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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-15
(45)【発行日】2022-12-23
(54)【発明の名称】ヒドロキシチロソールの製造
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20221216BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20221216BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20221216BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20221216BHJP
C12R 1/185 20060101ALN20221216BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/22
C12N15/60
C12N15/52
C12R1:185
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021029116
(22)【出願日】2021-02-25
(65)【公開番号】P2022130128
(43)【公開日】2022-09-06
【審査請求日】2022-08-17
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】520449563
【氏名又は名称】マイクロバイオファクトリー株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】517132810
【氏名又は名称】地方独立行政法人大阪産業技術研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】駒 大輔
(72)【発明者】
【氏名】大本 貴士
(72)【発明者】
【氏名】森芳 邦彦
(72)【発明者】
【氏名】山中 勇人
(72)【発明者】
【氏名】大橋 博之
(72)【発明者】
【氏名】清水 雅士
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２１／０２７１７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／００６８７７５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Applied and Environmental Microbiology，2012年，Vol.78, No.17, pp.6203-6216
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入され、内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊され、
内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊され、且つ、
ヒドロキシチロソールの生産能を有する、エシェリキア属の形質転換体であって、
さらに、下記（１）～（５）の５つの遺伝子が発現可能に導入されている、形質転換体。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧ fbr 又はａｒｏＦ fbr
（５）ｔｙｒＡ fbr
【請求項2】
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、又は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ）属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、請求項１記載の形質転換体。
【請求項3】
さらに、４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、請求項１又は２記載の形質転換体。
【請求項4】
さらに、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項5】
さらに、下記（６）及び（７）の遺伝子が発現可能に導入されている、請求項１から４のいずれかに記載の形質転換体。（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
【請求項6】
さらに、下記（８）～（１０）の少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入されている、請求項１から５のいずれかに記載の形質転換体。（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
【請求項7】
糖質原料と、請求項１から６のいずれかに記載の形質転換体とを反応させる工程を含む、ヒドロキシチロソールの製造方法。
【請求項8】
前記反応が、糖質原料の流加培養により行われる、請求項７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒドロキシチロソール製造のための微生物及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒドロキシチロソール（以下、「ＨＴＹ」と略されることがある。）はオリーブなどの天然物から得られるが、精製が非常に困難であり、低純度品にも関わらず非常に高価（１００万円／ｋｇ）である。化学合成法で高純度品を製造することも可能であるが、価格は依然として高い（２０万円／ｋｇ）。そこでバイオ技術を用いたヒドロキシチロソールの新たな合成方法が検討されている。
バイオ技術を用いた合成方法には、バイオコンバージョンと発酵法の２つがある。バイオコンバージョンでは比較的高い収量でヒドロキシチロソールを得ることが可能である（～６ｇ／Ｌ、非特許文献１、非特許文献２）。しかし、バイオコンバージョンでの基質となるチロシン、チロソール、ＤＯＰＡは非常に高価であり（数千円～数万円／ｋｇ）、それがヒドロキシチロソールの製造価格が高騰する原因となっている。またチロソールは化石資源由来であり、それらの使用は近年の持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）を推進する枠組みから逸脱するため、社会的にも好ましくない。
一方、発酵法での原料となる糖質は安価だが（数百円／ｋｇ）、発酵法によるヒドロキシチロソールの生産量が低いために（～０．６５ｇ／Ｌ、非特許文献３）、ヒドロキシチロソールを安価に製造することが不可能であった。
バイオ技術を用いた合成方法には、バイオコンバージョンと発酵法の２つがある。バイオコンバージョンでは比較的高い収量でヒドロキシチロソールを得ることが可能である（～６ｇ／Ｌ、非特許文献１、非特許文献２）。しかし、バイオコンバージョンでの基質となるチロシン、チロソール、ＤＯＰＡは非常に高価であり（数千円～数万円／ｋｇ）、それがヒドロキシチロソールの製造価格が高騰する原因となっている。またチロソールは化石資源由来であり、それらの使用は近年の持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）を推進する枠組みから逸脱するため、社会的にも好ましくない。
一方、発酵法での原料となる糖質は安価だが（数百円／ｋｇ）、発酵法によるヒドロキシチロソールの生産量が低いために（～０．６５ｇ／Ｌ、非特許文献３）、ヒドロキシチロソールを安価に製造することが不可能であった。
【0003】
一方、シキミ酸経路を強化した組み換え大腸菌を利用して、グルコース等の糖から、チロシン、フェニルアラニン、２－フェニルエタノール（フェネチルアルコール、２ＰＥ）等の芳香族化合物を効率よく生産する方法が報告された（特許文献１）。
また、シキミ酸経路を拡張した組み換え大腸菌を利用して、グルコース等の糖から、チロソール（４－ヒドロキシフェニルエタノール、４ＨＰＥ）や２ＰＥ等の芳香族化合物を効率よく生産する方法が報告された（非特許文献４）。
この非特許文献４には、ｐｈｅＡ遺伝子を欠失させたフェニルアラニン要求性の組み換え大腸菌（ΔｐｈｅＡ）は、副産物が抑制され、チロソール（４ＨＰＥ）の収率が倍増することが開示されている（同文献のTABLE 5、及び6211頁右欄第一パラグラフ等）。
また、シキミ酸経路を拡張した組み換え大腸菌を利用して、グルコース等の糖から、チロソール（４－ヒドロキシフェニルエタノール、４ＨＰＥ）や２ＰＥ等の芳香族化合物を効率よく生産する方法が報告された（非特許文献４）。
この非特許文献４には、ｐｈｅＡ遺伝子を欠失させたフェニルアラニン要求性の組み換え大腸菌（ΔｐｈｅＡ）は、副産物が抑制され、チロソール（４ＨＰＥ）の収率が倍増することが開示されている（同文献のTABLE 5、及び6211頁右欄第一パラグラフ等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】ＷＯ２０１９／０３０８０８
【非特許文献】
【0005】
【文献】Z. Bouallagui and S. Sayadi, Bioconversion of p-Tyrosol into Hydroxytyrosol under Bench-Scale Fermentation, BioMed Research InternationalVolume 2018, Article ID 7390751
【文献】Chaozhi Li et al., Efficient Synthesis of Hydroxytyrosol from l-3,4-Dihydroxyphenylalanine Using Engineered Escherichia coli Whole Cells、J. Agric. Food Chem., 2019, 67, 24, 6867-6873
【文献】Xianglai Li et al., Establishing an Artificial Pathway for Efficient Biosynthesis of Hydroxytyrosol, ACS Synth Biol. 2018, 16;7(2):647-654
【文献】Koma et al., Production of Aromatic Compounds by Metabolically Engineered Escherichia coli with an Expanded Shikimate Pathway, Appl. Environ. Microbiol. 78:6203-6216, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路を利用した、グルコースからチロソール（４ＨＰＥ）、２－フェニルエタノール（２ＰＥ）、及びヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）への合成ルートの概略を図１に示す。図１は、非特許文献４のＦＩＧ．１を参照したものである。
大腸菌で糖質原料からヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）、チロソール（４ＨＰＥ）、２－フェニルエタノール（２ＰＥ）等を合成するためには、少なくとも、菌体内で生成する４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４ＨＰＰ）又はフェニルピルビン酸（ＰＰ）を、それぞれ、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）又はフェニルアセトアルデヒド（ＰＡＡＬ）に変換する経路が必要である。その経路のために、外来生物種から得られるフェニルピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ｐｄｃ遺伝子）が導入される（拡張シキミ酸経路）。
また、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）の上流の化合物であるチロソール（４ＨＰＥ）の収率を向上させるには、菌株のフェニルアラニン合成経路を欠失させることが好ましい（ΔｐｈｅＡ）（非特許文献４のTABLE 5、及び6211頁右欄第一パラグラフ等）。
大腸菌で糖質原料からヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）、チロソール（４ＨＰＥ）、２－フェニルエタノール（２ＰＥ）等を合成するためには、少なくとも、菌体内で生成する４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４ＨＰＰ）又はフェニルピルビン酸（ＰＰ）を、それぞれ、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）又はフェニルアセトアルデヒド（ＰＡＡＬ）に変換する経路が必要である。その経路のために、外来生物種から得られるフェニルピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ｐｄｃ遺伝子）が導入される（拡張シキミ酸経路）。
また、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）の上流の化合物であるチロソール（４ＨＰＥ）の収率を向上させるには、菌株のフェニルアラニン合成経路を欠失させることが好ましい（ΔｐｈｅＡ）（非特許文献４のTABLE 5、及び6211頁右欄第一パラグラフ等）。
【0007】
本発明者らは、非特許文献４及び特許文献１に記載された教示に従って、シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路に関連する遺伝子の発現を強化し、かつ、ｐｈｅＡ遺伝子を欠失させることにより、ヒドロキシチロソール産生組み換え大腸菌株を作製した（図２参照）。図２において、太線の矢印は、過剰発現が誘導可能であることを示す。
図２のような、ｐｄｃ遺伝子が導入され、かつ、フェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）であるヒドロキシチロソール産生組み換え大腸菌株は、試験管等による小スケールではフェニルアラニンを加えた培地で概ね問題なく生育し、ヒドロキシチロソールを産生できた。しかしながら、本発明者らは、同株が、ジャーファーメンターにおける大スケール培養では、フェニルアラニンを加えても菌そのものの生育が悪くヒドロキシチロソールの工業的な生産には利用できない、という新たな課題を見出した。
図２のような、ｐｄｃ遺伝子が導入され、かつ、フェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）であるヒドロキシチロソール産生組み換え大腸菌株は、試験管等による小スケールではフェニルアラニンを加えた培地で概ね問題なく生育し、ヒドロキシチロソールを産生できた。しかしながら、本発明者らは、同株が、ジャーファーメンターにおける大スケール培養では、フェニルアラニンを加えても菌そのものの生育が悪くヒドロキシチロソールの工業的な生産には利用できない、という新たな課題を見出した。
【0008】
本開示は、ヒドロキシチロソールの生産性が向上可能な組み換え株、及び前記株を用いたヒドロキシチロソールの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示は、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入され、内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊され、内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊され、且つ、ヒドロキシチロソールの生産能を有する、エシェリキア属の形質転換体に関する。
【0010】
本開示は、糖質原料と本開示に係る形質転換体とを反応させる工程を含む、ヒドロキシチロソールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【0011】
本開示によれば、ヒドロキシチロソールの生産性が向上可能なエシェリキア属の形質転換体、及び前記形質転換体を用いたヒドロキシチロソールの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、グルコースからフェニルアラニン、２－フェニルエタノール（２ＰＥ）、チロシン、チロソール（４ＨＰＥ）、及びヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）等の芳香族化合物への合成ルートの概略を示す。シキミ酸経路と、拡張されたシキミ酸経路（導入された外因性ｐｄｃ遺伝子等）が利用される。
【図2】図２は、従来技術（非特許文献４）に基づいてＨＴＹの生産性向上を試みた株（実施例Ｆ株）におけるＨＴＹ合成ルートの概略を示す。Ｆ株では、シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路の遺伝子発現が強化されている（発現誘導、太線及び太字部分）。また、Ｆ株は、ｐｈｅＡ遺伝子を欠失していることにより、フェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）である。
【図3】シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路の遺伝子発現が強化され、かつ、ΔｐｈｅＡである株は、ラージスケールの培養で増殖能が悪化する。図３は、その増殖能悪化の原因となるエールリッヒ経路（点線矢印）の概略を示す。エールリッヒ経路が働くことで、前記株では、フェニルアラニンを添加してもすぐにフェニルアラニンが枯渇して増殖性が悪くなり、培養液中に２ＰＥが蓄積する。
【図4】図４は、本開示に係る形質転換株における糖質原料からＨＴＹへの合成ルートの概略を示す。本開示に係る形質転換株では、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されているため、エールリッヒ経路が機能せず、フェニルアラニンが消費されず、株の増殖性が向上する。一方で、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊された場合でも、ＩｌｖＥ、ＡｌａＣ、ＡｓｐＣ等の他のアミノ酸アミノトランスフェラーゼにより補完される場合には、チロシン要求性とはならない。
【図5】図５は、実施例のＦ株の増殖と、グルコース流加培養（発酵）によるヒドロキシチロソールの生産を観察したグラフである。●が菌数（ＯＤ660）を示す。△、■、◇、及び〇が、それぞれ、反応液（又は培地）中のヒドロキシチロソール濃度（ｇ／Ｌ）、チロソール濃度（ｇ／Ｌ）、２－フェニルエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、及びフェニルアラニン濃度（ｇ／Ｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明者らは、グルコースからヒドロキシチロソールを製造する効率を向上させるために、シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路の遺伝子発現を強化し、かつ、フェニルアラニン要求性に改変した株を作製した。しかし、この株は、試験管レベルの容量の培養では増殖性に問題がないように見えるが、ジャーファーメンター（バイオリアクター）等における大量培養時に増殖性が顕著に低下するという新たな課題が見出された。
本開示は、この新たな課題が、ｔｙｒＢ遺伝子を破壊する改変を加えた株により解決される、という知見に基づく。
この株を用いれば、糖質原料からのヒドロキシチロソール製造における効率の向上が、ジャーファーメンター等の大量培養システムで可能になる、という格別顕著な効果を奏し得る。
本開示は、この新たな課題が、ｔｙｒＢ遺伝子を破壊する改変を加えた株により解決される、という知見に基づく。
この株を用いれば、糖質原料からのヒドロキシチロソール製造における効率の向上が、ジャーファーメンター等の大量培養システムで可能になる、という格別顕著な効果を奏し得る。
【0014】
本開示における上記効果のメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推定される。シキミ酸経路及び拡張シキミ酸経路の強化とフェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）の改変を有する株の増殖性の低下は、エールリッヒ経路が原因であると推定される（図３）。すなわち、添加されたフェニルアラニンが、タンパク質合成（菌体の増殖）ではなく、２－フェニルエタノール等の合成に消費されて枯渇してしまう。そして、本開示に係る形質転換体は、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されることでエールリッヒ経路が機能しなくなり、フェニルアラニンの消費が抑制され、菌体の増殖性が回復し、ＨＴＹの生産性が向上する（図４）。
ただし、本開示は、このメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
ただし、本開示は、このメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【0015】
［形質転換体］
本開示に係る形質転換体は、エシェリキア属の菌の形質転換体である。
エシェリキア属の菌としては、一又は複数の実施形態において、エシェリキア コリ（大腸菌）が挙げられる。
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株及びＢ株、これらに由来する株が挙げられる。大腸菌Ｋ１２株由来の株としては、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ１３３０、ＪＭ１０９、ＨＳＴ０２、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、及びこれらの染色体にラムダＤＥ３遺伝子が組み込まれたＤＥ３株が挙げられる。Ｂ株由来の株としては、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）等が挙げられる。
大腸菌としては、これら菌株から派生した自然変異株でも人為的な遺伝子改変株であってもよい。
本開示に係る形質転換体は、エシェリキア属の菌の形質転換体である。
エシェリキア属の菌としては、一又は複数の実施形態において、エシェリキア コリ（大腸菌）が挙げられる。
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株及びＢ株、これらに由来する株が挙げられる。大腸菌Ｋ１２株由来の株としては、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ１３３０、ＪＭ１０９、ＨＳＴ０２、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、及びこれらの染色体にラムダＤＥ３遺伝子が組み込まれたＤＥ３株が挙げられる。Ｂ株由来の株としては、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）等が挙げられる。
大腸菌としては、これら菌株から派生した自然変異株でも人為的な遺伝子改変株であってもよい。
【0016】
本開示において、遺伝子名は、特に言及がない場合、大腸菌の遺伝子名を意味する。本開示において、遺伝子は、大腸菌の当該遺伝子のオーソログ（他生物種由来のホモログ）を含みうる。本開示において、遺伝子の配列は、特に言及がない場合、野生型（例えば、大腸菌であれば、Ｋ－１２株）のもの、あるいは、データベース（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫなど）に本願出願時において登録されているものを指すが、野生型と同等の機能を果たす範囲、又は、野生型と同等の蛋白質をコードする範囲で配列が異なっていてもよく、オーソログの配列であってもよい。また、遺伝子は、宿主での発現のため、コドンが最適化されてもよい。
本開示において「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有する類縁遺伝子を意味する。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素のアミノ酸配列に対して同一性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列である酵素をいう。
本開示において「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有する類縁遺伝子を意味する。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素のアミノ酸配列に対して同一性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列である酵素をいう。
【0017】
［ｐｄｃ遺伝子］
本開示の形質転換体は、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入されている。
本開示において、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性とは、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４ＨＰＰ）から４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）への反応を触媒できる酵素活性をいう。このような酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を、本開示において、ｐｄｃ遺伝子という。
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、一又は複数の実施形態において、ＨＴＹの生産性向上の観点から、宿主であるエシェリキア属の菌が有さない酵素、すなわち、外因性の酵素であることが好ましい。
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素としては、一又は複数の実施形態において、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、又は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼとしては、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、ＮＢＲＣ１０２２８９）のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＬＪ３６０００．１）及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
サッカロミケス属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼとしては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＲＯ１０（ＧｅｎＢａｎｋ ＤＡＡ１２２２３．１）及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
本開示に係る形質転換体に導入されるｐｄｃ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、上記の酵素をコードする外因性遺伝子又はこれらのオーソログである。
外因性ｐｄｃ遺伝子が導入されることで、シキミ酸経路が拡張され、シキミ酸経路由来のＰＰ及び４ＨＰＰがそれぞれＰＡＡＬ及び４ＨＰＡＡＬへ変換され、さまざまな芳香族化合物の生産が可能になる（拡張されたシキミ酸経路、図１）。
本開示の形質転換体は、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入されている。
本開示において、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性とは、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４ＨＰＰ）から４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）への反応を触媒できる酵素活性をいう。このような酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を、本開示において、ｐｄｃ遺伝子という。
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、一又は複数の実施形態において、ＨＴＹの生産性向上の観点から、宿主であるエシェリキア属の菌が有さない酵素、すなわち、外因性の酵素であることが好ましい。
４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素としては、一又は複数の実施形態において、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、又は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼとしては、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、ＮＢＲＣ１０２２８９）のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＬＪ３６０００．１）及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
サッカロミケス属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼとしては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＲＯ１０（ＧｅｎＢａｎｋ ＤＡＡ１２２２３．１）及びこれらに由来する酵素が挙げられる。
本開示に係る形質転換体に導入されるｐｄｃ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、上記の酵素をコードする外因性遺伝子又はこれらのオーソログである。
外因性ｐｄｃ遺伝子が導入されることで、シキミ酸経路が拡張され、シキミ酸経路由来のＰＰ及び４ＨＰＰがそれぞれＰＡＡＬ及び４ＨＰＡＡＬへ変換され、さまざまな芳香族化合物の生産が可能になる（拡張されたシキミ酸経路、図１）。
【0018】
本開示において、遺伝子を「発現可能に導入する」方法は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、遺伝子の発現亢進を誘導可能なプロモーター等の発現調節配列とともに導入する方法が挙げられる。
本開示において、発現誘導可能なプロモーターとともに導入される遺伝子は、単独の遺伝子であってもよく、複数遺伝子が発現可能なオペロンであってもよい。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、一又は複数の実施形態において、Ｔ７プロモーターが挙げられる。発現誘導にＴ７プロモーターを用いる場合、宿主微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株であることが好ましい。宿主微生物としては、一又は複数の実施形態において、λＤＥ３ファージを溶原化したＤＥ３株が挙げられる。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、その他の一又は複数の実施形態において、λファージのＰＬプロモーター（熱で発現誘導されるプロモーター）、アラビノースオペロンのアラビノースプロモーター（アラビノースで発現誘導されるプロモーター）、ｔｅｔプロモーター（テトラサイクリンで発現誘導されるプロモーター）、ｔｙｒＲなどの構成タンパク質のプロモーター、及び、構成性の人工プロモーターなどが挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、プラスミドで導入する方法、及び、宿主染色体に組み込む方法が挙げられる。
本開示において、遺伝子を発現誘導可能なプロモーターとともに染色体に導入する方法は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、実施例に記載の方法（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９に記載の方法）が挙げられる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
導入される遺伝子が、染色体上に組み込まれる場合、その座位は、宿主ゲノムが本来備えている当該遺伝子の座位でもよく、当該遺伝子とは別の宿主染色体の座位に導入さてもよい。
本開示において、発現誘導可能なプロモーターとともに導入される遺伝子は、単独の遺伝子であってもよく、複数遺伝子が発現可能なオペロンであってもよい。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、一又は複数の実施形態において、Ｔ７プロモーターが挙げられる。発現誘導にＴ７プロモーターを用いる場合、宿主微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株であることが好ましい。宿主微生物としては、一又は複数の実施形態において、λＤＥ３ファージを溶原化したＤＥ３株が挙げられる。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、その他の一又は複数の実施形態において、λファージのＰＬプロモーター（熱で発現誘導されるプロモーター）、アラビノースオペロンのアラビノースプロモーター（アラビノースで発現誘導されるプロモーター）、ｔｅｔプロモーター（テトラサイクリンで発現誘導されるプロモーター）、ｔｙｒＲなどの構成タンパク質のプロモーター、及び、構成性の人工プロモーターなどが挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、プラスミドで導入する方法、及び、宿主染色体に組み込む方法が挙げられる。
本開示において、遺伝子を発現誘導可能なプロモーターとともに染色体に導入する方法は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、実施例に記載の方法（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９に記載の方法）が挙げられる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
導入される遺伝子が、染色体上に組み込まれる場合、その座位は、宿主ゲノムが本来備えている当該遺伝子の座位でもよく、当該遺伝子とは別の宿主染色体の座位に導入さてもよい。
【0019】
［フェニルアラニン要求性］
本開示に係る形質転換体は、宿主ゲノムのｐｈｅＡ遺伝子、すなわち、内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊されている。
本開示において、「ｐｈｅＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７０８１である。
本開示において、ｐｈｅＡ遺伝子が破壊されているとは、一又は複数の実施形態において、ｐｈｅＡ遺伝子又はその発現調節配列の変異（塩基配列の付加、置換、及び／又は欠失など）により、ｐｈｅＡ遺伝子の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、野生型ｐｈｅＡ遺伝子の遺伝子産物の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、形質転換体がフェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）となっていることをいう。
本開示に係る形質転換体は、宿主ゲノムのｐｈｅＡ遺伝子、すなわち、内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊されている。
本開示において、「ｐｈｅＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７０８１である。
本開示において、ｐｈｅＡ遺伝子が破壊されているとは、一又は複数の実施形態において、ｐｈｅＡ遺伝子又はその発現調節配列の変異（塩基配列の付加、置換、及び／又は欠失など）により、ｐｈｅＡ遺伝子の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、野生型ｐｈｅＡ遺伝子の遺伝子産物の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、形質転換体がフェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）となっていることをいう。
【0020】
シキミ酸経路、及び、拡張されたシキミ酸経路を有する株において、フェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）となる変異が導入されると、４ＨＰＥの生産性が向上することが知られている（非特許文献４の表５、及び６２１１頁右欄第一パラグラフ等）。したがって、ＨＴＹ生産株をΔｐｈｅＡとすることで、合成経路上で４ＨＰＥの下流に位置するＨＴＹの生産性も向上することが想定された（図２）。
そこで、ＨＴＹ生産株をΔｐｈｅＡとした株を作製したところ、この株は、試験管レベルでの培養であれば増殖性に問題は認められなかった。しかしながら、この株をジャーファーメンターのようなラージスケールで培養すると増殖性が著しく低下する、すなわち、菌数（菌密度）の上昇が通常の菌に比べて著しく低い段階で止まってしまうという問題点が、本発明者らにより見出された（実施例Ｆ株、図５）。
ラージスケールの培養では、エールリッヒ経路の影響が大きくなり、フェニルアラニンが枯渇し、増殖性に悪影響を及ぼしていると考えられる（図３）。
そこで、ＨＴＹ生産株をΔｐｈｅＡとした株を作製したところ、この株は、試験管レベルでの培養であれば増殖性に問題は認められなかった。しかしながら、この株をジャーファーメンターのようなラージスケールで培養すると増殖性が著しく低下する、すなわち、菌数（菌密度）の上昇が通常の菌に比べて著しく低い段階で止まってしまうという問題点が、本発明者らにより見出された（実施例Ｆ株、図５）。
ラージスケールの培養では、エールリッヒ経路の影響が大きくなり、フェニルアラニンが枯渇し、増殖性に悪影響を及ぼしていると考えられる（図３）。
【0021】
［内因性ｔｙｒＢ遺伝子の破壊］
本開示に係る形質転換体は、宿主ゲノムのｔｙｒＢ遺伝子、すなわち、内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されている。
本開示において、「ｔｙｒＢ」遺伝子は、チロシンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４５０３１である。
本開示において、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されているとは、一又は複数の実施形態において、ｔｙｒＢ遺伝子又はその発現調節配列の変異（塩基配列の付加、置換、及び／又は欠失など）により、ｔｙｒＢ遺伝子の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、野生型ｔｙｒＢ遺伝子の遺伝子産物の機能が抑制又は消失していることをいう。
本開示に係る形質転換体は、宿主ゲノムのｔｙｒＢ遺伝子、すなわち、内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されている。
本開示において、「ｔｙｒＢ」遺伝子は、チロシンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４５０３１である。
本開示において、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されているとは、一又は複数の実施形態において、ｔｙｒＢ遺伝子又はその発現調節配列の変異（塩基配列の付加、置換、及び／又は欠失など）により、ｔｙｒＢ遺伝子の機能が抑制又は消失していることをいい、あるいは、野生型ｔｙｒＢ遺伝子の遺伝子産物の機能が抑制又は消失していることをいう。
【0022】
シキミ酸経路、及び、拡張されたシキミ酸経路を有し、かつ、フェニルアラニン要求性（ΔｐｈｅＡ）である株は、培地に添加したフェニルアラニンがエールリッヒ経路により消費されるため（図3）、ラージスケール培養で増殖阻害が発生するが、内因性ｔｙｒＢ遺伝子を破壊することで、エールリッヒ経路の問題を解消することができる（図４）。
ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されるとチロシン要求性になると考えられたが、チロシン要求性にならない場合がある。例えば、ＩｌｖＥ、ＡｌａＣ、ＡｓｐＣ等の他のアミノ酸アミノトランスフェラーゼが存在すると、ｔｙｒＢ遺伝子産物の機能が補完され、チロシン要求性とならない。本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、チロシン要求性ではない。
なお、ＩｌｖＥ、ＡｌａＣ、ＡｓｐＣ等のアミノ酸アミノトランスフェラーゼが存在しても増殖阻害は発生しない。これは、これらの酵素のPｈｅ→ＰＰの活性が高くなく、エールリッヒ経路が働きにくいからと考えられる。
ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されるとチロシン要求性になると考えられたが、チロシン要求性にならない場合がある。例えば、ＩｌｖＥ、ＡｌａＣ、ＡｓｐＣ等の他のアミノ酸アミノトランスフェラーゼが存在すると、ｔｙｒＢ遺伝子産物の機能が補完され、チロシン要求性とならない。本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、チロシン要求性ではない。
なお、ＩｌｖＥ、ＡｌａＣ、ＡｓｐＣ等のアミノ酸アミノトランスフェラーゼが存在しても増殖阻害は発生しない。これは、これらの酵素のPｈｅ→ＰＰの活性が高くなく、エールリッヒ経路が働きにくいからと考えられる。
【0023】
本開示において、宿主ゲノム遺伝子（内因性遺伝子）の破壊方法は、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、部位特異的な組み換えで行われる。部位特異的な組み換えは、一又は複数の実施形態において、ＣＲＩＭプラスミドを利用する方法、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムを利用する方法、出芽酵母の組み換え酵素ＦＬＰとＦＲＴ配列を利用する方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用する方法、Ｐ１トランスダクションを利用する方法などが挙げられる。
【0024】
［ヒドロキシチロソールの生産能］
本開示に係る形質転換体は、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）を生産する能力を有する。本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、糖質原料からＨＴＹを生産する能力を有する。
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に生産する観点から、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましい。
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に生産する観点から、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましい。
本開示に係る形質転換体は、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）を生産する能力を有する。本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、糖質原料からＨＴＹを生産する能力を有する。
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に生産する観点から、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましい。
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に生産する観点から、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましい。
【0025】
［４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素］
本開示における４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素は、チロソール（４ＨＰＥ）がヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）となる化学反応を触媒できるものである（図１）。
４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素としては、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼ（４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－モノオキシゲナーゼ）が使用できる。
本開示における４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素は、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、一又は複数の実施形態において、二成分酵素のものが好ましく、補酵素として還元型のフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）、すなわち、ＦＡＤＨ2を使用する、二成分型ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼがより好ましい。
本開示における４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素は、チロソール（４ＨＰＥ）がヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）となる化学反応を触媒できるものである（図１）。
４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素としては、一又は複数の実施形態において、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼ（４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－モノオキシゲナーゼ）が使用できる。
本開示における４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素は、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、一又は複数の実施形態において、二成分酵素のものが好ましく、補酵素として還元型のフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）、すなわち、ＦＡＤＨ2を使用する、二成分型ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼがより好ましい。
【0026】
本開示における４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子の遺伝子産物（ｈｐａＢ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＴ４６００３．１、ｈｐａＣ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＴ４６００２．１）、及びこれらに由来する酵素又はこれらのオーソログの遺伝子産物が好ましい。
同酵素としては、その他の一又は複数の実施形態において、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｈｐａＡＣ遺伝子の遺伝子産物（ｈｐａＡ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ０７４７８．１、ｈｐａＣ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ０７４７９．１）、若しくは、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｎｓのフェノールー２－ヒドロキシラーゼ（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ６６５４６．１、ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂ： ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ６６５４７．１）、及びこれらに由来する酵素又はこれらのオーソログの遺伝子産物が挙げられる。
同酵素としては、その他の一又は複数の実施形態において、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｈｐａＡＣ遺伝子の遺伝子産物（ｈｐａＡ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ０７４７８．１、ｈｐａＣ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ０７４７９．１）、若しくは、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｎｓのフェノールー２－ヒドロキシラーゼ（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａ：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ６６５４６．１、ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂ： ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ６６５４７．１）、及びこれらに由来する酵素又はこれらのオーソログの遺伝子産物が挙げられる。
【0027】
［４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素］
本開示における４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）がチロソール（４ＨＰＥ）となる化学反応を触媒できるものである（図１）。
４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、一又は複数の実施形態において、大腸菌ｙａｈＫ遺伝子の遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７３４２８．１）、大腸菌ｙｊｇＢ遺伝子の遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７７２２６．２）、大腸菌ｙｑｈＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６０４７．１）及びこれらに由来する酵素、又はこれらのオーソログの遺伝子産物が挙げられる。
これらの中でも、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、ｙａｈＫ及びｙｊｇＢがより好ましく、ｙａｈＫが更に好ましい。
本開示における４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４ＨＰＡＡＬ）がチロソール（４ＨＰＥ）となる化学反応を触媒できるものである（図１）。
４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、一又は複数の実施形態において、大腸菌ｙａｈＫ遺伝子の遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７３４２８．１）、大腸菌ｙｊｇＢ遺伝子の遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７７２２６．２）、大腸菌ｙｑｈＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６０４７．１）及びこれらに由来する酵素、又はこれらのオーソログの遺伝子産物が挙げられる。
これらの中でも、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、ｙａｈＫ及びｙｊｇＢがより好ましく、ｙａｈＫが更に好ましい。
【0028】
［シキミ酸経路の強化］
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、一又は複数の実施形態において、シキミ酸経路に関する遺伝子（群）の発現が強化されていることが好ましく、該遺伝子（群）が発現可能に導入されていることが好ましく、宿主染色体上に発現可能に導入されていることがより好ましい。
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、一又は複数の実施形態において、シキミ酸経路に関する遺伝子（群）の発現が強化されていることが好ましく、該遺伝子（群）が発現可能に導入されていることが好ましく、宿主染色体上に発現可能に導入されていることがより好ましい。
【0029】
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、下記（１）～（５）の５つの遺伝子の全てが発現可能に導入されていることが好ましく、宿主染色体上に発現可能に導入されていることがより好ましい。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｔｙｒＡfbr
上記（４）及び（５）に加え、上記（１）～（３）のすべてを発現可能に導入することで、上記（４）及び（５）の発現亢進による代謝負荷を低減しうる。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｔｙｒＡfbr
上記（４）及び（５）に加え、上記（１）～（３）のすべてを発現可能に導入することで、上記（４）及び（５）の発現亢進による代謝負荷を低減しうる。
【0030】
本開示において、「ａｒｏＡ」遺伝子は、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４５５２８である。
本開示において、「ａｒｏＢ」遺伝子は、３－デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７９２７である。
本開示において、「ａｒｏＣ」遺伝子は、コリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６８１４である。
本開示において、「ａｒｏＧ」遺伝子は、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－７－ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：６４５６０５である。
本開示において、「ａｒｏＧfbr」遺伝子は、ａｒｏＧのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＧfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－２３６９４７に開示のものを使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
本開示において、「ａｒｏＦ」遺伝子は、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－７－ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７０８４である。
本開示において、「ａｒｏＦfbr」遺伝子は、ａｒｏＦのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＦfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－２３６９４７に開示のものを使用できる。
本開示において、「ｔｙｒＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７１１５である。
本開示において、「ｔｙｒＡfbr」遺伝子は、ｔｙｒＡのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ｔｙｒＡfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－０７６３５２に開示のものを使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
本開示において、「ａｒｏＢ」遺伝子は、３－デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７９２７である。
本開示において、「ａｒｏＣ」遺伝子は、コリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６８１４である。
本開示において、「ａｒｏＧ」遺伝子は、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－７－ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：６４５６０５である。
本開示において、「ａｒｏＧfbr」遺伝子は、ａｒｏＧのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＧfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－２３６９４７に開示のものを使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
本開示において、「ａｒｏＦ」遺伝子は、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－７－ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７０８４である。
本開示において、「ａｒｏＦfbr」遺伝子は、ａｒｏＦのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＦfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－２３６９４７に開示のものを使用できる。
本開示において、「ｔｙｒＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７１１５である。
本開示において、「ｔｙｒＡfbr」遺伝子は、ｔｙｒＡのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ｔｙｒＡfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平０５－０７６３５２に開示のものを使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
【0031】
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（１）～（５）の５つの遺伝子に加え、下記（６）及び（７）の２つの遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましく、宿主染色体上に発現可能に導入されていることがより好ましい。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
ここで、発現誘導可能なプロモーターとしてＴ７プロモーターを使用する場合、目的の芳香族化合物の生産性向上の点から、上記（７）ｔｋｔＡのプロモーターは発現誘導能が低減した変異型Ｔ７プロモーターであることが好ましい。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
ここで、発現誘導可能なプロモーターとしてＴ７プロモーターを使用する場合、目的の芳香族化合物の生産性向上の点から、上記（７）ｔｋｔＡのプロモーターは発現誘導能が低減した変異型Ｔ７プロモーターであることが好ましい。
【0032】
本開示において、「ｐｐｓＡ」遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６２０９である。
本開示において、「ｔｋｔＡ」遺伝子は、トランスケトラーゼ１をコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７４２０である。
本開示において、「ｔｋｔＡ」遺伝子は、トランスケトラーゼ１をコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７４２０である。
【0033】
本開示に係る形質転換体は、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（１）～（７）の７つの遺伝子に加え、下記（８）から（１０）の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、更に好ましくは３つの遺伝子が発現可能に導入されていることが好ましく、宿主染色体上に発現可能に導入されていることがより好ましい。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
上記（９）のａｒｏＥ又はｙｄｉＢは相互に代替可能であるが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（９）の遺伝子としては、ａｒｏＥが好ましい。
上記（１０）のａｒｏＬ又はａｒｏＫは相互に代替可能であるが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（１０）の遺伝子としては、ａｒｏＬが好ましい。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
上記（９）のａｒｏＥ又はｙｄｉＢは相互に代替可能であるが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（９）の遺伝子としては、ａｒｏＥが好ましい。
上記（１０）のａｒｏＬ又はａｒｏＫは相互に代替可能であるが、ＨＴＹを効率的に産生する観点から、上記（１０）の遺伝子としては、ａｒｏＬが好ましい。
【0034】
本開示において、「ａｒｏＤ」遺伝子は、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６２１０である。
本開示において、「ａｒｏＥ」遺伝子は、デヒドロシキミ酸レダクターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７７７６である。
本開示において、「ｙｄｉＢ」遺伝子は、キナ酸／シキミ酸５－デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６２００である。
本開示において、「ａｒｏＬ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４５０３１である。
本開示において、「ａｒｏＫ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：２８４７７５９である。
本開示において、「ａｒｏＥ」遺伝子は、デヒドロシキミ酸レダクターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４７７７６である。
本開示において、「ｙｄｉＢ」遺伝子は、キナ酸／シキミ酸５－デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４６２００である。
本開示において、「ａｒｏＬ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：９４５０３１である。
本開示において、「ａｒｏＫ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅＩＤ：２８４７７５９である。
【0035】
［ヒドロキシチロソールの製造方法］
本開示に係るヒドロキシチロソールの製造方法は、糖質原料と、本開示に係る形質転換体とを反応させる工程を含む製造方法に関する。
本開示におけるこの「反応」は、「培養」や「発酵」ということもできる。
本開示に係る形質転換体と反応させる糖質原料としては、糖や糖アルコールが挙げられる。糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜等が挙げられる。糖アルコールとしては、グリセリン等が挙げられる。
糖質原料と本開示に係る形質転換体との反応は、一又は複数の実施形態において、所定量まで液体培地で培養した本開示に係る形質転換体に対して導入した発現誘導を行い、その後、培養中の培地に糖質原料を添加することで行うことができる。
本開示に係る形質転換体の培養は、フェニルアラニン要求性であること以外は、通常の培養方法の条件で行うことができ、反応工程も、従来の発酵又は反応の条件で行うことができる。
培養の培地は、フェニルアラニンに加え、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、ミネラル、ビタミンなどのその他の成分を含むもので、本開示の微生物が生育できるものなら特に限定されない。培地におけるフェニルアラニンの含有量（初期濃度）としては、一又は複数の実施形態において、０．２～１０ｍＭ、又は、１～８ｍＭが挙げられる。
本開示に係る形質転換体の培養は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、ジャーファンメンターやバイオリアクター等の大量培養可能な装置で行うことが好ましい。
本開示に係る形質転換体の培養は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、糖質原料を培養中に添加する流加培養が好ましい。
本開示に係るヒドロキシチロソールの製造方法は、糖質原料と、本開示に係る形質転換体とを反応させる工程を含む製造方法に関する。
本開示におけるこの「反応」は、「培養」や「発酵」ということもできる。
本開示に係る形質転換体と反応させる糖質原料としては、糖や糖アルコールが挙げられる。糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜等が挙げられる。糖アルコールとしては、グリセリン等が挙げられる。
糖質原料と本開示に係る形質転換体との反応は、一又は複数の実施形態において、所定量まで液体培地で培養した本開示に係る形質転換体に対して導入した発現誘導を行い、その後、培養中の培地に糖質原料を添加することで行うことができる。
本開示に係る形質転換体の培養は、フェニルアラニン要求性であること以外は、通常の培養方法の条件で行うことができ、反応工程も、従来の発酵又は反応の条件で行うことができる。
培養の培地は、フェニルアラニンに加え、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、ミネラル、ビタミンなどのその他の成分を含むもので、本開示の微生物が生育できるものなら特に限定されない。培地におけるフェニルアラニンの含有量（初期濃度）としては、一又は複数の実施形態において、０．２～１０ｍＭ、又は、１～８ｍＭが挙げられる。
本開示に係る形質転換体の培養は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、ジャーファンメンターやバイオリアクター等の大量培養可能な装置で行うことが好ましい。
本開示に係る形質転換体の培養は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、糖質原料を培養中に添加する流加培養が好ましい。
【0036】
糖質原料の流加培養によるヒドロキシチロソールの製造方法は、例えば、実施例の方法を参照できる。簡単には、前培養を行い、１～１０％の濃度で最小培地に植菌して培養し、ＯＤ660が０．５～２０に達したら発現誘導（Ｔ７プロモーターであれば、例えば１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加）して２～５時間培養した後、原料である糖質溶液を所定の供給スピードで流加して２０～３５時間反応し、培養液及び／又は菌内にヒドロキシチロソールを得る。
【0037】
［培養温度］
微生物が生育できる温度が挙げられる。生育速度の観点から、その生物の至適な培養温度が好ましい。大腸菌であれば、一又は複数の実施形態において、２５℃～４０℃、又は、３０℃～３７℃が挙げられる。
［培地］
微生物が生育できる培地であれば制限されない。培地は、一又は複数の実施形態において、液体培地である。ＬＢ培地などの天然培地にフェニルアラニンを加えたもの、Ｍ９や実施例のＨＣＦ培地などの合成培地にフェニルアラニンを加えたものが挙げられる。化合物の精製を考えた場合には合成培地の方が好ましい。
［培養ｐＨ］
培養ｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０～７．５の範囲が挙げられ、その他の態様において、７．０付近、又は、６．２～７．２が挙げられる。
［培地への糖質原料の添加量（流加速度）］
糖質溶液の添加量は、菌の種類、菌体量、培養条件に依存して調節する。一又は複数の実施形態において、添加した糖質原料の多くがなるべくＨＴＹに変換されるように糖質原料を流加することが好ましい。一又は複数の実施形態において、酢酸などの副産物量を抑制できる範囲で添加することが好ましい。
一又は複数の実施形態において、糖質原料を、培地中の濃度が０～２ｇ／Ｌ、好ましくは０．１～１ｇ／Ｌの範囲に収まるように添加する。
添加される糖質原料の総量は、菌の種類や培養条件によって異なるが、添加した糖質原料のほぼすべてが菌体によって消費される量が好ましい。大腸菌の場合には、一又は複数の実施形態において、１００～３００ｇ／Ｌ程度が挙げられる
［培養時間］
培養時間は、一又は複数の実施形態において、流加した糖質原料がなくなるまで培養することが好ましい。
但し、培養条件はこれらに限定されない。
微生物が生育できる温度が挙げられる。生育速度の観点から、その生物の至適な培養温度が好ましい。大腸菌であれば、一又は複数の実施形態において、２５℃～４０℃、又は、３０℃～３７℃が挙げられる。
［培地］
微生物が生育できる培地であれば制限されない。培地は、一又は複数の実施形態において、液体培地である。ＬＢ培地などの天然培地にフェニルアラニンを加えたもの、Ｍ９や実施例のＨＣＦ培地などの合成培地にフェニルアラニンを加えたものが挙げられる。化合物の精製を考えた場合には合成培地の方が好ましい。
［培養ｐＨ］
培養ｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０～７．５の範囲が挙げられ、その他の態様において、７．０付近、又は、６．２～７．２が挙げられる。
［培地への糖質原料の添加量（流加速度）］
糖質溶液の添加量は、菌の種類、菌体量、培養条件に依存して調節する。一又は複数の実施形態において、添加した糖質原料の多くがなるべくＨＴＹに変換されるように糖質原料を流加することが好ましい。一又は複数の実施形態において、酢酸などの副産物量を抑制できる範囲で添加することが好ましい。
一又は複数の実施形態において、糖質原料を、培地中の濃度が０～２ｇ／Ｌ、好ましくは０．１～１ｇ／Ｌの範囲に収まるように添加する。
添加される糖質原料の総量は、菌の種類や培養条件によって異なるが、添加した糖質原料のほぼすべてが菌体によって消費される量が好ましい。大腸菌の場合には、一又は複数の実施形態において、１００～３００ｇ／Ｌ程度が挙げられる
［培養時間］
培養時間は、一又は複数の実施形態において、流加した糖質原料がなくなるまで培養することが好ましい。
但し、培養条件はこれらに限定されない。
【0038】
本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
＜１＞ ４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入され、
内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊され、
内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊され、且つ、
ヒドロキシチロソールの生産能を有する、エシェリキア属の形質転換体。
＜２＞ ４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、又は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ）属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、＜１＞記載の形質転換体。
＜３＞ さらに、４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞又は＜２＞記載の形質転換体。
＜４＞ さらに、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜５＞ さらに、下記（１）～（５）の５つの遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の形質転換体。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｔｙｒＡfbr
＜６＞ さらに、下記（６）及び（７）の遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の形質転換体。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
＜７＞ さらに、下記（８）～（１０）の少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の形質転換体。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
＜８＞ 糖質原料と、＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の形質転換体とを反応させる工程を含む、ヒドロキシチロソールの製造方法。
＜９＞ 前記反応が、糖質原料の流加培養より行われる、＜８＞記載の製造方法。
＜１＞ ４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外因性遺伝子が発現可能に導入され、
内因性ｐｈｅＡ遺伝子が破壊され、
内因性ｔｙｒＢ遺伝子が破壊され、且つ、
ヒドロキシチロソールの生産能を有する、エシェリキア属の形質転換体。
＜２＞ ４－ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、又は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ）属酵母のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、＜１＞記載の形質転換体。
＜３＞ さらに、４－ヒドロキシフェニルエタノール－３－ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞又は＜２＞記載の形質転換体。
＜４＞ さらに、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜５＞ さらに、下記（１）～（５）の５つの遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の形質転換体。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｔｙｒＡfbr
＜６＞ さらに、下記（６）及び（７）の遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の形質転換体。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
＜７＞ さらに、下記（８）～（１０）の少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入されている、＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の形質転換体。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
＜８＞ 糖質原料と、＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の形質転換体とを反応させる工程を含む、ヒドロキシチロソールの製造方法。
＜９＞ 前記反応が、糖質原料の流加培養より行われる、＜８＞記載の製造方法。
【実施例】
【0039】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【0040】
実施例で使用した株を表１に示す。
本開示において「Ｔ７ｐ」は、Ｔ７ｌａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーが付加されたＴ７プロモーター）を意味する。本開示において「Ｔ７ｐ(-8TC)」とは、発現誘導能が低減した変異型Ｔ７ｐを意味する。本開示において、「Ｔ７ｔ」は、Ｔ７ターミネーターを意味する。
本開示において「Ｔ７ｐ」は、Ｔ７ｌａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーが付加されたＴ７プロモーター）を意味する。本開示において「Ｔ７ｐ(-8TC)」とは、発現誘導能が低減した変異型Ｔ７ｐを意味する。本開示において、「Ｔ７ｔ」は、Ｔ７ターミネーターを意味する。
【0041】
【表1】
【0042】
１．Ａ株（ｔｙｒＡ挿入株）の作製
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrの作製
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｃＴｙｒＡ－Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣ，配列番号１）とＥｃＴｙｒＡ－ＲＭ１（ＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣ，配列番号２）プライマーペア、ＥｃＴｙｒＡ－ＦＭ１（ＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧ，配列番号３）とＥｃＴｙｒＡ－ＲＭ２（ＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＡＣＧＴＡＡＴＣＧＣＣＧＡＡＣ，配列番号４）プライマーペア、及びＥｃＴｙｒＡ－ＦＭ２（ＧＴＴＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣＧＴＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧ，配列番号５）とＥｃＴｙｒＡ－Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＣ，配列番号６）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより３つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、３つの増幅断片を鋳型としてＥｃＴｙｒＡ－ＦとＥｃＴｙｒＡ－Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、５３番目のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ３５４番目のアラニンがバリンに置換されたＴｙｒＡをコードするＤＮＡ（ｔｙｒＡfbr）を得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクター（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）をそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ，配列番号７）とＴ７ターミネータープライマー（ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ，配列番号８）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。コロニーダイレクトＰＣＲにはＯｎｅＴａｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いた。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
ＬＢ寒天培地の組成（本実施例において以下同じ）：１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ７．０
ＬＢ液体培地の組成（本実施例において以下同じ）：１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrの作製
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｃＴｙｒＡ－Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣ，配列番号１）とＥｃＴｙｒＡ－ＲＭ１（ＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣ，配列番号２）プライマーペア、ＥｃＴｙｒＡ－ＦＭ１（ＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧ，配列番号３）とＥｃＴｙｒＡ－ＲＭ２（ＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＡＣＧＴＡＡＴＣＧＣＣＧＡＡＣ，配列番号４）プライマーペア、及びＥｃＴｙｒＡ－ＦＭ２（ＧＴＴＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣＧＴＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧ，配列番号５）とＥｃＴｙｒＡ－Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＣ，配列番号６）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより３つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、３つの増幅断片を鋳型としてＥｃＴｙｒＡ－ＦとＥｃＴｙｒＡ－Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、５３番目のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ３５４番目のアラニンがバリンに置換されたＴｙｒＡをコードするＤＮＡ（ｔｙｒＡfbr）を得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクター（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）をそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ，配列番号７）とＴ７ターミネータープライマー（ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ，配列番号８）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。コロニーダイレクトＰＣＲにはＯｎｅＴａｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いた。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
ＬＢ寒天培地の組成（本実施例において以下同じ）：１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ７．０
ＬＢ液体培地の組成（本実施例において以下同じ）：１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
【0043】
（２）Ａ株の作製
ｔｙｒＡfbr遺伝子の大腸菌染色体への導入は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）により行った。はじめに染色体へ導入するためのＤＮＡ断片を含む溶液の調製を行った。上記で作製したプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrを鋳型ＤＮＡとして、ｄｅｌｔａ－ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ－Ｆ（ＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号９）とｄｅｌｔａ－ｆｅａＢ－ＦＲＴ－Ｒ（ＴＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号１０）のプライマーセットを用いて、２つのフリパーゼ認識配列（ＦＲＴ）とカナマイシン耐性遺伝子配列（Ｋｍ）を含むｔｙｒＡfbr遺伝子（ＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｔｙｒＡfbr－Ｔ７ｔ）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＤｐｎＩで一晩消化し、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製したものを染色体導入用のＤＮＡ溶液とした。
つぎに、大腸菌のエレクトロポレーションセルの調製を行った。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６株を１０ｍＭのＬ－アラビノースと１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ液体培地にて、ＯＤ660が０．５程度に達するまで３０℃で培養した。次に、２ｍＬの菌液を５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。再度、菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水５０μＬに懸濁してエレクトロポレーションセルとした。
つぎに、エレクトロポレーションセルにＤＮＡ断片を１００～２００ｎｇ（１μＬ程度）添加し、溶液をエレクトロポレーションキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションキュベットに１ｍＬのＬＢ液体培地を加えた後、菌懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、３７℃で２時間程度振とうした。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーから、ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ座位にｔｙｒＡfbr遺伝子を持つ大腸菌をコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＫ２（ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ，配列番号１１）とＤｏｗｎ－ｆｅａＢ（ＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧ，配列番号１２）のプライマーセットを添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ座位にｔｙｒＡfbr遺伝子が挿入された菌株（Ａ株）を確認した。
ｔｙｒＡfbr遺伝子の大腸菌染色体への導入は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）により行った。はじめに染色体へ導入するためのＤＮＡ断片を含む溶液の調製を行った。上記で作製したプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrを鋳型ＤＮＡとして、ｄｅｌｔａ－ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ－Ｆ（ＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号９）とｄｅｌｔａ－ｆｅａＢ－ＦＲＴ－Ｒ（ＴＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号１０）のプライマーセットを用いて、２つのフリパーゼ認識配列（ＦＲＴ）とカナマイシン耐性遺伝子配列（Ｋｍ）を含むｔｙｒＡfbr遺伝子（ＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｔｙｒＡfbr－Ｔ７ｔ）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＤｐｎＩで一晩消化し、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製したものを染色体導入用のＤＮＡ溶液とした。
つぎに、大腸菌のエレクトロポレーションセルの調製を行った。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６株を１０ｍＭのＬ－アラビノースと１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ液体培地にて、ＯＤ660が０．５程度に達するまで３０℃で培養した。次に、２ｍＬの菌液を５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。再度、菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水５０μＬに懸濁してエレクトロポレーションセルとした。
つぎに、エレクトロポレーションセルにＤＮＡ断片を１００～２００ｎｇ（１μＬ程度）添加し、溶液をエレクトロポレーションキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションキュベットに１ｍＬのＬＢ液体培地を加えた後、菌懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、３７℃で２時間程度振とうした。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーから、ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ座位にｔｙｒＡfbr遺伝子を持つ大腸菌をコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＫ２（ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ，配列番号１１）とＤｏｗｎ－ｆｅａＢ（ＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧ，配列番号１２）のプライマーセットを添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｌｄｈＡ－ｆｅａＢ座位にｔｙｒＡfbr遺伝子が挿入された菌株（Ａ株）を確認した。
【0044】
２．Ｂ株（ｐｄｃ挿入株）の作製
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｐｄｃの作製
人工合成したｐｄｃ遺伝子（配列番号１３、合成時に末端にＮｄｅＩとＸｈｏＩのサイトを付加してある）とｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｐｄｃの作製
人工合成したｐｄｃ遺伝子（配列番号１３、合成時に末端にＮｄｅＩとＸｈｏＩのサイトを付加してある）とｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
【0045】
配列番号１３：ATGAAACTGGCTGAAGCTCTGCTGCGTGCCCTGAAAGACCGTGGTGCTCAAGCGATGTTTGGTATTCCGGGTGATTTTGCTCTGCCGTTTTTCAAAGTGGCGGAAGAAACCCAGATTCTGCCGCTGCATACGCTGAGCCACGAACCGGCCGTTGGTTTTGCGGCCGATGCAGCTGCGCGTTATAGCTCTACCCTGGGTGTGGCAGCAGTTACGTACGGCGCTGGTGCGTTCAACATGGTCAATGCCGTGGCAGGTGCTTATGCGGAAAAATCACCGGTGGTTGTCATCTCGGGTGCACCGGGCACCACGGAGGGTAACGCTGGTCTGCTGCTGCATCACCAGGGTCGTACCCTGGATACGCAGTTTCAAGTCTTCAAAGAAATTACCGTGGCACAAGCACGTCTGGATGACCCGGCTAAAGCACCGGCAGAAATCGCACGTGTGCTGGGTGCTGCGCGTGCGCAGTCTCGTCCGGTTTACCTGGAAATTCCGCGTAACATGGTCAATGCGGAAGTTGAACCGGTCGGTGATGACCCGGCATGGCCGGTTGATCGTGACGCTCTGGCCGCATGCGCGGATGAAGTGCTGGCTGCGATGCGTAGTGCGACCTCCCCGGTTCTGATGGTTTGTGTCGAAGTGCGTCGCTATGGTCTGGAAGCGAAAGTGGCAGAACTGGCACAGCGTCTGGGTGTTCCGGTGGTTACCACGTTTATGGGCCGTGGTCTGCTGGCAGATGCTCCGACCCCGCCGCTGGGCACGTACATTGGTGTTGCTGGCGACGCGGAAATCACCCGTCTGGTCGAAGAATCAGATGGTCTGTTTCTGCTGGGCGCCATTCTGAGCGACACCAACTTCGCAGTGTCTCAGCGCAAAATTGACCTGCGTAAAACGATCCATGCCTTTGATCGCGCAGTCACCCTGGGTTATCACACGTACGCCGATATCCCGCTGGCAGGCCTGGTTGACGCTCTGCTGGAACGTCTGCCGCCGTCGGATCGTACCACGCGTGGCAAAGAACCGCATGCATATCCGACCGGTCTGCAGGCAGACGGTGAACCGATTGCACCGATGGATATCGCGCGTGCGGTGAATGACCGTGTTCGCGCGGGTCAAGAACCGCTGCTGATTGCCGCAGATATGGGCGACTGCCTGTTTACCGCGATGGATATGATCGACGCTGGTCTGATGGCGCCGGGCTATTACGCCGGTATGGGTTTCGGTGTCCCGGCAGGTATTGGTGCACAGTGCGTGTCAGGCGGTAAACGTATCCTGACCGTCGTGGGTGATGGCGCGTTTCAAATGACGGGTTGGGAACTGGGCAACTGTCGTCGCCTGGGTATTGATCCGATTGTGATCCTGTTCAACAATGCCAGTTGGGAAATGCTGCGCACCTTTCAGCCGGAATCCGCATTCAATGATCTGGATGACTGGCGTTTTGCGGACATGGCTGCGGGTATGGGTGGTGATGGTGTTCGTGTCCGTACCCGTGCGGAACTGAAAGCCGCACTGGATAAAGCATTTGCTACGCGCGGTCGTTTCCAACTGATTGAAGCCATGATCCCGCGTGGCGTGCTGTCGGATACCCTGGCTCGCTTCGTCCAAGGTCAAAAACGTCTGCATGCTGCCCCGCGTGAATAA
【0046】
（２）Ｂ株の作製
染色体ＤＮＡのｍｔｌＡ座位にｐｄｃ遺伝子が挿入された菌株（Ｂ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。
ｐｄｃ遺伝子を染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｐｄｃ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｍｔｌＡ－Ｆ（ＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号１４）とｄｅｌｔａ－ｍｔｌＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号１５）のプライマーセットを用いた。また、ｍｔｌＡ座位へのｐｄｃ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡ（ＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣ，配列番号１６）のプライマーセットを用いた。
染色体ＤＮＡのｍｔｌＡ座位にｐｄｃ遺伝子が挿入された菌株（Ｂ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。
ｐｄｃ遺伝子を染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｐｄｃ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｍｔｌＡ－Ｆ（ＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号１４）とｄｅｌｔａ－ｍｔｌＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号１５）のプライマーセットを用いた。また、ｍｔｌＡ座位へのｐｄｃ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡ（ＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣ，配列番号１６）のプライマーセットを用いた。
【0047】
３．Ｃ株（ｙａｈＫ挿入株）の作製
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｙａｈＫの作製
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｙａｈＫ－Ｎｄｅ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧ，配列番号１７）とｙａｈＫ－Ｘｈｏ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＧＴＧＣＧ，配列番号１８）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりｙａｈＫ遺伝子を含むＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｙａｈＫの作製
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｙａｈＫ－Ｎｄｅ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧ，配列番号１７）とｙａｈＫ－Ｘｈｏ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＧＴＧＣＧ，配列番号１８）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりｙａｈＫ遺伝子を含むＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。
【0048】
（２）Ｃ株の作製
染色体ＤＮＡのｐｙｋＡ座位にｙａｈＫ遺伝子が挿入された菌株（Ｃ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｙａｈＫ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｐｙｋＡ－Ｆ（ＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号１９）とｄｅｌｔａ－ｐｙｋＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号２０）のプライマーセットを用いた。また、ｐｙｋＡ座位へのｙａｈＫ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡ（ＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧ，配列番号２１）のプライマーセットを用いた。
染色体ＤＮＡのｐｙｋＡ座位にｙａｈＫ遺伝子が挿入された菌株（Ｃ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｙａｈＫ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｐｙｋＡ－Ｆ（ＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号１９）とｄｅｌｔａ－ｐｙｋＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号２０）のプライマーセットを用いた。また、ｐｙｋＡ座位へのｙａｈＫ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡ（ＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧ，配列番号２１）のプライマーセットを用いた。
【0049】
４．Ｄ株（ｈｐａＢＣ挿入株）の作製
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣの作製
大腸菌ＢＬ２１の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｈｐａＢＣ－Ｆ（ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＣＧＣ，配列番号２２）とｈｐａＢＣ－Ｒ（ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣ，配列番号２３）のプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクターとＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを得た。
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣの作製
大腸菌ＢＬ２１の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｈｐａＢＣ－Ｆ（ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＣＧＣ，配列番号２２）とｈｐａＢＣ－Ｒ（ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣ，配列番号２３）のプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクターとＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを得た。
【0050】
（２）Ｄ株の作製
染色体ＤＮＡのｐｈｅＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（Ｄ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｐｈｅＡ－Ｆ（ＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号２４）とｄｅｌｔａ－ｐｈｅＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＧＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号２５）のプライマーセットを用いた。また、ｐｈｅＡ座位へのｈｐａＢＣ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡ（ＣＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴ，配列番号２６）のプライマーセットを用いた。
染色体ＤＮＡのｐｈｅＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（Ｄ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ、プライマーにｄｅｌｔａ－ｐｈｅＡ－Ｆ（ＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号２４）とｄｅｌｔａ－ｐｈｅＡ－ＦＲＴ－Ｒ（ＧＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号２５）のプライマーセットを用いた。また、ｐｈｅＡ座位へのｈｐａＢＣ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡ（ＣＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴ，配列番号２６）のプライマーセットを用いた。
【0051】
５．Ｅ株（ｌａｃＩQ1及びｈｐａＢＣ挿入株）の作製
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣの作製
ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩＱ１－Ｆ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＧ，配列番号２７）とｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩＱ－Ｒ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣ，配列番号２８）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。増幅されたＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡをそれぞれＮｃｏＩとＤｐｎＩで消化し、該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1を抽出し精製した。
つぎにｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを鋳型として、ｈｐａＢＣ－ＦとｈｐａＢＣ－Ｒのプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンのＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1ベクターとＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣを得た。
（１）プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣの作製
ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩＱ１－Ｆ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＧ，配列番号２７）とｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩＱ－Ｒ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣ，配列番号２８）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。増幅されたＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡをそれぞれＮｃｏＩとＤｐｎＩで消化し、該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。菌株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1を抽出し精製した。
つぎにｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを鋳型として、ｈｐａＢＣ－ＦとｈｐａＢＣ－Ｒのプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンのＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1ベクターとＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣを得た。
【0052】
（２）Ｅ株の作製
染色体ＤＮＡのｔｙｒＢ座位にｌａｃＩQ1とｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（Ｅ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣ、プライマーにＤｅｌｔａ－ｔｙｒＢ－Ｑ－Ｆ（ＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧ，配列番号２９）とｄｅｌｔａ－ｔｙｒＢ－ＦＲＴ－Ｒ（ＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号３０）のプライマーセットを用いた。また、ｔｙｒＢ座位へのｌａｃＩQ1とｈｐａＢＣ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢ（ＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧ，配列番号３１）のプライマーセットを用いた。
染色体ＤＮＡのｔｙｒＢ座位にｌａｃＩQ1とｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（Ｅ株）の作製は、Ａ株の作製と同様に行った。染色体に挿入するための遺伝子カセットをＰＣＲで増幅するために、鋳型ＤＮＡにプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－ｈｐａＢＣ、プライマーにＤｅｌｔａ－ｔｙｒＢ－Ｑ－Ｆ（ＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧ，配列番号２９）とｄｅｌｔａ－ｔｙｒＢ－ＦＲＴ－Ｒ（ＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ，配列番号３０）のプライマーセットを用いた。また、ｔｙｒＢ座位へのｌａｃＩQ1とｈｐａＢＣ遺伝子の挿入を確認するために、Ｋ２とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢ（ＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧ，配列番号３１）のプライマーセットを用いた。
【0053】
６．Ｐ１ファージライセートの調製
Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｄ株、又はＥ株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃でＯＤ660が０．１程度になるまで培養した。１Ｍ塩化カルシウムを５０μＬ添加し、さらに１００μＬのＰ１ファージ溶液（＞１０8ｐｆｕ／ｍＬ）を添加して３７℃で３～４時間程度培養した。１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを０．２μｍのポアサイズの滅菌フィルターでろ過することで、Ｐ１ファージライセートを得た。
Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｄ株、又はＥ株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃でＯＤ660が０．１程度になるまで培養した。１Ｍ塩化カルシウムを５０μＬ添加し、さらに１００μＬのＰ１ファージ溶液（＞１０8ｐｆｕ／ｍＬ）を添加して３７℃で３～４時間程度培養した。１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを０．２μｍのポアサイズの滅菌フィルターでろ過することで、Ｐ１ファージライセートを得た。
【0054】
７．ヒドロキシチロソール生産菌Ｆ株の作製
フェニルアラニン生産菌Ｐ株を５ｍＬのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μＬの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍＬチューブに移した。そこにＡ株のＰ１ファージライセートを２０μＬ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μＬとＬＢ液体培地を７００μＬ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｆｅａＢのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｆｅａＢ－ｌｄｈＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｔｙｒＡfbrが挿入されていることを確認した。
なお、Ｐ株は、特許文献１のＰｈｅ１３株に該当し、同文献を参照して作製できる。また、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． （２０２０） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８６：ｅ００５２５－２０にも記載されている。これらの文献は参照により援用される。
つぎにこの株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養した。培養液を氷冷した後、１ｍＬの培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。菌体を１００μＬのＴＳＳ溶液（１０％ポリエチレングリコール３３５０、５％ジメチルスルホキシド、７０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化カリウム、３０ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し、５０ｎｇ／μＬのｐＣＰ２０プラスミド溶液を１μＬ添加し、氷中で３０分間静置した。４２℃で９０秒間ヒートショックした後に氷中で２分間静置し、９００μＬのＬＢ培地を加え、１００μＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で一晩培養し、出現したコロニーをＬＢ寒天培地にストリークして、４２℃で一晩培養した。つぎに、出現したコロニーを新たなＬＢ寒天培地にストリークして、３７℃で一晩培養した。Ｄｏｗｎ－ｌｄｈＡ２（ＧＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＣ，配列番号３２）とＤｏｗｎ－ｆｅａＢのプライマーペアを用いて、ｆｅａＢ－ｌｄｈＡ座位に挿入されたＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrからカナマイシン耐性遺伝子が除去されたことを確認した。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｃ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｙａｈＫが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｐｙｋＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｙａｈＫからカナマイシン耐性遺伝子を除去した。除去の確認は、ＵＰ－ｐｙｋＡ（ＡＣＧＣＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧ，配列番号３３）とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｂ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｍｔｌＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｐｄｃが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｍｔｌＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｐｄｃからカナマイシン耐性遺伝子を除去した。除去の確認は、ＵＰ－ｍｔｌＡ（ＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧ，配列番号３４）とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｄ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｈｅＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｐｈｅＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣからカナマイシン耐性遺伝子を除去し、ヒドロキシチロソール生産菌のＦ株を得た。除去の確認は、ＵＰ－ｐｈｅＡ（ＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣ，配列番号３５）とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
フェニルアラニン生産菌Ｐ株を５ｍＬのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μＬの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍＬチューブに移した。そこにＡ株のＰ１ファージライセートを２０μＬ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μＬとＬＢ液体培地を７００μＬ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｆｅａＢのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｆｅａＢ－ｌｄｈＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｔｙｒＡfbrが挿入されていることを確認した。
なお、Ｐ株は、特許文献１のＰｈｅ１３株に該当し、同文献を参照して作製できる。また、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． （２０２０） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８６：ｅ００５２５－２０にも記載されている。これらの文献は参照により援用される。
つぎにこの株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養した。培養液を氷冷した後、１ｍＬの培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。菌体を１００μＬのＴＳＳ溶液（１０％ポリエチレングリコール３３５０、５％ジメチルスルホキシド、７０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化カリウム、３０ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し、５０ｎｇ／μＬのｐＣＰ２０プラスミド溶液を１μＬ添加し、氷中で３０分間静置した。４２℃で９０秒間ヒートショックした後に氷中で２分間静置し、９００μＬのＬＢ培地を加え、１００μＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で一晩培養し、出現したコロニーをＬＢ寒天培地にストリークして、４２℃で一晩培養した。つぎに、出現したコロニーを新たなＬＢ寒天培地にストリークして、３７℃で一晩培養した。Ｄｏｗｎ－ｌｄｈＡ２（ＧＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＣ，配列番号３２）とＤｏｗｎ－ｆｅａＢのプライマーペアを用いて、ｆｅａＢ－ｌｄｈＡ座位に挿入されたＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｔｙｒＡfbrからカナマイシン耐性遺伝子が除去されたことを確認した。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｃ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｙａｈＫが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｐｙｋＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｙａｈＫからカナマイシン耐性遺伝子を除去した。除去の確認は、ＵＰ－ｐｙｋＡ（ＡＣＧＣＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧ，配列番号３３）とＤｏｗｎ－ｐｙｋＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｂ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｍｔｌＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｐｄｃが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｍｔｌＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｐｄｃからカナマイシン耐性遺伝子を除去した。除去の確認は、ＵＰ－ｍｔｌＡ（ＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧ，配列番号３４）とＤｏｗｎ－ｍｔｌＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
つぎに、得られた株を先と同様の方法に従って、Ｄ株のＰ１ファージライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｈｅＡ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣが挿入されていることを確認した。つぎに先と同様の方法に従って、ｐＣＰ２０を用いて、ｐｈｅＡ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣからカナマイシン耐性遺伝子を除去し、ヒドロキシチロソール生産菌のＦ株を得た。除去の確認は、ＵＰ－ｐｈｅＡ（ＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣ，配列番号３５）とＤｏｗｎ－ｐｈｅＡのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
【0055】
８．ヒドロキシチロソール生産菌Ｇ株の作製
ヒドロキシチロソール生産菌Ｆ株の作製と同様の方法により、Ｆ株をＥ株のＰ１ライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｔｙｒＢ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣが挿入されていることを確認した。つぎにｐＣＰ２０を用いて、ｔｙｒＢ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣからカナマイシン耐性遺伝子を除去し、ヒドロキシチロソール生産菌のＧ株を得た。除去の確認は、ＵＰ－ｔｙｒＢ（ＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＧＴＣＧ，配列番号３６）とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
ヒドロキシチロソール生産菌Ｆ株の作製と同様の方法により、Ｆ株をＥ株のＰ１ライセートと反応させた。Ｋ２とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｔｙｒＢ座位にＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣが挿入されていることを確認した。つぎにｐＣＰ２０を用いて、ｔｙｒＢ座位に挿入したＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ｌａｃＩQ1－Ｔ７ｐ－ｈｐａＢＣからカナマイシン耐性遺伝子を除去し、ヒドロキシチロソール生産菌のＧ株を得た。除去の確認は、ＵＰ－ｔｙｒＢ（ＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＧＴＣＧ，配列番号３６）とＤｏｗｎ－ｔｙｒＢのプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲで行った。
【0056】
９．グルコース流加培養１
ＬＢ寒天培地に生育したＦ株、又はＧ株をＬＢ液体培地に植菌し、３３℃で８時間振とう培養した。１５ｍＬの培養液を１．５ＬのＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地を含む３Ｌ容のジャーファーメンターに植菌して培養を開始した。
ジャーファーメンターには、丸菱バイオエンジニアリング社製のＢｉｏｎｅｅｒシリーズＭＤＬ－８Ｃを用いた。
ＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地の組成は、１１６８ｍＬの蒸留水に、１５０ｍＬの１０×リン酸／クエン酸緩衝液、３．６ｍＬの５００ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物水溶液、１５ｍＬの１００×微量金属溶液、６３．４ｍＬの７００ｇ／Ｌグルコース溶液、３４０μＬの２０ｇ／Ｌチアミン塩酸塩溶液、１００ｍＬの１．２４ｇ／１００ｍＬフェニルアラニン溶液を加えたものである（培地中のフェニルアラニン濃度は５ｍＭ）。
蒸留水と１０×リン酸／クエン酸緩衝液をジャーファーメンターのベッセルに入れてオートクレーブ滅菌しておき、滅菌後の溶液が室温に戻った後に、別でオートクレーブ滅菌しておいた硫酸マグネシウム溶液とグルコース溶液、そしてろ過除菌しておいたチアミン塩酸塩溶液、微量金属溶液、およびフェニルアラニン溶液を加えた。
１０×リン酸／クエン酸緩衝液の組成は、１３３ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、４０ｇ／Ｌリン酸水素２アンモニウム、１７ｇ／Ｌクエン酸であり、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．３に調整した。１００×微量金属溶液の組成は、１０ｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、０．２５ｇ／Ｌ塩化コバルト６水和物、１．５ｇ／Ｌ塩化マンガン４水和物、０．１５ｇ／Ｌ塩化銅２水和物、０．３ｇ／Ｌホウ酸、０．２５ｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム２水和物、１．３ｇ／Ｌ酢酸亜鉛２水和物、０．８４ｇ／Ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物である。
ＬＢ寒天培地に生育したＦ株、又はＧ株をＬＢ液体培地に植菌し、３３℃で８時間振とう培養した。１５ｍＬの培養液を１．５ＬのＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地を含む３Ｌ容のジャーファーメンターに植菌して培養を開始した。
ジャーファーメンターには、丸菱バイオエンジニアリング社製のＢｉｏｎｅｅｒシリーズＭＤＬ－８Ｃを用いた。
ＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地の組成は、１１６８ｍＬの蒸留水に、１５０ｍＬの１０×リン酸／クエン酸緩衝液、３．６ｍＬの５００ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物水溶液、１５ｍＬの１００×微量金属溶液、６３．４ｍＬの７００ｇ／Ｌグルコース溶液、３４０μＬの２０ｇ／Ｌチアミン塩酸塩溶液、１００ｍＬの１．２４ｇ／１００ｍＬフェニルアラニン溶液を加えたものである（培地中のフェニルアラニン濃度は５ｍＭ）。
蒸留水と１０×リン酸／クエン酸緩衝液をジャーファーメンターのベッセルに入れてオートクレーブ滅菌しておき、滅菌後の溶液が室温に戻った後に、別でオートクレーブ滅菌しておいた硫酸マグネシウム溶液とグルコース溶液、そしてろ過除菌しておいたチアミン塩酸塩溶液、微量金属溶液、およびフェニルアラニン溶液を加えた。
１０×リン酸／クエン酸緩衝液の組成は、１３３ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、４０ｇ／Ｌリン酸水素２アンモニウム、１７ｇ／Ｌクエン酸であり、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．３に調整した。１００×微量金属溶液の組成は、１０ｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、０．２５ｇ／Ｌ塩化コバルト６水和物、１．５ｇ／Ｌ塩化マンガン４水和物、０．１５ｇ／Ｌ塩化銅２水和物、０．３ｇ／Ｌホウ酸、０．２５ｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム２水和物、１．３ｇ／Ｌ酢酸亜鉛２水和物、０．８４ｇ／Ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物である。
【0057】
培養は３３℃で行い、通気量は３Ｌ／分とし、溶存酸素量の値が３０％となるように回転数を自動調整した。ｐＨは６．８で制御し、ｐＨの制御には２８％のアンモニア水を用いた。培養開始後、菌株のＯＤ660の値が１７～２９に達した時にイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加し、培養温度を３０℃、ｐＨを６．５に変更した。Ｆ株の培養の際には、菌数を増加させるために、必要に応じて１．２４ｇ／１００ｍＬのフェニルアラニン溶液を３度添加した。
途中グルコースが枯渇した場合、又は枯渇しそうな場合には、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ程度になるようにフィード溶液（＋Ｐｈｅ）を適時添加した。フィード溶液（＋Ｐｈｅ）は、１３６ｍＬの蒸留水に２８０ｇのグルコースを加えてオートクレーブ滅菌し、溶液が５０℃程度に冷えた後に別滅菌しておいた５００ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物水溶液を１６ｍＬ、ろ過除菌しておいた１００×微量金属溶液を４ｍＬ、ろ過除菌しておいた２０ｇ／Ｌチアミン塩酸塩溶液を９００μＬ、ろ過除菌しておいた０．６６ｇ／５０ｍＬのフェニルアラニン溶液を５０ｍＬ加えることで調製した。
途中グルコースが枯渇した場合、又は枯渇しそうな場合には、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ程度になるようにフィード溶液（＋Ｐｈｅ）を適時添加した。フィード溶液（＋Ｐｈｅ）は、１３６ｍＬの蒸留水に２８０ｇのグルコースを加えてオートクレーブ滅菌し、溶液が５０℃程度に冷えた後に別滅菌しておいた５００ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物水溶液を１６ｍＬ、ろ過除菌しておいた１００×微量金属溶液を４ｍＬ、ろ過除菌しておいた２０ｇ／Ｌチアミン塩酸塩溶液を９００μＬ、ろ過除菌しておいた０．６６ｇ／５０ｍＬのフェニルアラニン溶液を５０ｍＬ加えることで調製した。
【0058】
培養液は適時サンプリングし、分光光度計によるＯＤ660の値の測定、ＨＰＬＣによるチロソール、ヒドロキシチロソール、フェニルアラニン及び２－フェニルエタノールの定量を行った。
ＨＰＬＣによる定量は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）にある芳香族化合物の定量方法を用い、検量線の作製にはヒドロキシチロソール、チロソール、フェニルアラニン及び２－フェニルエタノールの標品（東京化成工業株式会社製）を用いた。
ＨＰＬＣによる定量は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）にある芳香族化合物の定量方法を用い、検量線の作製にはヒドロキシチロソール、チロソール、フェニルアラニン及び２－フェニルエタノールの標品（東京化成工業株式会社製）を用いた。
【0059】
１０．グルコース流加培養２
ＬＢ寒天培地に生育したＧ株をＬＢ液体培地に植菌し、３３℃で８時間振とう培養した。１５ｍＬの培養液を１．５ＬのＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地を含む３Ｌ容のジャーファーメンターに植菌して培養を開始した。培養条件やジャーファーメンターの設定等は、グルコース流加培養１と同様にした。ただし、ＩＰＴＧの添加は培地のグルコースが枯渇した時に行った（ＯＤ660が２９．０であった）。また、ＩＰＴＧを添加した直後、オートクレーブ滅菌した１５０ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ溶液を５０ｍＬ加えて、１００分間はグルコースが枯渇した状態で培養し、その後にグルコースの流加培養を開始した。グルコースのフィードに関しては、グルコース流加培養１に準じた。なお、ＩＰＴＧを添加した際、ｐＨは６．５に変更したが、培養温度は３３℃のままとした。
培養液は適時サンプリングし、分光光度計によるＯＤ660の値の測定、ＨＰＬＣによるチロソール、ヒドロキシチロソール及びフェニルアラニンの定量を行った。
ＬＢ寒天培地に生育したＧ株をＬＢ液体培地に植菌し、３３℃で８時間振とう培養した。１５ｍＬの培養液を１．５ＬのＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地を含む３Ｌ容のジャーファーメンターに植菌して培養を開始した。培養条件やジャーファーメンターの設定等は、グルコース流加培養１と同様にした。ただし、ＩＰＴＧの添加は培地のグルコースが枯渇した時に行った（ＯＤ660が２９．０であった）。また、ＩＰＴＧを添加した直後、オートクレーブ滅菌した１５０ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ溶液を５０ｍＬ加えて、１００分間はグルコースが枯渇した状態で培養し、その後にグルコースの流加培養を開始した。グルコースのフィードに関しては、グルコース流加培養１に準じた。なお、ＩＰＴＧを添加した際、ｐＨは６．５に変更したが、培養温度は３３℃のままとした。
培養液は適時サンプリングし、分光光度計によるＯＤ660の値の測定、ＨＰＬＣによるチロソール、ヒドロキシチロソール及びフェニルアラニンの定量を行った。
【0060】
１１．結果
（１）グルコース流加培養１のＦ株
Ｆ株のグルコース流加培養１の結果を図５に示す。
・ＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地で、１６時間後にＯＤ660の値が９．２で停止していた。１６．５時間後にフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を添加したところＯＤ660の値が向上し始めた。１９時間後にもＯＤ660の値が停止したため、フェニルアラニンを添加した。２０時間後にＩＰＴＧを添加した際に、フェニルアラニンが枯渇した状態ではヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）を合成するためのタンパク質が作れなくなるため、フェニルアラニンを添加した。
・２ｇ／Ｌ以上の２－フェニルエタノール（２ＰＥ）が培地に蓄積した。
・チロソールの生産量は５．７ｇ／Ｌであった。
・ヒドロキシチロソールの生産量は２．６ｇ／Ｌであった。
・ＯＤ660は２１．６までしか向上しなかった。フェニルアラニンを添加すればもう少し向上すると思われるが、同時に副産物である２－フェニルエタノールの蓄積量も増加すると考えられる。
・Ｆ株のＯＤ660の値の低さと２ＰＥの蓄積は、試験管培養では予想できない結果であった。
・フェニルアラニン要求性（Δｐｈｅ）であるＦ株が、増殖能が悪く、２ＰＥが蓄積するのは、添加したフェニルアラニンがエールリッヒ経路（図３の点線矢印の経路）により消費され、２－フェニルエタノールに変換されるためであると考えられる。
・なお、Ｆ株の試験管培養を行うと、ＨＣＦ培地＋５ｍＭ Ｐｈｅ培地を用いた４８時間培養後に、ＯＤ660が２．６でヒドロキシチロソール濃度が１．３ｇ／Ｌとなった。試験管培養としては良好な結果であり、やや増殖は悪いものの高いＨＴＹ濃度が認められ、ジャーファーメンターの培養におけるＦ株の図５の結果は予想できなかった。
（１）グルコース流加培養１のＦ株
Ｆ株のグルコース流加培養１の結果を図５に示す。
・ＨＣＦ（＋Ｐｈｅ）培地で、１６時間後にＯＤ660の値が９．２で停止していた。１６．５時間後にフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を添加したところＯＤ660の値が向上し始めた。１９時間後にもＯＤ660の値が停止したため、フェニルアラニンを添加した。２０時間後にＩＰＴＧを添加した際に、フェニルアラニンが枯渇した状態ではヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）を合成するためのタンパク質が作れなくなるため、フェニルアラニンを添加した。
・２ｇ／Ｌ以上の２－フェニルエタノール（２ＰＥ）が培地に蓄積した。
・チロソールの生産量は５．７ｇ／Ｌであった。
・ヒドロキシチロソールの生産量は２．６ｇ／Ｌであった。
・ＯＤ660は２１．６までしか向上しなかった。フェニルアラニンを添加すればもう少し向上すると思われるが、同時に副産物である２－フェニルエタノールの蓄積量も増加すると考えられる。
・Ｆ株のＯＤ660の値の低さと２ＰＥの蓄積は、試験管培養では予想できない結果であった。
・フェニルアラニン要求性（Δｐｈｅ）であるＦ株が、増殖能が悪く、２ＰＥが蓄積するのは、添加したフェニルアラニンがエールリッヒ経路（図３の点線矢印の経路）により消費され、２－フェニルエタノールに変換されるためであると考えられる。
・なお、Ｆ株の試験管培養を行うと、ＨＣＦ培地＋５ｍＭ Ｐｈｅ培地を用いた４８時間培養後に、ＯＤ660が２．６でヒドロキシチロソール濃度が１．３ｇ／Ｌとなった。試験管培養としては良好な結果であり、やや増殖は悪いものの高いＨＴＹ濃度が認められ、ジャーファーメンターの培養におけるＦ株の図５の結果は予想できなかった。
【0061】
（２）グルコース流加培養１のＧ株
Ｇ株のグルコース流加培養１の結果を図６に示す。
・ＯＤ660は３５を超えた。培地に添加するフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は初期の分とフィード溶液に加えた分のみであったが、菌株の増殖能はＦ株よりも大幅に向上した。
・２－フェニルエタノール（２ＰＥ）の蓄積量は０．３５ｇ／Ｌであった。
・チロソールは１．５ｇ／Ｌ、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）は６．３ｇ／Ｌの生産量であった。
・Ｇ株では、Ｆ株のエールリッヒ経路が破壊された（ｔｙｒＢ遺伝子が破壊された）ことにより（図４）、フェニルアラニンの消費が抑制され、Ｇ株の増殖能がＦ株と比べて大幅に向上し、２ＰＥの蓄積量がＦ株と比べて大幅に減少し、ＨＴＹの生産性が向上した。
・なお、Ｇ株は、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されているが、チロシンを別途添加しなくても上記のような増殖能を示した。但し、Ｇ株は、Ｆ株同様、フェニルアラニン要求性（Δｐｈｅ）である。
Ｇ株のグルコース流加培養１の結果を図６に示す。
・ＯＤ660は３５を超えた。培地に添加するフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は初期の分とフィード溶液に加えた分のみであったが、菌株の増殖能はＦ株よりも大幅に向上した。
・２－フェニルエタノール（２ＰＥ）の蓄積量は０．３５ｇ／Ｌであった。
・チロソールは１．５ｇ／Ｌ、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）は６．３ｇ／Ｌの生産量であった。
・Ｇ株では、Ｆ株のエールリッヒ経路が破壊された（ｔｙｒＢ遺伝子が破壊された）ことにより（図４）、フェニルアラニンの消費が抑制され、Ｇ株の増殖能がＦ株と比べて大幅に向上し、２ＰＥの蓄積量がＦ株と比べて大幅に減少し、ＨＴＹの生産性が向上した。
・なお、Ｇ株は、ｔｙｒＢ遺伝子が破壊されているが、チロシンを別途添加しなくても上記のような増殖能を示した。但し、Ｇ株は、Ｆ株同様、フェニルアラニン要求性（Δｐｈｅ）である。
【0062】
（３）グルコース流加培養２のＧ株
Ｇ株のグルコース流加培養２の結果を図７に示す。
・ＯＤ660は３５を超えた。
・ＩＰＴＧ添加後に粉末酵母エキスＤ３－Ｈを添加してＨｐａＢＣタンパク質の合成を促すことで、チロソールのヒドロキシチロソールへの変換能を向上させることを試みた。結果、チロソールは１．０ｇ／Ｌ、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）は８．７ｇ／Ｌの生産量であり、ＨＴＹの生産性がさらに向上した。
Ｇ株のグルコース流加培養２の結果を図７に示す。
・ＯＤ660は３５を超えた。
・ＩＰＴＧ添加後に粉末酵母エキスＤ３－Ｈを添加してＨｐａＢＣタンパク質の合成を促すことで、チロソールのヒドロキシチロソールへの変換能を向上させることを試みた。結果、チロソールは１．０ｇ／Ｌ、ヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）は８．７ｇ／Ｌの生産量であり、ＨＴＹの生産性がさらに向上した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】