を効果的に減少させると、ＣＫＤのリン酸塩負荷が減少し、ＣＶＤ、骨疾患、および腎機能のさらなる悪化に寄与する後遺症を減少させるのに役立つ。
【0006】
ＷＯ２０１０／０７８４４９は、体液貯留または塩過負荷および胃腸管障害に関連する障害の治療において、ＮＨＥ媒介対向輸送を阻害するための化合物および方法を開示している。ＷＯ２０１４／１６９０９４は、ＮＨＥ３結合化合物およびリン酸輸送を阻害するための方法を開示している。
【0007】
上記を考慮して、腸における過剰なナトリウムおよびリン酸塩の吸収は、高血圧、ＣＫＤ、ＣＶＤ、骨疾患および関連する死亡率等の疾患の発生率の増加に寄与することが認識されている。したがって、これらの状態、特にＮＨＥ３を阻害する処置のための代替処置が必要である。特に、インビボでのナトリウムおよびリン酸塩の吸収を低減するのに効果的であると同時に、ＮＨＥ３阻害に対して高度の選択性を有する化合物が必要とされている。さらに、ＮＰＴ２ｂ阻害剤化合物と組み合わせて有効であるＮＨＥ３阻害剤化合物を有することが望ましい。
【0008】
したがって、本発明は、式Ｉ：
（式中、両方のＲはＣＮであるか、または両方のＲはＣ（Ｏ）ＮＨ２である）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化1】
【0009】
特定の実施形態では、両方のＲはＣ（Ｏ）ＮＨ２である。
【0010】
特定の実施形態では、化合物は、式：
の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
【化2】
【0011】
さらなる実施形態では、化合物は、式：
の化合物である。
【化3】
【0012】
さらなる実施形態では、化合物は、
の二塩酸塩である。
【化4】
【0013】
特定の実施形態では、化合物は、式：
の化合物である。
【化5】
【0014】
特定の実施形態では、化合物は、
の二塩酸塩である。
【化6】
【0015】
本発明はまた、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、高血圧およびＣＶＤからなる群から選択される疾患を処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ネコのＣＫＤを処置する方法であって、それを必要とするネコに、治療有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【0016】
本発明はまた、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、およびＣＶＤからなる群から選択される疾患を処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、式ＩＩ：
の化合物、またはその薬学的に許容される塩とを組み合わせた治療効果のある組み合わせ物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ネコのＣＫＤを処置する方法であって、それを必要とするネコに、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩とを組み合わせた治療効果のある組み合わせ物を投与することを含む方法を提供する。
【化7】
【0017】
さらに、本発明は、治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。特に、本発明は、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、高血圧またはＣＶＤの処置における使用のための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、ネコのＣＫＤの処置における使用のための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0018】
さらに、本発明は、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全またはＣＶＤの処置における、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩と同時に、別個にまたは逐次的に組み合わせた使用のための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本発明は、ネコのＣＫＤの処置における、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩と同時に、別個にまたは逐次的に組み合わせた使用のための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0019】
さらに、本発明は、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全またはＣＶＤの処置における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と同時に、別個にまたは逐次的に組み合わせた使用のための式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本発明は、ネコのＣＫＤの処置における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と同時に、別個にまたは逐次的に組み合わせた使用のための式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0020】
さらに、本発明は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0021】
さらに、本発明は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩をさらに含む薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0022】
さらに、本発明は、ＣＫＤ、高リン血症、続発性副甲状腺機能亢進症、心不全、高血圧またはＣＶＤを処置するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本発明は、ネコのＣＫＤを処置するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0023】
本発明の化合物および組み合わせは、高リン血症、特にＥＳＲＤまたはＣＫＤまたは家族性高リン血症における高リン血症、副甲状腺機能亢進症、特にＣＫＤに関連する続発性副甲状腺機能亢進症、リン酸カルシウム腎臓結石、ＣＫＤまたはＥＳＲＤに関連する心臓弁の石灰化、ＣＫＤに関連する骨折、カルシフィラキシス、腫瘍状石灰沈着、および急性腎疾患を含む、ナトリウムおよび／またはリン酸塩の不均衡に関連する疾患および状態の処置に使用することができる。
【0024】
特定の実施形態では、式ＩＩの化合物は遊離酸である。特定の実施形態では、式ＩＩの化合物は二ナトリウム塩である。式ＩＩの遊離酸化合物は、本明細書では「化合物Ａ」と呼ばれる。
【0025】
本明細書で使用される場合、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を制限、減速、停止、または反転させることを含む。
【0026】
一実施形態では、処置される哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物はネコまたはイヌ、好ましくはネコである。
【0027】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、哺乳動物に単回または複数回投与されると、診断中または処置中の患者に所望の効果を提供する、式ＩもしくはＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の量または用量を指す。
【0028】
有効量は、既知技法の使用によって、かつ同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定され得る。患者に対する有効量を決定する際には、患者の人種、患者のサイズ、年齢および健康状態全般、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の関与度または重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投与計画、併用薬の使用、並びに他の関連する状況を含むがこれらに限定されない多くの要因が考慮される。式ＩおよびＩＩの化合物は、約０．０１～約１５ｍｇ／体重ｋｇの範囲内の１日当たりの用量で有効である。
【0029】
式ＩまたはＩＩの化合物は、本化合物を生物学的に利用可能にする、任意の経路によって投与される薬学的組成物として配合される。好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような薬学的組成物およびそれを調製するためのプロセスは、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．，“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌ．Ｖ． Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
【0030】
式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩は、本発明の治療用途において使用されてもよく、ある特定の配置が好ましい。本発明の化合物の以下のリストは、そのような配置について説明する。これらの選好は、本発明の治療用途および化合物の両方に適用可能であることが理解されるであろう。
【0031】
当業者は、両方のＲがＣ（Ｏ）ＮＨ２である化合物の場合、アミジン尿素部分がＥまたはＺ配置のいずれかで存在し得、また２つの間で容易に切り替わる可能性があることを理解するであろう。本発明の化合物は、ＥおよびＺ異性体の両方、ならびにそれらの混合物を含む。
【0032】
式Ｉの化合物は、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化8】
【化9】
【0033】
本発明は、全ての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む上述の化合物のエナンチオマーの混合物を企図するが、式Ｉａ’および式Ｉａ’’の化合物ならびにそれらの薬学的に許容される塩が特に好ましい。特に、式Ｉａ’’の化合物の二塩酸塩が好ましい。
【0034】
当業者は、個々のエナンチオマーを、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点で、選択的結晶化技術、キラルクロマトグラフィー（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、およびＥ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４を参照されたい）、または超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）（例えば、Ｔ．Ａ．Ｂｅｒｇｅｒ；「Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｉｍｅｒ」、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０１５年７月を参照されたい）のような方法によって分離または分割し得る。
【0035】
式Ｉの化合物の薬物的に許容される塩は、例えば、当技術分野で周知の標準的な条件下で、適切な溶媒中での式Ｉの化合物の適切な遊離塩基と適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る（例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．； Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．，４，４２７－４３５，２０００およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，１－１９，１９７７を参照されたい）。特に、式Ｉの化合物の好ましい塩は二塩酸塩である。
【0036】
式ＩＩの化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当技術分野で周知の標準的条件下で、適切な溶媒中での式ＩＩの化合物の適切な遊離酸形態と適切な薬学的に許容される塩基との反応によって形成され得る（例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．； Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，４，４２７－４３５，２０００およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．； Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，１－１９，１９７７を参照されたい）。特に、式ＩＩの化合物の好ましい塩は二ナトリウム塩である。
【0037】
ＷＯ２０１８／０３４８８３は、ナトリウム依存性リン酸共輸送体２ｂ（ＮＰＴ２ｂまたはＮａＰｉＩＩｂ）の阻害剤である式ＩＩの化合物を含む化合物の属を記載している。ＮＰＴ２ｂは、能動輸送によるリン酸塩吸収を促進する小腸の管腔表面に見られる。式ＩＩの化合物は、ＷＯ２０１８／０３４８８３に記載されている方法によって調製され得る。
【0038】
式Ｉの化合物、またはその塩は、当業者に知られている様々な手順によって調製され得、そのうちのいくつかが、以下の調製例および実施例で説明されている。各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに例証するために、以下の調製および実施例が提供される。さらに、当業者は、式Ｉの化合物が、当業者によって調製され得る対応する所望の立体化学的配置を有する出発材料または中間体を使用することによって調製され得ることを理解する。
【0039】
ある特定の略語は次のように定義される。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＢＣＥＣＦ－ＡＭ」は２’，７’－ビス（２－カルボキシエチル）－５（６）－カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステルを指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＤＣＭ」は塩化メチレンまたはジクロロメタンを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「ＥＳ／ＭＳ」はエレクトロスプレー質量分析を指し、「ＥＭＳ」はメタンスルホン酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールまたはエチルアルコールを指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「ｈ」は時間を指し、「ＨＥＰＥＳ」は４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し、「ＩＣ５０」は最大阻害の半分での阻害剤濃度を指し、「ＬＣ－ＭＳ」は液体クロマトグラフィー－質量分析を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、「ｍｉｎ」は分を指し、「ＭＴＢＥ」はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し、「ｍ／ｚ」は質量対電荷比を指し、「ｐｄ（ｄｂａ）２」はビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）を指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指す。
【0040】
ＬＣ－ＭＳは、ＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標）ＨＰ１２６０液体クロマトグラフィーシステムで実行される。質量スペクトル測定は、ＥＳ／ＭＳ（正および／または負のモードで取得）により達成され、ＥＬＳＤを有していても有していなくてもよいＨＰＬＣに接続された質量選択性検出器四重極質量分析計で実行される。ＬＣ－ＭＳ条件（低ｐＨ）：カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）ＮＸ Ｃ１８ ２．０×５０ｍｍ ３．０μｍ、１１０Å、勾配：１．５ｍｉｎで５～９５％Ｂ、次いで０．５ｍｉｎ間９５％Ｂ、カラム温度：５０℃＋／－１０℃、流速：１．２ｍＬ／ｍｉｎ、１μＬ注入量、溶媒Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含む脱イオン水、溶媒Ｂ、０．１％ギ酸を含むＣＡＮ、波長２００～４００ｎｍおよび２１２～２１６ｎｍ。ＨＰＬＣがＥＬＳＤを備えている場合、設定は、４５℃の蒸発器温度、４０℃のネブライザ温度、および１．６ＳＬＭのガス流速である。代替のＬＣ－ＭＳ条件（高ｐＨ）：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ｘＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｃ１８カラ２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ、勾配１．５ｍｉｎで５～９５％Ｂ、次いで０．５０ｍｉｎ間９５％Ｂ、カラム温度：５０℃＋／－１０℃、流速：１．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入量１μＬ、溶媒Ａ：１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ９、溶媒Ｂ：ＡＣＮ、波長：２００～４００ｎｍおよび２１２～２１６ｎｍ、ＥＬＳＤがある場合：４５℃の蒸発器温度、４０℃のネブライザ温度および１．６０ＳＬＭガス流速。
【0041】
調製物１
同じスケールで３つの反応を並行して設定する。各反応について、溶液１および溶液２の２つの溶液を準備する。溶液１：キシレン（１．０８Ｌ）中の４－（３－ブロモフェニル）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン（５４．０ｇ、１４５．５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ｄｂａ）２（３．３５ｇ、５．８２ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（３．３７ｇ、０．０４当量５．８２ｍｍｏｌ）を窒素下１５℃で添加する。混合物を１ｈ撹拌する。溶液２：キシレン（１．０８Ｌ）中のＫ２ＣＯ３（１０．１ｇ、７２．７ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下０℃でフェニルメタンチオール（２７．１ｇ、２１８．３ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。混合物を１５℃で１ｈ攪拌する。１５℃で溶液１を溶液２に滴下により添加し、混合物を１４０℃で１２ｈ撹拌する。
【化10】
【0042】
３つの反応混合物を合わせ、水（５００ｍＬ）で洗浄する。有機層を濃縮し、石油エーテル中の１～１７％ＥｔＯＡｃの勾配を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（９２ｇ、５０％）を得る。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ７．２８－７．１７（ｍ，８Ｈ）、７．０５－７．０４（ｍ，１Ｈ）、７．００－６．９５（ｍ，１Ｈ）、６．７４－６．６９（ｍ，１Ｈ）、４．１５－４．０４（ｍ，３Ｈ）、３．７６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．４７（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．９０（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，７．２ＭＨｚ，１Ｈ）、２．５０－２．４２（ｍ，４Ｈ）。
【0043】
調製物２
同じスケールで２つの反応を並行して設定する。各反応について、４－（３－ベンジルスルファニルフェニル）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン（５０．０ｇ、１２１ｍｍｏｌ）、酢酸（５２．１７ｇ、８６８．８ｍｍｏｌ）、およびＡＣＮ（６９０ｍＬ）中の水（６２ｍＬ）の撹拌混合物に、１，３－ジクロロ－５，５－ジメチル－イミダゾリジン－２，４－ジオン（４７．５ｇ、２４１ｍｍｏｌ）を０℃で少しずつ加える。混合物を０～５℃で２ｈ撹拌し、次いで反応混合物を真空中で濃縮する。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）およびＨＣｌ（１，４－ジオキサン中の４Ｍ溶液、１０ｍＬ）を各反応に加え、反応混合物を合わせる。３０ｍｉｎ間撹拌し、濾過により固形物を収集する。固体をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で洗浄して表題化合物（１１２ｇ）を得、これをさらなる精製なしで使用する。定量的収量を仮定すると、純度は１０３ｇの理論的収量に基づいて９２％ｗ／ｗと推定される。ＴＬＣ（１：６ ＥｔＯＡｃ：石油エーテル）Ｒｆ＝０．０５。
【化11】
【0044】
調製物３
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］カルバメート（５．２２ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）およびトリメチルアミン（６．３８ｇ、８．７９ｍＬ、６３．０ｍｍｏｌ、３．００当量）の無水ＤＣＭ（１２０ｍＬ）中の溶液に、ラセミ３－（６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル）ベンゼンスルホニルクロリド（Ａｂａｃｉｐｈａｒｍ、８．２１ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で室温で一晩撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮する。油性残渣にＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、固形物を濾別し、濾液を真空中で濃縮して、オレンジ色の油を得る。ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ラセミ化合物（６．９２ｇ、５５％）を無色の油として得る。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ７．７５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６７（ｓ，１Ｈ）、７．４４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．２３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．７１（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．４２－５．０５（ｂｒ ｍ，１Ｈ）、４．２９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．７３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．５７（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．５５－３．４６（ｍ，８Ｈ）、３．３４－３．２５（ｍ，２Ｈ）、３．１４－３．０８（ｍ，２Ｈ）、２．９７（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，５．２９Ｈｚ，１Ｈ）、２．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，７．２Ｈｚ，１Ｈ）、２．４６（ｓ，３Ｈ）、１．４１（ｓ，９Ｈ）。
【化12】
【0045】
９５：５のＥｔＯＨ：ＡＣＮで溶出する６２９ｍｇの１１回の注入でのＣｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＤ（８×３５ｃｍ）カラム（流速４００ｍＬ／ｍｉｎ、２６０ｎｍで検出）上でエナンチオマーを分離すると、表題化合物（２．９４ｇ、２３％）が２番目に溶出する異性体として得られる。キラルＨＰＬＣ（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＤ－Ｈ ４．６×１５０ｍｍ、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２５０ｎｍ、溶離剤：９５：５のＥｔＯＨ：ＡＣＮ）は、＞９９％ｅｅを示す。
【0046】
代替合成
ＤＣＭ（１．７０Ｌ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］カルバメート（５７．１ｇ、２３０ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（６５．２ｇ、６４５ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。３－（６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル）ベンゼンスルホニルクロリド、塩酸塩（調製物２に従って調製された材料、８４．０ｇ、１８１ｍｍｏｌ）を０℃で混合物に少しずつ加える。混合物を２５°Ｃまで温め、４ｈ攪拌する。反応混合物を、３－（６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル）ベンゼンスルホニルクロリド、塩酸塩（調製物２に従って調製された材料、５２ｇ、それぞれ１１２ｍｍｏｌ、合計１０４ｇ、２２４ｍｍｏｌ）から始めて本質的に上記のように調製された２つの反応混合物と合わせる。得られた混合物を氷水（１．８Ｌ）に注ぎ、次いで有機層を水（２×１．５Ｌ）で洗浄し、濃縮して黄色の残渣を得る。ＤＣＭ中１～２％のＭｅＯＨの勾配を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、ラセミ化合物を黄色い油として得る（１５７ｇ、収率６４％）。
ＤＣＭ（１．７０Ｌ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］カルバメート（５７．１ｇ、２３０ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（６５．２ｇ、６４５ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。３－（６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル）ベンゼンスルホニルクロリド、塩酸塩（調製物２に従って調製された材料、８４．０ｇ、１８１ｍｍｏｌ）を０℃で混合物に少しずつ加える。混合物を２５°Ｃまで温め、４ｈ攪拌する。反応混合物を、３－（６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル）ベンゼンスルホニルクロリド、塩酸塩（調製物２に従って調製された材料、５２ｇ、それぞれ１１２ｍｍｏｌ、合計１０４ｇ、２２４ｍｍｏｌ）から始めて本質的に上記のように調製された２つの反応混合物と合わせる。得られた混合物を氷水（１．８Ｌ）に注ぎ、次いで有機層を水（２×１．５Ｌ）で洗浄し、濃縮して黄色の残渣を得る。ＤＣＭ中１～２％のＭｅＯＨの勾配を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、ラセミ化合物を黄色い油として得る（１５７ｇ、収率６４％）。
【0047】
このラセミ材料（１５７ｇ、２６１ｍｍｏｌ）を、上記のように調製された追加のラセミ材料（２３ｇ、３８ｍｍｏｌ）と合わせる。７０：３０のＣＯ２：ＭｅＯＨ中の（０．１％ＮＨ４ＯＨ）で溶出するＣｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＤ－Ｈ（５μｍ、３×２５ｃｍ）カラム（流速７０ｇ／ｍｉｎ、２２０ｎｍでＵＶ検出）を使用したＳＦＣによりエナンチオマーを分離すると、表題化合物（５０ｇ、２８％）が、黄色いガム、２番目に溶出する異性体、＞９９％ｅｅとして得られる。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）６０２／６０４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0048】
調製物４
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－［２－［［３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］フェニル］スルホニルアミノ］エトキシ］エトキシ］エチル］カルバメート（２．９４ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）に、１，４－ジオキサン中の４Ｍ塩酸（１０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、白色のフォーム（２．８５ｇ、＞１００％）を得る。高真空下で一晩乾燥させ、それ以上の操作なしで使用する。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）５０２／５０４［Ｍ＋Ｈ］＋
【化13】
【0049】
調製物５
１０ｇのＩｓｏｌｕｔｅ（登録商標）ＳＣＸカラムを使用して、Ｎ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド二塩酸塩（９９２ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を精製し、７４０ｍｇの遊離塩基を透明な無色の半固体（７４０ｍｇ、８０％）として得る。
【化14】
【0050】
調製物６
１５℃のＭｅＯＨ（１９０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－［２－［［３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］フェニル］スルホニルアミノ］エトキシ］エトキシ］エチル］カルバメート（４８ｇ、８０ｍｍｏｌ）に、１，４－ジオキサン中の４Ｍ塩酸（１００ｍＬ、４００ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩撹拌する。真空中で溶媒を除去し、残渣を水（１５０ｍＬ）に溶解する。この溶液に５Ｎ ＮａＯＨ（３０ｍＬ）および２Ｎ ＮａＯＨ（５０ｍＬ）をｐＨ９～１０になるまで添加し、次いで２０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（７５ｍＬ）を加えて溶液をｐＨ１１にする。水性混合物をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ、次いで１×１００ｍＬ）で抽出する。有機物を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液（１２０ｍＬ）および２０％Ｎａ２ＣＯ３（３０ｍＬ）の混合物で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。残渣をトルエンに溶解し、真空中で濃縮し、次いでこの操作をさらに２回繰り返す。残渣をＤＣＭに溶解し、真空中で濃縮し、次いでこの操作をさらに２回繰り返して暗黄色の油（４２ｇ、９４％）を得るが、純度は、内部標準としてアニソールを使用した１Ｈ－ＮＭＲ比較に基づいて約９０ｗｔ％である。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ７．７６－７．７２（ｍ，１Ｈ）、７．６８－７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．４３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６－７．３３（ｍ，１Ｈ）、７．２３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．７４－６．７２（ｍ，１Ｈ）、４．２８－４．２２（ｍ，１Ｈ）、３．６７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２－３．４９（ｍ，９Ｈ）、３．１１（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，５．５Ｈｚ，１Ｈ）、２．８７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．５８（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，７．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．４４（ｓ，３Ｈ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）５０２／５０４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【化15】
【0051】
実施例１
１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）およびピリジン（１０ｍＬ）中のＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド（調製物５に従って調製、７４０ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ジフェノキシメチレンシアナミド（３５１ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で室温で一晩撹拌する。ブタン－１，４－ジアミン（６５ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で２４ｈ加熱し、次いで９０℃で一晩加熱する。反応混合物をＲＴに冷却する。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、５％炭酸カリウム水溶液で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、オレンジ色の油を得る。ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗混合物を精製して、黄色いフォームとして表題化合物を得る（５９１ｍｇ、６７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１１９３［Ｍ＋Ｈ］＋
【化16】
【0052】
代替合成
１，４－ジオキサン（２４０ｍＬ）中のＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド（調製６に従って調製、純度９０ｗｔ％、２４．５ｇ、４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１７．７ｍＬ、２１９ｍｍｏｌ）およびジフェノキシメチレンシアナミド（１０．５ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で室温で一晩撹拌する。反応混合物に、ブタン－１，４－ジアミン（１．９３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４つの等しい部分に分割し、各部分を９０℃で２１ｈ加熱する。ブタン－１，４－ジアミン（１０２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）を反応物の各部分に添加し、９０℃で２３ｈ加熱を続ける。ブタン－１，４－ジアミン（４２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）を反応混合物の一部に添加し、ＬＣ－ＭＳで決定されるように、シアノイソウレア中間体：表題化合物の比率が１：５を超えることが示される。反応混合物のすべての部分を９０℃で一晩加熱し続け、次いでＲＴに冷却する。反応部分を合わせる。Ｎ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド（純度９０ｗｔ％）を使用して、本質的に同じ方法で調製された他の２つのバッチと混合物を合わせる（それぞれ１０．０５ｇ、１８．００ｍｍｏｌおよび５．２０ｇ、９．３２ｍｍｏｌ）。減圧下で溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、次いで有機物を５％炭酸カリウム水溶液（２× ８０ｍＬ）で洗浄する。水性洗浄液を合わせ、ＤＣＭ（２×４０ｍＬ）で抽出する。すべての有機洗浄液を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）で洗浄する。有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、黄褐色の油を得る。ＤＣＭ中８～１６％ＥｔＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、粗材料を精製する。次いで、ＤＣＭ中５～１２％および２～１２％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより、材料を２回再精製する。ＤＣＭ中２～１２％ＭｅＯＨの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより不純な画分を再精製し、純粋な材料を合わせて、表題化合物をオフホワイトのフォーム状固体として得る（１５．３ｇ、３６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１１９３［Ｍ＋Ｈ］＋。
１，４－ジオキサン（２４０ｍＬ）中のＮ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド（調製６に従って調製、純度９０ｗｔ％、２４．５ｇ、４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１７．７ｍＬ、２１９ｍｍｏｌ）およびジフェノキシメチレンシアナミド（１０．５ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で室温で一晩撹拌する。反応混合物に、ブタン－１，４－ジアミン（１．９３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４つの等しい部分に分割し、各部分を９０℃で２１ｈ加熱する。ブタン－１，４－ジアミン（１０２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）を反応物の各部分に添加し、９０℃で２３ｈ加熱を続ける。ブタン－１，４－ジアミン（４２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）を反応混合物の一部に添加し、ＬＣ－ＭＳで決定されるように、シアノイソウレア中間体：表題化合物の比率が１：５を超えることが示される。反応混合物のすべての部分を９０℃で一晩加熱し続け、次いでＲＴに冷却する。反応部分を合わせる。Ｎ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－３－［（４Ｓ）－６，８－ジクロロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－４－イル］ベンゼンスルホンアミド（純度９０ｗｔ％）を使用して、本質的に同じ方法で調製された他の２つのバッチと混合物を合わせる（それぞれ１０．０５ｇ、１８．００ｍｍｏｌおよび５．２０ｇ、９．３２ｍｍｏｌ）。減圧下で溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、次いで有機物を５％炭酸カリウム水溶液（２× ８０ｍＬ）で洗浄する。水性洗浄液を合わせ、ＤＣＭ（２×４０ｍＬ）で抽出する。すべての有機洗浄液を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）で洗浄する。有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、黄褐色の油を得る。ＤＣＭ中８～１６％ＥｔＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、粗材料を精製する。次いで、ＤＣＭ中５～１２％および２～１２％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより、材料を２回再精製する。ＤＣＭ中２～１２％ＭｅＯＨの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより不純な画分を再精製し、純粋な材料を合わせて、表題化合物をオフホワイトのフォーム状固体として得る（１５．３ｇ、３６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１１９３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0053】
実施例２
実施例１（６７０ｍｇ、０．５６２ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）および水（１ｍＬ）を添加し、室温で一晩撹拌する。減圧下で揮発性物質を除去する。最少量のＭｅＯＨに残渣を溶解し、１０ｇのＩｓｏｌｕｔｅ（登録商標）ＳＣＸカラムに通して精製し、黄色いフォーム（６２９ｍｇ）を得る。分取ＨＰＬＣ［カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）ＥＶＯ Ｃ１８ １００×３０ｍｍ、粒径５μｍ、５０℃のインラインヒータ、溶離液：ＡＣＮ中５１～８６％（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中５％ＭｅＯＨ）］によって精製し、オレンジ色の油（２５３ｍｇ、３７％）としての遊離塩基として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１２２９［Ｍ＋Ｈ］＋。バイアル内で、遊離塩基化合物（２２３ｍｇ、０．１８１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解し、塩酸（ジエチルエーテル中１Ｍ溶液、１ｍＬ）を振とうしながら滴下により添加する。溶液から白い固体が析出する。混合物を５ｍｉｎ振とうし、次いで真空中で濃縮して、表題化合物を微細な白色粉末（２３６ｍｇ、１００％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１２２９ ［遊離塩基Ｍ＋Ｈ］＋、１２２７［遊離塩基Ｍ－Ｈ］＋
【化17】
【0054】
代替合成
以下の様式で等量の２つの混合物を調製する：各部分について、実施例１の化合物（５．１ｇ、４．３ｍｍｏｌ）、ジオキサン中４Ｍ塩酸（５０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）および水（２５ｍＬ）を混合する。各溶液を６５℃に２ｈ加熱する。混合物をＲＴに冷却し、室温で一晩撹拌し、次いで、実施例１の化合物（３．１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）から始めて本質的に同じ方法で調製された別のバッチとそれらを合わせる。混合物を真空中で濃縮する。残渣に水／ＥｔＯＨ（１：２、１００ｍＬ）を添加し、真空中で濃縮する。この操作を３回繰り返す。残渣にＥｔＯＨを添加し、４５℃で１０ｍｉｎ間撹拌し、次いで真空中で濃縮する。この操作を３回繰り返す。残渣を真空中室温で２２ｈ乾燥させる。残渣に、実施例１を用いて上記と本質的に同じ方法で調製された生成物の別のバッチ（１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加する。真空中室温で２３ｈ、５０℃で１６ｈ、５５℃で６ｈ、および室温で７２ｈ乾燥させて、表題化合物（１４．７ｇ、９４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１２２９［遊離塩基Ｍ＋Ｈ］＋。
以下の様式で等量の２つの混合物を調製する：各部分について、実施例１の化合物（５．１ｇ、４．３ｍｍｏｌ）、ジオキサン中４Ｍ塩酸（５０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）および水（２５ｍＬ）を混合する。各溶液を６５℃に２ｈ加熱する。混合物をＲＴに冷却し、室温で一晩撹拌し、次いで、実施例１の化合物（３．１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）から始めて本質的に同じ方法で調製された別のバッチとそれらを合わせる。混合物を真空中で濃縮する。残渣に水／ＥｔＯＨ（１：２、１００ｍＬ）を添加し、真空中で濃縮する。この操作を３回繰り返す。残渣にＥｔＯＨを添加し、４５℃で１０ｍｉｎ間撹拌し、次いで真空中で濃縮する。この操作を３回繰り返す。残渣を真空中室温で２２ｈ乾燥させる。残渣に、実施例１を用いて上記と本質的に同じ方法で調製された生成物の別のバッチ（１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加する。真空中室温で２３ｈ、５０℃で１６ｈ、５５℃で６ｈ、および室温で７２ｈ乾燥させて、表題化合物（１４．７ｇ、９４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ）１２２９［遊離塩基Ｍ＋Ｈ］＋。
【0055】
活性評価
インビトロＮＨＥ３阻害活性
ＮＨＥ３アッセイを作製するために、ＮＨＥ３を選択的に発現する細胞を、内因性のＮＨＥ欠損細胞株でヒトＮＨＥ３を過剰発現させることによって生成する。ＮＨＥ欠損細胞株を、化学物質による突然変異誘発によって生成する。突然変異誘発後、リチウム（Ｌｉ）をロードした細胞を酸性の細胞外環境に曝露することにより、ＮＨＥ欠損細胞が選択される。これらの条件下で、ＮＨＥは細胞外Ｌｉ＋を細胞外プロトンと交換するため、ＮＨＥ欠損細胞のみが有毒な細胞内アシドーシスを回避して生き残ることができる。
インビトロＮＨＥ３阻害活性
ＮＨＥ３アッセイを作製するために、ＮＨＥ３を選択的に発現する細胞を、内因性のＮＨＥ欠損細胞株でヒトＮＨＥ３を過剰発現させることによって生成する。ＮＨＥ欠損細胞株を、化学物質による突然変異誘発によって生成する。突然変異誘発後、リチウム（Ｌｉ）をロードした細胞を酸性の細胞外環境に曝露することにより、ＮＨＥ欠損細胞が選択される。これらの条件下で、ＮＨＥは細胞外Ｌｉ＋を細胞外プロトンと交換するため、ＮＨＥ欠損細胞のみが有毒な細胞内アシドーシスを回避して生き残ることができる。
【0056】
ＮＨＥ欠損細胞株ＮＨＤ Ｃ８を、突然変異誘発および細胞株Ｄｅｄｅ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－３９（商標））からの選択によって生成する。突然変異誘発は、Ｄｅｄｅ ＣＣＬ－３９細胞を最終濃度５００μｇ／ｍｌの増殖培地中のＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０ｈ処理することによって誘導される。ＮＨＥ欠損細胞は、ＬｉＣｌ溶液（１３０ｍＭのＬｉＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのグルコースおよび２０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）中で２ｈ間の培養に続いて、塩化コリン溶液（１３０ｍＭの塩化コリン、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＣａＣｌ２、および２０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸－Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５）中で３０ｍｉｎ間の培養により選択される。標準培地で９０％のコンフルエンスまで増殖した後の生存細胞を、２回目の選択サイクルに供する。単一クローンコロニーを分離し、完全にコンフルエントになるまで増殖させ、３回目の選択サイクルに供する。生き残ったクローンを拡大し、ナトリウム水素交換体の活性について試験する（以下のアッセイを参照）。
【0057】
ｍｙｃタグ付きのヒトＮＨＥ３をコードするｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、上記のＮＨＥ欠損ＮＨＤ Ｃ８細胞で安定した細胞株を作製する。安定にＮＨＥ３を過剰発現する細胞を、１０％ＦＢＳ、４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および抗生物質／抗真菌溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）で維持する。
【0058】
ＮＨＥ活性を測定するために、ＮＨ４Ｃｌを添加することにより細胞の細胞内ｐＨを低下させる。次いで、ナトリウム依存性の細胞内ｐＨ変化を、細胞内ｐＨ感受性フルオレセイン色素であるＢＣＥＣＦ－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定する。ＮＨＤ８／ＮＨＥ３細胞を、マルチチャネルピペットで９６ウェルポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェルあたり３０，０００で分散させる。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２４ｈインキュベートする。細胞培養培地を吸引し、細胞をＮａＣｌ－ＨＥＰＥＳ溶液１００μｌ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）で２回洗浄し、次いで細胞をＮＨ４Ｃｌ／プルロニックＦ－１２７／プロベネシド溶液１００μｌ（１３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、０．０６２５％プルロニックＦ－１２７、２ｍＭのプロベネシド、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）で室温で６０ｍｉｎ間インキュベートする。インキュベーション後、細胞をアンモニウム不含、ナトリウム不含のＨＥＰＥＳ／０．１％ＢＳＡ溶液１００μｌ（１００ｍＭの塩化コリン、１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）で２回洗浄する。次いで、化合物または対照と共に３０μＭアミロライドを含む８６μｌのアンモニウム不含、ナトリウム不含のＨＥＰＥＳ／０．１％ＢＳＡを適切なウェルに加える。ＮＨＥ活性は、１４μｌの１Ｍ ＮａＣｌを添加して、１４０ｍＭの最終濃度を達成することによって開始する。プレートを、５０５ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長での蛍光強度についてすぐに読み取る。試験した各濃度での阻害のパーセンテージは、０％阻害として１％ＤＭＳＯを用いたＮＨＥ活性、および１００％阻害として飽和濃度の標準阻害剤を用いたＮＨＥ活性と比較して計算される。１０００ｎＭから０．１５２ｎＭに加えて化合物を含まない９濃度応答曲線を、Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０を決定する４パラメータモデルにフィッティングする。
【0059】
実施例２は、５．７６ｎＭのＩＣ５０（個々のＩＣ５０の幾何平均、ｎ＝７、幾何平均の標準誤差０．７２）で濃度依存的にヒトＮＨＥ３を阻害する。実施例２は、強力なＮＰＴ２ｂ（ＩＣ５０＝５８．４μＭ）またはＳＧＬＴ１（ＩＣ５０＝６．６μＭ）阻害剤ではなかったという点で、ＮＨＥ３に対して選択的である。実施例１は、３７．９ｎＭのＩＣ５０（個々のＩＣ５０の幾何平均、ｎ＝２、幾何平均の標準誤差６．２）で濃度依存的にヒトＮＨＥ３を阻害する。
【0060】
血圧に対する実施例２の効果
体重２５０～３００ｇ、７週齢の雄の自然発症高血圧（ＳＨＲ）ラットを、逆光サイクル（午前８時が消灯、午後８時が点灯）に順応させ、通常の餌および水を自由に与える。埋め込み型遠隔測定デバイス（モデルＴＡ１１ＰＡ－Ｃ４０、Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を腹部大動脈に埋め込む。手術から回復した後、血圧（平均動脈圧、ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）を測定するためにラットを静かな遠隔測定施設の部屋の個々のケージに入れる。ＤＳＩ Ｄａｔａｑｕｅｓｔ ＩＶ４．０ソフトウェアを使用して、デジタル化された圧力信号を５分ごとに２０秒間取得する。
体重２５０～３００ｇ、７週齢の雄の自然発症高血圧（ＳＨＲ）ラットを、逆光サイクル（午前８時が消灯、午後８時が点灯）に順応させ、通常の餌および水を自由に与える。埋め込み型遠隔測定デバイス（モデルＴＡ１１ＰＡ－Ｃ４０、Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を腹部大動脈に埋め込む。手術から回復した後、血圧（平均動脈圧、ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）を測定するためにラットを静かな遠隔測定施設の部屋の個々のケージに入れる。ＤＳＩ Ｄａｔａｑｕｅｓｔ ＩＶ４．０ソフトウェアを使用して、デジタル化された圧力信号を５分ごとに２０秒間取得する。
【0061】
３１匹のＳＨＲラットをＭＡＰによって２つの群に無作為化し、ビヒクル（ｎ＝１５）（１０％アカシア、精製水中０．０５％消泡剤）または０．１５ｍｇ／ｋｇ／日の実施例２で１４日間１日２回処置する。１回目の投薬は午前６時から６時３０分（消灯の２ｈ前）に行い、２回目の投薬は午後４時から４時３０分に行う。毎日の食物消費および体重増加も監視する。
【0062】
ＭＡＰ、ＨＲ、および体重（ＢＷ）データは、共分散としてベースラインを使用した共分散の反復測定分析（ＡＮＣＯＶＡ）によって分析する。食物消費（ＦＣ）データは、分散の反復測定分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析する。０．１５ｍｇ／ｋｇ／日の実施例２で処置された群の試験の時間経過（１～１４日目）にわたる平均血圧は、０．０００７のｐ値を有する対照群のそれよりも４．８３ｍｍ Ｈｇ低い（表１）。ＨＲ、ＢＷ、またはＦＣに大きな影響は観察されない。
【表1】
【0063】
ナトリウム吸収に対する実施例１の効果
塩化ナトリウムの経口ボーラス投薬後の尿中ナトリウム排泄は、腸内のナトリウム吸収の間接的な尺度である。
塩化ナトリウムの経口ボーラス投薬後の尿中ナトリウム排泄は、腸内のナトリウム吸収の間接的な尺度である。
【0064】
体重が２００～２５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙを、等しい平均体重に基づいて群に無作為化する。以降、次の製剤を「１％ＨＥＣ」と呼ぶ：水中の１％ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）および０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０および消泡剤ビヒクル。０．１ｍｇ／ｍＬの実施例１（最終用量１ｍｇ／ｋｇを１０ｍＬ／ｋｇの量で投薬）は、事前に秤量した量の化合物を含むガラスバイアル内で１％ＨＥＣと配合し、均一懸濁液として観察されるまでプローブで超音波処理する。化合物がバイアルの側面または底に付着しないようにするために、攪拌棒をボトルに追加し、配合および投薬プロセス全体を通して懸濁液を攪拌する。実施例１のその後の投薬溶液は、１％ＨＥＣでの段階希釈によって調製する。１０ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ（最終用量２００ｍｇ／ｋｇを２０ｍｌ／ｋｇの量で投薬）は、滅菌水を添加することによって配合される。
【0065】
試験の前日、動物を一晩絶食させるために食物なしで水にアクセスできる清潔なケージに入れる。試験の日に、ラットにビヒクルまたは様々な用量の実施例１を経口投薬する。３０ｍｉｎ後、動物にＮａＣｌを投薬し、次いですぐに代謝ケージに移す。尿サンプルを２ｈ収集する。正味尿量を記録する。臨床生化学分析器を使用して、尿中ナトリウムおよびクレアチニンを評価する。
【0066】
クレアチニンに対する尿中ナトリウムの比率（ｍＭ／ｍＭ）として表される値が計算され、平均±ＳＥＭとして示される。ＥＤ５０を計算するために４パラメータロジスティック曲線フィッティングツールＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で曲線をフィッティングする。曲線フィッティングの目的で、実施例１の用量は、ビヒクルのみの群に対して、ソフトウェアで人工的に０．００１ｍｇ／ｋｇに設定されている。
【0067】
実施例１およびＮａＣｌボーラスの経口投与に続いて、尿中ナトリウム排泄は、用量依存的に減少する（表２）。尿中ナトリウム排泄に関する実施例１のＥＤ５０は０．０５８ｍｇ／ｋｇである。尿中ナトリウム排泄の用量依存的減少は、実施例１による腸内ナトリウム吸収の用量依存的阻害と一致している。
【表2】
【0068】
ナトリウムおよびリン酸塩の吸収に対する実施例２の効果
リン酸ナトリウムの経口ボーラス投薬後の尿中ナトリウムおよびリン酸塩排泄は、腸内のナトリウムおよびリン酸塩吸収の間接的な尺度である。
リン酸ナトリウムの経口ボーラス投薬後の尿中ナトリウムおよびリン酸塩排泄は、腸内のナトリウムおよびリン酸塩吸収の間接的な尺度である。
【0069】
体重１９５～２２１ｇの範囲の約７週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを、等しい平均体重に基づいて群に無作為化する。
【0070】
０．３ｍｇ／ｍＬ（最終用量３ｍｇ／ｋｇを１０ｍＬ／ｋｇの量で投薬）での実施例２は、事前に秤量した量の化合物を含むガラスバイアル内に１％ＨＥＣを加えることにより配合し、次いでそれが均一懸濁液として観察されるまでプローブで超音波処理する。化合物がバイアルの側面または底に付着しないようにするために、攪拌棒をボトルに追加し、配合および投薬プロセス全体を通して懸濁液を攪拌する。実施例２のその後の投薬溶液は、１％ＨＥＣでの段階希釈によって調製する。３４．５ｍｇ／ｍｌのＮａＨ２ＰＯ４（最終用量６９０ｍｇ／ｋｇを２０ｍｌ／ｋｇの量で投薬）は、滅菌水を添加することによって配合される。
【0071】
試験の日に、動物を試験前に４ｈ絶食させるために食物なしで水にアクセスできる清潔なケージに入れる。ラットに、ビヒクルまたは様々な用量の実施例２を経口投薬する。１５ｍｉｎ後、動物に滅菌水またはＮａＨ２ＰＯ４を投薬し、すぐに代謝ケージに移す。尿サンプルを４ｈ収集する。正味尿量を記録する。臨床生化学分析器を使用して、尿中ナトリウム、クレアチニン、およびリン酸塩を評価する。尿中リンまたはナトリウム対食事中のリンまたはナトリウムの比率として表される値が計算され、平均±ＳＥＭとして示される。ＥＤ５０を計算するために４パラメータロジスティック曲線フィッティングツールＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で曲線をフィッティングする。曲線フィッティングの目的で、実施例２の用量は、ビヒクルのみの群に対して、ソフトウェアにおいて人工的に０．００００１ｍｇ／ｋｇに設定されている。
【0072】
実施例２およびリン酸塩ボーラスの経口投与に続いて、尿中ナトリウムおよびリン酸塩排泄は、用量依存的に減少する（表３）。尿中リン排泄に関する実施例２のＥＤ５０は０．０４１ｍｇ／ｋｇであり、ナトリウム排泄に関する実施例２のＥＤ５０は０．０５８ｍｇ／ｋｇである。尿中ナトリウムおよびリン酸塩排泄の用量依存的減少は、実施例２による腸内ナトリウムおよびリン酸塩吸収の用量依存的阻害と一致している。
【表3】
【0073】
ラットにおけるリン酸塩吸収に対するＮＰＴ２ｂ阻害剤（化合物Ａ）と組み合わせた実施例２の効果
ＮＰＴ２ｂ阻害剤投薬溶液：化合物Ａおよびポリ－１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３０重量％の化合物Ａおよび７０重量％のＰＶＰ－ＶＡの比率でボトルに量り入れる。混合物をＭｅＯＨで希釈し、続いて５Ｎ ＮａＯＨを使用して化合物Ａに１モルあたり２モルのＮａＯＨを添加することにより、透明な黄色の溶液を調製する。溶液を熱窒素流によって噴霧乾燥し、固体分散粉末を収集し、次いで真空炉内でさらに乾燥させる。噴霧乾燥固体分散体（ＳＤＤ）の用量は、全体を通して医薬品有効成分（ＡＰＩ）として表される。
ＮＰＴ２ｂ阻害剤投薬溶液：化合物Ａおよびポリ－１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３０重量％の化合物Ａおよび７０重量％のＰＶＰ－ＶＡの比率でボトルに量り入れる。混合物をＭｅＯＨで希釈し、続いて５Ｎ ＮａＯＨを使用して化合物Ａに１モルあたり２モルのＮａＯＨを添加することにより、透明な黄色の溶液を調製する。溶液を熱窒素流によって噴霧乾燥し、固体分散粉末を収集し、次いで真空炉内でさらに乾燥させる。噴霧乾燥固体分散体（ＳＤＤ）の用量は、全体を通して医薬品有効成分（ＡＰＩ）として表される。
【0074】
化合物Ａ投薬溶液を作製するために、適切な量の化合物Ａ ＳＤＤをバイアルに量り取り、水に溶解する（１０ｍＬ／ｋｇ投薬量）。化合物がバイアルの側面または底に付着しないようにするために、攪拌棒をボトルに追加し、配合および投薬プロセス全体を通して懸濁液を攪拌する。より低い用量のその後の溶液は、水での段階希釈によって調製する。７ｍｇ／ｍＬのＰＶＰ－ＶＡをビヒクル対照として使用する。
【0075】
ＮＨＥ３阻害剤投薬溶液：実施例２投薬溶液を作製するために、適切な量の化合物をバイアル内で秤量し、１％ＨＥＣに溶解する（１０ｍＬ／ｋｇ投薬量）。化合物がバイアルの側面または底に付着しないようにするために、攪拌棒をボトルに追加し、配合および投薬プロセス全体を通して懸濁液を攪拌する。より低い用量のその後の溶液は、ＨＥＣでの段階希釈によって調製する。
【0076】
放射性標識リン酸塩投薬溶液を作製するために、１６．２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．９％生理食塩水、ｐＨ７．４の溶液を調製し、無菌の０．２２μｍポリエーテルスルホンＭｉｌｌｅｘ－ＧＰ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過する。放射性リン酸塩（Ｈ３
３３ＰＯ４、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を溶液１ｍＬあたり約２．５μＣｉで添加し、再度濾過する。
【0077】
３つの別個の試験を行う。これらの試験では、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、ほぼ等しい平均体重の群に無作為化する。一晩絶食させた後、すべての動物に、いずれかのビヒクル、様々な用量の化合物Ａ（試験１）、様々な用量の実施例２（試験２）または１．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａおよび様々な用量の実施例２（試験３）を１０ｍＬ／ｋｇで投薬する。１５ｍｉｎ後、放射性標識リン酸塩を２ｍＬの量で経口投薬する。１５ｍｉｎ後、採血し、血漿を調製する。５０μＬの血漿中の放射能（ｄｐｍ）をシンチレーションカウンティングによって測定し、リン酸塩の吸収を計算するために使用する。結果は、１００％の吸収を表すビヒクル対照で正規化される。表７に示されるＥＤ５０およびＥｍａｘを計算するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して可変勾配を有する非線形回帰を用いて曲線をフィッティングする。ＥＤ５０計算における曲線フィッティングの目的で、実施例２の用量は、試験２におけるビヒクルのみの群に対して、および試験３におけるビヒクル＋１．２ｍｇ／ｋｇ化合物Ａに対して、ソフトウェアで人工的に０．００００１ｍｇ／ｋｇに設定されている。試験１における化合物Ａのみには、曲線フィッティングを行わなかった。
【0078】
ラットで行われた３つの別個の試験、化合物Ａの用量応答試験（試験１）、実施例２の用量応答試験（試験２）、および１．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの存在下での実施例２の用量応答試験（試験３）の結果を、以下の表４～７に要約する。実施例２および化合物Ａは両方とも、用量依存的にリン酸塩吸収を阻害し、試験された最高用量での阻害率はそれぞれ３７％および１８％である。しかしながら、組み合わせて与えられた場合、１．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａと組み合わせた実施例２の最高用量で７０％の阻害が達成される。したがって、２つの化合物は、いずれかの化合物を単独で投薬する場合よりも一緒に投薬する場合の方が効果的であり、ラットの腸のリン酸塩吸収に寄与する個別の経路を阻害する各化合物と一致している。
ラットにおけるリン酸塩吸収および腸のリン酸塩保持に対するＮＰＴ２ｂ阻害剤（化合物Ａ）と組み合わせた実施例２の効果
この試験の目的は、ラットにおいて、化合物を投薬してから１５ｍｉｎ後のリン酸塩吸収および化合物を投薬してから４．２５ｈ後に腸に保持されたリン酸塩に対する、実施例２、化合物Ａ、および実施例２／化合物Ａの組み合わせの効果を調査することである。後者は、長期間にわたって吸収される経口リン酸塩負荷の尺度である。
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
ラットにおけるリン酸塩吸収および腸のリン酸塩保持に対するＮＰＴ２ｂ阻害剤（化合物Ａ）と組み合わせた実施例２の効果
この試験の目的は、ラットにおいて、化合物を投薬してから１５ｍｉｎ後のリン酸塩吸収および化合物を投薬してから４．２５ｈ後に腸に保持されたリン酸塩に対する、実施例２、化合物Ａ、および実施例２／化合物Ａの組み合わせの効果を調査することである。後者は、長期間にわたって吸収される経口リン酸塩負荷の尺度である。
【0079】
この試験では、１）１％ＨＥＣおよび２）水中０．４６％ポリ－１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡビヒクル）の２つのビヒクルを使用する。この試験におけるビヒクル対照群は、２つのビヒクルの１：１の組み合わせを受ける。
【0080】
実施例２、化合物Ａおよびリン酸塩投薬溶液は、用量が実施例２については０．４ｍｇ／ｋｇ、化合物Ａについては１０ｍｇ／ｋｇであり、それらが５ｍＬ／ｋｇの量で投薬される濃度で調製されることを除いて、上記と同様に調製される。実施例２および化合物Ａのみの群は、他の化合物のビヒクルと１：１で混合され、一方化合物Ａおよび実施例２は、投薬前に１：１で混合される。最終投薬量はすべての場合において１０ｍＬ／ｋｇである。
【0081】
雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを４ｈ絶食させた後、適切なビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ、０．４ｍｇ／ｋｇの実施例２、または両方の化合物の組み合わせを投与した。１５ｍｉｎ後、動物に放射性標識リン酸塩溶液を投薬する。１５ｍｉｎ後、採血し、血漿を調製する。血漿中の放射能をシンチレーションカウンティングによって測定し、リン酸塩吸収の阻害を計算するために使用する。実施例２（０．４ｍｇ／ｋｇ）はリン酸塩吸収を２９％阻害し（Ｐ＝０．０４６対ビヒクル対照）、化合物Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）はリン酸塩吸収を３５％阻害するが（Ｐ＝０．０１３対ビヒクル対照）、２つの化合物はリン酸塩の吸収を６３％阻害する（Ｐ＝０．０００１対ビヒクル対照）。実施例２／化合物Ａの組み合わせによる６３％の阻害は、いずれかの化合物単独による阻害を上回っている。データは、平均±ＳＥＭとして示され、群の動物数は８に等しい。統計的有意性は、ＪＭＰ１２．１を使用した実施例２／化合物Ａの組み合わせとのＤｕｎｎｅｔｔの比較を伴うＡＮＯＶＡによって決定される。
【0082】
放射性標識リン酸塩溶液を投薬してから４ｈ後、胃、小腸、大腸および糞便を収集し、秤量し、および３７℃で一晩１Ｎ ＮａＯＨで消化する。各画分の放射能をシンチレーションカウンティングによって測定する。
【0083】
消化管で回収された用量の割合は、投薬量と比較した胃、小腸、大腸、および糞便で回収された放射能として定義される。データは平均±ＳＥＭとして示され、群の動物数は８に等しい。統計的有意性は、ＪＭＰ１２．１を使用した実施例２／化合物Ａの組み合わせとのＤｕｎｎｅｔｔの比較を伴うＡＮＯＶＡによって決定される。
【表8】
【0084】
消化管の各セクションから回収された放射性標識リン酸塩用量のパーセント、平均±ＳＥＭ
【0085】
回収された総放射能は、実施例２および化合物Ａの両方を投薬された動物（４６％）の方が、どちらか一方のみを投与された動物（それぞれ３１％および３２％）よりも大きい（表８）。したがって、この組み合わせは、いずれかの化合物単独よりも効果的である。
【0086】
胃腸管データで回収されたパーセント用量を、リン酸塩吸収の阻害に対する実施例２および化合物Ａの効果の相加性を試験するために、ＪＭＰ１２．１の二元配置ＡＮＯＶＡによってさらに分析する。実施例２／化合物Ａ相互作用の試験は有意であり（ｐ＝０．０１８７）、この試験で試験された用量での化合物間の相乗的関係を示している。すなわち、組み合わせの抑制効果は、個々の化合物の効果の合計よりも大きい。