特許7196143IP Force 特許公報全文掲載

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技術分野

（相互参照） 本出願は、２０１４年１２月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／０９４，９１７号；２０１４年１２月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／０９４，９１９号；および２０１４年１２月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／０９４，９２４号の利益を主張しており、これら出願のすべては、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

（発明の要旨） 単一細胞における複数の標的核酸配列を検出するための方法、組成物およびキットを記載する。開示される方法は、核酸標的分子全般の検出に適しており、特に、細胞の混合物中に存在する単一細胞におけるｍＲＮＡ標的分子の検出にふさわしく、その個々の細胞起源情報が保持される。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 図１は、ユニーク結合物質（ＵＢＡ）、エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成するように構築された一連のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む分子複合体の一実施形態の略図を示している。
【図2】 図２は、ユニーク結合物質（ＵＢＡ）、９ヌクレオチドコード（下図）を含むエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および４つのＡＰＳコード（ＳＣ１～ＳＣ４）を含む細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を含む分子複合体の一実施形態の略図を示している。この非限定的な例では、ＥＳＢは、ＵＢＡに共有結合により付着されたオリゴヌクレオチドリンカーの相補的領域にアニーリングすることによってＵＢＡに付着されている（上図）。各ＡＰＳコードは、それ自体がＥＳＢの相補的領域にアニールされるスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチド（スプリント６）に相補的な配列とアニーリングすることによって、いずれかの末端において隣接する７ヌクレオチドコード（下図）を含む。スプリントオリゴヌクレオチドへのアニーリングによるＣＯＢのコンビナトリアル構築の後、ＡＰＳサブユニットがライゲートされる（矢印で示されている位置において）ことにより、ＥＳＢおよびＣＯＢを含む単一の共有結合的分子複合体が形成される。
【図3】 図３は、開示される方法および組成物のエピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードの分子構成要素、ならびに分子バーコード化複合体を形成するためのそれらの構築のグラフィカル表示を示している。
【図4】 図４は、開示される方法および組成物、ならびに個々の細胞における複数のエピトープの検出におけるそれらの使用の一実施形態におけるＵＢＡ－ＥＳＢ構成要素の略図を示している。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ－ＥＳＢ複合体は、細胞起源バーコードの構築のために使用される共通リンカー（ＣＬ）をさらに含む。
【図5】 図５は、ユニーク細胞起源バーコードを形成するための第１のラウンドのスプリットプール合成経路を図示している。細胞サンプルを複数のＵＢＡ－ＥＳＢ複合体で処理した後、そのサンプルを一連のアリコートに分割し、第１のＡＰＳを、個々の細胞内の結合したＵＢＡ－ＥＳＢ複合体にカップリングさせる（ここで、各サンプルアリコートは、異なるＡＰＳで処理される）。
【図6】 図６は、ユニーク細胞起源バーコードを形成するためのその後のラウンドのスプリットプール合成経路を図示している。図５に図示された第１のＡＰＳのカップリングラウンドの後、サンプルアリコートをプールし、混合し、新しい一連のアリコートに再分配する。次いで、第２のＡＰＳ単位を、第１のカップリング工程において生成された結合したＵＢＡ－ＥＳＢ－ＡＰＳ複合体にカップリングする（ここで、各サンプルアリコートは、再度、異なるＡＰＳで処理される）。サンプルをアリコートにし、カップリング反応を行い、細胞サンプルスプリットプールをプールするというラウンドの反復を実施することによって、実質的にユニークな細胞起源バーコードのセットが合成される。
【図7】 図７は、標的ｍＲＮＡ分子を検出およびバーコード化するための近接プローブセットの一例を図示しており、そのプローブセットは、オリゴヌクレオチド近接プローブ１５および１９の対を含み、その各近接プローブは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列領域を含み、架橋オリゴヌクレオチド２０を用いて連結され得、それらの近接プローブは、１つまたはそれを超えるプライマー配列、エピトープ特異的バーコード領域、ならびに本開示の組成物および方法を用いるユニーク細胞起源バーコードの作製において使用するための共通リンカー領域をさらに含み得る。
【図8】 図８は、特定のｍＲＮＡ分子を標的にするための近接プローブセットの別の例を図示している。
【図9】 図９は、ユニーク細胞起源バーコードを有する細胞内の標的ｍＲＮＡ分子の各存在を標識するために使用されるプロセスの一例を図示している。この例では、ＵＢＡは、ＣＤ４ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。
【図10】 図１０は、２つの近接プローブ配列に加えて２つのスプリント分子および架橋オリゴヌクレオチドを使用する、標的ｍＲＮＡ分子を検出およびバーコード化するための近接プローブセットの別の例を図示している。
【図11】 図１１は、図１０に図示された近接プローブセットの作製において使用されるオリゴヌクレオチド配列の非限定的な例を図示している。
【図12】 図１２は、２つの近接プローブを連結するために、組み合わされた単一のスプリント－架橋オリゴヌクレオチドを使用する、標的ｍＲＮＡ分子を検出およびバーコード化するための近接プローブセットの別の非限定的な例を図示している。
【図13】 図１３は、図１２に図示された近接プローブセットの作製において使用されるオリゴヌクレオチド配列の非限定的な例を図示している。
【図14】 図１４は、２つの近接プローブを連結するために、組み合わされた単一のスプリント－架橋オリゴヌクレオチドを使用する、標的ｍＲＮＡ分子を検出およびバーコード化するための近接プローブセットの別の非限定的な例を図示している。
【図15】 図１５は、コード領域ＳＣ１～ＳＣ４を含むＡＰＳを構築してユニーク細胞起源バーコードにするために使用されるスプリントオリゴヌクレオチドの非限定的な例を図示している。下図は、抗体または抗体フラグメントを含むＵＢＡをバーコード化するためのオリゴヌクレオチドの一例を示している。
【図16】 図１６は、コード領域ＳＣ１～ＳＣ３を含むＡＰＳを構築してユニーク細胞起源バーコードにするために使用されるスプリントオリゴヌクレオチド分子の非限定的な例を図示している。開示される方法および組成物のいくつかの例では、ＵＢＡは、抗体であり得る。他の例では、ＵＢＡは、オリゴヌクレオチドプローブ配列、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。構築された細胞起源バーコードは、１つまたはそれを超える増幅プライマーおよび／または配列決定プライマー配列をさらに含み得る。
【図17】 図１７は、コード領域ＳＣ１～ＳＣ３を含むＡＰＳを構築して、ＰＣＲ増幅プライマーおよび配列決定プライマーを含み得るユニーク細胞起源バーコードにするために使用されるスプリントオリゴヌクレオチド分子の非限定的な例を図示している。
【図18】 図１８は、一般的ポリＴプライマー配列を用いてｍＲＮＡ分子をバーコード化するための方法の非限定的な例を図示している。
【図19】 図１９は、標的ｍＲＮＡ配列特異的プライマーを用いてｍＲＮＡ分子をバーコード化するための方法の非限定的な例を図示している。
【図20】 図２０は、コード領域ＳＣ１～ＳＣ３を含むＡＰＳを構築して、特定のｍＲＮＡ標的分子に対するユニーク細胞起源バーコード（またはオリゴヌクレオチドでタグ化された抗体）にするために使用される、近接プローブセットおよびスプリントオリゴヌクレオチド分子の非限定的な例を図示している。
【図21】 図２１は、第１のスプリント分子（スプリントＳＰ－Ｖ４）を用いて構築された伸長中のＣＯＢの５’末端に第２のスプリント分子（スプリントＳＰ－Ｖ５）をハイブリダイズさせることによってＣＯＢの長さ（すなわち、サブコード領域の数）を延長する非限定的な例を図示している。
【図22】 図２２は、ＡＰＳを構築して標的ｍＲＮＡ分子に対するユニーク細胞起源バーコードを作製するために使用される近接プローブセット（「架橋」配列をさらに含み得る標的特異的プローブの対および１つまたはそれを超える「スプリント」オリゴヌクレオチド分子を含む）の非限定的な例を図示しており、ここで、相補的配列の認識事象の数とその近接要件とが組み合わさることにより、標的検出の特異性が高まる。
【図23】 図２３は、ＡＰＳを構築して標的ｍＲＮＡ分子に対するユニーク細胞起源バーコードを作製するために使用される近接プローブセット（架橋配列をさらに含み得る標的特異的プローブの対および１つまたはそれを超えるスプリントオリゴヌクレオチド分子を含む）のさらなる非限定的な例を図示しており、ここで、相補的配列の認識事象の数とその近接要件とが組み合わさることにより、標的検出の特異性が高まる。
【図24】 図２４は、細胞の混合集団を含むサンプル内の稀な細胞、例えば、ＨＩＶウイルス核酸配列を含む細胞の部分集団を識別するため、および識別された部分集団の個々の細胞における特定の標的分子のセット、例えば、タンパク質Ｘを検出するために、開示される組成物およびバーコード化方法を使用するための一実施形態を図示している。
【図25】 図２５は、特定の標的分子のセット、例えば、タンパク質Ｘを個々の細胞ベースで検出するために、稀な細胞、例えば、ＨＩＶウイルス核酸配列を含む細胞のバーコード化された集団をリサンプリングするために開示される組成物および方法を使用するための一実施形態を図示しており、ここで、それらの目的の標的分子は、バーコード化が行われた時点では未知のものであった。
【図26】 図２６は、自己環状化オリゴヌクレオチドバーコードを抗体または抗体フラグメントに付着するための方法を図示しており、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して（左）または接続オリゴヌクレオチドへのアニーリングを介して（右）、タンパク質分子に付着されている。オリゴヌクレオチドでタグ化された抗体は、イムノＰＣＲ反応を使用することによって低含量のタンパク質の検出を可能にし、ここで、結合した抗体に対応するオリゴヌクレオチドバーコードが、定量的ＰＣＲまたは配列決定を用いて、増幅され、かつ検出される。
【図27】 図２７は、光切断可能な結合を含むヘアピンオリゴヌクレオチド構造を用いて、結合した抗体－ＥＳＴ（エピトープ特異的タグ）複合体の各存在をユニーク細胞起源バーコードでバーコード化するためのプロセスの非限定的な例を図示している。
【図28】 図２８は、図２７に図示されたＣＯＢ構築プロセスにおいて使用される、ヘアピンを形成するオリゴヌクレオチド配列の非限定的な例を図示している。
【図29】 図２９は、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子を含む個々の細胞を識別するための開示される方法の一実施形態を図示している。標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列またはポリ－ｄＴオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれかを含むＵＢＡは、ＵＢＡコード配列（すなわちＥＳＢ）に付着されている。固定され、透過処理された細胞における標的ＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションの後、逆転写およびバーコード化の反応を行うことにより、細胞起源を識別するためのユニーク細胞特異的バーコードを含むＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体が形成される。開示される方法のいくつかの実施形態において、配列決定プライマーをもた含む標的特異的プライマーを用いて、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子と会合した細胞起源バーコードを選択的に増幅することによって、そのＲＮＡ標的の同一性および標的ＲＮＡ分子が検出された個々の細胞の同一性を解読するために配列決定され得る増幅産物が形成される。
【図30】 図３０は、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子を含む個々の細胞を識別するための開示される方法の代替の実施形態を図示している。標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列またはポリ－ｄＴオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれかを含むＵＢＡは、ＵＢＡコード配列（すなわちＥＳＢ）に付着されている。固定され、透過処理された細胞における標的ＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションの後、逆転写、ポリ－ｄＧ付加およびバーコード化の反応を行うことにより、細胞起源を識別するためのユニーク細胞特異的バーコードを含むＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体が形成される。この非限定的な実施形態では、配列決定プライマーも必要に応じて含むポリ－ｄＣプライマーを用いて、すべてのＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体が増幅される。その後、配列決定プライマーをさらに含む標的特異的プライマーを用いて、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子と会合した細胞起源バーコードを選択的に増幅することによって、ＲＮＡ標的の同一性および標的ＲＮＡ分子が検出された個々の細胞の同一性を解読するために配列決定され得る増幅産物が形成され得る。
【図31】 図３１は、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子を含む個々の細胞を識別するための開示される方法のなおも別の実施形態を図示している。標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列またはポリ－ｄＴオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれかを含むＵＢＡは、ＵＢＡコード配列（すなわちＥＳＢ）に付着されている。固定され、透過処理された細胞における標的ＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションの後、逆転写およびバーコード化の反応を行うことにより、細胞起源を識別するためのユニーク細胞特異的バーコードを含むＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体が形成される。開示される方法のいくつかの実施形態において、配列決定プライマーをもまた含むセミランダムプライマー（例えば、配列ＮＮＮＧＡＧを有する）を用いて、１つまたはそれを超える目的の標的ＲＮＡ分子と会合した細胞起源バーコードを選択的に増幅することによって、そのＲＮＡ標的の同一性および標的ＲＮＡ分子が検出された個々の細胞の同一性を解読するために配列決定され得る増幅産物が形成される。そのセミランダムプライマーの非ランダム部分は、そのプライマーが、標的ＲＮＡをプロービングするために使用されたポリ－ｄＴまたは標的特異的配列の位置から３２～１２８ヌクレオチドの位置においてＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体に相補的であり、ＵＢＡ－ＥＳＢ－ＣＯＢ結合体とハイブリダイズする確率を最大するように選択され、それによって、増幅産物が、現代のハイスループット配列決定システムの配列決定容量の効率的な使用を最適化するのに適切な長さになることが保証される。

代表図 図1本件の代表的な図

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