(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-16
(45)【発行日】2022-12-26
(54)【発明の名称】歯周組織用製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20221219BHJP
A61K 35/32 20150101ALI20221219BHJP
A61K 35/36 20150101ALI20221219BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20221219BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20221219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61K35/32
A61K35/36
A61K31/728
A61P1/02
A61P43/00 121
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2022082090
(22)【出願日】2022-05-19
(62)【分割の表示】P 2021008491の分割
【原出願日】2021-01-22
(65)【公開番号】P2022103370
(43)【公開日】2022-07-07
【審査請求日】2022-05-26
(31)【優先権主張番号】P 2020009021
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】519320642
【氏名又は名称】医療法人社団サカイクリニック６２
(74)【代理人】
【識別番号】100170874
【弁理士】
【氏名又は名称】塩川 和哉
(74)【代理人】
【識別番号】100160543
【弁理士】
【氏名又は名称】河野上 正晴
(72)【発明者】
【氏名】坂井 万里
【審査官】小川 知宏
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１１８７９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２１６４３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】アイエスデンタルクリニックWebページ（wayback machine archive），2018年，https://web.archive.org/web/20180902070752/http://is-dental.jp/dental/periodontaldisease
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００
Ａ６１Ｋ ３１／７２８
Ａ６１Ｐ １／００ － ４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
凍結乾燥されて得られた培養上清の粉末及び架橋ヒアルロン酸ゲルを混合することを含む、歯周組織用注射製剤の製造方法であって、前記培養上清が、脂肪組織由来間葉系間質細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞の培養上清であり、
前記培養上清が、
第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
を含む方法によって得られ、
第１培地が、ＦＢＳ含有ＤＭＥ培地であり、
第２培地が、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳであり、
第２培養工程は、ＣＯ２培養を行わない、歯周組織用注射製剤の製造方法。
【請求項2】
第１培養工程において、コンフルエントとなるまで培養して得られる、請求項１に記載の歯周組織用注射製剤の製造方法。
【請求項3】
第２培地が、アミノ酸を実質的に含まない、請求項１又は２に記載の歯周組織用注射製剤の製造方法。
【請求項4】
第１培地が、ＦＢＳ含有ＤＭＥ培地である、請求項１～３のいずれか一項に記載の歯周組織用注射製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、培養上清を含む歯周組織用製剤及びその製剤を用いた手術方法に関する。
【背景技術】
【0002】
歯周組織は、歯周病によって冒される。歯周病が進行すると、歯と歯肉との間に、いわゆる歯周ポケットが発生し、歯肉が退縮してくる。さらに歯周病が進行すると、歯槽骨が溶けて歯が動くようになり、最後は抜歯の必要性が生じる。また、歯周組織は、歯の矯正によっても冒される場合がある。
【0003】
歯周病等によって冒された歯周組織の再生については、従来から様々な方法が検討されてきた。例えば、骨移植術、ＧＴＲ法、エナメル基質蛋白による歯周組織再生療法が、従来から行われてきた。
【0004】
近年、リグロス（商標）という歯周組織再生剤が販売されている。リグロスは、線維芽細胞増殖因子と呼ばれるたんぱくを主成分として含み、骨、筋肉、脂肪細胞等の増殖及び分化を促進することができるとされている。また、これは強力な血管新生作用があるため、歯周組織を再生させることができるとされている。しかしながら、その処置にあたっては、歯周外科手術が必要であり、また非常に高価である。
【0005】
歯肉の再生にあたっては、ヒアルロン酸の注入も行われている。ヒアルロン酸の注入は、適切な方法で行われれば歯肉の再生に効果的であるものの、患者の体調及び／又は体質によっては、効果が現れにくい場合もあり、また歯槽骨の再生には効果がなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、簡単な操作によって処置することができ、安全性及び歯周組織の再生性能が高い新規な歯周組織用製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、以下の態様を有する本発明により、上記課題を解決できることを見出した。
《態様１》
培養上清を含む、歯周組織用製剤。
《態様２》
前記培養上清が、
第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
を含む方法によって得られる、態様１に記載の歯周組織用製剤。
《態様３》
第１培養工程において、コンフルエントとなるまで培養して得られる、態様２に記載の歯周組織用製剤。
《態様４》
第２培地が、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む、態様２又は３に記載の歯周組織用製剤。
《態様５》
前記緩衝剤が、グッド緩衝剤から選択される、態様４に記載の歯周組織用製剤。
《態様６》
前記グッド緩衝剤が、ＨＥＰＥＳである、態様５に記載の歯周組織用製剤。
《態様７》
第２培地は、注射用の輸液又は点滴用の輸液である、態様２～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様８》
前記培養上清が、脂肪組織由来間葉系間質細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞の培養上清である、態様１～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様９》
ヒアルロン酸をさらに含む、態様１～８のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様１０》
前記ヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸ゲルである、態様１～９のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様１１》
培養上清を含む歯周組織用製剤の製造方法であって、
第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
第２培養工程の後に、第２培地を含む前記培養上清を得る工程と
を含む、方法。
《態様１》
培養上清を含む、歯周組織用製剤。
《態様２》
前記培養上清が、
第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
を含む方法によって得られる、態様１に記載の歯周組織用製剤。
《態様３》
第１培養工程において、コンフルエントとなるまで培養して得られる、態様２に記載の歯周組織用製剤。
《態様４》
第２培地が、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む、態様２又は３に記載の歯周組織用製剤。
《態様５》
前記緩衝剤が、グッド緩衝剤から選択される、態様４に記載の歯周組織用製剤。
《態様６》
前記グッド緩衝剤が、ＨＥＰＥＳである、態様５に記載の歯周組織用製剤。
《態様７》
第２培地は、注射用の輸液又は点滴用の輸液である、態様２～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様８》
前記培養上清が、脂肪組織由来間葉系間質細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞の培養上清である、態様１～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様９》
ヒアルロン酸をさらに含む、態様１～８のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様１０》
前記ヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸ゲルである、態様１～９のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様１１》
培養上清を含む歯周組織用製剤の製造方法であって、
第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
第２培養工程の後に、第２培地を含む前記培養上清を得る工程と
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図4a】図４ａは、重度歯周病によって歯周組織が破壊されている患者の歯周組織の状態を示している。図４ａ左図の矢印は、歯槽骨が欠損した結果生じた陥没を示す。図４ａ右図の矢印は、菲薄化した犬歯の根尖部の骨を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の歯周組織用製剤は、培養上清を有効成分として含む。歯周組織用製剤とは、一例では歯周組織の再生用製剤を意味する。歯周組織は、歯冠部分および歯根部分を含む。本発明の歯周組織用製剤は、特に歯冠部分の歯肉および歯根部分の歯槽骨の再生用製剤に関する。一例では、歯周組織用製剤は、歯周病又は歯槽膿漏の治療用製剤であってもよい。本明細書において、培養上清とは、細胞を培養して得られる培養液であり、通常は細胞を実質的に含まない。また、本明細書において、ヒアルロン酸とは、種々の鎖長及び荷電状態の、並びに架橋を含む種々の化学的修飾を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はヒアルロナンの全ての改変体、及びそれらの改変体の組み合わせを包含する。さらに、本明細書において、歯周組織とは、歯及びその周囲組織を含み、例えばエナメル質、象牙質、歯髄、歯肉等の歯冠部分、及びセメント質、歯槽骨、血管、神経等の歯根部分を含む。
【0010】
本発明者は、歯周病等によって冒された歯周組織が、培養上清を含む製剤によって、非常に効果的かつ容易に再生できることを見出した。すなわち、従来の再生方法では、歯周外科手術が必要であったり、処置者によって効果に差が出たり、処置者によって安全性が低くなったりするという課題があったのに対して、本発明の製剤によれば、再生をしたい歯周組織の周囲に注射をすればよいだけであり、またその再生の効果も非常に高いことが分かった。特に、歯槽骨に対しては、従来の再生方法では実質的に再生がされていなかったのに対して、本発明の製剤によれば、歯槽骨に対しても再生が可能になることが分かった。
【0011】
〈培養上清〉
上述のように、培養上清とは、細胞を培養して得られる培養液であり、通常は細胞を実質的に含まない。培養上清を得るために使用される細胞又は幹細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であってもよく、昆虫由来であってもよく、鳥類由来であってもよいし、植物由来であってもよい。免疫反応を生じさせない観点から、細胞は、ヒト由来の細胞が好ましく、特に間葉系又は上皮系の細胞又は幹細胞が用いられる。好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞であり、特に好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞又は臍帯血幹細胞である。
上述のように、培養上清とは、細胞を培養して得られる培養液であり、通常は細胞を実質的に含まない。培養上清を得るために使用される細胞又は幹細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であってもよく、昆虫由来であってもよく、鳥類由来であってもよいし、植物由来であってもよい。免疫反応を生じさせない観点から、細胞は、ヒト由来の細胞が好ましく、特に間葉系又は上皮系の細胞又は幹細胞が用いられる。好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞であり、特に好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞又は臍帯血幹細胞である。
【0012】
培養方法は、対象となる細胞に応じて適宜調整すればよい。例えば、哺乳動物由来の細胞を用いる場合、培養は、哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、一般的には３７℃、５％ＣＯ２で数日間培養し、必要に応じて培地を交換すればよい。
【0013】
培地としては、特に限定されないが、例えば１０～１５%の自己血清又は牛胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補充したα-ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を挙げることができる。ヒト又は動物由来の成分を含まない培地を用いてもよい。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アドレノメデユリン等の成長因子を培地に加えてもよい。また、培地として、第２培地として以下に挙げたものを使用することもできる。
【0014】
培養上清は、第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、細胞を培養する第２培養工程と、第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程とを含む方法によって得ることができる。
【0015】
第１培養工程は、公知の培養方法を適宜採用することができる。第１培養工程は、細胞を増殖させることを主な目的としており、サブコンフルエント又はコンフルエントとなるまで培養することができる。
【0016】
第１培地としては、使用する細胞を増殖させることができる培地であれば、任意の培地を使用することができる。一例として、１０～１５%の自己血清又は牛胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補充したα-ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を挙げることができる。ヒト又は動物由来の成分を含まない培地を用いてもよい。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アドレノメデユリン等の成長因子を培地に加えてもよい。
【0017】
第１培養工程の後、細胞を回収して、適宜洗浄を行うことができる。その後、回収した細胞を、第１培地と異なる第２培地において培養する。
【0018】
第２培養工程は、ＣＯ２培養器を用いず、ＣＯ２培養を行わないものが好ましい。つまり、培養容器を用い、ＣＯ２インキュベートせずに、３４～４０℃の範囲で、好ましくは３７℃前後で培養を行うことが好ましい。第２培養工程は、５時間以上５日以下（１０時間以上２日以下、又は５時間以上３日以下）細胞を培養する工程であることが好ましい。培養は、培養される細胞に応じて接着培養でも浮遊培養でもよいし、細胞を取り除く場合は、細胞が取り除かれやすい方法で培養すればよい。
【0019】
第２培地は、第１培地として用いることができるとして挙げた培地及び他の周知の培地を用いることができ、さらにカルシウムイオン源及び／又は緩衝剤を添加して調製されていてもよい。免疫反応を生じさせない観点から、無血清培地を用いることが好ましい。第２培地は、カルシウムイオン及び緩衝剤を含み、さらにプロスタグランジンを随意に含む電解質溶液であることが好ましい。プロスタグランジンをさらに含む場合には、特に有利な効果が得られることが分かった。カルシウムイオン源としては、水溶性かつ生体許容性のカルシウム塩であれば特に限定されないが、例えば塩化カルシウムを挙げることができる。
【0020】
また、第２培地は、注射用の輸液又は点滴用の輸液を含んでいてもよい。第２培地が注射用の輸液又は点滴用の輸液を含む場合、注射用の輸液又は点滴用の輸液として製造販売されているものを適宜用いることができる。注射用の輸液の例は、糖液剤、細胞外液補充液（生理食塩液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、細胞外液補充液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）、低張性電解質液、アミノ酸製剤（高濃度アミノ酸液、腎不全用アミノ酸液、肝不全用アミノ酸液、小児用アミノ酸液）、ＰＰＮ（末梢静脈栄養輸液）、ＴＰＮ（高カロリー輸液）、脂肪乳剤及び代用血漿増量剤である。これらの中では、細胞外液補充液（生理食塩液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、細胞外液補充液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）、及び等張性電解質液が好ましい。具体的な輸液は、パレプラス（登録商標）である。これらの輸液に、上述のカルシウム源、緩衝剤、プロスタグランジン等を添加して用いてもよい。
【0021】
第２培地にカルシウムイオンが含まれる場合、カルシウムイオンは、０．０４５ｍＭ以上１．８０２ｍＭ以下が好ましく、０．０７４ｍＭ以上１．５０５ｍＭ以下でもよいし、０．０４５ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、０．１８０ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、１ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、１．３ｍＭ以上１．８ｍＭ以下でもよいし、１．２ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし、１ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし、０．０４５ｍＭ以上１．３５２ｍＭ以下でもよいし、０．１８０ｍＭ以上０．９０１ｍＭ以下でもよいし、２０ｍｇ／ｌ以上１００ｍｇ／ｌ以下でもよい。第２培地に含まれる塩類の例は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＣａＣｌ２であり、１ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよいし、４ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよく、６ｇ／Ｌ以上１１ｇ／Ｌ以下含まれてもよい。
【0022】
緩衝剤としては、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３等の無機系緩衝剤を挙げることができ、またグッド緩衝剤（Ｇｏｏｄ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｓ）等の有機系緩衝剤を用いることもできる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ、ビストリスメタン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミン塩酸、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、Ｔｒｉｓ、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ等を挙げることができ、この中でも特にＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）を用いることが好ましい。これらは、他の塩（例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ピルビン酸、クエン酸、並びにその塩類など）と併せて用いられてもよい。これらの緩衝剤の含有量は、調節するｐＨの範囲等に応じて調整すればよく、例えば１ｍｇ／ｌ以上５ｇ／ｌ以下であってもよく、２ｍｇ／ｌ以上５００ｍｇ／ｌ以下であってもよく、１０ｍｇ／ｌ以上３００ｍｇ／ｌ以下であってもよい。
【0023】
第２培地の酸性度は、例えばｐＨ５．５以上ｐＨ９以下であり、ｐＨ７．２以上ｐＨ７．８以下でもよい。
【0024】
第２培地は、糖質が少ないものが好ましく、糖質を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、糖質（例えばグルコース）の含有量が、１ｇ／ｌ以下であることが好ましく、０．８ｇ／ｌ以下でもよく、０．５ｇ／ｌ以下でもよいし、０．１ｇ／Ｌ以上１．５ｇ／Ｌでもよく、０．１ｇ／Ｌ以上１．２ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．５ｇ／Ｌ以上１．２ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．８ｇ／Ｌ以上１．１ｇ／Ｌ以下でもよい。
【0025】
第２培地は、アミノ酸が少ないか、アミノ酸を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、アミノ酸含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく、０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。
【0026】
第２培地は、ビタミン類が少ないか、ビタミン類を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、ビタミン類の含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく、０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。第２培地は、抗生物質（例えばペニシリン）、成長因子やサイトカインを含まないことが好ましい。
【0027】
第２培地は、鉄、銅、鉛といった重金属元素や、微量元素を少ししか含まないか、全く含まないことが好ましい。このような元素が少ないので、金属含有たんぱく質の合成を抑え、増殖因子の合成を促すことができる。第２培地は、ポリアミン（例えば、Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ２ＨＣｌ）といった発がん性物質を含まないことが好ましい。第２培地は、プリン塩基を含まないことが好ましい．第２培地がプリン塩基を含まない場合、核酸のサルベージ経路を活性化できる。
【0028】
第２培地は、ビタミンやアミノ酸を含まないか、わずかしか含まないため、オートファジーを促進して増殖因子の合成を増やすことができる。第２培地は、一般的な培養環境において、培養中の環境を一定に保つことができる（例えば、酸性度の変動を抑えることができ、培養中、緩衝能を持つので、ＣＯ２培養などを行う必要がなくなる。）。
【0029】
第２培地は、通常の培地に比べ水分量が多いことが好ましい。例えば第２培地を１００重量％とした場合、水分量は９５重量％以上９９．９９重量％以下が好ましく、９６重量％以上９９．９重量％以下でもよく、９７重量％以上９９．９重量％以下でもよい。培地の水分量が多いことで浸透圧を下げることができる。すると、例えば、細胞を接着培養した場合、通常トリプシンといった動物由来の消化酵素を用いて培養容器から細胞をはがすものの、第２培地を用いると、消化酵素を用いる必要がなくなる。すると、第２培地を含む剤を患者に投与した際に、動物由来成分による感染等の副作用を軽減することができる。
【0030】
第２培地は、糖質（例えば、グルコース）、塩類（カルシウムイオン源を含み、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ２のみからなるか主な塩類としてこれらを含むもの）、及び緩衝剤（例えばＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、及びグッド緩衝剤（特にＨＥＰＥＳ）のみからなるか主な緩衝剤としてこれらを含むもの）と残部が溶媒（例えば水）のみからなるものであってもよい。このような組成であれば、後述する実施例でその有効性が確認された通り、特定の遺伝子やタンパク質を高発現するとともに、生体親和性に優れた培地かつ輸液として機能する。
【0031】
第２培地は、アミノ酸含有量が少ないことで、合成分泌された増殖因子との相互作用を（主に酸化・還元）及び重合反応が回避され、成分の変質を防げるとともに、混入するアミノ酸による吸湿と変質を防げることができる。また、第２培地は、アミノ酸含有量が少ないことで、化粧品原料とした時に細菌の繁殖リスクが軽減されるため、防腐剤・酸化防止剤を添加しなくても、製品の安定性が担保できる。第２培地が、アミノ酸を含まない場合、患部に使うための脱アミノ酸工程が不要となり、患部に常在する細菌などの増殖のための栄養とはならない。このことは、創傷面に利用した際に、悪臭の原因とならないことを意味する。また、製剤化した後に、第２培地を含む剤を注射等によって投与した際の味覚障害、体臭の原因にならないので、医薬として用いる際に利便性が高い。第２培地が、アミノ酸を含まない場合、脱塩が行いやすい。そのため、細胞を大量培養した際に簡便に凍結乾燥化による高濃度増殖因子乾燥物を得ることができる。通常の培地の場合、どのような場合でも４８～７２時間で培地を交換しなければならない。第２培地がアミノ酸含有培地ではない場合、培養細胞の代謝活性を抑えることで、４℃冷所に保管しておけば長期間（例えば７日間程度）生存環境を維持でき、その後に培地に交換することで細胞を再び増殖できる。第２培地は、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む培地であることが好ましく、好ましくはシンプルな組成を有するものであるため、汎用性が高く全ての動物細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞・幹細胞含む）及び植物細胞（特に植物のカルス培養や、植物幹細胞の維持）に適用できる。
【0032】
第２培地を含む培養上清を得る工程は、第２培養工程の後に行われる。この工程は、さらにトレハロースを添加する工程を含むことが好ましい。培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含むことが好ましい。培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の第２培地（培養上清を含む）を６０重量％以上１００重量％以下含んでもよいし、７０重量％以上９９重量％以下、７０重量％以上９０重量％以下、８０重量％以上９９重量％以下、９０重量％以上１００重量％以下、９０重量％以上９５重量％以下含むことが好ましい。通常、幹細胞などの培養上清は、通常、遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分を用いる。この明細書に記載される方法は、第２培地を積極的に製剤に含めることができるので、単に、第２培養工程後の培地をろ過したものを用いてもよい。
【0033】
製剤は、上記のようにして得られた培養上清を、凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物、エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物、限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物、又はフィルターを用いて培養上澄みを固液分離して得られる処理物、もしくは、上述のような処理をする前の培養上清の原液であってもよい。また、例えば、細胞を培養した上澄みを、遠心分離（例えば、１、０００×ｇ、１０分）した後、硫安（例えば、６５％飽和硫安）で分画し、沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い、シリンジフィルター（例えば、０．２μｍ）で濾過し、無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を、そのまま用いても、また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて、取り扱いやすい液量、例えば０．２ｍｌ又は０．５ｍｌ等となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに、感染性病原体リスクの対策として、培養上清をウイルスクリアランスフィルターやγ線照射により処理してもよい。
【0034】
上記の通り、第２培養工程及び培養上清を得る工程の後に、回収した培養上清を凍結する凍結工程を含んでもよい。培養上清を凍結するためには、例えば、培養上清を－２００℃以上０℃以下にすればよく、－１００℃以上－５℃以下にしてもよい。なお、培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の細胞を破砕し、遠心分離後、フィルターを用いてろ過したものであっても、さらにろ過物を凍結・乾燥したものであってもよい。
【0035】
〈ヒアルロン酸〉
本発明者らは、培養上清に加えて、さらにヒアルロン酸を含む製剤が顕著な効果をもたらすことを見出した。培養上清のみの製剤では、歯槽骨に対しても効果はあるものの、その効果を実感できるようになるのに時間がかかっており、また培養上清による製剤は、高額となる傾向があるため、効果が現れる前に治療を止めてしまう患者もいたが、本発明の製剤においてヒアルロン酸を併用することによって、効果を早期に実感させることができた。効果が早期に実感できるという点は、治療を継続する上で非常に重要であり、ヒアルロン酸をさらに含む製剤は、患者にとって非常に満足度の高い製剤となった。
本発明者らは、培養上清に加えて、さらにヒアルロン酸を含む製剤が顕著な効果をもたらすことを見出した。培養上清のみの製剤では、歯槽骨に対しても効果はあるものの、その効果を実感できるようになるのに時間がかかっており、また培養上清による製剤は、高額となる傾向があるため、効果が現れる前に治療を止めてしまう患者もいたが、本発明の製剤においてヒアルロン酸を併用することによって、効果を早期に実感させることができた。効果が早期に実感できるという点は、治療を継続する上で非常に重要であり、ヒアルロン酸をさらに含む製剤は、患者にとって非常に満足度の高い製剤となった。
【0036】
理論に拘束されないが、ヒアルロン酸を用いると、ヒアルロン酸注入部分が膨潤することで、歯茎の菲薄化により生じるブラックトライアングルを解消することができる。ヒアルロン酸は、時間をかけて吸収されてしまうが、吸収後に元の位置に戻ってしまうことはない。これは、ヒアルロン酸の投与により、歯肉を膨潤させることで歯肉の細胞に伸展刺激を付与し、線維芽細胞の活性、例えばコラーゲン合成能や増殖能を高めて歯肉の再生を促すことができるからと考えられているが、かかる効果が発揮されるためには継続的な投与を必要とする。一方で、培養上清は、即効性はないものの、歯肉および歯槽骨に作用し、歯周組織の再生を促すことができ、ヒアルロン酸によって伸展された組織周辺において、培養上清の組織再生能力が効果的に発揮され、相乗的な効果が得られたと考えられる。
【0037】
用語「ヒアルロン酸」は、グルクロン酸とＮ‐アセチルグルコサミンから主に構成されるグリコサミノグリカンの一種である。上述のように、「ヒアルロン酸」は、種々の鎖長及び荷電状態の、並びに架橋を含む種々の化学的修飾を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はヒアルロナンの全ての改変体、及びそれらの改変体の組み合わせを包含する。即ち、この用語はまた、種々の対イオンを有するヒアルロン酸の種々のヒアルロン酸塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを包含する。また、ヒアルロン酸の種々の修飾は、酸化（例えば、－ＣＨ２ＯＨの－ＣＨＯ及び／又は－ＣＯＯＨへの酸化）；近接のヒドロキシル基の過ヨウ素酸塩酸化、場合により続く還元（例えば、－ＣＨＯの－ＣＨ２ＯＨへの還元）、又はアミンによってカップリングさせ、イミンを形成し、第２級アミンへの還元；硫酸化；脱アミド酸、場合により続く新しい酸を用いた脱アミノ化又はアミド形成；エステル化；架橋；種々の化合物による置換、例えば架橋剤又はカルボジイミド支援カップリングを用いる；ヒアルロン酸への、タンパク質、ペプチド及び活性薬剤成分などの異なる分子のカップリングを伴うもの等の用語によって包含される。修飾の他の例は、イソウレア、ヒドラジド、ブロモヤン、モノエポキシド及びモノスルホンカップリングである。
【0038】
ヒアルロン酸は、動物及び非動物源の種々の供給源から得ることができる。非動物源の供給源は酵母を含み、好ましくは細菌を含む。単一のヒアルロン酸分子の分子量は、典型的には、０．１～１０ＭＤａの範囲であるが、他の分子量も可能である。
【0039】
ある種の実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、１～１００ｍｇ／ｍｌの範囲にある。いくつかの実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、２～５０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。特定の実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、５～３０ｍｇ／ｍｌの範囲、又は１０～３０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。ある種の実施形態において、ヒアルロン酸は架橋される。架橋されたヒアルロン酸は、共有架橋、ヒアルロン酸鎖の物理的巻き込み、及び静電相互作用、水素結合及びファン・デル・ワールス力などの種々の相互作用によって、一緒に保持されるヒアルロン酸分子の連続的なネットワークを作製するヒアルロン酸鎖間の架橋を含む。
【0040】
ヒアルロン酸の架橋は、化学的架橋剤を用いた修飾によって達成されてもよい。化学的架橋剤は、例えば、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択されてもよい。実施形態によれば、化学的架橋剤は、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２－エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）及びジエポキシオクタンからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、化学的架橋剤は１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【0041】
架橋されたヒアルロン酸製造物は、好ましくは生体適合性である。これは全くないか、またはごく軽度の免疫応答が処置された個体に生じることを暗に意味する。即ち、全くないか、ごく軽度の望ましくない局所又は全身の効果が処置された個体で発生する。
【0042】
本発明に係る架橋されたヒアルロン酸製造物は、ゲル又はヒドロゲルであってもよい。すなわち、それは、水不溶性とみなされ得るが、液体、典型的には水性液体に供された場合、ヒアルロン酸分子の架橋系を実質的に希釈することができる。
【0043】
ゲルは、重量でほとんど液体が含まれており、例えば９０～９９．９％の水を含むことができ、液体中の３次元の架橋ヒアルロン酸ネットワークに起因して、固体のように挙動する。その重要な液体含量により、ゲルは、構造的にフレキシブルであり、組織工学における足場として、組織増強のために非常に有用にする自然な組織と類似している。
【0044】
前述のように、架橋ヒアルロン酸ゲルを形成するヒアルロン酸の架橋は、化学架橋剤、例えばＢＤＤＥ（１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテルなど）による修飾によって達成することができる。ヒアルロン酸濃度及び架橋の程度は、機械的特性、例えば、ゲルの弾性係数Ｇ’及び安定性に影響を与える。
【0045】
架橋ヒアルロン酸ゲルは、しばしば、「修飾度」という点で特徴付けられる。ヒアルロン酸ゲルの修飾度は、一般的に０．１～１５モル％の間の範囲である。ヒアルロン酸ゲルの修飾度は、有利には、より架橋されたヒアルロン酸ゲルと比較して２モル％以下の修飾度、例えば１．５モル％以下、例えば１．２５モル％以下、例えば０．１～２モル％以下の範囲、例えば０．２～１．５モル％の範囲、例えば０．３モル～１．２５モル％の範囲である。修飾度（モル％）は、ＨＡの二糖単位を繰り返す総モル量に対して、ＨＡに結合する架橋剤（単数又は複数）の量、即ち、結合した架橋剤（単数又は複数）のモル量を示す。修飾度は、ＨＡがどの程度、化学架橋剤によって化学的に修飾されたかを反映している。修飾度を決定するための架橋技術及び適切な分析技術に関する反応条件はすべて、これら及び他の関連する因子を容易に調整することができる当業者に周知であり、それにより、適切な条件を与え、０．１～２％の範囲の修飾度を得て、修飾度に関する得られた製造物特徴を変更することができる。ＢＤＤＥ（１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル）架橋されたヒアルロン酸ゲルは、例えば、国際公開ＷＯ９７／０４０１２Ａの実施例１及び２に記載された方法に従って調製されてもよい。
【0046】
好ましい実施形態では、ヒアルロン酸は、化学的架橋剤によって架橋された架橋ヒアルロン酸ゲルの形態で存在し、ここで、該ヒアルロン酸の濃度は１０～３０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、該化学的架橋剤による修飾度は０．１～２モル％の範囲にある。
【0047】
ヒアルロン酸ゲルはまた、架橋していない、すなわち、三次元の架橋ヒアルロン酸ネットワークに結合していないヒアルロン酸の部分を含むことができる。しかしながら、好ましくは、少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％のヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ネットワークの一部を形成する。
【0048】
なお、用いるヒアルロン酸の種類は、本発明の製剤を用いる歯周組織の部位によって変えることができるが、例えば、歯肉に注射をする場合には、ヒアルロン酸ゲルの粒子が比較的小さくて柔らかいもの、例えばレスチレン・ヴィタール スキンブースターズ（登録商標）を用いることが好ましい。
【0049】
〈その他〉
本発明の歯周組織用製剤は、公知の方法を用いて製造することができ、歯周組織への注射、塗布等の公知の投与方法を用いて投与することができる。一例として、歯肉内投与又は歯槽骨内投与があげられ、この場合１か所又は複数個所に投与されうる。本発明の製剤を１投与単位として０．１ｍＬ以上３．０ｍＬ以下で投与することが好ましく、より好ましくは０．２ｍＬ以上２．０ｍＬ以下、０．３ｍＬ以上１．５ｍＬ以下、又は０．５ｍＬ以上１．２ｍＬ以下で投与される。
本発明の歯周組織用製剤は、公知の方法を用いて製造することができ、歯周組織への注射、塗布等の公知の投与方法を用いて投与することができる。一例として、歯肉内投与又は歯槽骨内投与があげられ、この場合１か所又は複数個所に投与されうる。本発明の製剤を１投与単位として０．１ｍＬ以上３．０ｍＬ以下で投与することが好ましく、より好ましくは０．２ｍＬ以上２．０ｍＬ以下、０．３ｍＬ以上１．５ｍＬ以下、又は０．５ｍＬ以上１．２ｍＬ以下で投与される。
【0050】
製剤を液剤として用いる場合、液剤を製造する方法は、公知の方法で製造することができる。例えば、凍結乾燥した培養上清の粉末を、薬学的に許容された溶媒に混合し、滅菌された液剤用の容器に充填する。そして、その容器に随意にさらにヒアルロン酸を添加することで製造することができる。薬学的に許容された溶媒の例は、注射用水、蒸留水、生理食塩水、電解質溶液剤、若しくは培養液に準ずる組成の液剤であり、滅菌された溶媒を用いることが好ましい。滅菌された液剤用の容器の例は、アンプル、バイアル、シリンジ、及びバッグである。これら容器は、ガラス製やプラスチック製など公知の容器を用いることができる。具体的には、プラスチック製容器の例は、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン・酢酸ビニル・コポリマーなどの材質を用いたものである。これら容器や溶剤の滅菌法の例は、加熱法（火炎法、乾燥法、高温蒸気法、流通蒸気法、煮沸法など）、濾過法、照射法（放射線法、紫外線法、高周波法など）、ガス法、及び薬液法である。このような滅菌法は、容器の材質、溶剤の性質に応じて、当業者であれば適宜選択して用いることができる。
【0051】
一つの態様において、培養上清は培養細胞を含んでいてもよい。細胞を液剤として治療に用いる場合、移植法として静脈内注射が最も多用され得る。例として、静脈内注射の場合においては、１×１０５細胞／ｍＬ以上５×１０7細胞／ｍＬ以下で液剤として調整することが好ましく、１×１０６細胞／ｍＬ以上１×１０7細胞／ｍＬがさらに好適である。また、ヒトにおいて静脈内注射１投与単位として調整される間葉系幹細胞剤としては、１×１０５細胞以上１×１０9細胞が好ましく、２×１０７細胞以上２×１０８細胞がさらに好適である。その他の投与ルートについては、組織へ移植可能な液量と、その液量に懸濁可能な最大の細胞数以下の範囲において、用いることができる。
【0052】
製剤を、薬学的に許容される担体又は媒体とともに調製してもよい。薬学的に許容される担体又は媒体は、例えば、安定化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤、又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。等張化剤の例は、塩化ナトリウム、及びグルコースである。緩衝剤の例は、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸、及びリン酸塩である。細胞を懸濁させるための水性媒質としては、例えば、浸透圧やｐＨを血液の値付近に調整し、塩類濃度等を調整した注射用の水溶液等を適宜用いればよく、例えば、酢酸リンゲル液、糖加酢酸リンゲル液等のリンゲル液その他の輸液、生理食塩水、またはブドウ糖液等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば輸液用リンゲル液を用いる場合、これに許容量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してもよい。抗酸化剤の例は、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、及びピロ亜硫酸ナトリウムである。
【0053】
本発明の製剤は、２０代～５０代の女性及び男性に対して特に有効であり、特に２０代～４０代の女性に極めて有効であることがわかった。
【0054】
なお、本明細書は、上述のような培養上清を含む歯周組織用製剤を用いた、対象（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）の歯周組織のための治療方法をも開示する。これを用いて治療を行う場合、注射等によって患部に投与することができる。
【0055】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明をするが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【0056】
《製造例１～２》
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
【0057】
コンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0058】
〈第２培養工程〉
洗浄後の細胞を、製造例１ではＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に置換し、製造例２では、ＨＢＳＳ(シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液)－ＨＥＰＥＳに置換した。その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け、ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地を用いた製造例１では、５％ＣＯ２培養器内で培養し、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地を用いた製造例２では、５％ＣＯ２を使用せずに培養器内で培養した。
洗浄後の細胞を、製造例１ではＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に置換し、製造例２では、ＨＢＳＳ(シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液)－ＨＥＰＥＳに置換した。その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け、ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地を用いた製造例１では、５％ＣＯ２培養器内で培養し、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地を用いた製造例２では、５％ＣＯ２を使用せずに培養器内で培養した。
【0059】
〈培養上清の回収〉
製造例１及び２のそれぞれについて、置換した直後（０時間）、３時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
製造例１及び２のそれぞれについて、置換した直後（０時間）、３時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
【0060】
なお、ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地は、ＦＢＳを含まないダルベッコ改変イーグル培地である。ＤＭＥ培地は、グルコース、Ｌ－グルタミンといった各種成分を含む。
【0061】
ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）は、（１）等張液である炭酸水素ナトリウム溶液、（２）ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４、グルコース、及びＫＨ２ＰＯ４を含む緩衝液及び（３）ＣａＣｌ２溶液を混合した溶液である。
【0062】
ＨＥＰＥＳは、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸であり、緩衝剤又はｐＨ調整剤である。
【0063】
ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に含まれる糖質の量は、４.５ｇ／Ｌ、アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は１.６ｇ／Ｌ、カルシウムイオンは１．８ｍＭであった。
【0064】
一方、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地（ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ）に含まれる糖質の量は、１.０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌは、８.０ｇ／Ｌ、ＫＣｌは、０.４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２は、０．１４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏは、０.２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏは、０．０６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４は、０．０６ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３は、０．３５ｇ／Ｌであり、また２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．４であり、アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は０ｇ／Ｌ、カルシウムイオンは１．５ｍＭであった。
【0065】
〈遺伝子発現量の測定方法〉
上記に示したように培養上清を回収後、そのウェルにそれぞれ４００マイクロリットルのＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーンＮｏ．３１９－９０２１１）を添加し、定法に従い細胞から全ＲＮＡを抽出し、エタチンメイト（ニッポン・ジーンＮｏ．３１２－０１７９１）を用いて得られた全ＲＮＡの沈殿物をヌクレアーゼフリー水に溶解させた。このうちの１．５マイクロリットルを用いてナノドロップ（サーモサイエンテフィック社）により全ＲＮＡの濃度を測定した。得られた全ＲＮＡ １００ナノグラムからアイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤＮｏ．１７０８８９１）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ社製ローター・ジーンＱ）による各遺伝子発現量の定量に用いた。
上記に示したように培養上清を回収後、そのウェルにそれぞれ４００マイクロリットルのＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーンＮｏ．３１９－９０２１１）を添加し、定法に従い細胞から全ＲＮＡを抽出し、エタチンメイト（ニッポン・ジーンＮｏ．３１２－０１７９１）を用いて得られた全ＲＮＡの沈殿物をヌクレアーゼフリー水に溶解させた。このうちの１．５マイクロリットルを用いてナノドロップ（サーモサイエンテフィック社）により全ＲＮＡの濃度を測定した。得られた全ＲＮＡ １００ナノグラムからアイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤＮｏ．１７０８８９１）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ社製ローター・ジーンＱ）による各遺伝子発現量の定量に用いた。
【0066】
〈リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現の定量化〉
合成したＤＮＡ、検出・定量化する遺伝子に特異的なプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、ＱＩＡＧＥＮ）、及びリアルタイムＰＣＲ試薬（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＱＩＡＧＥＮ）を混合し、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱシステム（ＱＩＡＧＥＮ社）にて、リアルタイムＰＣＲを行い、検出・定量化する遺伝子の断片を増幅した。この際、ハウスキーピング遺伝子であるβ―Ａｃｔｉｎ特異的なプライマーを同様に増幅し、その増幅曲線を指標として検出・定量化したい遺伝子の定量値を相対的に算出した。各遺伝子に特異的なプライマーとしてＱＩＡＧＥＮ社の以下のプライマー混合液を用いた。
合成したＤＮＡ、検出・定量化する遺伝子に特異的なプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、ＱＩＡＧＥＮ）、及びリアルタイムＰＣＲ試薬（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＱＩＡＧＥＮ）を混合し、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱシステム（ＱＩＡＧＥＮ社）にて、リアルタイムＰＣＲを行い、検出・定量化する遺伝子の断片を増幅した。この際、ハウスキーピング遺伝子であるβ―Ａｃｔｉｎ特異的なプライマーを同様に増幅し、その増幅曲線を指標として検出・定量化したい遺伝子の定量値を相対的に算出した。各遺伝子に特異的なプライマーとしてＱＩＡＧＥＮ社の以下のプライマー混合液を用いた。
【0067】
ヒトβ―Ａｃｔｉｎ
Ｈｓ＿ＡＣＴＢ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００９５４３１
ヒトＦＧＦ２
Ｈｓ＿ＦＧＦ２＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００４７５７９
ヒトＶＥＧＦＡ
Ｈｓ＿ＶＥＧＦＡ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０１０１０１８４
Ｈｓ＿ＡＣＴＢ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００９５４３１
ヒトＦＧＦ２
Ｈｓ＿ＦＧＦ２＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００４７５７９
ヒトＶＥＧＦＡ
Ｈｓ＿ＶＥＧＦＡ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０１０１０１８４
【0068】
〈培養上清に含まれるタンパク質の定量化方法〉
回収した培養上清を０．２２マイクロメートル径のフィルターに通し、タンパク質定量用のサンプルとした。サンプルのタンパク質定量にはＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２）キットを用い、そのプロトコールに従って、各タンパク質の定量値を得た。
回収した培養上清を０．２２マイクロメートル径のフィルターに通し、タンパク質定量用のサンプルとした。サンプルのタンパク質定量にはＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２）キットを用い、そのプロトコールに従って、各タンパク質の定量値を得た。
【0069】
その結果を表１に示す。
【0070】
【表1】
【0071】
〈リアルタイムＰＣＲの結果〉
細胞内のＶＥＧＦ遺伝子の発現量は、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。また、細胞内のＦＧＦ－２遺伝子の発現量も、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。
細胞内のＶＥＧＦ遺伝子の発現量は、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。また、細胞内のＦＧＦ－２遺伝子の発現量も、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。
【0072】
〈タンパク定量の結果〉
培養上清中のＶＥＧＦの量は、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。培養上清中のＦＧＦ－２の量は、製造例１（ＤＭＥ培地）が多かった。
培養上清中のＶＥＧＦの量は、製造例２（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）が多かった。培養上清中のＦＧＦ－２の量は、製造例１（ＤＭＥ培地）が多かった。
【0073】
０、６、２４、４８時間、経時的に遺伝子の発現量、培養上清中のタンパク質の量、ともに増加傾向にあった。ＶＥＧＦ遺伝子の発現量、培養上清中のタンパク質の量は製造例２が多かった。ＦＧＦ－２の遺伝子発現量は、製造例２が多かったが、培養上清中のタンパク質の量に関しては製造例１の方が多かった。
【0074】
《製造例３及び４》
〈第１培養工程〉
正常ヒト皮膚組織を酵素処理し抽出した表皮角化細胞を、サプリメントＳ７（ギブコ社製Ｎｏ．Ｓ０１７５）含有無血清細胞用培地（ギブコ社製Ｎｏ．ＭＥＰＩ５００ＣＡ）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
〈第１培養工程〉
正常ヒト皮膚組織を酵素処理し抽出した表皮角化細胞を、サプリメントＳ７（ギブコ社製Ｎｏ．Ｓ０１７５）含有無血清細胞用培地（ギブコ社製Ｎｏ．ＭＥＰＩ５００ＣＡ）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
【0075】
コンフルエントになったことを確認後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0076】
〈第２培養工程〉
洗浄後の細胞を、製造例３では、サプリメント７不含無血清細胞用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ）に置換し、製造例４ではＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４溶液に置換した。
洗浄後の細胞を、製造例３では、サプリメント７不含無血清細胞用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ）に置換し、製造例４ではＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４溶液に置換した。
【0077】
〈培養上清の回収〉
その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け、置換した直後（０時間）、３時間後、６時間後、２４時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け、置換した直後（０時間）、３時間後、６時間後、２４時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
【0078】
製造例３のサプリメント７不含無血清細胞用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ）に含まれる糖質の量は、１.０ ｇ／Ｌ、アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は１.５ｇ／Ｌ、カルシウムイオンは８．４ｍｇ／Ｌであった。
【0079】
〈リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現の定量化〉
製造例１～２に記載のように、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現の定量化及びタンパク質の定量化を行った。ただし、ヒトＥＧＦに特異的なプライマーとしてＱＩＡＧＥＮ社の以下のプライマー混合液を用いた。
製造例１～２に記載のように、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現の定量化及びタンパク質の定量化を行った。ただし、ヒトＥＧＦに特異的なプライマーとしてＱＩＡＧＥＮ社の以下のプライマー混合液を用いた。
【0080】
ヒトＥＧＦ
Ｈｓ＿ＥＧＦ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００５１６４６
Ｈｓ＿ＥＧＦ＿１＿ＳＧ カタログ番号ＱＴ０００５１６４６
【0081】
結果を表２に示す。
【0082】
【表2】
【0083】
細胞内のＥＧＦ遺伝子の発現量は、製造例３（ＥｐｉＬｉｆｅ培地）よりも、製造例４（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ培地）の方が多かった。細胞内のＦＧＦ－２遺伝子発現量も、製造例３よりも製造例４の方が多かった。細胞内のＶＥＧＦ遺伝子発現量も、製造例３も製造例４の方が多かった。
【0084】
《製造例５～７》
製造例１の第１培養工程と同様に培養を行ってコンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を、３種類の溶液で置換し、５％ＣＯ２を使用しないで培養し４８時間後の細胞内各ｍＲＮＡの発現量を定量した。製造例５では、ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に置換し、製造例６では、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４培地に置換し、製造例７では、プレプラス輸液に置換した。
製造例１の第１培養工程と同様に培養を行ってコンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を、３種類の溶液で置換し、５％ＣＯ２を使用しないで培養し４８時間後の細胞内各ｍＲＮＡの発現量を定量した。製造例５では、ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に置換し、製造例６では、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４培地に置換し、製造例７では、プレプラス輸液に置換した。
【0085】
パレプラスは、パレプラス輸液を意味し、ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｌ－乳酸ナトリウム、塩化カルシウム水和物、硫酸マグネシウム水和物、硫酸亜鉛水和物、チアミン塩化物塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、シアノコバラミン、パンテノール、氷酢酸、アミノ酸、電解質、安定剤、及びｐＨ調節剤含む。
【0086】
ｍＲＮＡの発現量を定量した結果を、表３に示す。
【0087】
【表3】
【0088】
表３から、製造例５のＤＭＥ培地よりも、製造例６の電解質溶液培地（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ及びパレプラス）の方が遺伝子の発現量は多いことが分かる。
【0089】
《製造例８～１２》
製造例１の第１培養工程と同様に培養を行ってコンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を、以下の表４に記載の溶液で置換し、培養４８時間後の細胞内各ｍＲＮＡの発現量を定量した。なお、製造例８のみ、５％ＣＯ２を使用して培養を行った。
製造例１の第１培養工程と同様に培養を行ってコンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を、以下の表４に記載の溶液で置換し、培養４８時間後の細胞内各ｍＲＮＡの発現量を定量した。なお、製造例８のみ、５％ＣＯ２を使用して培養を行った。
【0090】
ＫＮ２号は、ＫＮ２号輸液を示す。ＫＮ２号輸液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、Ｌ－乳酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム水和物、リン酸二カリウム及びブドウ糖を含む。
【0091】
また、「＋Ｃａ」とは、カルシウムイオンが１．０ｍＭとなるように塩化カルシウムが追加で添加されていることを意味している。
【0092】
【表4】
【0093】
製造例９と製造例１０とを比較した場合、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）が添加されていることによって、ＰＨが酸性になる速度が緩やかになることで、遺伝子発現が促進されることがわかる。
【0094】
《凍結乾燥方法の例》
第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を５０ｍＬ遠沈管（住友ベークライト株式会社）に回収後、遠心分離（７４０Ｇ、５分間）し、その上清を、膜孔径０.２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し、シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し、－８０℃のフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密閉した。
第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を５０ｍＬ遠沈管（住友ベークライト株式会社）に回収後、遠心分離（７４０Ｇ、５分間）し、その上清を、膜孔径０.２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し、シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し、－８０℃のフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密閉した。
【0095】
《製造例１３》
製造例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
製造例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
【0096】
洗浄後の細胞を、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４培地に置換した。その後１２ウェルを２ウェルずつ６つの群に細胞を分けて、これらを培養器内で培養した（製造例１３）。置換した直後（０時間）、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりＶＥＧＦ遺伝子の発現の相対定量を行った。
【0097】
その結果を表５に示す。
【0098】
【表5】
【0099】
表５に示される通り、５日後まで遺伝子発現が維持されていることが明らかとなった。
【0100】
《製造例１４》
製造例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
製造例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
【0101】
洗浄後の細胞を、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ６．５、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．８、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ９．０に置換した。置換した直後（０時間）、４８時間後に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりＶＥＧＦ遺伝子の発現の相対定量を行った。
【0102】
その結果を表６に示す。
【0103】
【表6】
【0104】
表６に示されるように、ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．０からＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．８まで遺伝子発現が維持されていることが明らかとなった。
【0105】
《製造例１５》
製造例１と同様に、１２ウェルプレートに脂肪組織由来間質細胞を培養し、コンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
洗浄後の細胞を３ウェルずつ４つの群に分け、それぞれ０ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＧＥ１（プロスタンディン 丸石製薬株式会社製）を添加したＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換し、培養器内で培養した。置換してから４８時間後、各ウェルから培養上清を回収しＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。また、培養上清回収後の各ウェルより、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出後アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、それをリアルタイムＰＣＲ(ローター・ジーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製)によるＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量に用いた。
製造例１と同様に、１２ウェルプレートに脂肪組織由来間質細胞を培養し、コンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
洗浄後の細胞を３ウェルずつ４つの群に分け、それぞれ０ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＧＥ１（プロスタンディン 丸石製薬株式会社製）を添加したＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換し、培養器内で培養した。置換してから４８時間後、各ウェルから培養上清を回収しＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。また、培養上清回収後の各ウェルより、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出後アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、それをリアルタイムＰＣＲ(ローター・ジーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製)によるＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量に用いた。
【0106】
その結果を表７に示す。
【0107】
【表7】
【0108】
表７に示されるように、ｍＲＮＡの発現量の相対定量値はＰＧＥ１の添加量に依らずほぼ同程度であった。タンパク量に関してはＰＧＥ１の添加量に応じ、増加傾向にあることが明らかとなった。このことから、培地をＰＧＥ１含有ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換し４８時間培養することで、より高濃度のＶＥＧＦを含む培養上清が得られることがわかった。
【0109】
《製造例１６～１８》
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、適宜希釈し、適量細胞数を同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）１枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、適宜希釈し、適量細胞数を同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）１枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
【0110】
コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0111】
〈第２培養工程〉
洗浄後、製造例１６にＤＭＥ高グルコース培地を、製造例１７に終濃度１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）を、製造例１８には終濃度２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳを添加した。
洗浄後、製造例１６にＤＭＥ高グルコース培地を、製造例１７に終濃度１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）を、製造例１８には終濃度２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳを添加した。
【0112】
培養器内で４８時間培養した後、培養上清をそれぞれ５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収し、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にてＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。更に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出、濃縮し、アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを得た。そしてそれを用いてリアルタイムＰＣＲ（ロータージーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＶＥＧＦ、ＦＧＦ２ｂａｓｉｃ、ＭＭＰ１、ＥＦＮＡ３、ＢＭＰ１、ＷＮＴ５Ａ遺伝子の各発現量の相対定量を行った。
【0113】
その結果を表８に示す。相対定量値は、ベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、ＤＭＥ高グルコース培地での値を基準値として算出した。
【0114】
【表8】
【0115】
表８に示される通り、細胞内の各ｍＲＮＡは、ＤＭＥ培地よりもＨＢＳＳ-１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４で培養した細胞内により多く発現する傾向が見られ、さらにＨＥＰＥＳの濃度は２０ｍＭである方がより多いことがわかった。
【0116】
《製造例１９～２０》
〈第１培養工程〉
製造例８～１２と同様に、脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した（製造例１９）。
〈第１培養工程〉
製造例８～１２と同様に、脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した（製造例１９）。
【0117】
同様に、ヒト歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を６ウェルプレート５枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した（製造例２０）。
【0118】
コンフルエントになったＡＳＣとＳＨＥＤについて、各ウェルの細胞を２ウェルずつ３つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0119】
〈第２培養工程〉
洗浄後、３つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４をそれぞれ３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ添加し、培養器内で４８時間培養した。
洗浄後、３つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４をそれぞれ３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ添加し、培養器内で４８時間培養した。
【0120】
その後、培養上清をそれぞれ５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収し、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にてＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。更に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出、濃縮し、アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを得た。そしてそれを用いてリアルタイムＰＣＲ（ロータージーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量を行った。
【0121】
その結果を表９に示す。相対定量値はベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、通常の培地量２ｍＬの値を基準値として算出した。
【0122】
【表9】
【0123】
細胞内のｍＲＮＡの発現量に関しては培養上清の量による変化は見られなかった。培養上清中に含まれるＶＥＧＦタンパク質の量は、培養上清の容積が多い方が少なく、培養上清の容積が少ない方がより多くなっていた。このことから、通常使用する培地の容積よりも少ない量の培地を用いることでより多くの成長因子を含む培養上清が得られることがわかった。
【0124】
《製造例２１～２２》
上記の凍結乾燥方法の例と同様にして、第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を回収し、遠心分離（７４０Ｇ、５分間）して得られた培養上清を、無添加の群と（製造例２１）、２５０ｍＭトレハロース（林原社製）を加えた群（製造例２２）と、の２つの群に分けた。その後、膜孔径０．２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し、シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し、－８０℃のフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密栓した。密栓した状態で、-８０℃、４℃、２５℃、の３つの温度条件でそれぞれを３週間、保管した。３週間経過後、凍結乾燥試料を注射用水（大塚製薬株式会社製）で再懸濁し、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。定量値は－８０℃で３週間保管後の培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準とし、各保管温度におけるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。
上記の凍結乾燥方法の例と同様にして、第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を回収し、遠心分離（７４０Ｇ、５分間）して得られた培養上清を、無添加の群と（製造例２１）、２５０ｍＭトレハロース（林原社製）を加えた群（製造例２２）と、の２つの群に分けた。その後、膜孔径０．２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し、シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し、－８０℃のフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密栓した。密栓した状態で、-８０℃、４℃、２５℃、の３つの温度条件でそれぞれを３週間、保管した。３週間経過後、凍結乾燥試料を注射用水（大塚製薬株式会社製）で再懸濁し、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。定量値は－８０℃で３週間保管後の培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準とし、各保管温度におけるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。
【0125】
その結果を表１０に示す。
【0126】
【表10】
【0127】
表１０に示される通り、無添加の凍結乾燥培養上清では、２５℃環境下での保管により、顕著なＶＥＧＦタンパク質の減少が確認できた。これは吸湿や光酸化に伴うタンパク質の分解を示唆している。一方で終濃度２５０ｍＭのトレハロースを添加するとＶＥＧＦタンパク質の減少は抑制されることがわかった。
【0128】
《製造例２３～２４》
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地で培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）５枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地で培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）５枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
【0129】
コンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0130】
洗浄後の細胞を、ＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳに置換し、培養器内で４８時間培養した後、培養上清をそれぞれ２０ｍＬ容量のシリンジ（テルモ社製）に１５ｍＬずつ回収した。回収した培養上清を凍結乾燥させた。
【0131】
２０ｍＬシリンジにて凍結乾燥させた培養上清２本をそれぞれ注射用水１５ｍＬに懸濁し、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、ＶＳ２０４１（ザルトリウス社製）と遠心分離機ＫＵＢＯＴＡ２８００（クボタ社製）を用いて０．６ｍＬとなるまで濃縮操作を行った。
【0132】
濃縮操作後、１本について、Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（富士フィルム和光社製）を用い、定法に従い培養上清中のＥｘｏｓｏｍｅを単離抽出した（製造例２３）。抽出したＥｘｏｓｏｍｅ抽出液は０．１ｍＬであった。残りの１本についてはそのまま１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に保管した（製造例２４）。
【0133】
濃縮操作を行い、Ｅｘｏｓｏｍｅｎを単離抽出したサンプル１と、濃縮操作を行っただけの培養上清サンプル２に関し、ＥｘｏｓｏｍｅＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（富士フィルム和光社製）を用い、定法に従いそれらに含まれるＥｘｏｓｏｍｅを相対的に定量した。定量値は４５０ｎｍの吸光度と６５０ｎｍの吸光度の差を求め、ブランクの値で補正を行い、その吸光度の値をもとに培養上清１５ｍＬに含まれる吸光度の積算値として表した。
【0134】
Ｅｘｏｓｏｍｅ定量値の結果は、製造例２３及び２４で、それぞれ１１６．９４と１５０．０６であった。
【0135】
この結果に示される通り、両者の吸光度の値の比較より、本製造方法による培養上清にはＥｘｏｓｏｍｅが含まれており、あえてそれを単離抽出せずとも相当量のＥｘｏｓｏｍｅを活用できることがわかった。
【0136】
《製造例２５～２６》
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）２枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
〈第１培養工程〉
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いて、培養フラスコＴ７５（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）２枚に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
【0137】
コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0138】
〈第２培養工程〉
洗浄後、２つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４を２ｍＬ添加し、培養器内で２４時間または４８時間培養した。２４時間または４８時間経過後、製造例２５については通常通り培養上清を５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収した。製造例２６に関してはセルスクレイパー（旭硝子社製）を用い、接着細胞を培養上清をと共に５ｍＬ容量のチューブに回収し、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所社製）を用い細胞を破砕し、測定試料とした。それぞれの試料をＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用い、ＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。１つ目の群（培養上清）から得られたＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準として、細胞含有培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。
洗浄後、２つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４を２ｍＬ添加し、培養器内で２４時間または４８時間培養した。２４時間または４８時間経過後、製造例２５については通常通り培養上清を５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収した。製造例２６に関してはセルスクレイパー（旭硝子社製）を用い、接着細胞を培養上清をと共に５ｍＬ容量のチューブに回収し、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所社製）を用い細胞を破砕し、測定試料とした。それぞれの試料をＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用い、ＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。１つ目の群（培養上清）から得られたＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準として、細胞含有培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。
【0139】
その結果を表１１に示す。
【0140】
【表11】
【0141】
表１１において、「＊（相対定量値）」は、２４時間培養後の培養上清から得られたＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準として、４８時間培養後の各試料に含まれるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出したものである。表１１に示される通り、 細胞含有培養上清を用いることで、より多くの増殖因子を活用できることが明らかとなった。
【0142】
《製造例２７～２９》
健常人皮膚組織由来表皮細胞から、常法により線維芽細胞を選択培養した。得られた初代培養を維持培養し、その４継代目を６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
健常人皮膚組織由来表皮細胞から、常法により線維芽細胞を選択培養した。得られた初代培養を維持培養し、その４継代目を６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
【0143】
洗浄後、製造例２７ではＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、各２ｍＬで置換し、製造例２８及び２９には、同量のＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４に製造例１及び２で示した脂肪組織幹細胞由来培養上清（ＡＳＣｓｕｐ．）をそれぞれ終濃度１０％、５０％となるように添加した溶液で置換した。その後培養器内で３、６、２４または４８時間培養した。
【0144】
それぞれの時間経過後、各ウェルより、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出後アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、それをリアルタイムＰＣＲ（ローター・ジーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製）によるＦＧＦｂａｓｉｃ、ＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量に用いた。相対定量値は、ベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、コンフルエントになった時点での細胞の各遺伝子発現量の値を基準値として算出した。
【0145】
その結果を表１２に示す。
【0146】
【表12】
【0147】
表１２に示されるように、ＦＧＦ-ｂａｓｉｃ遺伝子に関して、ＡＳＣ-ｓｕｐ．無添加群（製造例２７）においては培地置換後２４時間までは時間経過に伴い発現が増加傾向であったが、４８時間後には停滞した。一方で添加群（製造例２８～２９）においては置換後４８時間まで、時間経過とともに発現の増加が見られ、その添加量に依存し増加率は高くなった。
【0148】
ＶＥＧＦ遺伝子に関しては無添加群、添加群ともに置換後４８時間まで、時間経過に伴い発現が増加傾向となり、ＡＳＣ-ｓｕｐ．の添加量依存的にその増加率は顕著に高くなった。線維芽細胞に脂肪組織由来間質細胞培養上清を添加することでその細胞自体の増殖因子の発現を促進させ、組織再生に有効であることが示唆された。
【0149】
《製造例３０～３１》
健常人皮膚組織由来表皮細胞を常法により抽出し、６ウェルプレートに播種した。その際、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（製造例３０）、及びＥｐｉＬｉｆｅ培地に製造例１で示した脂肪組織幹細胞由来培養上清を添加したもの（製造例３１）の２群に分け、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになったことを確認した後、常法に従い、Ｌ－ＤＯＰＡ染色を施し、表皮細胞に含まれる色素幹細胞の色調を定量した。定量値は画像ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用い、Ｌ－ＤＯＰＡ染色を施した色素幹細胞の黒色部分の面積の割合から得た。
健常人皮膚組織由来表皮細胞を常法により抽出し、６ウェルプレートに播種した。その際、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（製造例３０）、及びＥｐｉＬｉｆｅ培地に製造例１で示した脂肪組織幹細胞由来培養上清を添加したもの（製造例３１）の２群に分け、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになったことを確認した後、常法に従い、Ｌ－ＤＯＰＡ染色を施し、表皮細胞に含まれる色素幹細胞の色調を定量した。定量値は画像ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用い、Ｌ－ＤＯＰＡ染色を施した色素幹細胞の黒色部分の面積の割合から得た。
【0150】
結果は、オリジナルサプリメント含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（製造例３０）及びＡＳＣ培養上清及びオリジナルサプリメント含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（製造例３１）で、それぞれ１８８４及び１１７４であった。
【0151】
脂肪組織幹細胞由来の培養上清を添加した培地の方が、表皮細胞中に存在する色素幹細胞のＬ－ＤＯＰＡ染色による色調の定量値が低いことから、脂肪組織幹細胞由来の培養上清には色素幹細胞の増殖、色素細胞への分化を抑える働きがあることが示唆された。
【0152】
《製造例３２》
上記凍結乾燥方法の例の培養上清の凍結乾燥品を製造した。１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を２種類のヒアルロン酸製剤であるレスチレンリド（ＧＡＬＤＥＴＲＡＭＡ社製）及びベロテロ（ＭＥＲＺ社）１ｍｌに融解させた。凍結乾燥培養上清は、ヒアルロン酸に融解することが明らかとなった。そのため、ヒアルロン酸を歯周組織に投与する際に、ヒアルロン酸とともに凍結乾燥培養上清を投与することができる。
上記凍結乾燥方法の例の培養上清の凍結乾燥品を製造した。１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を２種類のヒアルロン酸製剤であるレスチレンリド（ＧＡＬＤＥＴＲＡＭＡ社製）及びベロテロ（ＭＥＲＺ社）１ｍｌに融解させた。凍結乾燥培養上清は、ヒアルロン酸に融解することが明らかとなった。そのため、ヒアルロン酸を歯周組織に投与する際に、ヒアルロン酸とともに凍結乾燥培養上清を投与することができる。
【0153】
《歯周組織に対する培養上清の薬理効果》
製造例２の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を、１ｍｌの生理食塩水に溶解し、注射用の製剤とした。
製造例２の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を、１ｍｌの生理食塩水に溶解し、注射用の製剤とした。
【0154】
〈被験者１〉
歯科矯正後に歯肉退縮した２６歳の女性に対して、３～４週間に１回の割合で３回、ヒアルロン酸の注入を通常の方法で注射によって行った。処置の際に強い痛みが生じていたものの、歯肉がある程度再生されて、被験者は満足していた。
歯科矯正後に歯肉退縮した２６歳の女性に対して、３～４週間に１回の割合で３回、ヒアルロン酸の注入を通常の方法で注射によって行った。処置の際に強い痛みが生じていたものの、歯肉がある程度再生されて、被験者は満足していた。
【0155】
〈被験者２〉
図１ａは、歯科矯正後に歯肉退縮した２９歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮が見られる。上顎前歯部に、歯間空隙があり、ブラックトライアングルが生じている。
図１ａは、歯科矯正後に歯肉退縮した２９歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮が見られる。上顎前歯部に、歯間空隙があり、ブラックトライアングルが生じている。
【0156】
その患者の下顎前歯部及び上顎前歯部の歯肉に対して、上記の１ｍｌの製剤を３～４週間に１回の割合で３回注射して投与した。
【0157】
図１ｂは、３回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、上顎前歯部の歯肉が増えて厚みが出ており、ブラックトライアングルが目立たなくなっていることが明確に分かる。下顎前歯部についても、歯肉が増えて乳頭部も厚みが出ていた。被験者は非常に満足していた。ただし、被験者は、１回目の注射後には結果を実感できず、２回目の注射後でも結果が分かりにくいと感じていた。
【0158】
〈被験者３〉
図２ａは、歯周病及び歯科矯正後に歯肉退縮した２８歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮及び付着歯肉の減少が見られ、歯肉が薄くなっている。下顎前歯部では歯肉退縮による歯間乳頭部の減少、及びブラックトライアングルが生じている。
図２ａは、歯周病及び歯科矯正後に歯肉退縮した２８歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮及び付着歯肉の減少が見られ、歯肉が薄くなっている。下顎前歯部では歯肉退縮による歯間乳頭部の減少、及びブラックトライアングルが生じている。
【0159】
その患者の下顎前歯部及び上顎前歯部の歯肉に対して、上記の１ｍｌの製剤を３～４週間に１回の割合で９回注射して投与した。
【0160】
図２ｂは、９回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、上顎前歯部と下顎前歯部の歯肉が増えて厚みが出ていることがわかる。特に下顎前歯部は、付着歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことによって明らかに歯間空隙が減少し、ブラックトライアングルが目立たなくなっていることが明確に分かる。下顎前歯部についても、歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことで、ブラックトライアングルが小さくなった。被験者は非常に満足していた。ただし、被験者は、１回目の注射後には結果を実感できず、２回目の注射後でも結果が分かりにくいと感じていた。
【0161】
〈被験者４〉
図３ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している３５歳の男性の歯周組織のパノラマＸ線画像である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の凹凸も著しく見られ、また犬歯の根尖部の骨も薄くなっていた。
図３ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している３５歳の男性の歯周組織のパノラマＸ線画像である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の凹凸も著しく見られ、また犬歯の根尖部の骨も薄くなっていた。
【0162】
その患者の歯槽骨に対して、上記の１ｍｌの製剤を３～４週間に１回の割合で４回注射して投与した。
【0163】
図３ｂは、４回注射後の歯周組織のパノラマＸ線画像である。施術前と比較して、欠損していた陥没部に歯槽骨が増えて骨が再生していることが分かる。また、犬歯の歯の根尖部にも骨が再生されて、白く写った部分の面積が増えていることが分かる。被験者は非常に満足していた。ただし、被験者は、１回目の注射後には結果を実感できず、２回目の注射後でも結果が分かりにくいと感じていた。
【0164】
〈被験者５〉
図４ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している男性の歯周組織の写真である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の歯肉及び犬歯の後方の歯肉が減少していた。その結果、犬歯を触るとグラグラと動く状態であった。
図４ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している男性の歯周組織の写真である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の歯肉及び犬歯の後方の歯肉が減少していた。その結果、犬歯を触るとグラグラと動く状態であった。
【0165】
その患者の歯槽骨に対して、上記の１ｍｌの製剤を３～４週間に１回の割合で３回注射して投与した。
【0166】
図４ｂは、３回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、陥没部の歯肉が再生されており、また犬歯後方の歯肉の厚みが増えていた。その結果、犬歯のグラつきはかなりの程度で治まった。被験者は非常に満足していた。ただし、被験者は、１回目の注射後には結果を実感できず、２回目の注射後でも結果が分かりにくいと感じていた。
【0167】
〈被験者６〉
製造例２の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を、１ｍｌの生理食塩水に溶解し、さらにヒアルロン酸（レスチレン・ヴィタール スキンブースターズ（登録商標））を１ｍｌ混合して、注射用の製剤とした。
製造例２の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を、１ｍｌの生理食塩水に溶解し、さらにヒアルロン酸（レスチレン・ヴィタール スキンブースターズ（登録商標））を１ｍｌ混合して、注射用の製剤とした。
【0168】
図１ａは、歯周病によって歯肉退縮した３０歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮が見られる。上顎前歯部に、歯間空隙があり、ブラックトライアングルが生じている。
【0169】
その患者の下顎前歯部及び上顎前歯部の歯肉に対して、上記の本発明の製剤２ｍｌを１～２ヶ月に１回の割合で６回注射して投与した。
【0170】
図１ｂは、６回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、上顎前歯部の歯肉が増えて厚みが出ており、ブラックトライアングルが消失していることが明確に分かる。下顎前歯部についても、歯肉が増えて乳頭部も厚みが出ていた。被験者は非常に満足していた。６回の注射によって、このように非常に良好な結果が得れたが、被験者は、１回目及び２回目の注射後にすでに結果を実感できていた。
【0171】
〈まとめ〉
各患者の個人差もあるものの、従来技術のヒアルロン酸を用いた歯周組織の再生の効果、培養上清を含む製剤を用いた場合の歯周組織の再生効果、及び患者の満足度をまとめると、概ね以下の表１３のようにまとめることができる。なお、再生性能の効果については歯科医師が判断を行った。ここで、「０」は効果なし、「１」は効果あり又はやや満足、「２」は効果高い又は満足、「３」は非常に効果が高い又は大満足を意味する。
各患者の個人差もあるものの、従来技術のヒアルロン酸を用いた歯周組織の再生の効果、培養上清を含む製剤を用いた場合の歯周組織の再生効果、及び患者の満足度をまとめると、概ね以下の表１３のようにまとめることができる。なお、再生性能の効果については歯科医師が判断を行った。ここで、「０」は効果なし、「１」は効果あり又はやや満足、「２」は効果高い又は満足、「３」は非常に効果が高い又は大満足を意味する。
【0172】
【表13】
【0173】
すなわち、培養上清を含む製剤を用いると、従来技術では不可能であった歯槽骨の再生が可能になり、歯肉の再生についても、従来技術よりも高い効果が得られた。また、培養上清及びヒアルロン酸を含む製剤を用いると、従来技術では不可能であった歯槽骨の再生が可能になり、歯肉の再生についても、高い効果が治療の初期のうちから得られた。このため、本発明の製剤によれば、高い再生効果が得られることに加えて、患者の満足度が非常に高く、治療を中断することなく継続的に行うことができた。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
