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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-16
(45)【発行日】2022-12-26
(54)【発明の名称】ダイナミン２関連疾患のためのアレル特異的サイレンシング療法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20221219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221219BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221219BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61P21/00
A61K48/00
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2019528473
(86)(22)【出願日】2017-11-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-16
(86)【国際出願番号】 EP2017080884
(87)【国際公開番号】W WO2018100010
(87)【国際公開日】2018-06-07
【審査請求日】2020-11-25
(31)【優先権主張番号】16306575.8
(32)【優先日】2016-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(73)【特許権者】
【識別番号】511244322
【氏名又は名称】アソシアシオン・アンスティテュ・ドゥ・ミオロジー
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＭＹＯＬＯＧＩＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】518059934
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ビトゥン，マルク
(72)【発明者】
【氏名】トロシェ，デルフィーヌ
(72)【発明者】
【氏名】プリュドン，ベルナール
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０５５８５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０９５４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０４３６３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００６－２８８３２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Brain, 2012, Vol.135,pp.1395-1411
【文献】NATURE GENETICS，米国，2005年10月16日，VOL:37, NR:11，PAGE(S):1207 - 1209，http://dx.doi.org/10.1038/ng1657
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）であって、AS-siRNAは、疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在する、非病理学的多型を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする、又は、疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とし、配列番号５～１０からなる群から選択されるセンス鎖を含む、AS-siRNA。
【請求項2】
１９～２３塩基対長である、請求項１記載のAS-siRNA。
【請求項3】
DNM2遺伝子が、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である及び／又は疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である、請求項１又は２記載のAS-siRNA。
【請求項4】
非病理学的多型が、rs2229920（Ｃ又はＴ）又はrs12461992（Ａ又はＴ）である、請求項１～３のいずれか一項記載のAS-siRNA。
【請求項5】
１９塩基対長であり、そして、ミスマッチの位置が、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ１６又はＮ１７位に位置する、請求項４記載のAS-siRNA。
【請求項6】
疾患を引き起こす突然変異が、1393C>Tである、請求項１記載のAS-siRNA。
【請求項7】
１９塩基対長であり、そして、ミスマッチの位置が、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、又はＮ１６位に位置する、請求項６記載のAS-siRNA。
【請求項8】
DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を２０～６０％低減することができる、請求項１～７のいずれか一項記載のAS-siRNA。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項記載のAS-siRNAをコードしているベクターであって、プラスミド又はウイルスのベクターである、ベクター。
【請求項10】
請求項９記載のベクターがトランスフェクト又は形質導入されている標的細胞。
【請求項11】
標的細胞内のDNM2遺伝子の野生型アレルの発現をサイレンシングすることなく、前記DNM2遺伝子の突然変異型アレルの発現をサイレンシングするインビトロ法であって、前記標的細胞に請求項１～８のいずれか一項記載のAS-siRNA又は請求項９記載のベクターを導入することを含む方法。
【請求項12】
DNM2遺伝子における疾患を引き起こす突然変異によって誘導される疾患を処置する方法であって、DNM2遺伝子における疾患を引き起こす突然変異によって誘導される疾患が、常染色体優性中心核ミオパシー、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病、又は遺伝性痙性対麻痺である方法において使用するための、又は、ダイナミン２の過剰発現に関連する疾患を処置する方法であって、ダイナミン２の過剰発現に関連する疾患が、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー、前立腺癌又は膵臓癌である方法において使用するための、又は、筋ジストロフィーを処置する方法であって、筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである方法において使用するための、請求項１～８のいずれか一項記載のAS-siRNA又は請求項９記載のベクター又は請求項１０記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、ダイナミン２のヘテロ接合型突然変異及び／又は過剰発現によって引き起こされる疾患を処置するための、ヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNAに関する。
本発明は、ダイナミン２のヘテロ接合型突然変異及び／又は過剰発現によって引き起こされる疾患を処置するための、ヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNAに関する。
【0002】
背景
ダイナミン２は、ラージGTPaseのスーパーファミリーに属する、遍在的に発現するタンパク質である。ダイナミン２（DNM2）は、生体膜を変形させる機械化学的足場分子として作用し、その結果、新生小胞が放出される。原形質膜において、DNM2は、クラスリン依存性及びクラスリン非依存性のエンドサイトーシスに関与している。このタンパク質は、エンドソームからの小胞の形成及びトランスゴルジネットワークにも関与している。幾つかの研究によって、アクチン及び微小管の細胞骨格の制御因子としてのダイナミン２の役割が明らかになっている。
ダイナミン２は、ラージGTPaseのスーパーファミリーに属する、遍在的に発現するタンパク質である。ダイナミン２（DNM2）は、生体膜を変形させる機械化学的足場分子として作用し、その結果、新生小胞が放出される。原形質膜において、DNM2は、クラスリン依存性及びクラスリン非依存性のエンドサイトーシスに関与している。このタンパク質は、エンドソームからの小胞の形成及びトランスゴルジネットワークにも関与している。幾つかの研究によって、アクチン及び微小管の細胞骨格の制御因子としてのダイナミン２の役割が明らかになっている。
【0003】
幾つかの優性遺伝性疾患は、該ダイナミン２タンパク質をコードしているDNM2遺伝子のヘテロ接合型突然変異によって引き起こされる。具体的には、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）は、DNM2遺伝子における突然変異から生じる。AD-CNMは、再生過程の非存在下で筋線維の中心に位置する核が高頻度で発生することを特徴とする稀な先天性ミオパシーである。AD-CNMは、重篤な新生児型から軽度の成人型まで広範囲にわたる臨床スペクトルに関連している。一般に、運動のマイルストーンが遅れ、そして、主に顔面筋及び肢筋がびまん性骨格筋脱力に冒される。筋脱力は、緩徐進行性であるが、４０代の間に独立歩行が失われる場合がある。重篤かつ早期発症型のCNMでは、小児科患者は、通常、全身性脱力、筋緊張低下、開口、眼瞼下垂、及び眼筋麻痺を伴う中等度の顔面脱力を有する。AD-CNMに利用可能な根治的処置は存在しない。
【0004】
DNM2遺伝子における突然変異は、シャルコー・マリー・ツース病及び遺伝性痙性対麻痺の稀な症例にも関与している。シャルコー・マリー・ツース病（CMT）は、身体の様々な部分にわたる筋組織及び触覚の進行性消失を特徴とする遺伝性運動感覚性ニューロパシーである。遺伝性痙性対麻痺（HSP）は、可変比率で生じる下肢の痙縮及び脱力を特徴とする遺伝性疾患である。DNM2遺伝子における約３０のヘテロ接合型突然変異が、AD-CNM、CMT、又はHSPの疾患に関与していると同定されているが、それらに対して利用可能な根治的処置は存在しない。
【0005】
突然変異の非存在下におけるDNM2の過剰発現は、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌等の他の疾患の幾つかの病態生理学的機序にも関与している。
【0006】
したがって、DNM2のヘテロ接合型突然変異及び／又は過剰発現によって引き起こされる疾患を処置するための治療用化合物及び方法が差し迫って必要とされている。
【0007】
DNM2の過剰発現に関連する病状を処置するために、従来のsiRNA又は薬理学的阻害剤を用いてダイナミン２を阻害するストラテジーが、幾つかの研究チームによって開発されている。本発明は、正常な細胞機能を可能にするのに十分な量の機能的DNM2を保持しながら、突然変異した又は過剰発現したダイナミン２を阻害することができるこれらストラテジーの改良に関する。
【0008】
発明の概要
一態様では、本発明は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）を提供する。具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９～２３、好ましくは１９塩基対長である。
一態様では、本発明は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）を提供する。具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９～２３、好ましくは１９塩基対長である。
【0009】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができ、該DNM2遺伝子は、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である及び／又は疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である。
【0010】
具体的には、本発明のAS-siRNAは、該非病理学的多型を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする。具体的な実施態様では、該非病理学的多型は、疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在する。より具体的には、該非病理学的多型は、rs2229920（Ｃ又はＴ）又はrs12461992（Ａ又はＴ）、好ましくはrs2229920（Ｃ又はＴ）である。
【0011】
より具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９塩基対長であり、そして、ミスマッチを含む。このミスマッチにより、他のアレルを保持しながら、該多型を有するアレルのみをAS-siRNAが特異的に標的とし、そして、サイレンシングすることが可能になる。具体的な実施態様では、ミスマッチの位置は、該AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ１６又はＮ１７位、好ましくはＮ１７位に位置する。
【0012】
具体的には、AS-siRNAは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４、好ましくは、配列番号１又は配列番号２からなる群から選択されるセンス鎖を含む。
【0013】
別の具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする。より具体的には、疾患を引き起こす突然変異は、1393C>T；c.1105C>T、c.1106G>A、c.1393C>T、c.1856C>T、又はc.1948G>A、好ましくは1393C>Tである。具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９塩基対長であり、そして、ミスマッチを含む。このミスマッチにより、野性型アレルを保持しながら、該突然変異体アレルをAS-siRNAが特異的に標的とし、そして、サイレンシングすることが可能になる。具体的な実施態様では、ミスマッチの位置は、該AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、又はＮ１６位、好ましくはＮ９又はＮ１０位、そして、より好ましくはＮ９位に位置する。
【0014】
具体的には、AS-siRNAは、配列番号５～配列番号１０、好ましくは、配列番号５又は配列番号６、そして、より好ましくは配列番号５からなる群から選択されるセンス鎖を含む。
【0015】
幾つかの実施態様では、本発明のAS-siRNAは、DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を２０～６０％、好ましくは約５０％低減することができる。
【0016】
本発明の別の態様は、本発明のAS-siRNAをコードしているベクターであって、好ましくは、プラスミド又はウイルスのベクター、例えば、AAVベクターであるベクターに関する。
【0017】
本発明は、また、本発明のベクターがトランスフェクト又は形質導入された標的細胞に関する。
【0018】
更なる態様では、本発明は、標的細胞内のDNM2遺伝子の野生型アレルの発現をサイレンシングすることなく、DNM2遺伝子の突然変異型アレルの発現をサイレンシングするインビトロ法であって、該標的細胞に本発明のAS-siRNA又はベクターを導入することを含む方法を提供する。
【0019】
別の態様によれば、ダイナミン２の過剰発現に関連する疾患を処置する、好ましくは、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌を処置する方法において使用するための、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞が本明細書に開示される。
【0020】
本発明の別の態様は、DNM2遺伝子における疾患を引き起こす突然変異によって誘導される疾患を処置する、好ましくは、常染色体優性中心核ミオパシー、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病、又は遺伝性痙性対麻痺を処置する、そして、より好ましくは、常染色体優性中心核ミオパシーを処置する方法において使用するための、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞に関する。
【0021】
本発明の他の態様及び実施態様は、以下の詳細な説明において明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ヘテロ接合型マウス胎仔線維芽細胞（MEF）におけるアレル特異的siRNAのスクリーニング。（Ａ）ヌクレオチド変化の領域における野生型（WT）及び突然変異型（R465W）のmRNA配列に加えて、単一点突然変異を標的とする１９の可能性のあるsiRNA（該mRNA配列に対して相補的ではないsiRNAセンス鎖）の配列を示す。矢印は、この試験で評価した１２のsiRNAを示す。（Ｂ）突然変異型ヌクレオチドを中心とするDnm2 RT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動におけるEcoNI切断プロファイル。siRNAとWT配列との間に導入されたミスマッチの位置に対してsiRNAを付番する。Sc：スクランブルsiRNA。NT：非トランスフェクト細胞。ヒストグラムは、各siRNAについて計算されたHTZ／WT比の平均±SEMを表す。＊スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．０５（ｎ＝５）。
【図2】ヘテロ接合型マウス胎仔線維芽細胞（MEF）におけるアレル特異的si9及びsi10。（Ａ）Dnm2及びGapdhのmRNAについてのRT-PCR産物のアガロースゲル、並びにローディング対照として用いたGapdhに対して正規化されたDnm2発現の定量。（Ｂ）si9、si10、及びスクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞からのDnm2アンプリコンの配列。四角は、突然変異型ヌクレオチド（スクランブルsiRNAのＮ＝Ｔ及びＡ）を示す。（Ｃ）アガロースゲル電気泳動におけるDnm2アンプリコンのEcoNI切断プロファイル、及び突然変異体／WT比の定量。（Ｄ）処理細胞及び対照細胞におけるDnm2に対する代表的なウエスタンブロット、並びにデンシトメトリーによるシグナルの定量。Gapdhをローディング対照として用いた。Sc：スクランブルsiRNA。NT：非トランスフェクト細胞。Ａ、Ｃ、及びＤでは、ヒストグラムは平均±SEMを表す。＊＊スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．００１（ｎ＝５）。
【図3】si9及びsi10は、マウス筋芽細胞におけるアレル特異的siRNAである。１００nM siRNAを４８時間かけて細胞にトランスフェクトした。（Ａ）不死化マウス筋芽細胞におけるデスミン免疫染色の代表的な画像。スケールバー＝５０μm。（Ｂ）siRNAがトランスフェクトされた筋芽細胞からのDnm2及びGapdhの半定量的RT-PCR産物、並びにGapdhに対して正規化されたDnm2発現の定量。（Ｃ）RT-PCR及びEcoNI切断後の突然変異型及びWTのDnm2転写物の定量、並びにGapdh発現に対する正規化。散布図のバーは、平均±SEMを表す。＊スクランブル値と比較した片側マンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．０５（ｎ＝４）。
【図4】TA筋における収縮特性。P0：絶対力。sP0：特定最大強縮力。mo：月。ｎ：分析した筋肉数。マンホイットニーＵ検定を用いて統計比較を実施した。WTに対する統計解析：ａ：Ｐ＜０．０５及びｂ：Ｐ＜０．００１。HTZ noShに対する統計解析：ｃ：Ｐ＜０．０５、ｄ：Ｐ＜０．０１、及びｅ：Ｐ＜０．００１。
【図5】マウスにおけるshAAVが形質導入された筋肉の分子的及び組織学的特徴。（Ａ）shAAVが形質導入されたHTZ TA筋からのDnm2及びGapdhのmRNAについてのRT-PCR産物のアガロースゲル、並びにローディング対照として用いたGapdhに対して正規化されたDnm2発現の定量。WT筋肉を対照として含めた。ヒストグラムは、平均±SEMを表す。＊nosh値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．０５（ｎ＝５）。（Ｂ）sh9-、sh10-、及びnosh-AAVを形質導入したTA筋肉からのDnm2アンプリコンの配列。四角は、突然変異型ヌクレオチド（Ｎ＝Ｔ及びＡ）の位置を示す。（Ｃ）アガロースゲル電気泳動におけるDnm2アンプリコンのEcoNI切断プロファイル、及び突然変異体／WT比の定量。ヒストグラムは、平均±SEMを表す。＊nosh値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．０５（ｎ＝５）。（Ｄ）WTマウス及びshAAV又は空AAVを形質導入したHTZマウスからのTA切片の代表的な組織化学的染色。HE：ヘマトキシリンエオシン染色。DPNH：還元ジホスホピリジンヌクレオチドジアホラーゼ染色。スケールバー＝５０μm。（Ｅ）形質導入HTZ TA筋における線維サイズの頻度の定量。WT筋肉を対照として用いた（条件あたりｎ＝３）。
【図6】患者由来の線維芽細胞におけるsi9及びsi10のアレル特異性。（Ａ）Dnm2及びGapdhのmRNAについてのRT-PCR産物のアガロースゲル、並びにローディング対照として用いたGapdhに対して正規化されたDnm2発現の定量。（Ｂ）si9、si10、及びスクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞からのDnm2アンプリコンの配列。四角は、突然変異型ヌクレオチド（スクランブル及びsi10 siRNAのＮ＝Ｔ及びＣ）を示す。（Ｃ）アガロースゲル電気泳動におけるDnm2アンプリコンのPfoI切断プロファイル、及び突然変異体／WT比の定量。（Ｄ）処理細胞及び対照細胞におけるDnm2に対する代表的なウエスタンブロット、並びにデンシトメトリーによるシグナルの定量。Gapdhをローディング対照として用いた。Sc：スクランブルsiRNA。NT：非トランスフェクト細胞。Ａ、Ｃ、及びＤでは、ヒストグラムは平均±SEMを表す。スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いて＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ＝５）。
【図7】１００nMでヒト線維芽細胞においてsi9によって誘導されたアレル特異的サイレンシング。（Ａ）１００nM siRNAをトランスフェクトした４８時間後のDnm2及びHPRTのRT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動。NT：非トランスフェクト細胞。ヒストグラムは、HPRTに対して正規化されたDNM2の平均±SEMを表す。＊＊スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．００１（ｎ＝５）。（Ｂ）アガロースゲル電気泳動におけるDNM2アンプリコンのBglI切断プロファイル、及び突然変異体／WT比の定量。ヒストグラムは、平均±SEMを表す。＊＊スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いてＰ＜０．００１（ｎ＝５）。（Ｃ）１００nM si9及びスクランブルsiRNAをトランスフェクトした４８時間後のヒト線維芽細胞の代表的な写真。
【図8】線維芽細胞におけるトランスフェリン取り込みアッセイ。（Ａ）患者由来の線維芽細胞におけるトランスフェリン取り込みアッセイ。３７℃で１５分間インキュベートした後にトランスフェリンの取り込みを定量した。ヒストグラムは平均±SEMを表し（各細胞株について２回の独立した実験からｎ＝６５細胞）、そして、スチューデントｔ検定を用いて統計解析を実施した（＊＊＊２つの対照細胞株に対してｐ＜０．０００１）。（Ｂ）健常対照線維芽細胞におけるトランスフェリン取り込みアッセイ。３７℃で１５分間インキュベートした後にトランスフェリンの取り込みを定量した。ヒストグラムは平均±SEMを表し（各細胞株について２回の独立した実験からｎ＝６５細胞）、そして、スチューデントｔ検定を用いて統計解析を実施したところ、各対照細胞株についてスクランブルの値とsi9の値との間に有意な差を示さなかった。
【図9】ヒト細胞における非病理学的多型に対するアレル特異的siRNAの開発。（Ａ）ヘテロ接合型多型の２つのバージョン（Ｔ又はＣ）に対する、siRNAをトランスフェクトしたヒト線維芽細胞（３０nMで４８時間）からのDNM2及びHPRTのmRNAのRT-PCR産物のアガロースゲル。スクランブル：スクランブルsiRNA。NT：非トランスフェクト細胞。（Ｂ）DNM2／HPRT比の定量。ヒストグラムは、平均±SEMを表す。スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いて＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１（NT、スクランブル、si17-713Cについてはｎ＝８。si16-713Cについてはｎ＝６。si17-713Tについてはｎ＝２）。Sc：スクランブルsiRNA。
【図10】ヘテロ接合型多型に対するsiRNAのアレル特異性。（Ａ）siRNAをトランスフェクトした細胞（３０nMで４８時間）又は非トランスフェクト細胞（NT）からのDNM2 RT-PCR産物の代表的なアガロースゲル。この患者由来の細胞株では、突然変異は、多型のバージョンＣとインフレームである。WT非切断アレルと突然変異型切断アレルとを識別するために、RT-PCR産物をBglI切断に供する。（Ｂ）突然変異体／WT比及びWT／HPRT比の定量。ヒストグラムは、平均±SEMを表す。スクランブル値と比較したマンホイットニーＵ検定を用いて＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１（NT、Sc、si17-713Cについてはｎ＝８。si16-713Cについてはｎ＝６。si17-713Tについてはｎ＝２）。Sc：スクランブルsiRNA。NT：非トランスフェクト細胞。
【図11】ヘテロ接合型多型に対するアレル特異的siRNAの長さの改変。（Ａ）siRNAの配列。下線付き配列は、１７位に多型（太字のＣ）を有する１９bp長のsiRNAの配列を示す。太字は、改変されたsiRNAにおける追加の塩基を示す。（Ｂ）全DNM2のRT-PCR産物（上のパネル）、BglIによって切断されたRT-PCR産物（中央のパネル）、及びHPRTのRT-PCR産物（下のパネル）のアガロースゲル。（Ｃ）合計DNM2／HPRT比の定量。（Ｄ）アレルＣ／アレルＴ比の定量。Ｃ及びＤでは、ヒストグラムは平均±SEMを表す（ｎ＝２）。
【0023】
発明を実施するための形態
発明の詳細な説明
本開示は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現を効率的にサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）であって、DNM2関連疾患を処置するために使用されるAS-siRNAの予想外の発見に基づく。
発明の詳細な説明
本開示は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現を効率的にサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）であって、DNM2関連疾患を処置するために使用されるAS-siRNAの予想外の発見に基づく。
【0024】
ダイナミン２は、DNM2遺伝子（Gene ID 1785）によってコードされている。より正確には、DNM2遺伝子は、１９番染色体の短腕内の１３．２の位置（19p13.2）に位置する。ダイナミン２の遺伝子又は遺伝子産物は、CMT2M、CMTDI1、CMTDIB、DI-CMTB、DYN2、DYN2_HUMAN、dynamin II、DYNIIを含むがこれらに限定されない他の名称によっても知られている。DNM2は、エンドサイトーシス及び細胞の構造フレームワーク（細胞骨格）において重要な役割を有している。このタンパク質は、構造を提供するためにフィラメントを構築する微小管及びアクチンを含む細胞骨格の複数の部分と相互作用する。これら細胞骨格の部分は、細胞内の分子の運動、細胞の形状、細胞の可動性、及び細胞の互いの又は細胞外マトリクスへの接着に関与している。したがって、DNM2遺伝子の変化は、エンドサイトーシスを妨害し、そして、細胞骨格の配置又はダイナミクスに干渉して、異常な細胞機能を引き起こす可能性がある。既に記載した通り、常染色体優性中心核ミオパシー、シャルコー・マリー・ツース病、及び遺伝性痙性対麻痺等の幾つかの優性遺伝性疾患は、DNM2遺伝子のヘテロ接合型突然変異によって引き起こされる。また、DNM2の過剰発現も病理学的であり、そして、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌等の他の疾患の幾つかの病態生理学的機序に関与している。
【0025】
本発明者らは、他のDNM2アレルを保持しながら、DNM2の一方のアレルのみの発現を特異的に抑制することに基づく治療アプローチについて調べた。一方では、このストラテジーは、DNM2の過剰発現に関連する疾患の場合、制御された方法でDNM2発現レベルを低下させることを目的とする。他方、このストラテジーは、正常な細胞機能に必要な野生型DNM2アレルのレベルを低下させることなく、突然変異体アレルの発現を特異的に阻害することによって、DNM2遺伝子におけるヘテロ接合型突然変異に起因する常染色体優性遺伝性疾患において有用であろう。この目的のために、本発明者らは、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみを制御された方法で阻害することができる、非常に効率的なアレル特異的siRNAを発見した。
【0026】
したがって、本発明の第１の態様は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA（AS-siRNA）である。
【0027】
RNA干渉は、典型的には特定のmRNA分子の破壊を引き起こすことによって、RNA分子が遺伝子発現を阻害する生物学的プロセスである。したがって、干渉RNAは、標的タンパク質の発現をダウンレギュレーションすることができるRNAである。例えば、それは、低分子干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、一本鎖RNA（ssRNA）、及び短いヘアピン型RNA（shRNA）の分子を包含する。RNA干渉とは、dsRNAが、転写後レベルにおいて標的遺伝子の発現を特異的に抑制する現象のことをいう。正常状態では、RNA干渉は、数千塩基対長の二本鎖RNA分子（dsRNA）によって開始される。インビボでは、細胞に導入されたdsRNAが、DICERと呼ばれる酵素によってsiRNAと呼ばれる短いdsRNA分子の混合物に切断される。哺乳類細胞では、Dicerによって生成されたsiRNAは、約２１塩基対（bp）長である。次いで、siRNAは、同種mRNAに対して作用し、そして、それを分解するRNase複合体RISC（RNA誘導サイレンシング複合体）に取り込まれる。また、RNA干渉は有用な研究ツールでもあるが、その理由は、１９～２３bpの二本鎖siRNAを使用して、対象となる特定の遺伝子の抑制を選択的かつロバストに誘導することができるためである。このアプローチの主な関心は特異性であるが、その理由は、単一ヌクレオチドのみが異なる場合であっても、siRNAが２つの配列を識別することができるためである。
【0028】
本発明者らは、ヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルを特異的に阻害するためにsiRNAのこの特異性を使用した。その結果、その特定の場合において、siRNAは「アレル特異的siRNA」（AS-siRNA）と呼ばれる。
【0029】
AS-siRNAとは、標的遺伝子の一方のアレルのみを特異的にサイレンシングすることができる任意のsiRNAを意味し、アレルは、染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの択一形態のうちの１つである。「遺伝子サイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制又は低減を指す。遺伝子サイレンシングは、転写に影響を与えるプロセス及び／又は転写後機構に影響を与えるプロセスを通して媒介され得る。幾つかの実施態様では、遺伝子サイレンシングは、siRNAがRNA干渉を介して配列特異的に遺伝子のmRNAの分解を開始させたときに生じる。したがって、遺伝子は、コード配列及び／又は発現に必要な制御配列を含む。例えば、「遺伝子」とは、mRNA、機能RNA、又は特定のタンパク質（制御配列を含む）を発現する核酸断片を指す。また、「遺伝子」は、例えば他のタンパク質についての認識配列を形成することができる、非発現DNAセグメントも含む。
【0030】
本発明の状況では、遺伝子は、ダイナミン２タンパク質をコードしているDNM2遺伝子である。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の変異体形態であるDNM2遺伝子の一方のアレルを特異的にサイレンシングする。
【0031】
本発明の状況では、DNM2遺伝子は、ヘテロ接合型DNM2遺伝子である。ヘテロ接合型DNM2遺伝子は、細胞内においてヘテロ接合型状態で存在するDNM2遺伝子である。「ヘテロ接合型」とは、所与の染色体座が２つの異なるアレルを有することを意味する。ヒト等の二倍体生物は、相同染色体と呼ばれる、２コピーの各染色体（一方は母系染色体、そして、もう一方は父系染色体）を含有する。したがって、各相同染色体は、所与の遺伝子の一方のアレルを有する。二倍体生物は、所与の遺伝子の該２つのアレルが所与の変異又は多型に関して異なる場合、ヘテロ接合型である。
【0032】
本発明の状況では、細胞又は生物は、DNM2遺伝子に関してヘテロ接合型であり、該DNM2遺伝子は、ヘテロ接合型状態で存在する、すなわち、DNM2遺伝子の２つのアレルは、所与の変異又は多型に関して異なる。
【0033】
本発明の一実施態様では、ヘテロ接合型とは、一方のアレルが野生型DNM2配列を有し、そして、他方のアレルがDNM2変異体をコードしている配列を有する遺伝子型を指す。具体的には、DNM2変異体をコードしている配列は、野生型配列に存在しない突然変異を含む。
【0034】
第１の好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である。この実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とする。
【0035】
第２の好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である。この第２の実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該非病理学的多型を含むか又は含まない、DNM2遺伝子のアレルの一方のみを標的とする。
【0036】
以下では、これら２つの好ましい実施態様について別々に説明する。
【0037】
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAS-siRNA
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子
本発明の一実施態様では、DNM2遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である。したがって、DNM2遺伝子は、２つのアレルに対応する２つの異なる形態で存在する：一方のDNM2アレルは「野生型アレル」であるのに対して、他方は「突然変異体アレル」である。この実施態様では、本発明のAS-siRNAは、野生型アレルを標的とすることなく、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを特異的に標的とし、そして、サイレンシングする。したがって、AS-siRNAは、野生型アレルに由来するmRNA及びタンパク質の発現に影響を与えることなく、突然変異体アレルに由来するダイナミン２mRNA及びダイナミン２タンパク質の発現をサイレンシングすることができる。
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子
本発明の一実施態様では、DNM2遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である。したがって、DNM2遺伝子は、２つのアレルに対応する２つの異なる形態で存在する：一方のDNM2アレルは「野生型アレル」であるのに対して、他方は「突然変異体アレル」である。この実施態様では、本発明のAS-siRNAは、野生型アレルを標的とすることなく、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを特異的に標的とし、そして、サイレンシングする。したがって、AS-siRNAは、野生型アレルに由来するmRNA及びタンパク質の発現に影響を与えることなく、突然変異体アレルに由来するダイナミン２mRNA及びダイナミン２タンパク質の発現をサイレンシングすることができる。
【0038】
具体的には、疾患を引き起こす突然変異は、病状に関与しているか又は病状に相関しているDNM2遺伝子内のヌクレオチドの任意の欠失、挿入、又は置換であり得る。好ましい実施態様では、疾患を引き起こす突然変異は、優性突然変異である。優性突然変異とは、優性アレルを生じさせる任意の突然変異を意味する。「優性アレル」とは、同じ遺伝子の劣性アレルの存在よりも上位で表現型に対してその効果を発揮するアレルを意味する。優性アレル及び劣性アレルという用語は、互いに対して相対的に定義され、そして、絶対的なものではない。言い換えれば、１つの突然変異体アレルと１つの野生型アレルとを有するヘテロ接合型個体では、優性突然変異の表現型の結果が観察される。劣性アレルは、個体が２コピーの突然変異型アレル（ホモ接合型としても知られている）又は２つの異なる突然変異型アレル（複合ヘテロ接合型としても知られている）を有する場合にのみにその効果を示す。
【0039】
具体的な実施態様では、優性突然変異は、機能獲得型突然変異である。機能獲得型突然変異は、タンパク質に対して新しい又は強化された活性を付与する突然変異として定義される。機能獲得型突然変異は、変化した遺伝子産物が新しい分子機能又は新しいパターンの遺伝子発現を有する突然変異の一種である。したがって、DNM2内の疾患を引き起こす突然変異は、機能獲得型のダイナミン２タンパク質を生じさせる。
【0040】
具体的な実施態様では、優性突然変異は、優性阻害効果による機能喪失型突然変異である。機能喪失型突然変異は、タンパク質の正常な活性を喪失又は減少させる突然変異として定義される。優性阻害効果は、突然変異型アレルの産物が野生型アレルからの産物の機能を変化させると定義される。これは、例えば、タンパク質の正常な機能にオリゴマー形成が必要なとき及び突然変異型タンパク質が野生型タンパク質とオリゴマー形成することができるときに生じる。したがって、DNM2内の疾患を引き起こす突然変異は、突然変異型ダイナミン２タンパク質の存在により、機能喪失型の野生型ダイナミン２タンパク質を生じさせる。
【0041】
別の具体的な実施態様では、疾患を引き起こす突然変異についてヘテロ接合型であるDNM2遺伝子は、ハプロ不全ではない。ハプロ不全は、遺伝子の１コピーが不活化又は欠失しており、そして、該遺伝子の残りの機能性コピーが、正常機能を保持するのに十分な量の遺伝子産物を生成するのに十分ではないときに生じる。言い換えれば、本発明の野生型DNM2アレルは、本発明のAS-siRNAによって突然変異体アレルをサイレンシングした後、正常機能を保持することができる。したがって、本発明は、好ましくは、ハプロ不全が存在しない常染色体優性疾患に関する。
【0042】
具体的な実施態様では、DNM2遺伝子内の優性突然変異は、常染色体優性疾患を生じさせる。常染色体優性疾患は、個体が常染色体の対において１コピーの突然変異体遺伝子及び１つの正常遺伝子を有する疾患である（常染色体は、性染色体ではない任意の染色体である）。常染色体優性疾患を有する個体は、５０％の確率で、突然変異体遺伝子、ひいては障害をその各次代に伝える。
【0043】
好ましい一実施態様では、常染色体優性疾患は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病（CMT）、又は遺伝性痙性対麻痺（HSP）から選択される。好ましくは、常染色体優性疾患は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）である。
【0044】
別の実施態様では、DNM2遺伝子内の疾患を引き起こす突然変異は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病（CMT）、又は遺伝性痙性対麻痺（HSP）から選択される疾患に関与しているか又は相関している。好ましくは、DNM2遺伝子内の疾患を引き起こす突然変異は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）に関与しているか又は相関している。
【0045】
好ましい実施態様では、DNM2遺伝子内の疾患を引き起こす突然変異は、単一ヌクレオチドの置換であり、より好ましくは、疾患を引き起こす突然変異は、ミスセンス突然変異である。ミスセンス突然変異とは、単一ヌクレオチドの変化によって異なるアミノ酸をコードしているコドンが生じる点突然変異を意味する。具体的な実施態様では、標的アレルは、p.E368K、p.E368Q、p.R369W、p.R369Q、p.V375G、p.R465W、p.R522H、p.R522C、p.R523G、p.E540K、p.E560K、p.D614N、p.A618T、p.A618D、p.S619L、p.S619W、p.L621P、p.624ins-1G、p.V625del、p.P627H、p.P627R、p.KDQ629-631del-ins、p.P647R、及びp.E650Kからなる群から選択されるAD-CNMに関連する少なくとも１つの突然変異、又はp.G358R、p.G537C、p.K554fs、p.D555_E557del、p.K559del、p.K562E、p.K562del、p.L570H、p.M580T、及びp.859-860delからなる群から選択されるCMTに関連する少なくとも１つの突然変異を有するタンパク質をコードしている。これら２つの群の突然変異については、アミノ酸をヒトDNM2アイソフォーム１（NP_001005360.1）に対して付番する。より好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、それぞれDNM2タンパク質配列における以下の置換：p.R465W、p.R369W、p.R369Q、p.R522H、p.S619L、及びp.E650Kに関与しているc.1393C>T；c.1105C>T；c.1106G>A；c.1393C>T；c.1856C>T、又はc.1948G>Aからなる群から選択されるミスセンス突然変異の存在についてヘテロ接合型である。更により好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、DNM2タンパク質配列におけるp.R465W置換に関与しているc.1393C>T突然変異の存在についてヘテロ接合型である。
【0046】
AS-siRNA
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の突然変異体アレルに由来する遺伝子転写物（メッセンジャーRNA又はmRNA）に特異的にハイブリダイズすることによって、DNM2遺伝子の該突然変異体アレルをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該突然変異体アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約１００％に等しい。
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の突然変異体アレルに由来する遺伝子転写物（メッセンジャーRNA又はmRNA）に特異的にハイブリダイズすることによって、DNM2遺伝子の該突然変異体アレルをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該突然変異体アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約１００％に等しい。
【0047】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする。したがって、本発明のAS-siRNAは、該疾患を引き起こす突然変異を含むmRNAの配列に対して相補的である。siRNAの特異性によって、単一ヌクレオチドだけが異なる場合であっても、２つの配列を識別することが可能になる。この特性により、本発明のAS-siRNAが、単一ヌクレオチド置換を生じさせる突然変異等の疾患を引き起こす突然変異を標的とすることが可能になる。
【0048】
本発明の一実施態様では、AS-siRNAは、１９～２３、例えば、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基対長である。好ましい具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９塩基対長である。
【0049】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、各鎖の３’末端にヌクレオチドの突出を含む。より具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、各鎖の３’末端に２つのデオキシチミジン（dTdT）で構成されるジヌクレオチドの突出を含む。
【0050】
幾つかの実施態様では、本発明のAS-siRNAは、（突然変異体アレルによってコードされている）該疾患を引き起こす突然変異を含む突然変異体DNM2 mRNA配列に対して完全に相補的である。他方、本発明のAS-siRNAは、突然変異体mRNAと比較したとき、ヌクレオチドが突然変異していない位置における単一ヌクレオチドのミスマッチを除いて、（野生型アレルによってコードされている）野生型DNM2 mRNA配列に対して相補的である。このミスマッチにより、野性型アレルを保持しながら、該突然変異体アレルをAS-siRNAが特異的に標的とし、そして、サイレンシングすることが可能になる。
【0051】
具体的な実施態様では、DNM2遺伝子は、DNM2タンパク質配列におけるp.R465W置換に関与しているc.1393C>T突然変異の存在についてヘテロ接合型であり、そして、本発明のAS-siRNAは、１９塩基対長である。したがって、該ミスマッチの位置は、AS-siRNA内の１９の可能性のある位置のうちのいずれかであり得る。
【0052】
好ましい実施態様では、ミスマッチの位置は、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、又はＮ１６位に位置する。より好ましくは、ミスマッチの位置は、Ｎ９又はＮ１０位、そして、更により好ましくはＮ９位に位置する。「センス鎖」とは、該疾患を引き起こす突然変異を含む標的突然変異体アレルと同じ配列を有するAS-siRNAの鎖を意味する。したがって、AS-siRNAの他の鎖は「アンチセンス」と呼ばれるが、その理由は、その配列が、「センス」配列と呼ばれる標的突然変異体DNM2 mRNAに対して相補的であるためである（その結果、mRNAのセンスセグメント「5'-AAGGUC-3’」は、アンチセンスmRNAセグメント「3'-UUCCAG-5’」にハイブリダイズする）。
【0053】
「センス鎖の５’末端からＮ９位」とは、（標的配列と同じ配列を有する）センス鎖の５’末端から９番目のヌクレオチドを意味する。センス鎖の５’末端からＮ９位は、siRNAが１９塩基対長であるとき、アンチセンス鎖の５’からＮ１１位に対応する。
【0054】
具体的な実施態様では、本発明は、センス鎖が配列番号５～配列番号１０、好ましくは、配列番号５又は配列番号６、そして、より好ましくは配列番号５からなる群から選択される配列を含む、１９～２３塩基対長のAS-siRNAに関する。
【0055】
より具体的な実施態様では、本発明は、センス鎖が配列番号５～配列番号１０、好ましくは、配列番号５又は配列番号６、そして、より好ましくは配列番号５からなる群から選択される配列からなる、１９～２３塩基対長のAS-siRNAに関する。
【0056】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、全DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を２０～６０％、例えば、２０、３０、４０、５０、又は６０％低減するために使用される。好ましくは、本発明のAS-siRNAは、全DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を約５０％低減するために使用される。「約」とは、＋又は－１０％、好ましくは＋又は－５％の値を意味する。例えば、約５０％は、４５～５５％、好ましくは、４７．５％～５２．５％を意味する。
【0057】
非病理学的多型を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAs-siRNA
非病理学的多型を含むDNM2遺伝子
本発明の別の態様は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるAs-siRNAに関し、該DNM2遺伝子は、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である。
非病理学的多型を含むDNM2遺伝子
本発明の別の態様は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるAs-siRNAに関し、該DNM2遺伝子は、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である。
【0058】
具体的な実施態様では、DNM2遺伝子は、一般的なヘテロ接合型非病理学的多型を含む。「一般的なヘテロ接合型非病理学的多型」とは、高いヘテロ接合型頻度を有する、すなわち、ヘテロ接合型状態で集団中に高頻度で存在する多型を指す。「高頻度」とは、母集団の少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも４０％がヘテロ接合型状態でみられる多型を意味する。
【0059】
「非病理学的多型」とは、疾患に関連しない遺伝子の核酸配列における変異を意味する。したがって、本発明によれば、非病理学的多型は、他の配列改変とは独立であると考えられるとき、単独では病状に関連していない遺伝子における配列変異に対応する。明確にするために、非病理学的多型が細胞内でヘテロ接合型である場合、それは、同じ遺伝子で生じる可能性のある他の配列変異とは独立であると考えられるとき、両多型が非病理学的であると考えられることを意味する。非病理学的多型は、コード領域及び非コード領域に変異を含み得る。更に、非病理学的多型は、病状を引き起こさないミスセンス及びナンセンスの突然変異を生じさせるものを含む、ヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は付加を含む。好ましくは、非病理学的多型は、単一ヌクレオチド置換である。
【0060】
ヘテロ接合型の一般的な多型を標的とすることによって、本発明のAS-siRNAは、特に突然変異の非存在下でのDNM2の過剰発現が病理学的状態に関連するとき、DNM2タンパク質の発現を減少させるために使用することができる。例えば、突然変異の非存在下におけるDNM2タンパク質の過剰発現は、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌に相関する。したがって、本発明は、非病理学的多型を含むDNM2アレルを標的とするAS-siRNAに関する。
【0061】
別の実施態様では、非病理学的多型を含むDNM2アレルは、ヘテロ接合型の疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在する。各特定の疾患を引き起こす突然変異ではなくヘテロ接合型の一般的な多型を標的とすることによって、単一のAS-siRNAを用いて、１人超の患者における１超の疾患を引き起こす突然変異の発現を阻害することができる。したがって、一実施態様では、ヘテロ接合型の非病理学的多型の標的バージョンは、該疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在し、そして、他のバージョンの多型を有する野生型アレルには存在しない。言い換えれば、ヘテロ接合型の非病理学的多型を標的とすることによって、突然変異体及び野生型のDNM2アレルを区別することが可能になる。該疾患を引き起こす突然変異は、疾患に関与しているか又は関連しているDNM2遺伝子内の任意のヘテロ接合型突然変異であってよい。例えば、DNM2遺伝子内の疾患を引き起こす突然変異は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病（CMT）、又は遺伝性痙性対麻痺（HSP）から選択される疾患に関与しているか又は相関している。好ましくは、DNM2遺伝子内の疾患を引き起こす突然変異は、常染色体優性中心核ミオパシー（AD-CNM）に関与しているか又は相関している。より好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、それぞれDNM2タンパク質配列における以下の置換：p.R465W、p.R369W、p.R369Q、p.R522H、p.S619L、及びp.E650Kに関与しているc.1393C>T；c.1105C>T；c.1106G>A；c.1393C>T；c.1856C>T、又はc.1948G>Aからなる群から選択されるミスセンス突然変異の存在についてヘテロ接合型である。更により好ましい実施態様では、DNM2遺伝子は、DNM2タンパク質配列におけるp.R465W置換に関与しているc.1393C>T突然変異の存在についてヘテロ接合型である。
【0062】
具体的な実施態様では、ヘテロ接合型の非病理学的多型は、rs2229920（Ｃ又はＴ）又はrs12461992（Ａ又はＴ）、好ましくはrs2229920（Ｃ又はＴ）である。
【0063】
AS-siRNA
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の該アレルに由来する遺伝子転写物（メッセンジャーRNA又はmRNA）に特異的にハイブリダイズすることによって、ヘテロ接合型の非病理学的多型を含むDNM2遺伝子の一方のアレルのみをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約１００％に等しい。
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の該アレルに由来する遺伝子転写物（メッセンジャーRNA又はmRNA）に特異的にハイブリダイズすることによって、ヘテロ接合型の非病理学的多型を含むDNM2遺伝子の一方のアレルのみをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約１００％に等しい。
【0064】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該非病理学的多型を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする。したがって、本発明のAS-siRNAは、該非病理学的多型を含むmRNAの配列に対して相補的である。siRNAの特異性によって、単一ヌクレオチドだけが異なる場合であっても、２つの配列を識別することが可能になる。この特性により、本発明のAS-siRNAが、単一ヌクレオチド置換を生じさせる多型を標的とすることが可能になる。
【0065】
具体的な一実施態様では、標的アレル（そして、結果的には標的mRNA）は、DNM2のmRNA及び／又はタンパク質のレベルを低下させるために、疾患を引き起こす突然変異の非存在下で任意に選択することができる。具体的には、本発明のAS-siRNAは、目的がDNM2 mRNA又はDNM2タンパク質の合計レベルを低下させることのみであるとき、該非病理学的多型を有する又は有しないmRNAを標的とすることができる。例えば、本発明のAS-siRNAは、DNM2が細胞内、例えば、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌において過剰発現している、ヘテロ接合型の非病理学的多型の２つのバージョンのうちの１つを有するDNM2アレルのいずれか１つを標的とすることができる。
【0066】
別の具体的な実施態様では、非病理学的多型の標的バージョンは、疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在する。したがって、本発明のAS-siRNAは、該多型の標的バージョン及び該疾患を引き起こす突然変異を有するアレルのみを標的とし、そして、サイレンシングする。この具体的な実施態様は、疾患を引き起こす突然変異の位置を予め確認しておくことを必要とする。
【0067】
本発明の一実施態様では、AS-siRNAは、１９～２３、例えば、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基対長である。好ましい具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、１９塩基対長である。
【0068】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、各鎖の３’末端にヌクレオチドの突出を含む。より具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、各鎖の３’末端に２つのデオキシチミジン（dTdT）で構成されるジヌクレオチドの突出を含む。
【0069】
幾つかの実施態様では、本発明のAS-siRNAは、該非病理学的多型の標的バージョンを含むDNM2 mRNA配列に対して完全に相補的である。他方、本発明のAS-siRNAは、多型が存在しない位置における１つの単一ヌクレオチドミスマッチを除いて、（他のアレルによってコードされている）該多型を含まないDNM2 mRNA配列に対して相補的である。このミスマッチにより、他のアレルを保持しながら、該多型を有するアレルのみをAS-siRNAが特異的に標的とし、そして、サイレンシングすることが可能になる。
【0070】
具体的な実施態様では、DNM2遺伝子は、非病理学的多型rs2229920（Ｃ又はＴ）の存在についてヘテロ接合型であり、該多型は、個体の４０％においてヘテロ接合型状態でみられる。したがって、本発明は、Ｃを含む配列又はＴ（mRNA配列ではＵに対応）を含む配列のいずれかを標的とするAS-siRNAに関する。
【0071】
好ましい実施態様では、本発明のAS-siRNAは、非病理学的多型rs2229920（Ｃ又はＴ）を標的とし、そして、１９塩基対長である。したがって、該ミスマッチの位置は、AS-siRNA内の１９の可能性のある位置のうちのいずれかであり得る。
【0072】
好ましい実施態様では、ミスマッチの位置は、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ１６又はＮ１７位に位置する。より好ましくは、ミスマッチの位置はＮ１７位に位置する。「センス鎖」とは、該非病理学的多型を含む標的アレルと同じ配列を有するAS-siRNAの鎖を意味する。したがって、AS-siRNAの他の鎖は「アンチセンス」と呼ばれるが、その理由は、その配列が、「センス」配列と呼ばれる標的DNM2 mRNAに対して相補的であるためである（その結果、mRNAのセンスセグメント「5'-AAGGUC-3’」は、アンチセンスmRNAセグメント「3'-UUCCAG-5’」によってブロックされる）。
【0073】
「センス鎖の５’末端からＮ１７位」とは、（標的配列と同じ配列を有する）センス鎖の５’末端から１７番目のヌクレオチドを意味する。センス鎖の５’末端からＮ１７位は、siRNAが１９塩基対長であるとき、アンチセンス鎖の３’からＮ３位に対応する。
【0074】
具体的な実施態様では、本発明は、センス鎖が配列番号１～配列番号４、好ましくは、配列番号１又は配列番号２からなる群から選択される配列を含む、１９～２３塩基対長のAS-siRNAに関する。
【0075】
より具体的な実施態様では、本発明は、センス鎖が配列番号１～配列番号４、好ましくは、配列番号１又は配列番号２からなる群から選択される配列からなる、１９～２３塩基対長のAS-siRNAに関する。
【0076】
具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を２０～６０％、例えば、２０、３０、４０、５０、又は６０％低減するために使用される。好ましくは、本発明のAS-siRNAは、DNM2 mRNA及び／又はDNM2タンパク質の発現を約５０％低減するために使用される。「約」とは、＋又は－１０％、好ましくは＋又は－５％の値を意味する。例えば、約５０％は、４５～５５％、好ましくは、４７．５％～５２．５％を意味する。
【0077】
AS-siRNAの方法及び使用
本発明は、本発明のAS-siRNAを標的mRNAに到達させる様々な方法を企図する。AS-siRNAは、直接、又はトランスフェクション試薬、例えば、脂質誘導体、リポソーム、リン酸カルシウム、ナノ粒子、マイクロインジェクション、若しくはエレクトロポレーションを用いて、単離オリゴヌクレオチドとして細胞に投与され得る。
本発明は、本発明のAS-siRNAを標的mRNAに到達させる様々な方法を企図する。AS-siRNAは、直接、又はトランスフェクション試薬、例えば、脂質誘導体、リポソーム、リン酸カルシウム、ナノ粒子、マイクロインジェクション、若しくはエレクトロポレーションを用いて、単離オリゴヌクレオチドとして細胞に投与され得る。
【0078】
別の実施態様では、本発明は、ベクターの形態でAS-siRNAを細胞に導入することを企図する。したがって、本発明の別の態様は、本発明のAS-siRNAをコードしているベクターに関する。ベクターは、具体的には、プラスミド又はウイルスのベクターであってよい。本発明の実施において有用な代表的なウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、具体的にはレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、及びアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターを含むが、これらに限定されるわけではない。具体的な実施態様では、ベクターは、AAV1、AAV8、又はAAV9のベクターである。適切なウイルスベクターの選択は、無論、標的細胞及びウイルスの向性に依存する。具体的な実施態様では、標的細胞は筋肉細胞であるが、具体的には筋肉向性を含む広い向性を有するウイルスベクターを用いてもよい。具体的な実施態様では、例えば、筋肉内注射で使用するために、AAV1ベクターが用いられる。別の実施態様では、ベクターは、全身経路を介して（例えば、血管内又は動脈内の経路を介して）投与されるべきであり、そして、ベクターは、AAV8又はAAV9のベクターである。
【0079】
具体的な実施態様では、本発明は、また、更なる急なヘアピンターンを有する、本発明のAS-siRNAに対応するshRNA（短いヘアピン型RNA）に関する。次いで、shRNAヘアピン構造は、細胞装置によってsiRNAに切断される。本発明の更なる態様は、本発明のAS-siRNAに対応するshRNAをコードしているベクターに関する。別の態様では、本発明は、また、本発明のAS-siRNAを含むか又は本発明のベクターがトランスフェクト若しくは形質導入された標的細胞に関する。例えば、標的細胞は、筋肉細胞（又は筋肉系統の細胞）、例えば患者由来の筋芽細胞等の筋芽細胞、又は例えば患者由来の線維芽細胞等の線維芽細胞から選択され得る。
【0080】
別の態様では、本発明は、標的細胞、例えば、筋肉標的細胞（例えば、筋肉細胞、例えば筋芽細胞、具体的には、患者由来の筋芽細胞）内のDNM2遺伝子の野生型アレルの発現をサイレンシングすることなく、DNM2遺伝子の突然変異型アレルの発現をサイレンシングするインビトロ法であって、該標的細胞に本発明のAS-siRNA又はベクターを導入することを含む方法に関する。
【0081】
別の態様では、本発明は、標的細胞内のDNM2遺伝子の他のアレルの発現をサイレンシングすることなく、ヘテロ接合型の非病理学的多型を有するDNM2遺伝子の一方のアレルの発現をサイレンシングするインビトロ法であって、該標的細胞に本発明のAS-siRNA又はベクターを導入することを含む方法に関する。
【0082】
更なる態様では、本発明は、DNM2遺伝子における疾患を引き起こす突然変異によって誘導される疾患を処置する方法において使用するための、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞に関する。好ましくは、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞は、中心核ミオパシー（例えば、常染色体優性中心核ミオパシー）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病（CMT）、又は遺伝性痙性対麻痺（HSP）を処置する方法において使用される。より好ましくは、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞は、常染色体優性中心核ミオパシーを処置する方法において使用される。
【0083】
別の態様では、本発明は、筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法において使用するための、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞に関する。
【0084】
別の態様では、本発明は、ダイナミン２の過剰発現に関連する疾患を処置する、好ましくは、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌を処置する方法において使用するための、本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞に関する。
【0085】
本明細書で使用するとき、用語「処置する」及び「処置」とは、被験体が疾患の少なくとも１つの症状の低減又は疾患の改善、例えば、有益な又は望ましい臨床結果を有するように、有効量の本発明のAS-siRNAを被験体に投与することを指す。この発明の目的のために、有益な又は望ましい臨床結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び（部分的であろうと完全であろうと）寛解を含むが、これらに限定されない。「処置する」は、処置を受けなかった場合の予想生存時間と比較して生存時間が延長することを指すことができる。あるいは、処置は、疾患の進行が低減又は停止した場合「有効」である。また、「処置」は、処置を受けなかった場合の予想生存時間と比較して生存時間が延長することも意味することができる。処置を必要としているものは、DNM2関連障害であると既に診断されているものに加えて、遺伝的感受性又は他の要因に起因してこのような障害を発する可能性があるものを含む。本明細書で使用するとき、用語「処置する」及び「処置」は、疾患又は障害の予防も指し、これは、このような疾患又は障害の発症を遅らせるか又は防ぐことを意味する。
【0086】
本発明のAS-siRNA、本発明に係るベクター又は細胞は、DNM2遺伝子におけるヘテロ接合型突然変異によって引き起こされるか又はDNM2の過剰発現によって引き起こされる任意の疾患を処置するため、好ましくは、常染色体優性中心核ミオパシー、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病、遺伝性痙性対麻痺、Ｘ連鎖性筋細管ミオパシー、又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌を処置するために処方及び投与することができる。本発明のAS-siRNA、本発明に係るベクター又は細胞は、AS-siRNAを、それを必要としている被験体におけるその作用部位と接触させる任意の手段によって処方される。
【0087】
本発明は、また、本発明のAS-siRNA、本発明に係るベクター又は細胞を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効な量の治療剤（本発明のAS-siRNA、ベクター、又は細胞）と薬学的に許容し得る担体とを含む。特定の実施態様では、用語「薬学的に許容し得る」は、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは米国薬局方若しくは欧州薬局方、又は動物及びヒトにおける使用についての他の一般的に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」とは、治療剤と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような薬学的担体は、滅菌液体、例えば、食塩溶液、水、及び石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であってよい。医薬組成物が静脈内投与されるとき、生理食塩水が好ましい担体である。食塩水、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。
【0088】
組成物は、必要に応じて、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。これら組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放製剤等の形態を取り得る。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。好適な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、被験体に適切に投与するための形態を提供するために、好適な量の担体と共に、好ましくは純粋な形態の治療剤を治療上有効な量含有する。
【0089】
医薬組成物は、哺乳類、具体的にはヒトへの任意の種類の投与に適合させ、そして、常法に従って処方される。組成物は、好適な従来の薬学的担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を使用することによって処方される。組成物の投与は、その経路を介して標的組織が利用可能である限り、任意の一般的な経路を介していてよい。
【0090】
ヌクレオチド反復配列伸長の処置において有効な本発明の治療剤の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。更に、インビボ及び／又はインビトロのアッセイは、場合により、最適な投薬量範囲を予測するのを支援するために使用され得る。処方において使用されるべき正確な用量は、投与経路及び疾患の重篤度にも依存し、そして、医師の判断及び各患者の状況に従って決定すべきである。それを必要としている被験体に投与されるAS-siRNA、ベクター、又は細胞の投薬量は、投与経路、被験体の年齢、又は必要な治療効果を得るために必要な発現レベルを含むがこれらに限定されるわけではない幾つかの要因に基づいて変動する。当業者は、この分野における知見に基づいて、これら要因及びその他に基づいて必要とされる投薬量範囲を容易に決定することができる。
【0091】
実施例
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAS-siRNA
材料及び方法
細胞培養
１３．５日齢胚からマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を調製した。ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ ウシ胎仔血清（FCS）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中において、細胞を３７℃（５％ ＣＯ２）で培養した。初代培養物、すなわち、胚解剖後２～３回継代したMEFに対して実験を実施した。健常対照被験体（Ｃ１及びＣ２）に由来する、及びp.R465W突然変異を有するDNM2に連鎖しているCNM患者１人に由来するヒト皮膚線維芽細胞を、同じ培地を用いて培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、７０％コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル（Polyplus Transfection, France）に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA（Eurogentec, Belgium）を対照として用いた。RNA及びタンパク質の抽出並びに免疫組織化学のために、４８時間後に細胞を収集した。
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAS-siRNA
材料及び方法
細胞培養
１３．５日齢胚からマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を調製した。ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ ウシ胎仔血清（FCS）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中において、細胞を３７℃（５％ ＣＯ２）で培養した。初代培養物、すなわち、胚解剖後２～３回継代したMEFに対して実験を実施した。健常対照被験体（Ｃ１及びＣ２）に由来する、及びp.R465W突然変異を有するDNM2に連鎖しているCNM患者１人に由来するヒト皮膚線維芽細胞を、同じ培地を用いて培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、７０％コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル（Polyplus Transfection, France）に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA（Eurogentec, Belgium）を対照として用いた。RNA及びタンパク質の抽出並びに免疫組織化学のために、４８時間後に細胞を収集した。
【0092】
全RNA抽出及びcDNA分析
製造業者のプロトコルに従って、それぞれ細胞及び筋肉についてRNA easy又はRNA easy Fibrous tissue mini kits（Qiagen, France）を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞又は組織切片を２２Ｇシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit（Life Technologies）を用いて、全RNA（１μg）を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた：９６℃で５分間；９６℃で３０秒間、適切な温度（５８～６２℃）で３０秒間、７２℃で３０秒間～１分間のサイクル；及び７２℃で７分間の最終工程。Gapdhを増幅させるために２３サイクル、Dnm2の半定量的分析については２８サイクル、ヒト及びマウスのDnm2アンプリコンの制限酵素切断については３０サイクル、そして、遺伝子型判定及び他のPCRについては３０サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す：
製造業者のプロトコルに従って、それぞれ細胞及び筋肉についてRNA easy又はRNA easy Fibrous tissue mini kits（Qiagen, France）を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞又は組織切片を２２Ｇシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit（Life Technologies）を用いて、全RNA（１μg）を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた：９６℃で５分間；９６℃で３０秒間、適切な温度（５８～６２℃）で３０秒間、７２℃で３０秒間～１分間のサイクル；及び７２℃で７分間の最終工程。Gapdhを増幅させるために２３サイクル、Dnm2の半定量的分析については２８サイクル、ヒト及びマウスのDnm2アンプリコンの制限酵素切断については３０サイクル、そして、遺伝子型判定及び他のPCRについては３０サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す：
【0093】
【表1】
【0094】
３７℃で２時間、２ＵのEcoNI（New England Biolabs, France）又はPfoI（ThermoFisher Scientific, France） ２Ｕによる制限酵素切断にPCR産物の半分を用いた。G-box（Ozyme, France）を用いてアガロースゲル電気泳動後のPCR産物の画像取得を実施し、そして、ImageJ Software（NIH；http://rsbweb.nih.gov/ij）を用いて関連するシグナルを定量した。プライマー（Eurofins, France） ５pmolを用いて２０ng DNA／１００bpに対してDNAシークエンシングを実施した。
【0095】
タンパク質抽出及びウエスタンブロット
１％ プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich, France）を添加した５０mM Tris-HCl pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ４０を含有する溶解バッファ中で、細胞ペレット及び凍結前脛骨筋（TA）をホモジナイズした。更に、Fastprep Lysing Matrix D及びFastprep apparatus（MP Biomedical, France）を用いて、前脛骨筋を溶解バッファ中で機械的にホモジナイズした。遠心分離（１４，０００ｇ、４℃、１５分間）後、BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific Pierce, France）を用いて上清中のタンパク質濃度を決定した。タンパク質 ２０μgをローディングバッファ（５０mM Tris-HCl、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１％ β－メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー）と混合し、そして、９０℃で５分間変性した。タンパク質サンプルを１０％ SDS-PAGEで分離し、そして、１００mA、４℃で一晩、PVDFメンブレン（孔径０．４５μm、Life Technologies）に転写した。５％ 脱脂粉乳及び０．１％ Tween20を含有するＰＢＳ中において、室温で１時間メンブレンをブロッキングし、次いで、４℃で一晩、０．１％ PBS-Tween20、１％ ミルク中の以下の一次抗体：ウサギポリクローナル抗ダイナミン２（Abcam ab3457, United Kingdom）及びウサギポリクローナル抗GAPDH（Santa Cruz, France）に曝露した。０．１％ PBS-Tween20でメンブレンをすすぎ、そして、０．１％ PBS-Tween20中二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗体（Jackson ImmunoResearch, United Kingdom製の抗ウサギ）と共に１時間インキュベートした。G-Box（Ozyme, France）内でECL detection Kit（Merck-Millipore, Germany）を用いて化学発光を検出し、そして、ImageJソフトウェアを用いて関連するシグナルの定量を実施した。
１％ プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich, France）を添加した５０mM Tris-HCl pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ４０を含有する溶解バッファ中で、細胞ペレット及び凍結前脛骨筋（TA）をホモジナイズした。更に、Fastprep Lysing Matrix D及びFastprep apparatus（MP Biomedical, France）を用いて、前脛骨筋を溶解バッファ中で機械的にホモジナイズした。遠心分離（１４，０００ｇ、４℃、１５分間）後、BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific Pierce, France）を用いて上清中のタンパク質濃度を決定した。タンパク質 ２０μgをローディングバッファ（５０mM Tris-HCl、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１％ β－メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー）と混合し、そして、９０℃で５分間変性した。タンパク質サンプルを１０％ SDS-PAGEで分離し、そして、１００mA、４℃で一晩、PVDFメンブレン（孔径０．４５μm、Life Technologies）に転写した。５％ 脱脂粉乳及び０．１％ Tween20を含有するＰＢＳ中において、室温で１時間メンブレンをブロッキングし、次いで、４℃で一晩、０．１％ PBS-Tween20、１％ ミルク中の以下の一次抗体：ウサギポリクローナル抗ダイナミン２（Abcam ab3457, United Kingdom）及びウサギポリクローナル抗GAPDH（Santa Cruz, France）に曝露した。０．１％ PBS-Tween20でメンブレンをすすぎ、そして、０．１％ PBS-Tween20中二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗体（Jackson ImmunoResearch, United Kingdom製の抗ウサギ）と共に１時間インキュベートした。G-Box（Ozyme, France）内でECL detection Kit（Merck-Millipore, Germany）を用いて化学発光を検出し、そして、ImageJソフトウェアを用いて関連するシグナルの定量を実施した。
【0096】
AAV生成及びインビボAAV注入
pSMD2-Dnm2-PTMプラスミド、AAV生成に必須のアデノウイルス配列をコードしているpXX6プラスミド、及びAAV1カプシドをコードしているpRepCApプラスミドを用いて、２９３細胞にトランスフェクトすることによって、AAV2/1偽型ベクターを調製した。イオジキサノール勾配においてベクター粒子を精製し、そして、Amicon Ultra-15 100Kカラム（Merck-Millipore）で濃縮した。定量PCRによって粒子価（ウイルスゲノム（vg）数／mL）を決定した。イソフルラン麻酔下で１月齢の野生型及びヘテロ接合型のKI-Dnm2R465Wマウスに注射した。１０１１vg／筋肉で２９Ｇニードルを用いて２つのTAにおいて、AAV-sh9、AAV-sh10、又はAAV-nosh（ウイルスゲノム中にshRNA配列を有しない陰性対照）の筋肉内注射を２回行った（３０μL／TA、２４時間間隔）。動物実験は、実験動物の使用に関する仏国の法律及び規制に従い、そして、外部の倫理委員会によって承認された（French Ministry of Higher Education and Scientific Researchによる承認番号00351.02）。
pSMD2-Dnm2-PTMプラスミド、AAV生成に必須のアデノウイルス配列をコードしているpXX6プラスミド、及びAAV1カプシドをコードしているpRepCApプラスミドを用いて、２９３細胞にトランスフェクトすることによって、AAV2/1偽型ベクターを調製した。イオジキサノール勾配においてベクター粒子を精製し、そして、Amicon Ultra-15 100Kカラム（Merck-Millipore）で濃縮した。定量PCRによって粒子価（ウイルスゲノム（vg）数／mL）を決定した。イソフルラン麻酔下で１月齢の野生型及びヘテロ接合型のKI-Dnm2R465Wマウスに注射した。１０１１vg／筋肉で２９Ｇニードルを用いて２つのTAにおいて、AAV-sh9、AAV-sh10、又はAAV-nosh（ウイルスゲノム中にshRNA配列を有しない陰性対照）の筋肉内注射を２回行った（３０μL／TA、２４時間間隔）。動物実験は、実験動物の使用に関する仏国の法律及び規制に従い、そして、外部の倫理委員会によって承認された（French Ministry of Higher Education and Scientific Researchによる承認番号00351.02）。
【0097】
筋肉収縮特性
６０mg/kg ペントバルビタールで麻酔したマウスにおいてTA筋の等尺性収縮特性をインサイツで試験した。TA筋の遠位腱をサーボモータシステム（305B Dual-Mode Lever, Aurora Scientific）のレバーアームに取り付けた。持続時間０．１msの最大上（１０Ｖ）方形波パルスを用いて、双極銀電極によって坐骨神経を刺激した。電気刺激に応答した等尺性収縮中に絶対最大等尺性力（P0）を測定した（周波数２５～１５０Hz；連発刺激５００ms）。P0が得られた最適筋長（L0）において全ての等尺性収縮測定を行った。TA筋を計量し、そして、P0を筋肉重量で除することによって特定力（sP0）を計算した。
６０mg/kg ペントバルビタールで麻酔したマウスにおいてTA筋の等尺性収縮特性をインサイツで試験した。TA筋の遠位腱をサーボモータシステム（305B Dual-Mode Lever, Aurora Scientific）のレバーアームに取り付けた。持続時間０．１msの最大上（１０Ｖ）方形波パルスを用いて、双極銀電極によって坐骨神経を刺激した。電気刺激に応答した等尺性収縮中に絶対最大等尺性力（P0）を測定した（周波数２５～１５０Hz；連発刺激５００ms）。P0が得られた最適筋長（L0）において全ての等尺性収縮測定を行った。TA筋を計量し、そして、P0を筋肉重量で除することによって特定力（sP0）を計算した。
【0098】
組織形態学的分析
イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。TA筋を液体窒素で冷却したイソペンタンで冷凍した。TA筋の横断切片（厚さ８μm）をヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色し、そして、標準的な方法によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド－テトラゾリウムレダクターゼ（NADH-TR）で還元した。正立顕微鏡（DMR, Leica）を用いて光学顕微鏡観察を実施し、そして、白黒カメラ（DS-Ri1, Nikon）及びNIS-Elements BRソフトウェア（Nikon, France）を用いて画像取込した。全ての撮像について、比較したサンプル間の曝露設定は同一であり、そして、室温で観察した。ImageJソフトウェアを用いてフェレット径を測定することによって、ラミニンで免疫細胞化学的に標識されたTA筋切片における線維サイズ分布を求めた。
イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。TA筋を液体窒素で冷却したイソペンタンで冷凍した。TA筋の横断切片（厚さ８μm）をヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色し、そして、標準的な方法によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド－テトラゾリウムレダクターゼ（NADH-TR）で還元した。正立顕微鏡（DMR, Leica）を用いて光学顕微鏡観察を実施し、そして、白黒カメラ（DS-Ri1, Nikon）及びNIS-Elements BRソフトウェア（Nikon, France）を用いて画像取込した。全ての撮像について、比較したサンプル間の曝露設定は同一であり、そして、室温で観察した。ImageJソフトウェアを用いてフェレット径を測定することによって、ラミニンで免疫細胞化学的に標識されたTA筋切片における線維サイズ分布を求めた。
【0099】
免疫細胞化学
細胞及びTA凍結切片（厚さ８μm）を４％ パラホルムアルデヒドで固定した（室温で１５分間）。ＰＢＳで洗浄した後、細胞及び凍結切片を室温で１０分間ＰＢＳ中０．５％ Triton X-100で透過処理し、そして、３０分間０．１％ PBS-Triton X-100、５％ ＢＳＡ、及び５％ ロバ血清でブロッキングした。サンプルを、０．１％ Triton X-100及び１％ BSAを含むＰＢＳ中において４℃で一晩、一次抗体：ウサギ抗Ｃ末端ダイナミン２（Abcam ab3457）又はウサギ抗ラミニン（Abcam ab11575）と共にインキュベートした。０．１％ PBS-Triton X-100で洗浄した後、サンプルを、室温で６０分間、ロバ抗ウサギAlexa 488二次抗体（Life Technologies, France）と共にインキュベートした。VECTASHIELD封入剤（Vector Laboratories, United Kingdom）を用いてスライドグラスを封入した。axiophot顕微鏡（Zeiss）又は共焦点顕微鏡（Olympus FV-1000）のいずれかを用いて画像を取得した。
細胞及びTA凍結切片（厚さ８μm）を４％ パラホルムアルデヒドで固定した（室温で１５分間）。ＰＢＳで洗浄した後、細胞及び凍結切片を室温で１０分間ＰＢＳ中０．５％ Triton X-100で透過処理し、そして、３０分間０．１％ PBS-Triton X-100、５％ ＢＳＡ、及び５％ ロバ血清でブロッキングした。サンプルを、０．１％ Triton X-100及び１％ BSAを含むＰＢＳ中において４℃で一晩、一次抗体：ウサギ抗Ｃ末端ダイナミン２（Abcam ab3457）又はウサギ抗ラミニン（Abcam ab11575）と共にインキュベートした。０．１％ PBS-Triton X-100で洗浄した後、サンプルを、室温で６０分間、ロバ抗ウサギAlexa 488二次抗体（Life Technologies, France）と共にインキュベートした。VECTASHIELD封入剤（Vector Laboratories, United Kingdom）を用いてスライドグラスを封入した。axiophot顕微鏡（Zeiss）又は共焦点顕微鏡（Olympus FV-1000）のいずれかを用いて画像を取得した。
【0100】
トランスフェリン取り込みアッセイ
siRNAをトランスフェクトした４８時間後の健常対照細胞株２つ（Ｃ１及びＣ２）及びp.R465W突然変異を発現している患者由来の細胞株１つを用いた。３７℃で４５分間、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で細胞を培養した。Transferrin-AlexaFluor488（Life Technologies, France）を４０μg/mLで添加し、そして、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして、室温で１５分間４％ パラホルムアルデヒドで固定した。共焦点Leica SP2顕微鏡を用いて細胞画像のスタック（０．５μm間隔）を得た。ImageJソフトウェアを用いてスタック投影において蛍光陽性表面を定量し、そして、全細胞表面に対して正規化した。
siRNAをトランスフェクトした４８時間後の健常対照細胞株２つ（Ｃ１及びＣ２）及びp.R465W突然変異を発現している患者由来の細胞株１つを用いた。３７℃で４５分間、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で細胞を培養した。Transferrin-AlexaFluor488（Life Technologies, France）を４０μg/mLで添加し、そして、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして、室温で１５分間４％ パラホルムアルデヒドで固定した。共焦点Leica SP2顕微鏡を用いて細胞画像のスタック（０．５μm間隔）を得た。ImageJソフトウェアを用いてスタック投影において蛍光陽性表面を定量し、そして、全細胞表面に対して正規化した。
【0101】
結果
ヘテロ接合型細胞におけるアレル特異的siRNAの同定
p.R465W DNM2突然変異を用いてKI-Dnm2R465Wマウスモデルを構築した。マウスでは、このミスセンス突然変異は、エキソン１１における単一点突然変異Ａ＞Ｔに対応している。ヘテロ接合型（HTZ）KI-Dnm2マウスから培養したマウス胎仔線維芽細胞（MEF）において、WTのDnm2アレルに影響を与えることなく突然変異型Dnm2アレルをサイレンシングするアレル特異的siRNAのスクリーニングを実施した。アンプリコンの制限酵素切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は１９の可能性があるsiRNAの中で１２のsiRNAのアレル特異性について評価した（図１Ａ）。図１ＡにsiRNAセンス鎖を表す。標的突然変異体mRNAに対して相補性によって結合するのは他のsiRNA鎖（アンチセンス鎖）である。低濃度（２０nM）では、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型の両方のアレルの発現が同様であることと一致して、１に等しい突然変異体／WT比を示す（図１Ｂ）。１２の評価したsiRNAの中でも、６つのsiRNA（si9、si10、si11、si12、si15、si16）は、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた対照細胞と比べて有意に低下した突然変異体／WT比によって証明される通り、アレル特異的サイレンシング特性を示す（図１Ｂ）。これら６つのsiRNA内において、ミスマッチの位置は、それぞれ、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、又はＮ１６位に位置する。
ヘテロ接合型細胞におけるアレル特異的siRNAの同定
p.R465W DNM2突然変異を用いてKI-Dnm2R465Wマウスモデルを構築した。マウスでは、このミスセンス突然変異は、エキソン１１における単一点突然変異Ａ＞Ｔに対応している。ヘテロ接合型（HTZ）KI-Dnm2マウスから培養したマウス胎仔線維芽細胞（MEF）において、WTのDnm2アレルに影響を与えることなく突然変異型Dnm2アレルをサイレンシングするアレル特異的siRNAのスクリーニングを実施した。アンプリコンの制限酵素切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は１９の可能性があるsiRNAの中で１２のsiRNAのアレル特異性について評価した（図１Ａ）。図１ＡにsiRNAセンス鎖を表す。標的突然変異体mRNAに対して相補性によって結合するのは他のsiRNA鎖（アンチセンス鎖）である。低濃度（２０nM）では、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型の両方のアレルの発現が同様であることと一致して、１に等しい突然変異体／WT比を示す（図１Ｂ）。１２の評価したsiRNAの中でも、６つのsiRNA（si9、si10、si11、si12、si15、si16）は、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた対照細胞と比べて有意に低下した突然変異体／WT比によって証明される通り、アレル特異的サイレンシング特性を示す（図１Ｂ）。これら６つのsiRNA内において、ミスマッチの位置は、それぞれ、AS-siRNAのセンス鎖の５’末端からＮ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、又はＮ１６位に位置する。
【0102】
アレル特異的サイレンシングを確立するために、２つの最も効率的なsiRNA、すなわち、si9及びsi10について、高濃度（１００nM）で更なる分析を続けた。４８時間後、全Dnm2-mRNA発現（WT＋突然変異型）は、両siRNAについて約５０％減少する（図２Ａ）。アンプリコンのシークエンシングは、スクランブルがトランスフェクトされた細胞においてHTZ Dnm2配列を示し、そして、si9及びsi10がトランスフェクトされた細胞ではWT配列のみを示した（図２Ｂ）。突然変異型アレルに対する２つのsiRNAのアレル特異性は、測定された突然変異体／WT比が約０．２であることにより証明され（図２Ｃ）、そして、ハウスキーピングGapdh mRNA発現に対する突然変異体及びWTのmRNAの両方の発現レベルの定量によって確認される（データ不図示）。タンパク質レベルでは、si9及びsi10はいずれも、Dnm2の細胞内局在を変化させることなく（データ不図示）、ウエスタンブロットによって証明された通り、Dnm2発現レベルの約５０％の減少を誘導した（図２Ｄ）。これら条件下では、si9及びsi10は、Dnm1及びDnm3の転写物の発現に影響を与えない（データ不図示）。まとめると、これらデータによって、si9及びsi10が効率的なアレル特異的siRNAであることが確認されるが、その理由は、両方ともWTに影響を与えることなく突然変異型Dnm2転写物を特異的にノックダウンし、その結果、残りの発現がDnm2の転写物及びタンパク質の残留半分になるためである。HTZ KI-Dnm2マウスに由来する不死化マウス筋芽細胞におけるRT-PCRによって、突然変異体アレルを特異的にサイレンシングする１００nM si9及びsi10の能力が確認された（図３）。
【0103】
KI-Dnm2マウスにおける筋肉表現型の回復
HTZ KI-Dnm2マウス由来のTA筋における筋肉の表現型は、２月齢で完全に確立され、そして、収縮特性の欠陥、線維サイズの減少による筋萎縮、及び酸化的染色における形態学的異常を含む。インビボ評価のために、si9及びsi10に対応するshRNAを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、並びにshRNA配列を有しない対照AAV（AAV-nosh）を構築した。１月齢のHTZ KI-Dnm2マウスのTA筋にAAVを筋肉内注射し、そして、３ヶ月後に筋肉の表現型を調べた。WT TAと比べて、noshを注射したHTZ筋肉では、質量が約３０％、絶対力が４０％、そして、特定力が１５％の有意な減少が存在する（図４）。sh9の発現によって、絶対力及び特定力がWT値まで完全に回復した。また、sh9注射マウスでは、筋肉量はnoSh筋肉と比べて大きく増加する（＋３０％）が、WT筋肉の質量よりもわずかに低くとどまっている（－１０％）。また、絶対力及び特定力、並びに筋肉量が増大することにより、sh10の発現によって有意な回復が達成される。（図４）。
HTZ KI-Dnm2マウス由来のTA筋における筋肉の表現型は、２月齢で完全に確立され、そして、収縮特性の欠陥、線維サイズの減少による筋萎縮、及び酸化的染色における形態学的異常を含む。インビボ評価のために、si9及びsi10に対応するshRNAを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、並びにshRNA配列を有しない対照AAV（AAV-nosh）を構築した。１月齢のHTZ KI-Dnm2マウスのTA筋にAAVを筋肉内注射し、そして、３ヶ月後に筋肉の表現型を調べた。WT TAと比べて、noshを注射したHTZ筋肉では、質量が約３０％、絶対力が４０％、そして、特定力が１５％の有意な減少が存在する（図４）。sh9の発現によって、絶対力及び特定力がWT値まで完全に回復した。また、sh9注射マウスでは、筋肉量はnoSh筋肉と比べて大きく増加する（＋３０％）が、WT筋肉の質量よりもわずかに低くとどまっている（－１０％）。また、絶対力及び特定力、並びに筋肉量が増大することにより、sh10の発現によって有意な回復が達成される。（図４）。
【0104】
Dnm2転写物の発現レベルをRT-PCRによって定量したところ、sh9発現筋肉におけるDnm2含量はnosh値と比べて有意な減少（－３０％）を示したが、sh10を発現している筋肉では統計的有意性には到達していない（図５Ａ）。それと一致して、Dnm2アンプリコンのシークエンシングは、AAVが形質導入された筋肉において突然変異型ヌクレオチド位置でHTZ配列を示し、ピークはsh9では突然変異型ヌクレオチドに対応するピークが実質的に減少し、そして、sh10ではより少ない程度であった（図５Ｂ）。RT-PCR及びEcoNI切断プロファイルを用いて突然変異体／WT比を定量することによって、アレル特異的サイレンシングを評価した。突然変異体／WT比の予測される低下が達成され、値はそれぞれsh9及びsh10について約０．５及び０．７に達した（図５Ｃ）。sh9によって達成された突然変異型転写物の特異的サイレンシングは、WT及び突然変異体のmRNAに対応する切断産物のGapdh発現に対する定量によっても示され、そして、WT又は突然変異型のアレルのいずれかを特異的に増幅するために設計されたプライマーを用いた第２のRT-PCRによって確認された（データ不図示）。
【0105】
組織学的レベルにおける表現型の回復を更に評価した。WT筋肉と比べたとき、HTZ TA筋は、HE染色に示されている線維サイズの減少、及びDPNH酸化的染色における酸化的物質の中央への蓄積を示す（図５Ｄ）。sh9発現筋肉では、線維サイズがより大きいと思われ、そして、DPNH染色において異常は見られなかった。対照的に、sh10発現TAには形態学的異常が依然として存在していた。線維サイズの頻度の計算（図５Ｅ）によって、sh9-AAVが形質導入されたHTZ TA筋においてのみ、これらパラメータが完全に回復することが確認される。まとめると、これらデータは、３ヶ月間処理した後にマウスにおける筋肉の表現型を完全に元に戻すsh9の能力を証明するが、sh10は、同じ条件下で部分的な回復を誘導しただけであった。しかし、この回復を改善するために、十分に当業者の一般知識の範囲内であるベクターの量、処理時間、又は他の適応の最適化を実施することができる。
【0106】
患者由来の細胞におけるアレル特異的サイレンシング
si9及びsi10のDnm2標的配列は、マウス配列とヒト配列との間で７９％の同一性を示す（１９bpのうちの１５）。p.R465W突然変異を発現している患者由来の線維芽細胞株１つにおいてインビボ評価するためにヒト特異的si9及びsi10を生成した。５０nMで４８時間si9をトランスフェクトした細胞においてDnm2のmRNA含量は約５０％減少する（図６Ａ）。アンプリコンのシークエンシングによって、WT及び突然変異型のDNM2のミックスを依然として発現しているスクランブル－及びsi10がトランスフェクトされた細胞と比べて、si9がトランスフェクトされた線維芽細胞において突然変異型mRNAが消失したことが確認される（図６Ｂ）。本発明者等はアンプリコンのPfoI切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発された半定量的RT-PCRアッセイを用いた。このアッセイを使用したところ、非トランスフェクト細胞及びスクランブルがトランスフェクトされた細胞については突然変異体／WT比が１に等しく、そして、si10では０．８に、そして、si9では０．２に有意に減少する（図６Ｃ）。４８時間にわたってsi9及びsi10の両方をトランスフェクトした結果、ウエスタンブロットによって証明された通り、DNM2タンパク質含量が減少した（図６Ｄ）。si9がヒト細胞においてアレル特異的siRNAの予測される特性を全て示したことに鑑みて、その結果、より高用量（１００nM）でsi9について更に調べた。この用量では、DNM2転写物の発現は依然として約５０％減少し（図７Ａ）、そして、明らかな細胞毒性なく（図７Ｃ）、突然変異型DNM2 mRNAに対するアレル特異性は維持される（図７Ｂ）。si9（センス鎖及びアンチセンス鎖）についての潜在的オフターゲットを同定するために使用したBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）は、１３の連続ヌクレオチドにおける完全同一性に対応する６８％の同一性を有する最も近縁な配列としてSLC9A8を示した。本発明者等は１００mM siRNAをトランスフェクトした４８時間後にRT-PCRによって、SLC9A8のmRNAのサイレンシングがsi9によって誘導される可能性について調べた。スクランブルsiRNAと比べて、si9はSLC9A8転写物の発現に影響を与えない（データ不図示）。
si9及びsi10のDnm2標的配列は、マウス配列とヒト配列との間で７９％の同一性を示す（１９bpのうちの１５）。p.R465W突然変異を発現している患者由来の線維芽細胞株１つにおいてインビボ評価するためにヒト特異的si9及びsi10を生成した。５０nMで４８時間si9をトランスフェクトした細胞においてDnm2のmRNA含量は約５０％減少する（図６Ａ）。アンプリコンのシークエンシングによって、WT及び突然変異型のDNM2のミックスを依然として発現しているスクランブル－及びsi10がトランスフェクトされた細胞と比べて、si9がトランスフェクトされた線維芽細胞において突然変異型mRNAが消失したことが確認される（図６Ｂ）。本発明者等はアンプリコンのPfoI切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発された半定量的RT-PCRアッセイを用いた。このアッセイを使用したところ、非トランスフェクト細胞及びスクランブルがトランスフェクトされた細胞については突然変異体／WT比が１に等しく、そして、si10では０．８に、そして、si9では０．２に有意に減少する（図６Ｃ）。４８時間にわたってsi9及びsi10の両方をトランスフェクトした結果、ウエスタンブロットによって証明された通り、DNM2タンパク質含量が減少した（図６Ｄ）。si9がヒト細胞においてアレル特異的siRNAの予測される特性を全て示したことに鑑みて、その結果、より高用量（１００nM）でsi9について更に調べた。この用量では、DNM2転写物の発現は依然として約５０％減少し（図７Ａ）、そして、明らかな細胞毒性なく（図７Ｃ）、突然変異型DNM2 mRNAに対するアレル特異性は維持される（図７Ｂ）。si9（センス鎖及びアンチセンス鎖）についての潜在的オフターゲットを同定するために使用したBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）は、１３の連続ヌクレオチドにおける完全同一性に対応する６８％の同一性を有する最も近縁な配列としてSLC9A8を示した。本発明者等は１００mM siRNAをトランスフェクトした４８時間後にRT-PCRによって、SLC9A8のmRNAのサイレンシングがsi9によって誘導される可能性について調べた。スクランブルsiRNAと比べて、si9はSLC9A8転写物の発現に影響を与えない（データ不図示）。
【0107】
最後に、患者由来の細胞における機能救済について調べることによってsi9特性を評価した。患者由来の線維芽細胞では、クラスリン媒介エンドサイトーシスに欠陥が生じる。蛍光トランスフェリン取り込みアッセイを用いて、正常エンドサイトーシスを回復させるsi9の能力を評価した。２つの健常対照細胞株と比べて、CNM患者由来のスクランブルがトランスフェクトされた細胞では１５分間のトランスフェリン取り込みが減少するが、アッセイ前４８時間にわたってsi9がトランスフェクトされた細胞では正常値が達成される（図８Ａ）。対照細胞株におけるsi9のトランスフェクトは、WT Dnm2 mRNAに対する効果が存在しないことと一致して、クラスリン媒介エンドサイトーシスに影響を与えない（図８Ｂ）。
【0108】
考察
RNAiによるアレル特異的サイレンシングは、単一ヌクレオチドのみが異なる場合であっても２つの配列を識別することができる、siRNAによって媒介されるRNA干渉プロセスの顕著な特異性から益を得る。この特性によって、AD-CNMに罹患している患者で同定された２４のDNM2突然変異の大部分を表す単一ヌクレオチド置換をもたらす優性突然変異、特にそのうち最も高頻度のもの（患者の３０％）、すなわち、p.R465W突然変異をアレル特異的RNAiが標的とすることができるようになった。上記結果は、救済動物モデルを通して、そして、患者由来の細胞において、DNM2に関連するCNMの治療ストラテジーとしてのp.R465W突然変異に対するアレル特異的RNAiの効率を証明した。
RNAiによるアレル特異的サイレンシングは、単一ヌクレオチドのみが異なる場合であっても２つの配列を識別することができる、siRNAによって媒介されるRNA干渉プロセスの顕著な特異性から益を得る。この特性によって、AD-CNMに罹患している患者で同定された２４のDNM2突然変異の大部分を表す単一ヌクレオチド置換をもたらす優性突然変異、特にそのうち最も高頻度のもの（患者の３０％）、すなわち、p.R465W突然変異をアレル特異的RNAiが標的とすることができるようになった。上記結果は、救済動物モデルを通して、そして、患者由来の細胞において、DNM2に関連するCNMの治療ストラテジーとしてのp.R465W突然変異に対するアレル特異的RNAiの効率を証明した。
【0109】
WT及び突然変異型アレルが同様に発現している優性遺伝性疾患の状況では、アレル特異的siRNAは、WTに影響を与えずに突然変異型アレルをサイレンシングした結果、標的のmRNA及びタンパク質の発現を約５０％減少させると予測される。この試験では、マウス及びヒトの細胞におけるsi9がそうである。
【0110】
非病理学的多型を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAS-siRNA
材料及び方法
細胞培養
ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ ウシ胎仔血清（FCS）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中において、p.R465W突然変異を有する１人のDNM2連鎖性CNM患者由来のヒト皮膚線維芽細胞を３７℃（５％ ＣＯ２）で培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、７０％コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル（Polyplus Transfection, France）に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA（Eurogentec, Belgium）を対照として用いた。RNA及び抽出及びRT-PCR分析のために、４８時間後に細胞を収集した。
材料及び方法
細胞培養
ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ ウシ胎仔血清（FCS）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中において、p.R465W突然変異を有する１人のDNM2連鎖性CNM患者由来のヒト皮膚線維芽細胞を３７℃（５％ ＣＯ２）で培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、７０％コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル（Polyplus Transfection, France）に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA（Eurogentec, Belgium）を対照として用いた。RNA及び抽出及びRT-PCR分析のために、４８時間後に細胞を収集した。
【0111】
全RNA抽出及びcDNA分析
製造業者のプロトコルに従ってRNA easyキット（Qiagen, France）を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞を２２Ｇシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit（Life Technologies）を用いて、全RNA（１μg）を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた：９６℃で５分間；９６℃で３０秒間、適切な温度（５８～６２℃）で３０秒間、７２℃で３０秒間～１分間のサイクル；及び７２℃で７分間の最終工程。HPRTを増幅させるために２７サイクル、DNM2の半定量的分析については２７サイクル、DNM2アンプリコンの制限酵素切断については３０サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す：
製造業者のプロトコルに従ってRNA easyキット（Qiagen, France）を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞を２２Ｇシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit（Life Technologies）を用いて、全RNA（１μg）を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた：９６℃で５分間；９６℃で３０秒間、適切な温度（５８～６２℃）で３０秒間、７２℃で３０秒間～１分間のサイクル；及び７２℃で７分間の最終工程。HPRTを増幅させるために２７サイクル、DNM2の半定量的分析については２７サイクル、DNM2アンプリコンの制限酵素切断については３０サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す：
【0112】
【表2】
【0113】
３７℃で２時間、２ＵのBglI（New England Biolabs, France） ２Ｕを用いる制限酵素切断にPCR産物の半分を用いた。G-box（Ozyme, France）を用いてアガロースゲル電気泳動後のPCR産物の画像取得を実施し、そして、ImageJ Software（NIH；http://rsbweb.nih.gov/ij）を用いて関連するシグナルを定量した。
【0114】
結果
ヘテロ接合型非病理学的多型を標的とすることによるアレル特異的siRNAの同定
患者由来の細胞はp.R465W DNM2突然変異を有し、そして、DNM2タンパク質配列における７１３位のアミノ酸をコードしているコドンの１つの塩基に対応する単一ヌクレオチド多型（SNP）rs2229920（Ｃ及びＴ）についてヘテロ接合型である。DNM2 mRNAをシークエンシングすることによって、本発明者等は、その突然変異が多型のＣバージョンとインフレームであることを示した。HTZ SNPの存在によって、SNPの２つの可能性のあるバージョン（Ｃ及びＴ）に対して効率的なAS-siRNAをスクリーニングすることができた。Ｃに対する２つのsiRNA（それぞれ１６又は１７位におけるミスマッチ、すなわち、si16-713C及びsi17-713Cを含む）及びＴに対する１つのsiRNA（si17-713Tと呼ばれる１７位におけるミスマッチを含む）を評価した。RT-PCR分析前に４８時間、３０nM siRNAを細胞にトランスフェクトした。３つの試験したsiRNAは、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞又は非トランスフェクト細胞と比べたとき、DNM2転写物の発現を減少させるのに効率的である（図９Ａ）。ハウスキーピング遺伝子として使用したHPRT mRNAに対するDNM2転写物の定量（図９Ｂ）は、１７位におけるミスマッチが１６位と比べてより効率的であることを示す。アンプリコンの制限酵素切断後にアレルＣ及びアレルＴを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は３０nMにおけるこれら３つのsiRNAのアレル特異性を４８時間にわたって評価した。スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型のアレル両方の発現が同様であることと一致して、１に等しいＣ（突然変異体）／Ｔ（WT）比を示す（図１０）。Ｃに対するsiRNAを使用したときは該比が減少するが、Ｔに対するsiRNAを使用したときは増加する（図１０Ｂの左パネル）。HPRT発現に対してＴヌクレオチドを有するmRNAレベルを定量することによって、これら３つのsiRNAのアレル特異性を確認したsi17-713Tを用いたときのみ減少を示す（図１０Ｂの右パネル）。
ヘテロ接合型非病理学的多型を標的とすることによるアレル特異的siRNAの同定
患者由来の細胞はp.R465W DNM2突然変異を有し、そして、DNM2タンパク質配列における７１３位のアミノ酸をコードしているコドンの１つの塩基に対応する単一ヌクレオチド多型（SNP）rs2229920（Ｃ及びＴ）についてヘテロ接合型である。DNM2 mRNAをシークエンシングすることによって、本発明者等は、その突然変異が多型のＣバージョンとインフレームであることを示した。HTZ SNPの存在によって、SNPの２つの可能性のあるバージョン（Ｃ及びＴ）に対して効率的なAS-siRNAをスクリーニングすることができた。Ｃに対する２つのsiRNA（それぞれ１６又は１７位におけるミスマッチ、すなわち、si16-713C及びsi17-713Cを含む）及びＴに対する１つのsiRNA（si17-713Tと呼ばれる１７位におけるミスマッチを含む）を評価した。RT-PCR分析前に４８時間、３０nM siRNAを細胞にトランスフェクトした。３つの試験したsiRNAは、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞又は非トランスフェクト細胞と比べたとき、DNM2転写物の発現を減少させるのに効率的である（図９Ａ）。ハウスキーピング遺伝子として使用したHPRT mRNAに対するDNM2転写物の定量（図９Ｂ）は、１７位におけるミスマッチが１６位と比べてより効率的であることを示す。アンプリコンの制限酵素切断後にアレルＣ及びアレルＴを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は３０nMにおけるこれら３つのsiRNAのアレル特異性を４８時間にわたって評価した。スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型のアレル両方の発現が同様であることと一致して、１に等しいＣ（突然変異体）／Ｔ（WT）比を示す（図１０）。Ｃに対するsiRNAを使用したときは該比が減少するが、Ｔに対するsiRNAを使用したときは増加する（図１０Ｂの左パネル）。HPRT発現に対してＴヌクレオチドを有するmRNAレベルを定量することによって、これら３つのsiRNAのアレル特異性を確認したsi17-713Tを用いたときのみ減少を示す（図１０Ｂの右パネル）。
【0115】
非病理学的多型のＣアレルに対するアレル特異的siRNAの配列の改変
siRNAの効率を増大させる目的で、５’又は３’にヌクレオチドを付加することによってsi17-713Cの長さを改変した（図１１Ａ）。５０nMで４８時間トランスフェクトしたとき、３つの改変されたsiRNA全てが、スクランブルsiRNAと比べてDNM2転写物の発現を減少させることができる（図１１Ｃ）が、その中でもsi713C-17/21は効率が低いと思われる（それでも約３０％は減少するので依然として関心対象である）。RT-PCR、その後BglI切断を用いてアレル特異性を評価した。非トランスフェクト細胞及びスクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞において、計算されたアレルＣ／アレルＴ比は、両アレルの発現レベルが同様であることと一致して約１である。予想の通り、Ｃに対する改変AS-siRNAの全てを５０nMで４８時間トランスフェクトした結果、アレルＣ／アレルＴ比が減少する。
siRNAの効率を増大させる目的で、５’又は３’にヌクレオチドを付加することによってsi17-713Cの長さを改変した（図１１Ａ）。５０nMで４８時間トランスフェクトしたとき、３つの改変されたsiRNA全てが、スクランブルsiRNAと比べてDNM2転写物の発現を減少させることができる（図１１Ｃ）が、その中でもsi713C-17/21は効率が低いと思われる（それでも約３０％は減少するので依然として関心対象である）。RT-PCR、その後BglI切断を用いてアレル特異性を評価した。非トランスフェクト細胞及びスクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞において、計算されたアレルＣ／アレルＴ比は、両アレルの発現レベルが同様であることと一致して約１である。予想の通り、Ｃに対する改変AS-siRNAの全てを５０nMで４８時間トランスフェクトした結果、アレルＣ／アレルＴ比が減少する。
【0116】
考察
幾つかの原因突然変異が同定されている優性疾患の場合、RNAiストラテジーによる２つのアレル特異的サイレンシングを開発することができる。第１のストラテジーは、AD-CNMを引き起こすp.R465W DNM2突然変異について開発されたので、各同定された突然変異に対するAS-siRNAを開発することによって個別療法に対応する。第２のストラテジーは、該疾患に関連する非病理学的変異体に対するAS-siRNAを開発することである。ここで、本発明者等はDNM2転写物のコード領域に存在する一般的な非病理学的単一ヌクレオチド多型（SNP）を標的とすることによって、DNM2連鎖性CNMについてこの汎突然変異ストラテジーを開発できることを示す。このSNPが高頻度でヘテロ接合型状態（一方のアレルはＣ、そして他方はＴ）でみられることに鑑みて、SNPに対するAS-siRNAは、突然変異とインフレームのSNPのバージョンに対するAS-siRNAを用いることによって、突然変異型転写物全てをサイレンシングすることができる。
幾つかの原因突然変異が同定されている優性疾患の場合、RNAiストラテジーによる２つのアレル特異的サイレンシングを開発することができる。第１のストラテジーは、AD-CNMを引き起こすp.R465W DNM2突然変異について開発されたので、各同定された突然変異に対するAS-siRNAを開発することによって個別療法に対応する。第２のストラテジーは、該疾患に関連する非病理学的変異体に対するAS-siRNAを開発することである。ここで、本発明者等はDNM2転写物のコード領域に存在する一般的な非病理学的単一ヌクレオチド多型（SNP）を標的とすることによって、DNM2連鎖性CNMについてこの汎突然変異ストラテジーを開発できることを示す。このSNPが高頻度でヘテロ接合型状態（一方のアレルはＣ、そして他方はＴ）でみられることに鑑みて、SNPに対するAS-siRNAは、突然変異とインフレームのSNPのバージョンに対するAS-siRNAを用いることによって、突然変異型転写物全てをサイレンシングすることができる。
【0117】
ここで、本発明者等は、SNP rs2229920の２つの可能性のあるバージョン（Ｃアレル又はＴアレルのいずれか）に対する幾つかの効率的なAS-siRNAを同定した。この結果は、生じる疾患が何であろうと（CNM、CMT、又はHSP）優性DNM2突然変異全てを標的とし、そして、このタンパク質の過剰発現に関連する疾患（Ｘ連鎖性中心核ミオパシー、膵臓癌、及び前立腺癌）においてDNM2発現を制御された方法で減少させることもできる可能性を初めて明らかにする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】