▶ ザ チャイニーズ ユニバーシティー オブ ホンコンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-19
(45)【発行日】2022-12-27
(54)【発明の名称】ＤＮＡのサイズに基づく解析
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221220BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221220BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20221220BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221220BHJP
G16H 50/20 20180101ALI20221220BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/02
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z
G16H50/20
C12Q1/6851 Z
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021028536
(22)【出願日】2021-02-25
(62)【分割の表示】P 2020105483の分割
【原出願日】2013-03-08
(65)【公開番号】P2021090438
(43)【公開日】2021-06-17
【審査請求日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】61/608,623
(32)【優先日】2012-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/621,451
(32)【優先日】2012-04-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513154234
【氏名又は名称】ザ チャイニーズ ユニバーシティー オブ ホンコン
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】ロー ユク ミン デニス
(72)【発明者】
【氏名】チャン クワン チー
(72)【発明者】
【氏名】ジュヨン ウェンリ
(72)【発明者】
【氏名】ジアーン ペイヨン
(72)【発明者】
【氏名】リャオ ジアウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チウ ワイ クン ロッサ
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０２４２６２１７（ＥＰ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／１１２３１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／０１９４５５（ＷＯ，Ａ２）
【文献】The Journal of Urology，2009年，Vol.181，p.363-371
【文献】PLoS ONE，2011年09月，Vol.6, No.9，e23418 p.1-10
【文献】J. AM. CHEM. SOC.，2010年，Vol.132，p.5793-5798
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物の試料を解析する方法であって、該試料は、正常細胞および癌に関連しているおそれのある細胞由来の無細胞ＤＮＡ断片を含み：
該方法は、
試料由来の複数のＤＮＡ断片のうちの各々について、
ＤＮＡ断片のシーケンシングから得られる１つまたは複数の読み取り配列を受け取ること、ここで、前記１つまたは複数の読み取り配列は、前記ＤＮＡ断片の両方の末端を含む；
前記１つまたは複数の読み取り配列を参照ゲノムにアラインして、前記ＤＮＡ断片の両方の末端についてアラインした位置を得ること；
アラインした位置を利用して前記ＤＮＡ断片のサイズを決定すること；
複数のサイズの各サイズについて、
複数のＤＮＡ断片のセットについてアラインした位置から決定したサイズを用いて、そのサイズに対応する試料由来の複数のＤＮＡ断片のセットの量を決定すること；
複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて第１パラメータの第１値を計算すること、ここで第１パラメータは前記試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度を提供する；
第１値を校正値と比較すること；並びに、
その比較に基づいて、腫瘍ＤＮＡの分画濃度を推定すること；を含む、方法。
【請求項2】
前記ＤＮＡ断片はランダムに選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡ断片はゲノムの複数の領域から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＤＮＡ断片はゲノムの複数の所定の領域から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＤＮＡ断片は複数の染色体から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記校正値は非腫瘍ＤＮＡと腫瘍ＤＮＡとを含む校正試料を用いて決定される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１パラメータは、長いＤＮＡ断片の存在度に対する短いＤＮＡ断片の存在度を表し、短いＤＮＡ断片は、長いＤＮＡ断片よりもサイズが小さい、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づき１つまたは複数の第２パラメータの１つまたは複数の第２値を計算すること、ここで当該１つまたは複数の第２パラメータは、試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの異なる統計的尺度を提供する；前記１つまたは複数の第２値を、対応する第２校正値と比較すること；そして、
第１値および１つまたは複数の第２値を含む比較に基づいて、試料における腫瘍ＤＮＡの分画濃度を推定すること；をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
第１校正データ点が、前記第１パラメータの値の校正値に対応する胎児ＤＮＡの分画濃度を特定し、１つまたは複数の第２校正データ点が、前記１つまたは複数の第２パラメータの値の１つまたは複数の第２校正値に対応する腫瘍ＤＮＡの分画濃度を特定し、そして
前記第１校正データ点および第２校正データ点は多次元曲線上の点であり、そして前記比較は、第１値および１つまたは複数の第２値に対応する座標を有する多次元点を同定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
校正データ点が、前記第１パラメータの値の校正値に対応する腫瘍ＤＮＡの分画濃度を特定し、そして前記校正データは異なる校正試料に対応するヒストグラムから決定され、ここでヒストグラムが複数のサイズのＤＮＡ断片の量を提供し、異なる校正試料の少なくとも一部は異なる分画濃度を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記１つまたは複数の読み取り配列はＤＮＡ断片の全長配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記１つまたは複数の読み取り配列は環状化ＤＮＡ断片から得られる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記１つまたは複数の読み取り配列はナノポアベースのシーケンサーから得られる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記１つまたは複数の読み取り配列は超並列ペアエンドシーケンシングより得られる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
複数の分画濃度にわたり校正値を近似する関数を決定することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記試料は血漿試料である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
コンピュータシステムにより実行され得る複数の命令を含むコンピュータプログラムであって、実行される場合、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法を実行するように前記コンピュータシステムを制御するコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月８日に出願された「ＳＩＺＥ－ＢＡＳＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＦＥＴＡＬ ＤＮＡ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＩＮ ＭＡＴＥＲＮＡＬ ＰＬＡＳＭＡ」と題する米国仮特許出願第６１／６０８，６２３号、および２０１２年４月６日に出願された「ＳＩＺＥ－ＢＡＳＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＦＥＴＡＬ ＤＮＡ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＩＮ ＭＡＴＥＲＮＡＬ ＰＬＡＳＭＡ」と題する米国仮特許出願６１／６２１，４５１号の優先権の利益を主張する非仮特許出願であり、それらの全内容は、あらゆる目的において参照により本明細書中に援用される。
本出願は、２０１２年３月８日に出願された「ＳＩＺＥ－ＢＡＳＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＦＥＴＡＬ ＤＮＡ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＩＮ ＭＡＴＥＲＮＡＬ ＰＬＡＳＭＡ」と題する米国仮特許出願第６１／６０８，６２３号、および２０１２年４月６日に出願された「ＳＩＺＥ－ＢＡＳＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＦＥＴＡＬ ＤＮＡ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＩＮ ＭＡＴＥＲＮＡＬ ＰＬＡＳＭＡ」と題する米国仮特許出願６１／６２１，４５１号の優先権の利益を主張する非仮特許出願であり、それらの全内容は、あらゆる目的において参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【0002】
母親血漿中における無細胞胎児ＤＮＡの発見が、非侵襲的な出生前診断の新たな可能性を切り開いてきた（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ １９９７；３５０：４８５－４８７）。分画胎児ＤＮＡ濃度の平均／中央値は、約３％～１０％であることが報告されている（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８；６２：７６８－７７５；Ｌｕｎ ＦＭＦ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００８；５４：１６６４－１６７２）。分画胎児ＤＮＡ濃度は、母体血漿ＤＮＡを用いた非侵襲的な出生前診断テストの性能に影響する重要なパラメータである。例えば、胎児染色体の異数体（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８、またはトリソミー１３）についての非侵襲的な出生前診断では、分画胎児ＤＮＡ濃度が高いほど、母体血漿中における異数染色体由来のＤＮＡ配列がより過剰に発現する。実際に、母体血漿中の分画胎児ＤＮＡ濃度を２分の１にすると、異数性を検出するためにカウントするのが必要な分子数は４倍になる（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００７；１０４：１３１１６－１３１２１）。
【0003】
ランダムな大量並列シーケンシングによる胎児トリソミーの非侵襲的な出生前検出では、試料の分画胎児ＤＮＡ濃度が、ロバストな検出を達成するために必要なシーケンシングの量に影響を与える（Ｆａｎ ＨＣ ａｎｄ Ｑｕａｋｅ ＳＲ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０；５：ｅ１０４３９）。実際、多くのグループでは、品質管理工程を含め、この工程で分画胎児ＤＮＡ濃度をまず測定し、最小分画胎児ＤＮＡ濃度より多くを含む試料のみが診断結果を出すのに適格とした（Ｐａｌｏｍａｋｉ ＧＥ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ２０１１；１３：９１３－９２０）。他のグループでは、特定の母体血漿試料が異数性妊娠由来であるリスクを推定するための診断アルゴリズムに、分画胎児ＤＮＡ濃度を含めた（Ｓｐａｒｋｓ ＡＢ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０１２；２０６：３１９．ｅ１－９）。
【0004】
異数性の検出に加えて、分画胎児ＤＮＡ濃度は、例えば、異常ヘモグロビン症（Ｌｕｎ ＦＭＦ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ２００８；１０５：１９９２０－１９９２５）や血友病（Ｔｓｕｉ ＮＢＹ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２０１１；１１７：３６８４－３６９１）などの単一遺伝子疾患を検出するための母性血漿ＤＮＡを用いた非侵襲的な出生前診断テストにも、同様に影響を与える。また、分画胎児ＤＮＡ濃度は、胎児の全ゲノムシーケンシングに加え、胎児の遺伝および突然変異についてのゲノムマップを構築するために行う必要があるシーケンシングの深さにも影響を与える（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２０１１／０１０５３５３）。
【0005】
分画胎児ＤＮＡ濃度を測定するための多くの方法が記載されている。一つのアプローチは、母系ゲノムには存在しない胎児特異的な父系配列の濃度を測定することである。そのような配列の例として、男児が有するＹ染色体上にある配列、およびＲｈ（Ｄ）陰性の妊婦が宿しているＲｈ（Ｄ）陽性胎児が有するＲＨＤ遺伝子由来の配列が挙げられる。また、母体および胎児の両方に存在する配列を用いて、全母体血漿ＤＮＡを測定することができる。それから、分画胎児ＤＮＡ濃度に達するために、全母体血漿ＤＮＡの濃度を超える胎児特異的な父系配列の濃度の比率を計算できる。
【0006】
使用可能な配列の別の例として、一塩基多型の使用が挙げられる（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）。分画胎児ＤＮＡ濃度を測定するための遺伝子マーカーを使用することの欠点は、どの遺伝子マーカーセットも単体では全ての胎児－母体ペアについての情報を提供できないことである。使用可能な更に別の方法として、母体血漿における胎児または胎盤特異的なＤＮＡメチル化パターンを示すＤＮＡ配列を使用することが挙げられる（Ｎｙｇｒｅｎ ＡＯ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０１０；５６：１６２７－１６３５）。ＤＮＡメチル化マーカーを使用することについての潜在的な欠点は、ＤＮＡメチル化のレベルは個体間で差があるということである。更に、ＤＮＡメチル化マーカーの検出に使用される方法は、通常複雑であり、メチル化感受性制限酵素による消化（Ｃｈａｎ ＫＣＡ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００８；５２：２２１１－２２１８）または亜硫酸水素塩転換（Ｃｈｉｍ ＳＳＣ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５；１０２：１４７５３－１４７５８）またはメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ ＥＡ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１１；１７：５１０－５１３）を利用することなどが含まれる。
【0007】
分画胎児ＤＮＡ濃度は重要な値なので、その値を決定するための追加的な方法およびシステムを有することが望ましい。
【発明の概要】
【0008】
実施形態は、生体試料由来のＤＮＡの混合物における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を、様々なサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて推定するための方法およびシステムを提供し得る。例えば、母体の血漿における胎児ＤＮＡまたは患者の血漿における腫瘍ＤＮＡの分画濃度が測定できる。ＤＮＡ断片のサイズは、胎児ＤＮＡの割合および腫瘍ＤＮＡの割合と相関していることが示された。（例えば、校正関数としての）校正データ点は、サイズパラメータの値と臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度との間の対応関係を示す。ある試料について、サイズパラメータの第１値は、試料におけるＤＮＡ断片のサイズから決定できる。第１値を校正データ点と比較することにより、臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度が推定できる。
【0009】
一実施形態によれば、方法は、生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を推定するものであり、ここで生体試料は臨床的に関連するＤＮＡおよびその他のＤＮＡを含む。複数のサイズのうちの各サイズについて、そのサイズに対応する生体試料由来の複数のＤＮＡ断片の量を測定する。コンピュータシステムは、第１パラメータの第１値を複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて計算する。第１パラメータは、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度を提供する。１つまたは複数の第１校正データ点が得られる。各第１校正データ点は、第１パラメータの校正値に対応する臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を特定する。１つまたは複数の校正データ点は、複数の校正試料から決定される。第１値を少なくとも１つの校正データ点の校正値と比較する。生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を当該比較に基づいて推定する。
【0010】
別の実施形態によれば、方法は、生物の生体試料を解析するものである。生体試料は、正常細胞由来のＤＮＡと、癌に関連しているおそれがある細胞由来のＤＮＡを含む。少なくともＤＮＡの一部は、生体試料における無細胞ＤＮＡである。複数のサイズのうちの各サイズについて、そのサイズに対応する生体試料由来の複数のＤＮＡ断片の量を測定する。コンピュータシステムは、第１パラメータの第１値を複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて計算する。第１パラメータは、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度を提供する。第１値を基準値と比較する。生物の癌のレベルの区分を当該比較に基づいて決定する。
【0011】
他の実施形態は、本明細書に記載の方法に関連するシステム、携帯可能な消費者用装置、およびコンピュータ可読媒体に関する。
【0012】
本発明の性質および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【発明を実施するための形態】
【0036】
定義
本明細書で使用する場合、用語「生体試料」とは、被験者（例えば、妊婦などのヒト）から採取され、対象とする１つまたは複数の核酸分子を含有するいずれかの試料を指す。例として、血漿、唾液、胸水、汗、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、糞便および子宮頸部スメア試料が挙げられる。生体試料は、ヒト、動物、または他の適切な生物から得ることができる。「校正試料」は、生体試料に対応するもので、生体試料の臨床的に関連するＤＮＡ画分が、例えば、臨床的に関連するＤＮＡに特異的なアレルを使用する方法等の校正方法によって分かるまたは決定されるものである。臨床的に関連するＤＮＡの例としては、母体の血漿における胎児ＤＮＡまたは患者の血漿における腫瘍ＤＮＡが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「生体試料」とは、被験者（例えば、妊婦などのヒト）から採取され、対象とする１つまたは複数の核酸分子を含有するいずれかの試料を指す。例として、血漿、唾液、胸水、汗、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、糞便および子宮頸部スメア試料が挙げられる。生体試料は、ヒト、動物、または他の適切な生物から得ることができる。「校正試料」は、生体試料に対応するもので、生体試料の臨床的に関連するＤＮＡ画分が、例えば、臨床的に関連するＤＮＡに特異的なアレルを使用する方法等の校正方法によって分かるまたは決定されるものである。臨床的に関連するＤＮＡの例としては、母体の血漿における胎児ＤＮＡまたは患者の血漿における腫瘍ＤＮＡが挙げられる。
【0037】
本明細書で使用する場合、用語「座位（ｌｏｃｕｓ）」又はその複数形の「座位（ｌｏｃｉ）」とは、ゲノム間で多様性を有する任意の長さのヌクレオチド（又は塩基対）の位置又はアドレスのことである。用語「読み取り配列」とは、核酸分子、例えば、ＤＮＡ断片の全部または一部から得られる配列を指す。一実施形態では、断片の一方の末端のみがシーケンシングされる。代わりに、断片の両方の末端（例えば、各末端から約３０ｂｐ）をシーケンシングして２つの読み取り配列を生成してもよい。その後、この一対の読み取り配列を参照ゲノムにアラインして、断片の長さが分かるようにしてもよい。更に別の実施形態では、直鎖状ＤＮＡ断片を、例えば、ライゲーションにより環状化してもよく、ライゲーション部位にまたがる部分をシーケンシングしてもよい。
【0038】
用語「ユニバーサルシーケンシング」とは、アダプターを断片の末端に加え、シーケンシング用のプライマーをアダプターに結合させるシーケンシングのことを指す。従って、任意の断片を同じプライマーを用いてシーケンシングすることができ、シーケンシングがランダムにできる。
【0039】
分画胎児ＤＮＡ濃度という用語は、胎児ＤＮＡの割合および胎児ＤＮＡ画分という用語と交換可能に使用され、生体試料（例えば、母体血漿または血清試料）中に存在する胎児から由来した胎児ＤＮＡ分子の割合を指す（Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８；６２：７６８－７７５；Ｌｕｎ ＦＭＦ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００８；５４：１６６４－１６７２）。同様に、分画腫瘍ＤＮＡ濃度という用語は、腫瘍ＤＮＡの割合および腫瘍ＤＮＡ画分という用語と交換可能に使用され、生体試料中に存在する腫瘍ＤＮＡ分子の割合を指す。
【0040】
用語「サイズプロファイル」は、一般に、生体試料中におけるＤＮＡ断片のサイズに関するものである。サイズプロファイルは、様々なサイズのＤＮＡ断片の量の分布を示すヒストグラムであってもよい。様々な統計パラメータ（サイズパラメータまたは単にパラメータとも呼ばれる）が、あるサイズプロファイルと別のサイズプロファイルとを区別するために使用できる。パラメータの１つとして、全ＤＮＡ断片に対するまたは他のサイズ範囲のＤＮＡ断片に対する、特定のサイズまたはサイズ範囲のＤＮＡ断片の割合がある。
【0041】
「臨床的に関連する」ＤＮＡの例としては、母体の血漿における胎児ＤＮＡおよび患者の血漿における腫瘍ＤＮＡが挙げられる。別の例として、移植患者の血漿における移植片に関連するＤＮＡの量の測定値が挙げられる。更なる例として、被験者の血漿における造血ＤＮＡと非造血ＤＮＡとの相対量の測定値が挙げられる。この後者の実施形態は、造血および／または非造血組織が関連する病理学的プロセスまたは傷害を検出またはモニタリングまたは予知するのに使用できる。
【0042】
「校正データ点（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ）」は、「校正値（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）」および対象とするＤＮＡ（すなわち、臨床的に関連するＤＮＡ）について測定された分画濃度あるいは既知の分画濃度を含む。校正値とは、臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度が既知である校正試料について決定されたサイズパラメータの値である。校正データ点は、様々な方法で定義でき、例えば、離散点として、または校正関数（検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）もしくは検量面（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ）とも呼ばれる）として定義できる。
【0043】
用語「癌のレベル」とは、癌が存在するか否か、癌の段階、腫瘍のサイズ、ある染色体領域において欠失または増幅がいくつあるか（例えば、２重または３重）、および／または癌の重症度についてのその他の尺度を指すことがある。癌のレベルは数字またはその他の記号であってもよい。レベルはゼロの場合もある。癌のレベルには、欠失または増幅に関連する前悪性または前癌状態も含まれる。
【0044】
詳細な説明
母体血漿中に存在する無細胞胎児ＤＮＡ分子は、一般的に、母親由来の分子よりも短いことが知られている（Ｃｈａｎ ＫＣＡ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：８８－９２；Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）。胎児ＤＮＡの存在により、母体血漿ＤＮＡの全体的なサイズ分布がシフトし、そのシフトの程度が胎児ＤＮＡの分画濃度と関連する。母体血漿ＤＮＡのサイズプロファイルの特定の値を測定することにより、実施形態で母体血漿中の分画胎児ＤＮＡ濃度を得ることができる。
母体血漿中に存在する無細胞胎児ＤＮＡ分子は、一般的に、母親由来の分子よりも短いことが知られている（Ｃｈａｎ ＫＣＡ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：８８－９２；Ｌｏ ＹＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）。胎児ＤＮＡの存在により、母体血漿ＤＮＡの全体的なサイズ分布がシフトし、そのシフトの程度が胎児ＤＮＡの分画濃度と関連する。母体血漿ＤＮＡのサイズプロファイルの特定の値を測定することにより、実施形態で母体血漿中の分画胎児ＤＮＡ濃度を得ることができる。
【0045】
また、非侵襲的な出生前診断における用途とは別に、実施形態は、癌の検出、移植、および医学的なモニタリングをするのに有用な可能性のある生物の液中にある様々なサイズの臨床的に有用な核酸種の分画濃度を測定するのに使用できる。以前から、癌患者の血漿中では、腫瘍由来のＤＮＡは非癌由来のＤＮＡよりも短いことが示されている（Ｄｉｅｈｌ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５；１０２：１６３６８－１６３７３）。移植関連では、造血由来のＤＮＡは、非造血ＤＮＡよりも短いことが示されている（Ｚｈｅｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０１２；５８：５４９－５５８）。例えば、患者がドナーから肝臓を受けると、その血漿中では肝臓（成人では非造血器官）由来のＤＮＡが造血由来のＤＮＡよりも短くなる（Ｚｈｅｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０１２；５８：５４９－５５８）。同様に、心筋梗塞または脳卒中の患者では、損傷を受けた非造血器官（すなわち、それぞれ心臓および脳）から放出されたＤＮＡにより、血漿ＤＮＡのサイズプロファイルは短いサイズ範囲にシフトする結果となることが期待されるであろう。
【0046】
Ｉ．サイズ分布
実施形態を実証するために、例えば、ペアエンド大量並列シーケンシングあるいは（例えば、バイオアナライザーを使用した）電気泳動により、サイズプロファイルを測定することができることを以下の実施例で示す。バイオアナライザーを用いた電気泳動は迅速かつ比較的安価な手順であるため、後者の例が特に有用である。これにより、血漿ＤＮＡ試料を比較的高価なシーケンシングプロセスに供する前に、この解析を品質管理手段として迅速に実行できるだろう。
実施形態を実証するために、例えば、ペアエンド大量並列シーケンシングあるいは（例えば、バイオアナライザーを使用した）電気泳動により、サイズプロファイルを測定することができることを以下の実施例で示す。バイオアナライザーを用いた電気泳動は迅速かつ比較的安価な手順であるため、後者の例が特に有用である。これにより、血漿ＤＮＡ試料を比較的高価なシーケンシングプロセスに供する前に、この解析を品質管理手段として迅速に実行できるだろう。
【0047】
図１は、本発明の実施形態に従った、母体血漿中の循環無細胞ＤＮＡのサイズ分布についてのプロット１００を示す。サイズ分布は、ＤＮＡ断片のサイズを測定し、その後、様々なサイズ、例えば、５０塩基～約２２０塩基の範囲内のＤＮＡ断片の数を数えることで得ることができる。プロット１００は、２つの分布を示す。分布１１０は、母体血漿試料における全ＤＮＡ断片についてのものであり、分布１２０は、胎児由来のＤＮＡのみについてのものである。横軸は、ＤＮＡ断片の塩基対（ｂｐ）のサイズである。縦軸は、測定したＤＮＡ断片の割合である。
【0048】
図１では、母体血漿における胎児由来のＤＮＡのサイズ分布は、母親由来のものよりも短いことが示される（Ｃｈａｎ ＫＣ ｅｔ ａｌ． ＣｌｉｎＣｈｅｍ ２００４；５０：８８－９２）。近年、我々は、妊婦における胎児特異的ＤＮＡおよび（主に母親由来の）全ＤＮＡについて解像度の高いサイズ分布を決定するために、ペアエンド超並列配列解析を使用してきた。我々は、ＤＮＡにおける２つの種の間の主な違いは、胎児由来のＤＮＡだと１６６ｂｐのＤＮＡ断片の分画が減少し、１５０ｂｐ以下の短いＤＮＡの割合が増加することであることを示した（Ｌｏ ＹＭ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０ ２：６１ｒａ９１）。
【0049】
ここで、我々は、母体血漿試料（生体試料の一例）における全ＤＮＡ断片のサイズ分布の解析をすることが、母体血漿における胎児ＤＮＡの分画濃度を測定するのにいかに有用であるかを概説する。母体血漿における胎児ＤＮＡの分画濃度が増加すると、全ＤＮＡについての全体的なサイズ分布が短くなる。一実施形態では、約１４４ｂｐのＤＮＡ断片と約１６６ｂｐのＤＮＡ断片との相対量（パラメータの一例）が、胎児ＤＮＡの分画濃度を反映させるのに使用できる。別の実施形態では、サイズプロファイルに関する他のパラメータまたはパラメータの組み合わせが血漿ＤＮＡのサイズ分布を反映させるのに使用できる。
【0050】
図２Ａは、本発明の実施形態に従った、異なる分画胎児ＤＮＡ濃度を有する２つの母体血漿試料における胎児ＤＮＡ（妊娠第１期）のサイズ分布についてのプロット２００を示す。これら二人の妊婦は、いずれも男児を宿していた。分画胎児ＤＮＡ濃度は、全シーケンシングされたＤＮＡ断片におけるＹ染色体由来の配列の割合から決定した。両方の試料は、妊娠第１期の妊婦から採取した。ケース３３８（実線、分画胎児ＤＮＡ濃度は１０％）は、ケース２６３（点線、分画胎児ＤＮＡ濃度は２０％）よりも低い分画胎児ＤＮＡ濃度を有していた。ケース２６３と比較すると、ケース３３８は、１６６ｂｐにおけるピークは高かったが、１５０ｂｐ未満のサイズのピークは低かった。言い換えると、ケース２６３では１５０ｂｐ未満のＤＮＡ断片がより多く、一方ケース３３８では約１６６ｂｐの断片がより多かった。これらの観察は、短いＤＮＡとおよび長いＤＮＡとの相対量が分画胎児ＤＮＡ濃度に相関しうるという仮説と一致する。
【0051】
図２Ｂは、本発明の実施形態に従った、異なる分画胎児ＤＮＡ濃度を有する２つの母体血漿試料における胎児ＤＮＡ（妊娠第２期）のサイズ分布についてのプロット２５０を示す。両方の試料は、妊娠第２期の妊婦から採取した。これら二人の妊婦は、いずれも男児を宿していた。分画胎児ＤＮＡ濃度は、全シーケンシングされたＤＮＡ断片におけるＹ染色体由来の配列の割合から決定した。先の実施例と同様に、ケース５４１５（点線、分画胎児ＤＮＡ濃度は１９％と高め）は、１５０ｂｐ未満のサイズのピークが高く、一方ケース５１６６（実線、分画胎児ＤＮＡ濃度は１２％と低め）では１６６ｂｐにおけるピークが高かった。
【0052】
分画胎児ＤＮＡ濃度の値に対する異なる値のサイズパラメータの相関を、以下のデータプロットに示す。さらに、腫瘍ＤＮＡの断片のサイズは、腫瘍ＤＮＡ断片および正常細胞由来のＤＮＡ断片を有する試料における腫瘍ＤＮＡ断片の割合に相関する。したがって、腫瘍断片のサイズも、試料における腫瘍断片の割合を決定するのに使用できる。
【0053】
ＩＩ．方法
ＤＮＡ断片のサイズは分画濃度（割合とも呼ばれる）に相関しているので、実施形態では、この相関関係を利用して試料における特定の種類のＤＮＡ（例えば、胎児ＤＮＡまたは腫瘍由来のＤＮＡ）の分画濃度を決定できる。特定の種類のＤＮＡは、臨床的に関連するＤＮＡであり、その分画濃度が推定対象である。したがって、この方法は、測定したＤＮＡ断片のサイズに基づいて、生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を推定することができる。
ＤＮＡ断片のサイズは分画濃度（割合とも呼ばれる）に相関しているので、実施形態では、この相関関係を利用して試料における特定の種類のＤＮＡ（例えば、胎児ＤＮＡまたは腫瘍由来のＤＮＡ）の分画濃度を決定できる。特定の種類のＤＮＡは、臨床的に関連するＤＮＡであり、その分画濃度が推定対象である。したがって、この方法は、測定したＤＮＡ断片のサイズに基づいて、生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を推定することができる。
【0054】
図３は、本発明の実施形態に従った、生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を推定する方法を示す方法３００のフローチャートである。生体試料は、臨床的に関連するＤＮＡおよびその他のＤＮＡを含む。生体試料は、患者、例えば、胎児を宿している妊婦の被験体から得ることができる。別の実施形態では、患者は腫瘍を有してもよく、または有すると疑われる者であってもよい。一実施態様では、生体試料は、ＤＮＡ断片のサイズを決定するのに利用可能な測定データ（例えば、読み取り配列）を出力する装置、例えば、シーケンシング装置に受けることができる。方法３００は、本明細書に記載される他の方法と同様、全部または一部をコンピュータシステムによって実行してもよい。
【0055】
ブロック３１０では、様々なサイズに対応するＤＮＡ断片の量を測定する。複数のサイズのうちの各サイズについて、そのサイズに対応する生体試料由来の複数のＤＮＡ断片の量を測定することができる。例えば、１４０塩基の長さを有するＤＮＡ断片の数を測定できる。この量をヒストグラムとして保存してもよい。一実施形態では、生体試料由来の複数の核酸のうちの各核酸のサイズを測定する。この測定は個別に行ってもよく（例えば、一分子のシーケンシングにより）、またはグループ単位で行ってもよい（例えば、電気泳動により）。サイズは、ある範囲に対応することもある。したがって、量は、サイズが特定の範囲内にあるＤＮＡ断片であってもよい。
【0056】
複数のＤＮＡ断片を、ランダムに選択またはゲノムの１つまたは複数の所定の領域から優先的に選択できる。例えば、上述したように、標的の濃縮を行ってもよい。別の実施形態では、ＤＮＡ断片は、ランダムに（例えば、ユニバーサルシークエンシングを用いて）シーケンシングでき、得られた読み取り配列を、被験体（例えば、参照ヒトゲノム）に対応するゲノムにアラインさせることができる。そして、読み取り配列が１つまたは複数の所定の領域にアラインするＤＮＡ断片のみをサイズを決定するのに使用できる。
【0057】
様々な実施形態では、サイズは、質量、長さ、または他の適切なサイズ測定値であり得る。本明細書に記載のように、測定は様々な方法で行うことができる。例えば、ペアエンドシーケンシングおよびＤＮＡ断片のアライメントを行ってもよく、または電気泳動を利用してもよい。生体試料の正確なサイズプロファイル提供するために、統計学的に有意なＤＮＡ断片数を測定してもよい。統計学的に有意なＤＮＡ断片数の例として、１００，０００超；１，０００，０００超；２，０００，０００超、または他の適切な値が挙げられるが、これは求める精度に依存しうる。
【0058】
一実施形態では、ペアエンドシーケンシングまたは電気泳動などの物理的測定から得られたデータを、コンピュータで受信し、解析して、ＤＮＡ断片のサイズの測定を達成してもよい。例えば、ペアエンドシーケンシングによる読み取り配列を（例えば、アラインメントにより）解析してサイズを決定してもよい。別の例として、電気泳動から得られた電気泳動図を解析してサイズを決定してもよい。一実施態様では、ＤＮＡ断片の解析には、シークエンシングまたはＤＮＡ断片を電気泳動にかけるといった実際のプロセスを含むが、別の実施態様では、得られたデータの解析を行うのみであってもよい。
【0059】
ブロック３２０では、第１パラメータの第１値を複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて計算する。一態様では、第１パラメータは、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度（例えば、ヒストグラム）を提供する。このパラメータは、複数のＤＮＡ断片のサイズから決定されるため、サイズパラメータと呼ぶことがある。
【0060】
第１パラメータは、様々な形態をとり得る。このようなパラメータが、特定のサイズのＤＮＡ断片の数を全断片数で除した値であり、これはヒストグラム（特定のサイズの断片の絶対的または相対的な数を提供する任意のデータ構造）から得ることができる。別の例として、パラメータは、特定のサイズまたは特定の範囲の断片の数を、別のサイズまたは範囲の断片数で除した値であることもある。除算することで、異なる試料について、解析対象のＤＮＡ断片数の違いを考慮した正規化として機能し得る。正規化は、各試料について同じ数のＤＮＡ断片を解析することによって達成できるが、これは解析対象の全断片数で除することでも同じ結果が得られる。他のパラメータの例を、本明細書に記載する。
【0061】
ブロック３３０では、１つまたは複数の第１校正データ点を得る。各第１校正データ点は、第１パラメータの特定の値（校正値）に対応する臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を特定できる。分画濃度は、特定の濃度または濃度範囲として特定できる。校正値は、複数の校正試料から決定された第１パラメータ（すなわち、特定のサイズパラメータ）の値に対応しうる。校正データ点は、既知の分画濃度を有する校正試料から決定でき、分画濃度は、本明細書に記載の様々な技術によって測定できる。少なくともいくつかの校正試料は異なる分画濃度を有するが、いくつかの校正試料は同じ分画濃度を有していてもよい。
【0062】
様々な実施形態では、１つまたは複数の校正点は、１つの離散点として、離散点のセットとして、関数として、１つの離散点と関数として、あるいは他の離散的または連続的な値のセットの組み合わせとして、定義してもよい。例として、校正データ点は、特定の分画濃度の試料について、サイズパラメータ（例えば、特定のサイズまたはサイズ範囲内の断片数）の１つの校正値から決定できる。複数のヒストグラムを、各校正試料についての別のヒストグラムとともに使用してもよく、そのうちのいくつかの校正試料は同じ分画濃度を有してもよい。
【0063】
一実施形態では、同じ分画濃度の複数の試料から得た同じサイズパラメータについての測定値を組み合わせて、特定の分画濃度についての校正データ点を決定できる。例えば、サイズパラメータの値の平均を同じ分画濃度の試料のサイズデータから得て、特定の校正データ点を決定（または校正データ点に対応する範囲を提供）できる。別の実施形態では、同じ校正値を有する複数のデータ点を使用して、平均分画濃度を決定できる。
【0064】
一実施態様では、多くの校正試料についてＤＮＡ断片のサイズを測定する。同じサイズパラメータの校正値を各校正試料について測定する。各校正試料についてのサイズパラメータを、試料の既知の分画濃度に対しプロットしてもよい。関数当てはめにより新しい試料の分画濃度を決定するのに使用できる校正データ点を定義する関数をプロットのデータ点に当てはめてもよい。
【0065】
ブロック３４０では、第１値を少なくとも１つの校正データ点の校正値と比較する。比較は様々な方法で行うことができる。例えば、比較は、第１値が校正値よりも高いか低いかということであってもよい。比較は、（校正データ点からなる）検量線と比較することを含み得るので、比較により、第１パラメータの第１値を有する曲線上の点を同定することができる。例えば、（新しい試料中におけるＤＮＡサイズの測定値から決定される）第１パラメータの計算値Ｘは、Ｆが校正関数（曲線）である関数Ｆ（Ｘ）に代入するのに使用できる。Ｆ（Ｘ）の算出値は、分画濃度である。誤差範囲は、各Ｘ値について異なっていてもよく、これによりＦ（Ｘ）の算出値の範囲が設けられる。
【0066】
ステップ３５０では、生体試料における臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を、比較に基づいて推定する。一実施形態では、第１パラメータの第１値が校正閾値より大きいまたは小さいか否かを決定し、これにより当該試料について推定した分画濃度が校正閾値に対応する分画濃度より大きいまたは小さいか否かを決定する。例えば、生体試料について計算した第１値Ｘ1が校正値ＸCより大きい場合、この生体試料の分画濃度ＦＣ1はＸCに対応する分画濃度ＦＣCより大きいと決定できる。この比較は、例えば、胎児の異数性のテストなど他のテストを行うのに生体試料中に十分な分画濃度があるか否かを決定するのに使用できる。この大きい小さいという関係は、パラメータをいかに定義するかに依存し得る。このような実施形態では、１つの校正データ点のみが必要であってもよい。
【0067】
別の実施形態では、比較は、校正関数に第１値を代入することによって達成される。校正関数は、第１値に対応する曲線上の点を同定することによって、第１値を効果的に校正値と比較することができる。推定した分画濃度を、校正関数の算出値として設ける。
【0068】
一実施形態では、生体試料についての複数のパラメータの値を決定できる。例えば、その生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルが異なる統計的尺度に対応する第２パラメータについての第２値を決定できる。第２値は、ＤＮＡ断片の同じサイズ尺度、または異なるサイズ尺度を用いて決定できる。各パラメータは、異なる検量線に対応しうる。一実施態様では、異なる値を、独立して異なる検量線と比較して複数の推定分画濃度を得ることができ、これらを平均してもよく、または算出範囲を設けるために用いてもよい。
【0069】
別の実施態様では、異なる値のパラメータを分画濃度を算出する単一の校正関数に効果的に代入できる多次元検量線を用いてもよい。単一の校正関数は、校正試料から得られた全てのデータ点を関数当てはめすることにより得られる。したがって、一実施形態では、第１校正データ点および第２校正データ点を多次元曲線上の点とすることができ、この曲線の場合、比較は、第１値および１つまたは複数の第２値に対応する座標を有する多次元の点を同定することを含む。
【0070】
ＩＩＩ．サイズの決定
血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、これらに限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を利用して決定できる。様々な実施形態では、測定するサイズは、長さ、分子量、または長さもしくは分子量に比例する測定パラメータ、例えばエレクトロフェログラムにおける移動度や電気泳動もしくは質量分析計において一定距離を移動するのにかかる時間などである。別の例では、ＤＮＡを、結合した染料の量が、ＤＮＡ分子の長さに比例するように、インターカレーター性蛍光色素、例えば臭化エチジウム又はＳＹＢＲグリーンで染色できる。ＵＶ光が試料に照射されたとき発する蛍光の強度によって結合した色素の量を決定できる。サイズを測定するためのいくつかの例およびその結果のデータを以下に記載する。
血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、これらに限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を利用して決定できる。様々な実施形態では、測定するサイズは、長さ、分子量、または長さもしくは分子量に比例する測定パラメータ、例えばエレクトロフェログラムにおける移動度や電気泳動もしくは質量分析計において一定距離を移動するのにかかる時間などである。別の例では、ＤＮＡを、結合した染料の量が、ＤＮＡ分子の長さに比例するように、インターカレーター性蛍光色素、例えば臭化エチジウム又はＳＹＢＲグリーンで染色できる。ＵＶ光が試料に照射されたとき発する蛍光の強度によって結合した色素の量を決定できる。サイズを測定するためのいくつかの例およびその結果のデータを以下に記載する。
【0071】
Ａ．シーケンシングを利用した第１胎児試料セット
表１は、例として、胎児ＤＮＡ画分に関する試料情報およびシーケンシング解析を示す。血漿試料は、それぞれ１人の男児を宿している８０人の妊婦から採取した。８０人の妊婦のうち、３９人は正倍数体の胎児を宿しており、１８人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿しており、１０人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１３人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿していた。血漿ＤＮＡのサイズ分布は、ペアエンド大量並列シーケンシングを用いて決定した。母体血漿ＤＮＡのシーケンシングライブラリーは、６塩基のバーコードを３回のプライマーＰＣＲ増幅により各血漿試料のＤＮＡ分子へ導入した以外は従前に記載（Ｌｏ ＹＭ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）のように構築した。
表１は、例として、胎児ＤＮＡ画分に関する試料情報およびシーケンシング解析を示す。血漿試料は、それぞれ１人の男児を宿している８０人の妊婦から採取した。８０人の妊婦のうち、３９人は正倍数体の胎児を宿しており、１８人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿しており、１０人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１３人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿していた。血漿ＤＮＡのサイズ分布は、ペアエンド大量並列シーケンシングを用いて決定した。母体血漿ＤＮＡのシーケンシングライブラリーは、６塩基のバーコードを３回のプライマーＰＣＲ増幅により各血漿試料のＤＮＡ分子へ導入した以外は従前に記載（Ｌｏ ＹＭ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）のように構築した。
【0072】
２つの試料を１シーケンシングレーン（すなわち２プレックスシーケンシング）に導入した。別の実施形態では、２個より多くの試料、例えば、６個、または１２個、または２０個、または２０個を超える試料を１シーケンシングレーンに導入できる。全ライブリは、３６ｂｐ×２ＰＥフォーマットを用いたＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりシーケンシングした。更に７サイクルのシーケンシングを行い、それぞれシーケンシングした血漿ＤＮＡ分子上のインデックス配列をデコードした。３６ｂｐの読み取り配列は、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ２（ＳＯＡＰ２）（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ）を用いてリピート領域をマスクしないヒト参照ゲノム（Ｈｇ１８）（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）にアラインした。個々のメンバーのペアエンド（ＰＥ）読み取り配列は、フローセル上の同じクラスタ位置でシーケンシングし、そして、ヒトゲノムの単一の位置に正しい方向で特異的にアラインした。ここで、ヌクレオチドのミスマッチは見られなかった。他の実施形態では、アラインメントは、特異的でなくてもよく、ミスマッチも許容され得る。
【0073】
６００ｂｐ以下の挿入サイズを示したＰＥ読み取り配列のみを解析用に回収した。これらの基準によると、これらの実験で解析した血漿ＤＮＡ断片のサイズは、３６ｂｐ～６００ｂｐの範囲にあった。それぞれシーケンシングしたＤＮＡ断片のサイズを、シーケンシングした断片の各末端における最も外側のヌクレオチドの座標から推定した。
【0074】
【表1】
【0075】
表１は、様々な異数性状態の試料についてのデータを示す。データには、症例数、妊娠期間の中央値と範囲、ペアエンド読み取り配列の数の中央値と範囲、胎児ＤＮＡ画分の中央値と範囲が含まれる。
【0076】
母体血漿試料における胎児ＤＮＡの分画濃度は、先に記載のようにＹ染色体にアラインする配列の量から導き出した（Ｃｈｉｕ ＲＷ ｅｔ ａｌ． ＢＭＪ ２０１１；３４２：ｃ７４０１）。この技術は、校正方法の一例である。したがって、表１で測定された胎児ＤＮＡ画分を校正データ点に使用して、新しい試料における胎児ＤＮＡ画分を推定できる。表１のデータを収集するために使用される試料を、校正試料とすることができる。
【0077】
Ｂ．標的シーケンシングを利用した第２胎児試料セット
表２は、試料情報および本発明の実施形態に従って標的を濃縮した母体血漿ＤＮＡを示す。血漿試料は、それぞれ１人の男児を宿している４８人の妊婦から採取した。４８人の妊婦のうち、２１人は正倍数体の胎児を宿しており、１７人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿しており、９人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿していた。これらのデータは、以下の実施例と共に、標的技術を用いることができる実施形態を示すものである。血漿ＤＮＡのサイズ分布は、ペアエンド大量並列シーケンシングを用いて決定できる。他の実施形態では、血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、これらに限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を利用して決定できる。
表２は、試料情報および本発明の実施形態に従って標的を濃縮した母体血漿ＤＮＡを示す。血漿試料は、それぞれ１人の男児を宿している４８人の妊婦から採取した。４８人の妊婦のうち、２１人は正倍数体の胎児を宿しており、１７人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿しており、９人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿していた。これらのデータは、以下の実施例と共に、標的技術を用いることができる実施形態を示すものである。血漿ＤＮＡのサイズ分布は、ペアエンド大量並列シーケンシングを用いて決定できる。他の実施形態では、血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、これらに限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を利用して決定できる。
【0078】
高倍率（ｈｉｇｈ－ｆｏｌｄ）シーケンシングで標的領域をカバーするために、一実施形態ではＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｃｈｒ７（０．９Ｍｂ領域）、ｃｈｒ１３（１．１Ｍｂ領域）、ｃｈｒ１８（１．２Ｍｂ領域）およびｃｈｒ２１（１．３Ｍｂ領域）のＤＮＡ分子を捕捉するプローブを設計した。このプローブ設計において、ｃｈｒ７、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、およびｃｈｒ２１のダウン症候群に関する重要領域（２１ｑ２２．１－ｑ２２．３）にあるエキソンをまず標的領域として選択した。ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８およびｃｈｒ２１は、ｃｈｒ７よりもエキソン領域が少ないので、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１８、およびｃｈｒ２１のダウン症候群に関する重要領域には追加の非エキソン領域を導入し、上記４つの染色体間の標的領域の全長のバランスをとった。選択した非エキソン領域は、１２０ｂｐの長さで、特異的にマッピング可能で、ＧＣ含量が０．５に近く、そして標的染色体にわたって均一に分布していた。
【0079】
上記エキソンおよび非エキソン領域の全ての座標をプローブ設計用にＡｇｉｌｅｎｔ ｅＡｒｒａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍに供した。５００ｎｇの各母体血漿ＤＮＡライブラリーを、捕捉プローブと共に６５℃で２４時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、標的ＤＮＡ分子を溶離し、製造業者の説明書に従い１２サイクルのＰＣＲによって増幅した。標的を濃縮したライブリは、５０ｂｐ×２ＰＥフォーマットを用いたＧＡ ＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりシーケンシングした。更に７サイクルのシーケンシングを行い、それぞれシーケンシングした血漿ＤＮＡ分子上のインデックス配列をデコードした。５０ｂｐの読み取り配列は、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ２（ＳＯＡＰ２）（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ）を用いてリピート領域をマスクしないヒト参照ゲノム（Ｈｇ１８）（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）にアラインした。個々のメンバーのＰＥ読み取り配列は、フローセル上の同じクラスタ位置でシーケンシングし、そして、ヒトゲノムの単一の位置に正しい方向で特異的にアラインした。２つのミスマッチが許容された。シーケンシングライブラリーの複雑さは、標的の濃縮後に大幅に減少した。
【0080】
６００ｂｐ以下の挿入サイズを示したＰＥ読み取り配列のみを解析用に回収した。これらの基準によると、この試験で解析した血漿ＤＮＡ断片のサイズは、３６ｂｐ～６００ｂｐの範囲にあった。それぞれシーケンシングしたＤＮＡ断片のサイズを、シーケンシングした断片の各末端における最も外側のヌクレオチドの座標から推定した。母体血漿試料における胎児ＤＮＡの分画濃度は、胎児特異的アレルを有する断片とそれぞれの母体と同じアレルを有する断片との比率より推定した。
【0081】
【表2】
【0082】
表２は、様々な異数性状態の試料について標的をシーケンシングしたデータを示す。
【0083】
Ｃ．胎児サンプルの電気泳動
血漿ＤＮＡのサイズ分布の解析は、大量並列シーケンシングの利用に加え、電気泳動により達成される。電気泳動では、断片が媒体を移動する時間を測定する。粒子のサイズが異なると、媒体を移動するのにかかる時間が異なる。したがって、一実施形態では、母体血漿ＤＮＡのシーケンシングライブラリーのマイクロ流体電気泳動により、母体血漿ＤＮＡのサイズ分布を決定できる。
血漿ＤＮＡのサイズ分布の解析は、大量並列シーケンシングの利用に加え、電気泳動により達成される。電気泳動では、断片が媒体を移動する時間を測定する。粒子のサイズが異なると、媒体を移動するのにかかる時間が異なる。したがって、一実施形態では、母体血漿ＤＮＡのシーケンシングライブラリーのマイクロ流体電気泳動により、母体血漿ＤＮＡのサイズ分布を決定できる。
【0084】
図４は、本発明の実施形態に従った、電気泳動を利用して得られる母体血漿ＤＮＡのサイズ分布を示すプロット４００（エレクトロフェログラム）である。マイクロ流体電気泳動は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。２つの試料のシーケンシングライブラリーのエレクトロフェログラムをプロット４００に示す。Ｘ軸は、ＤＮＡがセンサに到達するまでにかかる時間を示し、ＤＮＡ断片のサイズに対応する。Ｙ軸は、特定の時間にセンサを通過するＤＮＡ断片の蛍光単位（ＦＵ）を表す。
【0085】
ＤＮＡ断片がセンサに到達するまでにかかる時間は、ＤＮＡ断片のサイズと正相関する。バイオアナライザーは、自動的に、被験試料がかかった時間を既知の長さのＤＮＡ断片の混合物（すなわち、ＤＮＡラダー）がかかった時間と比較することにより、時間を断片のサイズに変換できる。続けて、ＤＮＡシーケンシングライブラリーを大量並列シーケンシングを利用してシーケンシングし、そしてＹ染色体配列の分画を用いてこれらの試料の分画胎児ＤＮＡ濃度を決定した。
【0086】
プロット４００において、実線４１０は、分画胎児ＤＮＡ濃度が８．３％の試料ＵＫ９２７９７を示し、破線４２０は、分画胎児ＤＮＡ濃度が２０．３％の試料ＵＫ９４８８４を示す。ＵＫ９２７９７試料と比較して、試料ＵＫ９４８８４（分画胎児ＤＮＡが多い試料）は、２００ｂｐ～２６７ｂｐのＤＮＡサイズに対応する６３秒～７３秒の電気泳動時間の間（領域Ａ）に比較的多いＤＮＡ量を有し、２９２ｂｐまでのＤＮＡサイズに対応する７３秒の電気泳動時間（領域Ｂ）以内に比較的低いＤＮＡ量を有していた。
【0087】
製造業者のプロトコル従い、合計サイズが１２２ｂｐのＤＮＡアダプターおよびプライマーセットを、シーケンシングライブラリー構築のため血漿ＤＮＡに導入した。したがって、領域Ａは、約７８ｂｐ～１４５ｂｐの血漿ＤＮＡ断片に対応し、領域Ｂは、約１７０ｂｐの血漿ＤＮＡ断片に対応する。そのように導き出すことは、ＤＮＡライブラリーの構築のための異なるプロトコルに応用できる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシングルリードシーケンシングライブラリの調製では合計サイズ９２ｂｐのアダプター／プライマーを導入するが、このサイズは、標準的なペアエンドシーケンシングライブラリーの調製では１１９ｂｐになる。
【0088】
別の実施形態では、血漿ＤＮＡは、当業者に知られている全ゲノム増幅システム、例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＰｌａｓｍａＰｌｅｘ ＷＧＡ ｋｉｔ （ｗｗｗ．ｒｕｂｉｃｏｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により増幅できる。増幅産物は、その後バイオアナライザーによって解析できる。さらに別の実施形態では、増幅産物は、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ（ｗｗｗ．ｃａｌｉｐｅｒｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌａｂｃｈｉｐ－ｓｙｓｔｅｍｓ）の電気泳動システムにより解析できる。さらに別の実施形態では、血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、ナノポアベースのシーケンサー（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ））より入手）またはＨｅｌｉｃｏ ＤＮＡ シーケンサー（ｗｗｗ．ｈｅｌｉｃｏｓｂｉｏ．ｃｏｍ）を用いて増幅せずに直接解析できる。
【0089】
ＩＶ．サイズパラメータ
上述のように様々なパラメータが、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度となる。パラメータは、解析するＤＮＡ断片の全サイズのまたは一部のみを使用して決定してもよい。一実施形態では、パラメータは、短いＤＮＡ断片と長いＤＮＡ断片の相対量であり、ここで短いＤＮＡおよび長いＤＮＡは、特定のサイズまたはサイズ範囲に対応しうる。
上述のように様々なパラメータが、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度となる。パラメータは、解析するＤＮＡ断片の全サイズのまたは一部のみを使用して決定してもよい。一実施形態では、パラメータは、短いＤＮＡ断片と長いＤＮＡ断片の相対量であり、ここで短いＤＮＡおよび長いＤＮＡは、特定のサイズまたはサイズ範囲に対応しうる。
【0090】
母体血漿ＤＮＡの全体的なサイズ分布が分画胎児ＤＮＡ濃度を反映させるのに使用できるか否かを調べるために、異なるパラメータを使用して短いＤＮＡおよび長いＤＮＡの相対量を定量し、これらのパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の相関を決定した。これらの調査の結果を以下のセクションで示す。短いＤＮＡの相対量を反映するために、例示として我々が用いたパラメータは、以下を含む：
ｉ．ＣＦ（サイズ≦１５０）と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合。ＣＦは累積度数（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を指す。よって、ＣＦ（サイズ≦１５０）は１５０ｂｐ以下の断片の累積度数を指す。
ｉｉ．（ＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｉｉｉ．（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｉｖ．（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｖ．（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｉ．ＣＦ（サイズ≦１５０）と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合。ＣＦは累積度数（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を指す。よって、ＣＦ（サイズ≦１５０）は１５０ｂｐ以下の断片の累積度数を指す。
ｉｉ．（ＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｉｉｉ．（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｉｖ．（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
ｖ．（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比。
【0091】
パラメータの他の例として、ヒストグラムの頻度数がある。一実施形態では、複数のパラメータを使用してもよい。例えば、各パラメータの値が異なる割合を示すことがあるので、これらの割合の平均を決定してもよい。別の実施形態では、各パラメータが、多次元校正関数の異なる次元に対応し、ここで、新しい試料のパラメータの値は、対応する多次元面上の座標に対応する。
【0092】
Ｖ．サイズと分画濃度との相関
シークエンシングを利用した２つの試料セットを様々なサイズパラメータと分画濃度との相関を説明するのに使用する。リピート要素のサイズの解析も行う。また、電気泳動のデータも、サイズパラメータと分画濃度との相関を示す。
シークエンシングを利用した２つの試料セットを様々なサイズパラメータと分画濃度との相関を説明するのに使用する。リピート要素のサイズの解析も行う。また、電気泳動のデータも、サイズパラメータと分画濃度との相関を示す。
【0093】
Ａ．第１試料セット
図５Ａは、本発明の実施形態に従った、母体血漿における胎児ＤＮＡの割合が様々な試料について、１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット５００である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。正倍数体試料を黒丸で示す。トリソミー１３（Ｔ１３）試料を白三角で示す。トリソミー１８（Ｔ１８）試料を白菱形で示し、トリソミー２１（Ｔ２１）試料を白逆三角で示す。
図５Ａは、本発明の実施形態に従った、母体血漿における胎児ＤＮＡの割合が様々な試料について、１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット５００である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。正倍数体試料を黒丸で示す。トリソミー１３（Ｔ１３）試料を白三角で示す。トリソミー１８（Ｔ１８）試料を白菱形で示し、トリソミー２１（Ｔ２１）試料を白逆三角で示す。
【0094】
全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度と１５０ｂｐ以下のＤＮＡとの割合の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７８７）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫しているようだ。これらの結果は、サイズパラメータの解析が母体血漿試料における分画胎児ＤＮＡ濃度を推定するために有用であることを示唆している。したがって、図５のデータ点を方法３００の校正データ点として使用できる。その後、新たな試料についてのパラメータＣＦ（サイズ≦１５０）が３０であると判定された場合、胎児ＤＮＡの割合は約７％～１６％の間であると推定できる。図５のデータ点も、導き出し示した生データ点に当てはまる校正関数を決定するために使用できる。
【0095】
図５Ｂは、（ＣＦサイズ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット５５０である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８１５）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。
【0096】
図６Ａは、（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット６００である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８０８）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の倍数性の状態が異なる試料間で一貫している。
【0097】
図６Ｂは、（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット６５０である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８０２）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の倍数性の状態が異なる試料間で一貫しているようだ。
【0098】
図７は、（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット７００である。８０個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８３１）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。
【0099】
Ｂ．第２試料セット
図８は、本発明の実施形態に従った、母体血漿における胎児ＤＮＡの割合が様々な試料について１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット８００である。標的を濃縮後に４８個の超並列ペアエンドシーケンシングした母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。正倍数体試料を黒丸で示す。トリソミー１３（Ｔ１３）試料を白三角で示す。トリソミー１８（Ｔ１８）試料を白菱形で示し、トリソミー２１（Ｔ２１）試料を白逆三角で示す。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度と１５０ｂｐ以下のＤＮＡとの割合の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８１６）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。これらの結果は、サイズパラメータの解析が母体血漿試料における分画胎児ＤＮＡ濃度を推定するために有用であることを示唆している。
図８は、本発明の実施形態に従った、母体血漿における胎児ＤＮＡの割合が様々な試料について１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット８００である。標的を濃縮後に４８個の超並列ペアエンドシーケンシングした母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。正倍数体試料を黒丸で示す。トリソミー１３（Ｔ１３）試料を白三角で示す。トリソミー１８（Ｔ１８）試料を白菱形で示し、トリソミー２１（Ｔ２１）試料を白逆三角で示す。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度と１５０ｂｐ以下のＤＮＡとの割合の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８１６）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。これらの結果は、サイズパラメータの解析が母体血漿試料における分画胎児ＤＮＡ濃度を推定するために有用であることを示唆している。
【0100】
図９Ａは、（ＣＦサイズ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット９００である。４８個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７７６）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。
【0101】
図９Ｂは、（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット９５０である。４８個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７９０）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。
【0102】
図１０Ａは、（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１０００である。４８個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７９３）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の状態が異なる試料間で一貫している。
【0103】
図１０Ｂは、（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１００５である。４８個の母体血漿試料について分画胎児ＤＮＡ濃度に対するサイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９）比をプロットした。全試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９）比の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７９８）。サイズパラメータと分画胎児ＤＮＡ濃度との間の正の相関は、胎児の染色体の倍数性の状態が異なる試料間で一貫している。
【0104】
Ｃ．反復要素
上述の通り我々は、母体血漿における全てのマッピング可能なＤＮＡ断片のサイズが分画胎児ＤＮＡ濃度と相関することを実証した。このセクションでは、ゲノム中の反復要素のサイズ解析も、血漿における分画胎児ＤＮＡ濃度の推定に使用できるか否かを調べる。本実施例で、我々は、ゲノムのＡｌｕ反復にマッピングしたＤＮＡ断片のサイズ分布を解析した。
上述の通り我々は、母体血漿における全てのマッピング可能なＤＮＡ断片のサイズが分画胎児ＤＮＡ濃度と相関することを実証した。このセクションでは、ゲノム中の反復要素のサイズ解析も、血漿における分画胎児ＤＮＡ濃度の推定に使用できるか否かを調べる。本実施例で、我々は、ゲノムのＡｌｕ反復にマッピングしたＤＮＡ断片のサイズ分布を解析した。
【0105】
図１１は、本発明の実施形態に従った、反復要素のサイズについて胎児ＤＮＡの割合に対しプロットしたサイズ比を示すプロットである。この例では、１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量の比（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））を、胎児ＤＮＡの割合に対するサイズ分布の変化を反映させるのに用いる。サイズ比と分画胎児ＤＮＡ濃度の間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．８２９）。この結果は、反復要素のサイズ分析もまた、母体試料のける胎児ＤＮＡ分画濃度を決定するのに使用できることを示唆している。
【0106】
大量並列シーケンシングの使用に加えて、他の方法、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を利用して母体血漿における反復要素（例えば、Ａｌｕ反復）のサイズ分布を決定できる。一実施形態では、母体血漿試料におけるＤＮＡは、リンカーにライゲーションできる。その後、ＰＣＲを、Ａｌｕ配列に特異的な１のプライマーおよびリンカーに特異的な他のプライマーを用いて行うことができる。ＰＣＲに続いて、ＰＣＲ産物のサイズを、例えば、電気泳動、質量分析、または大量並列シーケンシングによって解析できる。これにより、母体血漿のＡｌｕ反復由来の配列のサイズを読み取ることができるだろう。この戦略は、他の標的配列または配列ファミリーにも使用できる。更に、ＰＣＲに続き、別のＡｌｕ特異的プライマーを用いるネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行ってもよく、ここでは同じリンカー特異的プライマーまたはリンカー中のネステッドプライマーのいずれかと組み合わせる。かかるネステッドＰＣＲは、対象とする配列（この場合、Ａｌｕ配列）を増幅させる特異性を増加させるという利点を有する。
【0107】
反復要素を利用する利点の１つは、反復要素のコピー数は比較的多いので、解析が容易なことである。例えば、増幅のサイクルが少なくてもよい場合がある。また、コピー数が多いと、解析精度が潜在的に高くなる。考えられる欠点は、個体間でコピー数が異なる反復要素のクラスもあるということである。
【0108】
Ｄ．電気泳動
図１２Ａは、本発明の実施形態に従った、サイズ比を決定するために使用できるエレクトロフェログラム１２００である。解析した全てのＤＮＡライブラリーについて、約２９２ｂｐに鋭いピークがあり、これに続き３００ｂｐ～４００ｂｐの範囲の二次ピークがあった。あるサイズ範囲の曲線下面積は、その領域由来のＤＮＡ断片の相対量を表すことができるので、領域Ａ（２００ｂｐ～２６７ｂｐ）の面積と領域Ｂ（２９０ｂｐ～２９４ｂｐ）の面積の比を用いて、短い断片ＤＮＡおよび長いＤＮＡ断片の相対量を定量化する。まず、手動で蛍光単位（ＦＵ）のベースラインを０に調整し、次に、選択領域の面積を求めた。
図１２Ａは、本発明の実施形態に従った、サイズ比を決定するために使用できるエレクトロフェログラム１２００である。解析した全てのＤＮＡライブラリーについて、約２９２ｂｐに鋭いピークがあり、これに続き３００ｂｐ～４００ｂｐの範囲の二次ピークがあった。あるサイズ範囲の曲線下面積は、その領域由来のＤＮＡ断片の相対量を表すことができるので、領域Ａ（２００ｂｐ～２６７ｂｐ）の面積と領域Ｂ（２９０ｂｐ～２９４ｂｐ）の面積の比を用いて、短い断片ＤＮＡおよび長いＤＮＡ断片の相対量を定量化する。まず、手動で蛍光単位（ＦＵ）のベースラインを０に調整し、次に、選択領域の面積を求めた。
【0109】
図１２Ｂは、本発明の実施形態に従った、母体血漿における胎児ＤＮＡの割合が様々な試料について２００ｂｐ～２６７ｂｐのＤＮＡ断片と２９０ｂｐ～２９４ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比（すなわち、エレクトロフェログラムに示された領域ＡとＢの面積比）を示すプロット１２５０である。２９２ｂｐのピークがＦＵ値６．１と低いＴ１３のケースが１つあったが、それ以外のケースは全て２０以上のＦＵ値を示した。この低いＦＵ値は面積測定が不正確になるだろうので、解析から除外した。領域ＡとＢの面積比を、他の７９個の母体血漿試料全てについての分画胎児ＤＮＡ濃度に対してプロットする。これらの試料について分画胎児ＤＮＡ濃度とＡとＢの面積比との間に正の相関があった（ピアソン相関係数＝０．７２３）。
【0110】
ＶＩ．校正データ点の決定
上述したように、校正データ点は、様々な方法で定義できる。さらに、校正データ点は、様々な方法で得ることができる。例えば、校正データ点は、単純に、あるパラメータの一連の校正値として対応する分画濃度とともにメモリから読み出すものであってもよい。また、校正データ点を定義する校正関数をメモリから読み出すこともできる（例えば、所定の関数形式を有する線形または非線形関数）。いくつかの実施形態では、校正データ点は、校正試料から測定されたデータから計算できる。
上述したように、校正データ点は、様々な方法で定義できる。さらに、校正データ点は、様々な方法で得ることができる。例えば、校正データ点は、単純に、あるパラメータの一連の校正値として対応する分画濃度とともにメモリから読み出すものであってもよい。また、校正データ点を定義する校正関数をメモリから読み出すこともできる（例えば、所定の関数形式を有する線形または非線形関数）。いくつかの実施形態では、校正データ点は、校正試料から測定されたデータから計算できる。
【0111】
Ａ．方法
図１３は、本発明の実施形態に従った、校正試料から得た測定値より校正データ点を決定するための方法１３００のフローチャートである。校正試料には、臨床的に関連するＤＮＡおよびその他のＤＮＡが含まれる。
図１３は、本発明の実施形態に従った、校正試料から得た測定値より校正データ点を決定するための方法１３００のフローチャートである。校正試料には、臨床的に関連するＤＮＡおよびその他のＤＮＡが含まれる。
【0112】
ブロック１３１０では、複数の校正試料を受けとる。校正試料は、本明細書に記載のように得られる。各試料は、別個の実験、またはある分子についてどの試料由来なのかを同定するいくつかの同定手段（例えば、バーコードでＤＮＡ断片をタグ付けする）により別個に解析できる。例えば、校正試料を、例えば、シーケンシング装置などのＤＮＡ断片のサイズを決定するために用いることができる測定データ（例えば、読み取り配列）を出力する装置で受け取ってもよく、または電気泳動装置で受け取ってもよい。
【0113】
ブロック１３２０では、臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を、複数の校正試料のそれぞれについて測定する。胎児ＤＮＡ濃度を測定する様々な実施形態では、父系遺伝配列又は胎児特異的エピジェネティックマーカーを使用してもよい。例えば、父系遺伝アレルは、妊婦のゲノムには存在しないので、母体血漿における分画胎児ＤＮＡ濃度に比例する割合で検出できる。胎児特異的エピジェネティックマーカーには、母体血漿における胎児または胎盤特異的ＤＮＡメチル化パターンを示すＤＮＡ配列を含みうる。
【0114】
ブロック１３３０では、それぞれの校正試料由来のＤＮＡ断片の量を、様々なサイズについて測定する。サイズは、本明細書に記載のように測定できる。校正試料のサイズプロファイルに関するデータを取得するために、サイズをカウントやプロットしてもよく、ヒストグラムを作成するのに使用してもよく、または他の分類手段に供してもよい。
【0115】
ブロック１３４０では、あるパラメータについての校正値を複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて計算する。校正値は、各校正試料について計算できる。一実施形態では、各校正値について同じパラメータを使用する。しかし、本明細書に記載の複数のパラメータを使用できる実施形態もある。例えば、１５０塩基未満のＤＮＡ断片の累積分画をパラメータとして使用でき、異なる分画濃度を有する試料は異なる校正値を有するであろう。各試料について校正値および測定された分画濃度を含む当該試料についての校正データ点を決定してもよい。これらの校正データ点は、方法３００で使用でき、あるいは最終校正データ点（例えば、関数当てはめにより定義される）を決定するのに使用できる。
【0116】
ブロック１３５０では、複数の分画濃度にわたり校正値を近似する関数を決定する。例えば、線形関数は、分画濃度の関数として校正値に当てはまるだろう。線形関数は、方法３００で使用される校正データ点を定義できる。
【0117】
いくつかの実施形態では、複数のパラメータについての校正値を、各試料について計算できる。ある試料についての校正値は、分画濃度とともにデータ点を提供できる多次元座標（各次元は、各パラメータについてのものである）を定義できる。従って、一実施態様では、多次元関数は、全ての多次元データ点に当てはめることができる。したがって、異なる値のパラメータを単一の校正関数に効果的に代入して分画濃度を算出できる多次元検量線を使用できる。そして、単一の校正関数を、校正試料から得られた全てのデータ点の関数当てはめにより作成できる。
【0118】
Ｂ．腫瘍ＤＮＡ濃度の測定
上述のように、実施形態はまた、生体試料における腫瘍ＤＮＡの濃度にも適用できる。腫瘍ＤＮＡの分画濃度の決定に関する例を次に示す。
上述のように、実施形態はまた、生体試料における腫瘍ＤＮＡの濃度にも適用できる。腫瘍ＤＮＡの分画濃度の決定に関する例を次に示す。
【0119】
我々は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に罹患している２人の患者から外科的腫瘍切除の前後の血漿試料を採取した。サイズ解析は、ペアエンド（ＰＥ）大量並列シーケンシングを用いて行った。母体血漿ＤＮＡのシーケンシングライブラリーは、従前に記載のように構築した（Ｌｏ ＹＭ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０；２：６１ｒａ９１）。全ライブリは、ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）５０ｂｐ×２ＰＥフォーマットを用いてシーケンシングした。５０ｂｐの読み取り配列は、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ２ （ＳＯＡＰ２）（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ）を用いて、リピート領域をマスクしないヒト参照ゲノム（Ｈｇ１８） （ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）にアラインした。それぞれシーケンシングした断片のサイズを、アラインした断片の各末端における最も外側のヌクレオチドの座標から推定した。
【0120】
我々は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ６．０ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＨＣＣ患者の血液細胞および腫瘍試料から抽出したＤＮＡの遺伝子型を決定した。それぞれのケースで、腫瘍組織においてヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を示す領域を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｌｅ ｖ４．０ を用いてＳＮＰ座位の異なるアレルの強度に基づき同定した。腫瘍由来のＤＮＡの分画濃度（Ｆ）は、式：Ｆ＝（Ａ-Ｂ）／Ａ×１００％（式中、Ａは、ＬＯＨ領域においてヘテロ接合ＳＮＰが欠失していないアレルを有する読み取り配列の数であり、Ｂは、ＬＯＨ領域においてヘテロ接合ＳＮＰが欠失しているアレルを有する読み取り配列の数である）を用い、ＬＯＨ領域で欠失および欠失していないアレルを有する配列の量の差から推定した。表３は、その結果を示す。
【0121】
【表3】
【0122】
表３は、血漿試料におけるシーケンシング情報および腫瘍ＤＮＡの分画濃度の測定値を示す。
【0123】
別の実施形態では、重複を示す座位を使用することができる。例えば、腫瘍では、２つのホモ接合染色体のうちの１つについて１コピー分増加しアレルが重複しているようになることがある。よって、１つまたは複数のヘテロ接合の座位において非重複アレル（例えば、ＳＮＰ）を有する読み取り配列の第１量Ａおよびヘテロ接合の座位において重複アレルを有する読み取り配列の第２量Ｂを決定できる。臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度Ｆは、第１量と第２量の比として（Ｂ-Ａ）／Ａ比を用いて計算できる。
【0124】
別の実施形態では、１つまたは複数のホモ接合の座位を使用してもよい。例えば、患者がホモ接合であり、１ヌクレオチドの変異が腫瘍組織内に存在する場合、１つまたは複数の座位を同定できる。その後、１つまたは複数のホモ接合の座位において野生型アレルを有する読み取り配列の第１量Ａを決定できる。そして、１つまたは複数のホモ接合の座位において変異型アレルを有する読み取り配列の第２量Ｂを決定できる。臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度Ｆは、第１量と第２量の比として２Ｂ／（Ａ＋Ｂ）比を用いて計算できる。
【0125】
Ｃ．データ点に対する関数当てはめ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｆｉｔ）の例
校正試料から決定されるパラメータ値に対し関数当てはめを実施する例をここで説明する。それぞれ１人の男児を宿している８０人の妊婦から採取した血漿試料を解析した。８０人の妊婦のうち、３９人は正倍数体の胎児を宿しており、１３人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿しており、１０人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１８人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿していた。これらの妊婦の妊娠期間の中間値は１３週と１日であった。ＤＮＡを血漿試料から抽出し、先に記載したＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォーム（Ｚｈｅｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ２０１２；５８：５４９－５８）を用いてシーケンシングした。ただし、シーケンシングは８－ｐｌｅｘフォーマットで行った。各ＤＮＡ分子について、両端からそれぞれから５０ヌクレオチドをシーケンシングし、参照ゲノム（ｈｇ１８）にアラインした。
校正試料から決定されるパラメータ値に対し関数当てはめを実施する例をここで説明する。それぞれ１人の男児を宿している８０人の妊婦から採取した血漿試料を解析した。８０人の妊婦のうち、３９人は正倍数体の胎児を宿しており、１３人はトリソミー１３（Ｔ１３）の胎児を宿しており、１０人はトリソミー１８（Ｔ１８）の胎児を宿しており、１８人はトリソミー２１（Ｔ２１）の胎児を宿していた。これらの妊婦の妊娠期間の中間値は１３週と１日であった。ＤＮＡを血漿試料から抽出し、先に記載したＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォーム（Ｚｈｅｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ２０１２；５８：５４９－５８）を用いてシーケンシングした。ただし、シーケンシングは８－ｐｌｅｘフォーマットで行った。各ＤＮＡ分子について、両端からそれぞれから５０ヌクレオチドをシーケンシングし、参照ゲノム（ｈｇ１８）にアラインした。
【0126】
次に、それぞれシーケンシングした分子のサイズを、両端の最も外側のヌクレオチドの座標から導き出した。各試料について、中央値が１１１０万の断片をシーケンシングし、参照ゲノムに特異的にアラインした。サイズが１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ分子の割合をサイズが１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡ分子の割合で除した比を計算し、この比をサイズ比を呼ぶ。８０人の妊婦は、全員男児を宿していたので、Ｙ染色体に特異的にアラインした読み取り配列の割合を、各血漿ＤＮＡ試料における胎児ＤＮＡの分画濃度を決定するのに用いた。
【0127】
試料は、ランダムに２セット、すなわちトレーニングセットとバリデーションセットに分けた。線形回帰を使用し、トレーニングセット内の試料に基づいて、分画胎児ＤＮＡ濃度とサイズ比との関係を確立した。その後、サイズ比から、線形回帰式を用いてバリデーションセットについての分画胎児ＤＮＡ濃度を導き出した。バリデーションは、次のセクションで説明する。
【0128】
図１４Ａは、本発明の実施形態に従った、トレーニングセットについての胎児ＤＮＡの分画濃度に対するサイズ比のプロット１４００である。上述のように、サイズ比は、サイズが１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ分子の割合をサイズが１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡ分子の割合で除することで計算する。データ点１４０５で示すように、サイズ比を、胎児のＤＮＡの分画濃度に対してプロットする。白丸は、正倍数体のケースを表す。黒塗りのマークは、異数性のケースを表す（Ｔ１３は黒四角、Ｔ１８は黒丸、Ｔ２１は黒三角）。線形回帰線１４１０は、データ点の関数当てはめによる結果である。関数当てはめは、任意の適切な技術、例えば、最小二乗法により行うことができる。この線１４１０は、トレーニングセット以外の他の試料について測定されたパラメータの値を推定するのに使用できる。線１４１０の各部分を校正データ点と考えることができる。
【0129】
ＶＩＩ．校正データ点との比較
上述したように、校正データ点を用いて、臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を決定できる。例えば、図１４Ａの生データ点１４０５を用いて、ある校正値に対する分画ＤＮＡ濃度の範囲を設けることができる（図１４Ａでラベルしたサイズ比）。この範囲は、分画濃度が閾値量より多いか否かを決定するのに使用できる。範囲の代わりに、特定のサイズ比における分画濃度の平均値を使用してもよい。例えば、新しい試料についてのサイズ比として１．３という測定値に対応する分画濃度は、１．３における２つのデータ点から計算した平均濃度として決定できる。一実施形態では、関数当てはめ（例えば、線１４１０）を使用してもよい。
上述したように、校正データ点を用いて、臨床的に関連するＤＮＡの分画濃度を決定できる。例えば、図１４Ａの生データ点１４０５を用いて、ある校正値に対する分画ＤＮＡ濃度の範囲を設けることができる（図１４Ａでラベルしたサイズ比）。この範囲は、分画濃度が閾値量より多いか否かを決定するのに使用できる。範囲の代わりに、特定のサイズ比における分画濃度の平均値を使用してもよい。例えば、新しい試料についてのサイズ比として１．３という測定値に対応する分画濃度は、１．３における２つのデータ点から計算した平均濃度として決定できる。一実施形態では、関数当てはめ（例えば、線１４１０）を使用してもよい。
【0130】
図１４Ｂは、本発明の実施形態に従った、胎児特異的配列を用いて測定した分画濃度に対する図１４Ａの線形関数１４１０から導き出した（推定した）分画濃度のプロット１４５０である。トレーニングセットのデータに基づいて決定された回帰式（すなわち、線１４１０）を用いて、バリデーション試料について決定されるサイズ比を、バリデーションセットの試料についての胎児ＤＮＡの分画濃度を導き出すのに使用した。測定された分画濃度は、血漿ＤＮＡ試料におけるＹ染色体配列の割合（すなわち、Ｙ染色体にアラインする読み取り配列の割合）に対応する。
【0131】
線１４６０は、２セットの値の間で完全な相関関係を表す。データ点１４５５のずれは、推定がどの程度正確であるかを示し、点が線１４６０上にあると点は完全に正確であることを示す。本明細書で述べたように、求める試験は、単に、生体試料において臨床的に関連するＤＮＡが十分な割合で存在するか否かを決定するためのものであるので、推定は完全に正確である必要はない。白丸は、正倍数体のケースを表す。黒塗りのマークは、異数性のケースを表す（Ｔ１３は黒四角、Ｔ１８は黒丸、Ｔ２１は黒三角）。サイズ比から導き出した画胎児ＤＮＡ濃度とＹ染色体配列の割合から測定した分画胎児ＤＮＡ濃度間の差の中央値は２．１％であった。試料の９０％で、その差は４．９％未満であった。
【0132】
異なる倍数性状態を有する試料を、キャリブレーションセットとバリデーションセットの両方で使用した。図１４Ａに示すように、サイズ比と分画胎児ＤＮＡ濃度間の関係は倍数性状態が異なる試料間で一貫していた。その結果、分画胎児ＤＮＡ濃度は、図１４Ｂに示すように、試料の倍数性状態を事前に知ることなく、試料のサイズ比から導き出すことができる。１つの検量線を、異なる倍数性状態を有する試料について使用した。つまり、我々は、分画胎児ＤＮＡ濃度を決定するための実施形態を適用する前に、試料の倍数性状態を知る必要がない。
【0133】
ＶＩＩＩ．癌
本明細書に記載のように、実施形態は、生体試料における腫瘍ＤＮＡの分画濃度を推定するのに使用できる。胎児の例と同様に、例えば、サイズパラメータの値と測定した分画濃度との間の相関関係を示すデータ点に関数（例えば、線形関数）を当てはめることにより、校正試料を用いて相関データ点を決定できる。
本明細書に記載のように、実施形態は、生体試料における腫瘍ＤＮＡの分画濃度を推定するのに使用できる。胎児の例と同様に、例えば、サイズパラメータの値と測定した分画濃度との間の相関関係を示すデータ点に関数（例えば、線形関数）を当てはめることにより、校正試料を用いて相関データ点を決定できる。
【0134】
Ａ．サイズと腫瘍ＤＮＡ濃度の相関
図１５Ａは、本発明の実施形態に従った、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者の血漿における腫瘍ＤＮＡの割合が様々な試料について１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット１５００である。２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。２つの白丸の位置は互いに近接している（ほぼ重なっている）。これらの結果は、サイズパラメータの解析がＨＣＣ患者の血漿試料における分画腫瘍ＤＮＡ濃度を推定するのに有用であることを示唆している。腫瘍切除後の１５０ｂｐ以下の分画腫瘍ＤＮＡ濃度およびＤＮＡ断片の割合の両方で減少がある。黒丸１５０５は、腫瘍ＤＮＡの割合がかなり低い試料に対応し、これは、腫瘍のサイズが小さいことに関連する。言い換えれば、大きな腫瘍を有する患者は、短いＤＮＡの割合が高く、これは、小さい腫瘍を有する患者と比較してＣＦ（≦１５０ｂｐ）の割合が高いことで反映される。
図１５Ａは、本発明の実施形態に従った、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者の血漿における腫瘍ＤＮＡの割合が様々な試料について１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット１５００である。２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対する１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合をプロットした。２つの白丸の位置は互いに近接している（ほぼ重なっている）。これらの結果は、サイズパラメータの解析がＨＣＣ患者の血漿試料における分画腫瘍ＤＮＡ濃度を推定するのに有用であることを示唆している。腫瘍切除後の１５０ｂｐ以下の分画腫瘍ＤＮＡ濃度およびＤＮＡ断片の割合の両方で減少がある。黒丸１５０５は、腫瘍ＤＮＡの割合がかなり低い試料に対応し、これは、腫瘍のサイズが小さいことに関連する。言い換えれば、大きな腫瘍を有する患者は、短いＤＮＡの割合が高く、これは、小さい腫瘍を有する患者と比較してＣＦ（≦１５０ｂｐ）の割合が高いことで反映される。
【0135】
図１５Ｂは、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者について、（ＣＦサイズ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１５５０である。ＣＦ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９）比を２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対しプロットした。２つの白丸の位置は互いに近接している。腫瘍切除後は、分画腫瘍ＤＮＡ濃度とサイズ比の両方の減少があった。
【0136】
図１６Ａは、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者について、（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１６００である。サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９）比を２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対しプロットした。腫瘍切除後は、分画腫瘍ＤＮＡ濃度とサイズ比の両方の減少があった。
【0137】
図１６Ｂは、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者について、（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１６５０である。サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９）比を２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対しプロットした。腫瘍切除後は、分画腫瘍ＤＮＡ濃度とサイズ比の両方の減少があった。
【0138】
図１７は、腫瘍切除前後の２人のＨＣＣ患者について、（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１７００である。サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９）比を２人のＨＣＣ患者について、腫瘍切除の前（黒丸）および後（白丸）の分画腫瘍ＤＮＡ濃度に対しプロットした。腫瘍切除後は、分画腫瘍ＤＮＡ濃度とサイズ比の両方の減少があった。
【0139】
Ｂ．治療によるサイズの減少
図１８Ａは、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット１８００である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。一般的に、腫瘍切除後の癌患者の血漿ＤＮＡにおける１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合の減少がある。
図１８Ａは、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片の割合を示すプロット１８００である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。一般的に、腫瘍切除後の癌患者の血漿ＤＮＡにおける１５０ｂｐ以下のＤＮＡの割合の減少がある。
【0140】
治療前と治療後についての割合の値の差分は、腫瘍の存在とサイズパラメータの値との相関関係を示している。治療前と治療後についての割合の値の差分を利用して、例えば、その割合が閾値を下回ると成功であることを示す場合、閾値に対する割合を比較することにより、治療の成功度を決定できる。別の例では、治療前と治療後の間の差分を閾値と比較できる。
【0141】
割合（または他のサイズパラメータの値）を用いて腫瘍の発生を検出できる。例えば、サイズパラメータのベースライン値を決定できる。そして、その後、サイズパラメータの値を再度測定できる。サイズパラメータの値が有意な変化を示した場合、その患者は、腫瘍を有しているリスクが高いとすることができる。割合があまり変わらない（すなわち、治療後の値が同じ）図１８Ａが示すように、サイズパラメータの値が個人間であまり変わらない場合、同じベースライン値を他の患者に適用できる。したがって、ベースライン値を、患者ごとに取る必要がない。
【0142】
図１８Ｂは、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、（ＣＦサイズ（サイズ≦１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１５０ｂｐ以下のＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１８５０である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。腫瘍切除後は、両者のケースともサイズ比の減少があった。
【0143】
図１９Ａは、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、（サイズ（１４０～１４６）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１４６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１９００である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。腫瘍切除後は、両者のケースともサイズ比の減少があった。
【0144】
図１９Ｂは、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、（サイズ（１４０～１５４）／サイズ（１６３～１６９））と表する１４０ｂｐ～１５４ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット１９５０である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。腫瘍切除後は、両者のケースともサイズ比の減少があった。
【0145】
図２０は、腫瘍切除前後のＨＣＣ患者について、（サイズ（１００～１５０）／サイズ（１６３～１６９））と表する１００ｂｐ～１５０ｂｐのＤＮＡ断片と１６３ｂｐ～１６９ｂｐのＤＮＡとの量のサイズ比を示すプロット２０００である。同じ癌患者由来の一対の試料は、破線でつながっている同一の記号で表す。腫瘍切除後は、両者のケースともサイズ比の減少があった。
【0146】
Ｃ．方法
図２１は、本発明の実施形態に従った、生物の生体試料を解析して癌のレベルの区分を決定するための方法２１００を示すフローチャートである。方法２１００は、生物（例えば、ヒト）の生体試料を解析できる。生物試料は、正常細胞由来のＤＮＡと、癌に関連しているおそれがある細胞由来のＤＮＡを含む。少なくともＤＮＡの一部は、生体試料における無細胞ＤＮＡである。方法３００および１３００の態様を方法２１００の実施形態に適用できる。
図２１は、本発明の実施形態に従った、生物の生体試料を解析して癌のレベルの区分を決定するための方法２１００を示すフローチャートである。方法２１００は、生物（例えば、ヒト）の生体試料を解析できる。生物試料は、正常細胞由来のＤＮＡと、癌に関連しているおそれがある細胞由来のＤＮＡを含む。少なくともＤＮＡの一部は、生体試料における無細胞ＤＮＡである。方法３００および１３００の態様を方法２１００の実施形態に適用できる。
【0147】
ブロック２１１０では、様々なサイズに対応するＤＮＡ断片の量を測定する。方法３００に記載のように、複数のサイズのうちの各サイズについて、そのサイズに対応する生体試料由来の複数のＤＮＡ断片の量を測定することができる。複数のＤＮＡ断片を、ランダムに選択またはゲノムの１つまたは複数の所定の領域から優先的に選択できる。例えば、上述したように、標的の濃縮を行ってもよく、あるいはゲノムの特定の領域由来の読み取り配列を選択してもよい。
【0148】
ブロック２１２０では、第１パラメータの第１値を複数のサイズのＤＮＡ断片の量に基づいて計算する。一態様では、第１パラメータは、生体試料におけるＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度（例えば、ヒストグラム）を提供する。このパラメータは、複数のＤＮＡ断片のサイズから決定されるため、サイズパラメータと呼ぶことができる。パラメータの例を本明細書に記載する。本明細書に記載のように複数のパラメータを用いてもよい。
【0149】
ブロック２１３０では、第１値を基準値と比較する。基準値の例として、正常値および正常値から特定の距離（例えば、標準偏差の単位内）にあるカットオフ値を含む。基準値は、（例えば、健康であることがわかっている）同じ生物由来の異なる試料から測定してもよい。よって、基準値は、生物が癌を有さないと推測される試料から決定される第１パラメータの値に対応し得る。一実施形態では、生体試料は、治療後の生物から得られ、基準値は、治療前に採取した試料から決定された第１パラメータの値に対応する（例えば、上記に例示されている）。基準値は、他の健康な生物の試料から決定してもよい。
【0150】
ブロック２１４０では、生物の癌のレベルの区分を、比較に基づいて決定する。様々な実施形態では、区分は、数値、文字、または他の任意の指標であり得る。区分することで、早期に癌に関する確率またはその他のスコアに関しｙｅｓまたはｎｏという２値の結果を提供することができる。確率およびその他のスコアは、絶対値であってもよく、あるいはその生物の従前の区分に対する相対値であってもよい。一実施態様では、区分は、生物が癌を有していない、または癌のレベルが低下したということである。別の実施形態では、区分は、生物が癌を有している、または癌のレベルが増加したということである。
【0151】
本明細書に記載のように、癌のレベルには、癌の存在、癌の段階、または腫瘍のサイズを含み得る。例えば、第１値を超えたか否か（例えば、第１パラメータを如何に定義するかによるが、その値よりも大きいまたは小さいということ）を利用して、癌が存在するかどうか、または少なくともその可能性（例えば、パーセンテージ尤度）を判断できる。さらに、閾値を超える程度が可能性の増大を示すようにして、複数の閾値を利用してもよい。さらに、上記の程度は、異なる癌のレベル、例えば、腫瘍の数または大きさに対応してもよい。したがって、実施形態は、生物の癌のレベルの診断、段階付け、予知、または進行状況のモニターが可能である。
【0152】
Ｄ．特定の領域のサイズ分布の決定
他の実施形態と同様に、ＤＮＡ断片の第１セットが、生物のゲノムにおける１つまたは複数の所定領域に対応しうる。よって、サイズ解析は、選択領域、例えば、特定の染色体、染色体の腕、または同じ長さ、例えば１Ｍｂの複数領域（ビン）、についても実施できる。例えば、対象の種類の癌で一般的に変化する領域に集中できる。図２２の表２２００は、様々な種類の癌で見られる一般的な染色体異常のいくつかを示す。増加は、特定のセグメント内の１つまたは複数のコピー数の追加を伴う染色体の増幅を指し、欠失は、特定のセグメント内のホモ接合染色体の片方または両方の欠失を指す。
他の実施形態と同様に、ＤＮＡ断片の第１セットが、生物のゲノムにおける１つまたは複数の所定領域に対応しうる。よって、サイズ解析は、選択領域、例えば、特定の染色体、染色体の腕、または同じ長さ、例えば１Ｍｂの複数領域（ビン）、についても実施できる。例えば、対象の種類の癌で一般的に変化する領域に集中できる。図２２の表２２００は、様々な種類の癌で見られる一般的な染色体異常のいくつかを示す。増加は、特定のセグメント内の１つまたは複数のコピー数の追加を伴う染色体の増幅を指し、欠失は、特定のセグメント内のホモ接合染色体の片方または両方の欠失を指す。
【0153】
一実施形態では、ＤＮＡ断片の追加のセットを、生体試料から同定してもよい。ＤＮＡ断片の各セットは、表２２００で特定した領域などの異なる所定領域に対応しうる。癌に関連しない領域もまた、例えば、基準値を決定するために使用できる。本明細書に記載のように、様々なサイズに対応するＤＮＡ断片の量を決定でき、ＤＮＡ断片の追加のセットそれぞれについてのパラメータのサイズ値を決定できる。したがって、ＤＮＡ断片のセットとゲノム領域との間に１対１の対応が存在するようなゲノム領域についてそれぞれの異なるサイズ値を決定できる。
【0154】
それぞれのサイズ値を、それぞれの基準値と比較できる。対応するサイズ値がそれぞれの基準値と統計学的に差異がある所定領域を同定できる。基準値が正常値である場合、統計的な差異は、カットオフのサイズ値と比較することによって決定できる（例えば、推定または測定した統計的分布に基づくカットオフ値が特定の数の正常値からの標準偏差である場合）。それぞれの基準値は、異なる領域に対し同一または異なっていてもよい。例えば、異なる領域は、サイズごとに異なる正常値を有することがある。
【0155】
一実施形態では、基準値と統計学的に差異がある領域の数を利用して、区分を決定してもよい。従って、対応するサイズの値がそれぞれの基準値と統計学的に差異がある所定領域を同定する数を決定できる。その数を、領域の閾値数と比較して、生物における癌のレベルの区分を決定できる。閾値数は、正常試料内および癌試料内の差に基づいて決定できる。
【0156】
表２２００で示すように、異なる癌はゲノムの異なる部分に関連する。したがって、どの領域が統計学的に差異があるかということを利用して、可能性のある１つまたは複数の癌の種類が同定された領域に関連する場合、その可能性のある癌の種類を決定できる。例えば、染色体セグメント７ｐ由来のＤＮＡ断片のサイズ値が正常値よりも有意に低いと分かった場合（例えば、カットオフ値の決定による）、その区分が癌の存在を示すなら結腸直腸癌が可能性のある癌として同定できる。染色体セグメント７ｐのサイズ値を区分を決定するただ一つの指標として用いてもよいし、あるいは複数の領域を用いてもよいことに留意されたい。一実施形態では、区分が全体として癌であることを示す場合にのみ、染色体セグメント７ｐのサイズ値を用いて結腸直腸癌を可能性のある癌として同定する。
【0157】
ＩＸ．コンピュータシステム
本明細書に記載のいずれのコンピュータシステムに関しても、任意の適切な数のサブシステムを利用することが可能である。このようなサブシステムの例を、図２３のコンピュータ装置２３００に示す。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ただ１つのコンピュータ装置を含み、この場合、サブシステムがコンピュータ装置の構成要素でありうる。他の実施形態では、コンピュータシステムは、複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を含むサブシステムでありうる。
本明細書に記載のいずれのコンピュータシステムに関しても、任意の適切な数のサブシステムを利用することが可能である。このようなサブシステムの例を、図２３のコンピュータ装置２３００に示す。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ただ１つのコンピュータ装置を含み、この場合、サブシステムがコンピュータ装置の構成要素でありうる。他の実施形態では、コンピュータシステムは、複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を含むサブシステムでありうる。
【0158】
図２３に示すサブシステムがシステムバス２３７５を介して相互接続される。例として、プリンター２３７４、キーボード２３７８、固定ディスク２３７９、ディスプレイアダプター２３８２に接続されたモニター２３７６、等の追加のサブシステム、が示されている。Ｉ／Ｏ制御装置２３７１に接続された周辺装置および入／出力（Ｉ／Ｏ）装置を、当技術分野で既知の任意の数のシリアルポート２３７７、等の手段によりコンピュータシステムに接続できる。例えば、シリアルポート２３７７または外部インターフェイス２３８１（例えば、イーサネット（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ等）を使って、コンピュータシステム２３００をインターネット等の広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナーに接続できる。システムバス２３７５を介した相互接続は、中央処理装置２３７３のそれぞれのサブシステムとの通信、およびシステムメモリー２３７２または固定ディスク２３７９からの命令の実行の制御、ならびにサブシステム間の情報交換の制御を可能とする。システムメモリー２３７２および／または固定ディスク２３７９は、コンピュータ可読媒体を組み入れることができる。本明細書に記載のいずれのデータも、１つの装置から別の装置に出力でき、また、ユーザーに対しても出力できる。
【0159】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェイス２３８１または内部インターフェイスにより接続された複数の同じ装置またはサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを介して通信できる。このような場合は、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバーと見なすことができ、この場合、それぞれは、同じコンピュータシステムの一部となりうる。クライアントおよびサーバーは、それぞれ複数のシステム、サブシステム、または装置を含んでもよい。
【0160】
本発明のいずれの実施形態も、モジュールまたは集積方式で一般的にプログラム可能なプロセッサを有するハードウェア（例えば、特定の目的の集積回路またはフィールドプログラム可能なゲートアレイ）および／またはコンピュータソフトウェアを使った制御論理の形で実装できることと理解すべきである。本明細書における開示および教示に基づいて、当業者なら、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使って、本発明の実施形態を実施する他の手段、および／または方法が分かり、理解するであろう。
【0161】
本出願に記載のいずれのソフトウェア成分または機能も、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋またはＰｅｒｌ等のいずれかの適切なコンピュータ言語を使い、例えば、従来の、またはオブジェクト指向技術を使って、プロセッサにより実行されるソフトウェアコードとして実装可能である。ソフトウェアコードは、保存および／または送信用のコンピュータ可読媒体上の一連の指令または命令として保存できる。適切な媒体には、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブもしくはフロッピー（登録商標）ディスク、等の磁気メディア、またはコンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等の光学メディア、フラッシュメモリ、等が含まれる。コンピュータ可読媒体は、このような保存または送信装置のいずれかの組み合わせであってもよい。
【0162】
このようなプログラムは、また、インターネットを含む種々のプロトコルに準拠した有線、光学、および／または無線ネットワークを介した送信に合わせたキャリアシグナルを使って、コード化および送信できる。従って、本発明の実施形態に係るコンピュータ可読媒体は、このようなプログラムでコードされたデータシグナルを使って作成できる。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のある装置と一緒にパッケージされても、または他の装置から別々に（例えば、インターネットのダウンロードにより）提供されてもよい。このようなコンピュータ可読媒体はいずれも、単一のコンピュータプログラム製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または全体コンピュータシステム）上にあっても、内部にあってもよく、また、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータプログラム製品上にあっても、内部にあってもよい。コンピュータシステムは、モニター、プリンター、または本明細書記載のいずれかの結果をユーザーに提供するための他の適切なディスプレイを含んでもよい。
【0163】
本明細書に記載の任意の方法は、全体的に、または部分的に、ステップを実行するよう構成できる、１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを使って実施できる。従って、実施形態は、本明細書に記載の任意の方法のステップを実行するように構成され、場合によっては、それぞれのステップまたはそれぞれのステップグループを実行する異なる装置を備えた、コンピュータシステムに関するものであってもよい。本明細書の方法のステップは、番号を付したステップとして示したが、同時にまたは異なる順序で行うことができる。さらに、これらのステップの一部は、他の方法による他のステップの一部と一緒に使用できる。また、全部または一部のステップを任意に選択できる。さらに、任意の方法の任意のステップを、モジュール、回路、またはこれらのステップを実行する他の手段と一緒に行うことができる。
【0164】
特定の実施形態の特定の詳細は、本発明の実施形態の趣旨および範囲を逸脱することなく、いずれかの適切な方法で組み合わせることができる。しかし、本発明の他の実施形態は、それぞれの個別態様、またはこれらの個別態様の特定の組み合わせ、に関連する具体的な実施形態に関するものであってもよい。
【0165】
本発明の代表的な実施形態の上記記載は、例示および説明の目的で提示するものである。本発明を記載された通りの形態として網羅的または限定的とする意図はなく、上記教示を考慮した多くの修正および変形が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最良に説明し、それにより、種々な実施形態で、特定の意図された用途に適合するように種々の変形を用いて、他の当業者が本発明を最良に利用できるように選択および記載した。
【0166】
特に逆の指示がなければ、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」の記述は、「１つまたは複数の」を意味するという意図である。
【0167】
全ての特許、特許出願、出版物、および上述の記載は、それらの全内容があらゆる目的において参照により本明細書に援用される。これらのいずれも先行技術であることを認めるものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】