特許7197213正常酸素条件と交互になった低酸素条件における骨髄浸潤リンパ球の活性化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-19
(45)【発行日】2022-12-27
(54)【発明の名称】正常酸素条件と交互になった低酸素条件における骨髄浸潤リンパ球の活性化
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20221220BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221220BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221220BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
A61K35/17 Z
A61P35/00
【請求項の数】
32
(21)【出願番号】P 2021063957
(22)【出願日】2021-04-05
(62)【分割の表示】P 2017512293の分割
【原出願日】2015-09-04
(65)【公開番号】P2021104048
(43)【公開日】2021-07-26
【審査請求日】2021-04-30
(31)【優先権主張番号】62/045,782
(32)【優先日】2014-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/186,040
(32)【優先日】2015-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】398076227
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】イヴァン エム． ボレロ
(72)【発明者】
【氏名】キンバリー エー． ヌーナン
【審査官】千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２２３１４６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Journal of Immunological Methods，2008年，vol.339，p.23-37
【文献】Eur J Immunol，2013年，vol.43，p.793-804
【文献】Cell Biology International ，2014年03月，vol.38，p.782-789
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）、ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）、
ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）、ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）、
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物であって、前記組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団由来のＭＩＬであり、前記組成物が、ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含み、
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の前記細胞の少なくとも２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ由来のＭＩＬである、組成物。
【請求項2】
前記組成物は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発現するＭＩＬの集団を含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも２％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの前記集団由来
のＭＩＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発現する複数のＭＩＬを含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも２％は、ＩＦＮγを発現する前記複数のＭＩＬ由来のＭＩＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも９８％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの前記集団由来のＭＩＬである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ由来のＭＩＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
ＣＤ８を発現するＭＩＬの集団を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ由来のＭＩＬである、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ由来のＭＩＬである、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含み、前記組成物中の前記細胞の少なくとも２１％は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの前記集団由来のＭＩＬである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
被験体のがんを処置するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
多発性骨髄腫を有する被験体を処置するための治療用活性化骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物の調製における骨髄浸潤リンパ球の使用であって、前記組成物が、（ａ）１％～３％の酸素の低酸素環境において、多発性骨髄腫を有する被験体から得られるＭＩＬを含む骨髄試料を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と共に培養して、低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球を産生するステップ；および、
（ｂ）正常酸素環境において、ＩＬ－２の存在下で、前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球を培養して、前記治療用活性化骨髄浸潤リンパ球を産生するステップ
を含む方法において調製される、使用。
【請求項12】
前記骨髄試料が、前記低酸素環境で２４時間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記骨髄試料が、前記低酸素環境において２日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
前記骨髄試料が、前記低酸素環境において３日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項15】
前記骨髄試料が、前記低酸素環境において２～５日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項16】
前記低酸素環境が、１％～２％の酸素である、請求項１１に記載の使用。
【請求項17】
前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球は、前記正常酸素環境において２～１２日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項18】
前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球は、前記正常酸素環境において６日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項19】
前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球は、前記正常酸素環境において９日間培養される、請求項１１に記載の使用。
【請求項20】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体が、ビーズに結合されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項21】
多発性骨髄腫を有する被験体を処置するための治療用活性化骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物の調製における骨髄浸潤リンパ球の使用であって、前記組成物が、（ａ）１％～２％の酸素の低酸素環境において、多発性骨髄腫を有する前記被験体から得られたＭＩＬを含む骨髄試料を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと共に２～５日間培養して、低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球を産生するステップ；および、
（ｂ）２１％の酸素の正常酸素環境において、ＩＬ－２の存在下で、前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球を２～１２日間培養して、前記治療用活性化骨髄浸潤リンパ球を産生するステップ
を含む方法において調製される、使用。
【請求項22】
前記骨髄は、前記低酸素環境において、３日間培養される、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球は、前記正常酸素環境において６日間培養される、請求項２１に記載の使用。
【請求項24】
前記低酸素条件で活性化された骨髄浸潤リンパ球は、前記正常酸素環境において９日間培養される、請求項２１に記載の使用。
【請求項25】
被験体のがんを処置するための組成物の調製における骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）の使用であって、前記組成物が、１％の酸素から７％の酸素を含む環境において前記ＭＩＬをインキュベートし、それにより活性化ＭＩＬを生じさせるステップ
を含む方法において調製される、使用。
【請求項26】
前記方法は、１％の酸素から３％の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
前記ＭＩＬは、少なくとも２４時間インキュベートされる、請求項２５または請求項２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項28】
前記ＭＩＬは、１日間から２０日間インキュベートされる、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
前記ＭＩＬは、３日間から１４日間インキュベートされる、請求項２８に記載の使用。
【請求項30】
前記方法は、前記ＭＩＬを、２１％の酸素を含む環境においてインキュベートするステップをさらに含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項31】
前記ＭＩＬは、２１％の酸素を含む環境において４日間インキュベートされる、請求項３０に記載の使用。
【請求項32】
患者のがんを処置するための医薬の製造における骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）の使用であって、前記医薬における前記ＭＩＬは、前記ＭＩＬを１％～７％の酸素の低酸素条件下において増殖させるステップ、および
前記ＭＩＬを正常酸素条件下において増殖させるステップ
を含む方法において調製される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張
この出願は、２０１４年９月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０４５，７８２
号および２０１５年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１８６，０４０号（
これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主
張する。
この出願は、２０１４年９月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０４５，７８２
号および２０１５年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１８６，０４０号（
これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主
張する。
【背景技術】
【0002】
骨髄破壊的化学療法は、長期治癒のエビデンスは極めて少ないにもかかわらず多発性骨
髄腫を含む多くの血液悪性疾患に対して受け入れられている療法である。しかしながら、
骨髄破壊的療法はまた、免疫ベースの療法を追加するための理想的な基盤をもたらす。特
に、高用量化学療法の結果として生じるリンパ球減少は、恒常的リンパ球増加を促進し、
免疫寛容を生じる抗原提示細胞（ＡＰＣ）を排除し、養子Ｔ細胞療法に対しより好適な環
境をもたらすサイトカイン放出を誘発する。免疫系が高用量化学療法の臨床的な利益に寄
与する可能性があるという間接的なエビデンスは、結果として自家幹細胞移植を受けてい
る骨髄腫、リンパ腫および急性骨髄性白血病の患者の臨床転帰が改善される早期のリンパ
系回復により示された。さらに、骨髄腫の転帰のこうした改善は、アフェレーシス産物か
ら注入された自家リンパ球の用量と直接相関した。まとめると、これらのデータは、抗腫
瘍免疫が測定可能な臨床的利益を有する可能性があるという仮説を裏付け、現在利用可能
な療法の効果を増すためにそのような免疫をどのように利用するかという問題を提起した
。
髄腫を含む多くの血液悪性疾患に対して受け入れられている療法である。しかしながら、
骨髄破壊的療法はまた、免疫ベースの療法を追加するための理想的な基盤をもたらす。特
に、高用量化学療法の結果として生じるリンパ球減少は、恒常的リンパ球増加を促進し、
免疫寛容を生じる抗原提示細胞（ＡＰＣ）を排除し、養子Ｔ細胞療法に対しより好適な環
境をもたらすサイトカイン放出を誘発する。免疫系が高用量化学療法の臨床的な利益に寄
与する可能性があるという間接的なエビデンスは、結果として自家幹細胞移植を受けてい
る骨髄腫、リンパ腫および急性骨髄性白血病の患者の臨床転帰が改善される早期のリンパ
系回復により示された。さらに、骨髄腫の転帰のこうした改善は、アフェレーシス産物か
ら注入された自家リンパ球の用量と直接相関した。まとめると、これらのデータは、抗腫
瘍免疫が測定可能な臨床的利益を有する可能性があるという仮説を裏付け、現在利用可能
な療法の効果を増すためにそのような免疫をどのように利用するかという問題を提起した
。
【0003】
養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）により測定可能な疾患を根絶する能力には、Ｔ細胞が、適切
に活性化され、十分な数で存在し、相当な抗腫瘍活性を有し、腫瘍部位に向かい、遭遇時
に腫瘍を有効に死滅させ、長い期間持続することが必要とされる。抗ＣＤ３およびＣＤ２
８が結合した常磁性ビーズを含む任意の技術によるＴ細胞の刺激は、アネルギー（寛容）
状態を有効に反転し、活性化Ｔ細胞をもたらし、その数を著しく増幅することができる。
ビーズに結合した抗ＣＤ３およびＣＤ２８は直接的で確固としたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけ
るＴ細胞の増幅をもたらすが、このアプローチの主な制約は、腫瘍特異的Ｔ細胞を濃縮す
ることなく全Ｔ細胞レパートリーを非特異的に刺激することである。ＡＣＴの腫瘍特異性
を増加させるための方策の１つは、より大きな内因性の腫瘍特異性を有するＴ細胞集団を
使用することである。そのように濃縮することが転移性黒色腫由来の腫瘍浸潤リンパ球（
ＴＩＬ）を使用したＡＣＴのかなりの抗腫瘍活性の理由である。しかしながら、ＴＩＬは
転移性黒色腫の患者の一部にしか存在せず、そのうち、採取可能な腫瘍を有する患者の６
０～７０％でしかＴＩＬの調製がうまくできず、このことがそのようなアプローチの一般
的適用性を制限する。骨髄は多発性骨髄腫などの多くの血液悪性疾患の腫瘍微小環境であ
るため、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を、こうした特定のがんに対する腫瘍特異的Ｔ細胞
療法をもたらすために利用することができよう。ＴＩＬとは対照的に、ＭＩＬはすべての
患者にあり、単純なベッドサイド手技により得られ、すべての患者において速やかに増幅
させることができる。
に活性化され、十分な数で存在し、相当な抗腫瘍活性を有し、腫瘍部位に向かい、遭遇時
に腫瘍を有効に死滅させ、長い期間持続することが必要とされる。抗ＣＤ３およびＣＤ２
８が結合した常磁性ビーズを含む任意の技術によるＴ細胞の刺激は、アネルギー（寛容）
状態を有効に反転し、活性化Ｔ細胞をもたらし、その数を著しく増幅することができる。
ビーズに結合した抗ＣＤ３およびＣＤ２８は直接的で確固としたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけ
るＴ細胞の増幅をもたらすが、このアプローチの主な制約は、腫瘍特異的Ｔ細胞を濃縮す
ることなく全Ｔ細胞レパートリーを非特異的に刺激することである。ＡＣＴの腫瘍特異性
を増加させるための方策の１つは、より大きな内因性の腫瘍特異性を有するＴ細胞集団を
使用することである。そのように濃縮することが転移性黒色腫由来の腫瘍浸潤リンパ球（
ＴＩＬ）を使用したＡＣＴのかなりの抗腫瘍活性の理由である。しかしながら、ＴＩＬは
転移性黒色腫の患者の一部にしか存在せず、そのうち、採取可能な腫瘍を有する患者の６
０～７０％でしかＴＩＬの調製がうまくできず、このことがそのようなアプローチの一般
的適用性を制限する。骨髄は多発性骨髄腫などの多くの血液悪性疾患の腫瘍微小環境であ
るため、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を、こうした特定のがんに対する腫瘍特異的Ｔ細胞
療法をもたらすために利用することができよう。ＴＩＬとは対照的に、ＭＩＬはすべての
患者にあり、単純なベッドサイド手技により得られ、すべての患者において速やかに増幅
させることができる。
【0004】
血液悪性疾患では、骨髄は、疾患の部位であるだけでなく、固有の微小環境でもある。
固形腫瘍でも、ＭＩＬ中でメモリー細胞またはエフェクター－メモリーＴ細胞が濃縮され
得るというエビデンスがある。骨髄内の免疫成分は、初期の乳癌のホストの腫瘍特異的Ｔ
細胞ならびにワクチン刺激Ｔ細胞の両方に関する抗原経験Ｔ細胞の貯蔵部である。骨髄で
は、メモリーＣＤ４細胞はＩＬ－７発現間質細胞との相互作用により維持され、ＣＤ８細
胞は抗原発現の持続性および有効な抗原提示により維持される。したがって、この状況に
おいて増加したＭＩＬの腫瘍特異性は、抗原の源としての腫瘍の存在による可能性が高く
、それらの持続性は間質要素、サイトカインならびにこの環境において有効な抗原提示が
可能な抗原提示細胞との特有の免疫相互作用により維持される。
固形腫瘍でも、ＭＩＬ中でメモリー細胞またはエフェクター－メモリーＴ細胞が濃縮され
得るというエビデンスがある。骨髄内の免疫成分は、初期の乳癌のホストの腫瘍特異的Ｔ
細胞ならびにワクチン刺激Ｔ細胞の両方に関する抗原経験Ｔ細胞の貯蔵部である。骨髄で
は、メモリーＣＤ４細胞はＩＬ－７発現間質細胞との相互作用により維持され、ＣＤ８細
胞は抗原発現の持続性および有効な抗原提示により維持される。したがって、この状況に
おいて増加したＭＩＬの腫瘍特異性は、抗原の源としての腫瘍の存在による可能性が高く
、それらの持続性は間質要素、サイトカインならびにこの環境において有効な抗原提示が
可能な抗原提示細胞との特有の免疫相互作用により維持される。
【0005】
ｅｘ－ｖｉｖｏで活性化されたＭＩＬは、養子Ｔ細胞療法に必須のいくつかの特性を有
する。活性化時に、これらは、末梢血リンパ球の対応するものと比較して顕著な腫瘍特異
性を示し、成熟した多発性骨髄腫プラズマ細胞ならびにそれらのクローン原性前駆細胞の
両方に存在する広い範囲の抗原を標的とし、多発性骨髄腫プラズマ細胞を有効に死滅させ
る。ＴＩＬと同様に、ＭＩＬは末梢リンパ球よりも高い内因性のポリクローナル抗原特異
性を有する。ＴＩＬとは対照的に、ＭＩＬはすべての患者にあり、より多くの免疫応答微
小環境から得られる。したがって、ＭＩＬは、骨髄が関わる血液悪性疾患のためのＡＣＴ
に対する新規で有望な腫瘍特異的アプローチとなる。
する。活性化時に、これらは、末梢血リンパ球の対応するものと比較して顕著な腫瘍特異
性を示し、成熟した多発性骨髄腫プラズマ細胞ならびにそれらのクローン原性前駆細胞の
両方に存在する広い範囲の抗原を標的とし、多発性骨髄腫プラズマ細胞を有効に死滅させ
る。ＴＩＬと同様に、ＭＩＬは末梢リンパ球よりも高い内因性のポリクローナル抗原特異
性を有する。ＴＩＬとは対照的に、ＭＩＬはすべての患者にあり、より多くの免疫応答微
小環境から得られる。したがって、ＭＩＬは、骨髄が関わる血液悪性疾患のためのＡＣＴ
に対する新規で有望な腫瘍特異的アプローチとなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一部の態様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物に関する。
組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞の少
なくとも約４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。例え
ば、組成物は、ＭＩＬを含んでもよく、フローサイトメトリーゲートによって決定される
場合に細胞の４０％がＣＤ３を発現してもよい。よって、組成物中の細胞の少なくとも約
４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来であろう。組成物は、インターフェロンガ
ンマ（「ＩＦＮγ」）を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞
の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。
組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞
の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよ
い。組成物は、ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。組成物は、ＣＤ８を発現
するＭＩＬの集団を含んでもよい。組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含ん
でもよい。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現するＭＩ
Ｌの集団由来のＭＩＬであってもよい。
組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞の少
なくとも約４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。例え
ば、組成物は、ＭＩＬを含んでもよく、フローサイトメトリーゲートによって決定される
場合に細胞の４０％がＣＤ３を発現してもよい。よって、組成物中の細胞の少なくとも約
４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来であろう。組成物は、インターフェロンガ
ンマ（「ＩＦＮγ」）を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞
の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。
組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。例えば、組成物中の細胞
の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよ
い。組成物は、ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。組成物は、ＣＤ８を発現
するＭＩＬの集団を含んでもよい。組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含ん
でもよい。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現するＭＩ
Ｌの集団由来のＭＩＬであってもよい。
【0007】
一部の態様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を活性化するための方法
であって、２１％未満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを
含む方法に関する。
であって、２１％未満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを
含む方法に関する。
【0008】
一部の態様では、本発明は、被験体のがんを処置するための方法に関する。本方法は、
被験体にＭＩＬを含む組成物を投与するステップを含んでもよい。一部の実施形態では、
本方法は、被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すステップおよび２１％
未満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートし、それにより活性化ＭＩＬを生
じさせるステップを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物であって、
前記組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団由来
のＭＩＬである、組成物。
（項目２）
前記組成物は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発現するＭＩＬの集団を含
み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの前記集団由来
のＭＩＬである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発
現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現する前記複数のＭＩＬ由来
のＭＩＬである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの前記集団
由来のＭＩＬである、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目５に記載の組成物。
（項目７）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目５または６に記載の組成物。
（項目８）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの集団を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目８または９に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの前記集団
由来のＭＩＬである、項目１～６、８および９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を生成するための方法であって、２１％未
満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを含む、方法。
（項目１３）
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を活性化するための方法であって、２１％未満の酸素
を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを含む、方法。
（項目１４）
被験体のがんを処置するための方法であって、
前記被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すステップ、
２１％未満の酸素を含む環境において前記ＭＩＬをインキュベートし、それにより活性
化ＭＩＬを生じさせるステップ、および
前記活性化ＭＩＬを前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目１５）
約１％の酸素から約７％の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステッ
プを含む、項目１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において少なくとも約２４時間インキュベ
ートされる、項目１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において約１日間から約２０日間インキュ
ベートされる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において約３日間から約１４日間インキュ
ベートされる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ＭＩＬを、約２１％の酸素を含む環境においてインキュベートするステップをさら
に含む、項目１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＭＩＬは、約２１％の酸素を含む環境において約４日間インキュベートされる、項
目１９に記載の方法。
（項目２１）
被験体のがんを処置するための方法であって、前記被験体に項目１から１１のいずれか
一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２２）
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を調製するための方法であって、
ＭＩＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素条件下において第１の期間にわたり増殖させるステ
ップ、および
低酸素増殖に続いて前記ＭＩＬを正常酸素条件下において第２の期間にわたり増殖させ
るステップを含む、方法。
（項目２３）
前記低酸素条件は、２１％未満の酸素である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記低酸素条件は、約１％の酸素から約７％の酸素である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記低酸素条件は、約１％から約３％の酸素である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記低酸素条件は、約２％の酸素である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の期間は、約１日間から約２０日間である、項目２２から２６のいずれか一項
に記載の方法。
（項目２８）
前記第１の期間は、約３日間から約１４日間である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の期間は、約３日間である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記正常酸素条件は、約２１％の酸素である、項目２２から２９のいずれか一項に記載
の方法。
（項目３１）
前記第２の期間は、約３から約７日間である、項目２２から３０のいずれか一項に記載
の方法。
（項目３２）
前記第２の期間は、約４日間である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の期間および前記第２の期間は、約３日間から約２４日間である、項目２２か
ら３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の期間および前記第２の期間は、約３から約１０日間である、項目３３に記載
の方法。
（項目３５）
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製剤であって、項目２２から３４のいずれか一項に記載の
方法によって調製されるＭＩＬを含む、製剤。
（項目３６）
低酸素条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖させた治療上有効な骨髄浸潤リンパ球（
ＭＩＬ）製剤。
（項目３７）
患者のがんを処置する方法であって、前記患者に項目３５または３６に記載の製剤を投
与するステップを含む、方法。
（項目３８）
患者のがんを処置する方法であって、
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を前記患者から取り出すステップ、
前記ＭＩＬを低酸素条件下において増殖させるステップ、
前記ＭＩＬを正常酸素条件下において増殖させるステップ、および
前記ＭＩＬを前記患者に投与するステップ
を含む、方法。
被験体にＭＩＬを含む組成物を投与するステップを含んでもよい。一部の実施形態では、
本方法は、被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すステップおよび２１％
未満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートし、それにより活性化ＭＩＬを生
じさせるステップを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物であって、
前記組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約４０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団由来
のＭＩＬである、組成物。
（項目２）
前記組成物は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発現するＭＩＬの集団を含
み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの前記集団由来
のＭＩＬである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ＣＤ３を発現するＭＩＬの前記集団は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発
現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２％は、ＩＦＮγを発現する前記複数のＭＩＬ由来
のＭＩＬである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの前記集団
由来のＭＩＬである、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目５に記載の組成物。
（項目７）
ＣＤ４を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目５または６に記載の組成物。
（項目８）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの集団を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約９８％は、ＣＸＣＲ４を発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
ＣＤ８を発現するＭＩＬの前記集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する前記複数のＭＩＬ
由来のＭＩＬである、項目８または９に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含み、
前記組成物中の細胞の少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの前記集団
由来のＭＩＬである、項目１～６、８および９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を生成するための方法であって、２１％未
満の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを含む、方法。
（項目１３）
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を活性化するための方法であって、２１％未満の酸素
を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステップを含む、方法。
（項目１４）
被験体のがんを処置するための方法であって、
前記被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すステップ、
２１％未満の酸素を含む環境において前記ＭＩＬをインキュベートし、それにより活性
化ＭＩＬを生じさせるステップ、および
前記活性化ＭＩＬを前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目１５）
約１％の酸素から約７％の酸素を含む環境においてＭＩＬをインキュベートするステッ
プを含む、項目１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において少なくとも約２４時間インキュベ
ートされる、項目１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において約１日間から約２０日間インキュ
ベートされる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＭＩＬは、２１％未満の酸素を含む環境において約３日間から約１４日間インキュ
ベートされる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ＭＩＬを、約２１％の酸素を含む環境においてインキュベートするステップをさら
に含む、項目１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＭＩＬは、約２１％の酸素を含む環境において約４日間インキュベートされる、項
目１９に記載の方法。
（項目２１）
被験体のがんを処置するための方法であって、前記被験体に項目１から１１のいずれか
一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２２）
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を調製するための方法であって、
ＭＩＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素条件下において第１の期間にわたり増殖させるステ
ップ、および
低酸素増殖に続いて前記ＭＩＬを正常酸素条件下において第２の期間にわたり増殖させ
るステップを含む、方法。
（項目２３）
前記低酸素条件は、２１％未満の酸素である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記低酸素条件は、約１％の酸素から約７％の酸素である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記低酸素条件は、約１％から約３％の酸素である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記低酸素条件は、約２％の酸素である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の期間は、約１日間から約２０日間である、項目２２から２６のいずれか一項
に記載の方法。
（項目２８）
前記第１の期間は、約３日間から約１４日間である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の期間は、約３日間である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記正常酸素条件は、約２１％の酸素である、項目２２から２９のいずれか一項に記載
の方法。
（項目３１）
前記第２の期間は、約３から約７日間である、項目２２から３０のいずれか一項に記載
の方法。
（項目３２）
前記第２の期間は、約４日間である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の期間および前記第２の期間は、約３日間から約２４日間である、項目２２か
ら３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の期間および前記第２の期間は、約３から約１０日間である、項目３３に記載
の方法。
（項目３５）
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製剤であって、項目２２から３４のいずれか一項に記載の
方法によって調製されるＭＩＬを含む、製剤。
（項目３６）
低酸素条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖させた治療上有効な骨髄浸潤リンパ球（
ＭＩＬ）製剤。
（項目３７）
患者のがんを処置する方法であって、前記患者に項目３５または３６に記載の製剤を投
与するステップを含む、方法。
（項目３８）
患者のがんを処置する方法であって、
骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を前記患者から取り出すステップ、
前記ＭＩＬを低酸素条件下において増殖させるステップ、
前記ＭＩＬを正常酸素条件下において増殖させるステップ、および
前記ＭＩＬを前記患者に投与するステップ
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、インターロイキン２を含む培地（＋ＩＬ２）またはインターロイキン２を含まない培地（ＩＬ２なし）中、正常酸素条件下または低酸素条件下のいずれかにおいて増幅させたＭＩＬに関するフローサイトメトリーの結果を示す。インターロイキン２を含む培地中、正常酸素条件下において増殖させたゲーティングされた細胞の３５．０９％はＣＤ３に関して陽性であった。インターロイキン２のない培地中、正常酸素条件下において増殖させたゲーティングされた細胞の３０．９８％はＣＤ３に関して陽性であった。インターロイキン２を含む培地中、低酸素条件下において増殖させたゲーティングされた細胞の８９．０１％はＣＤ３に関して陽性であった。インターロイキン２のない培地中、低酸素条件下において増殖させたゲーティングされた細胞の８９．９６％はＣＤ３に関して陽性であった。
【0010】
【0011】
【0012】
【図4】図４は、１０日間（Ｄ１０）または１２日間（Ｄ１２）のいずれかで増幅させた細胞について、骨髄腫細胞株（Ｕ２６６／Ｈ９２９）または対照細胞株（ＳＷ７８０）のいずれかに関する低酸素条件下または正常酸素条件下において増幅したＭＩＬの腫瘍特異性を示すグラフである。低酸素細胞は、２％の酸素を含む環境において３日間、増殖させ、続いて正常酸素環境（２１％の酸素）において増幅させた。１０日目に、低ＣＦＳＥであり、腫瘍抗原に反応してインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を産生していた総Ｔ細胞のパーセントによって求める場合、低酸素条件下において増幅させたＭＩＬの２５．１％と比較すると、正常酸素条件下において増幅させた細胞の４％が腫瘍特異的であった。
【0013】
【0014】
【0015】
【図7】図７は、さまざまな酸素条件下において増幅させたＭＩＬに関する、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４またはＣＤ８のいずれかに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。正常酸素条件下において増幅させた全ＭＩＬ集団の２８．３８％がＣＸＣＲ４陽性およびＣＤ４陽性の両方であり、平均蛍光強度が３．９であった。低酸素条件下において増幅させたＭＩＬの６８．９１％がＣＸＣＲ４陽性およびＣＤ４陽性の両方であり、平均蛍光強度が５．４であった。正常酸素条件下において増幅させたＭＩＬの８．０２％がＣＸＣＲ４陽性およびＣＤ８陽性の両方であり、平均蛍光強度が４．６であった。低酸素条件下において増幅させたＭＩＬの１１．０８％がＣＸＣＲ４陽性およびＣＤ８陽性の両方であった。これらの結果は、低酸素がＣＸＣＲ４を発現する細胞の数ならびに細胞当たりの発現の程度（ＭＦＩ）をともに増加させ、このことがこれらの細胞が注入時に骨髄に移動する可能性を増加させることを示唆している。
【0016】
【図8A】図８は、パネル（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）とラベルした３つのパネルからなる。パネルＡは、細胞増幅前の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）およびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。パネルＢは、正常酸素条件下における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。示されるとおり、ＰＢＬにおける４－１ＢＢ発現は、ＣＤ８ ＰＢＬが１１．３４％から０．３４％に低下し、ＭＩＬ ＣＤ８が１５．１％から７．５４％の低下を示した。パネルＣは、低酸素条件における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。低酸素条件における増幅後にＰＢＬは４－１ＢＢをダウンレギュレートした（ＣＤ８ ＰＢＬ：ベースラインの１１．３４％から０％へ）一方で、低酸素条件における増幅後にＭＩＬは４－１ＢＢをアップレギュレートした（ＣＤ８ ＭＩＬ：ベースラインの１５．１％から２１．７９％へ）。
【図8B】図８は、パネル（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）とラベルした３つのパネルからなる。パネルＡは、細胞増幅前の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）およびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。パネルＢは、正常酸素条件下における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。示されるとおり、ＰＢＬにおける４－１ＢＢ発現は、ＣＤ８ ＰＢＬが１１．３４％から０．３４％に低下し、ＭＩＬ ＣＤ８が１５．１％から７．５４％の低下を示した。パネルＣは、低酸素条件における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。低酸素条件における増幅後にＰＢＬは４－１ＢＢをダウンレギュレートした（ＣＤ８ ＰＢＬ：ベースラインの１１．３４％から０％へ）一方で、低酸素条件における増幅後にＭＩＬは４－１ＢＢをアップレギュレートした（ＣＤ８ ＭＩＬ：ベースラインの１５．１％から２１．７９％へ）。
【図8C】図８は、パネル（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）とラベルした３つのパネルからなる。パネルＡは、細胞増幅前の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）およびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。パネルＢは、正常酸素条件下における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。示されるとおり、ＰＢＬにおける４－１ＢＢ発現は、ＣＤ８ ＰＢＬが１１．３４％から０．３４％に低下し、ＭＩＬ ＣＤ８が１５．１％から７．５４％の低下を示した。パネルＣは、低酸素条件における増幅後のＰＢＬおよびＭＩＬに関する、ＣＤ４、ＣＤ８および４－１ＢＢに対するゲートを利用したフローサイトメトリーの結果を示す。低酸素条件における増幅後にＰＢＬは４－１ＢＢをダウンレギュレートした（ＣＤ８ ＰＢＬ：ベースラインの１１．３４％から０％へ）一方で、低酸素条件における増幅後にＭＩＬは４－１ＢＢをアップレギュレートした（ＣＤ８ ＭＩＬ：ベースラインの１５．１％から２１．７９％へ）。
【0017】
【0018】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
養子Ｔ細胞療法を用いて達成する主な目標は、最も多くの腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させ
る能力であり、それらの細胞はその後再注入されるとまたｉｎ ｖｉｖｏにおいて増幅し
、長い期間持続することになる。一部の態様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩ
Ｌ」）の固有の特性を活用するＴ細胞増幅に対する新規のアプローチに関する。特に、Ｍ
ＩＬは、末梢リンパ球（ＰＢＬ）とは著しく異なる。例えば、ＭＩＬは、より容易に増幅
され、ＰＢＬよりも大きな程度に活性化マーカーをアップレギュレートし、より偏ったＶ
βレパートリーを維持し、骨髄へ移動し、最も重要なことに、著しく高い腫瘍特異性を有
する。ＭＩＬ抗骨髄腫免疫は、臨床反応と直接相関するが、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細
胞増幅または持続的な臨床反応は、これまで注入後には観察されなかった。
る能力であり、それらの細胞はその後再注入されるとまたｉｎ ｖｉｖｏにおいて増幅し
、長い期間持続することになる。一部の態様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩ
Ｌ」）の固有の特性を活用するＴ細胞増幅に対する新規のアプローチに関する。特に、Ｍ
ＩＬは、末梢リンパ球（ＰＢＬ）とは著しく異なる。例えば、ＭＩＬは、より容易に増幅
され、ＰＢＬよりも大きな程度に活性化マーカーをアップレギュレートし、より偏ったＶ
βレパートリーを維持し、骨髄へ移動し、最も重要なことに、著しく高い腫瘍特異性を有
する。ＭＩＬ抗骨髄腫免疫は、臨床反応と直接相関するが、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細
胞増幅または持続的な臨床反応は、これまで注入後には観察されなかった。
【0021】
約１％の酸素から約７％の酸素または約１％の酸素から約３％の酸素、例えば、２％の
酸素（低酸素条件）など２１％未満の酸素のＯ２レベルにおいてＭＩＬを培養することに
より、正常酸素条件においてのみ培養する場合と比較して全般的な細胞の増幅ならびに腫
瘍細胞を認識するその能力の両方が増す。このように、一部の実施形態では、本発明は、
以下の１つまたは複数を含む治療的使用のためのＭＩＬの調製のための方法に関する。患
者から骨髄が採取されてもよい。採取された骨髄は、例えば、腫瘍特異的なＭＩＬを作り
出すために凍結されてもよく、またはすぐに使用されてもよい。骨髄が凍結される場合、
それは好ましくはインキュベーションの前に解凍される。骨髄は、ＭＩＬを精製するため
に当業者に公知の方法により処理されてもよい。ＭＩＬは例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビ
ーズなどのビーズを用いて活性化することができる。溶液中のビーズ対細胞の比は変化し
てもよく、一部の好適な実施形態では、比は３対１である。同様に、ＭＩＬは、例えば、
抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの非存在下、１つまたは複数の抗体、抗原および／またはサイ
トカインの存在下において増幅させてもよい。例えば、ＭＩＬに添加されるビーズ、抗体
、抗原および／またはサイトカインの量を調整するために、採取された骨髄の細胞数が決
定されてもよい。一部の実施形態では、ＭＩＬは、特に、細胞を回収するよう設計された
ビーズを使用して捕捉される。
酸素（低酸素条件）など２１％未満の酸素のＯ２レベルにおいてＭＩＬを培養することに
より、正常酸素条件においてのみ培養する場合と比較して全般的な細胞の増幅ならびに腫
瘍細胞を認識するその能力の両方が増す。このように、一部の実施形態では、本発明は、
以下の１つまたは複数を含む治療的使用のためのＭＩＬの調製のための方法に関する。患
者から骨髄が採取されてもよい。採取された骨髄は、例えば、腫瘍特異的なＭＩＬを作り
出すために凍結されてもよく、またはすぐに使用されてもよい。骨髄が凍結される場合、
それは好ましくはインキュベーションの前に解凍される。骨髄は、ＭＩＬを精製するため
に当業者に公知の方法により処理されてもよい。ＭＩＬは例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビ
ーズなどのビーズを用いて活性化することができる。溶液中のビーズ対細胞の比は変化し
てもよく、一部の好適な実施形態では、比は３対１である。同様に、ＭＩＬは、例えば、
抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの非存在下、１つまたは複数の抗体、抗原および／またはサイ
トカインの存在下において増幅させてもよい。例えば、ＭＩＬに添加されるビーズ、抗体
、抗原および／またはサイトカインの量を調整するために、採取された骨髄の細胞数が決
定されてもよい。一部の実施形態では、ＭＩＬは、特に、細胞を回収するよう設計された
ビーズを使用して捕捉される。
【0022】
採取されたＭＩＬは、優先的には低酸素環境において、例えば、第１の期間、増殖させ
る。一部の実施形態では、ＭＩＬは組織培養バッグ中、２％のＡＢ血清および２００Ｕの
ＩＬ２を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に入れられてもよい。他の培養条件およ
び要素は、当業者によって認識されるとおりに使用することができることが予想される。
ＭＩＬは、約１％から約７％の酸素（低酸素、低酸素条件）、好ましくは、約２％の酸素
などの約１％から約３％の酸素の環境において約３から約１０日間、例えば、４日間など
の約３から約２０日間（すなわち、第１の期間）増殖させてもよい。低酸素環境は、例え
ば、細胞が増殖させる容器に亜酸化窒素を加えることによって作り出すことができる。一
部の実施形態では、低酸素環境は、低圧チャンバーを利用することによって作り出しても
よい。低酸素増殖後に、ＭＩＬは、正常酸素環境、例えば、２１％の酸素において増殖さ
せてもよい。一部の好適な実施形態では、ＭＩＬは、正常酸素条件においてさらに約３か
ら約７日間（すなわち、第２の期間）増殖させる（例えば、約３から約１０日間の増殖な
どの合計約３から約２７日間の増殖）。増殖させた細胞は、その後、患者（例えば、患者
もしくは同種異系のレシピエントのいずれか）に投与されてもよく、または将来的な使用
のために保存されてもよい。
る。一部の実施形態では、ＭＩＬは組織培養バッグ中、２％のＡＢ血清および２００Ｕの
ＩＬ２を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に入れられてもよい。他の培養条件およ
び要素は、当業者によって認識されるとおりに使用することができることが予想される。
ＭＩＬは、約１％から約７％の酸素（低酸素、低酸素条件）、好ましくは、約２％の酸素
などの約１％から約３％の酸素の環境において約３から約１０日間、例えば、４日間など
の約３から約２０日間（すなわち、第１の期間）増殖させてもよい。低酸素環境は、例え
ば、細胞が増殖させる容器に亜酸化窒素を加えることによって作り出すことができる。一
部の実施形態では、低酸素環境は、低圧チャンバーを利用することによって作り出しても
よい。低酸素増殖後に、ＭＩＬは、正常酸素環境、例えば、２１％の酸素において増殖さ
せてもよい。一部の好適な実施形態では、ＭＩＬは、正常酸素条件においてさらに約３か
ら約７日間（すなわち、第２の期間）増殖させる（例えば、約３から約１０日間の増殖な
どの合計約３から約２７日間の増殖）。増殖させた細胞は、その後、患者（例えば、患者
もしくは同種異系のレシピエントのいずれか）に投与されてもよく、または将来的な使用
のために保存されてもよい。
【0023】
患者の骨髄から採取され、本明細書に記載の方法に従って、すなわち、低酸素条件下に
おいて第１の期間、続いて正常酸素条件下において第２の期間、処理されたＭＩＬは、予
想外にも同じ手順に供された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）よりも良好に働く。下に示すとお
りＭＩＬの増強された能力としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方にお
ける著しい増幅、４－１ＢＢなどの生物学的マーカーの発現の向上および腫瘍特異性の増
加が挙げられる。
おいて第１の期間、続いて正常酸素条件下において第２の期間、処理されたＭＩＬは、予
想外にも同じ手順に供された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）よりも良好に働く。下に示すとお
りＭＩＬの増強された能力としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方にお
ける著しい増幅、４－１ＢＢなどの生物学的マーカーの発現の向上および腫瘍特異性の増
加が挙げられる。
【0024】
当業者は、本発明の手順が、骨髄腫、肺癌および乳癌を含む多くの異なる種類のがんを
処置するために利用することができることを認識するであろう。骨髄はセントラルメモリ
ー細胞の貯蔵部であるため、あらゆる種類のがんからの腫瘍特異的Ｔ細胞が患者の骨髄で
見つかった。本明細書中で開示されるとおり、低酸素培養条件は、増幅ならびに腫瘍特異
性の両方を増加させるため、このアプローチは、広い範囲のがん患者からのＭＩＬを増殖
させるために使用することができる。一部の好適な実施形態では、患者のＭＩＬが、採取
され、低酸素条件において第１の期間、例えば、約１日間から約２０日間増幅させた後、
正常酸素条件において第２の期間、例えば、約３日から約７日間増幅させる。細胞は、そ
の後、処置のために患者に提供されてもよく、または将来的な使用のために保存されても
よい。
処置するために利用することができることを認識するであろう。骨髄はセントラルメモリ
ー細胞の貯蔵部であるため、あらゆる種類のがんからの腫瘍特異的Ｔ細胞が患者の骨髄で
見つかった。本明細書中で開示されるとおり、低酸素培養条件は、増幅ならびに腫瘍特異
性の両方を増加させるため、このアプローチは、広い範囲のがん患者からのＭＩＬを増殖
させるために使用することができる。一部の好適な実施形態では、患者のＭＩＬが、採取
され、低酸素条件において第１の期間、例えば、約１日間から約２０日間増幅させた後、
正常酸素条件において第２の期間、例えば、約３日から約７日間増幅させる。細胞は、そ
の後、処置のために患者に提供されてもよく、または将来的な使用のために保存されても
よい。
【0025】
一部の態様では、本発明は、低酸素環境におけるＭＩＬの増幅が、注入後にｉｎ ｖｉ
ｖｏにおけるＴ細胞増幅を可能にするという発見に関する。特に、ＭＩＬを２％Ｏ２（低
酸素）において３日間、続いて２１％Ｏ２（正常酸素）に切り替えて増殖させた結果、腫
瘍特異性がほぼ１０倍高くなった（図４）。まとめると、これらのデータは、そのような
増殖条件が、同じ供給源から得た腫瘍特異的ＭＩＬの絶対数を、正常酸素条件下において
のみ増殖させたＭＩＬと比較して増加させることができることを示唆している。
ｖｏにおけるＴ細胞増幅を可能にするという発見に関する。特に、ＭＩＬを２％Ｏ２（低
酸素）において３日間、続いて２１％Ｏ２（正常酸素）に切り替えて増殖させた結果、腫
瘍特異性がほぼ１０倍高くなった（図４）。まとめると、これらのデータは、そのような
増殖条件が、同じ供給源から得た腫瘍特異的ＭＩＬの絶対数を、正常酸素条件下において
のみ増殖させたＭＩＬと比較して増加させることができることを示唆している。
【0026】
すべての実験は、患者のサンプルからのＭＩＬ産物を使用して実施した。図３に示され
るとおり、低酸素条件における完全な規模の臨床的ＭＩＬ産物の増幅は、劇的にＴ細胞数
を増加させた。正常酸素条件を用いた場合、７日を過ぎてＭＩＬを増幅させるのが困難で
あったことに留意すべきである。この実験では、７日目の増幅は、低酸素での１１９倍に
対して正常酸素では３６．３倍であった。さらに、低酸素条件下において増殖させた細胞
は、１２日目まで増幅し続け、１１日目に総計２２０倍の増幅に達した。
るとおり、低酸素条件における完全な規模の臨床的ＭＩＬ産物の増幅は、劇的にＴ細胞数
を増加させた。正常酸素条件を用いた場合、７日を過ぎてＭＩＬを増幅させるのが困難で
あったことに留意すべきである。この実験では、７日目の増幅は、低酸素での１１９倍に
対して正常酸素では３６．３倍であった。さらに、低酸素条件下において増殖させた細胞
は、１２日目まで増幅し続け、１１日目に総計２２０倍の増幅に達した。
【0027】
さらに良好な増幅およびさらに高い腫瘍特異性を得ることに加えて、Ｔ細胞の生存を最
大にするために増殖条件を最適化した。４－１ＢＢの発現が、多くのこれらの特性の重要
なレギュレーターであることが示された。これは、Ｔ細胞増幅を制御し、アポトーシスを
低減し、ＣＤ８細胞の細胞傷害活性を増大し、生存を向上させることができる。まとめる
と、活性化ＭＩＬ上の４－１ＢＢ発現は、生存および腫瘍特異性を高める重要なレギュレ
ーターである可能性がある。したがって、ＭＩＬ上の４－１ＢＢ発現を調べ、さまざまな
条件において増殖させたＰＢＬのものと比較した。図８に示したとおり、ベースラインの
４－１ＢＢの発現は、ＭＩＬでＰＢＬでよりも高かった（１８．２％対８．１％）。興味
深いことに、正常酸素におけるＴ細胞増幅は、両集団でその発現を低下させた（ＭＩＬ
１０．７％、ＰＢＬ ２．８％）一方、低酸素における増幅は、４－１ＢＢ発現をＭＩＬ
で著しく増加させ（４３．４％）、ＰＢＬでその発現を完全に阻害した（０％）。これら
のデータは、ＰＢＬとＭＩＬの間の顕著な差をさらにまた強調し、４－１ＢＢのアップレ
ギュレーションが、単に低酸素増殖条件だけでなくさらなる要因に依存することをさらに
示す。
大にするために増殖条件を最適化した。４－１ＢＢの発現が、多くのこれらの特性の重要
なレギュレーターであることが示された。これは、Ｔ細胞増幅を制御し、アポトーシスを
低減し、ＣＤ８細胞の細胞傷害活性を増大し、生存を向上させることができる。まとめる
と、活性化ＭＩＬ上の４－１ＢＢ発現は、生存および腫瘍特異性を高める重要なレギュレ
ーターである可能性がある。したがって、ＭＩＬ上の４－１ＢＢ発現を調べ、さまざまな
条件において増殖させたＰＢＬのものと比較した。図８に示したとおり、ベースラインの
４－１ＢＢの発現は、ＭＩＬでＰＢＬでよりも高かった（１８．２％対８．１％）。興味
深いことに、正常酸素におけるＴ細胞増幅は、両集団でその発現を低下させた（ＭＩＬ
１０．７％、ＰＢＬ ２．８％）一方、低酸素における増幅は、４－１ＢＢ発現をＭＩＬ
で著しく増加させ（４３．４％）、ＰＢＬでその発現を完全に阻害した（０％）。これら
のデータは、ＰＢＬとＭＩＬの間の顕著な差をさらにまた強調し、４－１ＢＢのアップレ
ギュレーションが、単に低酸素増殖条件だけでなくさらなる要因に依存することをさらに
示す。
【0028】
これらの培養条件は臨床試験に採用され、低酸素増殖条件は、全体のＴ細胞増幅を平均
７．９Ｅ９から１．８Ｅ１０に増加させた。さらに、低酸素増殖条件はまた、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおけるＴ細胞増幅も観察することができた（図６は、すべての患者に関する６０日
目までの総リンパ球数を示す）。
７．９Ｅ９から１．８Ｅ１０に増加させた。さらに、低酸素増殖条件はまた、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおけるＴ細胞増幅も観察することができた（図６は、すべての患者に関する６０日
目までの総リンパ球数を示す）。
【0029】
一部の態様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を含む組成物に関する。
ＭＩＬは、活性化ＭＩＬであってもよい。
ＭＩＬは、活性化ＭＩＬであってもよい。
【0030】
好適な実施形態では、組成物は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団を含み、すなわち、Ｃ
Ｄ３を発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、フローサイトメトリーによって検出さ
れる場合に、ＣＤ３を発現する骨髄浸潤リンパ球である。例えば、組成物中の細胞の少な
くとも約４０％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％またはさらに少
なくとも約８９％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。好適
な一実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも約８０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約４０％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の約４５％から約１００％、約５０％から約１００
％、約５５％から約１００％、約６０％から約１００％、約６５％から約１００％、約７
０％から約１００％、約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から
約１００％、約８６％から約１００％、約８７％から約１００％、約８８％から約１００
％またはさらに約８９％から約１００％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬ
であってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサイトメトリーによっ
て検出される場合に、ＣＤ３を発現しないＭＩＬの集団または低レベル、すなわち、ＣＤ
３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較して低レベルのＣＤ３を発現
するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
Ｄ３を発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、フローサイトメトリーによって検出さ
れる場合に、ＣＤ３を発現する骨髄浸潤リンパ球である。例えば、組成物中の細胞の少な
くとも約４０％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％またはさらに少
なくとも約８９％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。好適
な一実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも約８０％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約４０％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の約４５％から約１００％、約５０％から約１００
％、約５５％から約１００％、約６０％から約１００％、約６５％から約１００％、約７
０％から約１００％、約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から
約１００％、約８６％から約１００％、約８７％から約１００％、約８８％から約１００
％またはさらに約８９％から約１００％は、ＣＤ３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬ
であってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサイトメトリーによっ
て検出される場合に、ＣＤ３を発現しないＭＩＬの集団または低レベル、すなわち、ＣＤ
３を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較して低レベルのＣＤ３を発現
するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
【0031】
一部の実施形態では、組成物は、インターフェロンガンマ（「ＩＦＮγ」）を発現する
ＭＩＬの集団を含み、すなわち、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、
フローサイトメトリーによって検出される場合に、ＩＦＮγを発現する骨髄浸潤リンパ球
である。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２％、例えば、組成物中の細胞の少なく
とも約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１
３％、１４％、１５％、１６％、１７％またはさらに少なくとも約１８％は、ＩＦＮγを
発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細
胞の約２％から約１００％、例えば、組成物中の細胞の約２％から約１００％、約３％か
ら約１００％、約４％から約１００％、約５％から約１００％、約６％から約１００％、
約７％から約１００％、約８％から約１００％、約９％から約１００％、約１０％から約
１００％、約１１％から約１００％、約１２％から約１００％、約１３％から約１００％
、約１４％から約１００％、約１５％から約１００％、約１６％から約１００％、約１７
％から約１００％またはさらに約１８％から約１００％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサイ
トメトリーによって検出される場合に、ＩＦＮγを発現しないＭＩＬの集団または低レベ
ル、すなわち、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較して低
レベルのＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
ＭＩＬの集団を含み、すなわち、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、
フローサイトメトリーによって検出される場合に、ＩＦＮγを発現する骨髄浸潤リンパ球
である。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２％、例えば、組成物中の細胞の少なく
とも約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１
３％、１４％、１５％、１６％、１７％またはさらに少なくとも約１８％は、ＩＦＮγを
発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細
胞の約２％から約１００％、例えば、組成物中の細胞の約２％から約１００％、約３％か
ら約１００％、約４％から約１００％、約５％から約１００％、約６％から約１００％、
約７％から約１００％、約８％から約１００％、約９％から約１００％、約１０％から約
１００％、約１１％から約１００％、約１２％から約１００％、約１３％から約１００％
、約１４％から約１００％、約１５％から約１００％、約１６％から約１００％、約１７
％から約１００％またはさらに約１８％から約１００％は、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサイ
トメトリーによって検出される場合に、ＩＦＮγを発現しないＭＩＬの集団または低レベ
ル、すなわち、ＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較して低
レベルのＩＦＮγを発現するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
【0032】
一部の実施形態では、組成物は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団を含み、すなわち
、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、フローサイトメトリーによっ
て検出される場合に、ＣＸＣＲ４を発現する骨髄浸潤リンパ球である。例えば、組成物中
の細胞の少なくとも約９８％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約９８．１％、９８
．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、
９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５
％、９９．６％またはさらに少なくとも約９９．７％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約９８％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約９８．１％から約１００％、約９８
．２％から約１００％、約９８．３％から約１００％、約９８．４％から約１００％、約
９８．５％から約１００％、約９８．６％から約１００％、約９８．７％から約１００％
、約９８．８％から約１００％、約９８．９％から約１００％、約９９．０％から約１０
０％、約９９．１％から約１００％、約９９．２％から約１００％、約９９．３％から約
１００％、約９９．４％から約１００％、約９９．５％から約１００％、約９９．６％か
ら約１００％またはさらに約９９．７％から約１００％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬ
の集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサ
イトメトリーによって検出される場合に、ＣＸＣＲ４を発現しないＭＩＬの集団または低
レベル、すなわち、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較
して低レベルのＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団の各細胞が、例えば、フローサイトメトリーによっ
て検出される場合に、ＣＸＣＲ４を発現する骨髄浸潤リンパ球である。例えば、組成物中
の細胞の少なくとも約９８％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約９８．１％、９８
．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、
９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５
％、９９．６％またはさらに少なくとも約９９．７％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの
集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約９８％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約９８．１％から約１００％、約９８
．２％から約１００％、約９８．３％から約１００％、約９８．４％から約１００％、約
９８．５％から約１００％、約９８．６％から約１００％、約９８．７％から約１００％
、約９８．８％から約１００％、約９８．９％から約１００％、約９９．０％から約１０
０％、約９９．１％から約１００％、約９９．２％から約１００％、約９９．３％から約
１００％、約９９．４％から約１００％、約９９．５％から約１００％、約９９．６％か
ら約１００％またはさらに約９９．７％から約１００％は、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬ
の集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物は、例えば、フローサ
イトメトリーによって検出される場合に、ＣＸＣＲ４を発現しないＭＩＬの集団または低
レベル、すなわち、ＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬの発現レベルと比較
して低レベルのＣＸＣＲ４を発現するＭＩＬの集団のいずれかを含む。
【0033】
一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団を含む。ＣＤ４を発現
するＭＩＬの集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含んでもよい。
するＭＩＬの集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含んでもよい。
【0034】
ＣＤ４を発現するＭＩＬの集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含んでもよい
。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも
約２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％
、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％
、４２％またはさらに少なくとも約４３％は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬ由来の
ＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２１％から約１００％
、例えば、組成物中の細胞の約２２％から約１００％、約２３％から約１００％、約２４
％から約１００％、約２５％から約１００％、約２６％から約１００％、約２７％から約
１００％、約２８％から約１００％、約２９％から約１００％、約３０％から約１００％
、約３１％から約１００％、約３２％から約１００％、約３３％から約１００％、約３４
％から約１００％、約３５％から約１００％、約３６％から約１００％、約３７％から約
１００％、約３８％から約１００％、約３９％から約１００％、約４０％から約１００％
、約４１％から約１００％、約４２％から約１００％またはさらに約４３％から約１００
％は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。
。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも
約２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％
、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％
、４２％またはさらに少なくとも約４３％は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬ由来の
ＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２１％から約１００％
、例えば、組成物中の細胞の約２２％から約１００％、約２３％から約１００％、約２４
％から約１００％、約２５％から約１００％、約２６％から約１００％、約２７％から約
１００％、約２８％から約１００％、約２９％から約１００％、約３０％から約１００％
、約３１％から約１００％、約３２％から約１００％、約３３％から約１００％、約３４
％から約１００％、約３５％から約１００％、約３６％から約１００％、約３７％から約
１００％、約３８％から約１００％、約３９％から約１００％、約４０％から約１００％
、約４１％から約１００％、約４２％から約１００％またはさらに約４３％から約１００
％は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。
【0035】
組成物は、ＣＤ８を発現するＭＩＬの集団を含んでもよい。ＣＤ８を発現するＭＩＬの
集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含んでもよい。
集団は、ＣＸＣＲ４を発現する複数のＭＩＬを含んでもよい。
【0036】
ＣＤ８を発現するＭＩＬの集団は、４－１ＢＢを発現する複数のＭＩＬを含んでもよい
。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも
約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１
８％、１９％、２０％またはさらに少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する複数の
ＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の約８％から約１００％、約９％から約１００％、
約１０％から約１００％、約１１％から約１００％、約１２％から約１００％、約１３％
から約１００％、約１４％から約１００％、約１５％から約１００％、約１６％から約１
００％、約１７％から約１００％、約１８％から約１００％、約１９％から約１００％、
約２０％から約１００％またはさらに約２１％から約１００％は、４－１ＢＢを発現する
複数のＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。
。例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも
約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１
８％、１９％、２０％またはさらに少なくとも約２１％は、４－１ＢＢを発現する複数の
ＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２％から
約１００％、例えば、組成物中の細胞の約８％から約１００％、約９％から約１００％、
約１０％から約１００％、約１１％から約１００％、約１２％から約１００％、約１３％
から約１００％、約１４％から約１００％、約１５％から約１００％、約１６％から約１
００％、約１７％から約１００％、約１８％から約１００％、約１９％から約１００％、
約２０％から約１００％またはさらに約２１％から約１００％は、４－１ＢＢを発現する
複数のＭＩＬ由来のＭＩＬであってもよい。
【0037】
一部の実施形態では、組成物は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団を含む。例えば、
組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２２％、
２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、
３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％ま
たはさらに少なくとも約４３％は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであ
ってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２１％から１００％、例えば、組
成物中の細胞の約２２％から約１００％、約２３％から約１００％、約２４％から約１０
０％、約２５％から約１００％、約２６％から約１００％、約２７％から約１００％、約
２８％から約１００％、約２９％から約１００％、約３０％から約１００％、約３１％か
ら約１００％、約３２％から約１００％、約３３％から約１００％、約３４％から約１０
０％、約３５％から約１００％、約３６％から約１００％、約３７％から約１００％、約
３８％から約１００％、約３９％から約１００％、約４０％から約１００％、約４１％か
ら約１００％、約４２％から約１００％またはさらに約４３％から約１００％は、４－１
ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物
は、例えば、フローサイトメトリーによって検出される場合に、４－１ＢＢを発現しない
ＭＩＬの集団または低レベル、すなわち、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩ
Ｌの発現レベルと比較して低レベルの４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団のいずれかを含
む。
組成物中の細胞の少なくとも約２１％、例えば、組成物中の細胞の少なくとも約２２％、
２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、
３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％ま
たはさらに少なくとも約４３％は、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであ
ってもよい。一部の実施形態では、組成物中の細胞の約２１％から１００％、例えば、組
成物中の細胞の約２２％から約１００％、約２３％から約１００％、約２４％から約１０
０％、約２５％から約１００％、約２６％から約１００％、約２７％から約１００％、約
２８％から約１００％、約２９％から約１００％、約３０％から約１００％、約３１％か
ら約１００％、約３２％から約１００％、約３３％から約１００％、約３４％から約１０
０％、約３５％から約１００％、約３６％から約１００％、約３７％から約１００％、約
３８％から約１００％、約３９％から約１００％、約４０％から約１００％、約４１％か
ら約１００％、約４２％から約１００％またはさらに約４３％から約１００％は、４－１
ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩＬであってもよい。一部の実施形態では、組成物
は、例えば、フローサイトメトリーによって検出される場合に、４－１ＢＢを発現しない
ＭＩＬの集団または低レベル、すなわち、４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団由来のＭＩ
Ｌの発現レベルと比較して低レベルの４－１ＢＢを発現するＭＩＬの集団のいずれかを含
む。
【0038】
一部の態様では、本発明は、被験体のがんを予防または処置するための方法であって、
被験体に本明細書に記載される組成物のいずれか１つを投与することを含む方法に関する
。好適な実施形態では、本方法は、被験体に治療有効量の本明細書に記載される組成物の
いずれか１つを投与することを含む。好適な実施形態では、本方法は、被験体に治療有効
量のＭＩＬ、例えば、本明細書に記載される活性化ＭＩＬを投与することを含む。被験体
は、新生物、例えば、がんを有し得る。例えば、被験体は、多発性骨髄腫を有し得る。被
験体は、ヒト被験体であってもよい。
被験体に本明細書に記載される組成物のいずれか１つを投与することを含む方法に関する
。好適な実施形態では、本方法は、被験体に治療有効量の本明細書に記載される組成物の
いずれか１つを投与することを含む。好適な実施形態では、本方法は、被験体に治療有効
量のＭＩＬ、例えば、本明細書に記載される活性化ＭＩＬを投与することを含む。被験体
は、新生物、例えば、がんを有し得る。例えば、被験体は、多発性骨髄腫を有し得る。被
験体は、ヒト被験体であってもよい。
【0039】
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物を生成するための方法であっ
て、低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることを含む方法に関する。一部の態
様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を活性化するための方法であって、
低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることを含む方法に関する。
て、低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることを含む方法に関する。一部の態
様では、本発明は、骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を活性化するための方法であって、
低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることを含む方法に関する。
【0040】
一部の態様では、本発明は、被験体のがんを処置するための方法に関する。本方法は、
被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すこと、低酸素環境においてＭＩＬ
をインキュベートすることにより、活性化ＭＩＬを生じさせることおよび活性化ＭＩＬを
被験体に投与することを含んでもよい。
被験体から骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）を取り出すこと、低酸素環境においてＭＩＬ
をインキュベートすることにより、活性化ＭＩＬを生じさせることおよび活性化ＭＩＬを
被験体に投与することを含んでもよい。
【0041】
低酸素環境は、約２１％未満の酸素、例えば、約２０％、１９％、１８％、１７％、１
６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５
％、４％未満または約３％未満の酸素を含んでもよい。例えば、低酸素環境は、約０％の
酸素から約２０％の酸素、例えば、約０％の酸素から約１９％の酸素、約０％の酸素から
約１８％の酸素、約０％の酸素から約１７％の酸素、約０％の酸素から約１６％の酸素、
約０％の酸素から約１５％の酸素、約０％の酸素から約１４％の酸素、約０％の酸素から
約１３％の酸素、約０％の酸素から約１２％の酸素、約０％の酸素から約１１％の酸素、
約０％の酸素から約１０％の酸素、約０％の酸素から約９％の酸素、約０％の酸素から約
８％の酸素、約０％の酸素から約７％の酸素、約０％の酸素から約６％の酸素、約０％の
酸素から約５％の酸素、約０％の酸素から約４％の酸素または約０％の酸素から約３％の
酸素を含んでもよい。好適な実施形態では、低酸素環境は、約１％から約７％の酸素を含
む。低酸素環境は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３
％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％
または約０％の酸素を含んでもよい。好適な実施形態では、低酸素環境は、約７％、６％
、５％、４％、３％、２％または１％の酸素を含む。
６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５
％、４％未満または約３％未満の酸素を含んでもよい。例えば、低酸素環境は、約０％の
酸素から約２０％の酸素、例えば、約０％の酸素から約１９％の酸素、約０％の酸素から
約１８％の酸素、約０％の酸素から約１７％の酸素、約０％の酸素から約１６％の酸素、
約０％の酸素から約１５％の酸素、約０％の酸素から約１４％の酸素、約０％の酸素から
約１３％の酸素、約０％の酸素から約１２％の酸素、約０％の酸素から約１１％の酸素、
約０％の酸素から約１０％の酸素、約０％の酸素から約９％の酸素、約０％の酸素から約
８％の酸素、約０％の酸素から約７％の酸素、約０％の酸素から約６％の酸素、約０％の
酸素から約５％の酸素、約０％の酸素から約４％の酸素または約０％の酸素から約３％の
酸素を含んでもよい。好適な実施形態では、低酸素環境は、約１％から約７％の酸素を含
む。低酸素環境は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３
％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％
または約０％の酸素を含んでもよい。好適な実施形態では、低酸素環境は、約７％、６％
、５％、４％、３％、２％または１％の酸素を含む。
【0042】
低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることは、例えば、組織培養培地におい
て少なくとも約１時間、例えば、少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間
、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間
、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約
１４日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。インキュベートすることは
、約１時間から約３０日間、例えば、約１日間から約２０日間、約１日間から約１４日間
または約１日間から約１２日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。一部
の好適な実施形態では、低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることは、低酸素
環境においてＭＩＬを約２日間から約５日間インキュベートすることを含む。本方法は、
低酸素環境においてＭＩＬを約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日
間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間インキュ
ベートすることを含んでもよい。一部の好適な実施形態では、本方法は、低酸素環境にお
いてＭＩＬを約３日間インキュベートすることを含む。
て少なくとも約１時間、例えば、少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間
、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間
、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約
１４日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。インキュベートすることは
、約１時間から約３０日間、例えば、約１日間から約２０日間、約１日間から約１４日間
または約１日間から約１２日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。一部
の好適な実施形態では、低酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることは、低酸素
環境においてＭＩＬを約２日間から約５日間インキュベートすることを含む。本方法は、
低酸素環境においてＭＩＬを約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日
間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間インキュ
ベートすることを含んでもよい。一部の好適な実施形態では、本方法は、低酸素環境にお
いてＭＩＬを約３日間インキュベートすることを含む。
【0043】
好適な実施形態では、本方法は、例えば、低酸素環境においてＭＩＬをインキュベート
した後に正常酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む。
した後に正常酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む。
【0044】
正常酸素環境は、少なくとも約２１％の酸素を含んでもよい。正常酸素環境は、約５％
の酸素から約３０％の酸素、例えば、約１０％の酸素から約３０％の酸素、約１５％の酸
素から約２５％の酸素、約１８％の酸素から約２４％の酸素、約１９％の酸素から約２３
％の酸素または約２０％の酸素から約２２％の酸素を含んでもよい。一部の実施形態では
、正常酸素環境は約２１％の酸素を含む。
の酸素から約３０％の酸素、例えば、約１０％の酸素から約３０％の酸素、約１５％の酸
素から約２５％の酸素、約１８％の酸素から約２４％の酸素、約１９％の酸素から約２３
％の酸素または約２０％の酸素から約２２％の酸素を含んでもよい。一部の実施形態では
、正常酸素環境は約２１％の酸素を含む。
【0045】
正常酸素環境においてＭＩＬをインキュベートすることは、例えば、組織培養培地にお
いて少なくとも約１時間、例えば、少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時
間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日
間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも
約１４日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。インキュベートすること
は、約１時間から約３０日間、例えば、約１日間から約２０日間、約１日間から約１４日
間、約１日間から約１２日間または約２日間から約１２日間、ＭＩＬをインキュベートす
ることを含んでもよい。
いて少なくとも約１時間、例えば、少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時
間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日
間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも
約１４日間、ＭＩＬをインキュベートすることを含んでもよい。インキュベートすること
は、約１時間から約３０日間、例えば、約１日間から約２０日間、約１日間から約１４日
間、約１日間から約１２日間または約２日間から約１２日間、ＭＩＬをインキュベートす
ることを含んでもよい。
【実施例】
【0046】
（実施例１．低酸素環境および正常酸素環境におけるＴ細胞の活性化および増幅）
フローサイトメトリーを使用して骨髄（ＢＭ）Ｔ細胞数を求める。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２
８ビーズを所定の比率（ビーズ：ＣＤ３細胞）で所定の濃度の組換え型ヒトサイトカイン
を含む培地に添加する。細胞をプレート、フラスコまたはバッグに播く。低酸素チャンバ
ーまたは細胞培養バッグのいずれかに９５％窒素および５％ＣＯ２ガス混合物を３分間フ
ラッシュすることによって低酸素条件を達成する。その後、容器をこのガス混合物で３０
秒間満たす。これにより容器中が２％またはそれ未満のＯ２ガスに達する。細胞を３７Ｃ
で３日間またはそれ超にわたり培養し、低酸素空気を放出し、正常酸素（２１％大気酸素
）レベルに替える。
フローサイトメトリーを使用して骨髄（ＢＭ）Ｔ細胞数を求める。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２
８ビーズを所定の比率（ビーズ：ＣＤ３細胞）で所定の濃度の組換え型ヒトサイトカイン
を含む培地に添加する。細胞をプレート、フラスコまたはバッグに播く。低酸素チャンバ
ーまたは細胞培養バッグのいずれかに９５％窒素および５％ＣＯ２ガス混合物を３分間フ
ラッシュすることによって低酸素条件を達成する。その後、容器をこのガス混合物で３０
秒間満たす。これにより容器中が２％またはそれ未満のＯ２ガスに達する。細胞を３７Ｃ
で３日間またはそれ超にわたり培養し、低酸素空気を放出し、正常酸素（２１％大気酸素
）レベルに替える。
【0047】
（実施例２．細胞型の表現型決定）
所望の決定のために蛍光色素コンジュゲート抗体で細胞を染色する。蛍光色素に直接コ
ンジュゲートしたＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ４、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８
、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＩＦＮｇ、ＩＬ１７
、生／死色素（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｄｙｅ）および／または目的の他の抗体を適切なア
イソタイプ対照とともに使用する。簡単にいえば、プレートまたはチューブ中の１×１０
６またはそれ未満の細胞をＦＡＣＳバッファー（１×ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／０．５％Ｅ
ＤＴＡ／０．５％ＮａＡｚｉｄｅ）または類似の洗浄バッファーにより遠心分離機におい
て回転させることによって洗浄する。洗浄バッファーを除去し、抗体およびアイソタイプ
対照を所定の濃度で添加する。細胞を７～３０分の間、室温または４℃で染色する。細胞
を２回洗浄バッファーで洗浄し、最小限の洗浄バッファーに再懸濁する。その後、細胞を
利用されている蛍光色素に対して適切に補償および準備されたフローサイトメーターに流
す。各サンプルに対して１０，０００またはそれ超の数の事象を収集する。ＦＡＣＳ解析
ソフトウェアを利用してデータを解析する。バックグラウンド除去のために蛍光色素標識
細胞をアイソタイプ対照と比較する。データを％陽性－％バックグラウンドとしてグラフ
化する。
所望の決定のために蛍光色素コンジュゲート抗体で細胞を染色する。蛍光色素に直接コ
ンジュゲートしたＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ４、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８
、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＩＦＮｇ、ＩＬ１７
、生／死色素（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｄｙｅ）および／または目的の他の抗体を適切なア
イソタイプ対照とともに使用する。簡単にいえば、プレートまたはチューブ中の１×１０
６またはそれ未満の細胞をＦＡＣＳバッファー（１×ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／０．５％Ｅ
ＤＴＡ／０．５％ＮａＡｚｉｄｅ）または類似の洗浄バッファーにより遠心分離機におい
て回転させることによって洗浄する。洗浄バッファーを除去し、抗体およびアイソタイプ
対照を所定の濃度で添加する。細胞を７～３０分の間、室温または４℃で染色する。細胞
を２回洗浄バッファーで洗浄し、最小限の洗浄バッファーに再懸濁する。その後、細胞を
利用されている蛍光色素に対して適切に補償および準備されたフローサイトメーターに流
す。各サンプルに対して１０，０００またはそれ超の数の事象を収集する。ＦＡＣＳ解析
ソフトウェアを利用してデータを解析する。バックグラウンド除去のために蛍光色素標識
細胞をアイソタイプ対照と比較する。データを％陽性－％バックグラウンドとしてグラフ
化する。
【0048】
（実施例３．増幅倍率（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の決定）
増幅の開始時に骨髄細胞を数える。フローサイトメトリーを利用してＣＤ３＋細胞のパ
ーセンテージを求める。ＣＤ３＋ＭＩＬの総数を、細胞の総数にＣＤ３のパーセンテージ
＝培養物中のＣＤ３＋ＭＩＬの総数を掛けることによって求める。培養の最終日に細胞を
回収し、計数する（手作業および自動セルカウンターの両方）。ＣＤ３＋のパーセンテー
ジを求める。培養の最終日のＣＤ３＋細胞の総数を、総細胞数にＣＤ＋のパーセンテージ
＝回収されたＣＤ３＋ＭＩＬの総数を掛けることによって求める。総増幅倍率＝培養の最
終日に回収されたＣＤ３＋ＭＩＬの総数÷培養の初日のＣＤ３＋ＭＩＬの総数。
増幅の開始時に骨髄細胞を数える。フローサイトメトリーを利用してＣＤ３＋細胞のパ
ーセンテージを求める。ＣＤ３＋ＭＩＬの総数を、細胞の総数にＣＤ３のパーセンテージ
＝培養物中のＣＤ３＋ＭＩＬの総数を掛けることによって求める。培養の最終日に細胞を
回収し、計数する（手作業および自動セルカウンターの両方）。ＣＤ３＋のパーセンテー
ジを求める。培養の最終日のＣＤ３＋細胞の総数を、総細胞数にＣＤ＋のパーセンテージ
＝回収されたＣＤ３＋ＭＩＬの総数を掛けることによって求める。総増幅倍率＝培養の最
終日に回収されたＣＤ３＋ＭＩＬの総数÷培養の初日のＣＤ３＋ＭＩＬの総数。
【0049】
（実施例４．腫瘍特異性）
製造業者のプロトコールに従ってＭＩＬをＣＦＳＥまたは類似の細胞膜組み込み色素（
ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ）で標識する。培地単独
、陰性対照（関連のないタンパク質もしくはライセート）により、または目的のタンパク
質もしくはライセートにより自家ＢＭをパルスする。その後、ＣＦＳＥ標識細胞をパルス
した自家ＢＭとともに２～７日間共培養する。組織培養プレートまたはフラスコから細胞
を回収した後、細胞外をＣＤ３によりおよび細胞内をＩＦＮｇにより染色する。ＣＦＳＥ
が低く（分裂した細胞）、ＩＦＮｇを産生しているＣＤ３＋細胞に対するゲーティングに
よって腫瘍特異性の解析を決定する。
製造業者のプロトコールに従ってＭＩＬをＣＦＳＥまたは類似の細胞膜組み込み色素（
ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ）で標識する。培地単独
、陰性対照（関連のないタンパク質もしくはライセート）により、または目的のタンパク
質もしくはライセートにより自家ＢＭをパルスする。その後、ＣＦＳＥ標識細胞をパルス
した自家ＢＭとともに２～７日間共培養する。組織培養プレートまたはフラスコから細胞
を回収した後、細胞外をＣＤ３によりおよび細胞内をＩＦＮｇにより染色する。ＣＦＳＥ
が低く（分裂した細胞）、ＩＦＮｇを産生しているＣＤ３＋細胞に対するゲーティングに
よって腫瘍特異性の解析を決定する。
【0050】
（実施例５．低酸素環境および正常酸素環境におけるＴ細胞の活性化および増幅）
ＭＩＬを２％Ｏ２（低酸素）において３日間増殖させ、続いて２１％Ｏ２（正常酸素）
に切り替えてＩＬ－２の存在下または非存在下においてさらに５日間、増殖させた。図９
に示されるとおり、低酸素に続いて正常酸素において増殖させると、正常酸素条件におい
てのみ増殖させたＭＩＬと比較して増幅がほぼ１０倍増加した。図４に示されるとおり、
腫瘍特異性も著しく向上した。１０日目に、低酸素条件において増殖させたＭＩＬの２５
．１％とは対照的に正常酸素条件の低ＣＦＳＥ細胞の４％が腫瘍特異的であった。まとめ
ると、これらのデータは、これらの増殖条件が活性化時に腫瘍特異的なものの絶対数を増
加させることができることを示唆している。
ＭＩＬを２％Ｏ２（低酸素）において３日間増殖させ、続いて２１％Ｏ２（正常酸素）
に切り替えてＩＬ－２の存在下または非存在下においてさらに５日間、増殖させた。図９
に示されるとおり、低酸素に続いて正常酸素において増殖させると、正常酸素条件におい
てのみ増殖させたＭＩＬと比較して増幅がほぼ１０倍増加した。図４に示されるとおり、
腫瘍特異性も著しく向上した。１０日目に、低酸素条件において増殖させたＭＩＬの２５
．１％とは対照的に正常酸素条件の低ＣＦＳＥ細胞の４％が腫瘍特異的であった。まとめ
ると、これらのデータは、これらの増殖条件が活性化時に腫瘍特異的なものの絶対数を増
加させることができることを示唆している。
【0051】
先行する段落の実験を小サンプルに対して行った。最初の臨床試験の患者からのＭＩＬ
産物もこの方法を使用して増幅させた。図３に示されるとおり、これらの条件におけるＭ
ＩＬの増幅は、劇的にＴ細胞数を増加させた。正常酸素条件における増殖は、７日を超え
るとほとんどＭＩＬを増幅できなかった。この実験では、低酸素条件の１１９倍とは対照
的に、７日目の増幅倍率は、正常酸素条件において３６．３倍であった。さらに、細胞は
、１２日目まで増幅し続け、死に始める前の１１日目に総計２２０倍の増幅に達した。
産物もこの方法を使用して増幅させた。図３に示されるとおり、これらの条件におけるＭ
ＩＬの増幅は、劇的にＴ細胞数を増加させた。正常酸素条件における増殖は、７日を超え
るとほとんどＭＩＬを増幅できなかった。この実験では、低酸素条件の１１９倍とは対照
的に、７日目の増幅倍率は、正常酸素条件において３６．３倍であった。さらに、細胞は
、１２日目まで増幅し続け、死に始める前の１１日目に総計２２０倍の増幅に達した。
【0052】
４－１ＢＢの発現が、多くのこれらの特性の重要なレギュレーターであることが示され
た。これは、Ｔ細胞増幅を制御し、アポトーシスを低減し、ＣＤ８細胞の細胞傷害活性を
増大し、生存を高めることができる。さらに、ＨＩＦ１αは、抗原に駆動されたＴ細胞の
生存を制御する。４－１ＢＢを発現するベクターを用いたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改
変Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける著しい増幅を示した。まとめると、活性化ＭＩＬ上
の４－１ＢＢ発現は、生存および腫瘍特異性を増加させる重要なレギュレーターである可
能性がある。本明細書中で開示される方法の際だった利点の１つは、４－１ＢＢ発現を向
上させるためにＭＩＬを改変する必要がないことである。この利点は、ＭＩＬまたはＰＢ
Ｌを正常酸素条件または低酸素条件のいずれかにおいて増殖させた図１０に示されている
。ＭＩＬにおける４－１ＢＢのベースライン発現を評価し、ＰＢＬと比較した。示される
とおり、４－１ＢＢ発現は、ＰＢＬよりもＭＩＬにおいて高かった（１８．２％対８．１
％）。興味深いことに、正常酸素におけるＴ細胞増幅は、両集団ともにその発現が低下し
た（ＭＩＬ １０．７％、ＰＢＬ ２．８％）一方で、低酸素における増幅は、４－１Ｂ
Ｂ発現をＭＩＬで著しく増加させ（４３．４％）、ＰＢＬでその発現を完全に阻害した（
０％）。これらのデータは、ＰＢＬとＭＩＬの間の顕著な差をさらにまた強調し、４－１
ＢＢのアップレギュレーションが単に低酸素増殖条件だけでなくさらなる要因に依存する
ことをさらに示す。さらに重要なことに、４－１ＢＢの予想外のアップレギュレーション
は、本発明の方法が、低酸素的に増殖させたＭＩＬを使用した患者の処置において顕著な
差をもたらすことを示す。同様の結果がＣＤ８細胞によっても観察された（図８）。
た。これは、Ｔ細胞増幅を制御し、アポトーシスを低減し、ＣＤ８細胞の細胞傷害活性を
増大し、生存を高めることができる。さらに、ＨＩＦ１αは、抗原に駆動されたＴ細胞の
生存を制御する。４－１ＢＢを発現するベクターを用いたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改
変Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける著しい増幅を示した。まとめると、活性化ＭＩＬ上
の４－１ＢＢ発現は、生存および腫瘍特異性を増加させる重要なレギュレーターである可
能性がある。本明細書中で開示される方法の際だった利点の１つは、４－１ＢＢ発現を向
上させるためにＭＩＬを改変する必要がないことである。この利点は、ＭＩＬまたはＰＢ
Ｌを正常酸素条件または低酸素条件のいずれかにおいて増殖させた図１０に示されている
。ＭＩＬにおける４－１ＢＢのベースライン発現を評価し、ＰＢＬと比較した。示される
とおり、４－１ＢＢ発現は、ＰＢＬよりもＭＩＬにおいて高かった（１８．２％対８．１
％）。興味深いことに、正常酸素におけるＴ細胞増幅は、両集団ともにその発現が低下し
た（ＭＩＬ １０．７％、ＰＢＬ ２．８％）一方で、低酸素における増幅は、４－１Ｂ
Ｂ発現をＭＩＬで著しく増加させ（４３．４％）、ＰＢＬでその発現を完全に阻害した（
０％）。これらのデータは、ＰＢＬとＭＩＬの間の顕著な差をさらにまた強調し、４－１
ＢＢのアップレギュレーションが単に低酸素増殖条件だけでなくさらなる要因に依存する
ことをさらに示す。さらに重要なことに、４－１ＢＢの予想外のアップレギュレーション
は、本発明の方法が、低酸素的に増殖させたＭＩＬを使用した患者の処置において顕著な
差をもたらすことを示す。同様の結果がＣＤ８細胞によっても観察された（図８）。
【0053】
図１１は、臨床処置のための投薬の結果を示す。Ｊ０７７０では、ＭＩＬを静置培養で
正常酸素条件において増殖させた。Ｊ０９９７では、ＭＩＬを波動（ＷＡＶＥ）中、正常
酸素条件において増殖させた。Ｊ１３４３では、ＭＩＬを低酸素条件において３日間、増
殖させ、続いて正常酸素条件において増殖させた。図６では、自家幹細胞移植後の３つの
実験に関するリンパ球絶対数をグラフ化している。Ｊ１３４３は無作為試験であり、その
患者は移植後に注入された低酸素ＭＩＬを受容したか、またはＭＩＬを注入されなかった
かのいずれかであった。
正常酸素条件において増殖させた。Ｊ０９９７では、ＭＩＬを波動（ＷＡＶＥ）中、正常
酸素条件において増殖させた。Ｊ１３４３では、ＭＩＬを低酸素条件において３日間、増
殖させ、続いて正常酸素条件において増殖させた。図６では、自家幹細胞移植後の３つの
実験に関するリンパ球絶対数をグラフ化している。Ｊ１３４３は無作為試験であり、その
患者は移植後に注入された低酸素ＭＩＬを受容したか、またはＭＩＬを注入されなかった
かのいずれかであった。
【0054】
図１１に示されるとおり、本方法の増殖条件は、全体のＴ細胞増幅を平均７．９Ｅ９か
ら１．８Ｅ１０に増加させた。さらに、これは図６に示されるとおり初めてｉｎ ｖｉｖ
ｏにおけるＴ細胞増幅を示し、これは患者の処置における方法の有効性に直接関係する。
グラフに第１のセットの患者に関する６０日目までの総リンパ球数を示す。
ら１．８Ｅ１０に増加させた。さらに、これは図６に示されるとおり初めてｉｎ ｖｉｖ
ｏにおけるＴ細胞増幅を示し、これは患者の処置における方法の有効性に直接関係する。
グラフに第１のセットの患者に関する６０日目までの総リンパ球数を示す。
【0055】
均等物
当業者は、慣用的な実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施
形態の多くの均等物を認識する、または確認することができるだろう。そのような均等物
は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
当業者は、慣用的な実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施
形態の多くの均等物を認識する、または確認することができるだろう。そのような均等物
は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
