特許 7197363 ヌクレアーゼを使用するヒト神経幹細胞のゲノム編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-19

(45)【発行日】2022-12-27

(54)【発明の名称】ヌクレアーゼを使用するヒト神経幹細胞のゲノム編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20221220BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20221220BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20221220BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20221220BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20221220BHJP

   C07K 14/565 20060101ALN20221220BHJP

   C07K 14/485 20060101ALN20221220BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/12

C12N5/10

C12N15/09 110

C12N9/16 Z

A61K35/30

A61P25/00

A61P25/16

A61P25/14

A61P25/28

A61P27/02

A61P9/10

A61P9/00

A61P29/00

C12N15/11 Z

C07K14/47

C07K14/565

C07K14/485

【請求項の数】 63

(21)【出願番号】P 2018554450

(86)(22)【出願日】2017-04-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-04-25

(86)【国際出願番号】 US2017027504

(87)【国際公開番号】W WO2017180926

(87)【国際公開日】2017-10-19

【審査請求日】2020-04-02

(31)【優先権主張番号】62/322,652

(32)【優先日】2016-04-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518361675

【氏名又は名称】ボコ シリコン バレー， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ポーテウス， マシュー エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】キルドベック， エリック ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】デバー， ダニエル ピー．

(72)【発明者】

【氏名】クラーク， ジョセフ ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ツカモト， アン

(72)【発明者】

【氏名】ウチダ， ノブコ

【審査官】新留 豊

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０７３８６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１８８０５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２８０２２２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０５７９７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５０４０２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２３８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】PLOS ONE，2015年，Vol.10, No.1，e0116032

【文献】Development，2017年，Vol.144，p.635-648

【文献】NATURE METHODS，2011年，Vol.8, No.10，p.861-869，DOI:10.1038/NMETH.1674

【文献】SCIENCE，2013年，Vol.339，p.823-826

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／１６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのポリヌクレオチドであって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するポリヌクレオチドを含むドナー鋳型と、
（ｂ）前記セーフハーバー遺伝子座に二本鎖切断を作製して前記セーフハーバー遺伝子座中への前記導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと
を単離されたヒト神経幹細胞中に導入することであって、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成すること
を含み、
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２ＲγまたはＨＢＢ遺伝子を含む、
方法。

【請求項2】

前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記タンパク質が、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記タンパク質が、前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記神経保護または神経再生タンパク質が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記神経保護または神経再生タンパク質が分泌タンパク質である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記ドナー鋳型が異種プロモーターを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ドナー鋳型の前記異種プロモーターが、誘導性プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを前記ヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のポリヌクレオチドおよび前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のポリヌクレオチドを含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはこれらの組合せにおける修飾を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記リボース基における前記修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記リボース基の２’位における前記修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記リン酸基における前記修飾がホスホロチオエート修飾を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

前記第１のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドである、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約１０％から約３０％が修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約１％から約１０％が修飾ヌクレオチドである、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ遺伝子を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

導入することがエレクトロポレーションを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記選択マーカーが、中枢神経系の細胞では発現されないマーカーを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記選択マーカーが細胞表面タンパク質である、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、これらのバリアント、これらの断片、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞による前記選択マーカーの発現に基づいて前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を精製することをさらに含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記精製された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。

【請求項35】

請求項３４に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項36】

それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療するための、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記医薬組成物が、白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される神経変性疾患の治療用である、請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記医薬組成物が、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、白質の消失を伴う白質脳症、副腎白質ジストロフィー、レフサム病、およびゼノベファントーシスからなる群から選択される白質ジストロフィーの治療用である、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項39】

前記医薬組成物が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中からなる群から選択される神経学的損傷の治療用である、請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して自己である、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項41】

前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して同種である、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項42】

前記医薬組成物が、注射または外科的移植によって投与されることを特徴とする、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項43】

（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのポリヌクレオチドであって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するポリヌクレオチドを含むドナー鋳型と、
（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞と
を含み、
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２ＲγまたはＨＢＢ遺伝子を含む、
キット。

【請求項44】

前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、請求項４３または４４に記載のキット。

【請求項46】

前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、請求項４３または４４に記載のキット。

【請求項47】

前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項48】

前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする遺伝子を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項49】

前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項50】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４３から４９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項51】

前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のポリヌクレオチドおよび前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のポリヌクレオチドを含む、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、請求項５０に記載のキット。

【請求項52】

前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、請求項５１に記載のキット。

【請求項53】

前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、請求項５２に記載のキット。

【請求項54】

前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５１から５３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項55】

前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５４に記載のキット。

【請求項56】

前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ遺伝子を含む、請求項４３から５５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項57】

前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、請求項４３から５６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項58】

遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するための説明書をさらに含む、請求項４３から５７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項59】

導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを含む遺伝子改変されたヒト神経幹細胞であって、前記導入遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座内に位置し、前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２ＲγまたはＨＢＢ遺伝子を含む、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。

【請求項60】

潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、請求項３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。

【請求項61】

前記潜在的な治療用分子が、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である、請求項６０に記載の使用。

【請求項62】

研究における、請求項３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。

【請求項63】

前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ遺伝子を含む、請求項３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３２２，６５２号に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書中に本明細書によって援用される。

【0002】

技術分野
本発明は、遺伝子改変された神経幹細胞を生成するための方法に関する。

【0003】

連邦政府によって支援された研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号Ｒ０１ ＡＩ１２０７６６およびＲ０１ ＡＩ０９７３２０の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
操作されたヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、本質的にあらゆる目的のゲノム配列を改変するための画期的な技術である（Porteusら、Nature Biotechnology ２３巻、９６７～９７３頁（２００５年））。この技術は、操作されたヌクレアーゼを利用して部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、それに続いて内因性の細胞修復機構によってＤＳＢが回復される。結果的に、突然変異を起こさせる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じて特定部位を突然変異させるか（これは切断の部位に挿入または欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）を作製する）、または、外因的に導入されたドナー鋳型を使用する相同組換え（ＨＲ）を通じてゲノム配列を精密に変更するかのいずれかを行い得る（Hendelら、Trends in Biotechnology ３３巻、１３２～１４０頁（２０１５年））。

【0005】

このプラットフォームへの最近の大きな追加は、ＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）および短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）からなる、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つパリンドロームリピート（clustered regularly interspaced palindromic repeat；ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムである（Jinekら、Science ３３７巻、８１６～８２１頁（２０１２年）；Maliら、Science ３３９巻、８２３～８２６頁（２０１３年）；Congら、Science ３３９巻、８１９～８２３頁（２０１３年）；Hsuら、Cell １５７巻、１２６２～１２７８頁（２０１４年））。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ＣｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される２つのＲＮＡから構成され、これらは、通常、キメラの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に融合される。ゲノム編集用のｓｇＲＮＡは、１００ヌクレオチド（ｎｔ）からなることがあり、そしてその５’末端の２０ｎｔが、ワトソン・クリック型塩基対形成により標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをガイドして標的ゲノムＤＮＡを開裂させ得る。

【0006】

残念なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムやその他のヌクレアーゼ媒介性の技術を使用するゲノム編集は、特にヒト神経幹細胞などの初代細胞において依然として非効率的である。そのため、ヒト神経幹細胞などの初代細胞を遺伝子改変するために使用できるゲノム編集に基づく組成物および方法が当該技術分野において依然として必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、かつ追加の利点も提供する。
神経幹細胞は、例えば、米国出願公開第２００１／００４４１２２号、同第２００３／０１０９０３９号、同第２００４／０１３７５３５号、米国特許第７０３７７１９号、およびUchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁において議論されている。
本明細書中で参照する全ての刊行物、特許、特許出願、および特許出願公開の開示は、本明細書中で参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】米国出願公開第２００１／００４４１２２号明細書

【文献】米国出願公開第２００３／０１０９０３９号明細書

【文献】米国出願公開第２００４／０１３７５３５号明細書

【文献】米国特許第７０３７７１９号明細書

【非特許文献】

【0008】

【文献】Porteusら、Nature Biotechnology ２３巻、９６７～９７３頁（２００５年）

【文献】Hendelら、Trends in Biotechnology ３３巻、１３２～１４０頁（２０１５年）

【文献】Jinekら、Science ３３７巻、８１６～８２１頁（２０１２年）

【文献】Maliら、Science ３３９巻、８２３～８２６頁（２０１３年）

【文献】Congら、Science ３３９巻、８１９～８２３頁（２０１３年）

【文献】Hsuら、Cell １５７巻、１２６２～１２７８頁（２０１４年）

【文献】Uchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の簡単な要旨
本発明は、遺伝子改変された（すなわち、ゲノム編集された）ヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、異種プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、

【0010】

（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法を提供する。

【0011】

本発明は、本発明の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞も提供する。本発明はまた、（ｉ）セーフハーバー遺伝子内に位置する、導入遺伝子（例えば、異種プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセットを含む、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞も提供する。本発明の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。

【0012】

本発明は、それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療するための方法であって、神経変性疾患または神経学的損傷の１つまたは複数の症状を予防または軽減するために、有効量の本発明の医薬組成物をヒト対象に投与することを含む方法も提供する。

【0013】

（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、異種プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞とを含むキットも本発明によって提供される。

【0014】

本発明は、潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、本発明の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞または本発明の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用も提供する。これは、小分子または生物学的分子をスクリーニングして、ヒト神経幹細胞またはそれらの分化した子孫に作用する潜在的な治療用分子を同定することを伴い得る。本発明の一実施形態では、潜在的な治療用分子は、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である。

【0015】

本発明は、研究における、本発明の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞または本発明の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用も提供する。研究用途としては、神経幹細胞の基礎生物学の基本的な生物学的研究および潜在的な療法を対象とする応用研究が挙げられる。

【0016】

本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかとなる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）前記セーフハーバー遺伝子座に二本鎖切断を作製して前記セーフハーバー遺伝子座中への前記導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と
を単離されたヒト神経幹細胞中に導入することであって、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成すること
を含む方法。
（項目２）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記タンパク質が、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記タンパク質が、前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記神経保護または神経再生タンパク質が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記神経保護または神経再生タンパク質が分泌タンパク質である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ドナー鋳型が異種プロモーターを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ドナー鋳型の前記異種プロモーターが、誘導性プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を前記ヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはこれらの組合せにおける修飾を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記リボース基における前記修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記リボース基の２’位における前記修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記リン酸基における前記修飾がホスホロチオエート修飾を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドである、項目１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１０％から約３０％が修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１％から約１０％が修飾ヌクレオチドである、項目１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
導入することがエレクトロポレーションを含む、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記選択マーカーが、中枢神経系の細胞では発現されないマーカーを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記選択マーカーが細胞表面タンパク質である、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、これらのバリアント、これらの断片、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞による前記選択マーカーの発現に基づいて前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を精製することをさらに含む、項目２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記精製された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
（項目３５）
項目３４に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目３６）
それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法であって、
前記ヒト対象に有効量の項目３５に記載の医薬組成物を投与すること
を含む方法。
（項目３７）
白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される神経変性疾患の治療用である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、白質の消失を伴う白質脳症、副腎白質ジストロフィー、レフサム病、およびゼノベファントーシスからなる群から選択される白質ジストロフィーの治療用である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
脊髄損傷、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中からなる群から選択される神経学的損傷の治療用である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して自己である、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して同種である、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
投与することが、注射または外科的移植によって投与することを含む、項目３６から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞と
を含むキット。
（項目４４）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、項目４３または４４に記載のキット。
（項目４６）
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、項目４３または４４に記載のキット。
（項目４７）
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、項目４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
（項目４８）
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする遺伝子を含む、項目４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
（項目４９）
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、項目４３から４８のいずれか一項に記載のキット。
（項目５０）
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目４３から４９のいずれか一項に記載のキット。
（項目５１）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
（項目５５）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、項目４３から５５のいずれか一項に記載のキット。
（項目５７）
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、項目４３から５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するための説明書をさらに含む、項目４３から５７のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを含む遺伝子改変されたヒト神経幹細胞であって、前記導入遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座内に位置する、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
（項目６０）
潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、項目３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。
（項目６１）
前記潜在的な治療用分子が、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である、項目６０に記載の使用。
（項目６２）
研究における、項目３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの操作されたヌクレアーゼを使用する相同組換えによってＧＦＰ導入遺伝子をＩＬ２Ｒγ遺伝子座に挿入したことを示す。図１ＡはＲＦＬＰのデータを提供する。図１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がＩＬ２Ｒγ遺伝子座においてＴＡＬＥＮより高い頻度の遺伝子編集を刺激することを示す。

【0018】

【図2】図２Ａ～２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮなどの操作されたヌクレアーゼを使用する神経幹細胞（ＮＳＣ）中へのＧＦＰ導入遺伝子のターゲティングされた組込みを示す。図２Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＧＦＰドナー鋳型の図解を提供する。図２Ｂは、ヌクレオフェクション後の長期培養におけるＧＦＰ^＋細胞の安定発現を示す。図２Ｃは、本明細書中に記載するゲノム編集を受けたＮＳＣの約２～４％がＧＦＰ陽性かつＣＤ１３３陽性であったことを示す。

【0019】

【図3】図３は、クローンに由来するＧＦＰ陽性の遺伝子改変ＮＳＣ（ＧＭ－ＮＳＣ）を示す。

【0020】

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、選別および増殖させたＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣに由来するオリゴデンドロサイトを示す。図４Ａは、ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣを示す。図４Ｂは、ＧＦＰおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現するＧＭ－ＮＳＣに由来するオリゴデンドロサイトを示す。ＧＭ－ＮＳＣを若年ｓｈｉ／ｓｈｉ－ｉｄ突然変異マウス脳の小脳に直接移植した。脳切片を移植の８週間後に処理した。より高倍率により、ヒト細胞の子孫がミエリン鞘（myelin sheat）を伴う成熟したミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化することが明らかとなり、分化能力がゲノム編集後に維持されていることを説明する。

【0021】

【図5】図５は、プラスミドに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングされた化学修飾したｓｇＲＮＡを有するＲＮＡに基づくシステムを使用して生成されたＩＮＤＥＬのパーセンテージを説明する。

【0022】

【図6】図６Ａ～６Ｃは、化学修飾したｓｇＲＮＡを有するＲＮＡに基づくシステムを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームの送達が、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングされたプラスミドに基づくシステムよりも多くのＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣを生じさせたことを示す。図６Ａは、プラスミドに基づくシステムを使用して生成されたＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図６Ｂは、化学修飾したｓｇＲＮＡを有するＲＮＡに基づくシステムを使用して産生されたＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図６Ｃは、試験したシステムの比較を提供する。

【0023】

【図7】図７は、本明細書中に記載するゲノム編集方法の例示的な実施形態の模式図を提供する。

【0024】

【図8】図８は、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングされたＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰ導入遺伝子の、精製ＧＭ－ＮＳＣ中での長期培養（ヌクレオフェクションから約１６８日後）における安定発現を示す。ＧＭ－ＮＳＣは、示したようにＦＡＣＳによって富化される。

【0025】

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、セーフハーバー遺伝子ＩＬ２ＲγへのＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰ導入遺伝子のターゲティングされた組込みを説明する。図９Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰドナー鋳型の図解を提供する。図９Ｂは、ターゲティングされた組込みの部位のＰＣＲ分析を示す。ターゲティングされた組込みについての予想されるアンプリコンの大きさは２３５５塩基である。

【0026】

【図10】図１０Ａ～１０Ｆは、ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰターゲティング導入遺伝子を持つＧＭ－ＮＳＣを示す。ＣＲＩＳＰＲで改変したＮＳＣをＦＡＣＳ精製してＧＦＰ^＋細胞を選択した（図１０Ａ）。選別したＧＦＰ^＋細胞を増殖させたところ（図１０Ｂ）、ほとんどが神経幹細胞マーカーＳｏｘ２陽性であった（図１０Ｃ）。ＴＡＬＥＮで改変したＮＳＣをＦＡＣＳ精製してＧＦＰ^＋細胞を選択した（図１０Ｄ）。選別したＧＦＰ^＋細胞を増殖させたところ、依然としてＧＦＰ^＋であった（図１０Ｄ）。また、増殖したＧＦＰ^＋細胞のほとんどがＳｏｘ２陽性であった（図１０Ｆ）。

【0027】

【図11】図１１Ａ～１１Ｅは、ＣＤ８^＋ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣの単離および精製を説明する。図１１Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型の図解を提供する。図１１Ｂは、ヌクレオフェクション後６継代での選択前のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１１Ｃは、ＭＡＣＳ ＣＤ８選択後のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。ＣＤ８^＋ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでオリゴデンドロサイトに分化した。図１１Ｄは、ＧＭ－ＮＳＣ細胞由来オリゴデンドロサイトの画像を提供する。図１１Ｅは、神経細胞（ダブルコルチン）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）に分化の細胞のパーセンテージを提供する。

【0028】

【図12】図１２Ａ～１２Ｃは、ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣの単離および精製を説明する。図１２Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＧＦＰ－２Ａトランケート型ＣＤ１９ドナー鋳型の図解を提供する。図１２Ｂは、ヌクレオフェクションから４０日目のＣＤ１９選択後のＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１２Ｃは、ほとんどの細胞が選択前にＣＤ１９陰性、ＧＦＰ陰性であったことを示す。図１２Ｄは、ほとんどの細胞がＭＡＣＳ ＣＤ１９選択後にＣＤ１９^＋およびＧＦＰ^＋であったことを示す。

【0029】

【図13-1】図１３Ａ～１３Ｆは、ＣＤ８^＋ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣの単離および精製を示す。図１３Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型の図解を提供する。図１３Ｂは、選択前のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｃは、選択後のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｄは、ＭＡＣＳ ＣＤ８選択カラムを通過したＣＤ８陰性細胞およびＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｅは、ＣＤ８選択細胞の高いパーセンテージがＧＦＰ＋でもあることを示す。図１３Ｆは、ＣＤ８選択ＧＭ－ＮＳＣの９０％がＧＦＰ^＋であることを示す。

【図13-2】図１３Ａ～１３Ｆは、ＣＤ８^＋ＧＦＰ^＋ ＧＭ－ＮＳＣの単離および精製を示す。図１３Ａは、例示的なＩＬ２Ｒγ－ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型の図解を提供する。図１３Ｂは、選択前のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｃは、選択後のＣＤ８^＋細胞およびＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｄは、ＭＡＣＳ ＣＤ８選択カラムを通過したＣＤ８陰性細胞およびＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージを示す。図１３Ｅは、ＣＤ８選択細胞の高いパーセンテージがＧＦＰ＋でもあることを示す。図１３Ｆは、ＣＤ８選択ＧＭ－ＮＳＣの９０％がＧＦＰ^＋であることを示す。

【0030】

【図14】図１４Ａ～１４Ｃは、オリゴデンドロサイト突然変異シバラーマウスへの移植後のＧＭ－ＮＳＣの生着、遊走、およびミエリン産生オリゴデンドロサイトへの分化を示す。ＧＦＰをＣＤ８から分離する２シストロン性ＩＬ２ＲＧ ＨＲカセットを作製して、ＮＳＣにターゲティングした。図１４Ａは、ＣＤ８マイクロビーズを用いてＧＭ－ＮＳＣをＭＡＣＳ選択したことを示す。次いで、ＧＭ－ＮＳＣを８週齢の若年シバラーｉｄマウスに移植した。脳室下帯（subventricualr zone）（ＳＶＺ）にターゲティングして細胞を両側に移植した。図１４Ｂは、ヒト特異的ｍＡｂ ＳＣ１２１で染色したマウス脳の切片を示す。移植の１２週後のＳＣ１２１染色により、ＲＭＳにおけるＧＭ－ＮＳＣの嗅球および白質路への広範な遊走は、脳梁、脳弓の海馬采、および小脳中のそれらを含んでいたことが実証された。図１４Ｃは、抗ＧＦＰ抗体で染色したマウス脳の切片を示す。移植したＧＭ－ＮＳＣは、マウス中でＧＦＰ導入遺伝子を発現し続けた。ロバストなＧＦＰ導入遺伝子の発現はＳＣ１２１染色に類似する。矢状脳切片により、移植細胞はＳＶＺ中に存在することが示される。加えて、遊走するヒト細胞は、吻側移動経路（ＲＭＳ）、脳梁（corpus collusum）、および皮質において検出される。

【0031】

【図15】図１５Ａ～１５Ｆは、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングされたＵｂＣ－ＧａｌＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９導入遺伝子を持つＣＤ１９^＋ ＧＭ－ＮＳＣを示す。ＭＡＣＳ ＣＤ１９選択マイクロビーズを使用して、細胞表面マーカーＣＤ１９を発現するＧＭ－ＮＳＣを精製した。プラスミドに基づくｓｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して生成されたＧＭ－ＮＳＣのフローサイトメトリーを図１５Ａ～１５Ｃに示す（選択前－図１５Ａ；選択後－図１５Ｂ；増殖－図１５Ｃ）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを有するＭＳＰ ｓｇＲＮＡを使用して生成されたＧＭ－ＮＳＣのフローサイトメトリーを図１５Ｄ～１５Ｆに示す（選択前－図１５Ｄ；選択後－図１５Ｅ；増殖－図１５Ｆ）。

【0032】

【図16】図１６は、ＮＳＣ中のＩＬ２ＲＧ遺伝子座にターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の相同組換え（ＨＲ）を示す。Ｃａｓ９（はさみ）を使用して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、かつ相同ドナー鋳型（挿入される導入遺伝子の周りにフランキングする８００ｂｐのアームを有する）を供給することによって、相同組換え（ＨＲ）のためにＩＬ２ＲＧ遺伝子座にターゲティングした。ＨＲにしたがって、ヒトＮＳＣにおけるＨＲの効率を評価するために下流のＧＦＰを駆動するＵｂＣプロモーターと共にＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡを内因性の開始コドンにノックインする。ＩＬ２ＲＧのエクソンを黒の四角で示す。

【0033】

【図17A】図１７Ａ～１７Ｂは、ＮＳＣ中のＨＢＢ遺伝子座（図１７Ａ）およびＣＣＲ５遺伝子座（図１７Ｂ）にターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の相同組換え（ＨＲ）を示す。図１７Ａは、Ｃａｓ９（はさみ）によりエクソン１中にＤＳＢを作製し、かつＵｂＣ－ＧＦＰ相同ドナー鋳型を供給することによって、ＨＢＢ遺伝子座にターゲティングしたことを示す。Ｉｎ（黒）－Ｏｕｔ（赤）プライマーセットを使用するＰＣＲ（８８１ｂｐ）によって、組込みを有する対立遺伝子を同定した。図１７Ｂは、上記の通りにエクソン３においてＣＣＲ５遺伝子座にターゲティングしたことを示す。Ｉｎ（黒）－Ｏｕｔ（赤）を使用してＰＣＲによって組込み（１２００ｂｐ）を受けた対立遺伝子を同定した。全てのＩｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲ用のローディングコントロールは、野生型ＣＣＲ５対立遺伝子であった。

【図17B】図１７Ａ～１７Ｂは、ＮＳＣ中のＨＢＢ遺伝子座（図１７Ａ）およびＣＣＲ５遺伝子座（図１７Ｂ）にターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の相同組換え（ＨＲ）を示す。図１７Ａは、Ｃａｓ９（はさみ）によりエクソン１中にＤＳＢを作製し、かつＵｂＣ－ＧＦＰ相同ドナー鋳型を供給することによって、ＨＢＢ遺伝子座にターゲティングしたことを示す。Ｉｎ（黒）－Ｏｕｔ（赤）プライマーセットを使用するＰＣＲ（８８１ｂｐ）によって、組込みを有する対立遺伝子を同定した。図１７Ｂは、上記の通りにエクソン３においてＣＣＲ５遺伝子座にターゲティングしたことを示す。Ｉｎ（黒）－Ｏｕｔ（赤）を使用してＰＣＲによって組込み（１２００ｂｐ）を受けた対立遺伝子を同定した。全てのＩｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲ用のローディングコントロールは、野生型ＣＣＲ５対立遺伝子であった。

【0034】

【図18】図１８は、ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９および化学修飾したｓｇＲＮＡが、試験した３つ全ての遺伝子座においてプラスミド送達よりも多くのＩＮＤＥＬを誘発したことを示す。Ｃａｓ９およびＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、またはＣＣＲ５に特異的なｓｇＲＮＡをコードする１ｕｇのプラスミド（ｐｘ３３０）をＮＳＣにエレクトロポレートした。「全ＲＮＡ」の実験のために、Ｃａｓ９をｍＲＮＡ（５ｕｇ）として送達し、かつ２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を含む末端化学修飾を有する遺伝子座特異的ｓｇＲＮＡ（１０ｕｇ）を送達した。培養の７日後にｇＤＮＡを回収し、ＰＣＲを実行して目的の領域を増幅し、かつＴｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）ソフトウェアを使用してＩＮＤＥＬを計算した。（Ｎ＝２～１４）、^＊＊ｐ＜０．０１、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。

【0035】

【図19】図１９は、３つ全ての遺伝子座が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９成分のプラスミド送達または全ＲＮＡ送達を使用するＮＳＣ中のＨＲに適していたことを示す。２ｕｇのＨＲドナーまたは２ｕｇのＨＲおよび遺伝子座特異的ＣＲＩＳＰＲ成分のいずれかを、上記の通りにＮＳＣにヌクレオフェクトした。遺伝子座特異的ＨＲドナープラスミドは、ＨＲ効率を評価するために少なくとも４００ｂｐの相同フランキングＵｂＣ－ＧＦＰを有する。エピソームＨＲドナーが増殖の間の希釈によって失われるまで細胞を少なくとも３０日間成長させて、ＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５遺伝子座中に組み込まれたカセットの安定発現を確認した。代表的なＦＡＣＳプロットを示しており、これは部位特異的ヌクレアーゼを用いるＨＲドナーの安定な組込みを強調する。

【0036】

【図20】図２０は、ＣＲＩＳＰＲのプラスミド送達によるＮＳＣのＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５遺伝子座へのターゲティングが、培養の少なくとも３０日後に平均でそれぞれ２．８％、４．１％、および２．４％のＧＦＰ^＋ ＮＳＣを生じたことを示す。上記の通りに実行したＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５にターゲティングする全ての実験から得られたＨＲ頻度。（Ｎ＝３～７）、^＊ｐ＜０．０５、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。

【0037】

【図21】図２１は、ｍｏｃｋまたはドナーのみの試料ではＰＣＲ増幅が検出されなかったが、ＣＲＩＳＰＲおよび相同ドナーを共にＮＳＣにエレクトロポレートした時にオンターゲットの組込みが明らかであったことを示し、意図した遺伝子座でのＨＲが確認される。培養の３０日目に実験群からｇＤＮＡを回収し、ＤＮＡレベルでＨＲドナーの部位特異的組込みを評価した。Ｉｎ／Ｏｕｔ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により、部位特異的ヌクレアーゼの存在下でのＨＲドナーのオンターゲットの組込みが確認される。

【0038】

【図22】図２２Ａ～２２Ｂは、ＣＤ８αを用いる磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）選択によるＧＭ－ＮＳＣの濃縮を示す。Ｔ２ＡペプチドモチーフによりＣＤ８αからＧＦＰを分離する２シストロン性ＩＬ２ＲＧ ＨＲカセットを作製して、ＩＬ２ＲＧがターゲティングされるＮＳＣのロバストな磁気ビーズ濃縮を可能にした。２ｕｇのＨＲドナーならびにＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする１ｕｇのプラスミドをＮＳＣにヌクレオフェクトした。細胞を３０日間成長させて、エピソームＨＲドナーをＮＳＣの増殖の間に希釈して消失させた。ターゲティングから６継代目にＣＤ８マイクロビーズ技術を使用して細胞を選択した。代表的なＦＡＣＳプロット（図２２Ａ）により、エレクトロポレーションから３０日目の濃縮前（左）、および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）ＣＤ８マイクロビーズ技術を使用する濃縮の３０日後（右）の２シストロン性ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＣＤ８カセットの安定な組込みを有するＮＳＣ集団を示す。全ての細胞継代においてＧＦＰ発現を分析しながら、エレクトロポレーションから９継代にわたってＧＭ－ＮＳＣを培養した（図２２Ｂ）。

【0039】

【図23】図２３Ａ～２３Ｂは、トランケート型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）を用いる磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）選択によるＧＭ－ＮＳＣの濃縮を示す。Ｔ２Ａペプチドモチーフによりトランケート型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）からＧＦＰを分離する２シストロン性ＩＬ２ＲＧ ＨＲカセットを作製して、ＩＬ２ＲＧがターゲティングされるＮＳＣのロバストな磁気ビーズ濃縮を可能にした。２ｕｇのＨＲドナーならびにＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする１ｕｇのプラスミドをＮＳＣにヌクレオフェクトした。細胞を３０日間成長させて、エピソームＨＲドナーをＮＳＣの増殖の間に希釈して消失させた。代表的なＦＡＣＳプロット（図２３Ａ）により、エレクトロポレーションから３０日目の濃縮前の２シストロン性ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９カセットの安定な組込みを有するＮＳＣ集団（左）、およびＭＡＣＳ ＣＤ１９マイクロビーズ技術を使用するＧＭ－ＮＳＣの濃縮された集団（右）を示す。ＧＦＰ発現を分析しながら、９継代にわたってＧＭ－ＮＳＣを培養した（図２３Ｂ）。

【0040】

【図24】図２４は、ＭＡＣＳ選択の前（ターゲティング）および後（濃縮）の、２シストロン性ドナーカセットを使用してＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングされたＧＭ－ＮＳＣの頻度を示す。Ｎ＝３。

【図25】図２５Ａ～２５Ｃは、ＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣの特徴を維持したことを示す。２シストロン性（bicstronic）ＧＦＰ－Ｔ２ａ－ｔＣＤ１９カセットを有する増殖／ＭＡＣＳ濃縮したＧＭ－ＮＳＣを細胞表面マーカーＣＤ１３３（ＰＥ）およびＣＤ１９（ＡＰＣ）について染色し、ＣＤ１９対ＧＦＰ（図２５Ａ）、ＣＤ１９対ＣＤ１３３（図２５Ｂ）をＦＡＣＳにより分析したか、あるいは、細胞をＣＤ１９（ＡＰＣ）について染色し、透過処理し、固定し、次いでＳＯＸ２（ＰＥ）について再び染色を行った（図２５Ｃ）。

【0041】

【図26】図２６Ａ～２６Ｃは、ＧＭ－ＮＳＣが部位に適切な様式でｉｎ ｖｉｖｏで、遊走、ＮＳＣマーカー、および３系統分化能力を維持することを示す。ＮＳＣに２シストロン性ＩＬ２Ｒγ ＨＲカセット（ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＣＤ８）をターゲティングした後、ＣＤ８マイクロビーズを用いてＭＡＣＳ選択し、新生ｓｈｉ／ｓｈｉ－ｉｄまたはｓｈｉ／＋ヘテロ接合ｉｄマウス脳のＳＶＺに両側にターゲティングして移植した。抗ＧＦＰ（緑）および抗Ｓｏｘ２（赤）ヘキスト３３３４５対比染色（青）で染色した海馬歯状回の共焦点画像（図２６Ａ～２６Ｃ）により、ＧＭ－ＮＳＣは遊走して、ＮＳＣマーカーＳｏｘ２（矢印）（図２６Ａ）、線条体の白質路の束（white tract bundle）において抗ＧＦＰ（緑）、抗ヒトＧＦＡＰ、ＳＣ１２３（赤）、およびＤＡＰＩ対比染色（青）（図２６Ｂ）、嗅球において抗ＧＦＰ（緑）、抗ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ＳＣ１２３（赤）、およびＤＡＰＩ対比染色（青）（図２６Ｃ）を維持することが明らかとなる。

【0042】

【図27】図２７Ａ～２７Ｃは、ＧＭ－ＮＳＣのオリゴデンドロサイト分化能力を示す。ＧＭ－ＮＳＣを若年ｓｈｉ／ｓｈｉ－ｉｄ突然変異マウス脳の小脳に直接的に移植した。脳切片を移植の８週間後に処理した。移植の８週間後のヒト特異的ＳＣ１２１ ｍＡｂによる免疫染色により、小脳の白質路内でのＧＭ－ＮＳＣの広範な遊走が実証された（図２７Ａ）。抗ＧＦＰによる同胞切片の免疫ペルオキシダーゼ染色により、ＳＣ１２１染色と同様の導入遺伝子の発現分布が明らかとなる（図２７Ｂ）。抗ＧＦＰ（緑）および抗ＭＢＰ（赤）による小脳の白質路の共焦点画像により、連続的なＧＦＰ発現およびミエリン産生が実証される（図２７Ｃ）。注射部位は示した通りである。

【0043】

【図28】図２８は、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座にＧＡＬＣ（ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９）をノックインするためのＨＲドナー、およびロバストなＭＡＣＳに基づく濃縮を可能とするためのｔＣＤ１９選択カセットの使用を示す。Ｃａｓ９（はさみ）を使用して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、かつ相同ドナー鋳型（挿入される導入遺伝子の周りにフランキングする８００ｂｐのアームを有する）を供給することによって、相同組換え（ＨＲ）のためにＩＬ２Ｒγ遺伝子座にターゲティングした。ＧａｌＣ酵素の過剰発現用およびＣＤ１９ ＭＡＣＳ選択を使用するターゲティングする細胞の濃縮用のＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９を有するＵｂＣ駆動カセットが後続するＩＬ２Ｒγ ｃＤＮＡを、ＨＲにしたがって内因性の開始コドンにノックインする。

【0044】

【図29】図２９Ａ～２９Ｂは、安定に組み込まれたＧＡＬＣ構築物を示す。以前に記載した通り、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＭＳＰ ＩＬ２Ｒγ ｓｇＲＮＡ、およびＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９ ＨＲドナー構築物をＮＳＣにヌクレオフェクトした。代表的なＦＡＣＳプロットにより、ｔＣＤ１９^＋細胞の濃縮の前（図２９Ａ）および後（図２９Ｂ）のヌクレオフェクションから３０日目のｔＣＤ１９発現により測定される、安定に組み込まれたＧＡＬＣ構築物が強調される。

【0045】

【図30】図３０は、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座へのＧＡＬＣカセットのオンターゲットの組込みを示す。エレクトロポレーションから３０日目に実験群からｇＤＮＡを回収し、ＤＮＡレベルでＧＡＬＣドナーの組込みを評価した。Ｉｎ／Ｏｕｔ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により、部位特異的ヌクレアーゼの存在下でのＨＲドナーのオンターゲットの組込みが示される。

【0046】

【図31】図３１は、ＧＡＬＣ ＮＳＣが機能的な酵素を過剰発現していたことを示す。ＧａｌＣ酵素アッセイを以下の実験群からの細胞タンパク質溶解物に対して行った：未編集ＮＳＣ、クラッベ病患者の線維芽細胞、ＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣ（２つの異なる実験）。ＧａｌＣ酵素活性をｐｍｏｌ／分／ｍｇ（未編集ＮＳＣに対して正規化）として提示している。Ｎ＝３、２つの独立した生物学的実験、^＊ｐ＜０．０５、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。

【0047】

【図32】図３２Ａ～３２Ｂは、ＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣの生物学的特徴を保持したことを示す。ヒト特異的ｍＡｂ ＳＣ１２１（茶）による免疫ペルオキシダーゼ染色により、小脳の白質中でのヒト細胞の生着が検出される（図３２Ａ）。抗ＭＢＰ（茶）による同胞切片の免疫ペルオキシダーゼ染色により、移植ＧＭ－ＮＳＣの同様の分布が明らかとなる（図３２Ｂ）。

【0048】

【図33】図３３Ａ～３３Ｄは、ＣＲＩＳＰＲシステムとＴａｌｅｎシステムとの比較を示す。ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子座を認識するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムまたはＴＡＬＥＮペアのいずれかを５００，０００個のＮＳＣにエレクトロポレート（プラスミド送達）した。ターゲティングの７日後にｇＤＮＡを回収し、切断部位に重複するプライマーを用いるＰＣＲによりＩＬ２ＲＧ対立遺伝子を増幅し、ＴＩＤＥを実行してＩＮＤＥＬ頻度を分析した（図３３Ａ）。（Ｎ＝４～７）、^＊ｐ＜０．０５、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡまたはｍＲＮＡとして送達されるＴＡＬＥＮペアを上記の通りにＮＳＣにエレクトロポレートした後、ＴＩＤＥソフトウェアによってＩＮＤＥＬについてＩＬ２ＲＧ対立遺伝子を分析した（図３３Ｂ）。（Ｎ＝２～５）、^＊ｐ＜０．０５、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。ＩＬ２ＲＧ相同アームを有するＵｂＣ－ＧＦＰドナー鋳型と共にＩＬ２ＲＧ操作されたヌクレアーゼをＮＳＣにエレクトロポレートした。ターゲティングの３０日後、ＦＡＣＳ ＧＦＰ分析のために細胞を回収した（図３３Ｃ）。（Ｎ＝４～６）。相同組換えにしたがってＡｆＩＩＩ制限部位を導入する目的のＩＬ２ＲＧ相同ドナー鋳型と共にＩＬ２ＲＧ操作されたヌクレアーゼをＮＳＣにエレクトロポレートした。ターゲティングの７日後にｇＤＮＡを回収した後、ＩＬ２ＲＧ対立遺伝子を増幅して１．６ｋｂの産物を産生した。増幅した対立遺伝子をＡｆＩＩＩにより消化し、ＰＡＧＥゲルを実行した。ＨＲ対立遺伝子の数を以下の通りに計算した：（（消化された対立遺伝子／消化された対立遺伝子）＋消化されなかった対立遺伝子）。（図３３Ｄ）（Ｎ＝４～６）、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定。

【発明を実施するための形態】

【0049】

発明の詳細な説明
Ｉ．導入
本発明は、ゲノム編集技術がヒト神経幹細胞の治療的潜在能力を増進するという発見に部分的に基づく。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、一時の介在で生涯にわたる影響力を有する神経学的障害に対する満たされていない医学上の必要性のための治療的潜在能力を有する。例えば、ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）は、高度に精製された胎児脳由来ヒト中枢神経系幹細胞集団であって、複数の作用機序を伴う生物学的なＮＳＣの活動性を有し、大域的な遊走ならびに成熟ニューロン、アストロサイト、およびミエリン産生オリゴデンドロサイトへの部位に適切な分化を通じて神経保護、ミエリン形成、および網膜の保護を提供する。ＮＳＣは４つの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で試験されており、安全性、ドナー細胞の生存、および／または予備的有効性について見込みのある結果が出ている。ゲノム編集技術の最近の進歩、すなわちＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームは、細胞療法用の遺伝子改変（ＧＭ）細胞を製造するための機会を加速させ、それが究極的には、例えば血液脳関門を乗り越える神経保護タンパク質の小生産工場として働くことによって、ＮＳＣの治療的潜在能力を広げる。ＮＳＣおよびＮＳＣを単離する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００１／００４４１２２号、同第２００３／０１０９０３９号、および同第２００４／０１３７５３５ Ａ１号、ならびに米国特許第７，０３７，７１９号に記載されている。

【0050】

本明細書中に記載するように、本発明者らは、相同プラスミドドナー鋳型と共に、部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発することによって、ＮＳＣ中の例えば、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢなどの「セーフハーバー遺伝子座」にＧＦＰカセットの相同組換え（ＨＲ）のためにターゲティングした。ＧＭ－ＮＳＣはロバストな長期間のＧＦＰ発現を示し、そして重要なことに、ｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲによるゲノム解析により、オンターゲットの組込みが確認された。トランケート型ＣＤ１９は、９０％を超えるＧＭ－ＮＳＣ集団の精製を可能とした。さらには、化学修飾したｓｇＲＮＡを有する「全ＲＮＡ」システムとしてＣＲＩＳＰＲプラットフォームを送達することにより、ＤＳＢの頻度が有意に向上し、それがその後、ＣＲＩＳＰＲのプラスミド送達に対して２倍にＨＲターゲティング率を向上させた。最も重要なことに、オリゴデンドロサイト突然変異シバラー（shiver）マウスへのＧＭ－ＮＳＣの移植により、ＧＭ－ＮＳＣが非遺伝子改変ＮＳＣと同等に、遊走し、かつミエリン産生オリゴデンドロサイトに分化することが示され、これはＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣの特徴を保持することを説明する。これらのタンパク質は血液脳関門を越えることができないので、ＧＭ－ＮＳＣの自己複製および大域的遊走の特性は、ＧＭ－ＮＳＣがタンパク質の連続的送達用の小生産工場として働いて、治療選択肢を広げ得ることを説明する。結論として、本明細書中に記載する研究の成功は、多数の神経変性障害ならびに脳、脊髄、および眼の損傷の治療を可能とする移植可能なＧＭ－ＮＳＣについての方法、組成物、およびキットを提供する。

【0051】

ＩＩ．概論
本発明の実施には、分子生物学の分野におけるルーチン技術が利用される。本発明において使用される一般的方法を開示する基本的な教科書としては、SambrookおよびRussell、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」（第３版、２００１年）；Kriegler、「Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual」（１９９０年）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、１９９４年））が挙げられる。

【0052】

核酸の大きさは、キロ塩基（ｋｂ）、塩基対（ｂｐ）、またはヌクレオチド（ｎｔ）のいずれかで与える。一本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの大きさはヌクレオチドで与えることがある。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、シークエンシングされた核酸、または公開されたＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の大きさは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与える。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、シークエンシングされたタンパク質、誘導されたアミノ酸配列、または公開されたタンパク質配列に由来する推定値である。

【0053】

市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van Devanterら、Nucleic Acids Res. １２巻：６１５９～６１６８頁（１９８４年）に記載されたような自動合成装置を使用して、BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. ２２巻：１８５９～１８６２頁（１９８１年）に最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法にしたがって、化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当該技術分野で認識される任意の戦略、例えば、PearsonおよびReanier、J. Chrom. ２５５巻：１３７～１４９頁（１９８３年）に記載されるようなネイティブアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行われる。

【0054】

ＩＩＩ．定義
別段の具体的な記載がなければ、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。加えて、本明細書中に記載する方法または材料に類似または同等のあらゆる方法または材料を本発明の実施において使用することができる。本発明の目的のために、以下の用語を定義する。

【0055】

本明細書中で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」という用語は、１つのメンバーを有する態様を含むだけでなく、１つより多くのメンバーを有する態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「剤（ｔｈｅ ａｇｅｎｔ）」への言及は、当業者に公知の１つまたは複数の剤への言及を含むなどである。

【0056】

「ヒト神経幹細胞」という用語は、ヒト供給源から得られるか、またはヒト起源の細胞に由来する、自己複製および多系列分化の特性を有する神経系列の細胞を指す。同様に、「ヒト神経幹細胞」という用語は、自己複製および多系統分化の特性を有する精製された細胞集団を指す。神経幹細胞は、対称的または非対称的のいずれかで分裂することができる。対称分裂する場合、神経幹細胞は分裂して２つの娘神経幹細胞または分化系列が決定した２つの前駆細胞を形成するが、別段の記載がなければ、本明細書中では対称分裂は対称的な自己複製を指す。非対称分裂する場合、神経幹細胞は分裂して１つの娘神経幹細胞および分化系列が決定した１つの前駆細胞（例えば、ニューロンまたはグリア前駆細胞のいずれか）を形成する。具体的には、神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトという中枢神経系の３つの主要な成熟クラスの細胞を産生する能力を有する。通常、ヒト神経幹細胞は、部位特異的に生着、増殖、遊走、および／または分化する能力を持つ。ヒト神経幹細胞は、転写因子Ｓｏｘ１およびＳｏｘ２の発現によって特徴付けることができる。加えて、ヒト神経幹細胞は、通常、特徴的な細胞表面マーカーを発現する。そのようなマーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５が挙げられる。したがって、ヒト神経幹細胞は、そのようなマーカーまたはそのようなメーカー（makers）の組合せ（例えば、ＣＤ１３３陽性ＣＤ２４陰性～低発現細胞）の発現に基づいて単離することができる。原理的に、ヒト神経幹細胞に特異的に発現するあらゆるマーカー、またはヒト神経幹細胞に特徴的なマーカーのあらゆる組合せをヒト神経幹細胞の単離において使用することができる。

【0057】

ヒト神経幹細胞は、ヒトの胚、胎児、または成人の供給源に由来してもよいし、あるいは胚性幹（ＥＳ）細胞および操作された多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのその他の細胞種から公知の技術を使用して誘導されてもよい。ヒト神経幹細胞は、体細胞集団、例えば線維芽細胞からのダイレクトリプログラミングによって誘導されてもよい。一部の実施形態では、ヒト神経幹細胞は、体性幹細胞または多能性幹細胞に由来する。ヒト神経幹細胞には、胎児脊髄および胎児脳組織などのヒト中枢神経系に由来する細胞が含まれる。例えば、ヒト神経幹細胞は、Uchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁に記載される方法を使用してヒト脳組織から直接単離されたヒト中枢神経系幹細胞であってもよい。

【0058】

ヒト神経幹細胞は、単層培養などの接着培養中、基質をコーティングした組織培養プレート上、懸濁培養中、またはニューロスフェアとして公知のクラスターを形成する細胞の自己接着性複合体としての、培養物であってよい。

【0059】

「初代ヒト神経幹細胞」という用語は、ヒト組織から単離されたヒト神経幹細胞、または培養物中で維持されたヒト神経幹細胞の子孫を指す。初代ヒト神経幹細胞は、通常、ヒト組織から元々単離された細胞の特徴を保持し、かつ不死化細胞株とは区別することができる。

【0060】

「ゲノム編集」という用語は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼを使用して、標的ＤＮＡ、例えば細胞のゲノムにおいて、ＤＮＡを挿入、置換、または除去する遺伝子操作の一種を指す。ヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置に特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、かつ細胞の内因性の機構を利用して、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、誘発された切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノム中の所望の位置に特異的一本鎖切断を作製する。非限定的な一例では、２つのニッカーゼを使用して、標的ＤＮＡの反対鎖上に２つの一本鎖切断を作製することによって平滑末端または付着末端を生成することができる。任意の好適なヌクレアーゼを細胞中に導入して、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘発することができ、ヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドまたはエキソヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え）による標的ＤＮＡ配列（例えば、セーフハーバー遺伝子）のヌクレアーゼ媒介性のゲノム編集が、本明細書中に記載する方法にしたがって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するために使用される。

【0061】

「ＤＮＡヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を開裂できる酵素を指し、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。本発明によれば、ＤＮＡヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子などの標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘発するために使用できる操作された（例えば、プログラム可能またはターゲティング可能な）ＤＮＡヌクレアーゼであり得る。以下に限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドまたはエキソヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せなどの任意の好適なＤＮＡヌクレアーゼを使用することができる。

【0062】

「二本鎖切断」または「ＤＳＢ」という用語は、ＤＮＡ二重らせんの両方の鎖を分断または開裂することを指す。ＤＳＢは、「平滑末端」をもたらす同じ位置での両方の鎖の開裂、または、各ＤＮＡ断片の末端における一本鎖ＤＮＡの領域、もしくは「付着末端」を生じるスタッガード（staggered）開裂を生じ得る。ＤＳＢは、１つまたは複数のＤＮＡヌクレアーゼの作用に起因し得る。

【0063】

「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」という用語は、修復をガイドするための相同鋳型を使用して二本鎖ＤＮＡ切断を正確かつ精密に修復する細胞中の機構を指す。最も一般的な形態のＨＤＲは相同組換え（ＨＲ）であり、これは２つの類似または同一のＤＮＡ分子の間でヌクレオチド配列が交換される一種の遺伝子組換えである。

【0064】

「核酸」、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖、二本鎖、または多鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびこれらのポリマーを指す。用語には、一本鎖、二本鎖、または多鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基またはその他の天然の、化学修飾された、生化学修飾された、非天然の、合成の、もしくは誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらのアナログの混合物を含むことができる。特に限定しない限り、用語には、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸が包含される。別段に示さない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した配列と共に、保存的に改変されたこれらのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、および相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res. １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. ２６０巻：２６０５～２６０８頁（１９８５年）；およびRossoliniら、Mol. Cell. Probes ８巻：９１～９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。

【0065】

「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」という用語は、ヌクレオシドの含窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、六員の糖アナログ、または直鎖糖アナログ）、および／またはリン酸骨格中に、またはこれらにおいて１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。

【0066】

「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含み得る。

【0067】

「セーフハーバー遺伝子」、または本明細書中で交換可能に使用される「セーフハーバー遺伝子座」という用語は、ゲノム中に組み込まれた導入遺伝子、例えば外来ＤＮＡの発現を可能とするゲノム上の位置を指す。場合によっては、セーフハーバー遺伝子座は、近くまたは隣接する内因性遺伝子および調節エレメントなどへの最小の影響力で、組み込まれたＤＮＡの安定発現を可能とする。場合によっては、セーフハーバー遺伝子は、神経幹細胞、その誘導体、およびこれらが分化した細胞などの様々な細胞種において、持続的な遺伝子発現を可能とし、かつ遺伝子改変のために操作されたヌクレアーゼによってターゲティングすることができる。セーフハーバー遺伝子の例としては、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびＨＢＢ遺伝子が挙げられる。場合によっては、１つより多くのセーフハーバー遺伝子をターゲティングすることによって、遺伝子改変される細胞中に１つより多くの導入遺伝子を導入することができる。

【0068】

「導入遺伝子」という用語は、ゲノム中の外来ＤＮＡを指す。導入遺伝子は、細胞の精製用のマーカーおよび／または目的の遺伝子を含有し得る。好適なマーカーは当該技術分野で公知であり、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびトランケート型ＣＤ１９などの細胞表面マーカー、ならびにＧＦＰなどの蛍光マーカーが挙げられる。目的の遺伝子は、当業者が選択することができ、中枢神経系の障害に関連するタンパク質をコードする導入遺伝子、あるいは神経保護もしくは神経再生タンパク質、これらのバリアント、これらの断片、またはこれらのペプチド模倣体をコードする遺伝子であり得る。

【0069】

導入遺伝子カセットの文脈における「カセット」という用語は、単一エレメントとして導入することができ、かつ所望の結果を達成するために一緒に機能し得る遺伝子配列エレメントの組合せを指す。導入遺伝子カセットは、異種プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含み得る。例えば、発現カセットは、第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）に作動可能に連結されたプロモーターを含んでよく、また、人間のマニピュレーションの結果として第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含むことができる。カセットは、通常、天然には見られない組合せでポリヌクレオチドを含む。

【0070】

「作動可能に連結された」という用語は、ポリヌクレオチドコード配列およびプロモーターなどの２つまたはそれより多くの遺伝子エレメントが、プロモーターに指示されるコード配列の転写などの、エレメントの適切な生物学的機能を可能とする相対的な位置で配置されていることを指す。

【0071】

「異種プロモーター」という用語は、天然には導入遺伝子に作動可能に連結されていないプロモーターを指す。異種プロモーターは、非ヒト生物体に由来する配列、または化学合成され、任意選択で改変された、プロモーター配列であり得る。あるいは、異種プロモーターは、導入遺伝子との組合せでは天然に見られない遺伝子座由来のヒト配列であり得る。

【0072】

「誘導性プロモーター系」という用語は、導入遺伝子の発現または発現レベルを改変するために操作された的に制御できる環境要因および／または外的刺激に応答するプロモーターを指し、または、例えば外来プロモーターおよび追加のエレメント（別個のプロモーターに作動可能に連結されたトランス活性化因子など）といった、エレメントの組合せを指す。誘導性プロモーター系は、酸素レベルなどの非生物要因または化学的もしくは生物学的分子に応答し得る。一部の実施形態では、化学的もしくは生物学的分子は、ヒト中に天然には存在しない分子であり得る。

【0073】

細胞に関して「単離された」という用語は、細胞が天然に存在する環境とは異なる環境中にその細胞があることを指し、例えば、細胞が天然には多細胞生物体中に存在し、かつ細胞が多細胞生物体から除去された場合に、細胞は「単離され」ている。単離された遺伝子改変細胞は、遺伝子改変細胞の混合集団中、または遺伝子改変細胞および遺伝子改変されていない細胞を含む混合集団中に存在し得る。例えば、単離された遺伝子改変細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子改変細胞の混合集団中、または遺伝子改変細胞および遺伝子改変されていない細胞を含む混合のｉｎ ｖｉｔｒｏ集団中に存在し得る。

【0074】

「細胞特異的プロモーター」という用語は、異なる細胞種または組織種において差次的な発現を指示するプロモーターを指す。発現は存在しても存在しなくてもよく、あるいは発現はその発生または分化の状態にしたがって異なる細胞種において異なるレベルで起こり得る。例えば、プロモーターは、優先的に神経細胞中または特定の神経系列の細胞中で、導入遺伝子の発現を駆動し得る。したがって、ニューロン、アストロサイト、もしくはオリゴデンドロサイトにおいて、または特定クラスのニューロンにおいてさえ、特異的に導入遺伝子を発現させることができる。

【0075】

「導入遺伝子が中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする」という語句は、遺伝子が、その存在または非存在が中枢神経系の遺伝的障害を引き起こすまたは障害に寄与する産物をコードすることを指す。遺伝的障害は、対応する突然変異遺伝子の野生型（正常）対立遺伝子を導入遺伝子として発現することによって治療され得る常染色体劣性の遺伝的障害であり得る。遺伝的障害は突然変異遺伝子によって引き起こされることがあり、本明細書中に記載する導入遺伝子は、障害を治療するために使用され得る。「導入遺伝子が神経保護または神経再生タンパク質をコードする」という語句は、導入遺伝子が、神経系の障害の発症もしくは進行を予防するもしくは予防を助ける産物、または疾患、状態、もしくは損傷の結果として失った神経系の機能の回復もしくは部分的な回復に寄与するまたは回復もしくは部分的な回復を引き起こす産物をコードすることを指す。本明細書中に記載する疾患、障害、または状態としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、網膜細胞などに影響を及ぼすものが挙げられる。そのような神経学的疾患、障害、または状態としては、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、記憶障害、癲癇、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、網膜症、視神経症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ミエリン疾患、多発性硬化症、卒中、脳性麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー（Pelizaeus-Merbacher）病などの遺伝性小児白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症およびクラッベ病、異染性白質ジストロフィー、テイ・サックス病、脊髄の損傷または外傷を挙げることができる。本明細書中に記載する疾患、障害、または状態としてはまた、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中も挙げられる。タンパク質は、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症（cerebrotendineous xanthomatosis））、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）、ＵＳＨ２Ａ（網膜色素変性症）、ＲＰＧＲ（網膜色素変性症）、ＲＰ２（網膜色素変性症）、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト）、ＲＳ－１（Ｘ連鎖性網膜分離）からなる群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質であり得る。

【0076】

「導入遺伝子が神経保護または神経再生タンパク質をコードする」という語句は、導入遺伝子が、神経系の障害の発症もしくは進行を予防するもしくは予防を助ける産物、または疾患、状態、もしくは損傷の結果として失った神経系の機能の回復もしくは部分的な回復に寄与するまたは回復もしくは部分的な回復を引き起こす産物をコードすることを指す。ある特定の実施形態では、神経保護または神経再生タンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0077】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書中で交換可能に使用される。用語には、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の操作された的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーが該当する。本明細書中で使用する場合、用語には、全長タンパク質などの任意の長さのアミノ酸鎖であって、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって連結されているものが包含される。

【0078】

「バリアント」という用語は、天然に存在するものから逸脱した生物体、株、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または特徴の形態を指す。

【0079】

「ペプチド模倣体」という用語は、ポリマーの全部または一部を構成する１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の操作された的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーを指す。ペプチド模倣体は、天然に存在するアミノ酸からなる対応するペプチドと比べて、安定性または生物学的活性などの特性が向上している場合がある。ペプチド模倣体は、例えば、１つまたは複数のＤ－アミノ酸を含み得る。

【0080】

「ベクター」または「組換えベクター」という用語は、宿主細胞中での特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能とする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成によって生成された核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部であり得る。通常、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるポリヌクレオチドを含む。この文脈における「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドコード配列およびプロモーターなどの２つまたはそれより多くの遺伝子エレメントが、コード配列のプロモーターに指示される転写などの、エレメントの適切な生物学的機能を可能とする相対的な位置で配置されていることを意味する。「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイを指すために本明細書中で使用される。本明細書中で使用する場合、プロモーターは、転写の開始部位の近くにある必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れていることがある遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも任意選択で含む。発現ベクター中に存在し得るその他のエレメントとしては、転写を増進するもの（例えば、エンハンサー）、および転写を終結させるもの（例えば、ターミネーター）、ならびに発現ベクターから産生される組換えタンパク質にある特定の結合親和性または抗原性を付与するものが挙げられる。

【0081】

「組換え」とは、遺伝子改変されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織、または生物体を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体）は、周知の方法を使用してマニピュレートされているものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、（例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、（１９８９年）または「Current Protocols in Molecular Biology」１～３巻、John Wiley & Sons, Inc.（１９９４～１９９８年）に記載される方法による）人間のマニピュレーションの結果として第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含み得る。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、通常、天然には見られない組合せでポリヌクレオチドを含む。例えば、人間によってマニピュレートされた制限部位またはプラスミドベクターの配列は、プロモーターをフランキングするまたはその他の配列から分離することができる。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現されたものであり、組換えの細胞、組織、および生物体は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。

【0082】

「選択マーカー」という用語は、遺伝子産物であって、その遺伝子産物を発現する細胞を細胞の混合集団から単離することを可能とするものを指す。そのような単離は、選択マーカー（抗生物質抵抗性遺伝子であり得る）を発現しない細胞の選択的な殺傷を通じて達成され得る。あるいは、選択マーカーは、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質の発現、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、もしくは類似の方法による細胞の単離を可能とする細胞表面マーカーの発現の結果として、マーカーを発現する細胞の単離を可能とし得る。好適な細胞表面マーカーとしては、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびトランケート型ＣＤ１９が挙げられる。好ましくは、所望の細胞を単離するために使用される細胞表面マーカーは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、またはＣＤ２０のサブユニットまたはトランケート型形態などの非シグナリング分子である。好適なマーカーおよび技術は当該技術分野で公知である。

【0083】

「検出可能なマーカー」という用語は、遺伝子産物であって、その遺伝子産物を発現する細胞の同定を可能とするものを指す。そのような同定は、例えば、蛍光タンパク質の発現または標識化抗体によって認識できる細胞表面マーカーの発現による、視覚的な同定であり得る。好適なマーカーおよび技術は当該技術分野で公知である。

【0084】

「精製マーカー」という用語は、特定の細胞種の精製を提供するマーカーを指す。したがって、精製マーカーは、上記のような選択マーカーであってもよく、それによって、例えば抗生物質選択またはＦＡＣＳもしくはＭＡＣＳによる、マーカーを発現する細胞の精製が可能となる。好適なマーカーおよび技術は当該技術分野で公知である。ヒト神経幹細胞を精製するためのマーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５が挙げられる。ヒト神経幹細胞はまた、メーカー（makers）の組合せの発現（例えば、ＣＤ１３３陽性ＣＤ２４陰性～低発現細胞）に基づいても単離することができる。原理的に、ヒト神経幹細胞に特異的に発現するあらゆるマーカー、またはヒト神経幹細胞に特徴的なマーカーのあらゆる組合せをヒト神経幹細胞の単離において使用することができる。

【0085】

「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書中で交換可能に使用される。哺乳動物としては、ネズミ科動物、類人猿、ヒト、農用動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ ｖｉｖｏで得られるまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの子孫もまた包含される。

【0086】

「治療する」という用語は、治療的利益および／または予防的利益が挙げられるが、これらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療されている１つまたは複数の疾患、状態、または症状における任意の治療上関連する向上または疾患、状態、または症状に対する任意の効果を意味する。予防的利益のために、特定の疾患、状態、もしくは症状を発症する可能性のある対象に対して、または疾患、状態、もしくは症状がまだ現れていないかもしれないが、疾患の生理学的症状の１つまたは複数を報告する対象に対して、組成物が投与され得る。

【0087】

「有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な剤の量を指す。治療有効量は、治療されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重篤度、投与方法など（これらは当業者によって容易に決定され得る）の１つまたは複数に応じて変化し得る。具体的な量は、選択された特定の剤、標的細胞種、対象中の標的細胞の位置、従っている投与レジメン、その他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれを運ぶ物理的送達システムの１つまたは複数に応じて変化し得る。

【0088】

「薬学的に許容される担体」という用語は、細胞、生物体、または対象に活性剤を投与することを助ける物質を指す。「薬学的に許容される担体」は、本発明の組成物中に含まれることができ、かつ患者に対して有意な有害の毒性効果を引き起こさない担体または医薬品添加物を指す。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水溶液、乳酸リンゲル液、生理的スクロース（normal sucrose）、生理的グルコース、細胞培養培地などが挙げられる。その他の医薬担体が本発明において有用であることを当業者は認識するであろう。

【0089】

参照数値に関する「約」という用語は、その値に１０％プラスまたはマイナスした値の範囲を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９、１０、および１１の参照数を含めて、９～１１の量を含む。参照数値に関する「約」という用語はまた、その値に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％プラスまたはマイナスした値の範囲も含み得る。

【0090】

ＩＶ．実施形態の詳細な説明
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数への言及を含む。本明細書中に記載する発明の態様および変形は、「からなる」および／または「から本質的になる」態様および変形を含むことが理解される。

【0091】

一態様では、本発明は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、遺伝子中に二本鎖切断を作製して末端結合を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法を提供する。

【0092】

一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法を提供する。

【0093】

一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0094】

セーフハーバー遺伝子座は、ゲノム中に組み込まれた導入遺伝子、例えば外来ＤＮＡの発現を可能とするゲノム上の位置であり得る。場合によっては、セーフハーバー遺伝子座は、近くのまたは隣接する内因性遺伝子、調節エレメントなどへの最小の影響力で、組み込まれたＤＮＡの安定発現を可能とする。場合によっては、セーフハーバー遺伝子は、神経幹細胞、その誘導体、およびこれらが分化した細胞などの様々な細胞種において、持続的な遺伝子発現を可能とし、かつ遺伝子改変のために操作されたヌクレアーゼによってターゲティングされ得る。

【0095】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、２）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼとをコードするヌクレオチド配列を前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0096】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）ヒト神経幹細胞の集団を単離すること、２）前記単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、３）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0097】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とをヒト神経幹細胞を含むヒト細胞集団中に導入すること、２）前記ヒト細胞集団からヒト神経幹細胞を単離し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、方法は、単離された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、培養期間は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の日数である。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0098】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0099】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、２）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0100】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）ヒト神経幹細胞の集団を単離すること、２）前記単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、３）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0101】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とをヒト神経幹細胞を含むヒト細胞集団中に導入すること、２）前記ヒト細胞集団からヒト神経幹細胞を単離し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0102】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0103】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、２）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0104】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）ヒト神経幹細胞の集団を単離すること、２）前記単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、３）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0105】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列とをヒト神経幹細胞を含むヒト細胞集団中に導入すること、２）前記ヒト細胞集団からヒト神経幹細胞を単離し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｃ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0106】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができる、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0107】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、２）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、精製マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0108】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）ヒト神経幹細胞の集団を単離すること、２）前記単離されたヒト神経幹細胞を培養すること、３）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とを前記培養されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0109】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）（ａ）（ｉ）導入遺伝子、（ｉｉ）選択マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とをヒト神経幹細胞を含むヒト細胞集団中に導入すること、２）前記ヒト細胞集団からヒト神経幹細胞を単離し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。

【0110】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、１）（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、（ｉｉ）精製マーカーをコードする核酸、および（ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）セーフハーバー遺伝子中に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子中への導入遺伝子の挿入を誘発することができるＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）とをヒト神経幹細胞を含むヒト細胞集団中に導入すること、２）前記ヒト細胞集団からヒト神経幹細胞を単離し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、前記単離されたヒト神経幹細胞から、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択マーカーに基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはこれらのトランケート型断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、およびＨＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物を含む条件下で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日のうちの任意の期間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0111】

一部の実施形態では、複数の導入遺伝子が複数のセーフハーバー遺伝子座に導入される。一部の実施形態では、複数の導入遺伝子が単一のセーフハーバー遺伝子座に導入される。一部の実施形態では、単一の導入遺伝子または複数の導入遺伝子が、１つまたは複数の非セーフハーバー遺伝子座に導入される。

【0112】

本明細書中に記載する導入遺伝子は、タンパク質または機能的な核酸（マイクロＲＮＡなど）をコードすることができる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）、ＵＳＨ２Ａ（網膜色素変性症）、ＲＰＧＲ（網膜色素変性症）、ＲＰ２（網膜色素変性症）、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト）、ＲＳ－１（Ｘ連鎖性網膜分離）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、タンパク質は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される。

【0113】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される神経保護または神経変性タンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、神経保護または神経変性タンパク質をコードし、神経保護または神経再生タンパク質は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、導入遺伝子はＢｃｌ－２をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子はテロメラーゼをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、生存を向上させて、または神経幹細胞を若返らせて、長期生存および／または治療用分子の発見を促進できるタンパク質をコードする。

【0114】

本明細書中に記載する導入遺伝子カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、異種プロモーターなどのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターおよび導入遺伝子は、同じセーフハーバー遺伝子中に位置する。一部の実施形態では、プロモーターおよび導入遺伝子は、異なるセーフハーバー遺伝子中に位置する。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、複数の導入遺伝子がヒト神経幹細胞中に導入される場合、導入遺伝子は１つまたは複数のプロモーターによって制御され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロモーターは、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、転写制御エレメント、エンハンサー、Ｕ６終結配列、１つまたは複数の核局在化シグナルなどであり得る。

【0115】

一部の実施形態では、本明細書中に記載する導入遺伝子カセットは、導入遺伝子が内因性プロモーターに作動可能に連結されるように、セーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0116】

一部の実施形態では、導入遺伝子およびＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、同時に導入される。一部の実施形態では、導入遺伝子およびＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、順次的に導入される。

【0117】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼシステムはＴＡＬＥＮシステムである。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムは、プラスミドに基づくＴＡＬＥＮを含む。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムは、ＲＮＡに基づくＴＡＬＥＮを含む。

【0118】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、プラスミドに基づくＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＲＮＡに基づくＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、タンパク質／ＲＮＡ複合体、またはプラスミド／ＲＮＡ複合体、またはタンパク質／プラスミド複合体を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞を生成する方法であって、導入遺伝子およびＤＮＡヌクレアーゼシステムを前記単離された神経幹細胞中に導入することを含み、導入遺伝子がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、かつＤＮＡヌクレアーゼシステムがＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび遺伝子座特異的ｓｇＲＮＡを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、神経幹細胞中に導入される前に修飾される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、神経幹細胞中に導入される前に修飾される。

【0119】

一部の実施形態では、生じた遺伝子改変された神経幹細胞の少なくとも１％は導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、生じた遺伝子改変された神経幹細胞の少なくとも０．５％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％は前記導入遺伝子を発現する。

【0120】

本明細書中に記載する方法によって得られる遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は、神経幹細胞の「幹細胞性」の維持などの、１つまたは複数の有利な特性を呈する。細胞が（時に大規模に）培養され、かつ遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を調製する方法におけるマニピュレーションの複数のステップに供されるという事実を考慮すれば、これは特に顕著である。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、ＳＯＸ２を発現することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、動物モデルの脳に移植された時に、生着または遊走することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、オリゴデンドロサイト、ニューロン、またはアストロサイトに分化することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、嗅球中の神経細胞系列に分化することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、長期間、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの系列に分化しながら、自己複製することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代にわたって、上記特徴の少なくとも１つを有する。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、上記特徴の少なくとも２つまたはそれより多くを有する。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代にわたって、上記特徴の少なくとも２つまたはそれより多くを有する。

【0121】

一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも３継代後に導入遺伝子を安定に発現することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、４、５、６、または７回の細胞培養の継代にわたって、導入遺伝子を安定に発現することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞集団の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％は、導入遺伝子を発現する。

【0122】

一部の実施形態では、本明細書中に記載する方法は選択マーカーを使用する。一部の実施形態では、選択マーカーは、中枢神経系の細胞で通常発現されないタンパク質である。一部の実施形態では、選択マーカーは、細胞表面上で発現されない（例えば、ＧＦＰ）。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。

【0123】

一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはこれらのトランケート型断片である。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはＣＤ８アルファ細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはＣＤ２０細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはトランケート型ＣＤ８細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはトランケート型ＣＤ１９細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはトランケート型ＣＤ２０細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞の選択を促進するために、２つまたはそれより多くの細胞表面マーカーが使用される。

【0124】

一部の実施形態では、細胞表面マーカーはケモカイン受容体である。一部の実施形態では、細胞表面マーカーはサイトカイン受容体である。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは細胞表面酵素（イソメチプロテアーゼ（isomethy protease）、メタロプロテアーゼ、またはネプリライシンなど）およびケモカイン受容体である。

【0125】

一部の実施形態では、神経幹細胞は、（例えば、ニューロスフェアとして公知のクラスターを形成することによって、）細胞の自己接着性複合体として培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は単層培養などの接着培養で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、基質でコーティングした組織培養プレート上で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は懸濁培養で培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子、および白血病抑制因子からなる群から選択される添加物の少なくとも１つを含む条件で培養される。

【0126】

一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）を前記神経幹細胞に導入する前に、ある長さの期間（３０日間など）にわたって培養される。一部の実施形態では、培養期間は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入される前に、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日である。

【0127】

一部の実施形態では、培養期間の長さは、増殖している神経幹細胞からドナー鋳型が希釈されて消失するために十分な長さである。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が前記神経幹細胞中に導入された後に、最低で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００日の間、培養される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ドナー鋳型および／またはＤＮＡヌクレアーゼ（もしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列）が神経幹細胞中に導入された後に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代の間、培養される。

【0128】

一部の実施形態では、神経幹細胞は、ヒトの１つまたは複数の脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または１つもしくは複数の体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される。一部の実施形態では、神経幹細胞はヒト神経幹細胞である。一部の実施形態では、神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、Ｃ１３３およびＣＤ２４などのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３陽性ＣＤ２４陰性～低発現のヒト脳細胞に由来する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0129】

本明細書中に記載する任意の１つまたは複数の方法によって作られた遺伝子改変された神経幹細胞もまた、本明細書中で提供される。遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は、以下においてより詳細にさらに記載される。

【0130】

本出願の別の態様は、セーフハーバー遺伝子座に挿入された導入遺伝子を含む、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞集団を提供する。

【0131】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ヒトの１つまたは複数の脳に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、マーカーの組合せの発現、例えばＣＤ１３３陽性ＣＤ２４陰性～低発現細胞に基づいて単離される。一部の実施形態では、神経幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５からなる群から選択される２つまたはそれより多くのマーカーの組合せの発現に基づいて単離される。

【0132】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代にわたってＳＯＸ２を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はオリゴデンドロサイトに分化することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ミエリン産生オリゴデンドロサイトに分化することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はニューロンに分化することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はアストロサイトに分化することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトなどの２つまたはそれより多くの神経細胞種に分化することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、動物モデルの脳に移植された時に生着することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、動物モデルの脳に移植された時に遊走することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、嗅球中の神経細胞系列に分化することができる。一部の実施形態では、生じる遺伝子改変された神経幹細胞は、長期間、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの系列に分化しながら自己複製することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の細胞培養の継代にわたって２つまたはそれより多くの上記で論じたような特徴を有し（例えば、ＳＯＸ２を発現し）、かつ動物モデルの脳に移植された時に遊走もしくは生着すること、またはニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトなどの少なくとも１つの神経細胞種に分化することを含む機能の少なくとも１つを呈する。

【0133】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞集団の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％は導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７回の細胞培養の継代にわたって導入遺伝子を安定に発現することができる。

【0134】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は選択マーカーをさらに発現する。一部の実施形態では、選択マーカーは、中枢神経系の細胞で発現されないマーカーを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面上で発現されない（すなわち、ＧＦＰ）。

【0135】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は選択マーカーとして使用することができる細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はＣＤ８細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はＣＤ８アルファ細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はＣＤ１９細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はＣＤ２０細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はトランケート型ＣＤ８細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はトランケート型ＣＤ１９細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はトランケート型ＣＤ２０細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は２つまたはそれより多くの細胞表面マーカーを発現する。

【0136】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はケモカイン受容体である細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞はサイトカイン受容体である細胞表面マーカーを発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、細胞表面酵素（イソメチプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼ、またはネプリライシンなど）およびケモカイン受容体である細胞表面マーカーを発現する。

【0137】

一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子はＩＬ２Ｒγである。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子はＣＣＲ５である。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子はＨＢＢである。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのセーフハーバー遺伝子が、１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するために使用される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのセーフハーバー遺伝子は、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびＨＢＢからなる群から選択される。

【0138】

一部の実施形態では、導入遺伝子はプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は異種プロモーターを含む。一部の実施形態では、異種プロモーターは導入遺伝子に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、異種プロモーターは導入遺伝子に作動可能に連結されており、異種プロモーターおよび導入遺伝子は同じセーフハーバー遺伝子中に位置する。一部の実施形態では、異種プロモーターは導入遺伝子に作動可能に連結されており、異種プロモーターおよび導入遺伝子は異なるセーフハーバー遺伝子中に位置する。一部の実施形態では、ドナー鋳型の異種プロモーターは誘導性プロモーター系を含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型の異種プロモーターは細胞特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、１つまたは複数のプロモーターを含む１つまたは複数の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロモーターは、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、転写制御エレメント、エンハンサー、Ｕ６終結配列、１つまたは複数の核局在化シグナルなどであり得る。

【0139】

一部の実施形態では、本明細書中に記載する導入遺伝子カセットは、導入遺伝子が内因性プロモーターに作動可能に連結されるように、セーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0140】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は導入遺伝子を発現し、導入遺伝子は、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）、ＵＳＨ２Ａ（網膜色素変性症）、ＲＰＧＲ（網膜色素変性症）、ＲＰ２（網膜色素変性症）、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト）、ＲＳ－１（Ｘ連鎖性網膜分離）からなる群から選択される導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、タンパク質は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される。

【0141】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される神経保護または神経変性タンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、神経保護または神経変性タンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、神経保護または神経再生タンパク質は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、導入遺伝子はＢｃｌ－２をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子はテロメラーゼをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、生存を向上させて、または神経幹細胞を若返らせて、長期生存および／または治療用分子の発見を促進できるタンパク質をコードする。

【0142】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、２つまたはそれより多くの導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、導入遺伝子から産生されるＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、導入遺伝子から産生されるｓｉＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、１つの導入遺伝子から産生されるＲＮＡを産生し、かつ別の導入遺伝子をタンパク質として発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、１つの導入遺伝子から産生されるｓｉＲＮＡを産生し、かつ別の導入遺伝子をタンパク質として発現する。

【0143】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ヒト対象に投与されて、神経変性疾患または神経学的損傷の１つまたは複数の症状を予防または軽減することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、ヒト対象に投与されて、神経変性疾患の１つまたは複数の症状を予防または軽減することができ、神経変性疾患は、白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される。
一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は、２つまたはそれより多く（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれより多く）の上記で論じた特徴を有する。

【0144】

Ａ．ヌクレアーゼ媒介性のゲノム編集
本発明は、操作された（例えば、プログラム可能なまたはターゲティング可能な）ＤＮＡヌクレアーゼなどのＤＮＡヌクレアーゼを使用して、セーフハーバー遺伝子などの標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘発することを含む。非限定的に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドまたはエキソヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せなどの任意の好適なＤＮＡヌクレアーゼを使用することができる。

【0145】

一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に存在する。ある特定の例では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。例えば、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスなどに基づき得る。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターに基づき得る。有用な発現ベクターは当業者に公知であり、多くが市販されている。以下のベクターを真核宿主細胞用の例として提供する：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０。しかしながら、宿主細胞に適合すれば、任意のその他のベクターを使用することができる。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する有用な発現ベクターが、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＯｒｉｇｅｎｅから市販されている。

【0146】

使用する標的細胞／発現系に応じて、プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含む多数の転写および翻訳制御エレメントのうちのいずれかを発現ベクターにおいて使用することができる。有用なプロモーターは、ウイルス、または任意の生物体、例えば原核生物または真核生物に由来し得る。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス後期主要プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（human U6 small nuclear promoter）（Ｕ６）、強化型Ｕ６プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0147】

他の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）として存在する。ＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって製造することができる。非限定的な例として、ＲＮＡを化学合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することができる。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する線状化プラスミドなどの鋳型ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を通じて生成することができる。Ｃａｓ９ ＯＲＦは、哺乳動物の系における発現のために最適化されたコドンであり得る。一部の例では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｎ末端および／またはＣ末端に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するＣａｓ９ポリペプチドをコードする。その他の例では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃ末端のＨＡエピトープタグをコードする。さらに他の例では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、キャップを付加され、ポリアデニル化され、および／または５－メチルシチジンで修飾されている。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。

【0148】

１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム操作のために使用できる細菌システムに基づく操作されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の部分に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入する時に、侵入者のＤＮＡセグメントが「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、ｃｒＲＮＡは、部分的な相補性領域を通じて、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別種のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡに相同な領域へとガイドする。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼはＤＮＡを開裂して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドのガイド配列によって特定される部位において二本鎖切断における平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、部位特異的なＤＮＡの認識および開裂のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とし得る。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを合わせて１つの分子（「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）にできるように、および単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分を操作して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをガイドして任意の所望の配列にターゲティングできるように、このシステムは操作されている（例えば、Jinekら（２０１２年）Science ３３７巻：８１６～８２１頁；Jinekら（２０１３年）eLife ２：ｅ００４７１；Segal（２０１３年）eLife ２：ｅ００５６３を参照）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作して、細胞のゲノム中の所望の標的において二本鎖切断を作製し、かつ細胞の内因性の機構を利用して相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘発された切断を修復することができる。

【0149】

一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＤＮＡ開裂活性を有する。Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列中の位置において１つまたは両方の鎖の開裂を導くことができる。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を開裂する１つまたは複数の不活化触媒ドメインを有するニッカーゼであり得る。

【0150】

Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、これらのバリアント、これらの突然変異体、およびこれらの誘導体が挙げられる。３つの主要型のＣａｓヌクレアーゼ（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）、ならびに５つのＩ型、３つのＩＩ型、および２つのＩＩＩ型のタンパク質を含む１０のサブタイプが存在する（例えば、HochstrasserおよびDoudna、Trends Biochem Sci、２０１５年：４０巻（１号）：５８～６６頁を参照）。ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ９が挙げられる。これらのＣａｓヌクレアーゼは当業者に公知である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばＮＢＣＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．番号ＮＰ＿２６９２１５に記載されており、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばＮＢＣＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．番号ＷＰ＿０１１６８１４７０に記載されている。本発明において有用なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、例えば、米国出願公開第２０１４／００６８７９７号、同第２０１４／０３０２５６３号、および同第２０１４／０３５６９５９号に開示されている。

【0151】

Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ポリペプチドは、以下に限定されないが、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ． Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａなどの様々な細菌種に由来し得る。

【0152】

「Ｃａｓ９」とは、ＲＮＡにガイドされる二本鎖ＤＮＡに結合するヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能ドメイン、例えばＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、両方の機能ドメインが活性である時に、ゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）中に二本鎖切断を誘発することができる。Ｃａｓ９酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群に属する細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の１つまたは複数の触媒ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は融合タンパク質であり、例えば、２つの触媒ドメインは異なる細菌種に由来する。

【0153】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼの有用なバリアントは、ＲｕｖＣ^－もしくはＨＮＨ^－酵素またはニッカーゼなどの単一の不活性触媒ドメインを含み得る。Ｃａｓ９ニッカーゼは、活性の機能ドメインを１つだけ有し、標的ＤＮＡの一鎖のみを切断することによって一本鎖切断またはニックを作製することができる。一部の実施形態では、少なくともＤ１０Ａ突然変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態では、少なくともＨ８４０Ａ突然変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼ中に存在する突然変異のその他の例としては、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａが挙げられるが、これらに限定されない。反対のＤＮＡ鎖にターゲティングする少なくとも２つのＤＮＡターゲティングＲＮＡが使用される場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して二本鎖切断を導入することができる。二重ニックを誘発された二本鎖切断はＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復することができる（Ranら、２０１３年、Cell、１５４巻：１３８０～１３８９頁）。この遺伝子編集戦略はＨＤＲを選好し、オフターゲットのＤＮＡ部位におけるｉｎｄｅｌ突然変異の頻度を減少させる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば、米国特許第８，８９５，３０８号；同第８，８８９，４１８号；および同第８，８６５，４０６号、ならびに米国出願公開第２０１４／０３５６９５９号、同第２０１４／０２７３２２６号、および同第２０１４／０１８６９１９号に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物体のためにコドンが最適化されている場合がある。

【0154】

一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ１およびＨＮＨヌクレアーゼドメインの２つの抑制化突然変異（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を含有するＣａｓ９ポリペプチドであってよく、これはｄＣａｓ９と称される（Jinekら、Science、２０１２年、３３７巻：８１６～８２１頁；Qiら、Cell、１５２巻（５号）：１１７３～１１８３頁）。一実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７、または任意のこれらの組合せの位置において少なくとも１つの突然変異を含む。そのようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそのバリアントの説明は、例えば国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異に加えて、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６における突然変異を含有し得る。一部の例では、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ突然変異を含有する。ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含むこともできる。一部の実施形態では、本発明のｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎの置換を含む。置換は、保存的な置換であってもよいし、またはＣａｓ９ポリペプチドを酵素活性がなくかつ標的ＤＮＡに結合できるようにする非保存的な置換であってもよい。

【0155】

ゲノム編集方法のために、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９に連結されたＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインを含むポリペプチドなどの、Ｃａｓ９融合タンパク質であり得る。ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合タンパク質（ｆＣａｓ９）は、２つのガイドＲＮＡを使用して標的ＤＮＡの一本鎖に結合し、二本鎖切断を生成することができる。

【0156】

一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、低下したオフターゲット作用およびロバストなオンターゲットの開裂を有する、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドバリアントであり得る。オンターゲットの特異性が向上したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントの非限定的な例としては、Slaymakerら、Science、３５１巻（６２６８号）：８４～８頁（２０１６年）に記載のＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．０）とも称される］、およびＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．１）とも称される］バリアント、ならびに以下の突然変異：Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つ、または４つを含有する、Kleinstiverら、Nature、５２９巻（７５８７号）：４９０～５頁（２０１６年）に記載のＳｐＣａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は４つ全ての突然変異を含有する）が挙げられる。

【0157】

２．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、ＦｏｋＩの開裂ドメインと３つまたはそれより多くのジンクフィンガーモチーフを含有するＤＮＡ認識ドメインとの融合である。精密な配向および間隔での２つの個々のＺＦＮのＤＮＡ中の特定の位置でのヘテロ二量体化は、ＤＮＡ中の二本鎖切断に繋がる。場合によっては、ＺＦＮは、開裂ドメインを各ジンクフィンガードメインのＣ末端に融合させている。２つの開裂ドメインが二量体化してＤＮＡを開裂するのを可能にするために、２つの個々のＺＦＮは、ある特定の距離を空けて、それらのＣ末端でＤＮＡの反対の鎖に結合する。場合によっては、ジンクフィンガードメインと開裂ドメインとの間のリンカー配列は、各結合性部位の５’端が約５～７ｂｐ離れていることを必要とする。本発明において有用な例示的ＺＦＮとしては、Urnovら、Nature Reviews Genetics、２０１０年、１１巻：６３６～６４６頁；Gajら、Nat Methods、２０１２年、９巻（８号）：８０５～７頁；米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，７４６，８３８号；同第６，７９４，１３６号；同第６，８２４，９７８号；同第６，８６６，９９７号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；同第７，０３０，２１５号；同第７，２２０，７１９号；同第７，２４１，５７３号；同第７，２４１，５７４号；同第７，５８５，８４９号；同第７，５９５，３７６号；同第６，９０３，１８５号；同第６，４７９，６２６号；ならびに米国出願公開第２００３／０２３２４１０号および同第２００９／０２０３１４０号に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

ＺＦＮは、標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生成して、遺伝子改変の導入を可能とするＤＮＡ切断修復を生じさせることができる。ＤＮＡ切断修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲでは、標的ＤＮＡの相同アームフランキング部位を含有するドナーＤＮＡ修復鋳型が提供され得る。

【0159】

一部の実施形態では、ＺＦＮは部位特異的な一本鎖ＤＮＡ切断またはニックを誘発し、したがってＨＤＲを生じさせる操作されたＺＦＮであり得るジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの説明は、例えば、Ramirezら、Nucl Acids Res、２０１２年、４０巻（１２号）：５５６０～８頁；Kimら、Genome Res、２０１２年、２２巻（７号）：１３２７～３３頁に見られる。

【0160】

３．ＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ結合性縦列反復配列の中央ドメイン、核局在化シグナル、およびＣ末端の転写活性化ドメインを含有する、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。一部の例では、ＤＮＡ結合性縦列反復配列は３３～３５アミノ酸の長さを含み、１つまたは複数の特定のＤＮＡ塩基対を認識できる２つの超可変のアミノ酸残基を１２位および１３位に含有する。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合することによって製造することができる。例えば、野生型または変異型のＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはＦｏｋＩの触媒ドメインなどのヌクレアーゼにＴＡＬＥタンパク質を融合させることができる。例えば、開裂の特異性または活性を向上させるＦｏｋＩに対するいくつもの突然変異が、ＴＡＬＥＮにおける使用のために為されてきた。そのようなＴＡＬＥＮを操作して、任意の所望のＤＮＡ配列に結合させることができる。

【0161】

ＴＡＬＥＮを使用して標的ＤＮＡ配列中に二本鎖切断を作製し、そしてそれがＮＨＥＪまたはＨＤＲを受けることによって、遺伝子改変を生成することができる。場合によっては、ＨＤＲを促進するために一本鎖のドナーＤＮＡ修復鋳型が提供される。

【0162】

ＴＡＬＥＮおよび遺伝子編集のためのその使用の詳細な説明は、例えば、米国特許第８，４４０，４３１号；同第８，４４０，４３２号；同第８，４５０，４７１号；同第８，５８６，３６３号；および同第８，６９７，８５３号；Scharenbergら、Curr Gene Ther、２０１３年、１３巻（４号）：２９１～３０３頁；Gajら、Nat Methods、２０１２年、９巻（８号）：８０５～７頁；Beurdeleyら、Nat Commun、２０１３年、４巻：１７６２頁；ならびにJoungおよびSander、Nat Rev Mol Cell Biol、２０１３年、１４巻（１号）：４９～５５頁に見られる。

【0163】

４．メガヌクレアーゼ
「メガヌクレアーゼ」は、高い特異性を有し得る希少切断性（rare-cutting）エンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼであり、少なくとも１２塩基対の長さ、例えば１２～４０塩基対または１２～６０塩基対の長さに及ぶＤＮＡ標的部位を認識する。メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの少なくとも１つの触媒ドメインおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインまたは核酸標的配列を特定するタンパク質を含む任意の融合タンパク質などの、モジュール式のＤＮＡ結合性ヌクレアーゼであり得る。ＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含有し得る。メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であり得る。

【0164】

一部の例では、メガヌクレアーゼは、天然に存在するもの（天然に見られるもの）または野生型であり、その他の例では、メガヌクレアーゼは、非天然の、操作された的な、操作された、合成の、合理的に設計された、または人間が作ったものである。ある特定の実施形態では、本発明のメガヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの突然変異体、およびこれらの誘導体が挙げられる。

【0165】

有用なメガヌクレアーゼおよび遺伝子編集におけるそれらの適用の詳細な説明は、例えば、Silvaら、Curr Gene Ther、２０１１年、１１巻（１号）：１１～２７頁；Zaslavoskiyら、BMC Bioinformatics、２０１４年、１５巻：１９１頁；Takeuchiら、Proc Natl Acad Sci USA、２０１４年、１１１巻（１１号）：４０６１～４０６６頁、ならびに米国特許第７，８４２，４８９号；同第７，８９７，３７２号；同第８，０２１，８６７号；同第８，１６３，５１４号；同第８，１３３，６９７号；同第８，０２１，８６７号；同第８，１１９，３６１号；同第８，１１９，３８１号；同第８，１２４，３６号；および同第８，１２９，１３４号に見られる。

【0166】

Ｂ．ＨＤＲ用のドナー鋳型
（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）導入遺伝子カセットにフランキングし、かつＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）開裂部位の両側にあるセーフハーバー遺伝子の部分に相同な２つの相同アームを含む、ドナー鋳型（例えば、組換えドナー修復鋳型）が本明細書中で提供される。ドナー鋳型は、選択マーカー、検出可能なマーカー、および／または精製マーカーをさらに含み得る。

【0167】

一部の実施形態では、相同アームは同一の長さである。他の実施形態では、相同アームは異なる長さである。相同アームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４５ｂｐ、５５ｂｐ、６５ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１．１キロ塩基（ｋｂ）、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、またはそれより長い場合がある。相同アームは、約１０ｂｐから約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐから約２０ｂｐ、約１０ｂｐから約５０ｂｐ、約１０ｂｐから約１００ｂｐ、約１０ｂｐから約２００ｂｐ、約１０ｂｐから約５００ｂｐ、約１０ｂｐから約１ｋｂ、約１０ｂｐから約２ｋｂ、約１０ｂｐから約４ｋｂ、約１００ｂｐから約２００ｂｐ、約１００ｂｐから約５００ｂｐ、約１００ｂｐから約１ｋｂ、約１００ｂｐから約２ｋｂ、約１００ｂｐから約４ｋｂ、約５００ｂｐから約１ｋｂ、約５００ｂｐから約２ｋｂ、約５００ｂｐから約４ｋｂ、約１ｋｂから約２ｋｂ、約１ｋｂから約２ｋｂ、約１ｋｂから約４ｋｂ、または約２ｋｂから約４ｋｂであり得る。

【0168】

ドナー鋳型は、発現ベクター中にクローニングすることができる。当業者に公知の従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく発現ベクターを使用することができる。

【0169】

Ｃ．ＤＮＡターゲティングＲＮＡ
一部の実施形態では、本発明の方法は、ガイド核酸、例えばＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはダブルガイド核酸）、またはガイド核酸（例えば、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列をヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む。

【0170】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列に相補的な第１のヌクレオチド配列（例えば、ガイド配列）、およびＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）またはそのバリアントと相互作用するタンパク質結合配列を含む第２のヌクレオチド配列（例えば、スキャフォールド配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ＤＮＡターゲティングＲＮＡのガイド配列（「第１のヌクレオチド配列」）は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対形成を使用してＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）を標的ＤＮＡ部位（例えば、セーフハーバー遺伝子配列）に導くことができる、約１０から約２０００の核酸、例えば、約１０から約１００の核酸、約１０から約５００の核酸、約１０から約１０００の核酸、約１０から約１５００の核酸、約１０から約２０００の核酸、約５０から約１００の核酸、約５０から約５００の核酸、約５０から約１０００の核酸、約５０から約１５００の核酸、約５０から約２０００の核酸、約１００から約５００の核酸、約１００から約１０００の核酸、約１００から約１５００の核酸、約１００から約２０００の核酸、約５００から約１０００の核酸、約５００から約１５００の核酸、約５００から約２０００の核酸、約１０００から約１５００の核酸、約１０００から約２０００の核酸、または約１５００から約２０００の核酸を５’末端に含み得る。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのガイド配列は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対形成を使用してＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）を標的ＤＮＡ部位（例えば、セーフハーバー遺伝子配列）に導くことができる約１００の核酸を５’末端に含む。一部の実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対形成を使用してＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）を標的ＤＮＡ部位（例えば、セーフハーバー遺伝子配列）に導くことができる２０の核酸を５’末端に含む。他の実施形態では、ガイド配列は、標的ＤＮＡ部位（例えば、セーフハーバー遺伝子配列）に相補的な２０未満、例えば、１９、１８、１７、１６、１５、またはそれ未満の核酸を含む。ガイド配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）を標的ＤＮＡ部位（例えば、セーフハーバー遺伝子配列）に導くことができる１７の核酸を含み得る。一部の例では、ガイド配列は、ターゲティング領域の５’末端において相補性領域中に約１から約１０の核酸ミスマッチを含有する。その他の例では、ガイド配列は、ターゲティング領域の３’末端において最後の約５から約１２の核酸には相補性領域中にミスマッチを含有しない。

【0171】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合性スキャフォールド配列（「第２のヌクレオチド配列」）は、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡデュプレックス（ｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成する２つの相補的なヌクレオチドストレッチを含み得る。タンパク質結合性スキャフォールド配列は、約３０の核酸から約２００の核酸の間、例えば、約４０の核酸から約２００の核酸の間、約５０の核酸から約２００の核酸の間、約６０の核酸から約２００の核酸の間、約７０の核酸から約２００の核酸の間、約８０の核酸から約２００の核酸の間、約９０の核酸から約２００の核酸の間、約１００の核酸から約２００の核酸の間、約１１０の核酸から約２００の核酸の間、約１２０の核酸から約２００の核酸の間、約１３０の核酸から約２００の核酸の間、約１４０の核酸から約２００の核酸の間、約１５０の核酸から約２００の核酸の間、約１６０の核酸から約２００の核酸の間、約１７０の核酸から約２００の核酸の間、約１８０の核酸から約２００の核酸の間、または約１９０の核酸から約２００の核酸の間であり得る。ある特定の態様では、タンパク質結合配列は、約３０の核酸から約１９０の核酸の間、例えば、約３０の核酸から約１８０の核酸の間、約３０の核酸から約１７０の核酸の間、約３０の核酸から約１６０の核酸の間、約３０の核酸から約１５０の核酸の間、約３０の核酸から約１４０の核酸の間、約３０の核酸から約１３０の核酸の間、約３０の核酸から約１２０の核酸の間、約３０の核酸から約１１０の核酸の間、約３０の核酸から約１００の核酸の間、約３０の核酸から約９０の核酸の間、約３０の核酸から約８０の核酸の間、約３０の核酸から約７０の核酸の間、約３０の核酸から約６０の核酸の間、約３０の核酸から約５０の核酸の間、または約３０の核酸から約４０の核酸の間であり得る。

【0172】

一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ配列に相補的なより短い領域（例えば、２０ヌクレオチド未満の長さ）を有するガイド配列を含むそのトランケート型形態である。ある特定の例では、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、オフターゲット作用を低下させることによって、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の向上した特異性を提供する。例えば、トランケート型ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対する１７、１８、または１９の相補的なヌクレオチド（例えば、１７～１８、１７～１９、または１８～１９の相補的なヌクレオチド）を有するガイド配列を含み得る。例えば、Fuら、Nat. Biotechnol.、３２巻（３号）：２７９～２８４頁（２０１４年）を参照。

【0173】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、上記のウェブベースのソフトウェアのうちのいずれかを使用して選択することができる。非限定的な例として、ＤＮＡターゲティングＲＮＡの選択の検討は、使用するＣａｓ９ヌクレアーゼ用のＰＡＭ配列、およびオフターゲットの改変を最小化するための戦略を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールは、ＤＮＡターゲティングＲＮＡを調製するため、標的改変効率を評価するため、および／またはオフターゲット部位における開裂を評価するための配列を提供することができる。

【0174】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって製造することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、発現カセットまたは発現ベクター中にクローニングされる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＰＣＲによって製造され、発現カセット中に含有される。例えば、ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅して、プロモーター配列（例えば、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列）に付加することができる。他の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）、ならびに転写制御エレメント、エンハンサー、Ｕ６終結配列、１つまたは複数の核局在化シグナルなどを含有する発現ベクター中にクローニングされる。一部の実施形態では、発現ベクターはマルチシストロン性または２シストロン性であり、蛍光タンパク質、エピトープタグ、および／または抗生物質抵抗性マーカーをコードするヌクレオチド配列も含み得る。２シストロン性の発現ベクターのある特定の例では、例えば蛍光タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａペプチドなどの自己開裂性ペプチドをコードする配列を使用して、例えば抗生物質抵抗性マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列に連結される。口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、馬鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、豚テシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、およびＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）などのウイルス２Ａペプチドは、高い開裂効率を有し、したがって２つのタンパク質が同時ではあるが、同じＲＮＡ転写物から別々に発現されることができる。

【0175】

ＤＮＡターゲティングＲＮＡを発現するための好適な発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。発現ベクターは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを含むｐＬＱ１６５１（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号５１０２４）であってよい。その他の発現ベクターの非限定的な例としては、ｐＸ３３０、ｐＳｐＣａｓ９、ｐＳｐＣａｓ９ｎ、ｐＳｐＣａｓ９－２Ａ－Ｐｕｒｏ、ｐＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＧＦＰ、ｐＳｐＣａｓ９ｎ－２Ａ－Ｐｕｒｏ、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ＯＦＰベクター、およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ＯＦＰベクターなどが挙げられる。

【0176】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は化学合成される。ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、２’－Ｏ－チオノカルバメートで保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトを使用して合成することができる。方法は、例えば、Dellingerら、J. American Chemical Society １３３巻、１１５４０～１１５５６頁（２０１１年）；Threlfallら、Organic & Biomolecular Chemistry １０巻、７４６～７５４頁（２０１２年）；およびDellingerら、J. American Chemical Society １２５巻、９４０～９５０頁（２００３年）に記載されている。

【0177】

特定の実施形態では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は化学修飾される。非限定的な例として、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、セーフハーバー遺伝子配列の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列（例えば、ガイド配列またはｃｒＲＮＡ）およびＣａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列（例えば、スキャフォールド配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む修飾されたｓｇＲＮＡである。

【0178】

いかなる特定の理論によっても縛られるものではないが、１つまたは複数の化学修飾を含有するｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集、例えば相同組換えのために使用された時に、対応する非修飾のｓｇＲＮＡと比べて、修飾されたｓｇＲＮＡの活性、安定性、および特異性を増加させ、かつ／または毒性を減少させることができる。修飾されたｓｇＲＮＡの非限定的な利点としては、標的細胞中への送達がより容易となること、安定性の増加、活性の継続時間の増加、および毒性の低下が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの部分として本明細書中に記載する修飾されたｓｇＲＮＡは、非修飾の配列同等物と比較して、より高頻度のオンターゲットゲノム編集（例えば、相同組換え）、活性および／または特異性の向上を提供する。

【0179】

ガイド配列の１つまたは複数のヌクレオチドおよび／またはスキャフォールド配列の１つまたは複数のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、約２０ヌクレオチドの長さのガイド配列は、１つまたはそれより多く、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の修飾ヌクレオチドを有し得る。場合によっては、ガイド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの修飾ヌクレオチドを含む。その他の場合には、ガイド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１９個、２０個、またはそれより多くの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の任意の核酸位置に位置することができる。すなわち、修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の最初および／または最後のヌクレオチドにおいてまたはその近くに、かつ／またはその間の任意の位置において、存在することができる。例えば、２０ヌクレオチドの長さのガイド配列について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の核酸の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、および／または２０位に位置することができる。ある特定の例では、ガイド配列の約１０％から約３０％、例えば、約１０％から約２５％、約１０％から約２０％、約１０％から約１５％、約１５％から約３０％、約２０％から約３０％、または約２５％から約３０％は、修飾ヌクレオチドを含み得る。その他の例では、ガイド配列の約１０％から約３０％、例えば、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％は、修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0180】

ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の５’末端（例えば、５’末端の末端ヌクレオチド）または５’末端の近く（例えば、５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）、かつ／またはガイド配列内の内部の位置に位置する。

【0181】

一部の実施形態では、修飾されたｓｇＲＮＡのスキャフォールド配列は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する。例えば、約８０ヌクレオチドの長さのスキャフォールド配列は、１つまたはそれより多く、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個の修飾ヌクレオチドを有し得る。一部の例では、スキャフォールド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの修飾ヌクレオチドを含む。その他の例では、スキャフォールド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１９個、２０個、またはそれより多くの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、スキャフォールド配列の任意の核酸位置に位置することができる。例えば、修飾ヌクレオチドは、スキャフォールド配列の最初および／または最後のヌクレオチドにおいてまたはその近くに、かつ／またはその間の任意の位置において、存在することができる。例えば、約８０ヌクレオチドの長さのスキャフォールド配列について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、配列の核酸の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、および／または８０位に位置することができる。一部の例では、スキャフォールド配列の約１％から約１０％、例えば、約１％から約８％、約１％から約５％、約５％から約１０％、または約３％から約７％は、修飾ヌクレオチドを含み得る。その他の例では、スキャフォールド配列の約１％から約１０％、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％は、修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0182】

ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、スキャフォールド配列の３’末端（例えば、３’末端の末端ヌクレオチド）または３’末端の近く（例えば、３’末端の１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）、かつ／またはスキャフォールド配列内の内部の位置に位置する。

【0183】

一部の実施形態では、修飾されたｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端（例えば、５’末端の末端ヌクレオチド）または５’末端の近く（例えば、５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる１つ、２つ、または３つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチド、およびスキャフォールド配列の３’末端（例えば、３’末端の末端ヌクレオチド）または３’末端の近く（例えば、３’末端の１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる１つ、２つ、または３つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチドを含む。

【0184】

一部の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端（例えば、５’末端の末端ヌクレオチド）または５’末端の近く（例えば、５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）に１つの修飾ヌクレオチド、およびスキャフォールド配列の３’末端（例えば、３’末端の末端ヌクレオチド）または３’末端の近く（例えば、３’末端の１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）に１つの修飾ヌクレオチドを含む。

【0185】

その他の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端（例えば、５’末端の末端ヌクレオチド）または５’末端の近く（例えば、５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる２つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチド、およびスキャフォールド配列の３’末端（例えば、３’末端の末端ヌクレオチド）または３’末端の近く（例えば、３’末端の１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる２つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチドを含む。

【0186】

さらに別の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端（例えば、５’末端の末端ヌクレオチド）または５’末端の近く（例えば、５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる３つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチド、およびスキャフォールド配列の３’末端（例えば、３’末端の末端ヌクレオチド）または３’末端の近く（例えば、３’末端の１、２、３、４、または５ヌクレオチド以内）で始まる３つの連続的なまたは不連続の修飾ヌクレオチドを含む。

【0187】

特定の実施形態では、修飾されたｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端に３つの連続的な修飾ヌクレオチドおよびスキャフォールド配列の３’末端に３つの連続的な修飾ヌクレオチドを含む。

【0188】

ｓｇＲＮＡの修飾ヌクレオチドは、リボース（例えば、糖）基、リン酸基、核酸塩基、または任意のこれらの組合せにおける修飾を含み得る。一部の実施形態では、リボース基における修飾は、リボースの２’位における修飾を含む。

【0189】

一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（tricycle-DNA）（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノ（phosphodiamidate morpholino）、またはこれらの組合せを含む。

【0190】

修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、糖および／または骨格修飾リボヌクレオチドを含む（すなわち、リン酸糖骨格への修飾を含む）ことができる。例えば、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように生来または天然のＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾することができる。一部の骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドを接続するホスホエステル基を修飾基、例えばホスホチオエート基に置換し得る。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＯＮ（Ｒは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである）から選択される基である。

【0191】

一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは糖修飾を含有する。糖修飾の非限定的な例としては、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（2'-deoxy-2'-deamine oligoribonucleotide）（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、およびこれらの組合せが挙げられる。

【0192】

一部の実施形態では、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－フルオロ、２’－アミノ、および／または２’－チオ修飾を含有する。一部の例では、修飾は、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、および／または５－フルオロ－ウリジンである。

【0193】

哺乳動物のＲＮＡには、９６より多くの天然に存在するヌクレオシド修飾が見られる。例えば、Limbachら、Nucleic Acids Research、２２巻（１２号）：２１８３～２１９６頁（１９９４年）を参照。ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号から、当該技術分野において周知である。本明細書中に記載するような使用のために好適な多数の修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。ヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドのアナログであってもよい。場合によっては、アナログは、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルウリジン、メチルシュードウリジン、チオウリジン、デオキシシチジン（deoxycytodine）、およびデオキシウリジンである。

【0194】

場合によっては、本明細書中に記載する修飾されたｓｇＲＮＡは、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドに組み込むことができる修飾核酸塩基の非限定的な例としては、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－０－メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６．－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１１（１－メチルイノシン）、ｍ’Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）（5-fonnylcytidine）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ^＊（中間体ヒドロキシワイブトシン（undermodified hydroxywybutosine））、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（クエオシン）、ｏＱ（エポキシクエオシン）、ｇａｌＱ（ガラククトシル－クエオシン）（galtactosyl-queuosine）、ｍａｎＱ（マンノシル－クエオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－０－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－ジメチルグアノシン）（4-demethyl guanosine）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ^２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７置換プリン、７－デアザ－８置換プリン、およびこれらの組合せが挙げられる。

【0195】

一部の実施形態では、修飾されたｓｇＲＮＡのリン酸骨格は変更されている。修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート、ホスホルアミデート（例えば、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホルアミデート（ＮＰ））、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、および／またはメチルホスホネート結合を含み得る。ある特定の例では、リン酸基は、ホスホチオエート、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、およびＮ３’－Ｐ５’－ホスホルアミデート（ＮＰ）などに変更されている。

【0196】

特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、またはこれらの組合せを含む。

【0197】

一部の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドを含む。その他の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。さらに他の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドおよび１つまたは複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。さらなる例では、修飾されたｓｇＲＮＡはＭヌクレオチドを含まない。ある特定の例では、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドおよび／または１つまたは複数のＭＳＰヌクレオチドを含み、１つまたは複数のＭヌクレオチドをさらに含む。ある特定のその他の例では、ＭＳヌクレオチドおよび／またはＭＳＰヌクレオチドは、修飾されたｓｇＲＮＡ中に存在する唯一の修飾ヌクレオチドである。

【0198】

本明細書中に記載する修飾のいずれかを、修飾されたｓｇＲＮＡのガイド配列および／またはスキャフォールド配列中に組み合わせ、組み込むことができることが留意されるべきである。

【0199】

場合によっては、修飾されたｓｇＲＮＡは、ステムループ（例えば、Ｍ２ステムループ）またはテトラループなどの構造修飾も含む。

【0200】

化学修飾されたｓｇＲＮＡを任意のＣＲＩＳＰＲ関連またはＲＮＡガイド化技術と共に使用することができる。本明細書中に記載するように、修飾されたｓｇＲＮＡは、任意のＣａｓ９ポリペプチド、または任意の操作されたもしくは人間により作られたＣａｓ９ポリペプチドなどのそのバリアントのためのガイドとして働くことができる。修飾されたｓｇＲＮＡは、単離された細胞中またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、動物中）でＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子をターゲティングすることができる。

【0201】

Ｄ．遺伝子改変された神経幹細胞を製造するための導入遺伝子カセット
遺伝子改変された神経幹細胞を製造するための導入遺伝子カセットは、本発明の任意の態様に関して本明細書中に記載する通りであってよい。カセットは、プロモーター（例えば、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）、転写制御エレメント、エンハンサー、Ｕ６終結配列、１つまたは複数の核局在化シグナルなどのうちの１つまたは複数を含有し得る。一部の実施形態では、カセットはマルチシストロン性または２シストロン性であり、また、蛍光タンパク質、エピトープタグ、および／または抗生物質抵抗性マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。２シストロン性カセットのある特定の例では、例えば蛍光タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａペプチドなどの自己開裂性ペプチドをコードする配列を使用して、例えば抗生物質抵抗性マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列に連結されている。口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、豚テシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、およびＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）などのウイルス２Ａペプチドは、高い開裂効率を有し、したがって２つのタンパク質が同時ではあるが、同じＲＮＡ転写物から別々に発現されることができる。例示的なカセットは、ＧＦＰの発現を駆動するユビキチンＣプロモーターを含有するレポーターカセットを含む。あるいは、自己開裂性の２Ａペプチドによって分離された２シストロン性のカセット構築物を生成することによって、２Ａペプチドの上流および下流に位置する２つの導入遺伝子の間の高い開裂効率が提供される。これらの構築物としては、（１）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８（遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の精製用のＣＤ８アルファ細胞表面マーカー）、（２）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ｔＣＤ１９（遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の精製用のトランケート型細胞表面マーカー）、（３）ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９（トランケート型ＣＤ１９を有するクラッベ病用の治療用酵素構築物）またはＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰ、および（４）ＵｂＣ－ＴＰＰ１－２Ａ－ＣＤ８（ＣＤ８アルファを有するＬＩＮＣＬ用の治療用酵素構築物）が挙げられる。

【0202】

Ｅ．遺伝子改変された神経幹細胞を単離および精製する方法
選択マーカー、検出可能なマーカー、細胞表面マーカー、および精製マーカーは、単独でまたは組合せで、本発明の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を単離および／または精製するために使用することができる。例えば、抗生物質抵抗性因子をコードする選択マーカー遺伝子の発現は、対応する抗生物質の存在下で、遺伝子改変細胞の優先的な生存を提供する一方、培養物中に存在するその他の細胞は選択的に殺傷される。あるいは、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質の発現または神経幹細胞で通常発現されない細胞表面マーカーの発現は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、または類似の方法によって、遺伝子改変された神経幹細胞が同定され、精製され、または単離されることを可能にし得る。以下の実施例において使用された好適な細胞表面マーカーは、ＣＤ８、トランケート型ＣＤ８、ＣＤ１９、およびトランケート型ＣＤ１９であるが、その他の細胞表面マーカーも同じ機能を遂げることができる。

【0203】

遺伝子改変細胞を単離または精製する方法は本明細書中に記載されており、また当該技術分野で公知である。具体的な実施例では、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳの方法が細胞表面マーカーＣＤ８またはＣＤ１９を発現するヒト神経幹細胞に対して使用された。

【0204】

遺伝子改変細胞を培養または増殖させる方法は当該技術分野で公知である。神経幹細胞およびそれらの子孫を培養する方法は公知であり、好適な培養培地、添加物、成長因子などが公知であり、かつ市販されている。通常、ヒト神経幹細胞は無血清条件下で維持および増殖される。１つの好適な培地は、Ｎ２添加物（ＧＩＢＣＯ）、線維芽細胞成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、リンパ球阻害因子（lymphocyte inhibitory factor）（１０ｎｇ／ｍｌ）、神経生存因子－１（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、およびＮ－アセチルシステイン（６０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むＥｘ Ｖｉｖｏ １５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）である。代替的な培地、添加物、および成長因子、ならびに／あるいは代替的な濃度を当業者は容易に決定することができ、それらはまた、幅広く文献に記載されている。

【0205】

一部の実施形態では、単離または精製された遺伝子改変細胞は、当業者に公知の標準的な方法にしたがってｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。

【0206】

Ｆ．ヌクレアーゼ媒介性のゲノム編集の成分の細胞中への導入
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）中に導入する方法は当該技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用して、ヌクレアーゼまたは核酸（例えば、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）、および相同組換え修復（ＨＤＲ）用のドナー鋳型など）をヒト神経幹細胞中に導入することができる。好適な方法の非限定的な例としては、エレクトロポレーション（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルスまたはバクテリオファージの感染、トランスフェクション、コンジュゲート化、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性のトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポソーム媒介性のトランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性の核酸送達などが挙げられる。

【0207】

一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼシステム（ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮなど）は神経幹細胞中に導入される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、プラスミドに基づくＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方は、神経幹細胞中に導入される前に修飾される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼシステムはＴＡＬＥＮシステムである。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムは、プラスミドに基づくＴＡＬＥＮを含む。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムは、ＲＮＡに基づくＴＡＬＥＮを含む。

【0208】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性のゲノム編集の成分は、送達システムを使用して標的細胞中に導入することができる。ある特定の例では、送達システムは、ヌクレアーゼ成分（ポリペプチドとして、または発現構築物によってコードされる）および１つまたは複数の核酸成分（ＤＮＡターゲティングＲＮＡおよび／またはドナー鋳型など）を含む、ナノ粒子、マイクロ粒子（例えば、ポリマーマイクロポリマー）、リポソーム、ミセル、ビロソーム、ウイルス粒子、核酸複合体、トランスフェクション剤、エレクトロポレーション剤（例えば、ＮＥＯＮトランスフェクションシステムの使用）、ヌクレオフェクション剤、リポフェクション剤、および／または緩衝系を含む。例えば、成分は、カプセル化またはパッケージ化されて陽イオン性のサブミクロンのＯ／Ｗエマルションとなるように、リポフェクション剤と混合することができる。あるいは、成分は、送達システムなしで例えば水溶液として、送達することができる。

【0209】

リポソームを調製し、かつポリペプチドおよび核酸をリポソーム中にカプセル化する方法は、例えば、Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols（Weissig編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９年、およびHeyesら（２００５年）J Controlled Release １０７巻：２７６～８７頁に記載されている。マイクロ粒子を調製し、かつポリペプチドおよび核酸をカプセル化する方法は、例えば、Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes)（ArshadyおよびGuyot編）、Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ、２００２年、およびMicroparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines（CohenおよびBernstein編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年に記載されている。

【0210】

Ｇ．ヒト神経幹細胞
ヒト神経幹細胞は、ＣＤ１３３＋ ＣＤ２４－／ｌｏ ＮＳＣを単離するために細胞表面マーカーを使用したUchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁に記載の方法を使用してヒト脳組織から直接単離された神経幹細胞であり得る。ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２９、およびＣＤ１５などのその他のマーカーを使用することもできる。ヒト神経幹細胞は、第２三半期のヒト胎児脳に由来し得る。原理的に、ヒト神経幹細胞に特異的に発現するあらゆるマーカー、またはヒト神経幹細胞に特徴的なマーカーのあらゆる組合せをヒト神経幹細胞の単離において使用することができる。

【0211】

ヒト神経幹細胞は、ヒトの胚、胎児、または成人の供給源に由来するものであってもよいし、あるいは胚性幹（ＥＳ）細胞および操作された多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのその他の細胞種から公知の技術を使用して誘導されたものであってもよい。ヒト神経幹細胞は、体細胞集団、例えば線維芽細胞からのダイレクトリプログラミングによって誘導されたものであってもよい。一部の実施形態では、ヒト神経幹細胞は、体性幹細胞または多能性幹細胞に由来する。ヒト神経幹細胞には、胎児脊髄および胎児脳組織などのヒト中枢神経系に由来する細胞が含まれる。ドナーから得られた初代神経幹細胞の使用は、ＣＮＳ障害の治療に直ちに適し、患者のＣＮＳに直接移植可能な細胞を提供するために、好ましい場合がある。

【0212】

本発明のヒト神経幹細胞は、自己または同種のヒト神経幹細胞であり得る。自己の幹細胞は治療される患者に由来し、したがって患者からの免疫応答を引き起こすことは期待されない。しかしながら、自己の幹細胞は、本発明による任意のさらなる改変に加えて、元々持っている疾患または障害を除去するために遺伝子の改変または矯正を必要とする可能性がある。対照的に、健常対象からの同種の、すなわちドナー由来の細胞は、本発明によって提供される改変以外の改変なしに、単離および精製して使用可能となり得る。そのような同種のヒト神経幹細胞は、本発明にしたがって遺伝子改変し、かつ大規模培養方法を使用して増殖させて、費用のかかる細胞の新たな誘導、改変、および増殖を個別に行うことなく既製品として使用できる、検証され、安全で、かつ一貫した製品を提供することができる。そのような同種細胞は、例えば標準的な凍結保存方法を使用して、調製しかつバンクに入れて、好適な患者が同定された時に使用可能な資源を提供することができる。

【0213】

神経幹細胞（ＮＳＣ）は、胚、成体組織、胎児組織、複能性幹細胞、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）もしくは操作された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞に直接由来し得る。場合によっては、多能性幹細胞は、野生型であるか、または遺伝子改変されているかのいずれかである。

【0214】

一部の実施形態では、ＮＳＣは、対象（例えば、ヒト対象）の神経系の組織から得られ、または組織に由来し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。神経組織は、正常または疾患のものであり得る。一部の実施形態では、神経組織は、中枢神経系の遺伝的障害を有する個体から得られる。他の実施形態では、神経組織は、神経変性疾患を有するまたは疾患を有することが疑われる個体からのものである。さらに他の実施形態では、神経組織は、神経学的損傷を有するまたは損傷を有することが疑われる個体からのものである。

【0215】

その他の場合には、本発明のＮＳＣは、以前に培養物中で維持された対称分裂している神経幹細胞集団からのものである。

【0216】

Ｈ．ＣＮＳの遺伝的障害、神経変性疾患、または神経損傷を治療するための導入遺伝子
一部の実施形態では、ドナー鋳型の導入遺伝子は、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする。遺伝的障害は、対応する突然変異遺伝子の野生型（正常）対立遺伝子を導入遺伝子として発現することによって治療され得る常染色体劣性の遺伝的障害であり得る。遺伝的障害は突然変異遺伝子によって引き起こされ、本明細書中に記載する導入遺伝子は、障害を治療するために使用され得る。一部の実施形態では、突然変異遺伝子を持つＮＳＣは、導入遺伝子によって突然変異遺伝子の野生型対立遺伝子を発現するように遺伝子改変され得る。導入遺伝子は、通常、３つの分類：（１）分泌タンパク質、（２）望まれないタンパク質および／または瘢痕組織を開裂または消化する細胞表面酵素、例えばメタロエンドペプチダーゼ（例えば、ネプリライシン）、および（３）調節可能なＢＣＬ２などの細胞内タンパク質のうちの１つに属する。

【0217】

本発明での使用のための例示的な導入遺伝子としては、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）、ＵＳＨ２Ａ（網膜色素変性症）、ＲＰＧＲ（網膜色素変性症）、ＲＰ２（網膜色素変性症）、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト）、ＲＳ－１（Ｘ連鎖性網膜分離）が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される。

【0218】

Ｉ．中枢神経系の遺伝子疾患、神経変性疾患、神経学的損傷、および網膜変性疾患。
本明細書中に記載する疾患、障害、および状態としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、網膜細胞などに影響を及ぼすものが挙げられる。本明細書中に記載する組成物、キット、および方法を使用して治療され得るそのような神経学的な疾患、障害、および状態としては、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、記憶障害、癲癇、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、網膜症、視神経症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ミエリン疾患、多発性硬化症、卒中、脳性麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病などの遺伝性小児白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症およびクラッベ病、異染性白質ジストロフィー、テイ・サックス病、脊髄の損傷または外傷が挙げられる。本明細書中に記載する疾患、障害、および状態としてはまた、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中が挙げられる。本明細書中に記載する疾患、障害、および状態としてはまた、網膜変性疾患が挙げられる。

【0219】

Ｊ．ＧＭ－ＮＳＣを使用するための方法
本明細書中に記載するＧＭ－ＮＳＣは、疾患の治療のために有用である。一部の実施形態では、神経変性疾患を治療する方法であって、導入遺伝子を含む複数の遺伝子改変された神経幹細胞を対象に投与することを含み、導入遺伝子が、セーフハーバー遺伝子座（本明細書中に記載するＧＭ－ＮＳＣ細胞のいずれかなど）に挿入される、方法が提供される。

【0220】

本明細書中に記載するＧＭ－ＮＳＣは、疾患の予防のために有用である。一部の実施形態では、神経変性疾患を予防する方法であって、導入遺伝子を含む複数の遺伝子改変された神経幹細胞を対象に投与することを含み、導入遺伝子が、セーフハーバー遺伝子座（本明細書中に記載するＧＭ－ＮＳＣ細胞のいずれかなど）に挿入される、方法が提供される。

【0221】

遺伝子改変されたヒト神経幹細胞をヒト対象中に投与して、神経変性疾患または神経学的損傷の１つまたは複数の症状を予防または軽減することができる。一部の実施形態では、生成された遺伝子改変された神経幹細胞をヒト対象に投与して、神経変性疾患の１つまたは複数の症状を予防または軽減することができ、ここで神経変性疾患は、白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される。

【0222】

本明細書中に記載する神経変性疾患または神経学的損傷としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、網膜細胞などに影響を及ぼすものが挙げられる。そのような神経変性疾患または神経学的損傷としては、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、記憶障害、癲癇、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、網膜症、視神経症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ミエリン疾患、多発性硬化症、卒中、脳性麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病などの遺伝性小児白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症およびクラッベ病、異染性白質ジストロフィー、テイ・サックス病、脊髄の損傷または外傷が挙げられる。本明細書中に記載する神経変性疾患または神経学的損傷としてはまた、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中が挙げられる。本明細書中に記載する神経変性疾患または神経学的損傷としてはまた、網膜変性疾患が挙げられる。

【0223】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される神経保護または神経変性タンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、神経保護または神経変性タンパク質をコードし、神経保護または神経再生タンパク質は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、導入遺伝子はＢｃｌ－２をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子はテロメラーゼをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、生存を向上させて、または神経幹細胞を若返らせて、長期生存および／または治療用分子の発見を促進できるタンパク質をコードする。

【0224】

一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、治療または投与される同じ対象に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された神経幹細胞は、別の１または複数の対象に由来する。例えば、１または複数の健常対象からの同種の、すなわちドナー由来の細胞を遺伝子改変して、患者対象に投与することができる。

【0225】

一部の実施形態では、神経変性疾患を治療する方法であって、１）複数の対象から同種のヒト神経幹細胞を単離すること、２）セーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を挿入することによって、単離されたヒト神経幹細胞を遺伝子改変すること、３）遺伝子改変された単離されたヒト神経幹細胞を増殖させること、４）複数の前記遺伝子改変された神経幹細胞を対象に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、そのような同種のヒト神経幹細胞は、本発明にしたがって遺伝子改変し、かつ大規模培養方法を使用して増殖させて、費用のかかる細胞の新たな誘導、改変、および増殖を個別に行うことなく既製品として使用できる、検証され、安全で、かつ一貫した製品を提供することができる。一部の実施形態では、そのような同種細胞は、例えば標準的な凍結保存方法を使用して、調製しかつバンクに入れて、好適な患者が同定された時に使用可能な資源を提供することができる。

【0226】

一部の実施形態では、神経変性疾患を治療する方法であって、１）患者からヒト神経幹細胞を単離すること、２）セーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を挿入することによって、単離されたヒト神経幹細胞を遺伝子改変すること、３）複数の前記遺伝子改変された神経幹細胞を前記患者に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、前記患者に投与する前に、遺伝子改変された単離されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む。

【0227】

投与される遺伝子改変された神経幹細胞の数、および投与経路は、異なる疾患標的に応じて変化する。例えば、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を治療するために、通常、５億～１０億の神経幹細胞が脳（すなわち、皮質下の部位または側脳室）への直接注射で投与される。追加の詳細については、Seldenら、J Neurosurg Pediatr. ２０１３年６月；１１巻（６号）：６４３～５２頁を参照。別の例として、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）を治療するために、３億の神経幹細胞が脳への直接注射で投与される。より詳細については、Guptaら、Sci Transl Med. ２０１２年１０月１０日；４巻（１５５号）：１５５ｒａ１３７を参照。別の例として、ＮＣＬまたはＰＭＤを治療するために、２０００万～４０００万の神経幹細胞が脊髄に直接注射される。別の例として、加齢黄斑変性を治療するために、１０万～２００万の神経幹細胞が網膜下注射または硝子体内注射により投与される。

【0228】

投与方法は、通常、免疫抑制対象中に本発明の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を移植することを伴う。移植された細胞、組織、または器官への免疫応答を回避するための免疫抑制は、移植外科および細胞療法の分野で周知であり、好適な剤および方法が広く利用可能である。免疫抑制薬としては、プレドニゾンおよびプレドニゾロンなどのグルココルチコイド、メトトレキサート、アザチオプリン、およびメルカプトプリンなどの細胞増殖抑制剤、抗ＩＬ－２受容体抗体バシリキシマブおよびダクリズマブなどの抗体、シクロスポリンなどのイムノフィリンに作用する薬物、ならびに、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質、およびミコフェノール酸などのその他の薬物を挙げることができる。次いで、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が、治療される疾患または状態に対して適切な部位、通常、脳または脊髄の予め定められた領域に投与される。

【0229】

本発明の神経幹細胞および医薬担体を含む医薬組成物が提供される。

【0230】

本発明の文脈において好適な薬学的に許容される担体は公知であり、細胞、生物体、または対象への活性剤の投与を助ける物質が挙げられる。「薬学的に許容される担体」は、本発明の組成物中に含まれることができ、かつ患者に対して有意な有害の毒性効果を引き起こさない担体または医薬品添加物を指す。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水溶液、乳酸リンゲル液、生理的スクロース、生理的グルコース、細胞培養培地などが挙げられる。

【0231】

本発明の神経幹細胞およびそのような細胞を含む医薬組成物は、単回用量または複数回用量（例えば、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約６ヶ月、または約１２ヶ月の間隔で投与される２回用量）として投与され得る。その他の好適な投与スケジュールは、医師によって決定され得る。

【0232】

潜在的な治療用分子を同定または開発するために、本明細書中に記載する方法によって製造されたＧＭ－ＮＳＣを使用する方法も本明細書中で提供される。例えば、一部の実施形態では、ＧＭ－ＮＳＣに対して効果を有する治療用分子を同定する方法であって、ＧＭ－ＮＳＣを治療用分子と接触させること、およびＧＭ－ＮＳＣに対する治療用分子（therapeutic moelecule）の効果を決定することを含む方法が提供される。治療用分子は、例えば、自己複製、遊走、またはミエリン形成を増進する薬物であり得る。治療用分子はまた、精神医学的または神経変性、および網膜変性を治療する薬物であり得る。治療用分子の非限定的な例としては、レチノイン酸、ブチル酸ナトリウム、アミトリプチリン、フルオキセチン、セルトラリン、カルバマゼピン、バルプロエート、ＫＨＳ１０１、オキサジアゾール化合物、ホスホセリン、Ｐ７Ｃ３、アトルバスタチン、メトホルミンが挙げられる。方法はまた、小分子または生物学的分子をスクリーニングして、特定のシグナル経路に関与する潜在的な治療用分子を同定することも含み得る。シグナル経路の非限定的な例としては、自己複製、遊走、ミエリン形成、および分化が挙げられる。

【0233】

Ｋ．キット
本発明はまた、（ａ）（ｉ）導入遺伝子（例えば、プロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞とを含むキットも提供する。単離された神経幹細胞は、ＣＤ１３３＋ ＣＤ２４－／ｌｏ ＮＳＣを単離するために細胞表面マーカーを使用したUchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁に記載の方法を使用してヒト脳組織から直接単離されたＮＳＣであり得る。

【0234】

ＤＮＡヌクレアーゼは、本発明の他の態様、すなわち本発明の方法、細胞、および／または医薬組成物に関して本明細書中に定義した通りである。

【0235】

細胞中にヌクレアーゼ媒介性のゲノム編集の成分を導入するためのエレクトロポレーション剤またはその他の剤もまた、本発明のキットに含まれ得る。好適な剤は当該技術分野で公知であり、広く市販されている。細胞への成分の送達方法（例えば、エレクトロポレーション）は本明細書中に記載されており、周知である。

【0236】

Ｌ．例示的な実施形態
本出願の一態様は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置する、セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型、ならびに（ｂ）セーフハーバー遺伝子座に二本鎖切断を作製してセーフハーバー遺伝子座への導入遺伝子の挿入を誘発できるＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、単離されたヒト神経幹細胞中に導入し、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成することを含む方法を提供する。

【0237】

上記の方法による一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0238】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、単離されたヒト神経幹細胞は初代神経幹細胞を含む。

【0239】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、単離されたヒト神経幹細胞は、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される。

【0240】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、導入遺伝子は、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、タンパク質は、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ－２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）、ＵＳＨ２Ａ（網膜色素変性症）、ＲＰＧＲ（網膜色素変性症）、ＲＰ２（網膜色素変性症）、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト）、ＲＳ－１（Ｘ連鎖性網膜分離）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、タンパク質は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される。

【0241】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、導入遺伝子は、神経保護または神経再生タンパク質、これらのバリアント、これらの断片、またはこれらのペプチド模倣体をコードする。一部の実施形態では、神経保護または神経再生タンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－２（ＮＴ－２）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、ニューロトロフィン－６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、神経保護または神経再生タンパク質は分泌タンパク質である。一部の実施形態では、導入遺伝子はＢｃｌ－２をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子はテロメラーゼをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、生存を向上させて、または神経幹細胞を若返らせて、長期生存および／または治療用分子の発見を促進できるタンパク質をコードする。

【0242】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、ドナー鋳型は異種プロモーターを含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型の異種プロモーターは、誘導性プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを含む。

【0243】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列はＲＮＡを含む。

【0244】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、方法は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、またはＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくはトランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣａｓポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列およびＣａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはこれらの断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドのバリアントは、高忠実度のまたは特異性が増進されたＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡは１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはこれらの組合せにおける修飾を含む。一部の実施形態では、リボース基における修飾は、リボース基の２’位における修飾を含む。一部の実施形態では、リボース基の２’位における修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、リン酸基における修飾はホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くは修飾ヌクレオチドであり、かつ／または第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くは修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１０％から約３０％は修飾ヌクレオチドであり、かつ／または第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１％から約１０％は修飾ヌクレオチドである。

【0245】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む。

【0246】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、導入することはエレクトロポレーションを含む。

【0247】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、ドナー鋳型は選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、中枢神経系の細胞で発現されないマーカーを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは細胞表面タンパク質である。一部の実施形態では、細胞表面タンパク質は、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、これらのバリアント、これらの断片、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0248】

上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、方法は、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞による選択マーカーの発現に基づいて、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を精製することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、精製された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む。

【0249】

本出願の別の態様は、上記の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を提供する。

【0250】

本出願の別の態様は、上記の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0251】

本出願の別の態様は、それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法であって、有効量の上記の医薬組成物をヒト対象に投与することを含む方法を提供する。

【0252】

上記のヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法による一部の実施形態では、方法は、白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される神経変性疾患の治療用である。一部の実施形態では、方法は、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、白質の消失を伴う白質脳症、副腎白質ジストロフィー、レフサム病、およびゼノベファントーシス（xenobefantosis）からなる群から選択される白質ジストロフィーの治療用である。一部の実施形態では、方法は、脊髄損傷、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中からなる群から選択される神経学的損傷の治療用である。

【0253】

上記のヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は対象に対して自己である。一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞は対象に対して同種である。

【0254】

上記のヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、投与することは、注射または外科的移植によって投与することを含む。

【0255】

本出願の別の態様は、（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置する、セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型、（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、および（Ｃ）単離されたヒト神経幹細胞を含む、キットを提供する。

【0256】

上記のキットによる一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0257】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、単離されたヒト神経幹細胞は初代神経幹細胞を含む。

【0258】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、単離されたヒト神経幹細胞は、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される。

【0259】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、導入遺伝子は、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、神経保護または神経再生タンパク質、これらのバリアント、これらの断片、またはこれらのペプチド模倣体をコードする遺伝子を含む。

【0260】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列はＲＮＡを含む。

【0261】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、またはＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくはトランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣａｓポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列およびＣａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはこれらの断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドのバリアントは、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡは１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル、３’－チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0262】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む。

【0263】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、ドナー鋳型は選択マーカーをさらに含む。

【0264】

上記のキットのいずれか１つによる一部の実施形態では、キットは、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するための説明書をさらに含む。

【0265】

本出願の別の態様は、導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを含む遺伝子改変されたヒト神経幹細胞であって、導入遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座内に位置する、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を提供する。

【0266】

本出願の別の態様は、潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、上記の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞のいずれか１つまたは上記の方法のいずれか１つによって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用を提供する。一部の実施形態では、潜在的な治療用分子は、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である。

【0267】

本出願の別の態様は、研究における、上記の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞のいずれか１つまたは上記の方法のいずれか１つによって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用を提供する。

【実施例】

【0268】

Ｖ．実施例
以下の実施例は、特許請求された発明を限定するためではなく、説明するために与えられる。

【0269】

これらの実施例は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの操作されたヌクレアーゼを使用する遺伝子改変されたヒト神経幹細胞（ＧＭ－ＮＳＣ）の生成を示す。セーフハーバー遺伝子座への相同組換えを使用して、細胞の精製用のマーカーおよび目的の遺伝子を含有する外来の導入遺伝子を神経幹細胞中に導入した。本実施例は、ＧＭ－ＮＳＣを生成するための方法および操作された細胞を精製するための方法を記載する。これらの実施例はまた、精製されたＧＭ－ＮＳＣが、動物モデルの脳に移植された時に、生着し、遊走し、かつ神経細胞種に分化したことも示す。

【0270】

ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）（ニューロスフェアとして成長させたヒト神経幹細胞）中のセーフハーバー用の相同組換え（ＨＲ）のために、３つのヒト遺伝子座を選択した。これらの遺伝子座は、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するＨＲのために、血液障害について大規模に特徴付けられてきた：（ｉ）ＩＬ２ＲＧは、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）－Ｘ１に関与する突然変異を抱えることがあり、（ｉｉ）ＨＢＢは鎌状赤血球症およびサラセミアに関与する突然変異を抱えることがあり、また（ｉｉｉ）ＣＣＲ５は、ＨＩＶの補助受容体をコードし、抗ＨＩＶ臨床試験において治療用の遺伝子編集のための標的として現在調査されている。これらの遺伝子座は、悪影響なしでＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞のゲノム中への外来の導入遺伝子の安定な遺伝子発現を可能とする「セーフハーバー」として働くことができる。

【0271】

Ａ．方法
ＴＡＬＥＮ媒介性のゲノム編集アセンブリーを構築するために、以前に記載された通りに（Millerら、Nature Biotechnology、２０１１年、２９巻：１４３～１４８頁）Δ１５２ Ｎ末端ドメインおよび＋６３ Ｃ末端ドメインを使用してＩＬ２ＲＧ ＴＡＬＥＮを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、記載された通りに（Hendelら、Cell Report、２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．０４０）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。

【0272】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のゲノム編集アセンブリーを構築するために、ヒトコドンに最適化されたＳｐＣａｓ９発現カセットおよびキメラｓｇＲＮＡの発現を駆動するヒトＵ６プロモーターを含有するｐｘ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）中に２０ｂｐのオリゴヌクレオチド標的配列をクローニングすることによって、ｓｇＲＮＡ発現ベクターを構築した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡの合成は、Hendelら、Cell Report、２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．０４０に詳細に記載されている。

【0273】

ターゲティングベクターのために、Ｋ５６２細胞から単離されたゲノムＤＮＡを使用する対応する遺伝子座のＰＣＲ増幅によって、相同の約２×８００ｂｐのアームを持つ３つのプラスミドターゲティングベクターを生成した。次いで、標準的なクローニング方法を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋に基づく約２，９００塩基対のベクター中に相同アームをクローニングした。上掲のHendelら、および追加の詳細のためにHendelら、Nature Biotechnology、２０１５年、３３巻：９８５～９８９頁を参照。ドナー鋳型は相同アームの間に、ＧＦＰの発現を駆動するユビキチンＣプロモーターを含有するレポーターカセットを含んでいた（図２Ａ）。あるいは、自己開裂性の２Ａペプチドによって分離された２シストロン性のカセット構築物を生成することによって、２Ａペプチドの上流および下流に位置する２つの導入遺伝子の間の高い開裂効率を提供した（図８）。構築物は、（１）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８（ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞の精製用のＣＤ８アルファ細胞表面マーカー；図１１Ａおよび１３Ａ）、（２）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ｔＣＤ１９（ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞の精製用のトランケート型細胞表面マーカー）、（３）ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９（トランケート型ＣＤ１９を有するクラッベ病用の治療用酵素構築物；図１２Ａ）またはＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰ（図９Ａ）、および（４）ＵｂＣ－ＴＰＰ１－２Ａ－ＣＤ８（ＣＤ８アルファを有するＬＩＮＣＬ用の治療用酵素構築物）を含んでいた。

【0274】

Uchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁に記載の方法を使用して、ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞をヒト脳組織から直接単離した。ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞は非ＧＭＰ条件下で生成した。Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、および白血病抑制因子（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中、１×１０^５／ｍｌの密度で細胞を培養した。ニューロスフェアをリベラーゼまたはベンザイムで継代し（すなわち、高度に精製したコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）での処理）、同じ培地中に再播種した。ＣＤ１３３＋ ＣＤ２４－／ｌｏ ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞を単離するために細胞表面マーカーを使用した。

【0275】

ヌクレオフェクションを使用して、単離したＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）中に遺伝子ターゲティングドナー鋳型を導入した。（別段の記載がなければ、）Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラムＣＡ１３７）、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｖ４ＸＰ－３０３２）、２０μＬの１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを用い、製造者の説明書にしたがい、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）によって５×１０^５個のＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞の単一懸濁液に１μｇのＴＡＬＥＮをコードするプラスミドおよび１～２μｇのドナープラスミドをトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞をフラスコに入れ、複数継代にわたって培養を続けた。場合によっては、培養したＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞を、上掲のUchidaらに記載のコラゲナーゼによる解離でのゲノム編集のために使用した。

【0276】

８００ｂｐの相同アームの間にＡｆｌＩＩ制限酵素部位を導入することによって、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）相同組換えドナーを作製した。（ＣＭＶプロモーター下の）Ｃａｓ９および（Ｕ６プロモーター下の）ｓｇＲＮＡをｐｘ３３０プラスミド構築物（１μｇ）中で送達した。ゴールデンゲートシステムを用いてＴＡＬＥＮペアを構築し、プラスミド構築物（各０．５μｇ）を介して送達した。１μｇのＨＲドナー鋳型または１μｇのＨＲドナーのいずれかおよび操作されたヌクレアーゼを、５００，０００個の神経幹細胞にヌクレオフェクトした。細胞を７日間、培養物中で成長させた。ゲノムＤＮＡを回収し、Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を単離し、ＡｆｌＩＩで終夜消化した。消化産物を１０％のＰＡＧＥゲルに流し、バンド強度を可視化した。ＲＦＬＰ分析により、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座へのドナー鋳型のＧＦＰ導入遺伝子の挿入を確認した。

【0277】

フローサイトメトリーを使用して相同組換えをモニターした。ヌクレオフェクション後の各継代においてＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞を分析した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＧＦＰの発現を測定した。場合によっては、各継代において導入遺伝子ＣＤ８またはＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって評価した。継代においてニューロスフェアを上記の通りに解離させ、製造者の説明書にしたがって抗ＣＤ８－ＡＰＣまたは抗ＣＤ１９－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｎｅｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単一細胞懸濁液を免疫染色した。

【0278】

ＧＦＰ導入遺伝子の挿入を持つＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞を精製するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した。ニューロスフェアを上記の通りに解離させ、ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で選別した。

【0279】

磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によってもＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣを精製した。ＣＤ８またはＣＤ１９のいずれかの導入遺伝子の細胞表面マーカーを発現するＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞を精製するために、ヒトＣＤ８マイクロビーズまたはＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のいずれかを製造者の説明書にしたがって使用した。

【0280】

精製したＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞の生着、遊走、神経保護、および網膜保護を試験するために、細胞を様々な免疫不全マウスに移植した。ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞の懸濁液（部位あたり１μＬ中に１×１０^５個の細胞）を調製し、新生または若年シバラー免疫不全（Ｓｈｉ－ｉｄ）マウスの脳梁、ＳＶＺ、または小脳白質の両側に移植した。

【0281】

Ｂ．ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰドナー鋳型
図２Ａは、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座に相同組換えされるＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰ相同組換えドナー鋳型の模式図を示す。各フランキングアームは、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン１の約８００ｂｐを含んでいた。ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞に１μｇのＨＲドナーまたは１μｇのＨＲドナーおよびヌクレアーゼをヌクレオフェクトした。細胞を７０日間成長させ、エピソームＨＲドナーが増殖する細胞から希釈されて消失するまで約１０日毎にＦＡＣＳを行って、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座に組み込まれたＧＦＰカセットの安定発現を確認した。ＩＬ２ＲＧはＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞中での操作されたヌクレアーゼを使用するＨＲのために好適な遺伝子座であることがデータにより確認される。

【0282】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座においてより高い頻度の遺伝子編集を刺激した。図１Ａおよび１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびＴＡＬＥＮシステムの両方が相同組換え（ＨＲ）を約１～６％の頻度で媒介したことを示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはＴＡＬＥＮシステムよりも２倍多くＨＲ事象を媒介した。

【0283】

長期間安定なＧＦＰ発現のレベル（２～４％のＧＦＰ）は、ＲＦＬＰ分析において決定された相同組換えのパーセンテージ（１．７～３％のＨＲ頻度）と合致していた（図２Ｂおよび２Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して遺伝子編集されたＧＦＰ^＋ ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞の画像を図３に提供する。

【0284】

図４Ａは、ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰドナー鋳型を持つＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞が移植後にシバラーマウスの脳に生着したことを示す。図４Ｂは、ＧＦＰ陽性ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞がミエリン産生ＧＭ－オリゴデンドロサイトに成長したことを示す。

【0285】

Ｃ．ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する相同組換え頻度の増加
プラスミドに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞の遺伝子編集効率を、ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する場合に対して比較した。Ｃａｓ９はｍＲＮＡとして送達し、５’末端および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込んだ２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を含む化学修飾を含んでいた。ＨｕＣＮＳ－ＳＣにプラスミドに基づくヌクレアーゼおよびＲＮＡに基づくヌクレアーゼをヌクレオフェクトした。培養７日後にゲノムＤＮＡを回収し、ＰＣＲを行ってターゲティングされた領域を増幅した。図５は、ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがプラスミドに基づくシステムと比べてより多くの二本鎖切断（ＩＮＤＥＬＳ）を誘発したことを示す。
ＨＲ頻度をＦＡＣＳによっても評価した。ＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞にＨＲドナー単独またはＨＲドナーおよび操作されたヌクレアーゼ（プラスミド（図６Ａ）またはＭＳ修飾ＲＮＡもしくはＭＳＰ ＭＳ修飾ＲＮＡ（図６Ｂ））をヌクレオフェクトした。細胞をＦＡＣＳによって計３０日間、１０日毎に分析し、エピソームＨＲドナーを希釈により消失させた。このデータも、ＭＳＰ修飾ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がＣａｓ９のプラスミド送達と比べて約２倍、ＨＲ頻度を増加させたことを示す。ＭＳ修飾はＩＮＤＥＬ効率を増加させても、ＨＲ活性は増進させなかった。

【0286】

Ｄ．ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＧＦＰドナー鋳型
図７は、例示的なＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＧＦＰドナー鋳型の模式図を示す。操作されたヌクレアーゼは、ドナー鋳型を介した相同組換え修復によって修復できる二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発することができる。遺伝子座特異的な相同アーム（ＩＬ２ＲＧ特異的なフランキングアーム）を有するドナー鋳型（ユビキチンＣプロモーター－ガラクトシルセラミダーゼ導入遺伝子－２Ａ－ＧＦＰ導入遺伝子）と共にヌクレアーゼを共送達することによって、ドナー鋳型をＩＬ２ＲＧ遺伝子座に挿入することができる。

【0287】

この実験では、単離されたＨｕＣＮＳ－ＳＣに１μｇのＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＧＦＰドナー鋳型を単独で、または１μｇのＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＧＦＰドナー鋳型と操作されたヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮ）との組合せをヌクレオフェクトした。細胞を７０日間成長させ、エピソームのドナー鋳型が増殖する細胞から希釈されて消失するまで約１０日毎にＦＡＣＳを行い、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座に組み込まれたＧＦＰカセットの安定発現を確認した。細胞を５６日間培養した後、選別してＧＦＰ陽性細胞を選択した。次いで、これらの細胞をさらに１４０日間選別した。

【0288】

図８は、精製されたＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞中で導入遺伝子が安定に発現されたこと、およびＧａｌＣおよびＧＦＰの発現が長期培養（ヌクレオフェクション後、約１６８日）において維持されたことを示す。エピソームＨＲドナー鋳型を希釈により消失させた３０日の後、ＧＦＰ陽性細胞の選別により、遺伝子編集されたＨｕＣＮＳ－ＳＣ（登録商標）細胞の純粋な集団が濃縮されたことがデータにより確認される。

【0289】

ＰＣＲ分析を行って、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座へのＧａｌＣ遺伝子のターゲティングされた組込みを確認した。フォワードプライマーはＧａｌＣ導入遺伝子中に置かれ、リバースプライマーは３’相同アームの外に位置し、ドナー鋳型中には存在しない。そのため、ＰＣＲではターゲティングされた組込みのみが増幅されるはずであり、２３５５塩基の長さの予想されたアンプリコンが生成された。単離されたＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞に１μｇのＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＧＦＰドナー鋳型およびＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼのいずれかをヌクレオフェクトした。細胞を７日間培養し、ゲノムＤＮＡを回収した。Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流した。図９Ｂにより、ＧａｌＣドナーによる操作されたヌクレアーゼ媒介性の相同組換え修復が確認される。

【0290】

フローサイトメトリーによりＧＦＰ^＋細胞を精製し、長期の培養／増殖（１６０日を超える）のために継代した。精製の際に、ＧＦＰの発現およびＳｏｘ２の発現をモニターした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で操作された細胞について、図１０Ａは、ＧＦＰの発現が増殖後に安定であったこと、および選別および増殖した細胞はＳｏｘ２陽性であったことを示す。図１０Ｂは、ＴＡＬＥＮで操作された細胞についての類似の結果を示す。

【0291】

Ｅ．ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型およびＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９ドナー鋳型
上記のＧＦＰ導入遺伝子をＣＤ８またはＣＤ１９（もしくはトランケート型ＣＤ１９）細胞表面マーカーのいずれかに置き換えた。例えばＣＤ８またはＣＤ１９選択マイクロビーズを使用して、これらのマーカーを発現する細胞を選択的に精製することができる。図１１Ａおよび１３Ａは、例示的なＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型の模式図を示す。図１２Ａは、例示的なＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型の模式図を示す。

【0292】

単離されたＨｕＣＮＳ－ＳＣに１μｇのＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＣＤ８ドナー鋳型またはＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９ドナー鋳型、およびＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼのいずれかをヌクレオフェクトした。

【0293】

ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－２Ａ－ＣＤ８導入遺伝子を発現する細胞のフローサイトメトリー分析を図１１Ｂ（ＭＡＣＳ選択前）および１１Ｃ（ＭＡＣＳ選択後）に示す。ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞の分化能力を評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン分化アッセイのために、マイトジェン無しでＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを添加して１０日間ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞を培養した。ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣは複能性であり、ニューロン（ダブルコルチン）、アストロサイト（ＧＦＡＰ）、およびオリゴデンドロサイト（Ｏ４、１４日目；図１１Ｄ）の系列に分化することができた。

【0294】

細胞表面マーカーＣＤ８およびＧＦＰの発現について、ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ＣＤ８導入遺伝子を発現する細胞の別の集団を分析した。図１３Ｂ（ＭＡＣＳ選択前）および１３Ｃ（ＭＡＣＳ選択後）は、選択後のＣＤ８^＋、ＧＦＰ^＋細胞の増加を示す。図１３Ｄは、ＣＤ８選択カラムを通過した細胞がＣＤ８^－、ＧＦＰ^－細胞であったことを示す。図１３Ｅは、ＣＤ８選択細胞の高いパーセンテージがＧＦＰ＋でもあることを示す。ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞を増殖させたところ、ＧＦＰはこれらの細胞中で安定であった（図１３Ｆ）。新生シバラーマウスへの移植のために単一細胞の懸濁液を調製した。移植の１２週後に、マウスの脳切片を分析した。ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞のロバストな生着および遊走が観察された（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。

【0295】

ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９導入遺伝子を発現する細胞のフローサイトメトリー分析を図１２Ｃ（ＭＡＣＳ選択前）および１２Ｄ（ＭＡＣＳ選択後）に示す。精製したところ、ＧＭ－ＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞は長期の培養／増殖の間、導入遺伝子の発現を保持した（図１２Ｂ）。

【0296】

Ｆ．ＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを伴うＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９ドナー鋳型
この実験では、単離されたＨｕＣＮＳ－ＳＣ細胞に１μｇのＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９ドナー鋳型およびプラスミドに基づくｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡを有するＭＳＰ修飾したｓｇＲＮＡのいずれかをヌクレオフェクトした。細胞表面マーカーｔＣＤ１９を使用して細胞を精製し、選択した細胞をさらに増殖させた。精製戦略を使用して、ＣＤ１９陽性細胞の純粋な集団を生成した。増殖後、精製された集団は細胞表面のＣＤ１９の発現を維持した。データは、プラスミドに基づくＣａｓ９を使用した場合と比べて、ＭＳＰ修飾はＨＤＲ頻度を増加させたことを示す。図１５Ａ～１５Ｆを参照。

【0297】

Ｇ．ＮＳＣにおけるＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の相同組換え（ＨＲ）
最初に、ＩＬ２Ｒγ特異的ＴＡＬＥＮペアおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＮＳＣ中でＮＳＣの「セーフハーバー」遺伝子座、インターロイキン－２受容体ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒγ）におけるゲノム編集効率を比較した。遺伝子付加用の神経幹細胞の細胞特異的セーフハーバーを２つの基準で分類した：１）ＮＳＣにおいて公知のまたは報告された生物学的機能がない、および２）外来プロモーターによる内因性遺伝子座での十分な遺伝子発現。これらの両方はＮＳＣにおいてＩＬ２Ｒγに当てはまる。誘発されたＤＳＢの頻度を特徴付けるために、最適化されたＩＬ２Ｒγ特異的ＴＡＬＥＮペアまたはＣＲＩＳＰＲ成分（Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレートし、細胞を７日間培養し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した後、ＩＮＤＥＬ頻度を分析した。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＡＬＥＮを使用しての５％と比較して、平均で１５％のＩＮＤＥＬを生成した（図３３Ａ）。次に、化学修飾したｓｇＲＮＡ（「全ＲＮＡ」）と共に、Ｃａｓ９のｍＲＮＡ送達に対してＩＬ２Ｒγ ＴＡＬＥＮペアのｍＲＮＡ送達を比較した。全ＲＮＡのＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＮＳＣへのエレクトロポレーションは、ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡ送達よりも５倍多いＩＮＤＥＬを誘発した（図３３Ｂ）。操作されたヌクレアーゼシステムの両方が（異なる頻度ではあるが）ＤＳＢを誘発したので、相同ＩＬ２Ｒγ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰドナーカセット（図１６）をコードするプラスミド、または単一のヌクレオチド変化を導入したプラスミドを用いて、ＨＲについてＮＳＣにターゲティングした。ターゲティングしたＮＳＣを少なくとも３０日間培養して、エピソームのドナー発現を希釈により消失させ、安定に組み込まれたカセットのＨＲのＧＦＰ ＦＡＣＳ分析を可能にした。両方の操作されたヌクレアーゼプラットフォームのプラスミドに基づく送達は平均で３．５％のＮＳＣにおいて安定なＧＦＰの発現を媒介したが（図３３Ｃ）、ＣＲＩＳＰＲシステムの一貫性は、より多くのＩＬ２Ｒγ対立遺伝子を改変した（図３３Ｄ）。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲシステムがＴＡＬＥＮより優れており、したがって本明細書中に記載する残りの研究のために使用されるヌクレアーゼであることを示唆した。

【0298】

次に、ＣＲＩＳＰＲシステムが２つの他のＮＳＣの「セーフハーバー」遺伝子座、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）およびβ－グロビン（ＨＢＢ）遺伝子を編集できるかどうかを試験した。これらのいずれも、ヒトの神経発生の間に機能するという報告はない（そしてそれが、それらがＮＳＣにおいてターゲティングするために安全な遺伝子座であると本発明者らが考えた理由である）。Ｃａｓ９ならびにＩＬ２Ｒγ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５に特異的なｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをＮＳＣ中にエレクトロポレートし、７日後にｇＤＮＡを抽出し、ＩＮＤＥＬ頻度について対立遺伝子を分析した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＩＬ２Ｒγ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５遺伝子座において、平均でそれぞれ１２％、６％、および３６％のＩＮＤＥＬを誘発した（図１８）。本発明者らの以前の報告に合致して、ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９および化学修飾したｓｇＲＮＡの送達は、試験した３つ全ての遺伝子座においてプラスミド送達よりも多くのＩＮＤＥＬを誘発した（図１８）。ＤＳＢの形成が３つ全ての遺伝子座においてＨＲを促進したかどうかを確かめるために、ＧＦＰをコードする相同ＤＮＡドナー鋳型、およびプラスミドまたは全ＲＮＡとして送達される対応するＣＲＩＳＰＲ成分を共にＮＳＣに共エレクトロポレートした。本発明者らの結果は、３つ全ての遺伝子座が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９成分のプラスミドまたは全ＲＮＡ送達を使用するＮＳＣにおけるＨＲに適していることを示した（図１９および図１７Ａ～１７Ｂ）。ＣＲＩＳＰＲのプラスミド送達によるＩＬ２Ｒγ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５遺伝子座でのＮＳＣへのターゲティングは、培養の少なくとも３０日後に平均でそれぞれ２．８％、４．１％、および２．４％のＧＦＰ^＋ ＮＳＣを生じさせた（図２０）。興味深いことに、ＩＬ２Ｒγ ＣＲＩＳＰＲの全ＲＮＡの送達は、プラスミド送達よりも２倍多くのＧＦＰ^＋ ＮＳＣを生じさせた。ＨＲが意図した遺伝子座で起こったかどうかを決定するために、Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲ（一方のプライマーがドナー構築物の相同アームの外で結合し、他方のプライマーがドナーカセット内で結合する）によってドナー構築物のオンターゲット組込みについてｇＤＮＡを分析し、したがって、オンターゲット組込み事象のみを増幅することができる。ｍｏｃｋまたはドナーのみの試料ではＰＣＲ増幅が検出されなかったが、ＣＲＩＳＰＲおよび相同ドナーを共にＮＳＣに共エレクトロポレートした時にオンターゲット組込みが明らかであり、意図した遺伝子座でのＨＲが確認された（図２１）。Ｃａｓ９は意図しないゲノム上の位置においてＤＳＢを作製することがあるので、Ｋ５６２細胞中での次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって以前にアッセイした３つの予測されるＩＬ２Ｒγオフターゲット部位においてオフターゲットＤＳＢ活性を調査した。ＩＬ２Ｒγにおいて２８％のＤＳＢ活性を検出したが、０．７％未満の開裂は調査したオフターゲット部位のいずれかで見られた（表１）。これらの研究を合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が最小のオフターゲット開裂と共にＮＳＣにおいて複数の「セーフハーバー」遺伝子座でオンターゲットＨＲを媒介できることが実証された。

【表1】

【0299】

方法
ＮＳＣ（ニューロスフェアとして成長させたヒト神経幹細胞）中のセーフハーバー用の相同組換え（ＨＲ）のために、３つのヒト遺伝子座を選択した。これらの遺伝子座は、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するＨＲのために、血液障害について大規模に特徴付けられてきた：（ｉ）ＩＬ２Ｒγは、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）－Ｘ１に関与する突然変異を抱えることがあり、（ｉｉ）ＨＢＢは鎌状赤血球症およびサラセミアに関与する突然変異を抱えることがあり、また（ｉｉｉ）ＣＣＲ５は、ＨＩＶの補助受容体をコードし、抗ＨＩＶ臨床試験において治療用の遺伝子編集のための標的として現在調査されている。これらの遺伝子座は、悪影響なしでＮＳＣ細胞のゲノム中への外来の導入遺伝子の安定な遺伝子発現を可能とする「セーフハーバー」として働くことができる。

【0300】

ＴＡＬＥＮ媒介性のゲノム編集アセンブリーを構築するために、以前に記載された通りに（Millerら、Nature Biotechnology、２０１１年、２９巻：１４３～１４８頁）Δ１５２ Ｎ末端ドメインおよび＋６３ Ｃ末端ドメインを使用してＩＬ２ＲＧ ＴＡＬＥＮを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、記載された通りに（Hendelら、Cell Report、２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．０４０）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。

【0301】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性のゲノム編集アセンブリーを構築するために、ヒトコドンに最適化されたＳｐＣａｓ９発現カセットおよびキメラｓｇＲＮＡの発現を駆動するヒトＵ６プロモーターを含有するｐｘ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）中に２０ｂｐのオリゴヌクレオチド標的配列をクローニングすることによって、ｓｇＲＮＡ発現ベクターを構築した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡの合成は、Hendelら、Cell Report、２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．０４０に詳細に記載されている。

【0302】

ｓｇＲＮＡを化学修飾するために、Ｃａｓ９をｍＲＮＡとして送達し、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を含む化学修飾を５’末端および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込み、したがってＣＲＩＳＰＲシステムの「全ＲＮＡ」送達を表す。

【0303】

ターゲティングベクターのために、Ｋ５６２細胞から単離されたゲノムＤＮＡを使用する対応する遺伝子座のＰＣＲ増幅によって、相同の約２×８００ｂｐのアームを持つ３つのプラスミドターゲティングベクター（ＣＣＲ５およびＩＬ２ＲＧプラスミドターゲティングベクターなど）を生成した。ＨＢＢは５４０ｂｐおよび４２０ｂｐの相同アームを有した。次いで、標準的なクローニング方法を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋に基づく約２，９００塩基対のベクター中に相同アームをクローニングした。上掲のHendelら、および追加の詳細のためにHendelら、Nature Biotechnology、２０１５年、３３巻：９８５～９８９頁を参照。ドナー鋳型は相同アームの間に、ＧＦＰの発現を駆動するユビキチンＣプロモーターを含有するレポーターカセットを含んでいた（図２Ａ）。あるいは、自己開裂性の２Ａペプチドによって分離された２シストロン性のカセット構築物を生成することによって、２Ａペプチドの上流および下流に位置する２つの導入遺伝子の間の高い開裂効率を提供した（図８）。構築物は、（１）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ＣＤ８（ＧＭ－ＮＳＣの精製用のＣＤ８アルファ細胞表面マーカー；図１１Ａおよび１３Ａ）、（２）ＵｂＣ－ＧＦＰ－２Ａ－ｔＣＤ１９（ＧＭ－ＮＳＣの精製用のトランケート型細胞表面マーカー）、（３）ＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｔＣＤ１９（トランケート型ＣＤ１９を有するクラッベ病用の治療用酵素構築物；図１２Ａ）またはＵｂＣ－ＧａｌＣ－２Ａ－ｅＧＦＰ（図９Ａ）、および（４）ＵｂＣ－ＴＰＰ１－２Ａ－ＣＤ８（ＣＤ８アルファを有するＬＩＮＣＬ用の治療用酵素構築物）を含んでいた。

【0304】

Uchidaら、Proc Natl Acad Sci USA、２０００年、９７巻（２６号）：１４７２０～１４７２５頁に記載の方法を使用して、ＮＳＣをヒト脳組織から直接単離した。ＮＳＣは非ＧＭＰ条件下で生成した。Ｎ２、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、線維芽細胞成長因子２、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、および白血病抑制因子（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中、１×１０^５／ｍｌの密度で細胞を培養した。ニューロスフェアをリベラーゼまたはベンザイムで継代し（すなわち、高度に精製したコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）での処理）、同じ培地中に再播種した。ＣＤ１３３＋ ＣＤ２４－／ｌｏ ＮＳＣを単離するために細胞表面マーカーを使用した。

【0305】

ヌクレオフェクションを使用して、単離したＮＳＣ中に遺伝子ターゲティングドナー鋳型を導入した。（別段の記載がなければ、）Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラムＣＡ１３７）、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｖ４ＸＰ－３０３２）、２０μＬの１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを用い、製造者の説明書にしたがい、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）によって５×１０^５個のＮＳＣの単一懸濁液に１μｇのＴＡＬＥＮをコードするプラスミドおよび１～２μｇのドナープラスミドをトランスフェクトした。あるいは、（別段の記載がなければ、）Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラムＣＡ１３７）、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｖ４ＸＰ－３０２４）を用い、製造者の説明書にしたがって１００マイクロＬのＮｕｃｅｌｏｃｕｖｅｔｔｅによるヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）によって２．５Ｅ６ ＧＭ－ＮＳＣに５μｇのＴＡＬＥＮをコードするプラスミドおよび５～１０μｇのドナープラスミドをトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、ＮＳＣをフラスコに入れ、複数継代にわたって培養を続けた。場合によっては、培養したＮＳＣを、上掲のUchidaらに記載のコラゲナーゼによる解離でのゲノム編集のために使用した。

【0306】

８００ｂｐの相同アームの間にＡｆｌＩＩ制限酵素部位を導入することによって、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）相同組換えドナーを作製した。（ＣＭＶプロモーター下の）Ｃａｓ９および（Ｕ６プロモーター下の）ｓｇＲＮＡをｐｘ３３０プラスミド構築物（１μｇ）中で送達した。ゴールデンゲートシステムを用いてＴＡＬＥＮペアを構築し、プラスミド構築物（各０．５μｇ）を介して送達した。１μｇのＨＲドナー鋳型または１μｇのＨＲドナーのいずれかおよび操作されたヌクレアーゼを、５００，０００個の神経幹細胞にヌクレオフェクトした。細胞を７日間、培養物中で成長させた。ゲノムＤＮＡを回収し、Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を単離し、ＡｆｌＩＩで終夜消化した。消化産物を１０％のＰＡＧＥゲルに流し、バンド強度を可視化した。ＲＦＬＰ分析により、ＩＬ２Ｒγ遺伝子座へのドナー鋳型のＧＦＰ導入遺伝子の挿入を確認した。切断対立遺伝子（８００ｂｐ）の密度を総対立遺伝子（未改変（１．６ｋｂ）および改変）で除算することによって、改変されたＩＬ２ＲＧ対立遺伝子の量を定量化した。

【0307】

ＭｉＳｅｑ ｒｕｎｓＩＬ２ＲＧ（ＯＮ）および上位３つのｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測されたオフターゲット（ＯＦＦ１～３）Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡアンプリコンのためのターゲティングされたアンプリコンライブラリー生成を、以前に報告されたディープシークエンシングＭｉＳｅｑの実行において利用されたシークエンシングプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。アンプリコンをゲル精製した後、２ラウンドのＰＣＲに供して、アダプターおよび実験を区別するための特有の８ｂｐのバーコードを付加した。次いで、バーコード付加したアンプリコンを精製し、等モル濃度でプールした。Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＡＮ） Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおけるインデックス付けと共に２×２００サイクルでｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシークエンサーで、精製したライブラリーをシークエンシングした。配列をヒトゲノムに対してアライメントし、以下に記載する通りにＩＮＤＥＬを算出した。

【0308】

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測されたＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位のＭｉＳｅｑ解析

【0309】

４つのアンプリコン配列標的領域（ＩＬ２ＲＧ、ＯＦＦ１～３）に対する各試料からの読取りをマッピングし、切断部位の隣にギャップを有するマッピングされた読取りの数を測定することによって、ＩＬ２ＲＧ（ＯＮ）および上位３つのｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測されたオフターゲットＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ部位を定量化した。具体的には、各読取りの最初の７０塩基とアンプリコン配列との間の完全なマッチを見つけることによって、各読取りを最初に標的領域の１つに割り当てた。読取りの最初の７０塩基対がいずれのアンプリコン配列にも完全にマッピングしない場合、読取りを破棄した。次いで、ＥＭＢＯＳＳバージョン６．５．７．０ニードルをデフォルトのパラメーターと共に使用して、各読取りをその対応する標的アンプリコン配列とアライメントした。ＩＮＤＥＬを有する読取りの数を定量化するために、少なくとも１つの挿入または欠失（読取りまたはアンプリコンのいずれかのアライメントにおける「－」）がＣＲＩＳＰＲ切断部位（ガイドＲＮＡ配列の塩基１７と１８との間）の５ｂｐ上流または下流で起こっている場合、各読取りを改変されたものとマークした。所与の標的部位における全ＩＮＤＥＬパーセンテージを、エレクトロポレートしない試料におけるバックグラウンドのＩＮＤＥＬパーセンテージを減算した、遺伝子座にマッピングされた読取りの総数に対する改変された遺伝子座にマッピングされた読取りの数として、報告した。

【0310】

Ｈ．磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）選択による遺伝子改変されたＮＳＣの濃縮
臨床的に妥当な移植可能な細胞数へのＧＭ－ＮＳＣの濃縮および増殖は、それらの移植能力を大きく増加させる。１ステップの磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）濃縮と連結させた、ＩＬ２ＲＧでのＨＲの成功後のＣＤ８のアルファ鎖（ＣＤ８α）の細胞表面マーカー発現を確立することによって、濃縮パラダイムを開発した。ＣＤ８α複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞中で細胞間シグナルを変換するためにアルファ鎖およびベータ鎖の二量体化を必要とする。なお、ＣＤ８αが発現されて機能的であるという報告はなく、アルファ鎖単独の発現はＮＳＣに影響を及ぼすはずであり、それによって選択導入遺伝子として単独で働くはずである。ターゲティングに成功すると、複数遺伝子のｍＲＮＡではあるがＧＦＰおよびＣＤ８αの２つの別個のタンパク質を発現するＩＬ２ＲＧ ＨＲドナー構築物（ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＣＤ８α）を作製した。Ｃａｓ９およびＩＬ２ＲＧに特異的なｓｇＲＮＡをコードするプラスミド、および上記のＣＤ８α ＨＲドナーカセットをＮＳＣにエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの６細胞継代後に、４．６７％のＮＳＣはＧＦＰを安定に発現しており（図２２Ａ、左）、本発明者らがＧＦＰ構築物で見出したものと類似していた（図１９）。次いで、ＮＳＣを１ステップのＣＤ８α磁気ビーズ濃縮プロトコールに供したところ、ＧＦＰを発現する細胞が９０％を超えて生じ（図２２Ａ、右）、また、これらの細胞は選択後の複数の継代にわたって増殖させ、かつ連続的にＧＦＰを発現することが示され、ＧＭ－ＮＳＣの集団であることが確認された（図２２Ｂ）。

【0311】

ＣＤ８αに加えて、本発明者らのＭＡＣＳに基づく濃縮プロトコールについてＣＤ１９細胞表面タンパク質も評価した。ＣＤ８複合体とは異なり、ＣＤ１９は、シグナル（ｒｅｆ）を変換する一本鎖分子である。したがって、細胞内シグナリングドメインが除去され、したがってＣＤ１９を単独で選択の目的のために働くようにしたトランケート型のＣＤ１９細胞表面タンパク質を作製した。ＣＤ１９もまた、神経発生またはグリア発生における公知の役割を持たない。したがって、ＩＬ２ＲＧ ＨＲドナー構築物（ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９）を作製し、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座におけるＨＲについてＮＳＣにターゲティングした。エレクトロポレーション後４継代目において、３．７８％のＮＳＣはＧＦＰを安定に発現しており、次いで細胞をｔＣＤ１９のＭＡＣＳに基づく濃縮に供した（図２３Ａ、左）。ｔＣＤ１９選択は、ＧＭ－ＮＳＣのＣＤ８選択と同様に、９０％を超えるＧＭ－ＮＳＣの濃縮および増殖を生じた（図２２Ｂ、図２３Ｂ、および図２４）。ＨＲを有する細胞を濃縮しているので、次に、より高い頻度のオフターゲットＩＮＤＥＬを有するＧＭ－ＮＳＣも選択しているかどうかを調査することを本発明者らは望んだ。ＩＬ２ＲＧ ＩＮＤＥＬの３倍の濃縮を観察したが（細胞は２×染色体の女性であるので）、オフターゲットＩＮＤＥＬはＣＤ８およびｔＣＤ１９で選択したＧＭ－ＮＳＣにおいて全て１％未満であった（表１）。

【0312】

ＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣＳの特徴を維持したかどうかを決定するために、ｔＣＤ１９選択スキームによってＩＬ２ＲＧがターゲティングされたＮＳＣを９５％を超えるまで濃縮した後（図２４）、細胞表面遺伝子ＣＤ１３３（図２５Ａ）、および細胞内のＮＳＣＳ維持転写因子ＳＯＸ２（図２５Ｂ）という２つの本質的ＮＳＣマーカーの発現を分析した。濃縮後４週間の増殖後、９５％より多くのＮＳＣがＣＤ１３３／ＣＤ１９／ＧＦＰ／ＳＯＸ２陽性であり、これはターゲティングされたニューロスフェアはＮＳＣの能力を完全に有し得ることを強調する。これらのデータは、移植のために９０％を超えるＧＭ－ＮＳＣを濃縮、そして増殖する単純な１ステップのＭＡＣＳに基づくプロトコールを詳述する。

【0313】

方法
フローサイトメトリーを使用して相同組換えをモニターした。ヌクレオフェクション後の各継代においてＮＳＣ細胞を分析した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＧＦＰの発現を測定した。場合によっては、各継代において導入遺伝子ＣＤ８またはＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって評価した。継代においてニューロスフェアを上記の通りに解離させ、製造者の説明書にしたがって抗ＣＤ８－ＡＰＣまたは抗ＣＤ１９－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｎｅｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単一細胞懸濁液を免疫染色した。

【0314】

ＧＦＰ導入遺伝子の挿入を持つＧＭ－ＮＳＣを精製するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した。ニューロスフェアを上記の通りに解離させ、ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で選別した。

【0315】

磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によってもＧＭ－ＮＳＣを精製した。ＣＤ８またはＣＤ１９のいずれかの導入遺伝子の細胞表面マーカーを発現するＧＭ－ＮＳＣを精製するために、ヒトＣＤ８マイクロビーズまたはＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のいずれかを製造者の説明書にしたがって使用した。

【0316】

Ｉ．ＧＭ－ＮＳＣはｉｎ ｖｉｖｏで遊走し、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＨＲのためにＮＳＣにターゲティングできることを本発明者らは示したが、ＧＭ－ＮＳＣがまだ、未編集のＮＳＣについて以前に示されたようなそれらのＮＳＣの生物学的活性を保持するかどうかも調査した。具体的には、ＧＦＰカセット（図１６）を用いてＮＳＣ中のＩＬ２ＲＧ遺伝子座にターゲティングし、ＧＭ－ＮＳＣを増殖させた後、免疫不全マウスに移植した。ＣＤ８αで精製したＧＭ－ＮＳＣを新生Ｓｈｉ－ｉｄマウスの脳室下帯（ＳＶＺ）の両側に移植し、１２週後に同じ動物からの同胞的な前脳切片を免疫組織化学によってヒト改変細胞の生着について分析した（図１４Ｂ～１４Ｃ）。ヒト特異的ｍＡｂ ＳＣ１２１（図１４Ｂ）およびＧＦＰ（図１４Ｃ）での免疫ペルオキシダーゼ染色により、皮質、脳梁におけるＧＭ－ＮＳＣの生着が検出され、そして重要なことに、吻側移動経路（ＲＭＳ）に沿ってＳＶＺから嗅球への細胞の遊走が示された（図１４Ｂ～１４Ｃ）。導入遺伝子のＧＦＰ発現がＳＣ１２１によって検出されたヒト細胞の生着に非常に類似していることを述べることは重要である。したがって、ＧＭ－ＮＳＣは、本発明者らが以前に報告した未編集のＮＳＣと同等に、ＳＶＺ／嗅覚系において生着および遊走することができる。

【0317】

ヒトＮＳＣの際立った機能は、長期間、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの系列に分化しながら自己複製する能力である。Ｓｈｉ／＋ヘテロ接合ｉｄマウスへの移植の２４週後、ＧＦＰ＋細胞が海馬で検出され、ＧＭ－ＮＳＣが長期間ロバストな遊走能力を維持することを示唆した。加えて、これらの細胞の一部は、ＳＶＺの他に成体げっ歯類におけるニューロン新生部位である海馬歯状回の顆粒細胞層下部においてＧＭ－ＮＳＣの転写因子ＳＯＸ２を発現した（図２６Ａの矢印）。これらのデータは、ＧＭ－ＮＳＣがニューロン新生部位に遊走し、ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖後にＮＳＣの自己複製能力を維持することを示唆する。ＧＭ－ＮＳＣがｉｎ ｖｉｖｏでアストロサイトまたはニューロンの系列に分化できることを確認するために、アストロサイト、ニューロンのマーカーであるそれぞれグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびダブルコルチン（ＤＣＸ）について脳切片の共焦点顕微鏡観察を行った。脳梁または線条体の白質の束において、ＧＦＡＰで共染色されたＧＦＰ陽性細胞が観察された（図２６Ｂ）。さらには、ＧＭ－ＮＳＣはＲＭＳに遊走し、嗅球においてＤＣＸ＋神経細胞系列に分化し（図２６Ｂ）、ＧＭ－ＮＳＣの遊走ならびに部位に適切な様式でのアストロサイトおよびニューロンの系列への分化を明らかにした。

【0318】

以前に記載（Ｕｃｈｉｄａ ＳＴＭ）された通りにオリゴデンドロサイト突然変異シバラー免疫不全マウス（ｓｈｉ／ｓｈｉ－ｉｄ）でオリゴデンドロサイトへのＧＭ－ＮＳＣの分化能力を評価した。ｓｈｉ／ｓｈｉ－ｉｄマウスは主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を欠失しており、ＭＢＰに対するｍＡｂはｓｈｉ／ｓｈｉマウスの脳（ｒｅｆ）を染色しない。移植の８週後、ＧＭ－ＮＳＣは小脳の白質路内に広範に遊走し（図２７Ａ）、導入遺伝子ＧＦＰを発現する（図２７Ｂ）。免疫蛍光染色は、生着した白質がＧＦＰおよびＭＢＰの共発現を示すことを明らかにする（図２７Ｃ）。より高倍率の異なるマウス脳において、ヒトＧＦＰ＋細胞はそれらの突起を伸ばし、ＭＢＰ発現は突起の先端に局在しており、成熟ミエリン形成性オリゴデンドロサイト（oligodendroctyes）を示すことを観察した（図４Ｂ）。全てを合わせると、ＧＭ－ＮＳＣは、以前に報告された未編集ＮＳＣと同等に、生着し、遊走し、自己複製し、かつ部位に適切な様式で３つのＣＮＳ系列に分化する能力を維持する。加えて、成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイトなどのＧＭ－ＮＳＣの子孫は、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９によって媒介される導入遺伝子の発現を持続する。

【0319】

方法
精製されたＧＭ－ＮＳＣの生着、遊走、神経保護、および網膜保護を試験するために、細胞を様々な免疫不全マウスに移植した。ＮＳＣの懸濁液（部位あたり１μＬ中に１×１０^５個の細胞）を調製し、新生または若年シバラー免疫不全（Ｓｈｉ－ｉｄ）マウスの脳梁、ＳＶＺ、または小脳白質の両側に移植した。

【0320】

Ｊ．ＧＡＬＣリソソーム酵素を過剰発現するＮＳＣはｉｎ ｖｉｖｏで生着し、ミエリンを産生する
リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）は、非効率なリソソームに起因する５０より多くの遺伝性の単一遺伝子代謝障害の一群である。それらのうち、グロボイド細胞白質ジストロフィー、またはクラッベ病は、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）を失うことによって主に中枢および末梢神経系に現れる一種のＬＳＤであり、ミエリンを産生するオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の死をそれぞれ引き起こす。欠けている酵素を送達するためにＮＣＬ患者の脳に、およびミエリン産生細胞を提供するためにペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）患者にＮＳＣが移植されている。ＧＭ－ＮＳＣは未編集ＮＳＣと同等にミエリンを産生することを本発明者らは示すので、ＧＡＬＣを過剰発現するＧＭ－ＮＳＣは、損傷したミエリン産生細胞の「相互矯正（cross-correction）」を可能とするのに十分なＧＡＬＣを産生するという点で優れており、さらにこれらの細胞は既に失われたオリゴデンドロサイトを「正常な」ＧＡＬＣ発現オリゴデンドロサイトに置換することもできる可能性がある。したがって、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座にＧＡＬＣ（ＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９）をノックインするためのＨＲドナー、そしてまたロバストなＭＡＣＳに基づく濃縮を可能とするためのｔＣＤ１９選択カセットを作製した（図２８）。ＮＳＣに「全ＲＮＡ」ＩＬ２ＲＧ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームおよびＧＡＬＣ ＨＲドナーをエレクトロポレートし、ターゲティングの少なくとも４継代後にエピソームドナーＤＮＡを希釈により消失させた後で５．１７％がＣＤ１９陽性ＮＳＣであった（図２９Ａ）。これと合致して、ｔＣＤ１９ ＭＡＣＳビーズにより９５％を超えるＧＭ－ＮＳＣが濃縮され（図２９Ｂ）、「Ｉｎ－Ｏｕｔ」ＰＣＲによりＩＬ２ＲＧ遺伝子座へのＧＡＬＣカセットのオンターゲット組込みが確認された（図３０）。ＧＡＬＣ ＮＳＣが機能的な酵素を過剰発現していることを確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＡＬＣ酵素アッセイを行った。それによれば、ＧＭ－ＮＳＣは、未編集ＮＳＣより３～５倍多くの、およびクラッベ病患者の線維芽細胞より１０倍多くのＧａｌＣ酵素を発現した（図３１）。次に、ＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣＳの生物学的特徴を保持しているかどうかを試験した。そのために、ＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣを若年Ｓｈｉ－ｉｄマウスの小脳に移植した。免疫組織化学分析はＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣの生着およびミエリン産生を示した（図３２Ａ～３２Ｂ）。これらのデータは、ＧＡＬＣ ＧＭ－ＮＳＣがそれらのＮＳＣＳの生物学的特徴を保持し、クラッベ病およびその他の脱髄性の中枢神経系障害の治療のための高い治療的可能性を有することを強く示唆する。

【0321】

方法
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ－ｈｕｍａｎ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄａｓｅ－ｇａｌｃ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｆ＿７３１０－ｇｈ）に記載の通りにＧＡＬＣ酵素アッセイを行った（Wiederschainら、Clin Chim Acta １９９２年）。簡潔に述べれば、未編集ＮＳＣ、クラッベ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ４３７２線維芽細胞、ＧＡＬＣ遺伝子中のイントロン１０の中央近くで始まる３０ｋｂの欠失についてヘテロ接合、Ｃｏｒｉｅｌｌ）、およびＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ｔＣＤ１９ドナー鋳型（Ｅｘｐ１）またはＩＬ２ＲＧ ｃＤＮＡ－ＵｂＣ－ＧＡＬＣ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（Ｅｘｐ２）を用いて改変した２つの異なるＧＥ－ＮＳＣからのタンパク質抽出物。ＧＡＬＣ酵素アッセイを行うために、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、かつ製造者の説明書にしたがってＭ－ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理することによって、これらの細胞からのタンパク質抽出物を調製した。０．２５～２．０ｍｇ／ｍｌの範囲のＢＳＡ標準曲線を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキットによってタンパク質濃度を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。

【0322】

２５０ｕｇまたは５００ｕｇのタンパク質抽出物（５０ｕＬ）を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（ｐＨ４．５）中に再懸濁した５０ｕＬの１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド基質（Ｓｉｇｍａ）とミスする（missing）ことによってＧＡＬＣアッセイを行った。反応物を３７℃で２０分インキュベートした後、０．５Ｍグリシン、０．３Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）を用いて停止させた。エンドポイントモードにおいてそれぞれ３６５ｎｍおよび４４５ｎｍ（トップリード）の励起波長および発光波長で、Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いてＢｉｏＴｅｋによってＧＡＬＣ酵素開裂の蛍光を測定した。ＧＡＬＣ酵素アッセイ用の標準曲線は、直線範囲を有する反応あたり０．０３７５ｎｇ～１．２ｎｇのｒｈＧＡＬＣの範囲の組換えヒトガラクトシルセラミダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７３１０－ＧＨ）によって確立した。３つの独立した試料を使用して全てのアッセイを三連で行った。ＧＡＬＣ酵素活性を未編集ＮＳＣを用いて正規化した。

【0323】

理解を明確にする目的の説明および例により、上記の発明をいくらか詳細に記載してきたが、添付の請求項の範囲内である特定の変更および改変を行い得ることを当業者は理解するであろう。加えて、本明細書中で提供する各参照文献は、各参照文献が参照することにより個々に組み込まれるのと同じ程度に、参照することによってその全体が組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図33】