特許7202890生理学的応答性マイクロニードル送達システムに関連する方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-28
(45)【発行日】2023-01-12
(54)【発明の名称】生理学的応答性マイクロニードル送達システムに関連する方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61M 37/00 20060101AFI20230104BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20230104BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20230104BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230104BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230104BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230104BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20230104BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230104BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20230104BHJP
【ＦＩ】
A61M37/00 512
A61K9/70
A61K38/28
A61K45/00
A61K47/36
A61K47/42
A61K47/46
A61P3/10
C12M1/00 A
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2018544087
(86)(22)【出願日】2017-02-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-03-14
(86)【国際出願番号】 US2017018319
(87)【国際公開番号】W WO2017143153
(87)【国際公開日】2017-08-24
【審査請求日】2020-02-14
【審判番号】
【審判請求日】2021-12-28
(31)【優先権主張番号】62/297,346
(32)【優先日】2016-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518073480
【氏名又は名称】ノース カロライナ ステート ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】グー チェン
(72)【発明者】
【氏名】イェ ヤンチー
【合議体】
【審判長】村上 聡
【審判官】佐々木 一浩
【審判官】宮部 愛子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００３／００８３６１８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１５３９００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第５７７３２５５（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61M37/00
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の生物学的障壁をわたって材料を輸送するためのデバイスであって、各々が基端部及び先端部を有し、少なくとも１つの経路が前記基端部及び前記先端部にまたは前記基端部と前記先端部との間に配設された複数のマイクロニードルと、
前記マイクロニードルの前記基端部が結合または統合される基板と、
前記マイクロニードルアレイの前記基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、前記リザーバーが、インスリン送達システムを備え、前記インスリン送達システムが、膵臓β細胞を含み、前記膵臓β細胞が、前記生物学的障壁をわたって輸送されるインスリンを生成し、かつレシピエントからのグルコースシグナルを検出する、前記リザーバーと、
前記マイクロニードル内に統合されたグルコースシグナル増幅器システムであって、前記レシピエントからの前記グルコースシグナルを増幅することができる構成要素を備え、前記細胞が、前記グルコースシグナル増幅器システムからの増幅されたグルコースシグナルに基づいて、インスリンを生成するか、または生成されるインスリンの量を変更する、前記グルコースシグナル増幅器システムと、を備える、前記デバイス。
【請求項2】
前記生物学的障壁をわたって輸送される前記インスリンの体積または量が、前記グルコースシグナルに基づいて変更され得る、請求項１に記載のデバイス。
【請求項3】
前記レシピエントからの前記グルコースシグナルが、前記グルコースシグナル増幅器システムからの増幅なしでは検出されるのに不十分である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項4】
前記リザーバーが、半透過性である、請求項１～３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項5】
前記リザーバーが、アルギン酸マイクロゲルを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項6】
前記リザーバーが、治療的、予防的、または診断的薬剤を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項7】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、自己組織化重合体ナノサイズ小胞を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項8】
前記グルコースシグナル増幅器が、グルコースオキシダーゼ、α－アミラーゼ、及びグルコアミラーゼを含む、請求項７に記載のデバイス。
【請求項9】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、前記マイクロニードルの前記先端部内にある、請求項１～８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項10】
治療を必要とする対象（ヒトを除く）における疾患を治療する方法であって、ａ）マイクロニードルパッチを前記対象に提供することであって、前記マイクロニードルパッチが、請求項１に記載のデバイスである、前記提供することと、
ｂ）前記マイクロニードルを前記生物学的障壁内に挿入することと、
ｃ）前記インスリンを、前記マイクロニードルを通して前記生物学的障壁内に送達することであって、送達されるインスリンの量または体積が、前記グルコースシグナル増幅器システムから受容されるグルコースシグナルによって決定される、前記送達することと、を含む、前記方法。
【請求項11】
前記リザーバーが、細胞生成物を送達するのに使用され得る材料マトリックスで構成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記リザーバーが、アルギン酸マイクロゲルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、グルコースシグナルを拡大し、それにより前記対象において存在する前記グルコースシグナルの強度に基づいて輸送されるインスリンの前記体積または量を変更する、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記生物学的障壁をわたって輸送される前記インスリンの体積または量が、前記グルコースシグナルに基づいて変更され得る、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記レシピエントからの前記グルコースシグナルが、前記グルコースシグナル増幅器システムからの増幅なしでは検出されるのに不十分である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、自己組織化重合体ナノサイズ小胞を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記グルコースシグナル増幅器が、グルコースオキシダーゼ、α－アミラーゼ、及びグルコアミラーゼを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、前記マイクロニードルの前記先端部内にある、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が、糖尿病と診断されている、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
治療的、予防的、または診断的薬剤を生物学的障壁をわたって送達するための部品のキットであって、ａ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードル、ならびに前記マイクロニードルの前記基端部が結合または統合される基板を備える、マイクロニードルパッチと、
ｂ）前記マイクロニードルアレイの前記基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、前記リザーバーが、インスリン送達システムを備え、前記インスリン送達システムが、膵臓β細胞を含み、前記膵臓β細胞が、前記生物学的障壁をわたって輸送されるインスリンを生成し、かつレシピエントからのグルコースシグナルを検出する、前記リザーバーと、
ｃ）前記マイクロニードル内に統合されたグルコースシグナル増幅器システムであって、送達されるインスリンの体積または量が、前記グルコースシグナル増幅器システムから受容されるグルコースシグナルに基づいて変更され、前記細胞が、前記グルコースシグナル増幅器システムからの増幅されたグルコースシグナルに基づいて、インスリンを生成するか、または生成されるインスリンの量を変更する、前記グルコースシグナル増幅器システムと、を含む、前記キット。
【請求項21】
前記リザーバーが、細胞生成物を送達するのに使用される材料マトリックスで構成される、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記リザーバーが、半透過性である、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項23】
前記リザーバーが、アルギン酸マイクロゲルを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項24】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、自己組織化重合体ナノサイズ小胞を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項25】
前記グルコースシグナル増幅器が、グルコースオキシダーゼ、α－アミラーゼ、及びグルコアミラーゼを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項26】
前記グルコースシグナル増幅器システムが、前記マイクロニードルの前記先端部内にある、請求項２０～２５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月１９日出願の米国仮特許出願第６２／２９７，３４６号の利益を主張し、これによりこの仮特許出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年２月１９日出願の米国仮特許出願第６２／２９７，３４６号の利益を主張し、これによりこの仮特許出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
真性糖尿病は、最も困難な慢性疾患のうちの１つとして、現在世界中で３億８７００万人を超える人々が発症しており、この数は２０３０年までに約５億人まで増加すると予想されている（Ｊ．Ｅ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０１０，８７，４、Ｂ．Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＩＤＦ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｔｌａｓ，６ｔｈ ｅｄｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ２０１３）。生涯にわたる外因性インスリンの提供は、１型糖尿病の治療にとって必須である（Ｍａｔｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２０１３，３６Ｓｕｐｐｌｙ１，Ｓ ６７、Ｒ．Ａ．Ｈａｙｗａｒｄ，Ｊａｍａ １９９７，２７８，１６６３、Ｄ．Ｒ．Ｏｗｅｎｓ，Ｂ．Ｚｉｎｍａｎ，Ｇ．Ｂ．Ｂｏｌｌｉ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ２００１，３５８，７３９、Ｒ．Ａ．Ｈａｙｗａｒｄ，Ｊａｍａ １９９７，２７８，１６６３、Ｄ．Ｒ．Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００１，３５８，７３９）。しかしながら、２０１４年には世界中で４９００万人の糖尿病関連死の予想が存在した。従来のインスリン注射の重要な制約は不適切な血糖制御にあり、これは失明、肢切断、及び腎不全などの糖尿病合併症をもたらす。逆に、インスリンでの過剰治療は低血糖を引き起こし、これは行動及び認知障害、発作、脳損傷、または死をもたらし得る（Ｍｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４，４３，３５９５、Ｃ．Ｒｉｃｏｒｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４，４，２５９、Ｇ．Ｓｔｅｉｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００４，５６，１２５、Ｚ．Ｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１１，４０，３６３８）。
【0003】
１型糖尿病の治療のために、インスリン生成細胞の移植が集中的に探究されている（Ｓ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００８，８６，１７６２）。しかしながら、移植された細胞の宿主認識、ドナー細胞への依存、及び広範な免疫抑制療法の必要性のために、直接的な細胞の埋め込みは、糖尿病管理において限定された役割を有している（Ｓ．Ｍｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００８，９５，１４４９、Ｒ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，４３，３２３９、Ａ．Ｒ．Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，３３，５１８）。代替的な技術は、膵臓β細胞を半透過性の容器内に被包し、被包された細胞への栄養素及び酸素の拡散及び輸送を依然として可能にしながら、それらを免疫系から単離し、保護することである（Ｈ． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２００７，７，３１４、Ｅ．Ｐｅｄｒａｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，１０９，４２４５、Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１０８，６３８０）。それにも関わらず、細胞カプセル埋め込みまたは撤去は通常、外科手順を必要とする。より重要なことに、細胞カプセルの生体適合性はしばしば損なわれ、持続的な炎症、異物巨細胞の形成、線維症、周囲組織への損傷、及びグルコースを制御するための埋め込みの失敗をもたらす（Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５２４，３９、Ｚ．Ｇｕ，Ａ．Ａ．Ａｉｍｅｔｔｉ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｔ．Ｄａｎｇ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．Ｓ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１３，７，４１９４、Ｗ．Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，３４９５）。組成物を、それを必要とする対象に送達するためのデバイス及び方法であって、手術を必要としないデバイス及び方法が、当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
対象の生物学的障壁をわたって材料を輸送するためのデバイスであって、各々が基端部及び先端部を有し、少なくとも１つの経路が基端部及び先端部にまたは基端部と先端部との間に配設された複数のマイクロニードルと、マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーと、シグナル増幅器システムであって、レシピエントからの生理学的シグナルを増幅することができる構成要素を備える、シグナル増幅器システムとを備える、デバイスが本明細書に開示される。
【0005】
対象の生物学的障壁をわたって材料を輸送するためのデバイスであって、各々が基端部及び先端部を有し、少なくとも１つの経路が基端部及び先端部にまたは基端部と先端部との間に配設された複数のマイクロニードルと、マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及び生理学的シグナルを検出するための手段を含み、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤の体積または量が生理学的シグナルに基づいて変更され得るように、薬剤送達システムが、フィードバック構成要素を備える、リザーバーとを備える、デバイスもまた本明細書に開示される。
【0006】
治療を必要とする対象における疾患を治療する方法であって、ａ）マイクロニードルパッチを対象に提供することであって、マイクロニードルパッチが、ｉ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードルと、ｉｉ）マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、ｉｉｉ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーと、ｉｖ）シグナル増幅器システムであって、レシピエントからの生理学的シグナルを増幅することができる構成要素を備える、シグナル増幅器システムとを備える、提供することと、ｂ）マイクロニードルを生物学的障壁内に挿入することと、ｃ）薬剤を、マイクロニードルを通して生物学的障壁内に送達することであって、送達される薬剤の量または体積が、シグナル増幅器システムから受容されるシグナルによって決定される、送達することとを含む、方法も更に本明細書に開示される。
【0007】
治療を必要とする対象における疾患を治療する方法であって、ａ）マイクロニードルパッチを対象に提供することであって、マイクロニードルパッチが、ｉ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードルと、ｉｉ）マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、ｉｉｉ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及び生理学的シグナルを検出するための手段を含み、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤の体積または量が生理学的シグナルに基づいて変更され得るように、薬剤送達システムが、フィードバック構成要素を備える、リザーバーとを備える、提供することと、ｂ）マイクロニードルを生物学的障壁内に挿入することと、ｃ）薬剤を、マイクロニードルを通して生物学的障壁内に送達することであって、送達される薬剤の量または体積が、生理学的シグナルに基づく、送達することとを含む、方法もまた本明細書に開示される。
【0008】
治療的、予防的、または診断的薬剤を生物学的障壁をわたって送達するための部品のキットであって、ａ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードル、ならびにマイクロニードルの基端部が結合または統合される基板を備える、マイクロニードルパッチと、ｂ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーと、ｃ）シグナル増幅器システムであって、送達される薬剤の体積または量が、シグナル増幅器システムから受容されるシグナルに基づいて変更される、シグナル増幅器システムとを含む、キットが本明細書に開示される。
【0009】
治療的、予防的、または診断的薬剤を生物学的障壁をわたって送達するための部品のキットであって、ａ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードル、ならびにマイクロニードルの基端部が結合または統合される基板を備える、マイクロニードルパッチと、ｂ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーとを含む、キットもまた本明細書に開示される。
【0010】
対象の生物学的障壁をわたって材料を輸送するためのデバイスであって、
各々が基端部及び先端部を有し、少なくとも１つの経路が基端部及び先端部にまたは基端部と先端部との間に配設された複数のマイクロニードルと、
マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、
マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーとを備える、デバイスが本明細書に開示される。
各々が基端部及び先端部を有し、少なくとも１つの経路が基端部及び先端部にまたは基端部と先端部との間に配設された複数のマイクロニードルと、
マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、
マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーとを備える、デバイスが本明細書に開示される。
【0011】
薬剤送達システムは、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤の体積または量が生理学的シグナルに基づいて変更され得るように、例えば、フィードバック構成要素を備え得る。フィードバック構成要素は、シグナルが検出されるときは薬剤送達システムが薬剤をレシピエントに送達し得るが、シグナルが検出されないときは薬剤が送達されないように、「オン及びオフ」スイッチを備え得る。逆に、シグナルの検出は逆の効果を有してもよく、シグナルが検出されない限り、薬剤送達システムが薬剤をレシピエントに送達せず、これは、薬剤送達システムにレシピエントへの送達のための薬剤を放出させない。説明として、フィードバック構成要素はレシピエントにおける病原体の存在（薬剤）を検出し得、薬剤が検出されるとき、フィードバック構成要素はリザーバーから抗体の放出を可能にし得る。
【0012】
別の例において、フィードバック構成要素は、ｐＨまたは温度などの生理学的シグナルの変化を検出し得る。フィードバック構成要素は、「カットオフ値」を含み得ることで、ｐＨもしくは温度が特定の値だけ変化するか、または特定の数値（例えば、６．５未満のｐＨ、もしくは例えば、９９．１超の温度）に到達したとき、フィードバック構成要素が、薬剤の放出、または放出され、その後レシピエントに投与される薬剤の量の変更を可能にする。
【0013】
フィードバック構成要素はまた、検出されるシグナルの量に基づいて放出される薬剤の量または体積も調節し得ることで、より多い量のシグナルの検出がより多い量の薬剤の放出をもたらし得るか、または逆に、より多い量のシグナルの検出がより少ない量の薬剤の放出をもたらし得る。
【0014】
任意で、デバイスは、シグナル増幅器システムを備えてもよく、シグナル増幅器システムは、レシピエントからの生理学的シグナルを増幅することができる構成要素を備える。シグナル増幅器システムは、シグナルを増加させることによって機能し、これは、薬剤送達システムによって検出されるシグナルを増加させる。これは、生理学的シグナルにおける非常に小さな変化を検出する必要性が存在する場合、または薬剤送達システムがシグナルの増幅なしでは変化を検出するのに十分に感受性ではない場合に行われ得る。シグナル増幅器システムの一例を、実施例１に見出すことができる。
【0015】
シグナル増幅器システムは、マイクロニードル内に統合され得る。例えば、シグナル増幅器システムは、マイクロニードルの外側のコーティングとして、またはマイクロニードルの先端部の内側のいずれかで、マイクロニードルの先端部内にあり得る。
【0016】
一態様において、検出される生理学的シグナルは、レシピエントにおいて存在する任意の物質であり得る。例えば、生理学的シグナルは、生物学的物質または薬物であり得る。物質は、レシピエントにおいて天然に存在し得るか、非内因性、つまり外来性物質であり得るかのいずれかである。別の態様において、対象における生理学的応答は、ｐＨ及び温度を含む生理学的環境因子を含み得る。生理学的シグナルの例としては、グルコース、コレステロール、ビリルビン、クレアチン、代謝酵素、ヘモグロビン、ヘパリン、凝固因子、尿酸、癌胎児抗原または他の腫瘍抗原、生殖ホルモン、酸素、ｐＨ、温度、アルコール、タバコ代謝物、ならびに違法薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0017】
レシピエントに送達されるリザーバー内の薬剤は、治療的、予防的、または診断的薬剤であり得る。例えば、薬剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、有機分子、生物活性無機分子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。例えば、幅広い薬物が、本マイクロニードルデバイス及び方法による送達のために製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「薬物」または「薬物製剤」という用語は、治療的、予防的、もしくは診断的薬剤、または刺青及び化粧品などのための薬学的賦形剤及び物質を含む、生体組織への導入に好適であり得る他の物質を指す。薬物は、生物学的活性を有する物質であり得る。薬物製剤は、液体溶液、ゲル、固体粒子（例えば、マイクロ粒子もしくはナノ粒子）、またはこれらの組み合わせなどの様々な形態を含み得る。薬物は、小分子、大（すなわち、巨大）分子、またはこれらの組み合わせを含み得る。代表的な非限定的ではない実施形態において、薬物は、アミノ酸、ワクチン、抗ウイルス剤、遺伝子送達ベクター、インターロイキン阻害剤、免疫調節剤、向神経因子、神経保護剤、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、多糖類、抗凝固剤、抗生物質、鎮痛剤、麻酔剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、及びウイルスの中から選択され得る。薬物は、天然に存在するか、合成されるか、または組み換えで生成される、好適なタンパク質、ペプチド、及びこれらの断片から選択され得る。一実施形態において、薬物製剤は、インスリンを含む。
【0018】
薬物製剤は、当該技術分野において既知である、ｐＨ修飾剤、粘度修飾剤、希釈剤などを含む１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含み得る。具体的には、薬剤は、インスリンであり得る。
【0019】
本明細書に開示されるデバイスは、それ自体の放出用の薬剤、または生物学的障壁リザーバーをわたって輸送される薬剤を生成するための手段を含み得る。薬剤を生成するための手段の一例は、細胞である。細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であっても、レシピエントに投与するための薬剤を生成することができる任意の他の供給源に由来する細胞あってもよい。例えば、細胞は、膵臓β細胞または幹細胞分化ヒト膵臓細胞であり得る。
【0020】
薬剤、または薬剤を生成するための手段は、例えば、半透過性であるリザーバー内に配設され得る。これは、レシピエントとの流体の交換を可能にし得ることで、フィードバック構成要素がレシピエントと流体連通の状態になり、それによりレシピエントの生理学的シグナルの変化を検出し得る。例えば、リザーバーは、レシピエントからの生理学的シグナルの変化に対して感受性である細胞を含み得る。レシピエントにおけるそのような生理学的変化は、フィードバック構成要素に関して上述したように、細胞を刺激して、薬剤を放出させるか、または薬剤の放出を停止させ得る。一例において、リザーバーは、アルギン酸マイクロゲルを含み得る。
【0021】
一例において、シグナル増幅器システムは、グルコースシグナル増幅器（本明細書において「ＧＳＡ」と称する）を含む。シグナル増幅器システムは、自己組織化重合体ナノサイズ小胞を含み得る。具体的な例として、グルコースシグナル増幅器は、グルコースオキシダーゼ、α－アミラーゼ、及びグルコアミラーゼを含み得る。
【0022】
マイクロニードル自体に関して、それらは、金属、セラミックス、半導体、有機物、重合体、及び複合体を含む様々な材料から構築され得る。好ましい構築材料としては、薬学等級のステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、鉄、スズ、クロム、銅、パラジウム、白金、これらの合金または他の金属、ケイ素、二酸化ケイ素、及び重合体が挙げられる。代表的な生物分解性重合体としては、乳酸及びグリコール酸のポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸－コ－グリコール酸などのヒドロキシ酸の重合体、ならびにＰＥＧ、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（乳酸－コ－カプロラクトン）との共重合体が挙げられる。代表的な非生物分解性重合体としては、ポリカーボネート、ポリエステル、及びポリアクリルアミドが挙げられる。
【0023】
マイクロニードルは、生物学的障壁内に挿入される間、最大数日間にわたって定位置ある間、及び除去される間に無傷であるような機械的強度を有するべきである。マイクロニードルが生物分解性重合体で形成される実施形態において、マイクロニードルは、少なくともマイクロニードルがその意図される目的（例えば、薬物を送達するためのその導管機能）を果たすのに十分に長く無傷でなくてはならない。マイクロニードルは、エチレンオキシドまたはガンマ線照射などの標準的な方法を使用して滅菌されるべきである。
【0024】
マイクロニードルは、直線状または先細りの軸を有し得る。好ましい一実施形態において、マイクロニードルの直径は、マイクロニードルの基端部で最大となり、端遠位基部の点まで先細りとなる。マイクロニードルはまた、直線状（先細りではない）部分及び先細りの部分の両方を含む軸を有するように製作されてもよい。ニードルはまた、先細りの端部を全く有しなくてもよく、すなわち、それらは、単に鈍い先端部または平坦な先端部を有する円柱であってもよい。実質的に均一な直径を有するが、一点へと先細りしない中空マイクロニードルは、本明細書において、「マイクロチューブ」と称される。本明細書で使用される場合、「マイクロニードル」という用語は、別段示されない限り、マイクロチューブ及び先細りのニードルの両方を含む。
【0025】
マイクロニードルは、基板に対して垂直に、またはある角度で配向され得る。好ましくは、基板の単位面積当たりでより大きい密度のマイクロニードルが提供され得るように、マイクロニードルは、基板に対して垂直に配向される。マイクロニードルのアレイは、マイクロニードル配向、高さ、または他のパラメータの混合を含み得る。
【0026】
マイクロニードルは、垂直に円形の断面を有する軸で形成されてもよく、断面は、非円形であってもよい。例えば、マイクロニードルの断面は、多角形（例えば、星形、方形、三角形）、長方形、または別の形状であってもよい。基部が約２００～６００μｍであり得、先端部が１～２０μｍであり得るように、断面寸法は、約１μｍ～１０００μｍであり得る。一実施形態において、マイクロニードルは、基部がおよそ４００μｍ及び先端部がおよそ５μｍであり得る。
【0027】
マイクロニードルの長さは典型的には、約１０μｍ～１ｍｍ、好ましくは４００μｍ～１ｍｍである。例えば、マイクロニードルの長さは、およそ８００μｍであり得る。長さは、特定の用途に対して選択され、これは、挿入された部分及び挿入されていない部分を構成する。マイクロニードルのアレイは、例えば、様々な長さ、外径、内径、断面形状、及びマイクロニードル間の間隔を有する、マイクロニードルの混合を含み得る。
【0028】
リザーバー内に貯蔵された、またはリザーバー内で生成された薬剤が、リザーバーから出て、マイクロニードル先端部を通して標的組織内へと流動し得るように、リザーバーは、マイクロニードルの先端部に接続され得る。リザーバーは、薬剤が送達される前に、好適で漏れのない薬剤の貯蔵または薬剤を生成する手段を提供するためにある。
【0029】
単一のマイクロニードルデバイスのリザーバーは、互いから、かつ／またはアレイ内のマイクロニードルのある部分から単離される、複数のコンパートメントを含み得る。デバイスは、例えば、異なるニードルを通して異なる薬剤を送達するように、または異なる速度でもしくは異なる時間に同一の薬剤もしくは異なる薬剤を送達するように提供され得る。あるいは、異なるコンパートメントの内容物は、例えば、材料の混合を可能にするように、コンパートメント間の障壁を貫通させること、または別様に除去することによって互いに組み合わされてもよい。
【0030】
マイクロニードル及び基板は、当業者にとって既知の方法によって作製される。例としては、ケイ素、金属、重合体、及び他の材料内に小さな機械構造を作製することによる微細製作プロセスが挙げられる。中空マイクロニードルの三次元アレイは、例えば、ドライエッチングプロセス、リソグラフィー的に画定された重合体中の微細鋳型作製及び選択的側壁電気メッキ、またはエポキシ鋳型トランスファーを使用する直接的微細成形技術の組み合わせを使用して製作され得る。これらの方法は、例えば、１９９８年６月１０日出願の米国第０９／０９５，２２１号、１９９９年５月２１日出願の米国第０９／３１６，２２９号、Ｈｅｎｒｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ Ｎｅｅｄｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，”Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐｐ．４９４－９８（Ｊａｎ．２６－２９，１９９８）に記載される。
【0031】
治療を必要とする対象における疾患を治療する方法であって、
ａ）マイクロニードルパッチを対象に提供することであって、マイクロニードルパッチが、
ｉ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードルと、
ｉｉ）マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、
ｉｉｉ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーと、
ｂ）マイクロニードルを生物学的障壁内に挿入することと、
ｃ）薬剤を、マイクロニードルを通して生物学的障壁内に送達することであって、送達される薬剤の量または体積が、シグナル増幅器システムから受容されるシグナルによって決定される、送達することとを含む、方法もまた本明細書に開示される。
ａ）マイクロニードルパッチを対象に提供することであって、マイクロニードルパッチが、
ｉ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードルと、
ｉｉ）マイクロニードルの基端部が結合または統合される基板と、
ｉｉｉ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーと、
ｂ）マイクロニードルを生物学的障壁内に挿入することと、
ｃ）薬剤を、マイクロニードルを通して生物学的障壁内に送達することであって、送達される薬剤の量または体積が、シグナル増幅器システムから受容されるシグナルによって決定される、送達することとを含む、方法もまた本明細書に開示される。
【0032】
上記に考察したように、薬剤送達システムは、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤の体積または量が生理学的シグナルに基づいて変更され得るように、例えば、フィードバック構成要素を備え得る。フィードバック構成要素は、シグナルが検出されるときに薬剤送達システムが薬剤をレシピエントに送達し得るように、「オン及びオフ」スイッチを本質的に備え得る。逆に、シグナルの検出は逆の効果を有してもよく、それにより薬剤送達システムにレシピエントへの送達のための薬剤を放出させない。説明として、フィードバック構成要素はレシピエントにおける病原体の存在を検出し得、分析物が検出されるとき、フィードバック構成要素はリザーバーから抗体の放出を可能にし得る。
【0033】
上記に考察したように、デバイスは、シグナル増幅器システムを備えてもよく、シグナル増幅器システムは、レシピエントからの生理学的シグナルを増幅することができる構成要素を備える。シグナル増幅器システムは、シグナルを増加させることによって機能し、これは、薬剤送達システムによって検出されるシグナルを増加させる。これは、生理学的シグナルにおける非常に小さな変化を検出する必要性が存在する場合、または薬剤送達システムがシグナルの増幅なしでは変化を検出するのに十分に感受性ではない場合に行われ得る。シグナル増幅器システムの一例を、実施例１に見出すことができる。
【0034】
キットもまた本明細書に開示される。キットは、本明細書に開示される方法とともに使用するための部品を含み得る。例えば、キットは、本明細書に開示されるデバイスを形成するのに必要とされる部品を含み得る。治療的、予防的、または診断的薬剤を生物学的障壁をわたって送達するための部品のキットであって、ａ）各々が基端部及び先端部を有する複数のマイクロニードル、ならびにマイクロニードルの基端部が結合または統合される基板を備える、マイクロニードルパッチと、ｂ）マイクロニードルアレイの基端部と接続されている少なくとも１つのリザーバーであって、リザーバーが、薬剤送達システムを備え、薬剤送達システムが、生物学的障壁をわたって輸送される薬剤、または生物学的障壁をわたって輸送される薬剤を生成するための手段、及びレシピエントからの生理学的シグナルを検出するための手段を含む、リザーバーとを含む、キットが開示される。薬剤送達システムは、フィードバック構成要素を更に備え得る。シグナル増幅器システムもまたキットの一部として開示され得、これは、本明細書で考察される。キットはまた、文書による使用説明書も含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1A】膵臓β細胞及びグルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）と統合された、マイクロニードル－アレイパッチに基づくグルコース応答システム（ＧＲＳ）の模式図を示す。ＧＳＡなしでは、正常血糖または高血糖状態のいずれにおいてもＭＮパッチからのわずかなインスリン放出が存在することを示す。ＭＮパッチは、架橋ヒアルロン酸（灰色）で構成される。
【図1B】膵臓β細胞及びグルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）と統合された、マイクロニードル－アレイパッチに基づくグルコース応答システム（ＧＲＳ）の模式図を示す。ＧＳＡありでは、高血糖状態によって引き起こされる有意に促進されたインスリン放出が存在することを示す。ＭＮパッチは、（上から下へ）α－アミロース及びＧＳＡの組織化した層を包埋する架橋ヒアルロン酸で構成される。
【図2A】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中、３７℃で、それぞれ２０分間、２時間、及び６時間のインキュベートした前後の、酵素被包ＧＳＡのＴＥＭ画像を示す。スケールバーは、２００ｎｍである。
【図2B】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。（上）は、４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中、３７℃で、２時間のインキュベートした前後の、ＦＩＴＣ－ＧＡ充填ＧＳＡ溶液の蛍光２．５Ｄ画像を示す。（下）は、示される白色破線に沿った蛍光強度の分布を示す。（ａ．ｕ．は、「任意単位」を表す）。
【図2C】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中、６時間のインキュベートした前後の、ＧＳＡのサイズ分布を示す。
【図2D】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。酸素濃度分子プローブを含有する異なるグルコースレベルの溶液中でインキュベートした、ＧＳＡのリン光寿命プロファイルを示す。
【図2E】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中のＧＯｘの全用量または半用量を充填したＧＳＡの、リン光寿命プロファイルを示す。
【図2F】グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）の特性評価を示す。３７℃での、異なるグルコース濃度を有する溶液中のＧＳＡの、３３０ｎｍでの紫外吸収の強度を示す。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す（ｎ＝３）。
【図3A】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。３７℃での、異なるグルコース濃度を有する溶液中のＧＳＡの、インビトロの蓄積酵素放出プロファイルを示す。＊１００または０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度溶液中のものとの比較での、４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中のＧＳＡのＰ＜０．０５。
【図3B】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。放出された酵素によって触媒されたα－アミロース加水分解からのグルコース生成を示す。＊１００または０ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中のものとの比較での、４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中のＧＳＡのＰ＜０．０５。
【図3C】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。マイクロ流体技術デバイスを通した異なるグルコース溶液の流入（１００及び４００ｍｇ／ｄＬ）によって刺激された、Ｌ－Ｓ ＧＲＳの分泌速度プロファイルを示す。（ｎ＝３）。
【図3D】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。インスリン（緑色）及び核（青色）で染色した、膵臓β細胞カプセルの免疫蛍光画像を示す。スケールバーは、５００μｍである。
【図3E】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。（ａ～ｃ）は、被包後１日目～３日目の膵臓β細胞の蛍光画像を示す。カルシウム－ＡＭ（生、緑色）及びエチジウムホモ二量体（死、赤色）で細胞を染色した。スケールバーは、５００μｍである。（右下）被包後１日目～３日目の時間の関数としての、細胞カプセルのインスリン分泌インデックス。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝３）。
【図3F】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。マイクロ流体技術デバイスを使用する、Ｌ－Ｓ ＧＲＳからの刺激されたインスリン分泌の模式図を示す。マイクロ流体技術チャネルを通して流動した異なるグルコース濃度を有するＫＲＢ、及び膵臓β細胞カプセルによって分泌されたインスリンを、出口から回収した。
【図3G】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。ＧＳＡ充填ＭＮパッチの写真を示す。スケールバーは、１ｃｍである。
【図3H】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。ＭＮパッチのＳＥＭ画像を示す。スケールバーは、５００μｍである。
【図3I】ＧＳＡのインビトロのグルコース応答研究ならびにＭＮパッチ及びＬ－Ｓ ＧＲＳの特性評価を示す。Ｌ－Ｓ ＧＲＳの蛍光顕微鏡画像を示す。ＭＮパッチにローダミン標識ＧＳＡを充填し、カルシウムＡＭ染色した膵臓β細胞カプセルをＭＮパッチの背部に位置付けた。スケールバーは、５００μｍである。
【図4A】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。マウスの背側皮膚がＭＮパッチで経皮治療されたことを示す。スケールバーは、１ｍｍである（上）。Ｈ＆Ｅ染色した治療した皮膚の断面を、黒色破線内の領域によって示す（下）。皮膚筋肉及び脂肪組織の領域をそれぞれ、Ｍ及びＦと標識する。スケールバーは、２００μｍである。
【図4B】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウス治療のためのＭＮパッチのインビボ研究を示す。マウスを、様々なＭＮ試料、つまりＧＲＳを有しない空ＭＮ（ＧＲＳなし）、Ｌ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｌ－ＧＲＳ）、Ｓ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されたＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にＧＯｘを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし））、及びＬ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にα－アミロースを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし））での経皮投与に供した。＊対照群との比較での、Ｌ－Ｓ ＧＲＳと統合されたＭＮの投与のＰ＜０．０５。
【図4C】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。投与の６時間後の、追加のＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）で治療した糖尿病マウスのＢＧＬの変化を示す。＊追加の投与なしとの比較での、ＭＮの追加の投与のＰ＜０．０５。黒色矢印は、投与点を示す。
【図4D】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。ＭＮ投与（ＭＮ Ｌ－Ｓ ＧＲＳまたは空ＭＮ（ＧＲＳを有しないＭＮ））後の健康なマウスのＢＧＬの変化を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝５）。
【図4E】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。健康な対照マウスとの比較での、Ｌ－Ｓ ＧＲＳを有するＭＮの投与の２時間後の糖尿病マウスに対する負荷試験を示す。投与時点を、黒色矢印によって指摘した。
【図4F】１型糖尿病治療のためのＬ－Ｓ ＧＲＳのインビボ研究を示す。０分の血糖読み取りをベースラインに設定して、応答性を１２０分間以内に曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて計算したことを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝５）。＊健康なマウスとの比較での、ＭＮ Ｌ－Ｓ ＧＲＳ投与で治療した糖尿病マウスのＰ＜０．０５。
【図5】低酸素感受性ヒアルロン酸（ＨＳ－ＨＡ）のグルコース応答機構を示す。
【図6】（左から右へ）４℃のＰＢＳ緩衝液、３７℃のＰＢＳ緩衝液、及び３７℃の対照レベルのグルコース濃度（１００ｍｇ／ｄＬ）を含有するＰＢＳ緩衝液とともにそれぞれ６時間インキュベートした後の、ＧＳＡのＤＬＳ測定のＴＥＭ画像を示す。
【図7】ＧＡとＡＡとの異なる酵素重量比での正規化したグルコース生成率を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝３）。
【図8】３ｍｇ／ｍＬのＡＡ及び６ｍｇ／ｍＬのＧＡを有する１０ｍｇ／ｍＬのα－アミロース溶液中での、α－アミロースのグルコースへの変換を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝３）。
【図9A】天然状態の（ａ）ＡＡ及び（ｂ）ＧＡ、ならびに４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する溶液中３７℃で６時間インキュベートしたＧＳＡから放出されたものの、ＣＤスペクトルを示す。
【図9B】天然状態の（ａ）ＡＡ及び（ｂ）ＧＡ、ならびに４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する溶液中３７℃で６時間インキュベートしたＧＳＡから放出されたものの、ＣＤスペクトルを示す。
【図10】２Ｄ組織培養プレート上で培養した細胞、及び被包の３０時間後の３Ｄカプセル内に被包された細胞のグルコース刺激インスリン分泌を示す。４００ｍｇ／ｄＬのグルコースＫＲＢ中のインスリン分泌の量を、１００ｍｇ／ｄＬのグルコースＫＲＢ中のインスリン分泌に正規化した。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝３）。
【図11】ＧＳＡ充填架橋ＭＮの機械的挙動を示す。（ｎ＝５）。
【図12】治療したＳＴＺ誘導糖尿病マウスのＢＧＬを示し、これは、ＧＲＳを有しないＭＮ、ＭＮ Ｌ－ＧＲＳ、ＭＮ Ｓ－ＧＲＳ、ＭＮ Ｌ－Ｓ－ＧＲＳ、ＭＮ Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし）、及びＭＮ Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし）の投与後の最初２時間、連続的に監視した。黒色矢印は、投与点を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝５）。＊健康なマウスとの比較での、ＭＮ Ｌ－Ｓ ＧＲＳ投与で治療した糖尿病マウスのＰ＜０．０５。
【図13】ＭＩＮ６細胞とともに２４時間のインキュベートした後の、ＧＳＡの細胞毒性研究を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。（ｎ＝６）。
【図14A】治療の２日後の、ＰＢＳ（ａ）またはＭＮパッチ（ｂ）の投与を有する周囲組織のＨ＆Ｅ染色した皮膚断面を示す。それらの皮膚試料は、ＭＮ注射部位から５ｍｍの距離にあった。スケールバーは、２００μｍである。
【図14B】治療の２日後の、ＰＢＳ（ａ）またはＭＮパッチ（ｂ）の投与を有する周囲組織のＨ＆Ｅ染色した皮膚断面を示す。それらの皮膚試料は、ＭＮ注射部位から５ｍｍの距離にあった。スケールバーは、２００μｍである。
【図15A】紙やすり被覆平行プレート（２５ｍｍ）を有するＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＲ－２０００応力制御レオメータを使用する、（ａ）２５℃及び（ｂ）３７℃での、９８％の完全細胞成長培地を含有する架橋ｍ－ＨＡハイドロゲルのレオロジー挙動を示す。実験は、２ｍｍの間隙を有する０．５Ｐａの幾何学での線形粘弾性体制内で実行した。測定は、少なくとも３回実行して、±１０％以内の再現性を確実にした。
【図15B】紙やすり被覆平行プレート（２５ｍｍ）を有するＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＲ－２０００応力制御レオメータを使用する、（ａ）２５℃及び（ｂ）３７℃での、９８％の完全細胞成長培地を含有する架橋ｍ－ＨＡハイドロゲルのレオロジー挙動を示す。実験は、２ｍｍの間隙を有する０．５Ｐａの幾何学での線形粘弾性体制内で実行した。測定は、少なくとも３回実行して、±１０％以内の再現性を確実にした。
【発明を実施するための形態】
【0036】
定義
本出願全体を通して使用される用語は、当業者にとって通常の典型的な意味で解釈されるべきである。しかしながら、本出願人は、以下の用語に、以下に定義される特定の定義が与えられることを要求する。
本出願全体を通して使用される用語は、当業者にとって通常の典型的な意味で解釈されるべきである。しかしながら、本出願人は、以下の用語に、以下に定義される特定の定義が与えられることを要求する。
【0037】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（その）」は、別段文脈が明確に規定しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つの細胞」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【0038】
「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるものと同程度「近く」にあるものと定義される。非限定的な一実施形態において、この用語は、１０％以内にあるものと定義される。別の非限定的な実施形態において、この用語は、５％以内にあるものと定義される。更に別の非限定的な実施形態において、この用語は、１％以内にあるものと定義される。
【0039】
「生物活性」に関するものを含むタンパク質の「活性」としては、例えば、転写、翻訳、細胞内転位、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、ならびに／または他のタンパク質へのホモ親和性及びヘテロ親和性結合が挙げられる。
【0040】
「生体適合性」は一般に、レシピエントに対して一般に非毒性であり、対象に対していかなる有意な有害作用も引き起こさない材料及びその任意の代謝物または分解生成物を指す。
【0041】
「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性の別の化合物または組成物（アジュバントなど）との組み合わせを含むことが意図される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「を含む」という用語は、組成物及び方法が引用される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」は、その組み合わせに対して本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び生成方法からの微量の混入物ならびに薬学的に許容される担体（リン酸緩衝食塩水及び保存剤など）を除外しない。「からなる」は、微量要素を超える他の成分及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの転換用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【0043】
「対照」は、比較目的で実験において使用される代替的な対象または試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。
【0044】
「有効量」は、有益な結果または所望される結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬で投与され得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「高グルコース条件」という用語は、２００ｍｇ／ｄＬ以上のグルコース濃度を有する環境を指す。例えば、「高血糖値」は、２００ｍｇ／ｄＬ以上の血流中のグルコースレベルを指す。いくつかの実施形態において、高グルコース条件は、２００～４００ｍｇ／ｄＬである。他の実施形態において、高グルコース条件は、３００～４００ｍｇ／ｄＬである。
【0046】
本明細書で使用される場合、「低グルコース条件」という用語は、０～２００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度を有する環境を指す。例えば、「低血糖値」は、２００ｍｇ／ｄＬ未満の血流中のグルコースレベルを指す。
【0047】
「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用されて、１つのアミノ酸のカルボキシル基によって別のアミノ酸のアルファアミノ基に結合された、２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を指す。
【0048】
「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に安全かつ非毒性である薬学的または治療的組成物を調製する上で有用である担体または賦形剤を意味し、獣医学及び／もしくはヒトの薬学的または治療的使用に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョンなど）、及び／または様々な種類の湿潤剤を包含する含み得る。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または当該技術分野において薬学的製剤中での使用が周知であり、以下に詳細に記載される他の材料を包含する。
【0049】
本明細書で使用される場合、「重合体」という用語は、比較的高分子量の天然または合成の有機化合物を指し、その構造は、反復小単位、つまり単量体（例えば、ポリエチレン、ゴム、セルロース）によって表すことができる。合成重合体は典型的には、単量体の付加または縮合重合によって形成される。本明細書で使用される場合、「共重合体」という用語は、２つ以上の異なる反復単位（単量体残基）から形成された重合体を指す。例としてかつ非限定的に、共重合体は、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、またはグラフト共重合体であり得る。特定の態様において、ブロック共重合体の様々なブロックセグメント自体が共重合体を含み得ることもまた企図される。
【0050】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値から及び／または「約」別の特定の値までと表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、その１つの特定の値から及び／または「約」他の特定の値までを含む。同様に、先行する「約」の使用によって、値が近似値として表現される場合、その特定の値が、別の実施形態を形成することが理解されるだろう。範囲の各々の終点が、他の終点と関連してだけではなく、他の終点とは無関係でも有意であることが、更に理解されるだろう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在すること、及びその値自体に加えて、各値もまた「約」その特定の値として本明細書に開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「約１０」もまた開示される。
【0051】
「治療有効量」または「治療有効用量」という用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医によって一般化された期間にわたって探求されている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、グルコース結合構造に結合したグルコース修飾インスリンなどの組成物の量を指す。いくつかの実施形態において、所望される応答は、Ｉ型糖尿病の制御である。いくつかの例において、所望される生物学的または医学的応答は、複数の投薬量の組成物を、数日、数週間、または数年間の期間にわたって対象に投与した後に達成される。
【0052】
「対象」または「レシピエント」という用語は、本明細書において、霊長類（例えば、ヒト）、雌ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、及びマウスなどを含むが、これらに限定されない、哺乳動物などの動物を含むものと定義される。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【0053】
本明細書で使用される場合、「治療する」「治療すること」、「治療」という用語、及びこれらの文法的変化形は、障害もしくは病態の１つ以上の付随する症状の強度を部分的もしくは完全に遅延、軽減、緩和、もしくは低減すること、ならびに／または障害もしくは病態の１つ以上の原因を軽減、緩和、もしくは妨害することを含む。本発明に従う治療は、防止的、予防的、または治療的に適用され得る。
【0054】
いくつかの例において、「治療する」「治療すること」、「治療」という用語、及びこれらの文法的変化形は、血糖値を制御し、対象の治療前と比較して、または母集団もしくは研究集団におけるそのような症状の発生率と比較して、Ｉ型糖尿病の症状の重症度を低減することを含む。
【0055】
「Ｉ型糖尿病」という用語は、インスリン生成細胞の自己免疫破壊及び身体がインスリンを生成する能力の低減から生じる真性糖尿病の形態を指す。インスリンの喪失は、血糖の増加をもたらす。
【実施例】
【0056】
実施例１：マイクロニードルパッチプラットフォーム
埋め込みなしでの血糖値（ＢＧＬ）のグルコース応答制御のための、膵臓β細胞からのインスリン分泌を調節するための無痛マイクロニードル（ＭＮ）パッチプラットフォームが本明細書に開示される。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、この戦略は、生（細胞に基づく）及び合成グルコース応答システム（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）の両方を統合して、外部に位置付けられたβ細胞カプセルがグルコースシグナルを感知し、低侵襲的な様式でＭＮを通してインスリンを分泌することを可能にする。初期設計では、細胞カプセルを、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）から作製されたＭＮパッチと統合した（図１Ａ）。高血糖状態下では、グルコースがＭＮを通して拡散し、アルギン酸マイクロゲル中に被包されたβ細胞と相互作用して、インスリン分泌を促進し得ることが予想された。しかしながら、グルコースの限定された拡散のために、パッチは高血糖状態に対して効果的に応答せず、インスリン分泌のわずかな増加が検出された。細胞応答を効果的に引き起こすために、本明細書に報告されるＭＮマトリックスは特に、合成「グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）」を含有する（図１Ｂ）。この革新的なＧＳＡは、３つの酵素、つまりグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、α－アミラーゼ（ＡＭ）、及びグルコアミラーゼ（ＧＡ）を捕捉する自己組織化重合体ナノサイズ小胞を備える。ＧＯｘは、酸素の存在下でグルコースをグルコン酸へと変換する。ＡＭは、α－アミロースを二糖類及び三糖類へと加水分解し、これは、ＧＡによってグルコースへと更に変換される（Ｎ．Ｇｕｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，３８，１５９９、Ｌ．Ｋａｎｄｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＴＨＥＯＣＨＥＭ ２００３，６６６－６６７，４８７）。
埋め込みなしでの血糖値（ＢＧＬ）のグルコース応答制御のための、膵臓β細胞からのインスリン分泌を調節するための無痛マイクロニードル（ＭＮ）パッチプラットフォームが本明細書に開示される。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、この戦略は、生（細胞に基づく）及び合成グルコース応答システム（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）の両方を統合して、外部に位置付けられたβ細胞カプセルがグルコースシグナルを感知し、低侵襲的な様式でＭＮを通してインスリンを分泌することを可能にする。初期設計では、細胞カプセルを、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）から作製されたＭＮパッチと統合した（図１Ａ）。高血糖状態下では、グルコースがＭＮを通して拡散し、アルギン酸マイクロゲル中に被包されたβ細胞と相互作用して、インスリン分泌を促進し得ることが予想された。しかしながら、グルコースの限定された拡散のために、パッチは高血糖状態に対して効果的に応答せず、インスリン分泌のわずかな増加が検出された。細胞応答を効果的に引き起こすために、本明細書に報告されるＭＮマトリックスは特に、合成「グルコースシグナル増幅器（ＧＳＡ）」を含有する（図１Ｂ）。この革新的なＧＳＡは、３つの酵素、つまりグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、α－アミラーゼ（ＡＭ）、及びグルコアミラーゼ（ＧＡ）を捕捉する自己組織化重合体ナノサイズ小胞を備える。ＧＯｘは、酸素の存在下でグルコースをグルコン酸へと変換する。ＡＭは、α－アミロースを二糖類及び三糖類へと加水分解し、これは、ＧＡによってグルコースへと更に変換される（Ｎ．Ｇｕｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，３８，１５９９、Ｌ．Ｋａｎｄｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＴＨＥＯＣＨＥＭ ２００３，６６６－６６７，４８７）。
【0057】
ＢＧＬの上昇に供されると、低酸素感受性材料で構成されるＧＳＡは急速に解離して、ＧＯｘ及び酸素消費による急速なグルコース酸化に応答して被包された酵素を放出する（Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，８２６０、Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５２４，３９）：
【化1】
【0058】
放出された酵素はその後、ＭＮマトリックス内に包埋されたα－アミロースを加水分解し（Ｓ．Ｐｅａｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９５３，１７２，１５８、Ｊ．Ｆ．Ｒｏｂｙｔ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １９６７，１２２，８、Ｗ．Ｊ．Ｗｈｅｌａｎｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９５２，１７０，７４８）、局所グルコース濃縮部位を生成する。「増幅された」グルコースは、外部に位置付けられたβ細胞カプセル内に効果的に拡散され、血管及び毛細リンパ管ネットワークへのインスリンの分泌及び拡散を促進する（Ａ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０，２８，１０７）。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導１型糖尿病マウスを動物モデルとして使用して、約１０７個のβ細胞からなるＧＲＳが高血糖状態に対して迅速に応答し、ＢＧＬを減少させ、低減したレベルで最大１０時間それを維持することが実証された。生理学的シグナル増幅器様式を有する、この細胞－合成複合型グルコース応答デバイスは、ＢＧＬの厳格な制御のための膵臓β細胞埋め込みに対する有用な代替物となる。
【0059】
３つの酵素を被包するための溶媒透析法によって、ＧＳＡを調製した（Ｊ． Ｅ．Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４，９，９０７、Ｈ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１４，５）。簡潔には、アミン官能化２－ニトロイミダゾール（ＮＩ）基を、アミド結合を介してＨＡに共有結合的に共役させた。疎水性ＮＩ基で官能化した低酸素感受性ＨＡ（ＨＳ－ＨＡ）は、ＧＯｘ、α－アミラーゼ、及びアミログルコシダーゼを含有する水溶液中でＧＳＡへと容易に自己組織化した（図５）。低酸素状態下で、疎水性ＮＩ基を、ニトロレダクターゼによって触媒したＮＡＤＰＨとの単一電子反応を介して親水性２－アミノミダゾールへと還元した（Ｙ．Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７０，６７，３８９）。アミン基を有する還元された生成物は水溶性であり、これはＧＳＡの解体を容易にした（Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，８２６０、Ｒ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１１，１３３，１５１７）。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（図２Ａ）は、ＧＳＡが単分散サイズの球形状を有することを示した。動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるＧＳＡの平均水力学的サイズは３４０ｎｍ（図２Ｃ）であり、これはＴＥＭ画像と一貫していた。ＨＡの残渣カルボキシルのために、ＧＳＡのゼータ電位を－４５．７±２．４ｍＶと決定した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＧＡ及びＡＭによるＧＳＡの蛍光画像は、酵素の同時被包の成功を更に確認した（図２Ｂ）。全ての酵素に基づくＧＳＡの充填容量を７．４±０．５重量％と決定し、充填効率を１６．１±１．０重量％と決定した。４℃でインキュベートしたとき、ＧＳＡは安定しており、２週間にわたって注目に値する濁度変化は観察されなかった。
【0060】
インビトロでのＧＳＡのグルコース応答能力を評価するために、典型的な高血糖レベル（４００ｍｇ／ｄＬ）、正常血糖レベル（１００ｍｇ／ｄＬ）、及び対照レベル（０ｍｇ／ｄＬ）を含む、様々なグルコース濃度を有する１×ＰＢＳ緩衝液溶液中で小胞を試験した。高血糖レベルは、他の２つの対照群と比較して、ＧＳＡ内で比較的より低い酸素環境を生成し、これは、酸素感受性リン光分子プローブによって確認した（図２Ｄ）。ＧＳＡの内側の酸素レベルは、経時的に徐々に低減し、２０分間以内に平衡に到達した。酸素消費動態は、小胞内に充填されるＧＯｘの量を変更することによって更に調節することができ、これは、半用量のＧＯｘで明確に遅延した低酸素効果を示した（図２Ｅ）。酸素レベルの減少とともに、ＮＩ基は、溶液に添加されたＮＡＤＰＨによって効果的に還元された。対応して、３３０ｎｍの紫外可視スペクトルでのＮＩの特徴的ピークは急速に減少し、これは生体内還元反応を実証した（図２Ｆ）。ＨＳ－ＨＡ上の水溶性ペンダント基の生成のために、ＧＳＡは解離し始め、その後被包された酵素を放出した。ＴＥＭ画像に示されるように、４００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液中のＧＳＡは、２０分間～６時間まで徐々の形態変化を経験し（図２Ａ）、これは、ＤＬＳによって示される平均水力学的サイズの顕著な減少と一貫していた（図２Ｃ）。対照的に、グルコースなしで、または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースとともにインキュベートしたＧＳＡは、安定した水力学的サイズを呈し、注目に値する形態変化は呈さなかった（図６）。更に、解離した小胞からの被包されたＦＩＴＣ標識酵素の放出を、蛍光顕微鏡によって可視化した。蛍光シグナル強度は有意に減少し、２時間後に均一な分布となり、これは、酵素が解離したＧＳＡから逃げ、溶液中に均等に分散することを示唆した（図２Ｂ）。
【0061】
グルコースレベル変化に応答する酵素放出動態を、次に試験した。正常グルコースレベル（１００ｍｇ／ｄＬ）及び対照レベル（０ｍｇ／ｄＬ）では、２４時間のインキュベーションのうちに、有意な量のＧＳＡから放出された酵素は検出されなかった（図３Ａ）。際立って対照的に、高血糖環境（４００ｍｇ／ｄＬ）では、最初２時間以内に、ＧＳＡからの急速な酵素放出速度が達成された。これは、グルコース酸化時の低酸素条件によって誘導された、ＮＩ基のより速い還元に起因した。
【0062】
その後、ＧＳＡから放出された酵素によって触媒された、α－アミロースからグルコースへの変換を、更に調査した。グルコース生成率によって示される、それらのα－アミロースの酵素加水分解能力を分析することによって、ＡＡ対ＧＡの被包比を１：２に事前最適化した（図７）。ＡＡ及びＧＡを利用して、１０ｍｇ／ｍＬのα－アミロース溶液を連続的に糖化した場合、グルコース生成は８１６±２６ｍｇ／ｄＬへと容易に増加し、８１．６％のα－アミロースの変換率が得られた（図８）。循環二色性（ＣＤ）スペクトルは、放出された酵素ＧＡ及びＡＡがそれらの二次立体構造を維持すること確認した（図９Ａおよび図９Ｂ）。一方で、様々なグルコース濃度を有するα－アミロース溶液中でＧＳＡをインキュベートした場合、１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有するものと比較して、４００ｍｇ／ｄＬのグルコースとともにインキュベートしたときに有意により速いグルコース生成が達成された（図３Ｂ）。それは、ＧＳＡの解体に関連する酵素の徐々の放出によって、α－アミロースの酵素加水分解が活性化したことを示した。まとめると、グルコースレベルの上昇を「感知」すると、ＧＳＡは、酵素を放出するように活性化され得、これは、α－アミロースからグルコースへの変換を促進して、下流作用のためのグルコースシグナルを増幅した。
【0063】
膵臓β細胞カプセルからインスリンを送達するためのＭＮパッチの使用を、更に調査した。Ｌ－Ｓ ＧＲＳの「生」グルコース応答構成要素を作製するために、マウス島β細胞株をＲＧＤ（Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１０８，６３８０．）及びＩＶ型コラーゲン（Ｌ． Ｍ．Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００７，２８，３００４．）とともに、２×１０６個の細胞／ｍＬの充填密度でアルギン酸マイクロゲル中に被包して、生物模倣型細胞－ＥＣＭ接着相互作用を有する良性環境を提供した。濃縮された細胞、及びカプセルの周囲の分泌されたインスリンの均一な分布とともに、被包の成功を蛍光顕微鏡によって可視化した（図３Ｄ）。得られたカプセルのサイズは、７３５±２７μｍであった。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）分析及び生－死アッセイを、１日目後～３日目まで実行して、被包されたβ細胞がそれらの生存率及び機能性を維持することを検証した（図３Ｅ）（Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１０８，６３８０．）。結果は、被包されたβ細胞が比較的長期間生存し、それらのインスリン分泌インデックスを２Ｄ組織培養プレート上で培養した細胞と比較したとき、正常なグルコース応答インスリン分泌能力を維持し得ることを示した（図１０）。
【0064】
一方で、微細成形アプローチを使用してＭＮパッチを製作した。結果として得られるＭＮデバイスは、１０ｍｍ２のパッチ内に４００個の錐体ニードルを有し、各ニードルは、基部で４００μｍの側辺長さ、先端部で５μｍの側辺長さ、及び８００μｍの高さを有した（図３Ｇ、３Ｈ）。ニードルは、交互の堆積を使用して、ＧＳＡ、α－アミロース、及び架橋ヒアルロン酸マトリックスからなる３層構造を有するように設計した。ＭＮの機械的強度を０．１８Ｎ／ニードルと決定し、これは破損することなく皮膚を穿通するのに十分であった（図１１）（Ｓ．Ｐ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０，１６，９１５）。蛍光図は、ＭＮパッチの膵臓β細胞カプセルとの代表的な統合を示した（図３Ｉ）。ＧＳＡを、ＭＮの先端部領域に良好に分布させ、細胞包埋カプセルを、ＭＮパッチの背部に位置付けた。
【0065】
マイクロ流体技術を通して、Ｌ－Ｓ ＧＲＳのＧＳＩＳを試験した（図３Ｆ）。高血糖レベル（４００ｍｇ／ｄＬ）及び正常血糖レベル（１００ｍｇ／ｄＬ）をそれぞれ有するクレブス・リンゲル緩衝液（ＫＲＢ）を連続的に注入して、開いたマイクロ流体チャネル内で、パッチ上のニードルをインキュベートした。高グルコースレベルの注入を有するＧＳＩＳは、低グルコースのものと比較して、３倍の増加を呈した（図３Ｃ）。これは、ＧＳＡの解離を急速に促進した高血糖流に起因し、その後のα－アミロースの加水分解は、β細胞カプセルからインスリンの分泌を引き起こすのに十分なグルコースレベルシグナルの増幅をもたらした。
【0066】
グルコース応答ＭＮデバイスのインビボ有効性を調査するために、ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスを、様々なＭＮ試料、つまりＧＲＳを有しない空ＭＮ（ＧＲＳなし）、Ｌ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｌ－ＧＲＳ）、Ｓ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されたＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にＧＯｘを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし））、及びＬ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にα－アミロースを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし））の経皮投与に供した。各ＭＮパッチを、自家製アプリケーターによって５Ｎ／パッチで投与して、均一な穿通を確実にし、局所皮膚接着剤によって皮膚上で不動化した。切除した皮膚組織は、ニードル挿入の可視部位を明確に示し（図４Ａ、上）、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した断面画像は、ＭＮが表皮におよそ２００μｍの深さまで穿通し得ることを示し（図４Ａ、下）、これは、ＧＳＡが実時間で間質液に曝露されることを可能にした（Ｓ．Ｐ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０，１６，９１５）。
【0067】
各群の治療したマウスのＢＧＬを、経時的に監視した。図４Ｂに示されるように、Ｌ－Ｓ ＧＲＳと統合されたＭＮパッチで治療したマウスのＢＧＬは、２時間以内にほぼ２００ｍｇ／ｄＬまで急速に減少し、高血糖または低血糖状態のピークなしで、有意に低減したレベルで６時間維持された。対照的に、完全なＳ－ＧＲＳなし（Ｌ－ＧＲＳ群）、または単に応答要素ＧＯｘを欠いている（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし）群）、または単に増幅要素ＡＭを欠いている（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし）群）場合では、ＢＧＬは最初の１時間のみ減少し、これはハイドロゲル中に留置された残渣量のインスリンの拡散によって説明し得る。その後、β細胞のインスリン分泌は基礎レベルで維持され、マウスのＢＧＬは高血糖状態に戻った。β細胞カプセルの不在下では、Ｓ－ＧＲＳ（Ｓ－ＧＲＳ）のみと統合されたＭＮで治療した群または空ＭＮ（ＧＲＳなし）群は、予想通り、注目に値するＢＧＬの減少は呈さなかった。Ｓ－ＧＲＳ群のＢＧＬの一時的な上昇は、α－アミロースの誘導された加水分解及び宿主グルコースクリアランスに起因し得る（図１２）。
【0068】
ＭＮパッチが、低血糖の潜在的なリスクを引き起こすことなくＢＧＬを調節し得るかどうかを評価するために、ＳＴＺ誘導マウスの群を、ＭＮパッチ交換投与に供した。第１の投与の６時間後の第２のＭＮパッチ治療は、高血糖トリガーの不在下で過剰なインスリンを分泌せず、これは、低血糖リスクを回避し得る。更に、追加のＭＮパッチは、対照と比較して、ＢＧＬの上昇に応答して治療効率を延長することができた（図４Ｃ）。対照としての、Ｌ－Ｓ ＧＲＳと統合されたＭＮパッチ及び空ＭＮで治療した健康なマウスの研究は、デバイスが低血糖を引き起こさないことを実証した（図４Ｄ）。Ｌ－Ｓ ＧＲＳからのわずかなインスリン放出が、依然としてマウスのＢＧＬを正常範囲内に維持した。グルコース負荷試験は、糖尿病マウスに対する厳格なグルコース制御能力を実証した（Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，８２６０、Ｄ．Ｈ．－Ｃ．Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，２４０１）。Ｌ－Ｓ ＧＲＳの投与の２時間後、糖尿病マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）グルコース注射で治療した。糖尿病マウスのＢＧＬは、１００ｍｇ／ｄＬの増加及び６０分間以内の初期ＢＧＬへの急速な減少を示した（図４Ｅ）。０～１２０分間の曲線下面積を計算して、グルコース恒常性のＭＮ維持を示した。グルコース負荷の２時間後、ＭＮ群と対照群との間には有意な差が観察された（図４Ｆ）。
【0069】
ＧＳＡ充填ＭＮパッチの生体適合性を評価するために、β細胞に対する溶解したマイクロニードルの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイによって評価した（図１３）。ＭＮ及び対応する溶解した生成物は、研究濃度では細胞生存率の有意な減少を示さなかった。ＭＮパッチで治療した皮膚は、ＭＮ除去後８時間以内に急速に回復し得、注射部位のＨ＆Ｅで染色した皮膚片は明白な炎症を示さなかった（図１４Ａおよび図１４Ｂ）（Ｗ．Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３，９４５）。
【0070】
現在、生体適合性及び安全性の問題が、膵島細胞移植の臨床用途を著しく妨害している（Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ ｅｔ ａ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１４，１４，４５、Ｓ．Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１５，９，６６４４、Ｋ．Ｍ．Ｂｒａｔｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１２，１，２６７）。従来の投与方法を利用し、侵襲的な手順に頼る代わりに、マイクロニードルパッチに基づく戦略は、内部高血糖状態によって引き起こされる、外部に位置付けられた膵臓β細胞からのインスリン分泌を制御するために開発された。重要なことに、初めて、生理学的シグナル（この場合「グルコースレベル」）を急速に増幅して、シグナルを効果的に輸送し、β細胞からのインスリン分泌を十分に刺激するために、合成増幅器が組み込まれた。インビボでの連続治療の結果は、延長した期間にわたる厳格なグルコース制御におけるＭＮパッチの効力を示した。この方法は、免疫応答及び長期間の有効性に関連する膵臓細胞療法の困難な問題を回避する。この有効投与期間は、細胞の密度及び生存率、ならびにグルコース及びインスリンを輸送するためのマトリックス材料の物理化学的特性を最適化することによって、更に延長され得る。一例において、ブタ島細胞または幹細胞分化ヒト膵臓細胞を有する新たに調製したパッチは、投与の容易さのため、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日数毎に患者に送達され得る。元の生物シグナルが応答性を引き起こすのに不十分である場合に、生理学的シグナル応答薬物送達系の有効性を改良するための合成増幅器が開示される。
【0071】
実施例１において使用される方法
材料
言及されない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、３００ｋＤａの分子量）はＦｒｅｄａ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から購入し、カスタム合成ペプチド（ＣＧＲＧＤＳ、ＭＷ５９４．３１）はＣｅｌｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＴＮ）から購入し、抗インスリン抗体（ａｂ１８１５４７）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＦＩＴＣ）（ａｂ６７１７）はＡｂｃａｍから購入し、皮膚貼付外科接着剤はＭｅｄｌｉｎｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
材料
言及されない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、３００ｋＤａの分子量）はＦｒｅｄａ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から購入し、カスタム合成ペプチド（ＣＧＲＧＤＳ、ＭＷ５９４．３１）はＣｅｌｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＴＮ）から購入し、抗インスリン抗体（ａｂ１８１５４７）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＦＩＴＣ）（ａｂ６７１７）はＡｂｃａｍから購入し、皮膚貼付外科接着剤はＭｅｄｌｉｎｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【0072】
低酸素感受性ヒアルロン酸（ＨＳ－ＨＡ）の合成及び特性評価
アミド形成を通して６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンを化学的に共役させることによって、低酸素感受性ヒアルロン酸（ＨＳ－ＨＡ）を合成した。最初に、６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンを合成して、ＨＡのカルボン酸基と反応させた。簡潔には、ＮＩ（０．１５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解させ、これにＫ２ＣＯ３（０．２８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。その後、６－（Ｂｏｃ－アミノ）ヘキシルブロミド（０．３９ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を溶液に滴加し、８０℃で４時間撹拌した。濾過を通して固体不純物を反応混合物から分離し、メタノールで洗浄した。蒸発によって固体生成物を残渣溶媒から得、これを脱イオン（ＤＩ）水中に懸濁させ、その後、酢酸エチルで抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで濃縮した。生成物を氷上でメタノール中に再溶解させた。メタノール中５ｍＬの１．２５Ｍ ＨＣｌを溶液に添加し、室温（ＲＴ）で２４時間撹拌した。その後、回転蒸発器を使用して溶媒を除去して、アミン官能化ＮＩを得た。第２に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で、６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンをＨＡに共役させた。簡潔には、０．２４ｇのＨＡ（分子量：約３００ｋＤａ）を水中に溶解させ、これにＥＤＣ（０．５６ｇ、３．４ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（０．３９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１５分間撹拌した。その後、ＤＭＦ中６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン（０．１８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、室温で２４時間反応させた。ＤＩ水及びメタノールの１：１の混合物に対して２４時間、ＤＩ水に対して４８時間透析を完全に実行した。その後、凍結乾燥によってＨＳ－ＨＡを得、１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ２３００）によって特性評価した。紫外可視吸光度によって、グラフト度を２０％と決定した。
アミド形成を通して６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンを化学的に共役させることによって、低酸素感受性ヒアルロン酸（ＨＳ－ＨＡ）を合成した。最初に、６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンを合成して、ＨＡのカルボン酸基と反応させた。簡潔には、ＮＩ（０．１５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解させ、これにＫ２ＣＯ３（０．２８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。その後、６－（Ｂｏｃ－アミノ）ヘキシルブロミド（０．３９ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を溶液に滴加し、８０℃で４時間撹拌した。濾過を通して固体不純物を反応混合物から分離し、メタノールで洗浄した。蒸発によって固体生成物を残渣溶媒から得、これを脱イオン（ＤＩ）水中に懸濁させ、その後、酢酸エチルで抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで濃縮した。生成物を氷上でメタノール中に再溶解させた。メタノール中５ｍＬの１．２５Ｍ ＨＣｌを溶液に添加し、室温（ＲＴ）で２４時間撹拌した。その後、回転蒸発器を使用して溶媒を除去して、アミン官能化ＮＩを得た。第２に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で、６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンをＨＡに共役させた。簡潔には、０．２４ｇのＨＡ（分子量：約３００ｋＤａ）を水中に溶解させ、これにＥＤＣ（０．５６ｇ、３．４ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（０．３９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１５分間撹拌した。その後、ＤＭＦ中６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン（０．１８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、室温で２４時間反応させた。ＤＩ水及びメタノールの１：１の混合物に対して２４時間、ＤＩ水に対して４８時間透析を完全に実行した。その後、凍結乾燥によってＨＳ－ＨＡを得、１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ２３００）によって特性評価した。紫外可視吸光度によって、グラフト度を２０％と決定した。
【0073】
６－（２－ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１．３０－１．７８（ｍ，８Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）４），２．７３（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），４．３８（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ２），７．１９（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｓ，１Ｈ）．
【0074】
ＨＳ－ＨＡ：１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１．８８－２．４０（ｍ，８Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）４），２．８７－３．１９（ｍ，４Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２，ＮＣＨ２），７．１９（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ）．
【0075】
メタクリル化ヒアルロン酸（ｍ－ＨＡ）の調製及び特性評価
メタクリル化無水物（ＭＡ）と反応させることによって、二重結合でヒアルロン酸（ＨＡ）を修飾した。２グラムのＨＡを１００ｍＬの蒸留（ＤＩ）水中に低温室内で一晩溶解させ、その後、１．６ｍＬのメタクリル化無水物（ＭＡ）を滴加した。５Ｎ ＮａＯＨを添加し、４℃で２４時間連続的に撹拌することによって、反応溶液をｐＨ８～９に維持した。その後、ｍ－ＨＡをアセトン中に沈殿させ、エタノールで３回洗浄し、その後、ＤＩ水中に溶解させた。ＤＩ水に対する４８時間の透析後、凍結乾燥によって精製されたｍ－ＨＡを８７．５％の収率で得、１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ２３００）によって特性評価した。標準的な逆重畳積分アルゴリズムを実行して、緊密な間隔のピークを分離した後、５．７４及び６．１７ｐｐｍ（メタクリル酸プロトン）でのプロトンピーク下面積比を、１．９９ｐｐｍ（ＨＡのＮ－アセチルグルコサミン）でのピークと比較することによって、修飾度（ＤＭ）を約１５％であると計算した。
メタクリル化無水物（ＭＡ）と反応させることによって、二重結合でヒアルロン酸（ＨＡ）を修飾した。２グラムのＨＡを１００ｍＬの蒸留（ＤＩ）水中に低温室内で一晩溶解させ、その後、１．６ｍＬのメタクリル化無水物（ＭＡ）を滴加した。５Ｎ ＮａＯＨを添加し、４℃で２４時間連続的に撹拌することによって、反応溶液をｐＨ８～９に維持した。その後、ｍ－ＨＡをアセトン中に沈殿させ、エタノールで３回洗浄し、その後、ＤＩ水中に溶解させた。ＤＩ水に対する４８時間の透析後、凍結乾燥によって精製されたｍ－ＨＡを８７．５％の収率で得、１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ２３００）によって特性評価した。標準的な逆重畳積分アルゴリズムを実行して、緊密な間隔のピークを分離した後、５．７４及び６．１７ｐｐｍ（メタクリル酸プロトン）でのプロトンピーク下面積比を、１．９９ｐｐｍ（ＨＡのＮ－アセチルグルコサミン）でのピークと比較することによって、修飾度（ＤＭ）を約１５％であると計算した。
【0076】
ｍ－ＨＡ：１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１．８５－１．９６（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ），１．９９（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３），５．７４（ｓ，１Ｈ，ＣＨ１Ｈ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ），６．１７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ１Ｈ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ）．
【0077】
紙やすり被覆平行プレート（２５ｍｍ）を有するＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＲ－２０００応力制御レオメータを使用して、３７℃で、ｍ－ＨＡハイドロゲルのレオロジー実験を実行した。紫外照射（波長：３６５ｎｍ、強度：９Ｗ／ｃｍ２）を介して、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ２％、重量％）及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、０．０５％、重量％）と１分間インサイチュで光重合することによって、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中２重量％のｍ－ＨＡハイドロゲルを架橋させた。実験は、２ｍｍの間隙を有する０．５Ｐａの幾何学での線形粘弾性体制内で実行した。測定は、少なくとも３回実行して、±１０％以内の再現性を確実にした。
【0078】
ＧＳＡの調製及び特性評価 水溶液中での自己組織化によって、ＧＳＡを調製した。簡潔には、２０ｍｇの両親媒性ＨＳ－ＨＡを水／メタノール（２：１の体積／体積）中に溶解させ、その後、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来する１ｍｇのＧＯｘ（２００Ｕ／ｍｇ、１６０ｋＤａ／７ｎｍ）、ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに由来する３ｍｇのα－アミラーゼ（５００～１，５００Ｕ／ｍｇ、５１ｋＤａ／２．４３ｎｍ）、及びａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来する６ｍｇのアミログルコシダーゼ（３００Ｕ／ｍＬ以上、７５ｋＤａ／３．３５ｎｍ）を添加した。混合物を４℃で２時間撹拌した。その後、脱イオン水に対する１日間の透析によって、メタノールを除去した。結果として得られるＧＳＡ懸濁液を、ｐＨ７．４で遠心分離濾過（１００ｋＤａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって更に濾過して、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって未充填の酵素を除去した。更なる研究のために、最終ＧＳＡ懸濁液を４℃で貯蔵した。蛍光ＧＳＡについて、ＧＳＡ調製中に０．０１重量％のローダミンＢを酵素溶液に添加した。ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを通して非被包酵素の量を測定し、酵素を含まない小胞を基礎補正として使用することによって、酵素被包小胞の充填容量（ＬＣ）及び被包効率（ＥＥ）を決定した。ＬＣ及びＥＥを、ＬＣ＝（Ａ－Ｂ）／Ｃ、ＥＥ＝（Ａ－Ｂ）／Ａとして計算し、式中、Ａは予想される酵素の被包量であり、Ｂは回収溶液中の酵素の空き量であり、Ｃは小胞の総重量であった。ゼータ電位及びサイズ分布をＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。ＪＥＯＬ２０００ＦＸ ＴＥＭ機器で、ＧＳＡのＴＥＭ画像を得た。
【0079】
酸素消費速度アッセイ
ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を製造業者のプロトコルに従って使用することによって、酸素消費速度（ＯＣＲ）を決定した。簡潔には、１０μＬのＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓプローブを含有する、０、１００、または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する２００μＬの５ｍｇ／ｍＬのＧＳＡ溶液を、９６ウェルプレート内に置き、３８０／６５０ｎｍの励起／発光波長、３７℃で、マイクロプレートリーダーでプレートを測定した。３０μｓ及び７０μｓの遅延時間ならびに３０μｓのゲート時間で、２つの強度読み取りを取得することによって、各試料ウェルを５分間毎に反復して測定した。各試料ウェルの得られたＴＲ－Ｆ強度シグナルを、以下、τ＝（７０－３０）／ｌｎ（Ｆ１／Ｆ２）（式中、Ｆ１及びＦ２は７０μｓ及び３０μｓの遅延時間でのＴＲ－Ｆ強度シグナルである）の通りリン光寿命（μｓ）τ値に変換した。結果として得られる寿命τの増加は、各試料中の酸素濃度を反映する。
ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を製造業者のプロトコルに従って使用することによって、酸素消費速度（ＯＣＲ）を決定した。簡潔には、１０μＬのＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓプローブを含有する、０、１００、または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する２００μＬの５ｍｇ／ｍＬのＧＳＡ溶液を、９６ウェルプレート内に置き、３８０／６５０ｎｍの励起／発光波長、３７℃で、マイクロプレートリーダーでプレートを測定した。３０μｓ及び７０μｓの遅延時間ならびに３０μｓのゲート時間で、２つの強度読み取りを取得することによって、各試料ウェルを５分間毎に反復して測定した。各試料ウェルの得られたＴＲ－Ｆ強度シグナルを、以下、τ＝（７０－３０）／ｌｎ（Ｆ１／Ｆ２）（式中、Ｆ１及びＦ２は７０μｓ及び３０μｓの遅延時間でのＴＲ－Ｆ強度シグナルである）の通りリン光寿命（μｓ）τ値に変換した。結果として得られる寿命τの増加は、各試料中の酸素濃度を反映する。
【0080】
インビトロでのＧＳＡのグルコース応答研究
ＧＳＡのグルコース応答能力を評価するために、ＧＳＡを５００μＬのＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、２．７ｍＭ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ；ｐＨ７．４）中で１００μｍのＮＡＤＰＨ及び５μｇ／ｍＬのチトクロムｃレダクターゼとともにインキュベートした。最初に、α－アミロースをエタノールで洗浄し、その後ＰＢＳ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。様々な量の４５％グルコース溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加して、様々なグルコース濃度（０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、及び４００ｍｇ／ｄＬ）の最終溶液に到達した。質量流量計の制御によって、２１％の酸素濃度を有する容器内で、混合物を３７℃でインキュベートした。所定の時間間隔で、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離（１０ｋＤａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、放出された酵素をＧＳＡ懸濁液から分離した。ＧＳＡ内に被包された残渣酵素の濃度、及びＧＳＡから分離した放出された酵素を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを使用して試験した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ多モードプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）でＡ５９５を検出し、酵素含有量を酵素溶液の標準曲線で較正した。１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、ｐＨ７．４で遠心分離濾過（１０ｋＤａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってグルコースを更に分離した。グルコース（ＧＯ）によって、グルコース濃度を決定した。簡潔には、試料を適切に希釈し、その後、３７℃でアッセイ試薬を３０分間添加した。２．０ｍＬの１２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各管に添加することによって、３０～６０秒間隔で反応を停止した。試薬ブランクに対して、５４０ｎｍで吸光度を測定した。標準曲線からグルコース濃度を計算した。ＧＳＡ溶液の紫外可視吸収をプロットするために、設定時間に３３０ｎｍのＡで強度を測定した。天然ＡＡ及びＧＡならびにＧＳＡ（１μｍ）から放出されたＡＡ及びＧＡの遠紫外ＣＤスペクトルをＣＤ分光計（Ａｖｉｖ）によって分析した。
ＧＳＡのグルコース応答能力を評価するために、ＧＳＡを５００μＬのＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、２．７ｍＭ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ；ｐＨ７．４）中で１００μｍのＮＡＤＰＨ及び５μｇ／ｍＬのチトクロムｃレダクターゼとともにインキュベートした。最初に、α－アミロースをエタノールで洗浄し、その後ＰＢＳ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。様々な量の４５％グルコース溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加して、様々なグルコース濃度（０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、及び４００ｍｇ／ｄＬ）の最終溶液に到達した。質量流量計の制御によって、２１％の酸素濃度を有する容器内で、混合物を３７℃でインキュベートした。所定の時間間隔で、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離（１０ｋＤａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、放出された酵素をＧＳＡ懸濁液から分離した。ＧＳＡ内に被包された残渣酵素の濃度、及びＧＳＡから分離した放出された酵素を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを使用して試験した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ多モードプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）でＡ５９５を検出し、酵素含有量を酵素溶液の標準曲線で較正した。１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、ｐＨ７．４で遠心分離濾過（１０ｋＤａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってグルコースを更に分離した。グルコース（ＧＯ）によって、グルコース濃度を決定した。簡潔には、試料を適切に希釈し、その後、３７℃でアッセイ試薬を３０分間添加した。２．０ｍＬの１２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各管に添加することによって、３０～６０秒間隔で反応を停止した。試薬ブランクに対して、５４０ｎｍで吸光度を測定した。標準曲線からグルコース濃度を計算した。ＧＳＡ溶液の紫外可視吸収をプロットするために、設定時間に３３０ｎｍのＡで強度を測定した。天然ＡＡ及びＧＡならびにＧＳＡ（１μｍ）から放出されたＡＡ及びＧＡの遠紫外ＣＤスペクトルをＣＤ分光計（Ａｖｉｖ）によって分析した。
【0081】
ＧＳＡ充填ＭＮの製作
Ｂｌｕｅａｃｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．からの１０個の均一なシリコン鋳型を使用して、マイクロニードル製作を実行した。レーザーアブレーションによって機械加工された２０×２０個のマイクロニードル錐体空洞のアレイで、各鋳型を特性評価した。ニードル空洞は、基部で４００μｍの側辺長さ、８００μｍの高さ、及び先端部で５μｍの側辺長さを有した。鋳型をプラズマ清浄した後、５０μＬのＧＳＡ溶液を鋳型表面上に堆積させた。その後、真空（６００ｍｍＨｇ）処理を５分間続けて、ＧＳＡ溶液がＭＮ空洞内に流動し、望ましい粘度を達成することを可能にした。その後、鋳型を、２０００ｒｐｍのＨｅｔｔｉｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ３２Ｒ遠心分離機に２０分間移して、ＧＳＡを先端部領域に圧縮した。ＧＳＡ層が完全に乾燥した後、０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのα－アミロース溶液の第２の層を鋳型に供給し、同じプロセスを使用して製作した。その後、ＭＢＡ（２重量％）及び光開始剤（０．５重量％）と混合した３００μＬのｍ－ＨＡ溶液（４重量％）を鋳型表面にピペッティングし、その後、真空及び遠心分離の組み合わせを続けた。ｍ－ＨＡ層が乾燥し、真空条件下で鋳型空洞から明白な気泡が生じなくなるまで、このプロセスを３～４回反復した。ＭＮパッチの背部について、４ｃｍ×１０ｃｍの銀接着テープ片を２ｃｍ×２ｃｍの鋳型基部プレートのまわりに適用し、準備した微細鋳型リザーバーに３ｍＬのＨＡ（５重量％）溶液を添加し、２５℃で乾燥させた（真空乾燥器内で一晩）。乾燥が完了した後、３０秒間の紫外照射（３６５ｎｍの波長）下、インサイチュ重合を通してマイクロニードルパッチを架橋させた。結果として得られる生成物を慎重に鋳型から分離し、自家製アプリケーターに適合させた。最終ＭＮは、密閉した６ウェル細胞培養プレート内、４℃で１週間貯蔵され得る。
Ｂｌｕｅａｃｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．からの１０個の均一なシリコン鋳型を使用して、マイクロニードル製作を実行した。レーザーアブレーションによって機械加工された２０×２０個のマイクロニードル錐体空洞のアレイで、各鋳型を特性評価した。ニードル空洞は、基部で４００μｍの側辺長さ、８００μｍの高さ、及び先端部で５μｍの側辺長さを有した。鋳型をプラズマ清浄した後、５０μＬのＧＳＡ溶液を鋳型表面上に堆積させた。その後、真空（６００ｍｍＨｇ）処理を５分間続けて、ＧＳＡ溶液がＭＮ空洞内に流動し、望ましい粘度を達成することを可能にした。その後、鋳型を、２０００ｒｐｍのＨｅｔｔｉｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ３２Ｒ遠心分離機に２０分間移して、ＧＳＡを先端部領域に圧縮した。ＧＳＡ層が完全に乾燥した後、０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのα－アミロース溶液の第２の層を鋳型に供給し、同じプロセスを使用して製作した。その後、ＭＢＡ（２重量％）及び光開始剤（０．５重量％）と混合した３００μＬのｍ－ＨＡ溶液（４重量％）を鋳型表面にピペッティングし、その後、真空及び遠心分離の組み合わせを続けた。ｍ－ＨＡ層が乾燥し、真空条件下で鋳型空洞から明白な気泡が生じなくなるまで、このプロセスを３～４回反復した。ＭＮパッチの背部について、４ｃｍ×１０ｃｍの銀接着テープ片を２ｃｍ×２ｃｍの鋳型基部プレートのまわりに適用し、準備した微細鋳型リザーバーに３ｍＬのＨＡ（５重量％）溶液を添加し、２５℃で乾燥させた（真空乾燥器内で一晩）。乾燥が完了した後、３０秒間の紫外照射（３６５ｎｍの波長）下、インサイチュ重合を通してマイクロニードルパッチを架橋させた。結果として得られる生成物を慎重に鋳型から分離し、自家製アプリケーターに適合させた。最終ＭＮは、密閉した６ウェル細胞培養プレート内、４℃で１週間貯蔵され得る。
【0082】
機械的強度試験
ＭＴＳ３０Ｇ引っ張り試験機でニードルをステンレス鋼プレートに押し付けることによって、応力－歪みゲージでＭＮの機械的強度を測定した。初期ゲージを、１０．００Ｎを細胞充填容量として、ＭＮ先端部とステンレス鋼プレートとの間を２．００ｍｍに設定した。ＭＮに向かって移動する上ステンレス鋼プレートの速度を、０．１ｍｍ・ｓ－１に設定した。ニードルが曲がり始めるときの、ＭＮの破損力を記録した。
ＭＴＳ３０Ｇ引っ張り試験機でニードルをステンレス鋼プレートに押し付けることによって、応力－歪みゲージでＭＮの機械的強度を測定した。初期ゲージを、１０．００Ｎを細胞充填容量として、ＭＮ先端部とステンレス鋼プレートとの間を２．００ｍｍに設定した。ＭＮに向かって移動する上ステンレス鋼プレートの速度を、０．１ｍｍ・ｓ－１に設定した。ニードルが曲がり始めるときの、ＭＮの破損力を記録した。
【0083】
細胞培養物
マウス膵島細胞腺腫細胞株６（ＭＩＮ６）細胞は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ ＭｃＭａｎｕｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）が快く提供した。使用した培養培地は、３７℃及び５％のＣＯ２の、５００ｍＬの培地当たりウシ胎仔血清（１５％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、及び２．５ｕＬの島メルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ）を有するＤＭＥＭ高グルコース培地であった。培地を３日毎に交換し、細胞を６０％の培養密度で継代培養した。ＭＩＮ６細胞株の第３２～３８の継代培養を使用した。
マウス膵島細胞腺腫細胞株６（ＭＩＮ６）細胞は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ ＭｃＭａｎｕｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）が快く提供した。使用した培養培地は、３７℃及び５％のＣＯ２の、５００ｍＬの培地当たりウシ胎仔血清（１５％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、及び２．５ｕＬの島メルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ）を有するＤＭＥＭ高グルコース培地であった。培地を３日毎に交換し、細胞を６０％の培養密度で継代培養した。ＭＩＮ６細胞株の第３２～３８の継代培養を使用した。
【0084】
膵臓β細胞の被包
２重量％のアルギン酸の水溶液を１２０００ｒｐｍで遠心分離して、いかなる不純物も除去した。アルギン酸（１２０ｍｇ）溶液を、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液中１－エチル－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍｇ／３０ｍｇ）と３０分間混合して、アルギン酸上のカルボニル基を活性化させ、その後、追加の１，６－ジアミノヘキサン（６０ｍｇ）と４時間混合した。混合物を２－プロパノール（ＩＰＡ）中に沈殿させて、未反応のジアミンを除去した。アルギン酸－アミン誘導体を、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．５）中、遊離チオールのＣｙｓ残基を有するＣＧＲＧＤＳのペプチド配列（ペプチド対アルギン酸の重量比は０．０２：１であった）と４℃で４時間反応させた。脱イオン水で５日間の広範な透析を介して、ペプチド修飾アルギン酸を精製（３５００Ｄａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）し、０．２２μｍのフィルターを通して滅菌し、凍結乾燥させた。ＭＩＮ６細胞をトリプシン処理し、１％のＩＶ型コラーゲンで補助した２％のアルギン酸－ＲＧＤ培養培地中（２×１０６個の細胞／ｍＬ）で懸濁させた。鈍い先端部である２２ゲージの金属ニードルが結合した１ｍＬのシリンジ内に、混合物を移した。シリンジポンプを備えるエレクトロスプレーシステム内に、シリンジを置いた。エレクトロスプレーシステムの正電極をニードルに接続し、負電極を５０ｍＬの２０ｍＭ ＢａＣｌ２を有する金属受容容器に接続した。高電位（８ｋＶ）下、５ｃｍの受容容器までの作動距離で、溶液を０．１５５ｍＬ／分の流量でスプレーした。液滴（５０～６５ｕＬ）を押し出した後、内相を滅菌ＢａＣｌ２（２００ｍＭ）溶液中で５分間ゼラチン化した。その後、回収したカプセルを滅菌ＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）で３回濯いでから、１２ウェル培養プレート内のＤＭＥＭ培地に移した。均一な数の約１００個のカプセルを回収し、各実験群のバルクハイドロゲルに更に導入して、処理間の比較を可能にした。１分間の紫外照射（波長：３６５ｎｍ）を介して、ＤＭＥＭ（２％、重量％、ＤＭＥＭ）中ｍ－ＨＡとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ２％、重量％）及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、０．０５％、重量％）とを光重合することによって、ＨＡハイドロゲルを架橋させた（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
２重量％のアルギン酸の水溶液を１２０００ｒｐｍで遠心分離して、いかなる不純物も除去した。アルギン酸（１２０ｍｇ）溶液を、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液中１－エチル－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍｇ／３０ｍｇ）と３０分間混合して、アルギン酸上のカルボニル基を活性化させ、その後、追加の１，６－ジアミノヘキサン（６０ｍｇ）と４時間混合した。混合物を２－プロパノール（ＩＰＡ）中に沈殿させて、未反応のジアミンを除去した。アルギン酸－アミン誘導体を、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．５）中、遊離チオールのＣｙｓ残基を有するＣＧＲＧＤＳのペプチド配列（ペプチド対アルギン酸の重量比は０．０２：１であった）と４℃で４時間反応させた。脱イオン水で５日間の広範な透析を介して、ペプチド修飾アルギン酸を精製（３５００Ｄａの分子質量カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）し、０．２２μｍのフィルターを通して滅菌し、凍結乾燥させた。ＭＩＮ６細胞をトリプシン処理し、１％のＩＶ型コラーゲンで補助した２％のアルギン酸－ＲＧＤ培養培地中（２×１０６個の細胞／ｍＬ）で懸濁させた。鈍い先端部である２２ゲージの金属ニードルが結合した１ｍＬのシリンジ内に、混合物を移した。シリンジポンプを備えるエレクトロスプレーシステム内に、シリンジを置いた。エレクトロスプレーシステムの正電極をニードルに接続し、負電極を５０ｍＬの２０ｍＭ ＢａＣｌ２を有する金属受容容器に接続した。高電位（８ｋＶ）下、５ｃｍの受容容器までの作動距離で、溶液を０．１５５ｍＬ／分の流量でスプレーした。液滴（５０～６５ｕＬ）を押し出した後、内相を滅菌ＢａＣｌ２（２００ｍＭ）溶液中で５分間ゼラチン化した。その後、回収したカプセルを滅菌ＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）で３回濯いでから、１２ウェル培養プレート内のＤＭＥＭ培地に移した。均一な数の約１００個のカプセルを回収し、各実験群のバルクハイドロゲルに更に導入して、処理間の比較を可能にした。１分間の紫外照射（波長：３６５ｎｍ）を介して、ＤＭＥＭ（２％、重量％、ＤＭＥＭ）中ｍ－ＨＡとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ２％、重量％）及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、０．０５％、重量％）とを光重合することによって、ＨＡハイドロゲルを架橋させた（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
【0085】
膵臓β細胞カプセルの特性評価
細胞クラスターの形態的特徴を分析するために、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ顕微鏡下で膵臓β細胞カプセルを観察した。膵臓β細胞カプセルの平均直径を楕円に適合させ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの粒子分析法を使用して画像を調節することによって分析した。
細胞クラスターの形態的特徴を分析するために、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ顕微鏡下で膵臓β細胞カプセルを観察した。膵臓β細胞カプセルの平均直径を楕円に適合させ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの粒子分析法を使用して画像を調節することによって分析した。
【0086】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、定性的な細胞生存率を可視化した。細胞カプセルをＰＢＳ（ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、２．７ｍＭ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ；ｐＨ７．４）中で４μｍのカルシウムＡＭ及び８μｍのエチジウムホモ二量体－１とともに１時間インキュベートした。その後、カプセルをＰＢＳ中で濯いで、過剰な染色溶液を除去し、２％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した。カプセルをガラススライド上に置き、デジタルカメラ及び互換性ＬＡＳ－ＡＦソフトウェアを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ５５００Ｂ蛍光顕微鏡を介して撮像した。生（緑色）（励起４９４ｎｍ、発光５１７ｎｍ）細胞及び死（赤色）（励起５２８ｎｍ、発光６１７ｎｍ）細胞の数を計数することによって、生存率を定量化した。
【0087】
グルコース応答システム（ＧＲＳ）の特性評価
ＳＥＭを使用して、ＭＮパッチの形態を特性評価した。両面粘着炭素タブを使用して、マイクロニードルをそれらの基部とともにＳＥＭ試料スタブに結合した。ＥｍＴｅｃｈ Ｔｕｒｂｏ ＥＭスパッタコーターを使用して、試料に７ｎｍの厚さの金－パラジウム層をコーティングした。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで、ＦＥＩ Ｖｅｒｉｏｓ４６０Ｌ電界放出走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）で撮像を実行した。カルシウムＡＭ染色した膵臓β細胞カプセルを、ローダミン標識ＧＳＡを充填したＭＮパッチの背部に位置付けた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ蛍光顕微鏡によって、Ｌ－Ｓ ＧＲＳの側面図から蛍光画像を取得した。
ＳＥＭを使用して、ＭＮパッチの形態を特性評価した。両面粘着炭素タブを使用して、マイクロニードルをそれらの基部とともにＳＥＭ試料スタブに結合した。ＥｍＴｅｃｈ Ｔｕｒｂｏ ＥＭスパッタコーターを使用して、試料に７ｎｍの厚さの金－パラジウム層をコーティングした。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで、ＦＥＩ Ｖｅｒｉｏｓ４６０Ｌ電界放出走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）で撮像を実行した。カルシウムＡＭ染色した膵臓β細胞カプセルを、ローダミン標識ＧＳＡを充填したＭＮパッチの背部に位置付けた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ蛍光顕微鏡によって、Ｌ－Ｓ ＧＲＳの側面図から蛍光画像を取得した。
【0088】
グルコース刺激インスリン分泌
静的グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを介して、被包された細胞の機能性評価を試験した。実験の２～３日前、９６ウェルプレート当たり２×１０５個のＭＩＮ６細胞を播種した（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）。２Ｄ細胞培養と同様に、グルコース処理の１日前、３Ｄカプセル内の同じ量の細胞を９６ウェルプレート内で培養した（１０個／各ウェル）。０．１％のＢＳＡで補助したクレブス・リンゲル（ＫＲＢ）緩衝液（１２８ｍｍのＮａＣｌ、４．８ｍｍのＫＣｌ、１．２ｍｍのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍｍのＭｇＳＯ４、２．５ｍｍのＣａＣｌ２、１０ｍｍのＨＥＰＥＳ、０．１重量容量％）を事前に調製した。３７℃及び５％のＣＯ２のＫＲＢ緩衝液ＢＳＡ中で、細胞を２時間インキュベートし、その後、同じ条件で１００ｍｇ／ｄＬまたは４００ｍｇ／ｄＬのグルコースとともに４５分間インキュベートした。マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ．）を使用して、細胞によって分泌されたインスリンの量を定量化した。ＫＲＢを含有する４００ｍｇ／ｄＬのグルコース中のインスリン分泌の量を、ＫＲＢを含有する１００ｍｇ／ｄＬのグルコース中で分泌されたインスリンに対して正規化し、インスリン分泌インデックスとして表現した。
静的グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを介して、被包された細胞の機能性評価を試験した。実験の２～３日前、９６ウェルプレート当たり２×１０５個のＭＩＮ６細胞を播種した（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）。２Ｄ細胞培養と同様に、グルコース処理の１日前、３Ｄカプセル内の同じ量の細胞を９６ウェルプレート内で培養した（１０個／各ウェル）。０．１％のＢＳＡで補助したクレブス・リンゲル（ＫＲＢ）緩衝液（１２８ｍｍのＮａＣｌ、４．８ｍｍのＫＣｌ、１．２ｍｍのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍｍのＭｇＳＯ４、２．５ｍｍのＣａＣｌ２、１０ｍｍのＨＥＰＥＳ、０．１重量容量％）を事前に調製した。３７℃及び５％のＣＯ２のＫＲＢ緩衝液ＢＳＡ中で、細胞を２時間インキュベートし、その後、同じ条件で１００ｍｇ／ｄＬまたは４００ｍｇ／ｄＬのグルコースとともに４５分間インキュベートした。マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ．）を使用して、細胞によって分泌されたインスリンの量を定量化した。ＫＲＢを含有する４００ｍｇ／ｄＬのグルコース中のインスリン分泌の量を、ＫＲＢを含有する１００ｍｇ／ｄＬのグルコース中で分泌されたインスリンに対して正規化し、インスリン分泌インデックスとして表現した。
【0089】
免疫蛍光撮像
被包の６時間後、細胞を４℃で４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、その後、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）中に包埋させ、ドライアイス上、イソペンタン浴内で急速凍結させた。凍結した細胞カプセルを切片化（５μｍの厚さ）し、顕微鏡スライド上に載せ、－８０℃で貯蔵した。インスリンを免疫蛍光で染色するために、スライドを２回洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００溶液を使用して３０分間透過処理し、その後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用して１時間遮断した。遮断後、１／２００の希釈度のインスリン抗体に対してモノクローナルである一次ウサギ（ａｂｃａｍ１８１５４７）を一晩４℃で適用し、その後、洗浄し、１／４００の希釈度の抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）（ａｂｃａｍ１５００７７）とともにインキュベートした（緑色）。スライドを３回洗浄し、細胞透過性染料ＤＡＰＩを適用して細胞核を染色し、カバーガラスで被覆した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ蛍光顕微鏡を使用して試料を撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して加工した。
被包の６時間後、細胞を４℃で４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、その後、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）中に包埋させ、ドライアイス上、イソペンタン浴内で急速凍結させた。凍結した細胞カプセルを切片化（５μｍの厚さ）し、顕微鏡スライド上に載せ、－８０℃で貯蔵した。インスリンを免疫蛍光で染色するために、スライドを２回洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００溶液を使用して３０分間透過処理し、その後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用して１時間遮断した。遮断後、１／２００の希釈度のインスリン抗体に対してモノクローナルである一次ウサギ（ａｂｃａｍ１８１５４７）を一晩４℃で適用し、その後、洗浄し、１／４００の希釈度の抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）（ａｂｃａｍ１５００７７）とともにインキュベートした（緑色）。スライドを３回洗浄し、細胞透過性染料ＤＡＰＩを適用して細胞核を染色し、カバーガラスで被覆した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０多パラメータ蛍光顕微鏡を使用して試料を撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して加工した。
【0090】
インビトロでのＧＲＳのグルコース応答研究
血液循環系のラボオンチップ模擬実験として、マイクロ流体技術デバイスを使用して、ＭＮからのインスリンの放出を実行した。グルコース応答能力を動的に評価するために、放出培地がニードル先端部を通して流動する間（様々なグルコース濃度を有するｐＨ７．４のＫＲＢ）、ＭＮパッチをマイクロ流体チャネルの開いた中心部に置いた。２つの別個のシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ２０００、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）で、注入及び撤去速度を５０μＬ／分に設定した。マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ．）を使用して、インスリン放出速度を定量化した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ多モードプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、４５０ｎｍでのインスリン含有量を測定し、インスリン標準曲線で較正した。
血液循環系のラボオンチップ模擬実験として、マイクロ流体技術デバイスを使用して、ＭＮからのインスリンの放出を実行した。グルコース応答能力を動的に評価するために、放出培地がニードル先端部を通して流動する間（様々なグルコース濃度を有するｐＨ７．４のＫＲＢ）、ＭＮパッチをマイクロ流体チャネルの開いた中心部に置いた。２つの別個のシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ２０００、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）で、注入及び撤去速度を５０μＬ／分に設定した。マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ．）を使用して、インスリン放出速度を定量化した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ多モードプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、４５０ｎｍでのインスリン含有量を測定し、インスリン標準曲線で較正した。
【0091】
ＳＴＺ誘導糖尿病マウスを使用するインビボ研究
糖尿病治療のためのＭＮパッチのインビボ有効性を、ＳＴＺ誘導成体糖尿病マウス（雄Ｃ５７Ｂ６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で評価した。動物研究プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌによって承認された。Ｃｌａｒｉｔｙ ＧＬ２Ｐｌｕｓグルコースメータ（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を使用して、血漿当量グルコースをマウスの尾静脈血液試料（約３μＬ）から測定した。それらのＢＧＬを投与前の２日間監視し、投与前に全てのマウスを一晩絶食させた。各群の５匹のマウスを、ＧＲＳを有しない空ＭＮを含有するＭＮ（ＧＲＳなし）、Ｌ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｌ－ＧＲＳ）、Ｓ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されたＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にＧＯｘを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし））、及びＬ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にα－アミロースを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし））で皮下治療するために選択した。自家製アプリケーターによって、５Ｎ／パッチで１０分間、ＭＮパッチを背側皮膚に適用した。皮膚貼付外科接着剤を使用して、持続した放出のためにパッチを皮膚に固定した。１２ｍｍ×１２ｍｍ×５ｍｍのカスタマイズＰＤＭＳ鋳型を、パッチの上に被覆した。ＰＤＭＳ鋳型の内側では、膵臓β細胞カプセルは、栄養素補給のために、ＤＭＥＭから作製された架橋ｍ－ＨＡハイドロゲル中に包埋された。ＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）群、ＭＮ（ＧＲＳなし）群について、細胞はデバイス内に組み込まれた。その後、各群の投与されたマウスのＢＧＬを連続的に（５、１５、３０、及び６０分間で、及びその後１時間に１回）監視した。グルコース負荷試験を実行して、ＭＮの投与の２時間後のＭＮのインビボでのグルコース応答性を確認した。簡潔には、マウスを一晩絶食させ、Ｌ－Ｓ ＧＲＳを投与した。投与の２時間後、マウスのグルコースレベルが最低値に到達したとき、腹腔内注射を介して１．５ｇのグルコース／ｋｇ（４５％の滅菌グルコース溶液、ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ）をマウスに与えた。健康なマウスに対するグルコース負荷試験を、対照として実行した。グルコース投与の０、１０、２０、３０、４０、６０、９０、及び１２０分間後に、尾静脈から採血し、血糖計を使用してグルコースレベルを測定した。同様に、低血糖のリスクを評価するために、２つの群の健康なマウスにＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）またはＭＮ（ＧＲＳなし）を投与したが、グルコース負荷には供与しなかった。
糖尿病治療のためのＭＮパッチのインビボ有効性を、ＳＴＺ誘導成体糖尿病マウス（雄Ｃ５７Ｂ６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で評価した。動物研究プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌによって承認された。Ｃｌａｒｉｔｙ ＧＬ２Ｐｌｕｓグルコースメータ（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を使用して、血漿当量グルコースをマウスの尾静脈血液試料（約３μＬ）から測定した。それらのＢＧＬを投与前の２日間監視し、投与前に全てのマウスを一晩絶食させた。各群の５匹のマウスを、ＧＲＳを有しない空ＭＮを含有するＭＮ（ＧＲＳなし）、Ｌ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｌ－ＧＲＳ）、Ｓ－ＧＲＳとのみ統合されたＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されたＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）、Ｌ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にＧＯｘを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＧＯｘなし））、及びＬ－Ｓ－ＧＲＳと統合されているが、Ｓ－ＧＲＳ中にα－アミロースを有しないＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ（ＡＭなし））で皮下治療するために選択した。自家製アプリケーターによって、５Ｎ／パッチで１０分間、ＭＮパッチを背側皮膚に適用した。皮膚貼付外科接着剤を使用して、持続した放出のためにパッチを皮膚に固定した。１２ｍｍ×１２ｍｍ×５ｍｍのカスタマイズＰＤＭＳ鋳型を、パッチの上に被覆した。ＰＤＭＳ鋳型の内側では、膵臓β細胞カプセルは、栄養素補給のために、ＤＭＥＭから作製された架橋ｍ－ＨＡハイドロゲル中に包埋された。ＭＮ（Ｓ－ＧＲＳ）群、ＭＮ（ＧＲＳなし）群について、細胞はデバイス内に組み込まれた。その後、各群の投与されたマウスのＢＧＬを連続的に（５、１５、３０、及び６０分間で、及びその後１時間に１回）監視した。グルコース負荷試験を実行して、ＭＮの投与の２時間後のＭＮのインビボでのグルコース応答性を確認した。簡潔には、マウスを一晩絶食させ、Ｌ－Ｓ ＧＲＳを投与した。投与の２時間後、マウスのグルコースレベルが最低値に到達したとき、腹腔内注射を介して１．５ｇのグルコース／ｋｇ（４５％の滅菌グルコース溶液、ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ）をマウスに与えた。健康なマウスに対するグルコース負荷試験を、対照として実行した。グルコース投与の０、１０、２０、３０、４０、６０、９０、及び１２０分間後に、尾静脈から採血し、血糖計を使用してグルコースレベルを測定した。同様に、低血糖のリスクを評価するために、２つの群の健康なマウスにＭＮ（Ｌ－Ｓ ＧＲＳ）またはＭＮ（ＧＲＳなし）を投与したが、グルコース負荷には供与しなかった。
【0092】
生体適合性研究
比色分析メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを使用して、細胞増殖分析を実行した。ＭＩＮ６細胞を、１ウェル当たり５，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、１００μＬのＤＭＥＭ中で培養した。その後、プレートを５％のＣＯ２中３７℃で１２時間インキュベートして、７０～８０％の培養密度に到達してから、溶解したＭＮ溶液の連続希釈を添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞をＫＲＢ溶液で洗浄し、１００μＬの新鮮なＦＢＳを含まないＤＭＥＭ及び新たに調製した２０μＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ溶液、５ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。プレートを更に４時間インキュベートした。その後、培養培地を慎重に除去し、その後、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して、１０分間以内に、５９０ｎｍ、及び６２０ｎｍの参照波長でプレートの吸光度を読み取った。
比色分析メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを使用して、細胞増殖分析を実行した。ＭＩＮ６細胞を、１ウェル当たり５，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、１００μＬのＤＭＥＭ中で培養した。その後、プレートを５％のＣＯ２中３７℃で１２時間インキュベートして、７０～８０％の培養密度に到達してから、溶解したＭＮ溶液の連続希釈を添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞をＫＲＢ溶液で洗浄し、１００μＬの新鮮なＦＢＳを含まないＤＭＥＭ及び新たに調製した２０μＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ溶液、５ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。プレートを更に４時間インキュベートした。その後、培養培地を慎重に除去し、その後、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して、１０分間以内に、５９０ｎｍ、及び６２０ｎｍの参照波長でプレートの吸光度を読み取った。
【0093】
マウスモデルにおいてＭＮパッチの生体適合性を評価すること。投与後２日目、ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、周囲の組織を切除した。ＰＢＳ投与を有するマウスを陰性制御として使用した。組織を１０％のホルマリン中に固定し、その後、パラフィン内に包埋し、５０μｍの切片に切断し、組織学的分析のためにＨ＆Ｅを使用して染色した。
【0094】
統計学的分析
データは、平均±標準偏差として示される。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計学的分析を実行した。Ｐ≦０．０５で、実験群間と対照群との差は、統計学的に有意であると見なされた。
参考文献
［１］Ｊ．Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｒ．Ａ．Ｓｉｃｒｅｅ，Ｐ．Ｚ．Ｚｉｍｍｅｔ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０１０，８７，４、Ｂ．Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＩＤＦ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｔｌａｓ，６ｔｈ ｅｄｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ２０１３．
［２］Ｍ．Ｃ．Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｍａｔｒｉａｎｏ，Ｊｕａｎｉｔａ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗｅｎｄｙ Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｂｕｔｔｅｒｙ，Ｋｏｆｉ Ｎｙａｍ，Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｄａｄｄｏｎａ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ２０１３，３６Ｓｕｐｐｌｙ１，Ｓ６７、Ｒ．Ａ．Ｈａｙｗａｒｄ，Ｊａｍａ１９９７，２７８，１６６３、Ｄ．Ｒ．Ｏｗｅｎｓ，Ｂ．Ｚｉｎｍａｎ，Ｇ．Ｂ．Ｂｏｌｌｉ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００１，３５８，７３９．
［３］Ｒ．Ｍｏ，Ｔ．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｄｉ，Ｗ．Ｔａｉ，Ｚ．Ｇｕ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４，４３，３５９５．
［４］Ｓ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｆｅｉｌｅｎ，Ｆ．Ｂｒｕｎｎｅｎｍｅｉｅｒ，Ｔ．Ｍｉｎｎｅｍａｎｎ，Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｍ．Ｗｅｂｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５，５４，６８７、Ｆ．Ｂ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｉｃｋｅｌｓ，Ｒ．Ａｌｅｊａｎｄｒｏ，Ｂ．Ｊ．Ｈｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｗｅａｓｅ，Ｂ．Ｎａｚｉｒｕｄｄｉｎ，Ｊ．Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｍ．Ｒ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ，Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｆ．Ｐａｔｔｏｕ，Ｔ．Ｂｅｒｎｅｙ，Ａ．Ｓｅｃｃｈｉ，Ｓ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｓｅｎｉｏｒ，Ｐ．Ｍａｆｆｉ，Ａ．Ｐｏｓｓｅｌｔ，Ｐ．Ｇ．Ｓｔｏｃｋ，Ｄ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｘ．Ｌｕｏ，Ｆ．Ｋａｎｄｅｅｌ，Ｅ．Ｃａｇｌｉｅｒｏ，Ｎ．Ａ．Ｔｕｒｇｅｏｎ，Ｐ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｎａｊｉ，Ｐ．Ｊ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｃ．Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ｙ．Ｃ．Ｋｕｄｖａ，Ｋ．Ｌ．Ｂｒａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｕｌｌ，Ｃ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．Ｈ．Ｋａｙ，Ｌ．Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｃ．Ｖａｎｔｙｇｈｅｍ，Ｍ．Ｂｅｌｌｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２０１２，３５，１４３６、Ｇ．Ｌ．Ｗａｒｎｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｍｅｌｏｃｈｅ，Ｒ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｚ．Ａｏ，Ｐ．Ｋｅｏｗｎ，Ｊ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．Ｖｅｒｃｈｅｒｅ，Ｎ．Ｐａｒｔｏｖｉ，Ｉ．Ｓ．Ｂｅｇｇ，Ｍ．Ｆｕｎｇ，Ｓ．Ｅ．Ｋｏｚａｋ，Ｓ．Ｏ．Ｔｏｎｇ，Ｋ．Ｍ．Ａｌｇｈｏｆａｉｌｉ，Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００８，８６，１７６２．
［５］Ｓ．Ｍｅｒａｎｉ，Ｃ．Ｔｏｓｏ，Ｊ．Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００８，９５，１４４９、Ｒ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｇｏｔｏ，Ｓ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．Ｕｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．Ｓａｔｏｍｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，４３，３２３９、Ａ．Ｒ．Ｐｅｐｐｅｒ，Ｂ．Ｇａｌａ－Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．Ｐａｗｌｉｃｋ，Ｓ．Ｍｅｒａｎｉ，Ｔ．Ｋｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，３３，５１８．
［６］Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ｇ．Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２００７，７，３１４、Ｅ．Ｐｅｄｒａｚａ，Ｍ．Ｍ．Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｆｒａｋｅｒ，Ｃ．Ｒｉｃｏｒｄｉ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔａｂｌｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，１０９，４２４５．
［７］Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｓｅｔｈ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１０８，６３８０．
［８］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｊ．Ｃ．Ｄｏｌｏｆｆ，Ｍ．Ｍａ，Ａ．Ｊ．Ｖｅｇａｓ，Ｈ．Ｈ．Ｔａｍ，Ａｎｄｒｅｗ Ｒ．Ｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｌｉ，Ｅ．Ｌａｎｇａｎ，Ｊ．Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．Ｌｏｏ，Ｓ．Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ，Ａ．Ｃｈｉｕ，Ｓ．Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ－Ｌｏｃｋ，Ｓ．Ａｒｅｓｔａ－Ｄａｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｂｏｃｈｅｎｅｋ，Ｊ．Ｍｅｎｄｏｚａ－Ｅｌｉａｓ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｑｉ，Ｄ．Ｍ．Ｌａｖｉｎ，Ｍ．Ｃｈｅｎ，Ｎ．Ｄｈｏｌａｋｉａ，Ｒ．Ｔｈａｋｒａｒ，Ｉ．Ｌａｃｉｋ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｃ．Ｗｅｉｒ，Ｊ．Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１５，１４，６４３．
［９］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｂ．Ｃ．Ｔａｎｇ，Ｋ．Ａ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１４，１４，４５．
［１０］Ｎ．Ｇｕｒｕｎｇ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｂｏｓｅ，Ｖ．Ｒａｉ，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１３，２０１３，１、Ｒ．Ｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｇｉｇｒａｓ，Ｈ．Ｍｏｈａｐａｔｒａ，Ｖ．Ｋ．Ｇｏｓｗａｍｉ，Ｂ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，３８，１５９９、Ｌ．Ｋａｎｄｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＴＨＥＯＣＨＥＭ ２００３，６６６－６６７，４８７．
［１１］Ｊ．Ｙｕ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｙｅ，Ｒ．ＤｉＳａｎｔｏ，Ｗ．Ｓｕｎ，Ｄ．Ｒａｎｓｏｎ，Ｆ．Ｓ．Ｌｉｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂ．Ｂｕｓｅ，Ｚ．Ｇｕ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，８２６０．
［１２］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５２４，３９、Ｚ．Ｇｕ，Ａ．Ａ．Ａｉｍｅｔｔｉ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｔ．Ｄａｎｇ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．Ｓ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１３，７，４１９４、Ｗ．Ｔａｉ，Ｒ．Ｍｏ，Ｊ．Ｄｉ，Ｖ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｘ．Ｇｕ，Ｊ．Ｂ．Ｂｕｓｅ，Ｚ．Ｇｕ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，３４９５．
［１３］Ｓ．Ｐｅａｔ，Ｗ．Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｒ．Ｒｅｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ １９５３，１７２，１５８、Ｊ．Ｆ．Ｒｏｂｙｔ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １９６７，１２２，８、Ｗ．Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ １９５２，１７０，７４８．
［１４］Ａ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｋａｅｓｔｎｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｓｕｔｔｅｒ，Ｎ．Ｇ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｍｉｋｓｚｔａ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅｔｔｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０，２８，１０７．
［１５］Ｊ．Ｅ．Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｔａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｇａｏ，Ｎ．Ｙｏｎｇｖｏｎｇｓｏｏｎｔｏｒｎ，Ｓ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｓ．Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｙａｎｏ，Ｌ．Ｚｈｕｏ，Ｍ．Ｋｕｒｉｓａｗａ，Ｊ．Ｙ．Ｙｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４，９，９０７、Ｈ．Ｙｕ，Ｘ．Ｑｉｕ，Ｓ．Ｐ．Ｎｕｎｅｓ，Ｋ．－Ｖ．Ｐｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４，５．
［１６］Ｙ．Ｓｅｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．Ｏｋａｍｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７０，６７，３８９．
［１７］Ｒ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｋｉｋｋａｗａ，Ｓ．－Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１１，１３３，１５１７．
［１８］Ｌ．Ｍ．Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．Ｎ．Ｈａｙｄａ，Ｋ．Ｈａｓｋｉｎｓ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｓｅｔｈ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００７，２８，３００４．
［１９］Ｓ．Ｐ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｄ．Ｇ．Ｋｏｕｔｓｏｎａｎｏｓ，Ｍ．ｄｅｌ Ｐｉｌａｒ Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｌｅｅ，Ｖ．Ｚａｒｎｉｔｓｙｎ，Ｓ．－Ｏ．Ｃｈｏｉ，Ｎ．Ｍｕｒｔｈｙ，Ｒ．Ｗ．Ｃｏｍｐａｎｓ，Ｉ．Ｓｋｏｕｎｔｚｏｕ，Ｍ．Ｒ．Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０，１６，９１５．
［２０］Ｄ．Ｈ．－Ｃ．Ｃｈｏｕ，Ｍ．Ｊ．Ｗｅｂｂｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｔｈａｐａ，Ｄ．Ｄｅｎｇ，Ｊ．Ｖ．Ｔｒｕｏｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｃｏｒｔｉｎａｓ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，２４０１．
［２１］Ｗ．Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｘｉａｏｙｕｎ，Ｗ．Ｚａｏｚｈａｎ，Ｃ．Ｌｉｚｈｕ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｗ．Ｆｅｉ，Ｌ．Ｌｉａｎｇｍｉｎｇ Ｗｅｉ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３，９４５．
［２２］Ｓ．Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｋ．Ｃｈｏｗ，Ｄ．Ｈｏ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｊ．Ｍ．Ｋａｒｐ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｐｅｔｒｏｓｋｏ，Ｊ．Ｓｈｉ，Ｍ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．Ｓｕｎ，Ｓ．Ｔｅｏｈ，Ｓ．Ｓ．Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｙ．Ｘｉａ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｇｕ，Ｃ．Ｘｕ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１５，９，６６４４、Ｋ．Ｍ．Ｂｒａｔｌｉｅ，Ｒ．Ｌ．Ｙｏｒｋ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｖｅｒｎａｌｅ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１２，１，２６７．
データは、平均±標準偏差として示される。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計学的分析を実行した。Ｐ≦０．０５で、実験群間と対照群との差は、統計学的に有意であると見なされた。
参考文献
［１］Ｊ．Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｒ．Ａ．Ｓｉｃｒｅｅ，Ｐ．Ｚ．Ｚｉｍｍｅｔ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０１０，８７，４、Ｂ．Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＩＤＦ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｔｌａｓ，６ｔｈ ｅｄｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ２０１３．
［２］Ｍ．Ｃ．Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｍａｔｒｉａｎｏ，Ｊｕａｎｉｔａ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗｅｎｄｙ Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｂｕｔｔｅｒｙ，Ｋｏｆｉ Ｎｙａｍ，Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｄａｄｄｏｎａ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ２０１３，３６Ｓｕｐｐｌｙ１，Ｓ６７、Ｒ．Ａ．Ｈａｙｗａｒｄ，Ｊａｍａ１９９７，２７８，１６６３、Ｄ．Ｒ．Ｏｗｅｎｓ，Ｂ．Ｚｉｎｍａｎ，Ｇ．Ｂ．Ｂｏｌｌｉ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００１，３５８，７３９．
［３］Ｒ．Ｍｏ，Ｔ．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｄｉ，Ｗ．Ｔａｉ，Ｚ．Ｇｕ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４，４３，３５９５．
［４］Ｓ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｆｅｉｌｅｎ，Ｆ．Ｂｒｕｎｎｅｎｍｅｉｅｒ，Ｔ．Ｍｉｎｎｅｍａｎｎ，Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｍ．Ｗｅｂｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５，５４，６８７、Ｆ．Ｂ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｉｃｋｅｌｓ，Ｒ．Ａｌｅｊａｎｄｒｏ，Ｂ．Ｊ．Ｈｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｗｅａｓｅ，Ｂ．Ｎａｚｉｒｕｄｄｉｎ，Ｊ．Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｍ．Ｒ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ，Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｆ．Ｐａｔｔｏｕ，Ｔ．Ｂｅｒｎｅｙ，Ａ．Ｓｅｃｃｈｉ，Ｓ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｓｅｎｉｏｒ，Ｐ．Ｍａｆｆｉ，Ａ．Ｐｏｓｓｅｌｔ，Ｐ．Ｇ．Ｓｔｏｃｋ，Ｄ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｘ．Ｌｕｏ，Ｆ．Ｋａｎｄｅｅｌ，Ｅ．Ｃａｇｌｉｅｒｏ，Ｎ．Ａ．Ｔｕｒｇｅｏｎ，Ｐ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｎａｊｉ，Ｐ．Ｊ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｃ．Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ｙ．Ｃ．Ｋｕｄｖａ，Ｋ．Ｌ．Ｂｒａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｕｌｌ，Ｃ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．Ｈ．Ｋａｙ，Ｌ．Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｃ．Ｖａｎｔｙｇｈｅｍ，Ｍ．Ｂｅｌｌｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２０１２，３５，１４３６、Ｇ．Ｌ．Ｗａｒｎｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｍｅｌｏｃｈｅ，Ｒ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｚ．Ａｏ，Ｐ．Ｋｅｏｗｎ，Ｊ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．Ｖｅｒｃｈｅｒｅ，Ｎ．Ｐａｒｔｏｖｉ，Ｉ．Ｓ．Ｂｅｇｇ，Ｍ．Ｆｕｎｇ，Ｓ．Ｅ．Ｋｏｚａｋ，Ｓ．Ｏ．Ｔｏｎｇ，Ｋ．Ｍ．Ａｌｇｈｏｆａｉｌｉ，Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００８，８６，１７６２．
［５］Ｓ．Ｍｅｒａｎｉ，Ｃ．Ｔｏｓｏ，Ｊ．Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００８，９５，１４４９、Ｒ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｇｏｔｏ，Ｓ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．Ｕｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．Ｓａｔｏｍｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，４３，３２３９、Ａ．Ｒ．Ｐｅｐｐｅｒ，Ｂ．Ｇａｌａ－Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．Ｐａｗｌｉｃｋ，Ｓ．Ｍｅｒａｎｉ，Ｔ．Ｋｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，３３，５１８．
［６］Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ｇ．Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２００７，７，３１４、Ｅ．Ｐｅｄｒａｚａ，Ｍ．Ｍ．Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｆｒａｋｅｒ，Ｃ．Ｒｉｃｏｒｄｉ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔａｂｌｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，１０９，４２４５．
［７］Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｓｅｔｈ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１０８，６３８０．
［８］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｊ．Ｃ．Ｄｏｌｏｆｆ，Ｍ．Ｍａ，Ａ．Ｊ．Ｖｅｇａｓ，Ｈ．Ｈ．Ｔａｍ，Ａｎｄｒｅｗ Ｒ．Ｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｌｉ，Ｅ．Ｌａｎｇａｎ，Ｊ．Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．Ｌｏｏ，Ｓ．Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ，Ａ．Ｃｈｉｕ，Ｓ．Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ－Ｌｏｃｋ，Ｓ．Ａｒｅｓｔａ－Ｄａｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｂｏｃｈｅｎｅｋ，Ｊ．Ｍｅｎｄｏｚａ－Ｅｌｉａｓ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｑｉ，Ｄ．Ｍ．Ｌａｖｉｎ，Ｍ．Ｃｈｅｎ，Ｎ．Ｄｈｏｌａｋｉａ，Ｒ．Ｔｈａｋｒａｒ，Ｉ．Ｌａｃｉｋ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｃ．Ｗｅｉｒ，Ｊ．Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１５，１４，６４３．
［９］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｂ．Ｃ．Ｔａｎｇ，Ｋ．Ａ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１４，１４，４５．
［１０］Ｎ．Ｇｕｒｕｎｇ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｂｏｓｅ，Ｖ．Ｒａｉ，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１３，２０１３，１、Ｒ．Ｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｇｉｇｒａｓ，Ｈ．Ｍｏｈａｐａｔｒａ，Ｖ．Ｋ．Ｇｏｓｗａｍｉ，Ｂ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，３８，１５９９、Ｌ．Ｋａｎｄｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＴＨＥＯＣＨＥＭ ２００３，６６６－６６７，４８７．
［１１］Ｊ．Ｙｕ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｙｅ，Ｒ．ＤｉＳａｎｔｏ，Ｗ．Ｓｕｎ，Ｄ．Ｒａｎｓｏｎ，Ｆ．Ｓ．Ｌｉｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂ．Ｂｕｓｅ，Ｚ．Ｇｕ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，８２６０．
［１２］Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５２４，３９、Ｚ．Ｇｕ，Ａ．Ａ．Ａｉｍｅｔｔｉ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｔ．Ｄａｎｇ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．Ｓ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１３，７，４１９４、Ｗ．Ｔａｉ，Ｒ．Ｍｏ，Ｊ．Ｄｉ，Ｖ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｘ．Ｇｕ，Ｊ．Ｂ．Ｂｕｓｅ，Ｚ．Ｇｕ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，３４９５．
［１３］Ｓ．Ｐｅａｔ，Ｗ．Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｒ．Ｒｅｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ １９５３，１７２，１５８、Ｊ．Ｆ．Ｒｏｂｙｔ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １９６７，１２２，８、Ｗ．Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ １９５２，１７０，７４８．
［１４］Ａ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｋａｅｓｔｎｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｓｕｔｔｅｒ，Ｎ．Ｇ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｍｉｋｓｚｔａ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅｔｔｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０，２８，１０７．
［１５］Ｊ．Ｅ．Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｔａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｇａｏ，Ｎ．Ｙｏｎｇｖｏｎｇｓｏｏｎｔｏｒｎ，Ｓ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｓ．Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｙａｎｏ，Ｌ．Ｚｈｕｏ，Ｍ．Ｋｕｒｉｓａｗａ，Ｊ．Ｙ．Ｙｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４，９，９０７、Ｈ．Ｙｕ，Ｘ．Ｑｉｕ，Ｓ．Ｐ．Ｎｕｎｅｓ，Ｋ．－Ｖ．Ｐｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４，５．
［１６］Ｙ．Ｓｅｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．Ｏｋａｍｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７０，６７，３８９．
［１７］Ｒ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｋｉｋｋａｗａ，Ｓ．－Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１１，１３３，１５１７．
［１８］Ｌ．Ｍ．Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．Ｎ．Ｈａｙｄａ，Ｋ．Ｈａｓｋｉｎｓ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｓｅｔｈ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００７，２８，３００４．
［１９］Ｓ．Ｐ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｄ．Ｇ．Ｋｏｕｔｓｏｎａｎｏｓ，Ｍ．ｄｅｌ Ｐｉｌａｒ Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｌｅｅ，Ｖ．Ｚａｒｎｉｔｓｙｎ，Ｓ．－Ｏ．Ｃｈｏｉ，Ｎ．Ｍｕｒｔｈｙ，Ｒ．Ｗ．Ｃｏｍｐａｎｓ，Ｉ．Ｓｋｏｕｎｔｚｏｕ，Ｍ．Ｒ．Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０，１６，９１５．
［２０］Ｄ．Ｈ．－Ｃ．Ｃｈｏｕ，Ｍ．Ｊ．Ｗｅｂｂｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｔｈａｐａ，Ｄ．Ｄｅｎｇ，Ｊ．Ｖ．Ｔｒｕｏｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｃｏｒｔｉｎａｓ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５，１１２，２４０１．
［２１］Ｗ．Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｘｉａｏｙｕｎ，Ｗ．Ｚａｏｚｈａｎ，Ｃ．Ｌｉｚｈｕ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｗ．Ｆｅｉ，Ｌ．Ｌｉａｎｇｍｉｎｇ Ｗｅｉ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３，９４５．
［２２］Ｓ．Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｋ．Ｃｈｏｗ，Ｄ．Ｈｏ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｊ．Ｍ．Ｋａｒｐ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｐｅｔｒｏｓｋｏ，Ｊ．Ｓｈｉ，Ｍ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．Ｓｕｎ，Ｓ．Ｔｅｏｈ，Ｓ．Ｓ．Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｙ．Ｘｉａ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｇｕ，Ｃ．Ｘｕ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１５，９，６６４４、Ｋ．Ｍ．Ｂｒａｔｌｉｅ，Ｒ．Ｌ．Ｙｏｒｋ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｖｅｒｎａｌｅ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１２，１，２６７．
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
