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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-23
(45)【発行日】2023-01-06
(54)【発明の名称】被験試料の評価方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20221226BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221226BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20221226BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20221226BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20221226BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221226BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z ZNA
G01N33/15 Z
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2018179975
(22)【出願日】2018-09-26
(65)【公開番号】P2020051835
(43)【公開日】2020-04-02
【審査請求日】2021-06-21
(73)【特許権者】
【識別番号】390011442
【氏名又は名称】株式会社マンダム
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(73)【特許権者】
【識別番号】505314022
【氏名又は名称】国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100141472
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 善弘
(72)【発明者】
【氏名】鳥山 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】藤田 郁尚
(72)【発明者】
【氏名】岡田 文裕
(72)【発明者】
【氏名】石井 健
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２５２０３５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２０３７１５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５１２４７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Xu, S. et al.，A novel TRPV4-specific agonist inhibits monocyte adhesion and atherosclerosis，Oncotarget，2016年，Vol.7，pp.37622-37635
【文献】PAIRET, N. et al.，TRPV4 inhibition attenuates stretch-induced inflammatory cellular responses and lung barrier dysfunction during mechanical ventilation，PLOS ONE，2018年04月17日，13(4)，e0196055
【文献】SCHERAGA, R. G. et al.，TRPV4 Mechanosensitive Ion Channel Regulates Lipopolysaccharide-Stimulated Macrophage Phagocytosis，The Journal of Immunology，2016年01月01日，196 (1)，pp.428-436
【文献】SANTONI, G. et al.，“Immuno-Transient Receptor Potential Ion Channels”: The Role in Monocyte- and Macrophage-Mediated Inflammatory Responses，Frontiers in Immunology，2018年06月06日，Vol.9，Article 1273
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験試料が有する抗炎症作用を評価する被験試料の評価方法であって、被験試料と単球とを接触させ、単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することを特徴とする被験試料の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、被験試料の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、炎症予防用化粧料、抗炎症用化粧料、炎症予防剤、抗炎症剤などの開発などに有用な被験試料の評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症は、化学的刺激、物理的刺激などによって引き起こされる生体反応の１つである。炎症は、組織などに損傷を与えることがあることから、当該炎症に対して抗炎症剤が適用されることがある。しかし、炎症には、種々の発症機構があることから、炎症を抑制する新たな抗炎症剤が待ち望まれている。
【0003】
ところで、ＴＲＰＶ４は、感覚受容に関与するチャネルである（例えば、非特許文献１参照）。しかし、本発明者らは、現時点では、ＴＲＰＶ４の活性化と炎症の抑制との関連性が具体的に記載された文献を現時点では発見していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】沼田朋大ら、「ＴＲＰチャネルの構造と多様な機能」、日本生化学会邦文誌 生化学、公益社団法人日本生化学会、２００９年、第８１巻、第１１号、ｐ.９６２―９８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験試料が有する抗炎症作用を容易に評価することができる被験試料の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の要旨は、被験試料が有する抗炎症作用を評価する被験試料の評価方法であって、被験試料と単球とを接触させ、単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することを特徴とする被験試料の評価方法に関する。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、被験試料が有する抗炎症作用を容易に評価することができる被験試料の評価方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】実施例１において、試料の種類とＩＬ－１β相対値との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図2】実施例２において、試料の種類とＩＬ－１β相対値との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図3】実施例３において、ＲＮＡ試料の種類とＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図4】実施例４において、ＲＮＡ試料の種類とＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図5】実施例５において、試料の種類とＩＬ－１β質量濃度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の被験試料の評価方法は、被験試料が有する抗炎症作用を評価する被験試料の評価方法であって、被験試料と単球とを接触させ、単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することを特徴とする。
【0010】
本発明の方法によれば、被験試料による単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有する抗炎症作用を評価するという操作が採られているので、被験試料が有する抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を容易に評価することができる。
【0011】
本発明の方法の具体例としては、
（Ａ）単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、
（Ｂ）単球のＴＲＰＶ４の機能の抑制条件下に、当該単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、および
（Ｃ）ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象に基づき、被験試料による単球のＴＲＰＶ４に対する活性促進作用を評価し、当該活性促進作用の評価結果に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価するステップ
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
（Ａ）単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、
（Ｂ）単球のＴＲＰＶ４の機能の抑制条件下に、当該単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、および
（Ｃ）ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象に基づき、被験試料による単球のＴＲＰＶ４に対する活性促進作用を評価し、当該活性促進作用の評価結果に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価するステップ
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0012】
ステップ（Ａ）では、単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定する。
【0013】
単球は、単離された株化されていない単球（以下、「単離単球」という）であってもよく、単球株化細胞であってもよい。単離単球の供給源としては、例えば、ヒト末梢血、ヒト骨髄、マウス末梢血、マウス骨髄などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。単離単球としては、例えば、ヒト単離単球、マウス単離単球などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒト単離単球としては、例えば、古典的単球、中間型単球、非古典的単球などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒトの古典的単球は、ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性（ＣＤ１４+ＣＤ１６-）を示す。ヒトの中間型単球は、ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性（ＣＤ１４+ＣＤ１６+）を示す。ヒトの非古典的単球は、ＣＤ１４低発現または陰性およびＣＤ１６陽性（ＣＤ１４lo/-ＣＤ１６+）を示す。マウス単球としては、例えば、古典的単球、非古典的単球などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マウスの古典的単球は、Ｌｙ６ｃ高発現（Ｌｙ６ｃhi）を示す。マウスの非古典的単球は、Ｌｙ６ｃ低発現（Ｌｙ６ｃlo）を示す。単離単球は、例えば、採取された末梢血、採取された骨髄を用い、後述の調製例１に記載の手法にしたがって調製することができる。単球株化細胞としては、例えば、ＴＨＰ－１、Ｕ９３７、ＫＧ１などのヒト単球株化細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0014】
ＴＲＰＶ４は、例えば、細胞外液の浸透圧の減少などによって活性化する非選択性陽イオンチャネルの１つである。ＴＲＰＶ４は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５に示されるアミノ酸配列を有する。
【0015】
被験試料としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験試料は、液体である場合、そのまま用いてもよく、必要に応じて溶媒で希釈して用いてもよい。また、被験試料は、固体である場合、溶媒に溶解させて用いることができる。
【0016】
溶媒は、被験試料の種類、測定対象の生理学的事象の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、被験試料の種類、測定対象の生理学的事象の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。溶媒としては、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、精製水、エタノール、エタノール水溶液、カルシウム含有溶液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕、カルシウム不含溶液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0017】
単球と被験試料との接触は、例えば、被験試料を含有する単球用培地において、単球の生理学的機能の維持に適した培養条件下に単球を培養することなどによって行なうことができる。
【0018】
単球用培地は、例えば、基本培地に培地添加物を添加することによって調製することができる。培地添加物としては、例えば、血清、抗生物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。基本培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。単球用培地は、血清飢餓培地であってもよく、非血清飢餓培地であってもよい。血清飢餓培地は、通常、好ましくは０～１％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０～０．５％（ｖ／ｖ）の血清濃度を有する。非血清飢餓培地は、通常、好ましくは２～１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５～１０％（ｖ／ｖ）の血清濃度を有する。これらの単球用培地のなかでは、種々の生理活性物質を含有する血清を含むので被験試料の効果をより特異的に評価することができることから、血清飢餓培地が好ましい。
【0019】
単球用培地における被験試料の量は、被験試料の種類、単球の数などによって異なるので一概に決定することができないことから、被験試料の種類、単球の数などに応じて適宜決定することが好ましい。単球と被験試料との接触に用いられる単球用培地は、被験試料の溶媒として用いられる単球用培地と同様である。単球と被験試料との接触時間は、被験試料の種類、培養温度などによって異なるので一概に決定することができないことから、被験試料の種類、培養温度などに応じて適宜決定することが好ましい。単球と被験試料との接触時間は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは０．１５時間以上、より好ましくは０．５時間以上、より一層好ましくは１時間以上、さらに好ましくは３時間以上、さらに一層好ましくは６時間以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは７２時間以下、より好ましくは１２時間以下、さらに好ましくは８時間以下である。
【0020】
培養条件には、培養温度、培養雰囲気における二酸化炭素濃度などが含まれる。培養温度は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは３５℃以上、より好ましくは３６．５℃以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは３８℃以下、より好ましくは３７．５℃以下である。具体的には、培養温度は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、通常、好ましくは３５～３８℃、より好ましくは３６．５～３７．５℃である。培養雰囲気における二酸化炭素濃度は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは４％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは５％（ｖ／ｖ）以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは７％（ｖ／ｖ）以下である。具体的には、二酸化炭素濃度は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、通常、好ましくは４～１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５～７％（ｖ／ｖ）である。
【0021】
ＴＲＰＶ４の活性化を介して引き起こされる生理学的事象としては、例えば、(i)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量の減少、(ii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球からＭ１型マクロファージへの分化の抑制、(iii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の細胞内カルシウムイオン濃度の増加、(iv)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の膜電位の増加などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0022】
生理学的事象の測定法としては、以下の測定法１～測定法４などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0023】
＜測定法１＞
測定法１では、生理学的事象として、前記「(i)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量の減少」が用いられる。測定法１は、
（１ａ）単球と炎症惹起物質とを接触させるステップ、および
（１ｂ）炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量を測定するステップ
を含む。
測定法１では、生理学的事象として、前記「(i)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量の減少」が用いられる。測定法１は、
（１ａ）単球と炎症惹起物質とを接触させるステップ、および
（１ｂ）炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量を測定するステップ
を含む。
【0024】
単球と炎症惹起物質との接触は、例えば、炎症惹起物質を含有する単球用培地において、単球の生理学的機能の維持に適した培養条件下に単球を培養することなどによって行なうことができる。
【0025】
炎症惹起物質としては、例えば、リポ多糖；Ｋ３ＣｐＧなどのＣｐＧオリゴヌクレオチド；Ｐａｍ３ＣＳＫ４などのリポペプチド；Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0026】
単球用培地における炎症惹起物質の量は、炎症惹起物質の種類、単球の数などによって異なるので一概に決定することができないことから、炎症惹起物質の種類、単球の数などに応じて適宜決定することが好ましい。培養条件は、単球と被験試料との接触の際に用いられる培養条件と同様である。
【0027】
測定法１をステップ（Ａ）に用いる場合、測定法１のステップ（１ａ）では、被験試料および炎症惹起物質は、同時に単球に接触させてもよく、別々に単球に接触させてもよい。
【0028】
被験試料および炎症惹起物質を同時に単球に接触させる場合、例えば、被験試料と炎症惹起物質とを含有する単球用培地などを用いることができる。被験試料および炎症惹起物質を同時に単球に接触させる際の培養温度は、前記培養条件における培養温度と同様である。単球と被験試料と炎症惹起物質との接触時間は、被験試料の種類、炎症惹起物質の種類、培養温度などによって異なるので一概に決定することができないことから、被験試料の種類、炎症惹起物質の種類、培養温度などに応じて適宜決定することが好ましい。
【0029】
被験試料および炎症惹起物質を別々に単球に接触させる場合、被験試料を単球に接触させた後、炎症惹起物質を当該単球に接触させてもよく、炎症惹起物質を単球に接触させた後、被験試料を当該単球に接触させてもよい。炎症惹起物質と単球とを接触させる際の培養温度は、前記培養条件における培養温度と同様である。単球と炎症惹起物質との接触時間は、炎症惹起物質の種類、培養温度などによって異なるので一概に決定することができないことから、炎症惹起物質の種類、培養温度などに応じて適宜決定することが好ましい。単球と炎症惹起物質との接触時間は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは０．１５時間以上、より好ましくは０．５時間以上、より一層好ましくは１時間以上、さらに好ましくは３時間以上、さらに一層好ましくは６時間以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは７２時間以下、より好ましくは１２時間以下、さらに好ましくは８時間以下である。
【0030】
炎症関連因子は、炎症部位に存在する因子である。炎症関連因子としては、例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦなどの炎症性サイトカイン；ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βなどのケモカイン；Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、ｓＩＣＡＭ－１などの細胞接着因子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの炎症関連因子のなかでは、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチンおよびｓＩＣＡＭ－１が好ましい。
【0031】
炎症関連因子の発現量の測定法としては、例えば、酵素標識免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ」という）、ウエスタンブロッティング法、免疫蛍光染色法、蛍光活性化セルソーティング（以下、「ＦＡＣＳ」という）、蛍光標識ビーズを用いたマルチプレックスアッセイなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。炎症関連因子のｍＲＮＡの発現量の測定法としては、例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0032】
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング法に用いられる抗体としては、例えば、炎症関連物質に対する抗体またはその抗体断片などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。炎症関連物質に対する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。炎症関連物質に対する抗体およびその抗体断片として、商業的に入手可能な抗体およびその抗体断片を用いることができる。
【0033】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法に用いられるプライマー対としては、例えば、炎症関連因子をコードする核酸の塩基配列の一部からなるプライマーと当該核酸のアンチセンス鎖の塩基配列の一部からなるプライマーとからなるプライマーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。プライマー対としては、商業的に入手可能なプライマー対を用いることができる。
【0034】
ノーザンブロッティング法に用いられるプローブとしては、例えば、炎症関連因子をコードする核酸の全部または一部からなる核酸、炎症関連因子をコードする核酸のアンチセンス鎖の全部または一部からなる核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。プローブが炎症関連因子をコードする核酸の一部からなる核酸または当該核酸のアンチセンス鎖の一部からなる核酸である場合、プローブの長さは、炎症関連因子の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、炎症関連因子の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。プローブの長さは、炎症関連因子の発現量の測定精度を向上させる観点から、通常、好ましくは２０～５００ヌクレオチド長である。
【0035】
＜測定法２＞
測定法２では、生理学的事象として、前記「(ii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球からＭ１型マクロファージへの分化の抑制」が用いられる。単球からＭ１型マクロファージの分化は、単球とＧＭ－ＣＳＦとを接触させることによって行なうことができる。測定法２は、
（２ａ）単球と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ－ＣＳＦ」という）とを接触させるステップ、および
（２ｂ）Ｍ１型マクロファージの数を測定するステップ
を含む。
測定法２では、生理学的事象として、前記「(ii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球からＭ１型マクロファージへの分化の抑制」が用いられる。単球からＭ１型マクロファージの分化は、単球とＧＭ－ＣＳＦとを接触させることによって行なうことができる。測定法２は、
（２ａ）単球と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ－ＣＳＦ」という）とを接触させるステップ、および
（２ｂ）Ｍ１型マクロファージの数を測定するステップ
を含む。
【0036】
単球とＧＭ－ＣＳＦとの接触は、例えば、ＧＭ－ＣＳＦを含有する単球用培地において、単球の生理学的機能の維持に適した培養条件下に単球を培養することなどによって行なうことができる。
【0037】
単球用培地におけるＧＭ－ＣＳＦの量は、単球の数などによって異なるので一概に決定することができないことから、単球の数などに応じて適宜決定することが好ましい。単球用培地におけるＧＭ－ＣＳＦの量は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、通常、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。単球用培地は、被験試料の溶媒として用いられる単球用培地と同様である。培養条件は、単球と被験試料との接触の際に用いられる培養条件と同様である。
【0038】
測定法２をステップ（Ａ）に用いる場合、測定法２のステップ（２ａ）では、被験試料およびＧＭ－ＣＳＦは、同時に単球に接触させてもよく、別々に単球に接触させてもよい。
【0039】
被験試料およびＧＭ－ＣＳＦを同時に単球に接触させる場合、例えば、被験試料とＧＭ－ＣＳＦとを含有する単球用培地などを用いることができる。この場合、単球と被験試料とＧＭ－ＣＳＦとの接触時間は、被験試料の種類などによって異なるので一概に決定することができないことから、被験試料の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。
【0040】
被験試料およびＧＭ－ＣＳＦを別々に単球に接触させる場合、被験試料およびＧＭ－ＣＳＦを単球に接触させる順序は、特に限定されるものではない。単球とＧＭ－ＣＳＦとの接触時間は、単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球からＭ１型マクロファージへの分化を抑制する観点から、好ましくは３日間以上、より好ましくは５日間以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは１４日間以下、より好ましくは１０日間以下である。
【0041】
Ｍ１型マクロファージの数の測定法としては、例えば、フローサイトメトリーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。フローサイトメトリーによってＭ１型マクロファージの数を測定する場合、Ｍ１型マクロファージのマーカーとしては、例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ１６３などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのＭ１型マクロファージのマーカーのなかでは、単球とＭ１型マクロファージとの容易に区別化する観点から、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６８が好ましい。Ｍ１型マクロファージは、「ＣＤ１４陰性、ＣＤ１１ｂ陽性およびＣＤ６８陽性」を示すことを指標として検出し、計数することができる。
【0042】
＜測定法３＞
測定法３では、生理学的事象として、前記「(iii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の細胞内カルシウムイオン濃度の増加」が用いられる。単球の細胞内カルシウムイオン濃度は、カルシウム指示薬を単球に導入し、単球内のカルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を指標として測定することができる。
測定法３では、生理学的事象として、前記「(iii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の細胞内カルシウムイオン濃度の増加」が用いられる。単球の細胞内カルシウムイオン濃度は、カルシウム指示薬を単球に導入し、単球内のカルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を指標として測定することができる。
【0043】
カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を簡便な操作で測定することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬の具体例としては、１－［６－アミノ－２－（５－カルボキシ－２－オキサゾリル）－５－ベンゾフラニルオキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル（以下、「Ｆｕｒａ ２－ＡＭ」という）、１－［２－アミノ－５－（２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３－オキソ－９－キサンテニル）フェノキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（以下、「Ｆｌｕｏ ３－ＡＭ」という）、１－［２－アミノ－５－（２，７－ジフルオロ－６－アセトキシメトキシ－３－オキソ－９－キサンテニル）フェノキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（以下、「Ｆｌｕｏ ４－ＡＭ」という）などの蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬のなかでは、カルシウムイオンの動態と夾雑物質の動態とを区別化し、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましく、Ｆｕｒａ ２－ＡＭ、Ｆｌｕｏ ３－ＡＭおよびＦｌｕｏ ４－ＡＭがより好ましい。
【0044】
蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。カルシウム指示薬が蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光カルシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、検出強度が高いことから、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際して、１種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長のそれぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。細胞内カルシウム濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２－ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。蛍光強度比は、例えば、式（Ｉ）：
［蛍光強度比］＝［第１蛍光強度］／［第２蛍光強度］ （Ｉ）
に基づいて求めることができる。
［蛍光強度比］＝［第１蛍光強度］／［第２蛍光強度］ （Ｉ）
に基づいて求めることができる。
【0045】
単球に蛍光カルシウム指示薬を導入する方法としては、例えば、単球が入った還流チャンバー内で蛍光カルシウム指示薬を含有する緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。指示薬導入後の単球と被験試料とを接触させる方法としては、蛍光カルシウム指示薬が導入された単球が入った還流チャンバー内で蛍光カルシウム指示薬を含有する緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験試料接触後の細胞とカルシウムイオンとを接触させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを含有し、被験試料を含まない緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。単球に蛍光カルシウム指示薬を導入する際の温度、単球と被験試料との接触温度および単球とカルシウムイオンとの接触温度は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは３５℃以上、より好ましくは３６．５℃以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは３８℃以下、より好ましくは３７．５℃以下である。単球と被験試料との接触時間は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは０．５分間以上、より好ましくは１分間以上であり、細胞内カルシウムの変化を的確に評価する観点から、好ましくは１時間以下、より好ましくは０．５時間以下である。単球とカルシウムイオンとの接触時間は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは５分間以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下である。
【0046】
＜測定法４＞
測定法４では、生理学的事象として、前記「(iv)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の膜電位の増加」が用いられる。単球の膜電位の測定法としては、例えば、ホールセル法、セルアタッチ法などのパッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
測定法４では、生理学的事象として、前記「(iv)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の膜電位の増加」が用いられる。単球の膜電位の測定法としては、例えば、ホールセル法、セルアタッチ法などのパッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0047】
ステップ（Ｂ）では、単球のＴＲＰＶ４の機能の抑制条件下に、当該単球と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定する。ステップ（Ｂ）における生理学的事象の測定は、単球のＴＲＰＶ４の機能の抑制条件下に行なうことを除き、ステップ（Ａ）と同様の条件および方法によって行なうことができる。また、ステップ（Ｂ）で測定される生理学的事象は、ステップ（Ａ）で測定された生理学的事象と同じ種類の生理学的事象である。
【0048】
単球のＴＲＰＶ４の機能を抑制する方法としては、例えば、ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４とを接触させる方法、単球のＴＲＰＶ４をノックダウンまたはノックアウトさせる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0049】
ＴＲＰＶ４活性抑制剤としては、例えば、２－メチル－１－［３－（４－モルホリニル）プロピル］－５－フェニル－Ｎ－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド（以下、「ＨＣ－０６７１４７」という）、３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イルメチル）－７－ブロモ－Ｎ－（１－フェニルシクロプロピル）－２－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］－４－キノリンカルボキサミド（以下、「ＧＳＫ２１９３８７４」という）、Ｎ－［４－［［４－（１－メチルエチル）－１－ピペラジニル］スルホニル］フェニル］－２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）ベンザミド塩酸塩（以下、「ＲＮ９８９３塩酸塩」という）、２，４－ジクロロ－Ｎ－（１－メチルエチル）－Ｎ－｛２－［（１－メチルエチル）アミノ］エチル｝ベンゼンスルホンアミド（以下、「ＲＮ－１７３４」という）、ルテニウムレッドなどのＴＲＰＶ４アンタゴニストなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのＴＲＰＶ４活性抑制剤のなかでは、単球のＴＲＰＶ４の活性化を介して引き起こされる生理学的事象を的確に測定する観点から、ＴＲＰＶ４アンタゴニストが好ましく、ＨＣ－０６７１４７、ＧＳＫ２１９３８７４、ＲＮ９８９３塩酸塩、ＲＮ－１７３４およびルテニウムレッドがより好ましく、ＨＣ０６７１４７およびＧＧＳＫ２１９３８７４がさらに好ましい。
【0050】
単球のＴＲＰＶ４に接触させるＴＲＰＶ４活性抑制剤の量は、ＴＲＰＶ４活性抑制剤の種類、単球の数などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ４活性抑制剤の種類、単球の数などに応じて適宜決定することが好ましい。
【0051】
ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４との接触は、単球のＴＲＰＶ４の機能の抑制条件下での被験試料の作用を的確に評価する観点から、単球と被験試料との接触前または接触と同時に行なうことが好ましい。
【0052】
ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４との接触を単球と被験試料との接触前に行なう場合、ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４との接触時間は、抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは５分間以上、より好ましくは１５分間以上であり、前記と同様に抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を的確に評価する観点から、好ましくは２４時間以下、より好ましくは１時間以下である。
【0053】
ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４との接触を単球と被験試料との接触と同時に行なう場合、ＴＲＰＶ４活性抑制剤と単球のＴＲＰＶ４との接触時間は、単球のＴＲＰＶ４と被験物質との接触時間と同様である。
【0054】
単球のＴＲＰＶ４をノックダウンさせる方法としては、例えば、ＲＮＡサイレンシング法によってＴＲＰＶ４遺伝子の発現を阻害する方法、ドミナント・ネガティブ変異体を発現させることによって正常なＴＲＰＶ４の機能を阻害する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。単球のＴＲＰＶ４をノックアウトさせる方法としては、例えば、相同組換法によってＴＲＰＶ４遺伝子を破壊する方法、ゲノム編集技術によってＴＲＰＶ４遺伝子を破壊する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【0055】
ステップ（Ｃ）では、ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象に基づき、被験試料による単球のＴＲＰＶ４に対する活性促進作用を評価し、当該活性促進作用の評価結果に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価する。
【0056】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象が「(i)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量の減少」である場合、被験試料は、以下の指標（１ａ）および（１ｂ）の少なくとも１つの指標に基づいて単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有すると評価される。
＜指標（１ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された炎症関連因子の発現量がステップ（Ｂ）で測定された炎症関連因子の発現量と比べて少ないこと
＜指標（１ｂ）＞
ステップ（Ａ）で測定された炎症関連因子のｍＲＮＡの発現量がステップ（Ｂ）で測定された炎症関連因子のｍＲＮＡの発現量と比べて少ないこと
＜指標（１ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された炎症関連因子の発現量がステップ（Ｂ）で測定された炎症関連因子の発現量と比べて少ないこと
＜指標（１ｂ）＞
ステップ（Ａ）で測定された炎症関連因子のｍＲＮＡの発現量がステップ（Ｂ）で測定された炎症関連因子のｍＲＮＡの発現量と比べて少ないこと
【0057】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象が「(ii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球からＭ１型マクロファージへの分化の抑制」である場合、被験試料は、以下の指標（２ａ）に基づいて単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有すると評価される。
＜指標（２ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定されたＭ１型マクロファージの数がステップ（Ｂ）で測定されたＭ１型マクロファージの数と比べて少ないこと
＜指標（２ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定されたＭ１型マクロファージの数がステップ（Ｂ）で測定されたＭ１型マクロファージの数と比べて少ないこと
【0058】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象が「(iii)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の細胞内カルシウムイオン濃度の増加」である場合、被験試料は、以下の指標（３ａ）に基づいて単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有すると評価される。
＜指標（３ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度がステップ（Ｂ）で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度と比べて高いこと
＜指標（３ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度がステップ（Ｂ）で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度と比べて高いこと
【0059】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）で測定された生理学的事象が「(iv)単球のＴＲＰＶ４の活性化に起因する単球の膜電位の増加」である場合、被験試料は、以下の指標（４ａ）に基づいて単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有すると評価される。
＜指標（４ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された単球の膜電位がステップ（Ｂ）で測定された単球の膜電位と比べて大きいこと
＜指標（４ａ）＞
ステップ（Ａ）で測定された単球の膜電位がステップ（Ｂ）で測定された単球の膜電位と比べて大きいこと
【0060】
被験試料は、単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有する場合、抗炎症作用、好ましくはＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を有すると評価されることができる。被験試料は、単球のＴＲＰＶ４に対して活性促進作用を有しない場合、抗炎症作用、好ましくはＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を有していないと評価されることができる。
【0061】
以上説明したように、本発明の被験試料の評価方法によれば、被験試料が有する抗炎症作用、好ましくはＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を容易に評価することができる。したがって、本発明の被験試料の評価方法は、炎症予防用化粧料、抗炎症用化粧料、炎症予防剤、抗炎症剤などの開発に好適に用いられることが期待されるものである。
【実施例】
【0062】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、「％（ｍ／ｖ）」は質量／体積パーセント、「％（ｖ／ｖ）」は体積／体積パーセント（体積％）を示す。また、以下において、捕捉用抗体液、定量用標品、ビオチン検出用抗体液、ストレプトアビジンＨＲＰ抗体液および基質溶液〔Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１／１〕は、ＥＬＩＳＡキット〔アール・アンド・ディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１ｂｅｔａ／ＩＬ－１Ｆ２ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標） ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ〕に含まれるものである。各略語の意味は、以下のとおりである。
【0063】
＜略語の説明＞
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素
ＬＰＳ：リポ多糖
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＦＡ：パラホルムアルデヒド
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素
ＬＰＳ：リポ多糖
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＦＡ：パラホルムアルデヒド
【0064】
調製例１
ヒトリンパ球分離用媒体〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ〕を用い、密度勾配遠心法にしたがい、健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞を分離した。末梢血単核細胞２．０×１０8個にＡＣＫ溶解緩衝液（組成：１５０ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウムおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）４ｍＬを添加した。得られた混合物を１５分間室温で静置することにより、前記混合物中の赤血球を溶血させた。
ヒトリンパ球分離用媒体〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ〕を用い、密度勾配遠心法にしたがい、健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞を分離した。末梢血単核細胞２．０×１０8個にＡＣＫ溶解緩衝液（組成：１５０ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウムおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）４ｍＬを添加した。得られた混合物を１５分間室温で静置することにより、前記混合物中の赤血球を溶血させた。
【0065】
死細胞除去キット〔ミリテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社製、商品名：ＭＡＣＳ（登録商標） Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ〕を用い、溶血後の混合物に含まれる死細胞を磁気標識した。得られた混合物を細胞分離用カラム〔ミリテニー・バイオテク社製、商品名：ＬＳカラム〕に供して当該混合物から標識死細胞を除去した。
【0066】
得られた混合物に含まれる末梢血単核細胞を細胞分離試薬〔ミリテニー・バイオテク社製、商品名：ＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏ Ｂｅａｄｓ〕で磁気標識した。得られた混合物から標識末梢血単核細胞を磁気分離することにより、ＣＤ１４陽性（ＣＤ１４+）細胞群を得た。以下において、得られたＣＤ１４陽性細胞群を単離単球として用いた。
【0067】
調製例２
ヒト単球株化細胞ＴＨＰ－１を培地Ａ〔０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地〕において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕と、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕とを表１に示される濃度となるように培地Ａに添加した。その後、ＴＨＰ－１をさらに６時間培養した。なお、ＬＰＳは、炎症性サイトカインＩＬ－１βの発現を誘導する。
ヒト単球株化細胞ＴＨＰ－１を培地Ａ〔０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地〕において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕と、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕とを表１に示される濃度となるように培地Ａに添加した。その後、ＴＨＰ－１をさらに６時間培養した。なお、ＬＰＳは、炎症性サイトカインＩＬ－１βの発現を誘導する。
【0068】
得られた培養物にポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）をその濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように添加した。得られた混合物を氷上に１０分間静置することにより、ＴＨＰ－１溶解物を調製した。ＴＨＰ－１溶解物を１７８００×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を回収することにより、実験番号１－１～１－５の試料を得た。
【0069】
【表1】
【0070】
実施例１
捕捉用抗体液１００μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れた。前記ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩（約８時間）インキュベートした。前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェルを洗浄液〔０．０５％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノウタラート（Ｔｗｅｅｎ－２０）含有ＰＢＳ溶液〕３００μＬで４回洗浄した。洗浄後のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルから残存している洗浄液を除去した。
捕捉用抗体液１００μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れた。前記ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩（約８時間）インキュベートした。前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェルを洗浄液〔０．０５％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノウタラート（Ｔｗｅｅｎ－２０）含有ＰＢＳ溶液〕３００μＬで４回洗浄した。洗浄後のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルから残存している洗浄液を除去した。
【0071】
ブロッキング緩衝液〔０．１％（ｍ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液〕３００μＬを前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れた後、前記ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートした。前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェルを前記洗浄液で４回洗浄した。
【0072】
実験番号１－１～１－５の試料１００μＬまたは定量用標品１００μＬを前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。その後、前記ＥＬＩＳＡプレートを室温でインキュベートした。インキュベーション開始から２時間経過時に前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェル中の反応生成物を洗浄した。
【0073】
洗浄後のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにビオチン検出用抗体液１００μＬを添加した。その後、前記ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベーション開始から２時間経過時に前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェル中の反応生成物を洗浄した。
【0074】
洗浄後のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにストレプトアビジンＨＲＰ抗体液１００μＬを添加した。その後、前記ＥＬＩＳＡプレートを室温でインキュベートした。インキュベーション開始から２０分間経過時に前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェル中の反応生成物を洗浄した。
【0075】
前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに基質溶液〔Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１／１〕１００μＬを添加した後、前記ＥＬＩＳＡプレートを遮光条件下に室温（２５℃）でインキュベートし、反応生成物を染色した。インキュベーション開始から２０分間経過時に、停止溶液５０μＬを前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。
【0076】
前記ＥＬＩＳＡプレートをプレートリーダー〔テカン（ＴＥＣＡＮ）社製、商品名：インフィニット Ｆ２００ ＰＲＯ〕に供し、吸光度を測定した。また、定量用標品の吸光度を測定することにより、吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を得た。吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を用い、各試料のＩＬ－１β質量濃度を算出した。つぎに、各試料のＩＬ－１β質量濃度を用い、式（ＩＩ）：
［ＩＬ－１β相対値（倍）］
＝［試料のＩＬ－１β質量濃度］／［実験番号１－１の試料のＩＬ－１β質量濃度］ （ＩＩ）
にしたがい、ＩＬ－１β相対値を求めた。
［ＩＬ－１β相対値（倍）］
＝［試料のＩＬ－１β質量濃度］／［実験番号１－１の試料のＩＬ－１β質量濃度］ （ＩＩ）
にしたがい、ＩＬ－１β相対値を求めた。
【0077】
試料の種類とＩＬ－１β相対値との関係を調べた結果を図１に示す。図中、レーン１は実験番号１－１の試料のＩＬ－１β相対値、レーン２は実験番号１－２の試料のＩＬ－１β相対値、レーン３は実験番号１－３の試料のＩＬ－１β相対値、レーン４は実験番号１－４の試料のＩＬ－１β相対値、レーン５は実験番号１－５の試料のＩＬ－１β相対値を示す。
【0078】
図１に示された結果から、実験番号１－３～１－５の試料のＩＬ－１β相対値（レーン３～５）は、実験番号１－２の試料のＩＬ－１β相対値（レーン２）と比べて小さいことから、ＴＲＰＶ４が活性化されているときの単球株化細胞のＩＬ－１β発現量は、ＴＲＰＶ４が活性化されていないときの単球株化細胞のＩＬ－１β発現量と比べて少ないことがわかる。また、培地ＡにおけるＴＲＰＶ４アゴニストの量が多いほど、ＩＬ－１β相対値が低くなる傾向があることから、ＴＲＰＶ４活性が増強されるほど、ＩＬ－１β発現量は、減少することがわかる。
【0079】
これらの結果から、単球株化細胞のＴＲＰＶ４の活性化は、ＬＰＳによる炎症誘導条件下での単球株化細胞におけるＩＬ－１β発現量を減少させることから、炎症を抑制させることがわかる。このように、単球株化細胞のＴＲＰＶ４の活性化と炎症の抑制とが関連していることから、被験試料と単球株化細胞とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を用いることにより、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することができることがわかる。また、単球株化細胞のＴＲＰＶ４を活性化させる物質は、ＴＲＰＶ４を活性化させて炎症を抑制することがわかる。
【0080】
調製例３
調製例１で得られた単離単球を培地Ａ〔０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地〕において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。前記培地ＡにおけるＴＲＰＶ４アンタゴニスト〔トクリス（ＴＯＣＲＩＳ）社製、商品名：ＨＣ０６７０４７〕の濃度を０μＭまたは３０μＭに調製し、単離単球をさらに３０分間培養した。
調製例１で得られた単離単球を培地Ａ〔０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地〕において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。前記培地ＡにおけるＴＲＰＶ４アンタゴニスト〔トクリス（ＴＯＣＲＩＳ）社製、商品名：ＨＣ０６７０４７〕の濃度を０μＭまたは３０μＭに調製し、単離単球をさらに３０分間培養した。
【0081】
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４、製品番号：Ｌ２６３０〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕をＬＰＳの濃度が表２に示される濃度となるように前記培地Ａに添加した。その後、単離単球をさらに６時間培養した。
【0082】
得られた培養物にポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）をその濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように添加した。得られた混合物を氷上に１０分間静置することにより、細胞溶解物を調製した。細胞溶解物を１７８００×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を回収することにより、実験番号２－１～２－８の試料を得た。
【0083】
【表2】
【0084】
実施例２
実施例１において、実験番号１－１～１－５の試料を用いる代わりに実験番号２－１～２－８の試料を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することにより、吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を得た。吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を用い、各試料のＩＬ－１β質量濃度を算出した。各試料のＩＬ－１β質量濃度を用い、式（ＩＩＩ）
［ＩＬ－１β相対値（倍）］
＝［試料のＩＬ－１β質量濃度］／［実験番号２－１の試料のＩＬ－１β質量濃度］ （ＩＩＩ）
にしたがい、ＩＬ－１β相対値を求めた。
実施例１において、実験番号１－１～１－５の試料を用いる代わりに実験番号２－１～２－８の試料を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することにより、吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を得た。吸光度とＩＬ－１β質量濃度との関係式を用い、各試料のＩＬ－１β質量濃度を算出した。各試料のＩＬ－１β質量濃度を用い、式（ＩＩＩ）
［ＩＬ－１β相対値（倍）］
＝［試料のＩＬ－１β質量濃度］／［実験番号２－１の試料のＩＬ－１β質量濃度］ （ＩＩＩ）
にしたがい、ＩＬ－１β相対値を求めた。
【0085】
試料の種類とＩＬ－１β相対値との関係を調べた結果を図２に示す。図中、レーン１は実験番号２－１の試料のＩＬ－１β相対値、レーン２は実験番号２－２の試料のＩＬ－１β相対値、レーン３は実験番号２－３の試料のＩＬ－１β相対値、レーン４は実験番号２－４の試料のＩＬ－１β相対値、レーン５は実験番号２－５の試料のＩＬ－１β相対値、レーン６は実験番号２－６の試料のＩＬ－１β相対値、レーン７は実験番号２－７の試料のＩＬ－１β相対値、レーン８は実験番号２－８の試料のＩＬ－１β相対値を示す。
【0086】
図２に示された結果から、実験番号２－３～２－５の試料のＩＬ－１β相対値（レーン３～５）は、実験番号２－２および２－６の試料のＩＬ－１β相対値（レーン２および６）と比べて小さいことから、ＴＲＰＶ４が活性化されているときの単離単球のＩＬ－１β発現量は、ＴＲＰＶ４が活性化されていないときの単離単球のＩＬ－１β発現量と比べて少ないことがわかる。また、培地ＡにおけるＴＲＰＶ４アゴニストの量が多いほど、ＩＬ－１β相対値が低くなる傾向があることから、ＴＲＰＶ４活性が増強されるほど、ＩＬ－１β発現量は、減少することがわかる。
【0087】
なお、実験番号２－７および２－８の試料のＩＬ－１β相対値（レーン７および８）は、実験番号２－１の試料のＩＬ－１β相対値（レーン１）と同程度であることから、ＴＲＰＶ４アゴニストおよびＴＲＰＶ４アンタゴニストは、ＩＬ－１βを誘導しないことがわかる。
【0088】
これらの結果から、単離単球のＴＲＰＶ４の活性化は、ＬＰＳによる炎症誘導条件下での単離単球におけるＩＬ－１β発現量を減少させることから、炎症を抑制させることがわかる。このように、単離単球のＴＲＰＶ４の活性化と炎症の抑制とが関連していることから、被験試料と単離単球とを接触させ、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を用いることにより、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することができることがわかる。また、単離単球のＴＲＰＶ４を活性化させる物質は、ＴＲＰＶ４を活性化させて炎症を抑制することがわかる。
【0089】
調製例４
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表３に示される濃度となるように前記培地Ａに添加し、培地Ｂ～Ｄを得た。
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表３に示される濃度となるように前記培地Ａに添加し、培地Ｂ～Ｄを得た。
【0090】
【表3】
【0091】
実施例３
ＴＨＰ－１を培地Ａ（実験番号３－１）、培地Ｂ（実験番号３－２）、培地Ｃ（実験番号３－３）または培地Ｄ（実験番号３－４）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から６時間経過時にＴＨＰ－１を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
ＴＨＰ－１を培地Ａ（実験番号３－１）、培地Ｂ（実験番号３－２）、培地Ｃ（実験番号３－３）または培地Ｄ（実験番号３－４）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から６時間経過時にＴＨＰ－１を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【0092】
得られたＴＨＰ－１と全ＲＮＡ抽出試薬〔モレキュラー・リサーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製、商品名：Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ〕とを用い、全ＲＮＡ含有溶液を得た。全ＲＮＡ含有溶液にクロロホルムを添加し、ＲＮＡを含有する水層を回収した。前記水層にイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄した後、ＲＮａｓｅ不含水に溶解させ、実験番号３－１～３－４のＲＮＡ試料を得た。
【0093】
実験番号３－１～３－４のＲＮＡ試料と逆転写キット〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製、商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ〕とを用い、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと表４に示されるプライマー対とＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘ〔東洋紡（株）製、商品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ〕とを用いてリアルタイムＰＣＲを行ない、各試料のＩＬ－１β Ｃｔ値およびＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値を得た。
【0094】
【表4】
【0095】
各試料のＩＬ－１β Ｃｔ値およびＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値を用い、式（ＩＶ）：
［ＩＬ－１β ΔＣｔ］
＝［試料のＩＬ－１β Ｃｔ値］－［ＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値］ （ＩＶ）
にしたがい、ＩＬ－１β ΔＣｔを求めた。つぎに、実験番号３－１のＩＬ－１β ΔＣｔ値を１としたときの各実験番号のＩＬ－１β ΔＣｔの相対値を算出した。以下において、ＩＬ－１β ΔＣｔの相対値をｍＲＮＡ量の増加度として用いた。
［ＩＬ－１β ΔＣｔ］
＝［試料のＩＬ－１β Ｃｔ値］－［ＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値］ （ＩＶ）
にしたがい、ＩＬ－１β ΔＣｔを求めた。つぎに、実験番号３－１のＩＬ－１β ΔＣｔ値を１としたときの各実験番号のＩＬ－１β ΔＣｔの相対値を算出した。以下において、ＩＬ－１β ΔＣｔの相対値をｍＲＮＡ量の増加度として用いた。
【0096】
ＲＮＡ試料の種類とＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度との関係を調べた結果を図３に示す。図中、レーン１は実験番号３－１のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン２は実験番号３－２のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン３は実験番号３－３のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン４は実験番号３－４のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度を示す。
【0097】
図３に示される結果から、実験番号３－３のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度は、実験番号３－２のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度と比べて小さいことがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ４が活性化されているときの単球株化細胞におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡ量は、ＴＲＰＶ４が活性化されていないときの単球株化細胞におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡ量と比べて少ないことがわかる。したがって、ＴＲＰＶ４の活性化は、単球株化細胞におけるＩＬ－１βの発現をｍＲＮＡレベルで抑制することがわかる。なお、実験番号３－４のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度は、実験番号３－１のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度と同程度以下であることから、ＴＲＰＶ４アゴニストは、単独では、単球株化細胞におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡの発現に対して影響を与えないことがわかる。
【0098】
調製例５
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表５に示される濃度となるように前記培地Ａに添加し、培地Ｅ～Ｇを得た。
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表５に示される濃度となるように前記培地Ａに添加し、培地Ｅ～Ｇを得た。
【0099】
【表5】
【0100】
実施例４
調製例１で得られた単離単球を培地Ａ（実験番号４－１）、培地Ｅ（実験番号４－２）、培地Ｆ（実験番号４－３）または培地Ｇ（実験番号４－４）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から６時間経過時に単離単球を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
調製例１で得られた単離単球を培地Ａ（実験番号４－１）、培地Ｅ（実験番号４－２）、培地Ｆ（実験番号４－３）または培地Ｇ（実験番号４－４）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から６時間経過時に単離単球を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【0101】
得られた単離単球と全ＲＮＡ抽出試薬〔モレキュラー・リサーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製、商品名：Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ〕とを用い、全ＲＮＡ含有溶液を得た。全ＲＮＡ含有溶液にクロロホルムを添加し、ＲＮＡを含有する水層を回収した。前記水層にイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄した後、ＲＮａｓｅ不含水に溶解させ、実験番号４－１～４－４のＲＮＡ試料を得た。
【0102】
実験番号４－１～４－４のＲＮＡ試料と逆転写キット〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製、商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ〕とを用い、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと表３に示されるプライマー対とＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘ〔東洋紡（株）製、商品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ〕とを用いてリアルタイムＰＣＲを行ない、各試料のＩＬ－１β Ｃｔ値およびＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値を得た。
【0103】
各試料のＩＬ－１β Ｃｔ値およびＧＡＰＤＨ Ｃｔ値の平均値を用い、前記式（ＩＶ）にしたがい、ＩＬ－１β ΔＣｔを求めた。つぎに、実験番号４－１のＩＬ－１β ΔＣｔ値を１としたときの各実験番号のＩＬ－１β ΔＣｔの相対値を算出した。以下において、ＩＬ－１β ΔＣｔの相対値をｍＲＮＡ量の増加度として用いた。
【0104】
実施例４において、ＲＮＡ試料の種類とＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度との関係を調べた結果を図４に示す。図中、レーン１は実験番号４－１のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン２は実験番号４－２のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン３は実験番号４－３のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度、レーン４は実験番号４－４のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度を示す。
【0105】
図４に示される結果から、実験番号４－３のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度は、実験番号４－２のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度と比べて小さいことがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ４が活性化されているときの単離単球におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡ量は、ＴＲＰＶ４が活性化されていないときの単離単球におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡ量と比べて少ないことがわかる。したがって、単離単球のＴＲＰＶ４の活性化は、単球株化細胞の場合と同様に、ＩＬ－１βの発現をｍＲＮＡレベルで抑制することがわかる。なお、実験番号４－４のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度は、実験番号４－１のＲＮＡ試料のＩＬ－１β ｍＲＮＡ量の増加度と同程度以下であることから、ＴＲＰＶ４アゴニストは、単独では、単離単球におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡの発現に対して影響を与えないことがわかる。
【0106】
調製例６
単球株化細胞ＴＨＰ－１を培地Ａにおいて、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。カルシウムキレート化剤〔アール・アンド・ディーシステムズ社製、商品名：ＢＡＰＴＡ－ＡＭ〕を表６に示される濃度となるように添加した。カルシウムキレート化剤の添加時から３０分間経過後、ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕と、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表６に示される濃度となるように添加し、ＴＨＰ－１をさらに６時間培養した。
単球株化細胞ＴＨＰ－１を培地Ａにおいて、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。カルシウムキレート化剤〔アール・アンド・ディーシステムズ社製、商品名：ＢＡＰＴＡ－ＡＭ〕を表６に示される濃度となるように添加した。カルシウムキレート化剤の添加時から３０分間経過後、ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４〕と、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表６に示される濃度となるように添加し、ＴＨＰ－１をさらに６時間培養した。
【0107】
得られた培養物にポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）をその濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように添加した。得られた混合物を氷上に１０分間静置することにより、ＴＨＰ－１溶解物を調製した。ＴＨＰ－１溶解物を１７８００×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を回収することにより、実験番号５－１～５－４の試料を得た。
【0108】
【表6】
【0109】
実施例５
実施例１において、実験番号１－１～１－５の試料を用いる代わりに実験番号５－１～５－４の試料を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することで得られた吸光度とＩＬ－１β質量濃度の関係式を用い、試料に含まれるＩＬ－１βの質量濃度を算出した。
実施例１において、実験番号１－１～１－５の試料を用いる代わりに実験番号５－１～５－４の試料を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することで得られた吸光度とＩＬ－１β質量濃度の関係式を用い、試料に含まれるＩＬ－１βの質量濃度を算出した。
【0110】
試料の種類とＩＬ－１β質量濃度との関係を調べた結果を図５に示す。図中、レーン１は実験番号５－１の試料のＩＬ－１β質量濃度、レーン２は実験番号５－２の試料のＩＬ－１β質量濃度、レーン３は実験番号５－３の試料のＩＬ－１β質量濃度、レーン４は実験番号５－４の試料のＩＬ－１β質量濃度を示す。
【0111】
図５に示された結果から、実験番号５－３の試料のＩＬ－１β質量濃度（レーン３）は、実験番号５－２の試料のＩＬ－１β質量濃度（レーン２）と比べて低いことがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ４アゴニストによって単球株化細胞のＴＲＰＶ４が活性化されているときの単球株化細胞のＩＬ－１β発現量は、ＴＲＰＶ４が活性化されていないときの単球株化細胞のＩＬ－１β発現量と比べて少ないことがわかる。また、図５に示された結果から、実験番号５－４の試料のＩＬ－１β質量濃度（レーン４）は、実験番号５－２の試料のＩＬ－１β質量濃度（レーン２）と比べて高いことがわかる。実験番号５－４では、カルシウムキレート化剤が用いられているため、当該カルシウムキレート化剤と細胞内カルシウムイオンとがキレート錯体を形成することから、イオンチャネルとして機能するＴＲＰＶ４の活性化によるＩＬ－１β発現抑制作用が低下していると考えられる。
【0112】
調製例７
ＦＢＳおよび抗生物質〔ギブコ社製、商品名：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ〕をＦＢＳの濃度が２０％（ｖ／ｖ）、抗生物質の濃度が１％（Ｖ/Ｖ）となるようにＲＰＭＩ１６３０培地に添加し、培地Ｈを得た。
ＦＢＳおよび抗生物質〔ギブコ社製、商品名：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ〕をＦＢＳの濃度が２０％（ｖ／ｖ）、抗生物質の濃度が１％（Ｖ/Ｖ）となるようにＲＰＭＩ１６３０培地に添加し、培地Ｈを得た。
【0113】
ＧＭ－ＣＳＦ〔シェナンドー（ＳＨＥＮＡＮＤＯＡＨ）社製、製品番号：１００－０８〕、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕およびＴＲＰＶ４アンタゴニスト〔シグマ－アルドリッチ社製、商品名：ＧＳＫ２１９３８７４〕を表７に示される濃度となるように培地Ｈに添加し、培地Ｉ～Ｋを得た。
【0114】
【表7】
【0115】
調製例８
Ｍ－ＣＳＦ〔シェナンドー社製、製品番号：１００－０３〕、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕およびＴＲＰＶ４アンタゴニスト〔シグマ－アルドリッチ社製、商品名：ＧＳＫ２１９３８７４〕を表８に示される濃度となるように培地Ｈに添加し、培地Ｌ～Ｎを得た。
Ｍ－ＣＳＦ〔シェナンドー社製、製品番号：１００－０３〕、ＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕およびＴＲＰＶ４アンタゴニスト〔シグマ－アルドリッチ社製、商品名：ＧＳＫ２１９３８７４〕を表８に示される濃度となるように培地Ｈに添加し、培地Ｌ～Ｎを得た。
【0116】
【表8】
【0117】
実施例６
調製例１で得られた単離単球を、培地Ｈ（実験番号６－１）、培地Ｉ（実験番号６－２）、培地Ｊ（実験番号６－３）、培地Ｋ（実験番号６－４）、培地Ｌ（実験番号６－５）、培地Ｍ（実験番号６－６）または培地Ｎ（実験番号６－７）が入った培養容器において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。なお、培養開始から２日間および５日間経過時に、新鮮な培地を単離単球の培養系に追加した。
調製例１で得られた単離単球を、培地Ｈ（実験番号６－１）、培地Ｉ（実験番号６－２）、培地Ｊ（実験番号６－３）、培地Ｋ（実験番号６－４）、培地Ｌ（実験番号６－５）、培地Ｍ（実験番号６－６）または培地Ｎ（実験番号６－７）が入った培養容器において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で培養した。なお、培養開始から２日間および５日間経過時に、新鮮な培地を単離単球の培養系に追加した。
【0118】
培養開始から７日間経過時に、細胞培養物を回収した。なお、接着細胞は、細胞解離試薬〔ギブコ社製、商品名：ＴｒｙｐＬＥTM ｅｘｐｒｅｓｓ〕を培養容器内に添加し、３７℃で１５分間静置した後、ピペッティングすることによって回収した。得られた細胞培養物をＰＢＳで洗浄した。
【0119】
死細胞染色色素〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ ｋｉｔ〕を用い、細胞培養物に含まれる死細胞を染色した。その後、細胞培養物を抗ＣＤ１４抗体〔バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）社製、商品名：ＢＶ４２１ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１４〕および抗ＣＤ１１ｂ抗体〔バイオレジェンド社製、商品名：ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ〕とともに室温で１０分間インキュベートすることにより、細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜上のＣＤ１４およびＣＤ１１ｂを染色した。染色後の細胞培養物をＰＢＳで洗浄した。
【0120】
洗浄後の細胞培養物を０．５％（ｖ／ｖ）ＰＦＡ含有ＰＢＳ溶液に浸漬させ、室温で１０分間固定した。固定後の細胞培養物を透過処理剤〔０．１％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）含有ＰＢＳ溶液〕中でインキュベーションすることにより、細胞膜透過処理を行なった。処理後の細胞培養物をＰＢＳで洗浄した。
【0121】
洗浄後の細胞培養物を抗ＣＤ６８抗体〔バイオレジェンド社製、商品名：ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ６８〕ともに室温で１０分間インキュベートすることにより、細胞培養物に含まれる細胞の内部のＣＤ６８を染色した。染色後の細胞培養物をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁し、試料を得た。
【0122】
得られた試料をフローサイトメータ〔ビーディー（ＢＤ）社製、商品名：ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ ＩＩ〕に供した。ＣＤ１４弱陽性、ＣＤ１１ｂ陽性およびＣＤ６８陽性を示す細胞をＭ１型マクロファージとしてソーティングし、ＣＤ１４陽性、ＣＤ１１ｂ陽性およびＣＤ６８陽性を示す細胞をＭ２型マクロファージとしてソーティングすることにより、試料におけるＭ１型マクロファージおよびＭ２型マクロファージそれぞれの含有率を算出した。その結果を表９に示す。
【0123】
【表9】
【0124】
表９に示された結果から、実験番号６－３のＭ１型マクロファージの含有率は、実験番号６－２および６－４のＭ１型マクロファージの含有率と比べて低いことがわかる。これらの結果から、単離単球のＴＲＰＶ４の活性化は、単離単球からＭ１型マクロファージへの分化を抑制することがわかる。Ｍ１型マクロファージは、炎症を引き起こすことから、単離単球のＴＲＰＶ４を活性化させる物質は、炎症を抑制することがわかる。
【0125】
また、表９に示された結果から、実験番号６－６のＭ２型マクロファージの含有率は、実験番号６－５および６－７のＭ２型マクロファージの含有率と同程度以上であることがわかる。これらの結果から、単離単球のＴＲＰＶ４の活性化は、単離単球からＭ２型マクロファージへの分化を抑制しないことがわかる。Ｍ２型マクロファージは、炎症を抑制することから、単離単球のＴＲＰＶ４を活性化させる物質は、炎症を抑制することがわかる。
【0126】
以上のことから、実施例１～６において、ＴＲＰＶ４アゴニストを用いる代わりに被験試料を用い、単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有する抗炎症作用を評価するという操作を採ることにより、被験試料が有する抗炎症作用、好ましくは単球のＴＲＰＶ４の活性化を介した抗炎症作用を容易に評価することができることがわかる。
【0127】
調製例９
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：Ｌ２６３０〕、Ｋ３ＣｐＧ〔ジーン・デザイン（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ）社製、製品番号：ＣＮ６５００３）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４〔インビトロジェン社製、製品番号：ｔｌｒｌ－ｐｍｓ〕、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：ｐ１５３０〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表１０に示される濃度となるように培地Ａに添加し、血清飢餓培地１～９を得た。
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：Ｌ２６３０〕、Ｋ３ＣｐＧ〔ジーン・デザイン（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ）社製、製品番号：ＣＮ６５００３）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４〔インビトロジェン社製、製品番号：ｔｌｒｌ－ｐｍｓ〕、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：ｐ１５３０〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表１０に示される濃度となるように培地Ａに添加し、血清飢餓培地１～９を得た。
【0128】
【表10】
【0129】
調製例１０
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：Ｌ２６３０〕、Ｋ３ＣｐＧ〔ジーン・デザイン（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ）社製、製品番号：ＣＮ６５００３）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４〔インビトロジェン社製、製品番号：ｔｌｒｌ－ｐｍｓ〕、ｐｏｌｙ Ｉ:Ｃ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：ｐ１５３０〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表１１に示される濃度となるように培地Ａに添加し、通常培地１～９を得た。
ＬＰＳ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：Ｌ２６３０〕、Ｋ３ＣｐＧ〔ジーン・デザイン（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ）社製、製品番号：ＣＮ６５００３）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４〔インビトロジェン社製、製品番号：ｔｌｒｌ－ｐｍｓ〕、ｐｏｌｙ Ｉ:Ｃ〔シグマ－アルドリッチ社製、製品番号：ｐ１５３０〕およびＴＲＰＶ４アゴニスト〔和光純薬（株）製、商品名：ＧＳＫ１０１６７９０Ａ〕を表１１に示される濃度となるように培地Ａに添加し、通常培地１～９を得た。
【0130】
【表11】
【0131】
実施例７
（１）血清飢餓培養
調製例１で得られた単離単球を血清飢餓培地１（実験番号７－１）、血清飢餓培地２（実験番号７－２）、血清飢餓培地３（実験番号７－３）、血清飢餓培地４（実験番号７－４）、血清飢餓培地５（実験番号７－５）、血清飢餓培地６（実験番号７－６）、血清飢餓培地７（実験番号７－７）、血清飢餓培地８（実験番号７－８）または血清飢餓培地９（対照；実験番号７－９）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で６時間培養した。
（１）血清飢餓培養
調製例１で得られた単離単球を血清飢餓培地１（実験番号７－１）、血清飢餓培地２（実験番号７－２）、血清飢餓培地３（実験番号７－３）、血清飢餓培地４（実験番号７－４）、血清飢餓培地５（実験番号７－５）、血清飢餓培地６（実験番号７－６）、血清飢餓培地７（実験番号７－７）、血清飢餓培地８（実験番号７－８）または血清飢餓培地９（対照；実験番号７－９）において、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気中で６時間培養した。
【0132】
得られた培養物にポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）をその濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように添加した。得られた混合物を氷上に１０分間静置することにより、単球溶解物を調製した。単球溶解物を１７８００×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を回収することにより、実験番号７－１～７－９の試料を得た。
【0133】
得られた試料と測定試薬〔イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製、商品名：Ｐｒｏｃａｒｔａ Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（２０ｐｌｅｘ）〕を用い、炎症関連因子の発現量を測定した。ＴＲＰＶ４アゴニストを含有していない培地を用いたときの炎症関連因子の発現量と、ＴＲＰＶ４アゴニストを含有している培地を用いたときの炎症関連因子の発現量とを比較し、ＴＲＰＶ４の活性化によって発現量が減少した炎症関連因子を調べた。
【0134】
（２）通常培養
実施例７（１）において、血清飢餓培地１、血清飢餓培地２、血清飢餓培地３、血清飢餓培地４、血清飢餓培地５、血清飢餓培地６、血清飢餓培地７、血清飢餓培地８または血清飢餓培地９を用いる代わりに通常培地１（実験番号８－１）、通常培地２（実験番号８－２）、通常培地３（実験番号８－３）、通常培地４（実験番号８－４）、通常培地５（実験番号８－５）、通常培地６（実験番号８－６）、通常培地７（実験番号８－７）、通常培地８（実験番号８－８）または通常培地９（対照；実験番号８－９）を用いたことを除き、実施例７（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ４の活性化によって発現量が減少した炎症関連因子を調べた。
実施例７（１）において、血清飢餓培地１、血清飢餓培地２、血清飢餓培地３、血清飢餓培地４、血清飢餓培地５、血清飢餓培地６、血清飢餓培地７、血清飢餓培地８または血清飢餓培地９を用いる代わりに通常培地１（実験番号８－１）、通常培地２（実験番号８－２）、通常培地３（実験番号８－３）、通常培地４（実験番号８－４）、通常培地５（実験番号８－５）、通常培地６（実験番号８－６）、通常培地７（実験番号８－７）、通常培地８（実験番号８－８）または通常培地９（対照；実験番号８－９）を用いたことを除き、実施例７（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ４の活性化によって発現量が減少した炎症関連因子を調べた。
【0135】
ＴＲＰＶ４の活性化によって発現量が減少した炎症関連因子を表１２～１４に示す。
【0136】
【表12】
【0137】
【表13】
【0138】
【表14】
【0139】
以上の結果から、ＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象として表１２～１４に記載の炎症関連因子またはそのｍＲＮＡの発現量の減少を用いることができることがわかる。
【0140】
以上説明したように、単球のＴＲＰＶ４の活性化は、炎症誘導条件下での単球におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡの発現を抑制することから、炎症を抑制させることがわかる。このように、単球のＴＲＰＶ４の活性化と炎症の抑制とが関連していることから、被験試料による単球のＴＲＰＶ４の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、被験試料の評価に当該生理学的事象を用いることにより、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することができることがわかる。また、単球のＴＲＰＶ４を活性化させる物質は、ＴＲＰＶ４を活性化させて炎症を抑制することがわかる。したがって、本発明は、炎症予防用化粧料、炎症予防剤などの開発に好適に用いられることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【0141】
配列番号：１は、ＩＬ－１βフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２は、ＩＬ－１βリバースプライマーの配列である。
配列番号：３は、ＧＡＰＤＨフォワードプライマーの配列である。
配列番号：４は、ＧＡＰＤＨリバースプライマーの配列である。
配列番号：２は、ＩＬ－１βリバースプライマーの配列である。
配列番号：３は、ＧＡＰＤＨフォワードプライマーの配列である。
配列番号：４は、ＧＡＰＤＨリバースプライマーの配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】