特許 7195283 Ｔ細胞前リンパ球性白血病の処置への使用のためのチノスタムスチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-15

(45)【発行日】2022-12-23

(54)【発明の名称】Ｔ細胞前リンパ球性白血病の処置への使用のためのチノスタムスチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4184 20060101AFI20221216BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221216BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20221216BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20221216BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4184 ZNA

A61P35/02

A61P35/04

A61P7/00

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2019568675

(86)(22)【出願日】2018-06-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-06

(86)【国際出願番号】 EP2018065664

(87)【国際公開番号】W WO2018229132

(87)【国際公開日】2018-12-20

【審査請求日】2021-06-01

(31)【優先権主張番号】1709402.0

(32)【優先日】2017-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】599108792

【氏名又は名称】ユーロ－セルティーク エス．エイ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ヨーク・メーリング

(72)【発明者】

【氏名】マルコ・ハーリング

【審査官】鈴木 理文

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１８１１５４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／４１８４

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ａ６１Ｐ ３５／０４

Ａ６１Ｐ ７／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

処置の必要がある患者のＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）の処置への使用のための、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。

【請求項2】

Ｔ－ＰＬＬが転移性である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

Ｔ－ＰＬＬが進行している、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が、患者体表面積１ｍ^２当たり０．３ｍｇから３００ｍｇ、または患者体表面積１ｍ^２当たり２０ｍｇから１５０ｍｇの用量で患者に静脈投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が、処置サイクルの第１日にまたは２１日の処置サイクルの第１日に患者に静脈投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が、６０分の輸液時間；または４５分の輸液時間；または３０分の輸液時間に渡って患者に静脈投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が、患者体表面積１ｍ^２当たり２０ｍｇから１５０ｍｇの用量で、２１日の処置サイクルの第１日に、６０分の輸液時間に渡って患者に静脈投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

患者がチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩および放射線療法によって処置される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

前記放射線療法処置が、連続５～１０日間で１から５Ｇｙ、好ましくは連続５～１０日間で２Ｇｙの放射線量で患者に与えられる、請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）を処置する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は最も生命を脅かす疾患の１つである。癌は、体の一部の細胞がコントロール不能な成長を経験する状態である。アメリカ癌協会からの最新のデータに従うと、２０１７年にはＵＳＡにおいて癌の１６９万の新たなケースがあるであろうということが見込まれる。癌は米国における死亡の二番目の最大の原因（心臓疾患のみに次ぐ二番目）であり、２０１７年には６０１，０００人超の生命を奪うであろう。事実、癌を発生する平均生涯リスクは米国人男性では４０．８％、米国人女性では３７．５％であるということが見込まれる。ゆえに、米国において、癌は重大な公衆衛生の負担をなしており、大きなコストにあたる。癌の型と癌を発生する集団の相対的割合とは遺伝的素因および食事などの多くの異なる因子に依存して変わるが、これらの数字は他所の世界中のほとんどの国において反映される。

【0003】

数十年に渡って、外科手術、化学療法、および放射線は種々の癌について確立された処置であった。通常は、患者はそれらの疾患の型および程度に依存してこれらの処置の組み合わせを受ける。だが、外科処置（すなわち患部組織の除去）が不可能であるときには、化学療法が癌患者のための最も重要なオプションである。外科手術は、場合によっては、例えば乳部、結腸、および皮膚のある種の部位に位置する腫瘍を除去することに有効であるものの、それは、背骨などの他の部分に位置する腫瘍の処置にも、血液および造血組織（例えば骨髄）の癌を包含する播種性血液癌の処置にも用いられ得ない。それらは多発性骨髄腫、リンパ腫、および白血病を包含する。放射線治療にはイオン化放射線に対する生体組織の暴露が関わり、暴露された細胞に死または損傷を引き起こす。放射線治療の副作用は急性かつ一時的であり得るが、他のものは不可逆的であり得る。化学療法には細胞複製または細胞代謝の遮断が関わる。これは最も多くの場合には乳、肺、および精巣癌の処置に用いられる。癌のこの処置の無効の主な原因の１つは癌細胞による薬剤抵抗性の発生であり、疾患の再発またはさらには死に至り得る深刻な問題である。それゆえに、より有効な癌処置が必要とされている。

【0004】

白血病は血液細胞の癌である。白血病は骨髄の造血組織で始まる。それらの癌は固形腫瘍を形成しないが、代わりに、多数の異常な白血球（白血病細胞および白血病芽球細胞）が血液中および骨髄中に増えていく。白血病の４つの主な型がある：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）。

【0005】

Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）は、血液学的悪性物のＷＨＯ分類では白血病性の末梢性Ｔ細胞新生物として認識され、成熟Ｔ細胞表現型である。最も頻繁な成熟Ｔ細胞白血病にあたるが、それでも、Ｔ－ＰＬＬは極めて稀な血液学的悪性物であり、日常の業務においては稀少に遭遇される（～０．６／百万の発生率）。Ｔ－ＰＬＬは非常に不良な予後をもまた有し、Ｔ－ＰＬＬの患者の全般的な生存中央値は従来の化学療法では大体７ヶ月である。

【0006】

典型的には、Ｔ－ＰＬＬの患者は、末梢血中の指数的に上昇していくリンパ球カウントを発症し、肝脾腫があるリンパ節腫脹、および骨髄の関与を伴う。

【0007】

特徴的に、Ｔ－ＰＬＬは急速な進行を示し、標準的な多剤化学療法にあまり応答しない。モノクローナル抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブは、再燃を原則とするが、高い寛解率を誘導することが示された唯一の（指向的な）薬剤であった。アレムツズマブは５１～９５％の範囲の全般的な奏効率を有し、完全奏効を達成した患者においては１５～１９ヶ月の生存中央値であった。

【0008】

しかしながら、アレムツズマブは２０１２年に市場から引き上げられ、現行では、Ｔ－ＰＬＬの有効なファーストライン処置はない。

【0009】

ゆえに、Ｔ－ＰＬＬの有効な化学療法処置の必要がある。

【0010】

特許文献１では、下の式Ｉの化合物が開示されている。これは、ＨＤＡＣ経路を強力に阻害するファースト・イン・クラスの二機能性アルキル化・ＨＤＡＣｉ融合分子である。

【化1】

【0011】

生物学的アッセイは、式Ｉの化合物がＨＤＡＣ酵素を強力に阻害するということを示した（９ｎＭというＨＤＡＣ１のＩＣ_５０）。式Ｉの化合物はチノスタムスチンというＩＮＮを有し、当分野においてはＥＤＯ－Ｓ１０１としてもまた公知である。これはＡＫ－ＤＡＣ（ファースト・イン・クラスのアルキル化デアセチラーゼ分子）であり、これは、前臨床研究においては、同時に癌細胞内のＤＮＡ鎖へのアクセスを改善すること、それらを破損させること、および損傷修復をブロックすることが示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】国際公開第２０１０／０８５３７７号パンフレット

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の第１の態様では、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）の処置への使用のための、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が提供される。

【0014】

驚くべきことに、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩はＴ－ＰＬＬの処置に特に有効であるということが見出され、活性データはこの化合物に対する強いインビトロおよびインビボの感受性を示した。それゆえに、Ｔ－ＰＬＬの新たな有効な処置の必要は本発明によって満たされる。

【0015】

本発明のさらなる態様では、Ｔ－ＰＬＬの処置のための医薬の製造のための、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の使用が提供される。

【0016】

本発明のさらなる態様では、その必要がある患者のＴ－ＰＬＬを処置する方法が提供され、前記患者にチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の有効量を投与することを含む。

【0017】

本発明のさらなる態様では、Ｔ－ＰＬＬを処置するための説明書と一緒になったチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩を含むキットが提供される。

【0018】

次の特徴は本発明の全ての態様に該当する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１ａは、増大していく濃度のＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１に対する暴露後の、コントロールに対して相対的なＨＨ細胞生存能のプロットを示している。図１ｂは、ＨＨ細胞におけるＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１の用量反応曲線を示している。

【図2】図２は患者Ｔ－ＰＬＬサンプルのウエスタンブロット分析を示しており、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１の、Ｔ－ＰＬＬに対応する種々のマーカーに対する効果を示している。

【図3a】図３ａは、４８ｈ処置後の懸濁培養のＴ－ＰＬＬ生細胞の相対数を示す用量反応曲線であり、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１を比較している。

【図3b】図３ｂは、増大していく濃度のＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１の初代Ｔ－ＰＬＬ細胞に対する効果を、ヒト骨髄間質細胞株ＮＫｔｅｒｔの共培養ありまたはなしで示している。

【図3c】図３ｃは、増大していく濃度のＳＡＨＡ（ボリノスタット）、ベンダムスチン、ＳＡＨＡ＋ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１のＮＫｔｅｒｔ細胞生存能に対する効果を示している。

【図3d】図３ｄでは、細胞を、ベンダムスチン、ボリノスタット、ベンダムスチンおよびボリノスタットの等モル組み合わせ、またはＥＤＯ－Ｓ１０１のどれかによって、０．１、１、５、または１０μＭの濃度のどれかで処置し、４８時間に渡ってインキュベーションし、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存能を算定した。

【図4a】図４ａはＣＤ２－ＭＴＣＰ１ｐ１３マウスの移入モデルの結果を示しており、フルダラビン、ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１を検討している。

【図4b】図４ｂはＣＤ２－ＭＴＣＰ１ｐ１３マウスの移入モデルの結果を示しており、フルダラビン、ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１を検討している。

【図4c】図４ｃはＣＤ２－ＭＴＣＰ１ｐ１３マウスの移入モデルの結果を示しており、フルダラビン、ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１を検討している。

【図5】図５はΔＪＡＫ１マウスの移入モデルの結果を示しており、フルダラビン、ベンダムスチン、およびＥＤＯ－Ｓ１０１を検討している。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本願においてはいくつもの一般的な用語および言い回しが用いられ、これらは次の通り解釈されるべきである。

【0021】

式Ｉの化合物はチノスタムスチンというＩＮＮを有し、当分野においてはＥＤＯ－Ｓ１０１としてもまた公知である。ＩＵＰＡＣ名称は７－（５－（ビス（２－クロロエチル）アミノ）－１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－Ｎ－ヒドロキシヘプタンアミドである。

【化2】

【0022】

「患者」は、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、および同類）、および非哺乳動物（例えば鳥および同類）を包含する。

【0023】

「医薬的に許容される塩」は、上で定義されている通り、医薬的に許容されかつ所望の薬理学的活性を持っている本発明の化合物の塩を意味する。かかる塩は、無機酸によってまたは有機酸によって形成される酸付加塩を包含する。医薬的に許容される塩は塩基付加塩をもまた包含し、これらは、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することが能うときに形成され得る。一般的には、例えば、かかる塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基形態を化学量論量の適宜の塩基または酸と水中もしくは有機溶媒中または２つの混合物中で反応させることによって調製される。一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水系媒体が好ましい。酸付加塩の例は、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、重硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸などの鉱酸付加塩、ならびに例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、サリチル酸、トシル酸、乳酸、ナフタレンスルホン酸（naphthalenesulphonae）、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸付加塩を包含する。アルカリ付加塩の例は、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、およびアンモニウム塩などの無機塩、ならびに例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、および塩基性アミノ酸塩などの有機アルカリ塩を包含する。

【0024】

本発明において、チノスタムスチンの医薬的に許容される塩は、好ましくは、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、重硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、グルタミン酸、グルクロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、トシル酸、マンデル酸、サリチル酸、乳酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、または酢酸塩であり得る。

【0025】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は驚くべき有効性をＴ－ＰＬＬに示すということが発見された。特に、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩はＴ－ＰＬＬの処置に有用であるということが発見された。

【0026】

Ｔ細胞前リンパ球性白血病またはＴ－ＰＬＬは白血病性の末梢性Ｔ細胞新生物であり、成熟Ｔ細胞表現型である（Ｅ．カンポ（Campo）ら，Ｂｌｏｏｄ，第１１７巻，２０１１年，ｐ．５０１９－３２）。最も頻繁な成熟Ｔ細胞白血病にあたるが、それでも、Ｔ－ＰＬＬは極めて稀な血液学的悪性物であり、日常の業務においては稀少に遭遇される（～０．６／百万の発生率）。Ｔ－ＰＬＬは非常に不良な予後をもまた有し、Ｔ－ＰＬＬの患者の全般的な生存中央値は従来の化学療法では大体７ヶ月である。

【0027】

典型的には、Ｔ－ＰＬＬの患者は、末梢血中の指数的に上昇していくリンパ球カウントを発症し、肝脾腫があるリンパ節腫脹、および骨髄の関与を伴う。

【0028】

患者に投与されるチノスタムスチンまたは医薬的に許容される塩の治療上有効な量は、いずれかの医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、処置される対象に本発明に従う治療効果を授ける量である。治療効果は客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果の指摘を与えるか、それを感ずる）であり得る。本発明に従うチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の有効量は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩が０．３ｍｇ／ｍ^２から３００ｍｇ／ｍ^２患者体表面積または２０ｍｇ／ｍ^２から１５０ｍｇ／ｍ^２患者体表面積の用量範囲で包含されるものであると思われる。

【0029】

いずれかの具体的な患者についての特定の治療上有効なドーズレベルは、障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事；使用される特定の化合物の投与の時間、投与経路、および排泄速度；処置の継続時間；使用される特定の化合物と組み合わせでまたは同時的に用いられる薬剤；ならびに医学分野において周知の同類の因子を包含する種々の因子に依存するであろう。

【0030】

「転移性癌」．癌は体内に広がる能力を有する。癌細胞は近傍の正常組織に移動することによって局所的に広がり得る。癌は近傍のリンパ節、組織、または器官まで領域的にもまた広がり得る。ゆえに、癌は体の遠隔の一部まで広がり得る。これが起こるときには、これは転移性癌（ステージＩＶ癌としてもまた公知）と呼ばれ、癌細胞が体の他の一部に広がるプロセスは転移と呼ばれる。それゆえに、転移においては、癌細胞はそれらが最初に形成されたところ（原発癌）から抜け出し、血液またはリンパ系を通って進み、体の他の一部において新たな腫瘍（転移性腫瘍）を形成する。

【0031】

転移性癌細胞は、癌が発見される場所の細胞ではなく原発癌のもののような特徴を有する。これは医師が癌が転移性であるかどうかを見分けることを可能にする。転移性癌は原発癌と同じ名称を与えられる。例えば、肺まで広がった乳癌は肺癌ではなく転移性乳癌と呼ばれる。これは肺癌としてではなくステージＩＶ乳癌として処置される。

【0032】

転移性Ｔ－ＰＬＬは、体の新たな位置に転移したＴ細胞前リンパ球性白血病を言う。癌はステージＩＶのＴ－ＰＬＬ癌として処置される。

【0033】

「進行した癌」は、治癒可能ではないが処置には応答する癌である。疾患を指向した治療は寿命を延ばすので、なお非常に重要である。末期癌では、治療は疾患の進行性が原因で生存をあまり延ばし得ず、緩和ケアが主な処置オプションである。

【0034】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の投与形態の好適な例は、限定なしに、経口、外用、非経口、舌下、直腸、膣内、眼内、および鼻腔内を包含する。非経口投与は、皮下注射、静脈、筋肉内、胸骨内注射、または輸液技術を包含する。好ましくは、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は、非経口的に、最も好ましくは静脈投与される。

【0035】

好ましくは、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は、その必要がある患者への０．３ｍｇ／ｍ^２から３００ｍｇ／ｍ^２患者体表面積の用量レベルで、その必要がある患者に静脈投与される。

【0036】

好ましくは、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は、その必要がある患者への２０ｍｇ／ｍ^２から１５０ｍｇ／ｍ^２患者体表面積の用量レベルで、その必要がある患者に静脈投与される。

【0037】

本発明の実施形態においては、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は、好ましくは、各処置サイクルの第１日に、その必要がある患者に投与され得るということが発見された。

【0038】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は、２１日の処置サイクルの第１日に投与され得る。

【0039】

本発明に従う実施形態において、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は、６０分の輸液時間；または４５分の輸液時間；または３０分の輸液時間に渡って、その必要がある患者に投与される。

【0040】

本発明に従う実施形態において、チノスタムスチンまたは医薬的に許容される塩は、２０ｍｇ／ｍ^２から１５０ｍｇ／ｍ^２患者体表面積の用量レベルで、２１日の処置サイクルの第１日に、６０分の輸液時間に渡って、その必要がある患者に投与される。

【0041】

本発明の実施形態においては、Ｔ－ＰＬＬを処置するための説明書と一緒になったチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩を含むキットが提供される。

【0042】

説明書は、処置されようとするＴ－ＰＬＬの状態；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事；使用される特定の化合物の投与の時間、投与経路、および排泄速度；処置の継続時間；使用される特定の化合物と組み合わせでまたは同時的に用いられる薬剤；ならびに医学分野において周知の同類の因子などの変数に従って、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩を投与することを指導し得る。

【0043】

本発明のさらなる実施形態において、前記処置の必要がある患者は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩によるＴ－ＰＬＬの処置と共に（それに先行して、その間に、またはその後にを包含する）、放射線療法を与えられる。本発明の実施形態において、患者は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩および放射線療法によって処置される。好ましくは、患者は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩による処置に先行して放射線療法処置を与えられる。放射線療法は、連続５～１０日間の１から５Ｇｙ、好ましくは連続５～１０日間の２Ｇｙのドーズで与えられ得る。

【0044】

本発明のさらなる実施形態において、前記処置の必要がある患者は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩によるＴ－ＰＬＬの処置に先行してまたはその後に、放射線療法を与えられる。好ましくは、患者は、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩による処置に先行して、放射線療法処置を与えられる。放射線療法は、連続５～１０日間の１から５Ｇｙ、好ましくは連続５～１０日間の２Ｇｙのドーズで与えられ得る。

【0045】

経口投与を意図されるときに、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は、固体または液体形態であり得る。ここで、半固体、半液体、懸濁液、およびゲル形態は、本明細書において固体または液体どちらかとして見なされる形態のうちに包含される。

【0046】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は、製薬分野において周知の方法論を用いて投与のために調製され得る。好適な医薬製剤および担体の例はＥ．Ｗ．マーチン（Martin）による「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記載されている。

【0047】

経口投与のための固体組成物としては、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸薬、カプセル、チューインガム、ウェハース、または同類の形態に製剤され得る。かかる固体組成物は典型的には１つ以上の不活性な希釈剤または担体を含有する。糖、ポリアルコール、可溶性ポリマー、塩、および脂質などの、担体または希釈剤として普通に用いられるいずれかの不活性な賦形剤は、本発明の組成物に用いられ得る。使用され得る糖およびポリアルコールは、限定なしに、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを包含する。ポリオキシエチレン、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、およびデキストランは、使用され得る可溶性ポリマーの例示である。有用な塩は、限定なしに、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムを包含する。使用され得る脂質は、限定なしに、脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、糖脂質、およびリン脂質を包含する。

【0048】

加えて、次の１つ以上が存在し得る：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース、またはデキストリン、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチ、および同類；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばスクロースまたはサッカリン；香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー；および着色料。

【0049】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の組成物がカプセル（例えばゼラチンカプセル）の形態であるときには、それは上の型の材料に加えて液体担体、例えばポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油を含有し得る。

【0050】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の組成物は、液体、例えばエリキシル、シロップ、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であり得る。液体は経口投与にとってまたは注射による送達にとって有用であり得る。経口投与を意図されるときには、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の組成物は、甘味料、保存料、色素／着色料、およびフレーバーエンハンサーの１つ以上を含み得る。注射による投与のためのチノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩の組成物では、界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤、および等張化剤の１つ以上もまた包含され得る。

【0051】

好ましい投与経路は非経口投与であり、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈、皮下、鼻腔内、硬膜外、鼻腔内、脳内、心室内、髄腔内、膣内、または経皮を包含するが、これらに限定されない。好ましい投与モードは医者の裁量に任され、部分的には、医学的状態の部位（例えば癌の部位）に依存するであろう。より好ましい実施形態においては、チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は静脈投与される。

【0052】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬の液体形態は、溶液、懸濁液、または他の同類の形態であり得、次の１つ以上をもまた包含し得る：無菌の希釈剤、例えば注射用の水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、不揮発性油、例えば合成モノもしくはジグリセリド（digylceride）、ポリエチレングリコール、グリセリン、または他の溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；および張度の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口の組み合わせまたは組成物は、ガラス、プラスチック、または他の材料から作られたアンプル、ディスポーザブルシリンジ、またはマルチドーズバイアル中に封入され得る。生理食塩水は好ましいアジュバントである。

【0053】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩あるいはそれを含む医薬は、いずれかの便利な経路によって、例えば輸液またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜層からの吸収によって、好ましくはボーラスによって投与され得る。

【0054】

チノスタムスチンまたはその医薬的に許容される塩を含む組成物の例は国際公開第２０１３／０４０２８６号に開示されている。

【0055】

本発明は次の限定しない実施例の考慮によってさらに理解され得る。

【実施例】

【0056】

次の実施例では、次式Ｉを有する化合物はＥＤＯ－Ｓ１０１と言われる。

【化3】

【0057】

ＥＤＯ－Ｓ１０１は国際公開第２０１０／０８５３７７号の実施例６に記載されている通り調製され得る。

【0058】

材料および方法
ＥＤＯ－Ｓ１０１およびコントロール化合物
・ＥＤＯ－Ｓ１０１はＥＤＯムンディファーマによって提供され、国際公開第２０１０／０８５３７７号の実施例６に記載されている通り合成された。
・ベンダムスチンはＥＤＯムンディファーマによって提供された。
・ボリノスタット（ＳＡＨＡ）（カタログ参照番号ＳＭＬ００６１－５ｍｇ）およびフルダラビンはシグマ・アルドリッチから購入した。

【0059】

細胞培養
１％Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ；シグマ・アルドリッチ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマ・アルドリッチ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／０．１Ｍ；ＰＡＡ）を補ったＲＰＭＩ－１６４０培地（シグマ・アルドリッチ）を、初代Ｔ－ＰＬＬ細胞、健康なＣＤ３＋Ｔ細胞、ＨＨ細胞の懸濁培養において、およびＮＫｔｅｒｔ細胞との共培養実験において、インビトロ実験作業のために用いた。全ての細胞培養実験について、細胞懸濁液は１．０×１０^６細胞／ｍＬ（初代Ｔ－ＰＬＬ細胞）および２．５×１０^５細胞／ｍＬ（ＨＨ細胞）の密度で維持した。

【0060】

細胞は、３７℃および５％ＣＯ_２において９０％湿度でＨＥＲＡｃｅｌｌインキュベータ（サーモサイエンティフィック・ヘレウス）によって培養した。ＣＤ４＋成熟Ｔ細胞白血病ＨＨ細胞はセザリー症候群の患者から元々単離された（シュタルクバウム（Starkebaum）ら，１９９１年）。ＮＫｔｅｒｔ（ヒト骨髄間質細胞［ＢＭＳＣ］）は２０１１年に理研細胞バンクから購入した。購入ままの元々の細胞ストックに由来し、かつ液体窒素による長期保存前に２から３代増殖させた細胞のみを用いた。細胞培養は第１０代（培養されること４から６週）の後に終えた。融解後には、特徴的な成長挙動の評価とフローサイトメトリーとによって細胞を確認した。細胞は標準的なＰＣＲプロトコールを用いてマイコプラズマの存在について日常的に検査した（プライマー：ｆｏｒ１：５’－ａｃａｃｃａｔｇｇｇａｇｙｔｇｇｔａａｔ－３’（配列番号１）、ｒｅｖ１：５’－ｃｔｔｃｗｔｃｇａｔｔｙｃａｇａｃｃｃａａｇｇｃａｔ－３’（配列番号２）、ｆｏｒ２：５’－ｇｔｇｓｇｇｍｔｇｇａｔｃａｃｃｔｃｃｔ－３’（配列番号３）、ｒｅｖ２：５’－ｇｃａｔｃｃａｃｃａｗａｗａｃｙｃｔｔ－３’（配列番号４））。

【0061】

健康なＣＤ３＋Ｔ細胞は健康なヒトドナーから単離された。

【0062】

共培養実験では、ヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）ＮＫｔｅｒｔ細胞（理研ＢＲＣ，日本国）を１．５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し（９６ウェルプレート）、３７℃において５％ＣＯ_２でインキュベーションした。２４時間後に、凡そ６０～８０％コンフルエンシーのＮＫｔｅｒｔ細胞を０．０２ｍｇ／ｍＬマイトマイシンＣによって３時間に渡ってＲＰＭＩ－１４６０中で処置し、それからＰＢＳ（ライフテクノロジーズ）によって２回洗浄した。別の２４時間後に、４×１０^５個のＴ－ＰＬＬ細胞をウェルあたり追加し（フィーダー細胞の支持ありおよびなし）、指摘されている化合物によって４８時間に渡って処置した。

【0063】

インビトロの薬剤処置および細胞生存能
ＥＤＯ－Ｓ１０１（ＥＤＯムンディファーマ）およびボリノスタット（ＳＡＨＡ；ＳＭＬ００６１－５ｍｇ，シグマ・アルドリッチ）をＤＭＳＯ中に溶解した。アルキル化剤ベンダムスチン（ムンディファーマ）はメタノール中に溶解した。細胞を指摘されている濃度および時間で各化合物（単数または複数）によって処置した。ドーズ決定は発表されている範囲およびＩＣ_５０／ＬＤ_５０タイトレーションに基づいた。アネキシンＶ（ＡｎｘＶ）および７ＡＡＤの二重染色を用いて、フローサイトメトリーによって細胞のアポトーシスを決定した。

【0064】

部分的には、それらの高レベルのゲノム不均一性および不安定な表現型が原因で、ヒト初代Ｔ－ＰＬＬ細胞は標準的なラボ細胞培養条件における培養操作には不適である。ＨＨ細胞は高度に化学療法抵抗性の皮膚リンパ腫に由来し、ラボ条件における培養操作にとって好適である。ＨＨ細胞はＴ－ＰＬＬ細胞と同等の表現型を見せ、ゆえに、Ｔ－ＰＬＬ細胞の代用細胞株としてインビトロ実験に頻繁に用いられる。ゆえに、ＥＤＯ－Ｓ１０１のインビトロ検証のためにはＨＨ細胞を選択した。

【0065】

ネズミモデル
ＤＢＡ２ｘＣ５７Ｂ６ＪＦ１マウスを全ての実験においてレシピエントとして用いた。ＣＤ２－ＭＴＣＰ１ｐ１３のｔｇマウスに由来する移植可能な白血病／リンパ腫細胞（グリッティ（Gritti）ら，Ｂｌｏｏｄ，１９９８年，第９２巻，ｐ．２６８－７３；血液、脾臓、および骨髄）を、バックグラウンドをマッチさせたマウスに腹腔内注射した（均一のコホートの作出を容易にするため）。ＣＤ２－ＭＴＣＰ１ｐ１３マウスからの１×１０^７個の細胞を同系レシピエントに腹腔内注射した（ｎ＝２６）。移植後の第１０日に始めて、一様な分布の白血病性血中白血球（ＷＢＣ）のマウスを選択し、４つの処置群にランダムに割り付けた。それから、各群を、基剤コントロール（ＤＭＳＯ）、フルダラビン（３４ｍｇ／ｋｇ，第１０、１５、１７、２１日）、ベンダムスチン（６０ｍｇ／ｋｇで第１０日、２０ｍｇ／ｋｇで第１５、１７、２１日）、およびＥＤＯ－Ｓ１０１（５０ｍｇ／ｋｇで第１０日、２０ｍｇ／ｋｇで第１５、１７、２１日）のどれかによって、指摘されている日に指摘されているドーズで処置した。

【0066】

ΔＪＡＫ１マウスに由来する移植可能な白血病／リンパ腫細胞（ハインリッヒ（Heinrich）ら，モレキュラー・セラピー（Molecular Therapy），２０１３年，第２１巻，ｐ．１１６０－８；ＪＡＫ１を活性化させる挿入変異導入に基づく節内性／脾臓成熟Ｔ細胞リンパ腫）を、バックグラウンドをマッチさせたマウスに静脈注射した（均一のコホートの作出を容易にするため）。２．５×１０^６個の細胞をＲａｇ１欠損マウスに静脈内移植した。それから、同等の白血球カウントのレシピエントをランダムに４つの処置群に分けた。それから、各処置群を、１８ｍｇ／ｋｇのベンダムスチン、フルダラビン、ＥＤＯ－Ｓ１０１、または基剤コントロールのどれかによって第７、１０、１３、１７、２２日に処置した（ＤＭＳＯ）。

【0067】

患者サンプル
ＷＨＯ基準に従って診断されたＴ－ＰＬＬ患者の末梢血（ＰＢ）からＴ－ＰＬＬ細胞を単離した（Ｓ．Ｈ．スワードロウ（Swerdlow）ら，Ｂｌｏｏｄ，２０１６年，第１２７巻，ｐ．２３７５－９０；ヘルリンク（Herling）ら，Ｂｌｏｏｄ，２００４年，第１０４巻，ｐ．３２８－３３５）。診断は臨床的特徴、イムノフェノタイピング（フローサイトメトリーおよび組織化学；ＴＣＬ１Ａ／ＭＴＣＰ１発現を包含する）、ＦＩＳＨ／核型、および分子的研究（ＴＣＲモノクローナル性）に基づいた。ヒト腫瘍サンプルは、ヘルシンキ宣言に従うインフォームドコンセント書面を踏襲して施設内審査委員会（ＩＲＢ）認可プロトコールによって得た。収集および使用はケルン大学病院の倫理委員会によって研究目的で認可された（＃１１－３１９）。患者コホートは、単剤アレムツズマブまたはフルダラビン－ミトキサントロン－シクロホスファミド（ＦＭＣ）プラスアレムツズマブ化学免疫療法のどれかによる均一のフロントライン処置（８７％のケース）に基づいて、ＴＰＬＬ１２０（ＮＣＴ００２７８２１３）およびＴＰＬＬ２（ＮＣＴ０１１８６６４０，未発表）前向き臨床試験の一部として選択されるか、またはドイツＣＬＬ研究グループの全国Ｔ－ＰＬＬレジストリに包含される通りであった（ＩＲＢ＃１２－１４６）。診断時に、患者は６２才の年齢中央値を有し、女性よりも１．５倍多くの男性を包含した。ＦＩＳＨ分析は標準的なプロトコールを用いた（Ｖｙｓｉｓ，アボット）。

【0068】

ウエスタンブロット分析
Ｔ－ＰＬＬ細胞をＴ－ＰＬＬ患者の末梢血（ＰＢ）から単離した。Ｔ－ＰＬＬ細胞を懸濁培養し、ベンダムスチン（１μＭ）、ボリノスタット（１μＭ）、ＥＤＯ－Ｓ１０１（１μＭ）、またはボリノスタット／ベンダムスチン（１μＭ）の等モル組み合わせのどれかによって、３６時間に渡って、指摘されている濃度で処置した。この時間後に、細胞を収穫およびリシスし、細胞ライセートをソニケーションし、遠心していずれかの細胞破片を除去し、上清を収集した。各細胞ライセート溶液（上清）の蛋白質濃度を決定し、標準的な方法を用いてウエスタンブロットを行った。

【0069】

用いた抗体は、ａｃヒストン３（シグマ・アルドリッチ）、ホスホＡＴＭセリン１９８１（シグマ・アルドリッチ）、ＡＴＭ（シグマ・アルドリッチ）、ホスホＫＡＰ－１セリン８２４（シグマ・アルドリッチ）、ＫＡＰ－１（シグマ・アルドリッチ）、ホスホｐ５３セリン１５（シグマ・アルドリッチ）、アセチルｐ５３（シグマ・アルドリッチ）、ｐ５３（シグマ・アルドリッチ）、ＰＡＲＰ（シグマ・アルドリッチ）、切断型ＰＡＲＰ（シグマ・アルドリッチ）、およびβ－アクチン（シグマ・アルドリッチ）であった。

【0070】

実施例１ － 細胞生存能
ベンダムスチンおよびボリノスタット（ＳＡＨＡ）と比較してＥＤＯ－Ｓ１０１の細胞障害性を評価するために、ＨＨ細胞をＥＤＯ－Ｓ１０１、ベンダムスチン、ボリノスタット、または等モルのベンダムスチン／ボリノスタット組み合わせのどれかによって４８時間の期間に渡って処置した。指摘されている化合物の０．１μＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭ溶液のどれかによって、細胞を処置した（図１ａ）。

【0071】

処置後に、アポトーシスマーカーアネキシンＶおよび７ＡＡＤによって細胞を染色することによって細胞死を評価し、アポトーシス細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。アネキシンＶはアポトーシス細胞を特異的に標的化および識別する。７ＡＡＤは後期アポトーシスまたは壊死細胞のマーカーである。アネキシンＶおよび７ＡＡＤ陰性細胞の数を各サンプルについてカウントした。各実験を指摘されている回数だけ繰り返し、アポトーシス陰性細胞の平均数をプロットし、無処置のコントロールサンプルに対して相対的に正規化した（図１ａ）。各処置の用量反応曲線（図１ｂ）を爾後にプロットし、各処置のＬＤ_５０（半数致死量）を決定した。

【0072】

ベンダムスチンおよびボリノスタット（vorinotstat）の等モル組み合わせ（ＬＤ_５０：１．１μＭ）ならびにＥＤＯ－Ｓ１０１（ＬＤ_５０：１．５μＭ）は、４８時間の処置後にＨＨ細胞死誘導に顕著な効力を実証した。ベンダムスチン／ボリノスタット組み合わせおよびＥＤＯ－Ｓ１０１両方は低いマイクロモーラー範囲のＬＤ_５０値を見せた。さらにその上、ＥＤＯ－Ｓ１０１およびベンダムスチン（bedamustine）／ボリノスタット組み合わせ処置両方は、単剤としてのボリノスタット（ＬＤ_５０：２．７μＭ）およびベンダムスチン（ＬＤ_５０：８．０μＭ）と比較して向上した細胞障害性を実証した。

【0073】

実施例２ － 患者Ｔ－ＰＬＬサンプルのウエスタンブロット分析
Ｔ－ＰＬＬ細胞（Ｌ１２３８^＊が変異したＡＴＭ，片アレルＡＴＭ喪失，コピー数＝１．４１）をＴ－ＰＬＬ患者の末梢血（ＰＢ）から単離し、懸濁培養し、１μＭのベンダムスチン（図２，レーン２）、ボリノスタット（レーン３）、ＥＤＯ－Ｓ１０１（レーン５）、またはボリノスタット／ベンダムスチンの等モル組み合わせ（レーン４）のどれかによって３６時間に渡って処置した。この時間後に、細胞を収穫し、リシスし、蛋白質発現レベルをウエスタンブロット分析によって決定した。

【0074】

図２は、負のコントロール（レーン１）と比較して、各処置の細胞ライセートのウエスタンブロットを示している。β－アクチンの染色を、実行した各ウエスタンブロットについてローディングコントロールとして用いた（それぞれ行ａからｋおよび行ｌからｏ）。

【0075】

ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンの脱アセチル化または他の蛋白質の脱アセチル化を促進する蛋白質を標的化する。ヒストンのアセチル化および脱アセチル化はＤＮＡ複製および修復に関係している翻訳後修飾であり、ゆえに、ヒストンのアセチル化状態は細胞複製経路に重大である。ゆえに、ＨＤＡＣ活性の阻害はＤＮＡ損傷応答の誘導につながる。これらの実験に用いられたＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタットおよび融合分子ＥＤＯ－Ｓ１０１を包含する。

【0076】

ＤＮＡアルキル化剤はＤＮＡに結合することによって正常なＤＮＡ複製経路が機能することを妨げ、ゆえに複製ストレスを引き起こす。引き起こされた損傷を修復しようとする中で、細胞はいわゆるＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）において一連の蛋白質をリクルートする。ＤＤＲにおいてリクルートされる蛋白質の多くは、損傷および複製ストレスのバイオマーカーとして用いられ得る。かかるバイオマーカーは、増大した発現レベルのγＨ２ＡＸ、リン酸化ＡＴＭ（ｐＡＴＭ）、リン酸化Ｋａｐ１（ｐＫａｐ１）、およびｐ５３の安定化を包含する。この例に用いられたＤＮＡアルキル化剤はベンダムスチンおよび融合分子ＥＤＯ－Ｓ１０１（これはＨＤＡＣ阻害剤でもまたある）を包含する。

【0077】

図２を参照すると、ベンダムスチン、ボリノスタット、またはそれらの組み合わせによる処置と比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１による患者から単離されたＴ－ＰＬＬ細胞サンプルの処置は、ＤＤＲの最も大きな誘導に至ったということが明瞭である。ＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置された細胞では、γＨ２ＡＸ（行ｌ）、ｐＡＴＭ（行ｂ）、およびｐＫＡＰ１（行ｄ）のレベルの最も大きい増大が判明した。これらの全てはＤＮＡ損傷応答に大いに関係している。ＤＤＲの誘導と整合して、Ｋａｐ１の発現レベル（行ｅ）はｐＫａｐ１のレベルと相関していた。これらの結果は、ＥＤＯ－１０１がボリノスタットおよびベンダムスチンと比較して最も強力なＤＮＡアルキル化活性を見せるということと、さらにその上、ＥＤＯ－Ｓ１０１はボリノスタットおよびベンダムスチンの組み合わせの効力を上回るということとを指摘している。

【0078】

ＤＤＲの誘導は、ｐ５３の安定化（行ｈ）ならびにｐ５３の爾後のリン酸化（行ｆ）およびアセチル化（アセチルｐ５３；行ｇ）をもまた引き起こす。図２を参照すると、ベンダムスチン、ボリノスタット、またはそれらの組み合わせと比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１による細胞の処置はアセチルｐ５３（行ｇ）およびｐ－ｐ５３（行ｆ）の最も多大な蓄積をもたらした。これらの結果は、ＥＤＯ－Ｓ１０１がＤＮＡ損傷の最も強力な誘導因子であることをさらに支持している。

【0079】

ＤＮＡ損傷が大規模でありＤＮＡが修復され得ないところでは、ｐ５３経路は細胞のアポトーシスを誘導することを担う。１つのかかる経路はＰＡＲＰの切断を特徴とする。図２に見られ得る通り、ベンダムスチン、ボリノスタット、またはそれらの組み合わせと比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１による細胞の処置は切断型ＰＡＲＰの最も多大な増大を引き起こした（ｃＰＡＲＰ；行ｊ）。これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１による処置が最も大規模で修復不可能なＤＮＡ損傷をＴ－ＰＬＬ細胞に引き起こし、細胞のアポトーシスを促進したということを指摘している。さらにその上、これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１による患者からのＴ－ＰＬＬ細胞の処置が、間質細胞によって授けられる細胞のアポトーシスからの保護効果に有効に打ち勝つということを指摘している。

【0080】

図２を参照すると、ボリノスタットまたはボリノスタットおよびベンダムスチンの組み合わせと比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１によるＴ－ＰＬＬ細胞の処置はヒストン３のアセチル化の最も大きい増大をもたらした（ａｃヒストン３）。これらのデータは、Ｔ－ＰＬＬ細胞においては、ＥＤＯ－Ｓ１０１がボリノスタット単独またはベンダムスチンとの組み合わせのボリノスタットよりも有効なＨＤＡＣ阻害剤であるということを指摘している。

【0081】

結論として、図２は、ＥＤＯ－Ｓ１０１が細胞の最も強いＤＮＡ損傷応答を誘導するということを指摘している。これは、ベンダムスチンまたはボリノスタットと比較して、ＤＮＡアルキル化剤としておよびまたＨＤＡＣ阻害剤としてのその向上した効力に帰せられ得る。さらにその上、ＥＤＯ－Ｓ１０１によって誘導されるＤＮＡ損傷および高アセチル化は、ボリノスタットおよびベンダムスチンの組み合わせによって誘導されるものを上回るということが明瞭である（例えば、ｐＡＴＭ、アセチルｐ５３、ｐＫＡＰ１、γＨ２ＡＸ、およびａｃヒストン３の比較的高値のレベルを見よ）。結果として、ボリノスタットおよびベンダムスチンの組み合わせによって処置されたものと比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１処置された細胞ではアポトーシスが強く誘導される（ｃＰＡＲＰの高値のレベルを見よ）。

【0082】

実施例３ － Ｔ－ＰＬＬにおける、ＥＤＯ－Ｓ１０１処置された細胞のアポトーシスと間質細胞によって媒介される保護に対する抵抗性との誘導
ＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置された細胞のアポトーシスをさらに評価するために、初代ヒトＴ－ＰＬＬ細胞を、ボリノスタット、ベンダムスチン、ＥＤＯ－Ｓ１０１、またはボリノスタットおよびベンダムスチンの等モル組み合わせのどれかによって、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、または１０μＭの濃度で処置し、４８時間に渡ってインキュベーションした。処置後に、アポトーシスマーカーアネキシンＶおよび７ＡＡＤによって細胞を染色することによって細胞死を評価し、アポトーシス細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。各実験を指摘されている回数だけ繰り返し、アポトーシス陰性細胞の平均数をプロットし、無処置のコントロールサンプルに対して相対的に正規化した。各処置の用量反応曲線（図３ａ）を爾後にプロットし、各処置のＬＤ_５０（半数致死量）を決定した。

【0083】

各処置のＬＣ_５０値をボリノスタット（２０．４μＭ）、ベンダムスチン（７．３μＭ）、ＥＤＯ－Ｓ１０１（１．０μＭ）、またはボリノスタットおよびベンダムスチンの等モル組み合わせ（４．４μＭ）について計算した。同等の実験条件において、ＥＤＯ－Ｓ１０１のＬＣ_５０値はＨＨ細胞（１．５μＭ）（図１ｂ）よりも初代ヒトＴ－ＰＬＬ細胞において低い（１．０μＭ）（図３ａ）ことが発見され、Ｔ－ＰＬＬ細胞に対する向上した有効性を指摘した。さらにその上、ボリノスタットおよびベンダムスチンの組み合わせ（４．４μＭ）と比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１（１．０μＭ）はＴ－ＰＬＬ細胞に対する効力の凡そ４倍の増大を見せた。

【0084】

健康なＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＥＤＯ－Ｓ１０１のＬＣ_５０は４．４μＭであることが決定され、ＥＤＯ－Ｓ１０１が実験条件においては健康なＣＤ３＋Ｔ細胞と比較してＴ－ＰＬＬ細胞に対して凡そ４倍強力であるということを指摘した。この結果は、ＥＤＯ－Ｓ１０１が健康なＴ細胞よりもＴ－ＰＬＬ細胞に対する選択性を有するということを実証した。

【0085】

ＮＫｔｅｒｔ骨髄間質細胞は変異Ｔ細胞を薬剤の効果およびアポトーシスから保護することが公知である。ＮＫｔｅｒｔ細胞によって初代ヒトＴ－ＰＬＬ細胞に授けられる保護を評価するために、ＮＫｔｅｒｔ細胞およびＴ－ＰＬＬ細胞をＥＤＯ－Ｓ１０１による処置のために共培養した。ＮＫｔｅｒｔ細胞の共培養あり（図３ｂ）およびなし（図３ｃ）の初代Ｔ－ＰＬＬ細胞を、増大していく濃度（０．１、１、または１０μＭ）のボリノスタット、ベンダムスチン、ボリノスタットおよびベンダムスチンの等モル組み合わせ、またはＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置し、４８時間に渡ってインキュベーションした。

【0086】

処置後に、アポトーシスマーカーアネキシンＶおよび７ＡＡＤによって細胞を染色することによって細胞死を評価し、アポトーシス細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。各実験を指摘されている回数だけ繰り返し、アポトーシス陰性細胞の平均数を、無処置のコントロールサンプルに対して相対的な比としてプロットした（図３ｂ、図３ｃ）。

【0087】

図３ｂを参照すると、左側のグラフのコントロールサンプルΦ（ラテン文字の大文字Ｏ（アルファベットのＯと／の組合せ）を、以下このように書く）は通常のＴ－ＰＬＬ細胞について１に正規化されている。図３ｃから見られ得る通り、Ｔ－ＰＬＬ／ＮＫｔｅｒｔ共培養細胞のコントロールサンプルΦは１よりも多大であり、単独培養と比較して、ＮＫｔｅｒｔ細胞の存在下におけるＴ－ＰＬＬ細胞の向上した生存を指摘している。

【0088】

図３ｂおよび３ｃを参照すると、Ｔ－ＰＬＬ細胞およびＴ－ＰＬＬ／ＮＫｔｅｒｔ共培養細胞両方はＥＤＯ－Ｓ１０１による処置に対して感受性であった。１０μＭのＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置されたときには、Ｔ－ＰＬＬ細胞および共培養Ｔ－ＰＬＬ／ＮＫｔｅｒｔ細胞両方において大規模なアポトーシスが観察され、９５％よりも多大な凡その細胞死カウントであった。これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１によるＴ－ＰＬＬ細胞の処置が、ＮＫｔｅｒｔ細胞によって授けられる保護に打ち勝ったということを指摘している。さらにその上、ベンダムスチン、ボリノスタット、またはベンダムスチンおよびボリノスタットの等モル組み合わせのどれかによって処置されたＴ－ＰＬＬ細胞は、共培養Ｔ－ＰＬＬ細胞のＮＫｔｅｒｔ関連の保護に打ち勝つことにおいてＥＤＯ－Ｓ１０１ほど有効ではなかった。これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１によるヒトＴ－ＰＬＬ細胞の処置が、細胞のアポトーシスの鍵の指標ｃＰＡＲＰの最も向上したレベルに至ったという観察によってさらに支持される（図２）。

【0089】

図３ｃに示されている共培養Ｔ－ＰＬＬ／ＮＫｔｅｒｔ細胞実験においては、ＥＤＯ－Ｓ１０１がＮＫｔｅｒｔ細胞の生存能に影響し得るという仮説を立てた。そのため、ＮＫｔｅｒｔ骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）フィーダー細胞単独の細胞生存能に対する効果をもまた検討した。細胞を、ベンダムスチン、ボリノスタット、ベンダムスチンおよびボリノスタットの等モル組み合わせ、またはＥＤＯ－Ｓ１０１のどれかによって、０．１、１、５、または１０μＭの濃度のどれかで処置し、４８時間に渡ってインキュベーションし、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存能を算定した（図３ｄ）。図３ｄに見られ得る通り、ＥＤＯ－Ｓ１０１、ボリノスタット、またはボリノスタットおよびベンダムスチンの等モル組み合わせによって処置されたＮＫｔｅｒｔ細胞の生存能の縮減は、検討された濃度において大まかには同等であった。ベンダムスチン処置は、ＮＫｔｅｒｔ細胞の生存能に対して著しい濃度依存的効果を有さなかった。重要なことに、ＥＤＯ－Ｓ１０１およびボリノスタットによって１０μＭで処置された細胞の生存能は同等であり、ＥＤＯ－Ｓ１０１によるＴ－ＰＬＬ／ＮＫｔｅｒｔ共培養細胞の処置によって誘導される細胞死（図３ｃ）が、ＮＫｔｅｒｔ細胞の縮減された生存能の結果ではないという確信を提供した（図３ｄ）。

【0090】

実施例４ － ＥＤＯ－Ｓ１０１による処置後の白血病性血中白血球（ＷＢＣ）カウントのインビボ分析
先に記載されている通り、ＣＤ２－ＭＴＣＰ１マウスに由来する白血病細胞をマウスに注射した（図４ａ）。

【0091】

ＣＤ２－ＭＴＣＰ１細胞は侵攻性の移植可能な亜株であり、Ｔ－ＰＬＬ様モデルとしてインビボ分析にとって好適である。腹腔内注射によるＣＤ２－ＭＴＣＰ１細胞の移植後の第１０日に、同等の白血病性血中白血球（ＷＢＣ）カウントのマウスをランダムに４つの群に分けた。移植後に、各群に、フルダラビン（３４ｍｇ／ｋｇ）、ベンダムスチン（第１０日，６０ｍｇ／ｋｇ；第１５～２１日，２０ｍｇ／ｋｇ）、またはＥＤＯ－Ｓ１０１（第１０日，５０ｍｇ／ｋｇ；第１５～２１日，２０ｍｇ／ｋｇ）のどれかを、指摘されているドーズで第１０日、第１５日、第１７日、第１９日、および第２１日に静脈投与した。血液のサンプルを定期的な間隔で取り（移植後の第９日および第１４日）、マウスは移植の２２日後に屠殺した（図４ａ）。

【0092】

比較化合物としてフルダラビンを実験のために選択した。白血病およびリンパ腫の処置のためのＦＤＡ認可された化学療法である。フルダラビンはプリン誘導体であり、ＤＮＡの複製に干渉する。これは世界保健機関の必須医薬品リストにある。

【0093】

取られた血液サンプルを白血病性血中白血球レベル（ＷＢＣ）について分析し、各群の平均細胞カウントを決定した。第１４日および第９日におけるＷＢＣカウントの比較では、コントロールサンプルおよびフルダラビンと比較して、ベンダムスチンおよびＥＤＯ－Ｓ１０１がＷＢＣ細胞の増大を有意に遅らせるということが判明した（図４ｂ）。これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１およびベンダムスチンがレシピエントマウスの疾患進行の開始を遅らせているということを指摘した。

【0094】

移植後の第２２日におけるマウスの屠殺後に、各マウスの死後脾臓重量を決定した（図４ｃ）。フルダラビンまたはコントロールによって処置されたコホートと比較して、ベンダムスチンまたはＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置されたマウスコホートの縮減された平均脾臓重量は、図４ｂにおいて先に論じられた発見を裏付けている。ゆえに、フルダラビン処置またはコントロールコホートと比較して、ＥＤＯ－Ｓ１０１または単剤ベンダムスチンによって処置されたコホートでは、腫瘍所見はより進行していないことが示された。

【0095】

実施例５ － ＥＤＯ－Ｓ１０１による処置後の白血病性血中白血球（ＷＢＣ）カウントのインビボ分析
先に記載されている通りΔＪＡＫ１マウスに由来する白血病／リンパ腫細胞をマウスに注射した（図５）。ΔＪＡＫ１は成熟Ｔ細胞リンパ腫のモデルである。移植後に、マウスをランダムに４つの群に分けた。各群に、フルダラビン（１８ｍｇ／ｋｇ）、ベンダムスチン（１８ｍｇ／ｋｇ）、またはＥＤＯ－Ｓ１０１（１８ｍｇ／ｋｇ）のどれかを、指摘されているドーズで第７日、第１０日、第１３日、第１７日、および第２２日に静脈投与した。各コホートのパーセンテージ生存を時間の関数としてプロットした（図５）。ＥＤＯ－Ｓ１０１によって処置されたマウスの全般的な生存（平均生存２６日）は、コントロールマウス（平均生存１９日）、ベンダムスチン（平均生存１８日）、またはフルダラビン（平均生存１９日）と比較して有意に延ばされることが発見された。これらのデータは、ＥＤＯ－Ｓ１０１による処置がＴ細胞リンパ腫のマウスの全般的な生存に対して正の効果を有し、ベンダムスチンまたはフルダラビンと比較して８日ほども平均生存時間を増大させるということを指摘している。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5】

【配列表】

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