特許 7203014 工学操作されたヌクレアーゼを使用した遺伝子発現の調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-28

(45)【発行日】2023-01-12

(54)【発明の名称】工学操作されたヌクレアーゼを使用した遺伝子発現の調節

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20230104BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20230104BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230104BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230104BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20230104BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230104BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230104BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230104BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20230104BHJP

【ＦＩ】

C12N15/52 Z ZNA

C12N9/16 Z

C12N5/10

C12N15/09 100

A61K38/46

A61K48/00

A61P7/00

A61K35/28

A61K35/545

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2019510787

(86)(22)【出願日】2017-08-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-05

(86)【国際出願番号】 US2017048397

(87)【国際公開番号】W WO2018039440

(87)【国際公開日】2018-03-01

【審査請求日】2020-07-27

(31)【優先権主張番号】62/378,978

(32)【優先日】2016-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/443,981

(32)【優先日】2017-01-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/545,778

(32)【優先日】2017-08-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・シー・ミラー

(72)【発明者】

【氏名】エドワード・ジェイ・レバー

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】Blood，2015年，Vol. 126 (23), 204

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００ － ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

左側および右側ＺＦＮを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、前記左側ＺＦＮは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、前記右側ＺＦＮは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む、上記ジンクフィンガーヌクレアーゼ。

【請求項2】

請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼを１つ以上コードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

配列番号２８及び／または配列番号３０を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む細胞。

【請求項6】

前記細胞が幹細胞または前駆体細胞である、請求項５に記載の細胞。

【請求項7】

前記細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の細胞。

【請求項8】

前記細胞のゲノムが前記ジンクフィンガーヌクレアーゼによって改変されている、請求項５～７のいずれかに記載の細胞。

【請求項9】

前記ゲノム改変が、挿入、欠失、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞。

【請求項10】

前記ゲノム改変がＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列の＋５８領域内に存在する、請求項８または９に記載の細胞。

【請求項11】

請求項５～１０のいずれかに記載の細胞から増殖されたか、前記細胞の子孫であるか、または前記細胞から分化した細胞であって、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、または請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む前記細胞。

【請求項12】

前記細胞が、前記ゲノム改変を有しない細胞と比較して増大したガンマグロビン及び／またはベータグロビンの発現を呈する、請求項５～１１のいずれかに記載の細胞。

【請求項13】

請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項５～１２のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。

【請求項14】

細胞の内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変するインビトロの方法であって、前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列が改変されるように、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを前記細胞に投与することを含み、場合によって、
（ｉ）前記方法は、外来性配列が前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列に挿入されるように、前記外来性配列を前記細胞に導入することをさらに含むか；または
（ｉｉ）前記改変が欠失を含む、前記方法。

【請求項15】

対象のグロビン産生を増大させるために使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記対象が異常ヘモグロビン症を有する、請求項１３または１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記異常ヘモグロビン症がベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を産生するインビトロの方法であって、
ａ）請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチドに細胞を接触させるステップと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドからの融合タンパク質の発現を促す条件に前記細胞を供するステップと、
ｃ）前記遺伝子改変細胞を産生するのに十分に発現した前記融合タンパク質で前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変するステップと
を含み、
場合により、前記方法は、少なくとも１つのサイトカインで前記細胞を刺激することをさらに含む、前記方法。

【請求項19】

請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項２～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、及び／または請求項５～１２のいずれかに記載の細胞を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月２４日に出願された米国仮出願第６２／３７８，９７８号、２０１７年１月９日に出願された米国仮出願第６２／４４３，９８１号、及び２０１７年８月１５日に出願された米国仮出願第６２／５４５，７７８号に基づく利益を主張するものであり、これらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0002】

本開示は、ゲノム工学、特に造血細胞のゲノムの標的改変の分野におけるものである。

【背景技術】

【0003】

ヒトゲノムは２０，０００～２５，０００個の遺伝子を含むが転写調節因子は２０００個未満であることがゲノムシーケンシングの取り組みにより明らかになったことを考慮すると、遺伝子発現をその種々の経時的、発生的、及び組織特異的な発現の全てにおいて制御するためには、いくつかの因子が相互作用しなければならないことが明らかである。遺伝子の発現は、ＤＮＡエレメントと相互作用する一般的な転写調節因子と特異的な転写調節因子との高度に複雑な混合物によって制御される。これらのＤＮＡエレメントは、コアプロモーター及びそれに関連する転写因子結合部位などの局所的なＤＮＡエレメントと、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、及び遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）などの遠位エレメントとの両方を含む（Ｍａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｅ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７：２９－５０を参照されたい）。

【0004】

エンハンサーエレメントは、ＳＶ４０ウイルスゲノムにおいて最初に特定され、その後、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座で見つかった。現在では多くの遺伝子の発現において調節的な役割を果たすことが知られているエンハンサーは、主に経時的及び空間的な遺伝子発現パターンに影響すると思われる。またエンハンサーは、標的の遺伝子のコアプロモーターから遠く離れたところで発現を調節するように機能することができ、プロモーターに対する任意の特定の配列の向きに依存しないことも分かっている。エンハンサーは、コアプロモーター領域の数百キロベース上流または下流に位置する場合があり、ここでエンハンサーは、イントロン配列内またはさらには遺伝子の３’末端を超えたところに位置する場合もある。

【0005】

ゲノムＤＮＡの標的切断に関する種々の方法及び組成物が記述されている。このような標的切断事象を使用すると、例えば、標的突然変異誘発を誘導したり、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導したり、所定の染色体座における標的組換えを容易にしたりすることができる。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号、同第９，２００，２６６号、同第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第９，１５０，８４７号、同第８，９５６，８２８号、同第８，９４５，８６８号、同第８，７０３，４８９号、同第８，５８６，５２６号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、米国特許公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００５／００６４４７４号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／００２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１９６３７３号、同第２０１５／００５６７０５号、及び同第２０１５／０３３５７０８号を参照されたい。これらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0006】

これらの方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換えによらないドナーの末端キャプチャ、または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）すなわちＨＤＲ）といったエラーの多いプロセスによる切断の修復が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的組み込み）をもたらし得るように、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導する工学操作された切断系の使用を含むことが多い。例えば、米国特許第９，０４５，７６３号、同第９，２００，２６６号、同第９，００５，９７３号、及び同第８，７０３，４８９号を参照されたい。これらの技術は、ゲノム領域の特異的欠失または特異的な点突然変異もしくは局所的変化の導入（別称、遺伝子補正）を含め、ドナーオリゴヌクレオチドの使用によりゲノム配列に部位特異的変化を導入するために使用することもできる。切断は、工学操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）といった特異的なヌクレアーゼの使用によって、または、特定の切断を導くための工学操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することによっても生じ得る。さらに、標的を定めたヌクレアーゼがアルゴノート系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１）を参照されたい）に基づいて開発されており、これらはゲノム編集及び遺伝子療法に使用される可能性も有し得る。

【0007】

赤血球（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）すなわち赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、血液の主要な細胞構成成分であり、ヒトの細胞の四分の一を占める。成熟ＲＢＣは核及び多くの他の細胞小器官を欠いており、ヘモグロビンが豊富である。ヘモグロビンは、肺から組織へ酸素を運搬し、また組織から二酸化炭素を運び出し肺に戻して除去するように機能する金属タンパク質である。このタンパク質は、ＲＢＣの乾燥重量のおよそ９７％を構成し、血液の酸素運搬能力を約７０倍増大させる。ヘモグロビンは、２本のアルファ（α）様グロビン鎖及び２本のベータ（β）様グロビン鎖、ならびに４つのヘム基を含むヘテロ四量体である。成体においてこのα２β２四量体は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）または成体ヘモグロビンと呼ばれる。一般的には、アルファグロビン鎖及びベータグロビン鎖はおよそ１：１の比で合成され、この比は、ヘモグロビン及びＲＢＣの安定化という観点から非常に重要であると思われる。発育中の胎児では、異なる形態のヘモグロビンである胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）が産生され、これはヘモグロビンＡよりも高い酸素結合親和性を有するため、酸素が母親の血流を介して胎児の身体に送達され得る。胎児グロビンをコードする遺伝子には２種類あり、これらは配列が極めて類似しており、ベータグロビン遺伝子座における配置の順序に基づいてＨＢＧ１（別称Ｇガンマ）及びＨＢＧ２（Ａガンマ）と呼ばれる。成体ヘモグロビンのように、胎児ヘモグロビンタンパク質は２本のαグロビン鎖を含むが、成体βグロビン鎖の代わりに２本の胎児ガンマ（γ）グロビン鎖を有する（すなわち、胎児ヘモグロビンはα２γ２である）。妊娠およそ３０週目の胎児においてガンマグロビンの合成が低下し始め、一方でベータグロビンの産生が増大する。生後およそ１０か月までには、新生児のヘモグロビンはほぼ全てがα２β２であるが、一部のＨｂＦ（総ヘモグロビンのおよそ１～３％）は成人期まで持続する。ガンマグロビンからベータグロビンへの産生の切り替えの調節はかなり複雑であり、主にガンマグロビン転写の下方調節と同時にベータグロビン転写の上方調節を伴う。

【0008】

ヘモグロビン鎖をコードする配列の遺伝的欠陥は、鎌状赤血球貧血ならびにアルファサラセミア及びベータサラセミアを含む異常ヘモグロビン症として知られる疾患群の一因となり得る。異常ヘモグロビン症患者の大多数において、ガンマグロビンをコードする遺伝子は依然として存在するが、上述のように分娩前後に生じる正常な遺伝子の抑制のため、発現は比較的低い。

【0009】

米国では５０００人中１人が鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有すると推定され、そのほとんどがサハラ以南のアフリカ系の人々である（Ｒｏｓｅｆｆ（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２５（２）：６７）。鎌状赤血球突然変異のヘテロ接合保因者には、マラリアに対する防御に起因する利益があると思われるため、この形質は時間と共に正の選択を受けてきた可能性がある。したがって、サハラ以南のアフリカでは人口の最大２８％が鎌状赤血球の形質を有すると推定されている（Ｅｌｇｕｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１２（２２）：７０５１）。鎌状赤血球症は、βグロビン遺伝子においてアミノ酸６番のバリンがグルタミン酸に置換された結果起こる突然変異（ＤＮＡレベルではＧＡＧからＧＴＧへの突然変異）によって引き起こされ、ここで結果として生じるヘモグロビンは、「ヘモグロビンＳ」または「ＨｂＳ」と呼ばれる。低酸素条件下では、デオキシ型のＨｂＳにおけるコンホメーション変化により、タンパク質のＥヘリックスとＦヘリックスとの間に疎水性パッチが露出する。ヘモグロビンのベータ鎖の６位における疎水性のバリン残基は、疎水性パッチと会合することができ、ＨｂＳ分子を凝集させ、繊維状の沈殿物を形成させる。これらの凝集物は次に、ＲＢＣの異常または「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性の喪失をもたらす。鎌状化しているＲＢＣは毛細血管床に入り込むことができなくなり、鎌状赤血球患者の血管閉塞性発作をもたらし得る。加えて、鎌状化したＲＢＣは正常なＲＢＣよりも脆弱であり、溶血傾向があり、最終的には患者の貧血を引き起こす。

【0010】

鎌状赤血球患者の処置及び管理は、抗生物質処置、疼痛管理、及び急性発症時の輸注を伴う生涯にわたる課題である。１つの手法はヒドロキシ尿素の使用であり、ヒドロキシ尿素は、部分的にはガンマグロビンの産生を増大することによりその効果を発揮する。しかしながら、慢性的なヒドロキシ尿素療法の長期の副作用は依然として未知であり、処置は、低い患者コンプライアンスにつながる望まれない副作用をもたらし、患者毎に異なる効力を有する（Ｂｒａｎｄｏｗ ａｎｄ Ｐａｎｅｐｉｎｔｏ（２０１１）Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８６（９）：８０４－８０６）。鎌状赤血球処置の効力が増大したにもかかわらず、患者の平均余命は未だ５０代半ばから後期でしかなく、疾患に関連する病的状態は患者の生活の質に深刻な影響を及ぼす。

【0011】

サラセミアもまたヘモグロビンに関する疾患であり、一般的にはグロビン鎖の発現低下を伴う。これは、遺伝子の調節領域における突然変異を通じて、または機能性グロビンタンパク質の発現低下もしくはレベル低下をもたらすグロビンコード配列における突然変異から生じ得る。アルファグロビン遺伝子座の突然変異によって生じるアルファサラセミアは、主に西アフリカ及び南アジア系の人々と関連付けられており、マラリアに対する抵抗性を与える可能性がある。ベータグロビン遺伝子座の突然変異によって生じるベータサラセミアは、主に地中海系、一般的にはギリシャならびにトルコ及びイタリアの沿岸地域の人々と関連付けられている。軽症型サラセミアでは、βグロビン対立遺伝子のうちの１つしか突然変異を保有しない。個体は小球性貧血を患うことになり、検出は通常、正常未満の平均血球体積（＜８０ｆＬ）を要する。軽症型サラセミアを患う対象の対立遺伝子は、β＋／βまたはβ０／βである（ここで「β＋」は、いくらかの量のβ鎖の形成を可能にする対立遺伝子を指し、「β」は、野生型βグロビン対立遺伝子を指し、「β０」は、ベータグロビン発現の完全欠損に関連するβグロビン突然変異を指す）。サラセミアの媒介者である対象は通常の生活を送ることができる場合が多いが、貧血の重症度に応じて時折、とりわけ病気または妊娠時に輸注を必要とすることがある。これらの患者の対立遺伝子は、β＋／β＋またはβｏ／β＋であり得る。重症型サラセミアは、両方の対立遺伝子がサラセミア突然変異を有するときに起こる。これは、重度に小球性かつ低色素性の貧血である。処置しなければ貧血、脾腫、及び重度の骨変形を引き起こし、進行すると２０歳前に死に至る。処置は、定期的な輸血、脾腫の場合は脾摘出術、及び輸注が原因の鉄過剰のキレート化からなる。重度サラセミア罹患者の処置には、適切なドナーが特定可能であれば骨髄移植も使用されるが、この手技は相当なリスクを有し得る。

【0012】

ＳＣＤとベータサラセミアとの両方の処置のために提唱されている１つの手法は、異常な成体ヘモグロビンをＨｂＦで機能的に置き換えることを目的としてガンマグロビンの発現を増大させることである。上述のように、ヒドロキシ尿素を用いたＳＣＤ患者の処置は、ガンマグロビン発現の増大に対するその効果をひとつの理由として成功すると考えられている。ガンマグロビン発現に影響することが発見された最初の化合物群は、細胞傷害性薬物であった。薬理学的な操作によってガンマグロビンをデノボ合成させる能力は、実験動物に５－アザシチジンを使用して初めて示された（ＤｅＳｉｍｏｎｅ（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９（１４）：４４２８－３１）。後続研究により、βサラセミア患者及び鎌状赤血球症患者のＨｂＦを増大させる５－アザシチジンの能力が確認された（Ｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７：１４６９－１４７５、及びＬｅｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｌｏｏｄ ６２：３７０－３８０）。加えて、短鎖脂肪酸（例えば酪酸及び誘導体）は、実験系においてＨｂＦを増大させることが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｌｏｏｄ ７２（６）：１９６１－１９６７）。また、ヒト集団の一部には、高量のＨｂＦが成人期まで持続する「遺伝性高胎児ヘモグロビン症」（ＨＰＦＨ）として知られる状態を有する集団がある（ＨＰＦＨヘテロ接合体の１０～４０％）（Ｔｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ １８（Ｒ２）：Ｒ２１６－Ｒ２２３を参照されたい）。これは稀な状態であるが、関連するベータグロビン異常が一切ない場合は、個体のヘモグロビンの１００％がＨｂＦであっても有意な臨床症状を伴うことはない。ベータサラセミアを有する個体が同時にＨＰＦＨも有する場合、ＨｂＦの発現は疾患の重症度を軽減し得る（Ｐｏｔｏｋａ ａｎｄ Ｇｌａｄｗｉｎ（２０１５）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０８（４）：Ｌ３１４－Ｌ３２４）。さらに、鎌状赤血球症の自然経過の重症度は患者毎に大きく異なり得、このばらつきは、ひとつには、疾患がより軽度な一部の個体は、より高レベルのＨｂＦを発現するという事実に起因し得る。

【0013】

ＨｂＦの発現を増大させる１つの手法には、産物がガンマグロビン発現の調節に関与する遺伝子の特定が含まれる。そのような遺伝子の１つは、リンパ球の発生におけるその役割のために最初に特定されたＢＣＬ１１Ａである。ＢＣＬ１１Ａは、ガンマグロビン発現の発生段階特異的な調節に関与すると考えられているジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは成体の赤血球系前駆体細胞において発現し、その発現の下方調節は、ガンマグロビン発現の増大をもたらす。加えて、ＢＣＬ１１Ａ ｍＲＮＡのスプライシングは発生段階的に調節される。胚細胞では、ＢＣＬ１１Ａ－Ｓ及びＢＣＬ１１Ａ－ＸＳとして知られるＢＣＬ１１Ａのより短いｍＲＮＡ変異体が主に発現するのに対し、成体細胞では、より長いＢＣＬ１１Ａ－Ｌ及びＢＣＬ１１Ａ－ＸＬのｍＲＮＡ変異体が主に発現する。Ｓａｎｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２ ｐ．１８３９を参照されたい。ＢＣＬ１１Ａタンパク質は、ベータグロビン遺伝子座と相互作用して、そのコンホメーション、ひいてはその発現を様々な発生段階で変化させると思われる。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡの使用が提唱されているが（例えば、米国特許公開第２０１１／０１８２８６７号を参照されたい）、この技術にはいくつかの潜在的な欠点がある。すなわち、完全なノックダウンが達成されない可能性があること、そのようなＲＮＡの送達が問題になる可能性があること、そしてこうしたＲＮＡが継続的に存在しなければならないことから、生涯にわたり複数の処置が必要になることである。

【0014】

ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を標的にすることにより、ＨｂＦを増大させる機構が提供される。例えば、米国特許公開第２０１５／０１３２２６９号及びＰＣＴ公開第ＷＯ ２０１６／１８３２９８号を参照されたい。ゲノムワイド関連解析により、高いＨｂＦレベルに関連するＢＣＬ１１Ａ遺伝子座における一組の遺伝的差異が特定された。こうした差異は、系統が限定された段階特異的なエンハンサー領域として機能するＢＣＬ１１Ａの非コード領域に見られる小ヌクレオチド多型（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）の集まりである。さらなる調査により、このＢＣＬ１１Ａエンハンサーは、赤血球系細胞におけるＢＣＬ１１Ａ発現のためには必要であるが、Ｂ細胞におけるその発現のためには必要とされないことが明らかになった（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：２５３－２５７を参照されたい）。このエンハンサー領域はＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２内に見られ、イントロン２では３つのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域（調節能に関連するクロマチンの状態を示すことが多い）が特定された。これら３つの領域は、ＢＣＬ１１Ａの転写開始部位からのキロベース単位の距離に従って「＋６２」、「＋５８」、及び「＋５５」と識別された。これらのエンハンサー領域は、約３５０（＋５５）、５５０（＋５８）、及び３５０（＋６２）のヌクレオチド長である（Ｂａｕｅｒ ２０１３，ｉｂｉｄ）。

【0015】

ヒトの治療処置に使用するためのヌクレアーゼを開発する際は、ヌクレアーゼが最上の安全性特性を有することが必須である。具体的に述べると、ヌクレアーゼは、オフターゲット切断のレベルが非常に低くなければならない。使用者が指定した標的以外の場所にかなりの数の二本鎖切断があると、オフターゲット遺伝子の抑制が起こり、稀な事例では染色体転座が発生する場合がある（Ｈｏｂａｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ（２０１６）Ｂｌｏｏｄ，１２７（２１）：２５２５－２５３５及びＴｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓを参照されたい）。工学操作されたヌクレアーゼとゲノムＤＮＡとの非特異的な相互作用を排除することにより、特異性の向上が達成され得る（米国仮特許出願第６２／３７８，９７８号及び同第６２／４４３，９８１号を参照されたい）。

【0016】

よって、例えば鎌状赤血球症及びベータサラセミアなどの異常ヘモグロビン症を処置するためにＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現を変化させるための、高度に特異的なさらなる方法及び組成物が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0017】

本発明は、遺伝子療法及びゲノム工学において使用するための高度に特異的な組成物及び方法を記述する。具体的に述べると、記述する方法及び組成物は、例えば、１つ以上のさらなる遺伝子の調節因子として機能する遺伝子であるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を（例えば、その発現を完全または部分的に消失させることにより）不活性化させることに関する。特に、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のエンハンサー機能に干渉して特定の細胞系統（例えば、赤血球系）におけるその活性を減少またはノックアウトするための方法及び組成物を記述する。さらに、本発明は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー機能に干渉するための方法及び組成物を提供し、ここでエンハンサー配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のコード配列内に位置せず、提供される試薬は、高度に特異的な活性を呈する。こうした状況下で結果として生じるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の下方調節は、ガンマグロビンの発現増大をもたらし、オフターゲット切断事象数が低減する。

【0018】

一部の態様では、本発明は、ＤＮＡ標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を各フィンガーが含む４つ、５つ、または６つのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む、天然に存在しないジンクフィンガータンパク質を含み、ここで認識ヘリックス領域は、表１の一行に示される順序の配列を含む。各ジンクフィンガーにおける７アミノ酸の認識ヘリックス領域には、ジンクフィンガー骨格（亜鉛配位残基を含めおよそ３０残基）内で－１から＋６の番号が付けられている。ある特定の実施形態では、本明細書に記述されるジンクフィンガータンパク質の構成成分ジンクフィンガーのうちの１つ、２つ、または３つ以上は、－５位、－１４位、または－５位と－１４位の両方（認識ヘリックス領域に使用される－１から＋６の番号付けから続く番号付け）におけるアミノ酸への突然変異を含むがこれらに限定されない、認識ヘリックス領域外の１つ以上の残基への突然変異をさらに含む。例えば、米国仮特許出願第６２／３７８，９７８号及び同第６２／４４３，９８１号に記述されているＱｍ４及びＱｍ１４の突然変異を参照されたい。ジンクフィンガータンパク質の構成成分ジンクフィンガーは、例えば米国特許第８，７７２，４５３号に記述されているような任意のリンカーによって連結されていてよい。ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、次のように呼称されるタンパク質：６３０１４（配列番号１に示される標的部位に結合する）及び６５７２２（配列番号２に示される標的部位に結合する）に対して、表１に示される認識ヘリックスを含む。

【0019】

ある特定の実施形態では、本明細書に記述されるジンクフィンガータンパク質は、機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、切断ドメイン（ジンクフィンガーヌクレアーゼを形成するため）など）に融合している。切断ドメイン及びジンクフィンガータンパク質を作動的に連結するには、米国特許第９，３９４，５３１号及び同第９，５６７，６０９号に記述されているリンカーを含むがこれらに限定されない任意のリンカーを使用してよい。さらに、ＦｏｋＩ切断ドメインが使用される場合、触媒ドメインにおけるさらなる突然変異、二量体化ドメインにおけるさらなる突然変異、リン酸接触残基へのさらなる突然変異（二量体化ドメインまたは触媒ドメイン内ではない）、ならびに触媒ドメインの突然変異、二量体化ドメインの突然変異、及びリン酸接触残基への突然変異のうち任意のものの組み合わせが存在し得、これには、限定されるものではないが、二量体化ドメインへのＥＬＤまたはＫＫＲ突然変異、ＦｏｋＩドメインの残基５２５への突然変異（ＫからＳ）、及び二量体化ドメインへのＥＬＤまたはＫＫＲ突然変異とＦｏｋＩドメインの残基５２５への突然変異（ＫからＳ）との組み合わせが含まれる（番号付けは野生型に対するものである）。米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、同第８，６２３，６１８号、及び米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号、ならびに米国仮特許出願第６２／３７８，９７８号及び同第６２／４４３，９８１号を参照されたい。

【0020】

ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を二量体化対として使用して、このＺＦＮ対の標的部位の一方もしくは両方、またはその付近を切断することができ、例えば、表１の「左側パートナー」（例えば、６３０１４）は、表１の「右側パートナー」（例えば、６５７２２）と二量体を形成して、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を切断することができる。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ対は、次のアミノ酸配列、６３０１４：

【化1】

を含み、ここでリンカー配列は、当技術分野で公知の任意のリンカー配列、例えば米国特許第９，３９４，５３１号及び同第９，５６７，６０９号に記述されているものであり得る。ある特定の実施形態では、６３０１４のリンカーは、Ｌ７ｃ５リンカー（ＬＲＧＳＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号５））を含むかまたはそれからなり、６５７２２に使用されるリンカーは、Ｌ０リンカー（ＬＲＧＳＱＬＶＫＳ（配列番号６）、米国特許第９，５６７，６０９号参照）を含むかまたはそれからなる。上記に示した配列のリンカーのＣ末端側にあるＦｏｋＩ切断ドメイン配列は、ジンクフィンガータンパク質に作動的に連結した代替的なＦｏｋＩドメインも含み得る。ある特定の実施形態では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、触媒ドメイン、二量体化ドメイン、リン酸接触残基への代替的または付加的な突然変異、ならびに、触媒ドメイン、二量体化ドメイン、及びリン酸接触残基のうちの任意のものへの突然変異の組み合わせを含み得る。

【0021】

別の態様では、本発明は、ゲノム工学を目的とした、ヒト幹細胞または前駆体細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）への少なくとも１つのヌクレアーゼ（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列に結合するヌクレアーゼ）の送達を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を各フィンガーが含む４つ、５つ、または６つのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含み、ここで認識ヘリックス領域は、表１の一行に示される順序の配列を含む。他の実施形態では、ＺＦＮヌクレアーゼは、６３０１４／６５７２２と呼称されるヌクレアーゼ対を含む。本明細書に記述されるヌクレアーゼ（複数可）は、リンカー、例えば、ＬＲＧＳＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号５）または（ＬＲＧＳＱＬＶＫＳ（配列番号６））を含むがこれらに限定されない、９，５６７，６０９に示されるリンカーを（例えば、ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間に）さらに含み得る。

【0022】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼはペプチドとして送達されるが、他の実施形態では、少なくとも１つのヌクレアーゼをコードする核酸として送達される。一部の実施形態では、２つ以上のヌクレアーゼが使用される。一部の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり、一部の事例では、ｍＲＮＡは保護されている。一部の態様では、ｍＲＮＡは化学的に改変されていてもよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４－１５７を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡ ｃａｐを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号及び同第８，１５３，７７３号を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未改変のヌクレオチドと改変されたヌクレオチドとの混合物を含み得る（米国特許公開第２０１２／０１９５９３６号を参照されたい）。好ましい一実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸は、電気穿孔によってＨＳＣ／ＰＣに送達される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、転写因子の結合部位またはその付近を切断する。一部の態様では、転写因子はＧＡＴＡ－１である。

【0023】

他の態様では、本発明は、内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列が、本明細書に記述される（例えば、表１に示される）ヌクレアーゼにより、例えば細胞の野生型配列と比較して遺伝的に改変されている、細胞または細胞株を含む。ＢＣＬ１１Ａエンハンサーに対する遺伝子改変は、グロビン（ベータ及びガンマ）遺伝子発現の改変をもたらす。本明細書に記述されるヌクレアーゼで改変された細胞または細胞株は、構造、機能、及び構造と機能両方の組み合わせにおいて野生型と区別可能である。遺伝子改変細胞または細胞株は、改変に対してヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。改変は、挿入（例えば、導入遺伝子挿入）、欠失、及び挿入と欠失の組み合わせを含み得る。このような挿入、欠失、及び挿入と欠失の組み合わせは、一般に「インデル」と呼ばれる。一部の好ましい実施形態では、インデルは、転写因子結合部位の破壊をもたらす。ある特定の実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ（複数可）の結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、及び結合部位と切断部位の組み合わせにおけるものか、またはその付近、例えば、切断部位（複数可）から１～３００個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対、より好ましくは、表１に示される結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、及び結合部位と切断部位の組み合わせの片側から１～１００個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対、さらにより好ましくは、結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、及び結合部位と切断部位の組み合わせの片側で１～５０個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対だけ、上流もしくは下流にある。ある特定の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列の遺伝子改変は、表１に示される配列（標的部位）の中及び／または間にある。改変は、切断部位における１つ以上のヌクレオチドに対する改変も含み得る。改変は、結合部位における１つ以上のヌクレオチドに対する改変も含み得る。改変は、切断部位における、そして結合部位のうちの１つ以上における、１つ以上のヌクレオチドに対する改変をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ標的部位（複数可）のうちの１つ以上は、改変されていない。他の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）の標的部位のうち少なくとも１つは改変されている。ある特定の実施形態では、改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの「＋５８」領域またはその付近、例えば、配列番号１及び配列番号２のうちのいずれかに示されるヌクレアーゼ結合部位またはその付近にある。例えば幹細胞（ＣＤ３４＋造血幹細胞などの造血幹細胞）または赤血球（ＲＢＣ）前駆体細胞など、任意の細胞または細胞株が、本明細書に記述されるヌクレアーゼによって改変され得る。

【0024】

本明細書に記述されるヌクレアーゼによる改変後に得られる細胞または細胞株、例えば、本明細書に記述されるヌクレアーゼで改変された細胞または細胞株の子孫である細胞または細胞株も記述される。本明細書に記述される改変幹細胞の子孫である部分的または完全に分化した細胞も提供される（例えば、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆体細胞）。ヌクレアーゼで改変された細胞の子孫である細胞は、増殖、分化、及び増殖と分化両方の組み合わせをインビトロ（培養下）で行ってもよいし、または、例えばヌクレアーゼで改変された幹細胞をエクスビボ投与した後に生きている対象において分化させてもよい。本明細書に開示される遺伝子改変細胞または細胞株のいずれも、ガンマグロビンの発現増大を示し得る。本明細書に記述される遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物も提供される。

【0025】

他の態様では、本発明は、ドナー核酸を標的細胞に送達し、ドナーが細胞に組み込まれた遺伝子改変細胞を用意することを含む。ドナーは、表１のヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸の前、後、またはそれと共に送達されてもよい。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内在性遺伝子座に組み込まれる外来性配列（導入遺伝子）を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、標的切断部位と相同性の領域が隣接する全長遺伝子またはその断片を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは相同領域を欠いており、相同性非依存性機構（すなわち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは、任意の核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断の相同組換え修復のための基質として使用されると、内在性染色体座（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域）にドナー特異的欠失を発生させるか、または代替的に（またはこれに加えて）内在性遺伝子座の新規対立遺伝子型（例えば、転写因子結合部位を除去する点突然変異）を作り出す核酸を含み得る。一部の態様では、ドナー核酸はオリゴヌクレオチドであり、組み込みは、遺伝子補正事象または標的欠失をもたらす。

【0026】

他の態様では、ヌクレアーゼ、ドナー、及びヌクレアーゼとドナー両方の組み合わせは、ウイルスによる遺伝子移入法、ウイルスによらない遺伝子移入法、及びウイルスによる遺伝子移入法とウイルスによらない遺伝子移入法の組み合わせによって送達される。好ましい実施形態では、ドナーは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して細胞に送達される。一部の事例では、ＡＡＶは、カプシド血清型と比較して異種血清型のＬＴＲを含む。

【0027】

一部の態様では、エンハンサーのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域内の領域（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの＋５８領域）を含む欠失は、表１に示される１つ以上のヌクレアーゼを使用して行われる。これらの欠失は、約１ヌクレオチド～約５５１ヌクレオチドを含む場合がある。よって、欠失は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、またはこの間の任意の値のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、欠失は、１つ以上の転写因子結合領域を含む。一部の好ましい実施形態では、欠失は、ＧＡＴＡ－１結合部位、または他の因子と組み合わせたＧＡＴＡ－１の結合部位を含む。

【0028】

一部の実施形態では、表１のＤＮＡ結合ドメインは、機能的ドメインに融合している。一部の態様は、ＤＮＡ結合ドメインと、遺伝子の発現を調節することができるドメインとの融合を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、調整因子が遺伝子発現を抑制する遺伝子発現調整ドメインに融合した表１のＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0029】

一部の実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣ細胞を、本発明のヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、及びヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせ（すなわち、表１に示されるＺＦＰ）に接触させる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、及びヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせは、核酸として送達され、他の実施形態では、タンパク質として送達される。一部の実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、及びヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせをコードするｍＲＮＡであり、さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは保護されていてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、化学的に改変されていてもよく、ＡＲＣＡ ｃａｐ、未改変のヌクレオチドと改変されたヌクレオチドとの混合物、及び、ＡＲＣＡ ｃａｐと、未改変のヌクレオチドと改変されたヌクレオチドとの混合物との組み合わせを含み得る。部分的または完全に分化した細胞を含む、これらの細胞の子孫である細胞または細胞株も提供される。

【0030】

一部の態様では、対象からのＨＳＣ／ＰＣのアフェレーシス、または採取した骨髄からの精製の後、ＨＳＣ／ＰＣを、本発明のヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、及びヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせにエクスビボで接触させる。一部の実施形態では、本明細書に記述されるヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域内に改変を引き起こし、例えば、野生型細胞から構造、機能、及び構造と機能の組み合わせが異なる遺伝子改変細胞、他の改変（例えば、ヌクレアーゼ改変）細胞、ならびに野生型と他の改変細胞との組み合わせをもたらす。さらなる実施形態では、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域改変を含むＨＳＣ／ＰＣは、対象に再導入される。一部の事例では、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域改変を含むＨＳＣ／ＰＣは、導入前に拡大される。他の態様では、遺伝子改変ＨＳＣ／ＰＣは骨髄移植で対象に与えられ、ＨＳＣ／ＰＣはインビボで生着し、分化し、成熟する。一部の実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣは、Ｇ－ＣＳＦ誘導性動員、プレリキサホル誘導性動員、及びＧ－ＣＳＦ誘導性動員とプレリキサホル誘導性動員の組み合わせの後に対象から単離され、他の実施形態では、この細胞は、ヒト骨髄またはヒト臍帯から単離される。一部の態様では、対象は、改変されたＨＳＣ／ＰＣを含むグラフトの導入前に軽度の骨髄破壊手技を処置され、他の態様では、対象は、強力な骨髄破壊的移植前治療レジメンで処置される。一部の実施形態では、本発明の方法及び組成物は、異常ヘモグロビン症を処置または防止するために使用される。一部の態様では、異常ヘモグロビン症はサラセミアである。一部の態様では、異常ヘモグロビン症はベータサラセミアであり、他の態様では、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症である。

【0031】

一部の実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣをドナー分子にさらに接触させる。一部の実施形態では、ドナー分子は、ウイルスベクターによって送達される。ドナー分子は、プロモーターありまたはなしの、機能的ポリペプチド（例えば、ｃＤＮＡまたはその断片）をコードする１つ以上の配列を含み得る。ドナー分子が不活性化のために使用される場合、２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳなどをコードする配列を含むがこれらに限定されない、さらなる配列（コード配列または非コード配列）が含まれてもよい。

【0032】

一態様において、本発明の方法及び組成物は、ＨＳＣ／ＰＣをインビボで接触させるための方法を含む。ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、またはヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせは、当技術分野で公知の方法によってインサイチュでＨＳＣ／ＰＣに送達される。一部の実施形態では、本発明のヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質は、それを必要とする対象に投与されるウイルス粒子を含み、他の実施形態では、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、またはヌクレアーゼとＤＮＡ結合タンパク質の組み合わせは、ナノ粒子（例えばリポソーム）を含む。一部の実施形態では、ウイルス粒子、ナノ粒子、またはウイルス粒子とナノ粒子の組み合わせは、ＨＳＣ／ＰＣが存在する臓器（例えば骨髄）に送達される。

【0033】

別の態様では、相同性非依存性機構を介して細胞のゲノムにドナー核酸を組み込む方法が本明細書に記述される。本方法は、細胞のゲノム内に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出すことと、ＤＳＢの部位にドナー核酸が組み込まれるように、本明細書に記述されるヌクレアーゼを使用してドナー分子を切断することとを含む。ある特定の実施形態では、ドナー核酸は、相同性に依存しない方法（例えば、ＮＨＥＪ）によって組み込まれる。上述のように、インビボ切断すると、ＤＳＢの場所に標的を定めて細胞のゲノムにドナー配列を組み込むことができる。ドナー配列は、ＤＳＢを作り出すために使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上と同じ標的部位のうちの１つ以上を含み得る。よって、ドナー配列は、組み込みが所望される内在性遺伝子を切断するために使用されるものと同じヌクレアーゼのうちの１つ以上によって切断してもよい。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ＤＳＢを誘導するために使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム内のＤＳＢは、任意の機構によって作り出してよい。ある特定の実施形態では、ＤＳＢは、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、目的の領域内の配列に結合するように工学操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、及び切断ドメインまたは切断ハーフドメインによって作り出される。

【0034】

一態様において、ドナーは、目的の遺伝子に結合するか、その発現を調整するか、または結合と発現調整の両方を行う、目的の調節タンパク質（例えばＺＦＰ ＴＦ、ＴＡＬＥ ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ）をコードし得る。一実施形態では、調節タンパク質は、ＤＮＡ配列に結合し、他の調節因子の結合を防止する。別の実施形態では、調節タンパク質の結合は、標的ＤＮＡの発現を調整（すなわち、誘導または抑制）し得る。

【0035】

一部の実施形態では、トランスジェニックＨＳＣ／ＰＣ細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニックＨＳＣ／ＰＣ細胞とトランスジェニック動物の組み合わせは、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。一部の事例では、トランスジェニック動物は、内在性遺伝子座におけるノックアウト、及び内在性遺伝子のそれに対応するヒト遺伝子との置き換えを含み、これにより、ヒトタンパク質を単離して研究することができるインビボ系の開発が可能になる。このようなトランスジェニックモデルは、小分子もしくは大きな生体分子、または目的のヒトタンパク質と相互作用するかもしくはそれを改変し得る他の実体を特定するためのスクリーニング目的で使用され得る。一部の態様では、本明細書に記述される方法のうちのいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞など）または動物の胚内の選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）に導入遺伝子を組み込み、その後この胚を移植することにより、生きた動物が産まれる。その後、この動物を性成熟するまで飼育し、子孫を産生させ、ここで子孫の少なくとも一部は、編集された内在性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む。

【0036】

別の態様では、細胞における遺伝子発現（例えば、ＢＣＬ１１Ａ、グロビン遺伝子、及びＢＣＬ１１Ａとグロビン遺伝子の組み合わせ）を変化させる方法であって、本明細書に記述される（表１に示される）１つ以上のヌクレアーゼを、１つ以上のタンパク質が発現し、遺伝子の発現が変化するような条件下で細胞に導入することを含む、方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、グロビン遺伝子（例えば、ガンマグロビンまたはベータグロビン）の発現が変化（例えば、増大）する。本明細書に記述される方法のうちのいずれかは、ドナー配列（例えば、外来性または内在性プロモーターの制御下にある導入遺伝子またはその断片）を細胞のゲノムに組み込むこと、例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるヌクレアーゼ切断部位またはその付近にドナーを組み込むことをさらに含み得る。細胞へのドナー配列の導入は、ウイルスベクターの使用による導入、オリゴヌクレオチドとしての導入、プラスミドによる導入、及びウイルスベクターの使用による導入、オリゴヌクレオチドとしての導入、またはプラスミドによる導入から選択される１つ以上の方法の組み合わせによって行われる。遺伝子発現を変化させ得る細胞は、例えば、赤血球（ＲＢＣ）前駆体細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、及びＲＢＣ前駆体細胞と造血幹細胞の組み合わせであり得る。

【0037】

他の実施形態では、内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変（ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列のヌクレオチド配列への改変）を含む遺伝子改変細胞を産生する方法であって、ａ）４つ、５つ、または６つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に細胞を接触させるステップであって、ジンクフィンガードメインの各々は表１の一行に示される順序の認識ヘリックス領域を含む、ステップと、ｂ）ポリヌクレオチドからのジンクフィンガータンパク質の発現を促す条件に細胞を供するステップと、ｃ）遺伝子改変細胞を産生するのに十分に発現したジンクフィンガータンパク質で内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変するステップとを含む、方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインで（例えば、ステップ（ａ）の前に）細胞を刺激する。ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、非ウイルスベクターの使用、ウイルスベクターの使用、化学的手段、または電場への曝露（例えば、電気穿孔）を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法を使用して、細胞に接触させてよい。

【0038】

本明細書に記述される方法によって産生された細胞の子孫である細胞を含む、本明細書に記述されるゲノム改変のうちの１つまたは組み合わせを含む細胞も提供される。

【0039】

グロビン遺伝子発現の増大を必要とする患者を処置する方法であって、患者に医薬調製物を投与することを含み、医薬調製物が、患者のグロビン遺伝子発現を増大させるのに十分な量で、本明細書に記述される遺伝子改変細胞、タンパク質、ポリヌクレオチド、ならびに遺伝子改変細胞、タンパク質、及びポリヌクレオチドから選択される１つ以上の組み合わせを含む、方法も提供される。ある特定の実施形態では、患者は、サラセミアまたは鎌状赤血球症を有することが知られているか、これらを有することが疑われるか、またはこれらを発症するリスクがある。

【0040】

本発明の核酸、タンパク質、遺伝子改変細胞、ならびに核酸、タンパク質、及び遺伝子改変細胞から選択される１つ以上の組み合わせを含む、キットも提供される。本キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含まれた遺伝子をコードするＲＮＡ分子、またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）、ヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、幹細胞の自己再生（「幹細胞性」）の好適な改変因子、細胞、緩衝液、指示書（例えば、本発明の方法を行うためのもの）などを含んでよく、これらのキット構成要素の種々の組み合わせも含まれる。本発明は、ヌクレアーゼによって行われる（例えば、表１の一行に示される）少なくとも１つのゲノム改変を含む遺伝子改変細胞（例えば、造血（ＣＤ３４＋）幹細胞またはＲＢＣ前駆体細胞などの幹細胞）であって、ゲノム改変が内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にあり、さらに、ゲノム改変が、挿入、欠失、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、配列番号１及び配列番号２のうちのいずれか、またはその付近、またはそれらの間にある改変を含む、細胞を含むが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、この細胞は、本明細書に記述される幹細胞の子孫である、遺伝子改変分化細胞（例えば、造血幹細胞またはＲＢＣ前駆体細胞の子孫であるＲＢＣ）である。

【0041】

ヌクレアーゼは、少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えば、表１に示されるもの）、少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、及び少なくとも１つのＺＦＮと少なくとも１つのＴＡＬＥＮの組み合わせを含んでもよい。ヌクレアーゼ（複数可）は、タンパク質形態で、ヌクレアーゼ（複数可）をコードするポリヌクレオチドとして、またはタンパク質形態とヌクレアーゼ（複数可）をコードするポリヌクレオチドの組み合わせとして細胞に導入されてもよい。ある特定の実施形態では、ゲノム改変は、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組み込みを含む挿入を含む。本明細書に記述される遺伝子改変細胞のうちの１つ以上を含む医薬組成物も提供される。

【0042】

認識ヘリックス領域を含む４つ、５つ、または６つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を含むＤＮＡ結合タンパク質であって、ジンクフィンガータンパク質が、表１の一行に示される順序の認識ヘリックス領域を含む、ＤＮＡ結合タンパク質も提供される。表１に示される標的部位の塩基対の一部分（例えば、少なくとも４つ、５つ、または６つ以上）を含む配列に結合する複数のリピートを含むＴＡＬＥタンパク質も提供される。本明細書に記述されるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質と、野生型または工学操作された切断ドメインもしくは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質も提供され、本明細書に記述されるタンパク質（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドも提供される。本明細書に記述される１つ以上のポリヌクレオチド、タンパク質、及びポリヌクレオチドとタンパク質の組み合わせを含む細胞（例えば、造血（ＣＤ３４＋）幹細胞などの単離幹細胞）も提供される。本明細書に記述される１つ以上のタンパク質、ポリヌクレオチド、細胞、またはこれらの組み合わせを含むキットも提供される。

【0043】

また、細胞（例えば、ＲＢＣ前駆体細胞、造血幹細胞、及びＲＢＣ前駆体細胞と造血幹細胞の組み合わせ）におけるグロビン遺伝子発現を変化させる方法であって、本明細書に記述される１つ以上のヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上のタンパク質が発現し、グロビン遺伝子（例えば、ガンマグロビン、ベータグロビン、及びガンマグロビンとベータグロビンの組み合わせ）の発現が変化（例えば、増大）するような条件下で細胞に導入することを含む、方法も記述される。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞のゲノムに、例えばウイルスベクターを使用して、オリゴヌクレオチドとして、またはプラスミドにより、ドナー配列を組み込むことをさらに含む。ドナー配列は、内在性または外来性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含み得る。

【0044】

内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内（例えば、表１に示される標的部位に）ゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を産生する方法であって、（ａ）４つ、５つ、または６つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに細胞を接触させるステップであって、ジンクフィンガードメインの各々は表１の一行に示される順序の認識ヘリックス領域を含む、ステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドからの融合タンパク質の発現を促す条件に細胞を供するステップと、（ｃ）遺伝子改変細胞を産生するのに十分に発現した融合タンパク質で内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変するステップとを含む、方法も提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのサイトカインで細胞を刺激することをさらに含む。ポリヌクレオチド（複数可）は、例えば、非ウイルス送達系、ウイルス送達系、送達ビヒクル、ならびに非ウイルス送達系、ウイルス送達系、及び送達ビヒクルから選択される組み合わせを使用して細胞内に送達してもよく、細胞を電場に供すること、または細胞膜破壊を送達機構として用いること（いわゆる「スクイーズ技術」、例えばＳｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ／ｐｏｎｅ．０１１８８０３を参照されたい）を含み得る。

【0045】

グロビン遺伝子発現の増大を必要とする患者（例えば、サラセミア（例えば、βサラセミア）もしくは鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症を有することが知られているか、これらを有することが疑われるか、またはこれらを発症するリスクがある患者）を処置する方法であって、患者のグロビン遺伝子発現を増大させるのに十分な量で、本明細書に記述される医薬組成物（例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞、またはタンパク質、ポリヌクレオチド、及び細胞から選択される組み合わせ）を患者に投与することを含む、方法も提供される。

【0046】

本開示全体を考慮すれば、当業者には、これら及び他の態様が容易に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１Ａ及び１Ｂは、オリゴヌクレオチド二重鎖組み込み部位アッセイの要旨を示す概略図である。図１には、補助的なオリゴヌクレオチド二重鎖ＤＮＡの存在下のＺＦＮで細胞が処置され、結果として生じる切断事象の画分にこれがキャプチャされる、アッセイの第１ステップが示される。図１Ｂには、細胞を７日間培養し、ゲノムＤＮＡを単離し、組み込まれたオリゴヌクレオチド二重鎖にプライマーを使用するアダプター媒介性ＰＣＲによってドナー組み込み部位に隣接するゲノムのセグメントを増幅する、後続のステップが示される。その後アンプリコンのシーケンシングを行うと、候補切断部位が明らかになる。

【図2-1】図２は、５１８５７／５１９４９の原型または親のＺＦＮ対を使用したオリゴヌクレオチド二重鎖組み込み部位アッセイによって特定された、４５５個の潜在的なオフターゲット遺伝子座の場所を示す。上位６３個の遺伝子座は灰色で強調されており、これらをインデルの追跡解析において解析した。各遺伝子座は、可能性が最も高い切断の場所を示す染色体及び塩基の番号、ならびにその遺伝子座において検出された組み込み体の数の表示によって識別されている。

【図2-2】図２－１の続き。

【図2-3】図２－２の続き。

【図2-4】図２－３の続き。

【図3-1】図３Ａ～３Ｃは、ジンクフィンガーの足場内にある例示的なリン酸接触残基を示す。図３Ａは、ＤＮＡ分子とのジンクフィンガーの相互作用を示し、野生型アルギニン側鎖の場所、及びそれがＤＮＡ分子のリン酸骨格とどのように相互作用するかを示す。図３Ｂ（配列番号７～１７）は、このアルギニンが各ジンクフィンガーの一次配列においてどこに位置しているか（太い矢印によって示された「Ｒ」残基の縦列）を示す例示的なＺＦＮ配列を示し、また、対応するリン酸の接触を排除するためにＺＦＰ骨格においてグルタミンと置換されたアルギニン（個別に四角で囲まれた「Ｒ」残基）も強調する。これらの配列は、認識ヘリックス領域（残基－１から＋３、＋５及び＋６は四角に囲まれ、陰影が付いている）ならびにＣ末端のジンクフィンガードメインと切断ドメイン（切断ドメインは図示せず）との間のリンカーの一部分も示す。さらに図３Ｃは、特異性最適化中にセリンに置換され得る、ＦｏｋＩ切断ドメインに存在するリジン側鎖に接触する別の潜在的な骨格の空間的な場所を示す。

【図3-2】図３－１の続き。

【図4】図４は、原型の５１８５７／５１９４９対または最適化された６３０１４／６５７２２対のいずれかでＣＤ３４細胞を処置したことによる、試験した種々の遺伝子座における改変レベルを比較するグラフである。下部に沿って、すなわちｘ軸上には、潜在的な切断標的として特定された遺伝子座が示され、縦軸すなわちｙ軸には、各部位に対するインデルの割合が示されている。ｙ軸は対数スケールで示されていることに留意されたい。濃灰色のバーは、５１８５７／５１９４９対によって切断された遺伝子座及び検出された切断の量を示し、一方で薄灰色のバーは、最適化された対によって切断された遺伝子座であり、測定されたほぼ全ての切断が、標的とされるＢＣＬ１１ａ標的配列にある。

【図5】図５Ａ及び５Ｂは、ＢＣＬ１１Ａ特異的ＺＦＮでの処置及び赤血球系分化後のｈＣＤ３４＋細胞において作られたグロビンｍＲＮＡの相対比を示すグラフである。２名の健常なヒトドナー（ＰＢ－ＭＲ－００３またはＰＢ－ＭＲ－００４）に由来するＣＤ３４＋細胞をＺＦＮ対で処置したかまたは処置せず、その後αグロビン、βグロビン、及びγグロビンの発現を解析した。ＺＦＮ処置後に見られるγグロビンｍＲＮＡの量を判定する最良の方法は、発現の変化をγグロビンのβグロビンに対する比（図５Ａ）、またはγグロビンのαグロビンｍＲＮＡに対する比（図５Ｂ）のいずれかとして表すことである。

【図6】図６は、処置されたＣＤ３４＋細胞において産生されるγグロビンタンパク質の相対量を示すグラフである。上記のように、健常なヒトドナーに由来する２つのＣＤ３４＋細胞ロットを使用した（ＰＢ－ＭＲ－００３及びＰＢ－ＭＲ－００４）。この実験では、両方のドナーロットのＨＳＰＣの赤血球系後代において、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーが６３０１４／６５７２２によって破壊されると、胎児グロビンタンパク質の百分率が約１５％～２０％のレベルまでおよそ３～４倍上昇したことが観察された。

【図7】図７は、上述の６３０１４／６５７２２処置ドナーロット（「＋ＺＦＮ」）を生着させたマウスにおける相対的なヒトキメリズムを示すグラフである。ヒトキメリズムは、ＦＡＣＳを使用したｈＣＤ４５マーカーをその表面に有する細胞の検出によって測定した。移植後第８週または第１２週のいずれかに収集した末梢血中のヒトｈＣＤ４５＋細胞の百分率が示されている。このデータは、トランスフェクトしていない対照（「（－）」）及びＺＦＮトランスフェクトＨＳＰＣ（「＋ＺＦＮ」）の生着後で比較可能なヒトキメリズムにより、この研究における良好な生着レベルを示した。白丸及び三角形は個々の動物を表す。

【図8】図８は、ヒト細胞が細胞表面上のｈＣＤ４５の存在によって特定された生着後のマウスの骨髄において検出されたキメリズムの百分率を示す。試料は生着後第１２週に解析した。

【図9-1】図９Ａ～９Ｄは、系統特異的な細胞表面マーカーを認識する抗体を用いた、第１２週に得た生着後マウスの骨髄細胞のＦＡＣＳ解析によって試験した、種々の造血細胞系統の再構築を示すグラフである。このデータは、注射後第１２週の骨髄におけるヒト造血性系統を解析したもの全てに関し、ＢＣＬ１１Ａ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡで処置したＣＤ３４＋細胞後代（「‘１４／’２２」）と、トランスフェクトしていない細胞のそれ（「（－）」）との間で比較可能な提示を示した。両ドナー（「００３」及び「００４」）に由来する細胞について、リンパ系、骨髄系、赤血球系、及びＨＳＰＣ（それぞれ図９Ａ～９Ｄ）からのデータが示されている。このデータは、注射後第１２週の骨髄におけるヒト造血性系統を解析したもの全てに関し、Ｂｃｌ１１Ａ ＺＦＮ ｍＲＮＡで処置したＣＤ３４＋細胞後代と、トランスフェクトしていない細胞のそれとの間で比較可能な提示を示した。

【図9-2】図９－１の続き。

【図9-3】図９－２の続き。

【図9-4】図９－３の続き。

【図10】図１０は、生着後マウスの末梢血から単離したＤＮＡ中のＢＣＬ１１Ａ標的における遺伝子改変のレベルをディープシーケンシングによってアッセイしたものを示すグラフである。データは、インプット細胞（ＺＦＮトランスフェクションの２日後、（「＋」））について、そして生着の８週間後または１２週間後の血液細胞について示されており、遺伝子改変の良好な保持が実証された。トランスフェクトしていない細胞は、「処置」のラインに「（－）」によって表されている。

【図11】図１１は、ＺＦＮ処置細胞（「＋」）の生着後の骨髄細胞試料に関する、ＢＣＬ１１Ａ標的における遺伝子改変の量を示すグラフである。無処置の細胞は、処置のラインに「（－）」によって表されている。ＢＣＬ１１Ａ依存性系統（ＣＤ１９マーカーを発現するＢ細胞；ＣＤ４５及び高レベルのＣＤ３８を発現する未分化の前駆細胞）及びＢＣＬ１１Ａ非依存性（骨髄系）系統の両方で比較可能な改変が観察された。インプット遺伝子改変レベルはＰＢ－ＭＲ－００４ドナー試料中よりもＰＢ－ＭＲ－００３ドナー試料中で高かったが、ＰＢ－ＭＲ－００４由来細胞は、マウスにおいてＰＢ－ＭＲ－００３由来細胞よりも高い改変レベル、すなわち改変のより良好な保持を一貫して示した。

【図12】図１２は、１４日間のインビトロ分化後の第１２週の骨髄細胞に由来する赤血球系細胞における遺伝子改変の量を示すグラフである。このデータは、上述の２名の異なるドナーを最初に生着させたマウスから得たものであり、ＺＦＮ処置（「＋ＺＦＮ」）により媒介されるＢＣＬ１１Ａ改変が赤血球系分化中に著しく変化しないことを実証した。ＺＦＮで処置しなかった細胞は「（－）ＺＦＮ」によって示されている。

【図13】図１３Ａ及び１３Ｂは、γグロビンコードｍＲＮＡの相対量を示すグラフであり、γグロビンｍＲＮＡの濃度は、γグロビン／βグロビンｍＲＮＡの比（図９Ａ）またはγグロビン／αグロビンｍＲＮＡの比（図９Ｂ）のいずれかとして示されている。トランスフェクトしていない試料（「（－）ＺＦＮ」）及びＺＦＮ処置試料（「＋ＺＦＮ」）の両方において、γグロビン対βグロビンまたはγグロビン対αグロビンのｍＲＮＡ比は、同じ群の個々のマウスの赤血球系後代同士の間で大きく異なった。しかしながら、このばらつき、及び２名の異なるヒトドナーの使用により導入されたばらつきにもかかわらず、６３０１４／６５７２２処置試料の平均は、それぞれに対応するトランスフェクトしていない試料と比較すると、γグロビンｍＲＮＡレベルの約１．５～２倍の上昇を示す。

【図14】図１４は、生着後マウスの骨髄由来細胞におけるγグロビンタンパク質の量の差（γグロビン／αグロビンまたはγグロビン／全β様タンパク質のいずれかの比として表される）を示すグラフであり、ここで骨髄細胞は、インビトロ分化プロトコールに従うものであった。タンパク質レベルは分化の１６日目に測定した。ガンマ（γ）グロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対アルファ（α）グロビンの比、ならびにガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対ベータ様グロビンの比（Ａガンマ、Ｇガンマ、ベータ及びデルタの各グロビンのピークの和）を判定した。ＰＢ－ＭＲ－００３由来試料の不十分な赤血球系分化と一致して、このドナーに由来するトランスフェクトしていない細胞中のガンマグロビンレベルは非常に高く（約３０％）、したがってＺＦＮ処置（「＋ＺＦＮ」）は、無処置の細胞（「（－）ＺＦＮ」）と比較して、ガンマグロビンレベルの１．２倍の上昇しかもたらさなかった。ＰＢ－ＭＲ－００４はトランスフェクションなしでより典型的なレベル（約９％）を示し、マウス継代の１２週間後にガンマグロビンタンパク質レベルの約２倍の上昇を呈した。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本明細書では、ＢＣＬ１１Ａ、ガンマグロビン、及びＢＬＣ１１Ａとガンマグロビンの組み合わせの発現の調整のため、かつ、異常ヘモグロビン症の処置、防止、または処置及び防止のための、ゲノム工学のための組成物及び方法が開示される。特に、表１の一行に示される認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含むヌクレアーゼを用いて標的を定めることにより、ＨＳＣ／ＰＣにおけるＢＣＬ１１Ａのエンハンサーの破壊が効率的に達成され、後の赤血球生成中の相対的なガンマグロビン発現の変化がもたらされる。こうしたＢＣＬ１１Ａ及びガンマグロビンの発現の調整は、ベータグロビン発現が不十分であるか、または突然変異型のベータグロビンが発現するような、異常ヘモグロビン症（例えば、ベータサラセミア、鎌状赤血球症）の処置に特に有用である。本発明の方法及び組成物を使用すれば、赤血球前駆体細胞におけるガンマグロビンの発現を変化させることにより、異常なベータグロビンによって引き起こされる合併症及び疾患関連の続発症を克服することができる。

【0049】

総則
本明細書に開示される方法の実施ならびに組成物の調製及び使用は、特記なき限り、当業者の技能範囲内である、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及びＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

【0050】

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖状または環状のコンホメーション、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的と解釈されてはならない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体のほか、塩基、糖、リン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）、ならびに塩基、糖、及びリン酸部分から選択される組み合わせが改変されているヌクレオチドも包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する。すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。

【0051】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう互換的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0052】

「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性の相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基に接触する）必要はない。このような相互作用は概して、１０^－６Ｍ^－１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」とは結合の強度を指し、結合親和性の増大はＫ_ｄの低下と相関する。

【0053】

「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子に結合しても（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子に結合しても（ＲＮＡ結合タンパク質）、タンパク質分子に結合してもよく（タンパク質結合タンパク質）、またはＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、もしくはタンパク質から選択される分子の組み合わせに結合してもよい。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体に結合してもよく（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合してもよく、または、それ自体と、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子との両方に結合してもよい。結合タンパク質は、２種以上の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、及びタンパク質結合活性を有する。

【0054】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインで、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化している結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーによって配列特異的にＤＮＡに結合するものである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。

【0055】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥがその同族標的ＤＮＡ配列に結合することに関与する。単一の「リピート単位」（別称「リピート」）は、一般的には３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を呈する。

【0056】

ジンクフィンガー及びＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を工学操作する（１つ以上のアミノ酸を変化させる）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学操作」することができる。したがって、工学操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を工学操作するための方法の非限定的な例は、デザイン及び選択である。デザインされたＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在しないタンパク質で、そのデザイン／組成が主に合理的基準からもたらされるものである。デザインのための合理的基準は、既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥデザインならびに結合データの情報を保管するデータベースで情報を処理するための置換規則及びコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、及び同第８，５８５，５２６号を参照されたい。また、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、及び同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。

【0057】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に存在しないタンパク質で、その産生が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスからもたらされるものである。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、同第８，５８６，５２６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。

【0058】

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与していると考えられている原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えば、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．ｉｂｉｄ、Ｇ．Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる全ての構成成分である。

【0059】

「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナーのキャプチャ及び相同組換えを含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構による細胞内の二本鎖切断の修復中に起こる、そのような交換の特殊形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けたもの）の修復の鋳型とするために「ドナー」分子を使用し、また、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすことから、「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」などとして知られている。いずれかの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、このような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、ドナーを使用して遺伝情報を再合成し、これを標的の一部とする「合成依存性鎖アニーリング」、これらの関連プロセスまたはこれらの組み合わせを含み得る。このような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の変化をもたらす。

【0060】

本開示の方法において、本明細書に記述される１つ以上の標的ヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内の所定の部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。ＤＳＢは、相同組換え修復、または相同組換えによらない修復機構によってインデルをもたらし得る。欠失は、任意の数の塩基対を含んでよい。同様に、挿入は、例えば、任意選択で、切断の領域内のヌクレオチド配列との相同性を有する、「ドナー」ポリヌクレオチドの組み込みを含む、任意の数の塩基対を含み得る。ドナー配列は物理的に組み込まれてよい。または代替的には、ドナーポリヌクレオチドが相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用され、ドナーにあるようなヌクレオチド配列の全てまたは一部が細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列は、変化させてもよく、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換してもよい。よって、「置き換える」または「置き換え」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列を別のもので置き換えること（すなわち、情報という意味での配列の置き換え）を表すものと理解することができ、１つのポリヌクレオチドを別のもので物理的または化学的に置き換えることが必ずしも必要であるとは限らない。

【0061】

本明細書に記述される方法のうちのいずれかにおいて、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、さらなるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮの対を使用してよい。

【0062】

本明細書に記述される方法のうちのいずれも、任意のサイズのドナーの挿入、または目的の遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる細胞内の１つ以上の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化のために使用することができる。遺伝子が部分的または完全に不活性化した細胞株も提供される。

【0063】

本明細書に記述される方法のうちのいずれかにおいて、外来性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）に、目的の領域内のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含めることにより、相同組換えを促して、目的の領域内の非同一配列を挿入することができる。よって、ある特定の実施形態では、ドナー配列のうち目的の領域内の配列と相同である部分は、置き換えられるゲノム配列と約８０～９９％（またはこの間の任意の整数）の配列同一性を呈する。他の実施形態では、例えば、１００個超の連続した塩基対のうち、ドナーとゲノム配列との間で１つのヌクレオチドしか異ならない場合、ドナーとゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同性部分は、新しい配列が目的の領域に導入されるように、目的の領域内に存在しない配列を含み得る。こうした事例において、非相同配列には、概して、目的の領域内の配列と相同または同一である、５０～１，０００塩基対（またはこの間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列が隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。

【0064】

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じる場合がある。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、標的を定めた二本鎖ＤＮＡ切断のために、融合ポリペプチドが使用される。

【0065】

「切断ハーフドメイン」とは、ポリペプチド配列で、第２のポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）と併せて、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するものである。「第１及び第２の切断ハーフドメイン」、「＋及び－の切断ハーフドメイン」、及び「右側及び左側の切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すよう互換的に使用される。

【0066】

「工学操作された切断ハーフドメイン」とは、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の工学操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変されている切断ハーフドメインである。参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、同第８，６２３，６１８号、及び米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。

【0067】

「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状、環状、または分枝状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２～１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはこの間もしくはこの上の任意の整数値）、好ましくは約１００～１００，０００ヌクレオチド長（またはこの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００～２０，０００ヌクレオチド長（またはこの間の任意の値）、さらにより好ましくは約５～１５ｋｂ（またはこの間の任意の値）であり得る。

【0068】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、一次ＤＮＡ、ならびにヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここでヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４のうちの各々２つを含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物によって異なる長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。ヒストンＨ１の１分子は概してリンカーＤＮＡと会合している。本開示において、「クロマチン」という用語には、原核生物及び真核生物両方の、あらゆる種類の細胞核タンパク質が包含されるものとする。細胞クロマチンには、染色体クロマチンとエピソームクロマチンとの両方が含まれる。

【0069】

「染色体」とは、細胞ゲノムの全てまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはその核型によって特徴付けられることが多く、核型とは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集まりである。細胞のゲノムは１つ以上の染色体を含み得る。

【0070】

「エピソーム」とは、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例は、プラスミド及びある特定のウイルスゲノムを含む。

【0071】

「接近可能領域」とは、核酸内に存在する標的部位に、その標的部位を認識する外来性分子が結合し得る、細胞クロマチン内の部位である。いずれかの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、接近可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされないものと考えられている。接近可能領域の明確な構造は、多くの場合、化学プローブ及び酵素プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。

【0072】

「標的部位」または「標的配列」は、十分な結合条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。

【0073】

「外来性」分子とは、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入され得る分子である。「細胞内の通常の存在」は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関して決定される。よって、例えば、筋肉の胚発生中にしか存在しない分子は、成体の筋細胞に対しては外来性分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞に対しては外来性分子である。外来性分子は、例えば、機能不全の内在性分子の正常機能バージョン、または正常に機能する内在性分子の機能不全バージョンを含み得る。

【0074】

外来性分子はとりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって作製されるような小分子、または、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子のあらゆる改変された誘導体、もしくは上記分子のうちの１つ以上を含むあらゆる複合体などの高分子であり得る。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状、分枝状、または環状であってもよく、任意の長さであってよい。核酸は、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

外来性分子は、内在性分子と同種の分子、例えば、外来性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外来性核酸は、細胞に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含み得る。外来性分子を細胞に導入するための方法は当業者に公知であり、限定されるものではないが、脂質媒介性移入（すなわち、中性及びカチオン性の脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、及びウイルスベクター媒介性移入を含む。外来性分子はまた、内在性分子と同種であるが細胞が由来する種とは異なる種に由来する分子であってもよい。例えば、元々はマウスまたはハムスター由来の細胞株にヒト核酸配列を導入してもよい。

【0076】

対照的に、「内在性」分子とは、特定の環境条件下で特定の発生段階における特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内在性分子は、タンパク質、例えば転写因子及び酵素を含み得る。

【0077】

本明細書で使用する場合、「外来性核酸の産物」という用語には、ポリヌクレオチドと、ポリペプチド産物、例えば転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）及び翻訳産物（ポリペプチド）との両方が含まれる。

【0078】

「融合」分子とは、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結した分子である。サブユニット分子は、化学的に同じ種類の分子であっても、化学的に異なる種類の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの融合物）、及び融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物、及び副溝バインダーと核酸との融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質が細胞に送達された結果、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に送達された結果生じる場合があり、ここでポリヌクレオチドが転写され、この転写物が翻訳されて融合タンパク質が作製される。トランススプライシング、ポリペプチドの切断、及びポリペプチドのライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他所に提示する。

【0080】

本開示における「遺伝子」には、遺伝子産物（以下参照）をコードするＤＮＡ領域のほか、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれ、このような調節配列がコード配列、転写配列、及びコード配列と転写配列の組み合わせに隣接しているか否かを問わない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。

【0081】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報が遺伝子産物に変換されることを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。

【0082】

遺伝子発現の「調整」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化及び遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変化、不活性化、ランダム突然変異）を使用して、発現を調整することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記述されるＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した遺伝子発現の低減の全てを指す。よって、遺伝子の不活性化は部分的なものでも完全なものでもよい。

【0083】

「保護された」ｍＲＮＡとは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳を増大させるようにｍＲＮＡを何らかのかたちで変化させたものである。保護の例としては、シチジン残基及びウリジン残基の２５％を上限に、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）及び５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を用いて置き換えることが挙げられる。結果として生じるｍＲＮＡは、その対応する非改変型と比較して低い免疫原性及び高い安定性を呈する。（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１１，ｐａｇｅｓ １８３３－１８４４を参照されたい）。他の変化としては、いわゆるＡＲＣＡキャップの付加が挙げられ、これはインビトロで産生されたｍＲＮＡの翻訳可能性を増大させる（米国特許第７，０７４，５９６号を参照されたい）。

【0084】

「目的の領域」とは、細胞クロマチンのうち、外来性分子に結合することが望ましい任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内にあるか遺伝子に隣接した非コード配列である。結合は、標的ＤＮＡ切断、標的組換え、及び標的ＤＮＡ切断と標的組換えの組み合わせの目的のためのものであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にある場合がある。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さくてもよく、最大２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。

【0085】

「真核」細胞としては、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0086】

「作動可能な連結」及び「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、２つ以上の構成成分（例えば配列エレメント）の並置に関連して互換的に使用され、ここでこれらの構成成分は、両構成成分が正常に機能し、かつ構成成分のうちの少なくとも１つが、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得るという可能性を許容するように配置されている。実例として、プロモーターなどの転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結している。転写調節配列は、概して、コード配列とシスで作動可能に連結しているが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列と連続していないが、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。

【0087】

融合ポリペプチドに関する「作動可能に連結した」という用語は、構成成分の各々が、作動可能に連結していない場合に果たす機能と同じ機能を、他の構成成分との連結において果たすという事実を指す場合がある。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関しては、この融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位、その結合部位、及びその標的部位と結合部位の組み合わせに結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドの場合は、この融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位、その結合部位、及びその標的部位とその結合部位の組み合わせに結合することができる一方で、切断ドメインが標的部位の近傍にあるＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓのＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインは、作動可能な連結状態にある。

【0088】

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」とは、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と配列が同一でないものの、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、少ない、または同じ数の残基を有していてよく、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含んでいてよく、また、対応する天然の分子よりも多い、少ない、または同じ数の残基を含み、かつ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含んだ組み合わせであってもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。上記Ａｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝学的及び化学的の両方の補完によって決定することができる。

【0089】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。一般的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、任意の核酸構築物を意味する。よって、この用語には、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターが含まれる。

【0090】

「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにブタ、ウシ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物などの実験動物を指す。したがって、本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象には、例えば神経毒を含む１つ以上の化学的毒素に曝露されたものが含まれる。

【0091】

「幹細胞性」とは、任意の細胞が幹細胞のように機能する相対的な能力、すなわち、全能性、多能性、もしくは寡能性の程度、及び幅広い、または限定されない自己複製といった、特定の幹細胞どれもが有し得る能力を指す。

【0092】

ヌクレアーゼ
本明細書では、導入遺伝子を運搬するドナー分子のインビボ切断に有用な組成物、特にヌクレアーゼ、及び標的を定めたかたちで導入遺伝子がゲノムに組み込まれるような細胞ゲノムの切断のためのヌクレアーゼが記述される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つ以上は天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つ以上は天然に存在しない。すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン、切断ドメイン、及びＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインの組み合わせにおいて工学操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変化させてもよい（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように工学操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含む（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；異種切断ドメインと合わさったメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）。

【0093】

Ａ． ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態では、インビボ切断、細胞ゲノムの標的切断、及びインビボ切断と細胞ゲノムの標的切断の組み合わせのために使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。単一のジンクフィンガータンパク質は、複数のジンクフィンガードメイン（例えば、３つ、４つ、５つ、または６つ以上のジンクフィンガードメイン）から構成されている。各ジンクフィンガードメインは約３０アミノ酸長であり、ベータターン（２つの亜鉛配位残基を含む）及びアルファヘリックス（２つの不変の亜鉛配位残基を含む）を含み、これらは、標的配列に対するタンパク質への結合を可能にする特定のコンホメーションに保たれている。ベータターンに２つのシステイン（Ｃｙｓ）亜鉛配位残基を有し、アルファヘリックスに２つのヒスチジン（Ｈｉｓ）亜鉛配位残基を有する、正準型（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガードメインを使用してもよいし、非正準型（ＣＨ３）を使用してもよい。例えば、米国特許第９，２３４，１８７号を参照されたい。ベータターンの亜鉛配位残基とアルファヘリックスの亜鉛配位残基との間には、７アミノ酸の認識ヘリックスが含まれる。ジンクフィンガードメイン内の認識ヘリックス領域には－１から＋６の番号が付けられており、この認識領域の外にある（そして亜鉛配位残基を除いた）アミノ酸は、骨格残基と呼ばれる。

【0094】

好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、認識ヘリックスが最適な標的部位に結合するように工学操作されているという意味で、天然に存在しない。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0095】

工学操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較すると、新規の結合特異性を有し得る。工学操作方法としては、合理的デザイン及び種々の種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的デザインには、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連付けられているものを使用することが含まれる。例えば、参照により全体が本明細書に援用される、共有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

【0096】

さらに、ある特定の実施形態では、ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の構成成分ジンクフィンガードメインの骨格に対する１つ以上の改変をさらに含む。標的ＤＮＡ配列に対するＺＦＰの特異性は、ジンクフィンガードメインと特定のＤＮＡ塩基との間、特に、認識ヘリックス領域と標的部位との間の配列特異的な接触に依存する（一般的に、各認識ヘリックスは３ヌクレオチドの標的サブサイトに結合する）。加えて、ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡ骨格のリン酸との非特異的相互作用に関与するアミノ酸残基も含む。Ｅｌｒｏｄ－Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１１７１）は、ジンクフィンガータンパク質とその同族のＤＮＡ標的との共結晶を通して、ＤＮＡ骨格のリン酸と水素結合を形成することで相互作用することができる特定のアミノ酸が存在することを実証した。周知のＺｉｆ２６８骨格を用いるジンクフィンガータンパク質は、一般的には、そのβシートの第２の鎖のアミノ末端残基としてアルギニンを有し、これはまた、第２の不変システインのカルボキシル末端から第２位である。この位置は、αヘリックスの始点に先行する５番目の残基（そして－１から＋６の番号が付いた認識ヘリックスに対して－５位）であるため、各ジンクフィンガードメイン内で（－５）と呼ぶことができる。この位置のアルギニンは、その側鎖であるグアニジウム基と荷電水素結合を形成することにより、ＤＮＡ骨格上のリン酸と相互作用することができる。また、Ｚｉｆ２６８骨格のジンクフィンガータンパク質は、第１の不変システインのアミノ末端から４残基目の位置にリジンを有する頻度が高い。この位置は、亜鉛配位システイン残基間に２つの残基を有するジンクフィンガーのαヘリックスの始点に先行する１４番目の残基（そして－１から＋６の番号が付いた認識ヘリックス領域に対して－１４位）であるため、各フィンガー内で（－１４）と呼ぶことができる。リジンは、その側鎖であるアミノ基と水媒介性の荷電水素結合を形成することにより、ＤＮＡ骨格上のリン酸と相互作用することができる。リン酸基はＤＮＡ骨格全体に見られるため、ジンクフィンガーとＤＮＡ分子との間のこの種類の相互作用は、一般に配列特異的ではないとみなされる（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，２００２）。

【0097】

近年の研究では、一部のヌクレアーゼにおいて非特異的にリン酸に接触する側鎖が、これらのヌクレアーゼの非特異性のある程度の要因でもあり得ると仮定された（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－５、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈ：４２９－４３５）。研究者らは、これらのヌクレアーゼが「過剰なＤＮＡ結合エネルギー」を有し得ること、つまり、ヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的に対して、標的部位に実質的に結合してこれを切断するのに必要な親和性よりも高い親和性を有し得ることを提唱した。よって、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，ｉｂｉｄ）またはＣａｓ９のＤＮＡ結合ドメイン（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ｉｂｉｄ）内のカチオン電荷を減少させてこれらのヌクレアーゼのＤＮＡ結合エネルギーを低下させる試みが行われ、その結果インビトロの切断特異性が増大した。しかしながら、さらなる研究（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７６）：１１０－１１３）では、ＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒによるＣａｓ９ ＤＮＡ結合ドメインの研究において突然変異したカチオン性アミノ酸の一部に関して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインの適切なフォールディング及び活性化の役割も示唆されている。このように、Ｃａｓ９の活性におけるこれらのアミノ酸の正確な役割は分かっていない。

【0098】

したがって、本発明の方法及び組成物は、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるＺＦＰのＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸への突然変異を含むが、これらは、ＤＮＡ認識ヘリックス内の変化を含まない。よって、本発明は、ヌクレオチドの標的特異性に必要とされないＺＦＰ骨格内のカチオン性アミノ酸残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこうした突然変異は、カチオン性のアミノ酸残基から中性またはアニオン性のアミノ酸残基への突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこうした突然変異は、極性のアミノ酸残基から中性または非極性のアミノ酸残基への突然変異を含む。好ましい実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して（－５）位、（－９）位、（－１４）位で作られるもの、ならびに（－５）位、（－９）位、及び（－１４）位で作られた突然変異から選択される突然変異の組み合わせである。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）、（－１４）における１つ以上の突然変異、ならびに（－５）、（－９）、及び（－１４）における突然変異から選択される突然変異の組み合わせを含み得る。さらなる実施形態では、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質中の１つ以上のジンクフィンガー（複数可）は、（－５）、（－９）、（－１４）、ならびに（－５）、（－９）、及び（－１４）から選択される組み合わせにおける突然変異を含み得る。一部の実施形態では、（－５）、（－９）、（－１４）、ならびに（－５）、（－９）、及び（－１４）から選択される組み合わせにおけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及び／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異する。

【0099】

本明細書に記述されるこれらの融合ポリペプチドのいずれかにおいて、ＺＦＰパートナーは、（－５）位、（－９）位、（－１４）位における突然変異、ならびに（－５）、（－９）、及び（－１４）における突然変異から選択される突然変異の組み合わせをジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインにさらに含んでもよい。一部の実施形態では、－５位のＡｒｇ（Ｒ）が、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変化する。他の実施形態では、（－９）位のＡｒｇ（Ｒ）が、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｄ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられる。さらなる実施形態では、（－１４）位のＡｒｇ（Ｒ）が、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられる。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（－５）位、（－９）位、（－１４）位のアミノ酸、ならびに（－５）、（－９）、及び（－１４）における突然変異から選択される突然変異の組み合わせが、上に列記したアミノ酸のいずれかに任意の組み合わせで変化している、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインにおける突然変異を含み得る。

【0100】

例示的な選択方法は、ファージディスプレイ及びツーハイブリッド系を含め、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、及び同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の向上は、例えば、共有のＷＯ０２／０７７２２７に記述されている。

【0101】

標的部位の選択、融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）のデザイン及び構築のためのＺＦＰならびに方法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、及び同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳細に記述されている。

【0102】

ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー）の構成成分のうちの１つ以上の間、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン同士の間、ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ）との間、ならびに１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン同士の間、及びＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間には、ほぼ全てのリンカー（スペーサー）が使用され得る。好適なリンカー配列の非限定的な例は、米国特許第８，７７２，４５３号、同第７，８８８，１２１号、同第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号、ならびに米国特許公開第２００９／０３０５４１９号、同第２０１５／００６４７８９号、及び同第２０１５／０１３２２６９号を含む。よって、本明細書に記述されるタンパク質は、本明細書に記述される組成物の個々のＤＮＡ結合構成成分同士の間、ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間、または１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン同士の間、及びＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間の、好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

【0103】

Ｂ．切断ドメイン
本明細書に記述されるＤＮＡ結合ドメインに任意の好適な切断ドメインを作動可能に連結させてヌクレアーゼを形成することができる。切断ドメインは、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼの切断ドメインのように、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する酵素は他にも知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメイン及び切断ハーフドメインの源として使用してもよい。

【0104】

同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上記の任意のヌクレアーゼまたはその一部分に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要である。代替的には、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよいし、各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、２つの融合タンパク質がそれぞれの標的部位に結合することにより、切断ハーフドメインが互いに対して空間的に位置付けられ、この位置付けにより、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって機能的な切断ドメインを形成できるように、互いに対して配置される。よって、ある特定の実施形態では、これらの標的部位の近端は、５～８ヌクレオチドまたは１５～１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在していてもよい（例えば、２～５０ヌクレオチド対またはそれ以上）。概して、切断部位は標的部位間に存在する。

【0105】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に（認識部位において）結合し、結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖ではその認識部位から９ヌクレオチドの位置で、他方の鎖ではその認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。よって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、工学操作されていてもされていなくてもよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含む。

【0106】

配列選択的（人工）ヌクレアーゼによる最適な切断特異性のためには、オンターゲットの結合及び活性が飽和しないように条件を整えることが望ましい。飽和条件下では、定義によれば、完全なオンターゲット活性を達成するのに必要なものに対して過剰なヌクレアーゼが使用される。この過剰はオンターゲットの利益を提供しないが、それにもかかわらず、オフターゲット部位における切断の増大をもたらし得る。単量体ヌクレアーゼの場合、飽和条件は、単純な用量応答研究を行って滴定曲線上の飽和プラトーを特定し回避することにより、容易に回避することができる。しかしながら、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはｄＣａｓ－Ｆｏｋなどの二量体ヌクレアーゼの場合、個々の単量体の結合親和性が似ていなければ、飽和条件の特定及び回避はより複雑であり得る。そのような場合、単純な１：１のヌクレアーゼ比を使用した用量応答研究では、結合がより弱い単量体の飽和点しか明らかにならない。このような状況では、例えば単量体の親和性が１０倍異なる場合、１：１滴定研究で特定された飽和点において、高親和性の単量体は、必要な濃度よりも１０倍高い濃度で存在することになる。すると、結果として生じる過剰な高親和性の単量体は、意図される標的における切断を有益に増大させることなくオフターゲット活性の増大をもたらす場合があり、あらゆるヌクレアーゼ対の特異性の全体的な減少につながる可能性がある。

【0107】

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、本開示において、本開示の融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。よって、標的を定めた二本鎖切断、ジンクフィンガー・Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用した細胞配列の標的を定めた置き換え、及び、標的を定めた二本鎖切断と、ジンクフィンガー・Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用した細胞配列の標的を定めた置き換えとの組み合わせにおいて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインを各々含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある切断ドメインを再構築することができる。代替的には、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を使用してもよい。ジンクフィンガー・Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用して標的を切断したり、標的の配列を変化させたりするためのパラメータは、本開示の他所に提供する。

【0108】

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、タンパク質のうち、切断活性を保持する任意の部分、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的な切断ドメインを形成する能力を保持する任意の部分であり得る。

【0109】

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、全体が本明細書に援用される米国特許第７，８８８，１２１号に記述されている。さらなる制限酵素は、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインも含み、これらも本開示によって想定される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０を参照されたい。

【0110】

ある特定の実施形態では、切断ドメインには、例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、及び同第８，６２３，６１８号に記述されている、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する、１つ以上の工学操作された切断ハーフドメイン（別称、二量体化ドメイン突然変異体）が含まれる。これらの特許は全て、その開示内容の全体が参照により本明細書に援用される。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、及び５３８位におけるアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響する標的であり、この番号付けは、以下に示す、
野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン（配列番号１８）
ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ
の配列を有する、１ＦＯＫ．ｐｄｂ及び２ＦＯＫ．ｐｄｂの結晶構造に関するものである（Ｗａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：９７－１００を参照されたい）。

【0111】

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な工学操作された切断ハーフドメインとしては、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位及び５３８位におけるアミノ酸残基の突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６及び４９９の突然変異を含む対が挙げられる。

【0112】

よって、一実施形態では、４９０の突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、５３８の突然変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、４８６の突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、４９９位の突然変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的に述べると、本明細書に記述される工学操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）及び５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼称される工学操作された切断ハーフドメインを産生し、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）及び４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼称される工学操作された切断ハーフドメインを産生することによって調製した。本明細書に記述される工学操作された切断ハーフドメインは、ＺＦＮホモ二量体による異常な切断が最小限に抑えられているかまたは消失している、偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。この開示内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。ある特定の実施形態では、工学操作された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位、及び４９６位（番号付けは野生型ＦｏｋＩに対するものである）の突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異、４９９位の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える突然変異、及び４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異を含む（それぞれ、別称「ＥＬＤ」ドメイン及び「ＥＬＥ」ドメイン）。他の実施形態では、工学操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位、及び５３７位（番号付けは野生型ＦｏｋＩに対するものである）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、５３８位の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、及び５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異を含む（それぞれ、別称「ＫＫＫ」ドメイン及び「ＫＫＲ」ドメイン）。他の実施形態では、工学操作された切断ハーフドメインは、４９０位及び５３７位（番号付けは野生型ＦｏｋＩに対するものである）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（
Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、及び５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異を含む（それぞれ、別称「ＫＩＫ」ドメイン及び「ＫＩＲ」ドメイン）。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、及び同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、工学操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」、「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異、及び「Ｓｈａｒｋｅｙ」と「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異の組み合わせを含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６－１０７を参照されたい）。

【0113】

よって、ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、上述の二量体化ドメインにおける突然変異、触媒ドメインにおける突然変異、リン酸接触残基などの他のアミノ酸残基における突然変異、ならびに二量体化ドメインにおける突然変異、触媒ドメインにおける突然変異、及びリン酸接触残基などの他のアミノ酸残基における突然変異から選択される突然変異の任意の組み合わせを含む、配列番号１８に示されるアミノ酸残基のうちの１つ以上における突然変異を含み得る。突然変異は、置換（野生型アミノ酸残基から異なる残基への置換）、挿入（１つ以上のアミノ酸残基の挿入）、欠失（１つ以上のアミノ酸残基の欠失）、ならびに置換、挿入、及び欠失から選択される突然変異の任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２、５２１～５３１のうちの１つ以上（番号付けは配列番号１８に対するものである）、及びこのような残基の任意の組み合わせが突然変異する。これは、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：７７８－７８４）に記述されているＺＦＮがその標的部位に結合した分子モデルにおけるＤＮＡ骨格の近くにこれらの残基が位置しているためである。ある特定の実施形態では、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、及び５２５位における１つ以上の残基が突然変異する。ある特定の実施形態では、突然変異は、野生型残基の、異なる残基、例えばセリン（Ｓ）残基との置換を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記述されるヌクレアーゼのＦｏｋＩ切断ドメインは、ＥＬＤ二量体化ドメイン突然変異、ＫＫＲ二量体化ドメイン突然変異、Ｋ５２５Ｓ突然変異、ならびにＥＬＤ二量体化ドメイン突然変異またはＫＫＲ二量体化ドメイン突然変異及びＫ５２５Ｓ突然変異から選択される任意の組み合わせを含む。

【0114】

本明細書に記述される工学操作された切断ドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、及び同第８，６２３，６１８号に記述されている野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位指向性突然変異誘発によって調製することができる。さらに、本明細書に記述される切断ドメインは、米国特許第９，３９４，５３１号及び同第９，５６７，６０９号に記述されているリンカーを含むがこれに限定されない任意の好適なリンカーを使用して、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）に融合してよい。

【0115】

代替的には、いわゆる「開裂酵素（ｓｐｌｉｔ－ｅｎｚｙｍｅ）」技術（例えば、米国特許公開第２００９／００６８１６４号を参照されたい）を使用して、核酸標的部位においてヌクレアーゼをインビボでアセンブルしてもよい。このような開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物で発現してもよいし、または、例えば自己切断性の２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離された１つのオープンリーディングフレームにおいて連結してもよい。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであっても、メガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。

【0116】

ヌクレアーゼは、例えばＷＯ２００９／０４２１６３及び２００９００６８１６４に記述されている酵母ベースの染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングしてよい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーター、または誘導性プロモーター、例えば、ラフィノース、ガラクトース、及びラフィノースとガラクトースの組み合わせの存在下で活性化（抑制解除）し、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。

【0117】

本明細書に記述されるヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位において、１つ以上の二本鎖切断、１つ以上の一本鎖切断、及び１つ以上の二本鎖切断と１つ以上の一本鎖切断の組み合わせを行うことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒活性のない切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ、Ｃａｓタンパク質、及びＦｏｋＩとＣａｓタンパク質の組み合わせ）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号、同第８，７０３，４８９号、及びＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（６）：５７７－５８２を参照されたい。触媒活性のない切断ドメインは、触媒活性のあるドメインと組み合わせると、ニッカーゼとして作用して一本鎖切断を行う場合がある。したがって、特定の領域に二本鎖切断を行うために、２つのニッカーゼを組み合わせて使用してもよい。当技術分野では、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（２）：ｅ１１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｏｃｔ １９において、さらなるニッカーゼも公知である。

【0118】

標的部位
上に詳細に記述したように、最適な任意の配列に結合するようにＤＮＡドメインを工学操作することができる。工学操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較すると、新規の結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表１に示されるＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列におけるＤＮＡｓｅＩ高感受性部位（例えば、＋５８）内の配列に結合するＤＮＡ結合ドメインを含め、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内の配列、例えば、ＢＣＬ１１Ａのエクソン２とエクソン３との間にある標的部位（一般的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはさらに多くの塩基対）に結合する。工学操作方法としては、合理的デザイン及び種々の種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的デザインには、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連付けられているものを使用することが含まれる。例えば、参照により全体が本明細書に援用される、共有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的デザインを行うこともできる。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。

【0119】

ＤＮＡ結合ドメインに適用可能なＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、ファージディスプレイ及びツーハイブリッド系を含め、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、及び同第６，２４２，５６８号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、及び英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の向上は、例えば、共有のＷＯ０２／０７７２２７に記述されている。

【0120】

標的部位の選択、融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）のデザイン及び構築のためのヌクレアーゼならびに方法は当業者に公知であり、参照により全体が本明細書に援用される米国特許公開第２００５／００６４４７４号及び同第２００６／０１８８９８７号に詳細に記述されている。

【0121】

加えて、これら及び他の参考文献に開示されているように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）ならびにＤＮＡ結合ドメイン（複数可）及び機能的ドメイン（複数可）の融合物は、例えば５以上のアミノ酸のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して、ひとつに連結することができる。米国特許第８，７７２，４５３号、同第７，８８８，１２１号（例えば、「ＺＣ」リンカー）、同第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号、米国公開第２００９／０３０５４１９号及び同第２０１５／００６４７８９号。本明細書に記述されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン同士の間に、好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号も参照されたい。

【0122】

ドナー
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記述されるＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域結合分子を使用した、細胞のゲノムへの外来性配列のヌクレアーゼ媒介性標的組み込みに関する。上記のように、外来性配列（別名「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」）の挿入は、例えば、指定領域の欠失のため、突然変異体遺伝子の補正のため、指定領域の欠失及び突然変異体遺伝子の補正の組み合わせのため、または野生型遺伝子の発現増大のためである。ドナー配列は、それが配置されるゲノム配列と同一でないのが一般的であることは、容易に明らかになるであろう。ドナー配列は、目的の場所における効率的なＨＤＲが可能になるように２つの相同性領域が隣接した非相同配列を含む場合もあれば、ＮＨＥＪなどの相同組換えによらない修復機構によって組み込まれる場合もある。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性の非連続的な領域をいくつか含み、かつ、例えば本明細書に記述されるヌクレアーゼのうちの１つによって誘導されたＤＳＢの修復のための基質として使用したとき、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域（またはその断片）の欠失をもたらす場合がある。さらに、目的の領域に通常は存在しない配列の標的挿入では、この配列はドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同性の領域が隣接していてよい。

【0123】

挿入されるポリヌクレオチドは、「外来性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」と呼ばれる場合もある。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖型または環状型で細胞に導入することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１０／００４７８０５号及び同第２０１１／０２０７２２１号を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、好ましくは、ＤＮＡ ＭＣ内に含まれ、これは、環状型または直鎖型で細胞に導入してよい。直鎖型で導入する場合、当業者に公知の方法によってドナー配列の末端を（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護してよい。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、任意選択で、自己相補的なオリゴヌクレオチドを一方または両方の末端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基といった、末端アミノ基（複数可）の付加及び改変されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。二本鎖型で導入される場合、ドナーは、１つ以上のヌクレアーゼ標的部位、例えば、細胞のゲノムに組み込もうとする導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位を含み得る。例えば、米国特許公開第２０１３／０３２６６４５号を参照されたい。

【0124】

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として、細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として導入しても、リポソームもしくはポロクサマーなどの薬剤と複合した核酸として導入してもよいし、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達してもよい。

【0125】

ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーは、長さ１ｋｂ超、例えば２～２００ｋｂ、２～１０ｋｂ（またはこの間の任意の値）の配列（例えばコード配列、別称、導入遺伝子）を含む。二本鎖ドナーは、例えば、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含む。ある特定の実施形態では、ドナーは、例えば一対のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮに対する、少なくとも２つの標的部位を含む。一般的にヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のため、導入遺伝子配列の外、例えば、導入遺伝子配列に対して５’側及び／または３’側にある。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）に関するものであってよい。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含まれるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、内在性標的を切断するために使用されたものと同じヌクレアーゼ（複数可）に関するものであり、この標的に、切断されたドナーが相同性非依存性の方法によって組み込まれる。

【0126】

ドナーは、その発現が、組み込み部位における内在性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１など）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入されるのが一般的である。しかしながら、ドナーが、プロモーター、エンハンサー、及びプロモーターとエンハンサー両方の組み合わせ、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることは明らかであろう。

【0127】

ドナー分子は、内在性遺伝子の全てもしくは一部が発現するか、または一切発現しないように、内在性遺伝子に挿入してよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、グロビンコード配列ありまたはなし）は、任意の内在性遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許公開第２００８／０２９９５８０号、同第２００８／０１５９９９６号、及び同第２０１０／００２１８２６４号を参照されたい。

【0128】

さらに、発現に必要ではないが、外来性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、ポリアデニル化シグナル、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。

【0129】

本明細書に記述されるドナー配列が有する導入遺伝子は、ＰＣＲなどの当技術分野で公知の標準的技術を使用して、プラスミド、細胞、または他の源から単離することができる。使用されるドナーは、環状超コイル状、緩んだ環状、直鎖状などを含む、様々な種類のトポロジーを含み得る。代替的には、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を使用してドナーを化学合成してもよい。加えて、ドナーは、メチル化されていても、メチル化を欠いていてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であり得る。

【0130】

本明細書に記述される二本鎖ドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然塩基、１つ以上の骨格、及び１つ以上の非天然塩基と１つ以上の骨格の組み合わせを含み得る。特に、本明細書に記述される方法を使用して、メチル化シトシンを有するドナー分子の挿入を行うと、目的の領域において転写静止状態を達成することができる。

【0131】

外来性（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的の配列（外来性配列）を含み得る。例示的な外来性配列としては、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、及び種々の種類の発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、カナマイシン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性、ブラストサイジン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光性もしくは発光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに向上した細胞増殖を媒介するタンパク質、向上した遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、及び向上した細胞増殖と遺伝子増幅の組み合わせを媒介するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）、ＨＡ、ビオチン化可能ペプチド、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。

【0132】

好ましい一実施形態では、外来性配列（導入遺伝子）には、限定されるものではないが、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、及び上記のいずれかの機能的断片を含む、細胞における発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡであり得る。

【0133】

例えば、外来性配列は、遺伝性疾患を有する対象において欠損しているかまたは非機能性であるポリペプチドをコードする配列を含み得る。遺伝性疾患は、次の遺伝性疾患：軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、Ａｉｃａｒｄｉ症候群、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルファサラセミア、アンドロゲン非感受性症候群、Ａｐｅｒｔ症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、Ｂａｒｔｈ症候群、ベータサラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、Ｇａｕｃｈｅｒ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータグロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、低ホスファターゼ症、Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ症候群、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｌａｎｇｅｒ－Ｇｉｅｄｉｏｎ症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、Ｍａｒｆａｎ症候群、Ｍｏｅｂｉｕｓ症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、Ｎｅｉｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病、骨形成不全症、ポルフィリン症、Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ症候群、早老症、Ｐｒｏｔｅｕｓ症候群、網膜芽細胞腫、Ｒｅｔｔ症候群、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ－Ｔａｙｂｉ症候群、Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｓｈｗａｃｈｍａｎ症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、Ｓｍｉｔｈ－Ｍａｇｅｎｉｓ症候群、スティックラー症候群、Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、Ｔｒｅａｃｈｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ症候群、トリソミー、結節性硬化症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、尿素サイクル異常症、ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌａｎｄａｕ病、Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ症候群、Ｗｉｌｌｉａｍｓ症候群、Ｗｉｌｓｏｎ病、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）を含むが、このいずれにも限定されない。

【0134】

標的組み込みにより処置され得るさらなる例示的な疾患としては、後天性免疫不全、リソソーム蓄積症（例えば、Ｇａｕｃｈｅｒ病、ＧＭ１、Ｆａｂｒｙ病及びＴａｙ－Ｓａｃｈｓ病）、ムコ多糖症（例えばＨｕｎｔｅｒ病、Ｈｕｒｌｅｒ病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、αサラセミア、βサラセミア）、及び血友病が挙げられる。

【0135】

ある特定の実施形態では、外来性配列は、標的組み込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）、及びさらなる機能性をコードする連結された配列を含み得る。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）などが挙げられる。

【0136】

挿入され得るさらなる遺伝子配列は、例えば、突然変異した配列に置き換わる野生型遺伝子を含み得る。例えば、野生型の第ＩＸ因子遺伝子配列を、遺伝子の内在性コピーが突然変異している幹細胞のゲノムに挿入してよい。野生型コピーは、内在性遺伝子座に挿入してもよいし、または代替的にはセーフハーバー遺伝子座を標的としてもよい。

【0137】

このような発現カセットの構築は、本明細書の教示に従えば、分子生物学の技術分野で周知の方法論を用いる（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。発現カセットを使用してトランスジェニック動物を作製する前に、発現カセットを好適な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株）に導入することにより、選択された制御エレメントに関連するストレス誘導因子に対する発現カセットの応答性を試験することができる。

【0138】

さらに、発現に必要ではないが、外来性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、ポリアデニル化シグナル、及び２Ａポリペプチドとポリアデニル化シグナルの組み合わせを含んでもよい。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントをレポーター遺伝子に作動的に連結して、キメラ遺伝子を作り出すことができる（例えば、レポーター発現カセット）。

【0139】

非コード核酸配列の標的挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列を標的挿入に使用することもできる。

【0140】

さらなる実施形態において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼデザインのための特異的な標的部位である非コード配列を含み得る。その後、原型のドナー分子が別の目的のドナー分子の挿入によって切断及び改変されるように、さらなるヌクレアーゼが細胞で発現してもよい。このようにして、特定の目的の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座における形質スタッキングを可能にする、ドナー分子の反復組み込みが発生し得る。

【0141】

送達
本明細書（表１）に記述されるヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記述されるタンパク質、ポリヌクレオチド、及びタンパク質とポリヌクレオチドの組み合わせを含む組成物は、任意の好適な手段によって任意の細胞型にインビボまたはエクスビボで送達され得る。

【0142】

好適な細胞としては、真核（例えば、動物）細胞及び原核細胞、ならびに真核細胞株及び原核細胞株が挙げられる。このような細胞から作製される、このような細胞または細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞としては、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞などの幹細胞も挙げられる。

【0143】

本明細書に記述されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、及び同第７，１６３，８２４号に記述されている。これらの特許は全て、その開示内容の全体が参照により本明細書に援用される。

【0144】

本明細書に記述されるヌクレアーゼ、ドナー構築物、及びヌクレアーゼとドナー構築物の組み合わせは、本明細書に記述されるＺＦＮ（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを使用して送達してもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系を使用してよい。参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、及び同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのうちもいずれも、処置に必要な配列のうちの１つ以上を含み得ることは明らかであろう。よって、１つ以上のヌクレアーゼ及びドナー構築物を細胞に導入するとき、ヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、及びヌクレアーゼとドナーポリヌクレオチドの組み合わせは、同じベクターに搭載しても、異なるベクター（ＤＮＡ ＭＣ（複数可））に搭載してもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼ、１つ以上のドナー構築物、及び１つ以上のヌクレアーゼと１つ以上のドナー構築物の組み合わせをコードする配列を含み得る。ヌクレアーゼ、ドナー構築物、及びヌクレアーゼとドナー構築物の組み合わせをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織に導入するには、従来のウイルスベースの遺伝子移入方法を使用しても、非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用してもよい。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ ＭＣ、ネイキッド核酸、及びリポソームまたはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合した核酸を含む。好適な非ウイルスベクターとしては、ＩｎＣｅｌｌＡｒｔ（Ｆｒａｎｃｅ）から市販されているベクターを含む、ナノタクシー（ｎａｎｏｔａｘｉｓ）ベクターが挙げられる。ウイルスベクター送達系は、細胞に送達された後のエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを含む。工学操作されたＤＮＡ結合タンパク質及びこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のインビボ送達の概説については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ １３（７）：８２９－８３９、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１２）：１４４４－１４５４、ならびに一般的な遺伝子送達に関する参考文献、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照されたい。

【0145】

核酸の非ウイルス送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、膜変形、及びＤＮＡ取り込みの薬剤による向上が挙げられる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも核酸の送達に使用することができる。

【0146】

さらなる例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されているものを含む（例えばＵＳ６００８３３６を参照されたい）。リポフェクションは例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記述されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。

【0147】

免疫脂質複合体などの標的を定めたリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。他の脂質：核酸複合体としては、新規のカチオン性脂質を含むもの、新規のＰＥＧ化脂質を含むもの、及び新規のカチオン性脂質と新規のＰＥＧ化脂質の組み合わせを含むものが挙げられる（例えば、米国仮特許出願第６２／４３２，０４２号及び同第６２／４５８，３７３号を参照されたい）。

【0148】

さらなる送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。この抗体はＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照されたい）。

【0149】

工学操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸の、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの送達系の使用は、体内の特定の細胞にウイルスの標的を定め、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよいし（インビボ）、またはインビトロで細胞を処置するために使用され、この改変された細胞が患者に投与されてもよい（エクスビボ）。ＺＦＰの従来のウイルスベースの送達系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、及び単純ヘルペスウイルスの各ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子移入方法を用いると宿主ゲノムへの組み込みが可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされる。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において高い形質導入効率が観察されている。

【0150】

レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、一般的に高いウイルス力価をもたらすレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含む。ベクターの複製及びパッケージングには最小限のシス作用性ＬＴＲで十分であり、その後これらのベクターを使用して治療遺伝子を標的細胞に組み込むことにより、持続的な導入遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びこれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

【0151】

一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において標的核酸を細胞に形質導入するため、また、インビボ及びエクスビボの遺伝子療法手技のためにも使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含め、いくつかの公開文献に記述されている。

【0152】

臨床治験における遺伝子移入では、少なくとも６つのウイルスベクター手法が現在利用可能であり、これらは、形質導入剤を作製するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって欠陥ベクターを補完することを含む手法を利用する。

【0153】

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床治験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３－１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験で最初に使用された治療用ベクターである（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０（１９９５））。ＭＦＧ－Ｓでパッケージングされたベクターでは５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０－２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２（１９９７）。

【0154】

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥があり非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく、期待される代替的な遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子移入及び安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ．１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびに任意の新規のＡＡＶ血清型を本発明に従って使用することもできる。

【0155】

複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生され、いくつかの異なる細胞型に容易に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、またはＥ３遺伝子に置き換わるように工学操作され、その後この複製欠損性ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞内で増殖させる。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉に見られるものといった非分裂性の分化細胞を含め、複数の組織型にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３－１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９（１９９８）を含む。

【0156】

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染可能なウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、ＡＡＶ及びアデノウイルスをパッケージングするために使用され得るＨＥＫ２９３細胞及びＳｆ９細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作製される。これらのベクターは一般的に、パッケージング及びその後の宿主への組み込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現しようとするタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、一般的に、宿主ゲノムへのパッケージング及び組み込みに必要とされるＡＡＶゲノムの逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされ、この細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含む。この細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染している。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているため、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの感受性のほうが高い、熱処置によって低減することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶは、バキュロウイルス発現系を使用して産生される（例えば、米国特許第６，７２３，５５１号及び同第７，２７１，００２号を参照されたい）。

【0157】

２９３系またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、一般的に、ウイルスを産生する細胞を増殖した後、細胞上清からウイルス粒子を収集するか、または細胞を溶解して粗溶解物からウイルスを収集することを含む。その後、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号及び同第６，９８９，２６４号を参照されたい）、イオン交換クロマトグラフィ及びＣｓＣｌ密度遠心分離（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０号）、免疫親和性クロマトグラフィ（例えばＷＯ２０１６１２８４０８）、またはＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した精製を含む、当技術分野で公知の方法によってＡＡＶを精製する。

【0158】

多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターが特定の組織型に対して高い特異度で送達されることが望ましい。したがってウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが知られる受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７－９７５１（１９９５）では、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、そしてこの組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告された。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞対に拡大適用することができる。例えば、繊維状ファージを工学操作して、事実上全ての選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示させることができる。上の記述は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用してもよい。このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを優先する特異的取り込み配列を含むように工学操作することができる。

【0159】

遺伝子療法ベクターは、後述のように、一般的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）または局所適用により、個々の患者に投与することによって、インビボ送達することができる。代替的には、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞にベクターをエクスビボで送達し、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者に細胞を再移植してもよい。

【0160】

ヌクレアーゼ、ドナー構築物、及びヌクレアーゼとドナー構築物の組み合わせを含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替的には、ネイキッドＤＮＡを投与してもよい。投与は、注射、注入、局所適用、及び電気穿孔を含むがこれらに限定されない、分子を導入して最終的には血液または組織細胞に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する好適な方法は当業者にとって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するためには２つ以上の経路を使用してよいが、特定の１つの経路が別の経路よりも即時的かつ効果的な反応をもたらし得ることが多い。

【0161】

本明細書に記述されるポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードするもの、二本鎖ドナー、及びヌクレアーゼをコードするものと二本鎖ドナーの組み合わせ）の導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３－９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７－２２２、米国特許公開第２００９／０１１７６１７号を参照されたい。

【0162】

薬学的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、また、組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、後述のように、利用可能な医薬組成物の好適な製剤は幅広く存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。

【0163】

ヌクレアーゼコード配列及びドナー構築物が同じ系を使用して送達されても異なる系を使用して送達されてもよいことは明らかであろう。例えば、ヌクレアーゼ及びドナーは、同じＤＮＡ ＭＣによって運搬されてよい。代替的には、ドナーポリヌクレオチドがＭＣによって運搬されてよい一方で、１つ以上のヌクレアーゼは標準的なプラスミドまたはＡＡＶベクターによって運搬されてよい。さらに、異なるベクターを同じ経路によって投与しても、異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与、または筋肉内注射）によって投与してもよい。ベクターは、同時に送達しても、任意の順番で送達してもよい。

【0164】

よって、本開示は、疾患のインビボまたはエクスビボ処置、及び治療用タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に適した条件を含む。組成物は、血清または標的の臓器もしくは細胞における治療用ポリペプチドの所望の濃度を得るのに効果的な量でヒト患者に投与される。投与は、ポリヌクレオチドを所望の標的細胞に送達する任意の手段によるものであり得る。例えば、インビボ及びエクスビボ両方の方法が想定される。門脈への静脈内注射は好ましい投与方法である。他のインビボの投与モードとしては、例えば、肝葉または胆管葉への直接注射及び肝臓遠位への静脈内注射が挙げられ、これには、肝動脈を通したもの、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射、及び胆樹を通した逆行性注射が含まれる。エクスビボの投与モードは、切除した肝実質細胞または肝臓の他の細胞の形質導入をインビトロで行ってから、形質導入後の切除した肝実質細胞をヒト患者の門脈の脈管構造、肝実質、または胆樹に注入し戻すことを含む。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３５－３４１を参照されたい。

【0165】

投与されるヌクレアーゼ（複数可）及びドナーの有効量は、患者毎に、また目的の治療用ポリペプチドによって異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって決定されるのが最もよく、適切な投与量は、当業者によって容易に決定され得る。組み込み及び発現に十分な時間（一般的には例えば４～１５日間）をおいた後、治療用ポリペプチドの血清または他の組織中レベルを解析し、投与前の初期レベルと比較することにより、投与される量が低すぎるか、適正範囲内であるか、または高すぎるかが判定される。初回投与及び後続投与の好適なレジメンも様々であるが、初回投与後に必要に応じて後続投与を行うのが典型的である。後続投与は、毎日から毎年や数年毎へと多岐にわたる様々な間隔で投与され得る。当業者であれば、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために適切な免疫抑制技術が推奨され得ることを察知するであろう。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：１３９１－１４０１を参照されたい。

【0166】

エクスビボ及びインビボの両方で投与される製剤は、液状懸濁液または乳化液を含む。活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され活性成分と適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組み合わせが挙げられる。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を向上させる他の試薬など、微量の補助物質を含み得る。

【0167】

細胞
本明細書には、本明細書（表１）に記述されるヌクレアーゼによって内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列が改変された細胞及び細胞株も記述される。この改変は例えば、細胞の野生型配列と比較したものであり得る。これらの細胞または細胞株は、改変に対してヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。ＢＣＬ１１Ａ配列への改変は、インデルを含み得る。

【0168】

改変は、好ましくは、ヌクレアーゼ（複数可）の結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、及び結合部位（複数可）と切断部位（複数可）の組み合わせにおけるものか、またはその付近、例えば、切断部位（複数可）から１～３００個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対、より好ましくは、結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、または結合部位（複数可）及び切断部位（複数可）の片側から１～１００個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対、さらにより好ましくは、結合部位（複数可）、切断部位（複数可）、または結合部位（複数可）及び切断部位（複数可）の片側から１～５０個以内（またはこの間の任意の値）の塩基対だけ、上流もしくは下流にある。ある特定の実施形態では、改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの「＋５８」領域またはその付近、例えば、表１の第１の縦列のいずれかに示されるヌクレアーゼ結合部位またはその付近にある。

【0169】

任意の細胞または細胞株、例えば幹細胞、例えば胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞が改変され得る。本明細書に記述される細胞の他の非限定的な例としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）、樹状細胞、Ｂ細胞が挙げられる。部分的または完全に分化した細胞を含む、幹細胞の子孫（例えば、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆体細胞）も提供される。改変されたＢＣＬ１１Ａ配列を含む他の細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。

【0170】

本明細書に記述される細胞は、例えばエクスビボ療法により、障害を処置または防止するのに有用である。ヌクレアーゼ改変細胞は、標準的な技術を使用して拡大し、患者に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３７０（１０）：９０１を参照されたい。幹細胞の場合、対象に注入した後、これらの前駆体の、機能的な導入遺伝子を発現する細胞へのインビボでの分化も起こる。本明細書に記述される細胞を含む医薬組成物も提供される。加えて、これらの細胞は、患者への投与前に凍結保存してもよい。

【0171】

本明細書に開示される改変細胞または細胞株のいずれも、ガンマグロビンの発現増大を示し得る。本明細書に記述される遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物も提供される。

【0172】

用途
本明細書に開示される方法及び組成物は、タンパク質の発現を改変するためのもの、または鎌状赤血球症もしくはサラセミアなどの遺伝性疾患において発現するタンパク質をコードする異常な遺伝子配列を補正するためのものである。よって、本方法及び組成物は、このような遺伝性疾患を処置または防止する。例えば幹細胞のゲノム編集を使用すると、異常な遺伝子を補正したり、野生型遺伝子を挿入したり、または内在性遺伝子の発現を変化させたりすることができる。非限定的な例として、例えば少なくとも１つのグロビン（例えば、αグロビン、γグロビン、βグロビン、及びこれらの組み合わせ）をコードする野生型遺伝子を細胞に挿入して（例えば、本明細書に記述される１つ以上のヌクレアーゼを使用して内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列に挿入して）、細胞内で欠損または欠如しているグロビンタンパク質を提供することにより、遺伝性疾患、例えば、不完全なグロビン発現により引き起こされる異常ヘモグロビン症を処置することができる。代替的に、または加えて、適切なドナーの投与ありまたはなしのゲノム編集は、不完全な内在性遺伝子の補正、例えば、αヘモグロビンまたはβヘモグロビンの点突然変異の補正により、遺伝子の発現を回復させたり、遺伝性疾患、例えば鎌状赤血球症を処置したり、任意の直接的もしくは間接的なグロビン調節遺伝子のノックアウトまたは変化（過剰発現または抑制）（例えば、γグロビン調節遺伝子ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ調節因子ＫＬＦ１の不活性化）を行ったりすることができる。具体的に述べると、本発明の方法及び組成物は、異常ヘモグロビン症の処置または防止に役立つ。

【0173】

本発明のヌクレアーゼは、赤血球生成中のＢＣＬ１１Ａの発現、ひいてはガンマグロビン発現の下方調節に必要であることが知られる、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域を標的とする。このエンハンサー領域の改変は、ガンマグロビン発現が増大した赤血球をもたらし得、よって鎌状赤血球症またはベータサラセミアの処置または防止に役立ち得る。

【0174】

以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは例示のみを目的とするものであり、他のヌクレアーゼ、例えば、ＴｔＡｇｏ系及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、工学操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインの天然に存在するものまたは工学操作されたものの融合物（工学操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）の組み合わせ、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインの天然に存在するものまたは工学操作されたものの融合物を含む）、ならびに異種切断ドメイン、メガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質の融合物（異種切断ドメインの組み合わせ、及びメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質の融合物を含む）を使用してよいことは察知されよう。

【実施例】

【0175】

実施例１：ジンクフィンガーヌクレアーゼのアセンブリ
ＺＦＮをヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に対してアセンブルし、後述のトランスフェクト細胞から単離したＤＮＡのディープシーケンシング解析によって活性を試験した。記述したように、エンハンサー領域の＋５８領域に対して特異的なＺＦＮを作った。ＺＦＮ対の５１８５７／５１９４９については以前に記述されている（ＷＯ２０１６／１８３２９８を参照されたい）。

【0176】

実施例２：オフターゲット解析
ＺＦＮ対によるオフターゲット切断を解析するため、２段階の無作為な特異性解析を行った。第１段階（図１）では、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（（２０１５），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３（２）：１８７－１９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１１７）により記述されたものと同様の手順を使用したオリゴヌクレオチド二重鎖組み込み部位アッセイにより、各ＺＦＮについて候補オフターゲット部位を特定した。

【0177】

オリゴヌクレオチド二重鎖組み込み部位アッセイは、ヌクレアーゼと二重鎖ＤＮＡの短いセグメントとを標的細胞に共導入すると、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路によるゲノム切断事象の画分の修復中に二重鎖の組み込みが起こる（Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３８（１５）ｅ１５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ５１２、Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ａｕｇ ７；２９（９）：８１６－２３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１９４８、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ）という観察に基づいている。組み込まれると、二重鎖は、切断事象の恒久的なタグとなる。その後、せん断されたゲノムＤＮＡにオリゴヌクレオチドアダプターをライゲーションしてから、２５サイクルのネステッドＰＣＲを２ラウンド行い、結果として生じるドナーとゲノムの接合部のディープシーケンシングを行うことにより、組み込み部位を特定する。このアッセイにより、ゲノム内の全ての潜在的な組み込み部位の評価が可能になる。

【0178】

組み込み部位アッセイは、ドナーの送達、ＺＦＮの発現、及びドナーの組み込みを最大にするため、Ｋ５６２細胞において行った。さらに、Ｋ５６２細胞は急速に分裂するため（倍加時間およそ２４時間）、細胞標的を切断するＺＦＮの能力にＫ５６２細胞が課すエピジェネティックな制限は最小限であると予想される。Ａｍａｘａシャトル及びＺＦＮの最大のオンターゲット活性のために最適化された設定を使用して、０．４７μｇのオリゴヌクレオチド二重鎖ドナー及び４００ｎｇの各ＺＦＮコードｍＲＮＡを電気穿孔により細胞（２×１０^５）に導入した。オリゴ及びｍＲＮＡの各組み合わせにつき４つの複製試料を調製した。トランスフェクション後７日目に、各試料でゲノムＤＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ）、４００ｎｇ（１３３０００個のハプロイドゲノム）を図１に概説した増幅プロトコールのインプットとして使用した。その後、試料を本質的に記述されているとおりに（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．ｉｂｉｄ）処理した。最終産物をプールし、数量化し、ペアエンドの１５０ｂｐリード及び８ｂｐ／１６ｂｐデュアルインデックスリードを用い、ＭｉＳｅｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のｖ２ ３００サイクルシーケンシングキットを使用したシーケンシングを行って、アンプリコンの各末端の試料バーコードを検出した。

【0179】

候補オフターゲット部位のリストを作製するため、シーケンシングデータを正しいプライミング配列についてフィルタリングし、続いてアダプター配列のトリミング及びゲノムへのマッピングを行った。次に、接合部の座標をマッピングし、二重鎖－ゲノム接合部、ならびにＤＮＡせん断により生じた切断の位置を使用して、明確な組み込み事象を特定した。その後、組み込み事象を処理して、ゲノムに近接した組み込みのクラスターを特定した（互いから１００ｂｐ以内に最低４つの明確な組み込み事象。全複製物で合計した）。ｈｇ３８アセンブリにおいてマッピング不可能であったコンティグ（すなわち、ｈｇ３８のｃｈｒＵｎ）に存在するクラスターは、さらなる解析から除外した。反復した遺伝子座にマッピングするクラスター（クラスター内の全ての配列でゲノムに対する３つ以上のヒットの中央値）は増幅アーティファクトであることが過去の経験から示されているため、これらも除外した。残りのクラスターは、それらが（合計４つのうち）少なくとも２つの複製ＺＦＮ処置試料に由来し、かつ対照に対してＺＦＮ処置試料中で≧５倍過剰の組み込み事象を呈した場合、候補ＺＦＮ切断部位としてスコアリングした。ＺＦＮ処置試料中の独特の組み込みの総数によって候補切断部位をランク付けした。ＺＦＮ対の５１８５７／５１９４９について、この解析によって特定された候補遺伝子座を図２に提供する。これは組み込み体の計数によってランク付けしてある。

【0180】

実施例３：ＺＦＮの最適化
オフターゲット切断を減少させるため、非特異的なリン酸の接触を選択的に除去してオフターゲット切断の大域的な抑制をもたらすヌクレアーゼ最適化のための方策（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１（４）：４２９－３５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８４５、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ）３５１（６２６８）：８４－８．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７）を採用した（米国仮出願第６２／４４３，９８１号及び同第６２／３７８，９７８号を参照されたい）。ＤＮＡのリン酸骨格と相互作用するジンクフィンガーフレームワーク内の主要な位置（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ ａｎｄ Ｐａｂｏ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５００７）：８０９－１７、Ｅｌｒｏｄ－Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４（１０）：１１７１－８０）（図３Ａ～３Ｂ）、ならびに同じくリン酸と接触することが予測される右側ＺＦＮのＦｏｋＩドメイン内の単一の位置（図３Ｃ）においてアミノ酸置換を行った。

【0181】

特異性は、２つの分離したｍＲＮＡから各ＺＦＮを独立して発現させることによってさらに改善した。これにより、送達比の最適化が可能になる。これらの取り組みにより、原型のＺＦＮ対との関連性が高く、ＤＮＡリン酸骨格との相互作用のエネルギーを減少させるが配列特異的な塩基の認識への影響は最小限または皆無である置換によって異なる、最適化されたＺＦＮ対が得られた。これと一貫して、原型の５１８５７／５１９４９対については、組み込み部位アッセイにより、ＺＦＮ切断の潜在的な標的となる４５５個の遺伝子座が得られた。最適化された対に関しては、この解析によるさらなる検査対象となるＺＦＮ切断の潜在的な標的として大幅に少ない数の遺伝子座が特定された（合計７２個）。両方の対において、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー内の意図される標的がトップランクの遺伝子座であった。さらに、最適化された対のＢＣＬ１１Ａエンハンサーにおいて大幅に高い割合の組み込み事象が認められ、その高い特異性と一貫性があった。

【0182】

重要な点として、配列データ処理のパイプラインを定義するにあたり、候補オフターゲット遺伝子座をフィルタリングして除外するのではなく、それらを可能な限り多く含めるよう、主要なパラメータを慎重すぎるほど保守的に選択したことを注記する。これを行ったのは、偽陽性となるほど大幅に大きな数を許容することと引き換えにしても、最適化されたＺＦＮの本物の切断部位を表し得るあらゆる遺伝子座が特定され、インデルの追跡研究において試験されることを確実にするためである。解析の第１段階では、各ＺＦＮ対で大きな候補遺伝子座のセットが得られ、このうち大部分が（特に最適化されたＺＦＮに関しては）真のオフターゲット切断部位を表さず、むしろインデルの追跡研究において切断に対して陰性であることを証明するバックグラウンド事象を表すことが予想された。

【0183】

解析の第２段階では、組み込み部位アッセイによって特定された候補オフターゲット遺伝子座を、ＺＦＮで処置したＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける改変の証拠（例えば、インデルの存在）についてスクリーニングした。

【0184】

特に、ＲＮＡトランスフェクションのための臨床スケール及び臨床条件（原型のＺＦＮ対では１２０μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ、及び最適化された対では１００μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）を使用して、動員された末梢血に由来するヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを原型のＺＦＮ対及び最適化されたＺＦＮ対で処置した。ゲノムＤＮＡをトランスフェクション２日後に単離した後、候補オフターゲット遺伝子座のＰＣＲ増幅及びディープシーケンシングを行って、インデルのレベルを数量化した。このステップで、原型のＺＦＮ対及び最適化されたＺＦＮ対の両方に関し、同じ１３７個の候補オフターゲット遺伝子座のセットを、原型のＺＦＮを用いた先行研究において他の方法によって特定されたより少ない数の候補オフターゲット部位と併せてスクリーニングした。

【0185】

結果は、最適化されたＺＦＮが原型の対よりも著しく特異的であることを示した。これは、ＺＦＮ切断の証拠に関するスコアが正であった遺伝子座の数（最適化された対で３に対して原型の対で５２）からはもちろん、最適化された対では大幅に低かった観察されたインデルのレベルからも明らかである。図４は、この研究でＺＦＮ切断の証拠を呈した全ての遺伝子座におけるインデル値のプロットを示す（ｙ軸の対数スケールに留意されたい）。このような遺伝子座の全てにおけるオフターゲットインデルの凝集は、オフターゲット活性の３００分の１への低減を示す（原型の対の凝集したオフターゲットインデルが４６．５％であるのに対して、最適化された対のオフターゲットインデルは０．１５％）。このオフターゲット活性の低減は、意図される標的部位における活性の損失なしに達成された（最適化されたＺＦＮの８１．９％に対して原型の対のインデルは７２．５％）。これらの研究において、原型の対（または親の対）は５１８５７／５１９４９であり、最適化されたＺＦＮ対は６３０１４／６５７２２であった（以下参照）。

【0186】

ヌクレアーゼのデザインを以下の表１に示す。

【表1】

【0187】

表１は、各ＺＦＮに関する特性評価情報を示す。左から始めて、ＳＢＳ番号（例えば５１８５７）が表示されており、ＳＢＳ番号の下にはＺＦＮが結合するＤＮＡ標的が表示さ
れている。次に、フィンガー１～６または１～５のアミノ酸認識ヘリックスデザインが示されている（表１の細分された縦列２）。また、表１の適切なヘリックスデザインの下には、米国仮特許出願第６２／３７８，９７８号及び同第６２／４４３，９８１号に記述されているような、示されたフィンガーのＺＦＰ骨格配列に対して作られた突然変異が示されている。表１で使用される表記において、「Ｑｍ５」は、示されたフィンガーの－５位（－１から＋６の番号が付いたヘリックスに対する）において、この位置のアルギニンがグルタミン（Ｑ）で置き換えられていることを意味し、「Ｑｍ１４」は、－１４位に通常存在するアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）で置き換えられていることを意味する。「なし」は、認識ヘリックス領域外に変化がないことを示す。よって、例えば、ＳＢＳ番号６３０１４はフィンガー１、３、及び５にＱｍ５突然変異を含むが、フィンガー２、４、及び６はジンクフィンガー骨格（例えば、認識ヘリックス領域外のジンクフィンガー配列）への突然変異を有しない。

【0188】

最後に、表１の最右列は、ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩ切断ドメインに連結するために使用されたリンカーを示し（例えば、この縦列の一番上のラインには、例えば米国特許第９，５６７，６０９号に記述されている「Ｌ７ｃ５」（ＬＲＧＳＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号５）が表示されている）、リンカーの呼称の下の四角内には、ＦｏｋＩリン酸接触突然変異及び二量体化突然変異の部位が示されている。詳細に述べると、Ｆｏｋ突然変異体の四角の一番上のラインには、二量体化ドメインに見られる突然変異の種類（例えばＥＬＤまたはＫＫＲ。これらは例えば米国特許第８，９６２，２８１号に記述されている）が示されている。二量体化突然変異体の呼称の下には、非特異的なリン酸接触を除去するために作られたＦｏｋＩドメイン内に存在する突然変異がある場合は、それが下に示されている（例えば、米国仮特許出願第６２／３７８，９７８号及び同第６２／４４３，９８１号に記述されているように、アミノ酸５２５位または４１６位のセリン残基が、それぞれ、リジンまたはアルギニンのいずれかに置換されている、Ｋ５２５ＳまたはＲ４１６Ｓ）。よって、例えば、ＳＢＳ番号６３０１４において、リンカーはＬ７ｃ５リンカーであり、ＦｏｋＩ切断ドメインはＥＬＤ二量体化突然変異体を含み、リン酸接触突然変異を含まない。さらに、ＳＢＳ番号６５７２２については、リンカーはＬ０リンカー（ＬＲＧＳＱＬＶＫＳ（配列番号６）、別称「標準的」リンカー、米国特許第９，５６７，６０９号参照）であり、ＦｏｋＩ切断ドメインは、ＫＫＲの二量体化突然変異及びＫ５２５ＳのＦｏｋＩリン酸接触突然変異を含む。

【0189】

全てのＺＦＮを機能性（以下の実施例４に記述するように、インデルについてアッセイすることにより決定される切断活性）について試験したところ、活性があることが分かった。

【0190】

さらに、どのＺＦＮデザインに最も高い特異性があったかを判定するために、ＺＦＮ処置したＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて、原型のＺＦＮ対によるオフターゲット切断が既知である部位のインデル解析を行った。これを達成するために、臨床条件及びｍＲＮＡ濃度（原型のＺＦＮ対では１２０μｇ／ｍＬ、及び最適化された対では１００μｇ／ｍＬ）を使用して、動員された末梢血に由来するヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを原型のＺＦＮ対及び最適化されたＺＦＮ対で処置した。これらの細胞及び未処置対照からゲノムＤＮＡをトランスフェクション２日後に単離した後、各候補遺伝子座のＰＣＲ増幅及びディープシーケンシングを行って、インデルのレベルを数量化した。

【0191】

Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで３００サイクルカートリッジを使用したペアエンドディープシーケンシングにより、各遺伝子座における改変レベルを判定した。対になった配列をマージし、全塩基にわたり≧１５のクオリティスコアでフィルタリングしたＳｅｑＰｒｅｐによってアダプタートリミングを行い、その後ヒトゲノムにマッピングした（ｈｇ３８アセンブリ）。誤った遺伝子座にマッピングされた配列は切り捨てた。野生型アンプリコンよりも＞７０ｂｐまたは＞７０％短い配列は、プライマー二量体産物を最小限に抑えるために除外した。標的アンプリコンと各ＭｉＳｅｑリードとのＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアライメント（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８（３）：４４３－５３））を行って、インデルをマッピングした。アライメントした配列におけるインデルは、本当の事象を実際より少なく計数することを避けるために長さ１ｂｐのインデルも許容したことを除いては、Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１１（ｉｂｉｄ）に記述されているように定義した。なお、遺伝子座の一部は、増幅しもシーケンシングされもしなかったか、または、高いバックグラウンド（対照試料において＞１％の改変）もしくは不十分なシーケンシング深度（＜１００００リード）を理由に解析から棄却した。この解析の結果及び「親」の５１８５７／５１９４９のＺＦＮ対との比較を以下の表２に提供する。

【表2】

【0192】

実施例４：ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮの活性
インビトロ試験では、ＣＤ３４＋細胞内でヌクレアーゼを試験した。ＺＦＮはｍＲＮＡとして供給し、このｍＲＮＡは次のようにインビトロで作った：ＺＦＮをコードする遺伝子を含むプラスミドを直線化し、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ（登録商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したインビトロｍＲＮＡ転写のために使用する。その後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してこのｍＲＮＡを精製した。

【0193】

動員された末梢血からＣＤ３４＋細胞を単離し、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンならびにＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１１０を補充したＸ－ＶＩＶＯ １０培地中で維持し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。単離または解凍の４８時間後に細胞のトランスフェクションを行った。少量のアリコートをＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でトリパンブルー溶液０．４％（ｗ／ｖ）と１：１で混合し、ＴＣ２０ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を決定した。

【0194】

大規模なトランスフェクションでは、ＭａｘＣｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍａｘｃｙｔｅ）で細胞を洗浄し、１ｍＬあたり３～５ｅ７細胞で１００μＬの電気穿孔緩衝液中に再懸濁した。典型的に、６０μｇ／ｍＬ～１２０μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度を使用して候補ＺＦＮセットをスクリーニングした。その後、増殖培地中１ｍＬあたり３ｅ６細胞で、３０℃で１８時間にわたって細胞を増殖させてから、３７℃でさらに２４時間かけて１ｍＬあたり１ｅ６細胞に希釈する。切断活性の決定のために、トランスフェクション２～３日後にゲノムＤＮＡを単離し、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー遺伝子座における遺伝子改変のレベルをＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でのディープシーケンシングによって測定した。

【0195】

表１のＺＦＮ対をＣＤ３４＋細胞において試験した。活性の結果を以下の表３に示す。

【表3】

【0196】

赤血球系分化前のＣＤ３４＋細胞におけるヌクレアーゼ活性を解析することに加えて、編集された細胞もインビトロで赤血球系細胞に分化させた。従ったプロトコールは、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，（（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １２０（１５）：２９４５－５３）に基づくものであった。簡潔に述べると、以下のプロトコールに従った。

【0197】

０日目～７日目：４×１０^４個のＣＤ３４＋細胞を、分化培地（ＥＤＭ）（イスコフ改変ダルベッコ培地［ＩＭＤＭ］、３３０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、２Ｕ／ｍＬのヘパリンナトリウム、５％のヒトＡＢ＋血漿）中２×１０４／ｍＬの密度で、１０^－６Ｍのヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、及び３ＩＵ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の存在下で培養した。

【0198】

４日目：ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＥＰＯ、及びヒドロコルチゾンを含む新鮮なＥＤＭ中に細胞を再懸濁した。

【0199】

７日目～１１日目：ＳＣＦ及びＥＰＯを補充した新鮮なＥＤＭ １ｍＬあたり細胞１．５×１０^５個の密度で細胞を再懸濁した。

【0200】

１１日目～２１日目：１１日目に、ＥＰＯを補充した新鮮なＥＤＭ中１×１０^６／ｍＬで細胞を再播種した。その後１４日目に、この同じ培地中に５×１０^６／ｍＬで細胞を再播種した。増殖はこの１４日目～１８日目の期間中に定常に達し、このとき細胞生存率が２１日目の培養終了まで低下し始めた。

【0201】

Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２を使用して、蛍光チャネル１（ＡＯ）を７００ミリ秒に設定し、蛍光チャネル２（ＰＩ）を５０００ミリ秒に設定したＡＯＰＩ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ Ａｓｓａｙモードを用い、アクリジンオレンジ陽性及びヨウ化プロピジウム排除（ＡＯＰＩ）を測定することにより、播種時及び分化過程における細胞数を計測した。

【0202】

以下のプロトコールを使用して、除核細胞の百分率を分化２１日目に判定した。除核率は、トランスフェクトしなかった対照と、ＺＦＮトランスフェクト試料との間で比較可能であり、これらの２つの群による百分率は５９～６３％であった。
１．細胞計数
２．１００，０００細胞、４５０ｘｇ、５分、室温でスピンダウン。
３．５０μＬのＰＢＳ－ＢＳＡ＋１μＬのＧｌｙＡ－ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）に再懸濁。
４．冷蔵庫で１５分間染色。
５．１ｍＬのＰＢＳ－ＢＳＡを添加、ボルテックス、スピンダウン。
６．２５０μＬのＰＢＳ－ＢＳＡ－ＮｕｃＲｅｄ（１ｍＬあたり２滴のＮｕｃＲｅｄ）中に再懸濁。
７．ＮｕｃＲｅｄ用ＡＰＣチャネルを使用してＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで獲得。
８．有核の赤血球系細胞はＧｌｙＡ陽性ＮｕｃＲｅｄ陰性／低画分に入り、赤芽球は二重ＧｌｙＡ－ＮｕｃＲｅｄ陽性画分に入る。

【0203】

ａ）電気穿孔の４８時間後、ｂ）細胞解凍日のインビトロ分化が開始されたとき、及びｃ）インビトロの赤血球系分化の１４日目に採取されたＤＮＡ試料において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子改変をＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって測定した。分化は２１日間にわたって行ったが、１４日時点は、ＤＮＡ回収の損失をもたらす赤血球系細胞の大部分の除核前であるため、これをＤＮＡ解析のために選択した。観察されたＢＣＬ１１Ａエンハンサーにおける改変の百分率をトランスフェクション条件の詳細と共に表４に列記する。

【表4】

【0204】

これらのデータは、最適化された対６３０１４及び６５７２２のｍＲＮＡをＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトすると、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー標的部位において非常に効率的な遺伝子改変が生じること（＞７５％の対立遺伝子の改変）、また、この改変が細胞の冷凍及び解凍後ならびに赤血球系分化後に非常に良好に維持されること（改変の＞９０％の保持）を示す。

【0205】

ＺＦＮ対６３０１４／６５７２２をさらなる解析のために選択した。これらのＺＦＮのアミノ酸配列を以下に示す。これらは各々、核局在化シグナル（ＮＬＳ、Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９（３ Ｐｔ ２）：４９９－５０９）、及びオンターゲットＺＦＮ活性を向上させる親水性ペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：１２０４－１０）を含み、これらはいずれもＮ末端コード配列に融合している。よって、ＺＦＮのｍＲＮＡ及びアミノ酸配列は次のとおりである。

【0206】

６３０１４のｍＲＮＡ（１７２５ｎｔ）

【化2】

【0207】

６３０１４のアミノ酸配列（認識ヘリックス領域には下線が引かれ、リンカーは大文字のイタリック体で示され、フィンガー１、３、及び５の骨格残基に対する突然変異は二重線で示され、二量体化ドメイン突然変異（ＥＬＤ）は太字及びイタリック体で示され、親水性ペプチドは小文字で示され、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は小文字のイタリック体で示されている）：

【化3】

【0208】

６５７２２のｍＲＮＡ（１６８０ヌクレオチド）：

【化4】

【0209】

６５７２２のアミノ酸配列（認識ヘリックス領域には下線が引かれ、リンカーは大文字のイタリック体で示され、親水性ペプチドは小文字であり、ヌクレアーゼ局在化シグナルは小文字のイタリック体であり、フィンガー１、２、及び４の骨格残基に対する突然変異は二重線で示され、二量体化ドメイン突然変異（ＥＬＤ）は太字及びイタリック体で示され、ＦｏｋＩリン酸接触突然変異（複数可）は波線で示されている）：

【化5】

【0210】

実施例５：赤血球系後代におけるグロビンレベルの鑑定
上記の表４に示した２つの細胞調製物について、分化の１４日目（除核及び赤血球系の成熟化の過程において全体的なｍＲＮＡレベルが劇的に低下する前）に単離した細胞ｍＲＮＡにおけるαグロビン、βグロビン、及びγグロビンのｍＲＮＡのレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した。γグロビンｍＲＮＡ値は、同じ試料から得たβグロビンｍＲＮＡに対して（図５Ａ）、またはαグロビンｍＲＮＡ値に対して（図５Ｂ）、正規化して示してある（１として定義されるトランスフェクションなしのＲＴ－ＰＣＲ標準における比に基づく任意単位を使用している）。

【0211】

ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーのＺＦＮ媒介性改変が胎児ヘモグロビンをタンパク質レベルで上昇させるかを判定するために、赤血球系分化のエンドポイントである２１日目に単離したタンパク質試料の逆相ＨＰＬＣを使用した。ガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対アルファグロビンの比、ならびにガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対ベータ様グロビンの比（Ａガンマ、Ｇガンマ、ベータ及びデルタの各グロビンのピークの和）を判定した。これらを図６に示す。

【0212】

この実験では、ＨＳＰＣの赤血球系後代において、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーが６３０１４／６５７２２によって破壊されると、胎児グロビンタンパク質の百分率が約１５％～２０％のレベルまでおよそ３～４倍上昇したことが観察された。

【0213】

実施例６：編集された細胞のＮＳＧマウスにおける生着
編集されたヒトＣＤ３４＋細胞を次いでＮＳＧマウスに注射し、生着を鑑定した。移植後第８週、及び第１２週、第１６週及び第２０週時点で収集した末梢血、ならびに第１２週及び第２０週時点で収集した骨髄において、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用し、ヒトキメリズムの程度（すなわち、ヒトＣＤ４５＋細胞の百分率）を測定した。加えて、ＺＦＮ改変細胞の生着のレベルを試験するため、ＺＦＮ標的遺伝子座の直接ハイスループットシーケンシングにより、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー遺伝子座における遺伝子破壊のレベルを評価し、インプット材料中で測定された標的遺伝子改変のレベルと比較した。

【0214】

２名の健常なドナー（ＰＢ－ＭＲ－００３及びＰＢ－ＭＲ－００４と呼ぶ）由来のＨＳＰＣをＧ－ＳＣＦ及びプレリキサホルで動員し、Ｙａｎｎａｋｉ ｅｔ ａｌ．（（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０（１）：２３０－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１）に記述されているように精製した。Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ－Ｋａｂｉ Ｌｏｖｏデバイスを使用して白血球アフェレーシス産物の血小板を枯渇させてから、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ機器を使用してＣＤ３４＋細胞を濃縮した。その後、精製された細胞をトランスフェクションのために培養物に播種した。

【0215】

ＣＤ３４＋細胞精製の２日後、Ｍａｘｃｙｔｅ機器を使用し、親のＺＦＮ対である６３０１４／６５７２２をコードする、１２０μｇ／ｍＬの単一のｍＲＮＡか、または最適化されたＺＦＮ対である８０μｇ／ｍＬの６３０１４及び２０μｇ／ｍＬの６５７２２をコードする、最適化された量の２つの別個のｍＲＮＡのいずれかの存在下で、これらの細胞を電気穿孔した。トランスフェクションの前に、細胞のアリコートをトランスフェクトしない対照として取っておいた。ＰＢ－ＭＲ－００３からは９５００万個の細胞をトランスフェクトし、ＰＢ－ＭＲ－００４からは１億２０００万個の細胞をトランスフェクトした。

【0216】

電気穿孔後、一過性の一晩培養を３０℃で行ってから、細胞を３７℃でさらに２４時間培養した。電気穿孔の２日後、ＤＮＡ解析のための細胞アリコートを取り、残りの細胞を採取し、凍結保存し、液体窒素中に保管した。

【0217】

コンディショニング：照射の１～２日前にマウスを１０ｍｇ／ｋｇ／日のバイトリル水で処置し、移植の１６～２４時間前に３００ＲＡＤを致死量以下で照射した。移植は尾静脈注射によって行った（以下参照）。その後、マウスに新鮮なバイトリル水を与えた。バイトリル水を１週間後に交換し、移植後１４日目にバイトリル水の追加を中止した。

【0218】

移植：移植日に、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０／１％ＰＳＧ＋３サイトカインカクテル（組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び組換えヒトＦｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ））を３７℃で予熱し、新鮮なＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡを室温で調製する（滅菌／濾過する）。凍結保存した細胞を３７℃で解凍し、ペレット化し、予熱したＸ－Ｖｉｖｏ培地に再懸濁し、再度ペレット化し、ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡに再懸濁し、計数した。もう一度ペレット化した後、細胞ペレットをマウス１匹あたり５５０μＬのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（細胞数に基づいて２×１０＾６細胞／ｍＬ）に再懸濁した。その後、細胞を室温でマウスの尾静脈に２５ゲージ針で注射した。研究群を以下の表５に示す。

【表5】

【0219】

動物の全体的な健康を毎日観察し、初めの２週間は毎日体重を量り、その後は隔週で体重を量った。移植後第８週、第１２週、第１６週、及び第２０週に顎下静脈から末梢血を収集したか（１００μＬ）、または、殺処分した動物では移植後第１２週及び第２０週に心穿刺によって採血した（１ｍＬ）。各群の動物の半分（１群あたり５匹のマウス）を移植後第１２週に安楽死させ、骨髄及び末端血液を解析のために収集した。各群の残りの動物（１群あたり５匹のマウス）は移植後第２０週に殺処分した。

【0220】

採血、細胞採取、及び処理：末梢血を顎下静脈または心穿刺によってＥＤＴＡ管に収集し、５００ｘｇで５分間遠心分離して血漿を除去した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による洗浄及び遠心分離の後、１０倍容量の溶血緩衝液をペレットに添加し、この混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、再び遠心分離及び洗浄した。ペレット化した画分を１ｍＬのＰＢＳ ＢＳＡ中で再構築し、アリコートを取って１，０００ｘｇで５分間遠心分離し、結果として得られたペレットをジェノタイピングのために保存した。上清画分をＦＡＣＳ解析に利用した。

【0221】

ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に骨髄、大腿骨、脛骨、及び骨盤骨を収集し、全骨髄をＰＢＳ ＢＳＡ溶液に流し入れ、７０μｍのナイロンストレーナーを使用して濾過した。ＰＢＳ ＢＳＡで容量を１０ｍＬに補整し、アリコートを細胞計数（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）に使用した。

【0222】

ＭｉＳｅｑディープシーケンシングを使用してＺＦＮ活性を解析した。簡潔に述べると、トランスフェクトしていない対照ＣＤ３４＋ＨＳＰＣまたはエンハンサーを標的とするＺＦＮ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＣＤ３４＋ＨＳＰＣのいずれかを注射したマウスのゲノムＤＮＡを、注射後第８週及び第１２週に得た血液試料または第１２週の骨髄から単離した。目的の領域（ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座内のＺＦＮ結合部位を含むもの）をＰＣＲ増幅し、改変のレベルをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（ＭｉＳｅｑ）でのペアエンドディープシーケンシングによって判定した。

【0223】

Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシングプラットフォームと適合するライブラリを作製するために、連続的ＰＣＲにおいて２セットの融合プライマーを使用して、アダプター、バーコード、及びフローセルバインダー（短いＤＮＡ配列）を標的特異的なアンプリコンに結合させた。マウスの血液及び骨髄試料中のヒトＢＣＬ１１Ａエンハンサー改変のＭｉＳｅｑによる評価では、これらの試料中の標的ＤＮＡの量が低かったため、プロトコールを補整する必要があった。

【0224】

ＭｉＳｅｑアダプターＰＣＲには、次のプライマー、
ＰＲＪＩＹＬＦＮ－ｆ２：
ＡＣＡ ＣＧＡ ＣＧＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＴＮ ＮＮＮ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＣＣ ＣＡＣ ＣＣＡ（配列番号３２）及び
ＰＲＪＩＹＬＦＮ－ｒ４：
ＧＡＣ ＧＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＡＧ ＡＣＡ ＴＡＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＧＧ Ｇ（配列番号３３）を使用した。

【0225】

解析のために、ＤＮｅａｓｙによってマウス骨髄試料からＤＮＡを単離し、各ＰＣＲ反応でおよそ１００ｎｇのＤＮＡを使用した。Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳによってマウス血液試料からＤＮＡを単離し、１５μＬの単離されたＤＮＡのうち１０μＬを各反応で使用した。各ＭｉＳｅｑ ＰＣＲ反応には、ＤＮＡの他に、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑミックス２５μＬ（Ｑｉａｇｅｎ）、上記のＢＣＬ１１Ａエンハンサープライマー各０．５μＬ（１００ｎＭの濃度で）、及び水を加えて、全反応物容量５０μＬとした。典型的なＭｉＳｅｑ ＰＣＲ条件は、９５℃で変性１５分間、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、及び７２℃で４０秒を３０サイクル、その後７２℃で伸長１０分間であった。ＭｉＳｅｑ ＰＣＲの後、ＰＣＲ産物を水で１：５０～１：２００に希釈したか、または出発細胞数が非常に低い試料では未希釈のままにした。バーコードＰＣＲは、上述のように希釈したＭｉＳｅｑ ＰＣＲ産物１μＬ、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑミックス２５μＬ、フォワードバーコードプライマー１μＬ、リバースバーコードプライマー１μＬ（いずれも１０ｎＭの濃度で）、及び水を用い、全反応物容量５０μＬで行った。バーコードＰＣＲ条件は、９５℃で変性１５分間、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を１８サイクル、その後７２℃で伸長１０分間であった。バーコードＰＣＲ産物をプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーでシーケンシングした。結果は上記の表５に示してある。

【0226】

キメリズムのＦＡＣＳ解析及び細胞系統の決定。ヒトキメリズムの程度を鑑定するため、末梢血（生着後第８週、第１２週、第１６週、及び第２０週）及び骨髄（生着後第１２週及び第２０週）における細胞の画分を、それぞれ、ｈＣＤ４５－ＡＰＣ Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びｈＣＤ４５－ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析を行った。加えて、以下の表６に記載の特異的な抗体で骨髄細胞を染色することにより、造血性系統の解析を行った。

【表6】

【0227】

加えて、ＨＳＰＣ集団の精製及びソーティングを行うため、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いる濃縮／枯渇方策を使用した。骨髄細胞をまずＣＤ１９－ビオチン、ＣＤ３－ビオチン、Ｂ２２０－ビオチン、ＴＥＲ１１９－ビオチン、及びｍ－ｃｋｉｔ－ビオチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色してから、抗ビオチンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートした。ＭＡＣＳの磁場に置かれたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、陽性の画分及び枯渇した画分を分離した。分離後、陽性の画分はストレプトアビジン－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ１９－ＰＥ、ＣＤ４５－ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、枯渇した画分はＣＤ３４－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｌｙ－Ａ－ＰＥ（ＤＡＫＯ）、ＣＤ１９－ＡＰＣ（ＢＤ）、Ｌｉｎ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ストレプトアビジン－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＢＶ５１０、ＣＤ３３－ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ）及びＣＤ３８－ＰＥＣｙ－７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。

【0228】

トランスフェクトしていないＨＳＰＣ及び６３０１４／６５７２２トランスフェクトＨＳＰＣを、上述の標準的手順を使用してＮＳＧマウスに生着させた。ＦＡＣＳを使用してｈＣＤ４５陽性細胞の割合を測定することにより、これらのマウスにおける生着後のヒトキメリズムの程度を鑑定した。

【0229】

図７は、移植後第８週及び第１２週に収集した末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を示し、図８は、第１２週に採取した骨髄中の百分率を示す。示されているように、この研究における生着レベルは、トランスフェクトしていない対照及び６３０１４／６５７２２トランスフェクトＨＳＰＣの生着後で比較可能なヒトキメリズムであった。複数の群に分配した６０匹中３匹のマウスしかＣＤ４５＋細胞を有せず、生着の失敗が示された。

【0230】

標準的手順を使用し、系統特異的な細胞表面マーカーを認識する抗体を用いた、第１２週に得た骨髄細胞のＦＡＣＳ解析により、種々の造血細胞系統の再構築を試験した。図９に示されているように、注射後第１２週の骨髄におけるヒト造血性系統を解析したもの全てに関し、ＢＣＬ１１Ａ特異的ＺＦＮコードｍＲＮＡで処置したＣＤ３４＋細胞後代と、トランスフェクトしていない細胞のそれとの間で比較可能な提示が観察された。生着後第１２週に殺処分したマウスの骨髄を単離し、示された系統マーカーを認識する抗体を使用したＦＡＣＳにより、種々の造血系統の分布を解析した。全ての数字は、示された系統マーカーに対して陽性に染色する細胞の、ヒトＣＤ４５陽性細胞の百分率に対する比として示されている。ただし、図９Ｃの赤血球系マーカーＣｄ７１＋（Ｔｅｒ１１９）を発現する細胞は例外とし、これは、赤血球系細胞がＣＤ４５陽性ではないことから、集団全体における陽性染色細胞の百分率として示されている。

【0231】

上述のＭｉＳｅｑシーケンシングプラットフォームを使用したＺＦＮ標的領域のディープシーケンシングにより、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーにおける遺伝子改変のレベル（挿入及び欠失［インデル］を有する対立遺伝子の％）を鑑定した。図１０には、第８週及び第１２週の血液試料に関するデータが示され、図１１には、第１２週の骨髄試料、及び６３０１４／６５７２２処置細胞の第１２週の骨髄細胞試料に由来するソーティングした系統に関するデータが示されている。比較のため、トランスフェクションの２日後に測定したインデルの百分率（表５に列記したとおり）も図１０及び１１のグラフに示してある。

【0232】

加えて、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーにおける遺伝子改変の良好な保持が、種々の時点及び種々の系統において、両方の６３０１４／６５７２２処置ＨＳＰＣドナーセットで見られた。ＢＣＬ１１Ａ依存性（Ｂ細胞、「ＣＤ１９」；未分化前駆細胞、「ＣＤ３８Ｈ」）及びＢＣＬ１１Ａ非依存性（骨髄系「ＣＤ３３」）の両系統で比較可能な改変が観察された。インプット遺伝子改変レベルはＰＢ－ＭＲ－００４ドナー試料中よりもＰＢ－ＭＲ－００３ドナー試料中で高かったが、ＰＢ－ＭＲ－００４由来細胞は、マウスにおいてＰＢ－ＭＲ－００３由来細胞よりも高い改変レベル、すなわち改変のより良好な保持を一貫して示す。

【0233】

全体として、マウスで観察されたＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーにおける遺伝子改変の保持は、様々な遺伝子標的を標的とするいくつかのＺＦＮを使用した過去のマウス実験で観察されたものと一貫性があった。

【0234】

さらに、ヒト赤血球系前駆細胞はマウスにおいて分化できないため、これらの細胞で起こったＢＣＬ１１Ａを標的とする遺伝子改変の量を判定するために、骨髄細胞をマウスから取り出し、インビトロで分化させた。これらの実験では、生着後第１２週に殺処分したマウスから骨髄由来のヒト細胞を取り出し、上述のようにインビトロで分化させた。ＢＣＬ１１Ａ標的遺伝子改変は、分化の１４日目に細胞から単離したＤＮＡのハイスループットＭｉｓｅｑシーケンシングにより測定した。

【0235】

赤血球系分化の１４日目の改変レベルを示す改変データ（インデル）を図１２に提示する。インビトロ分化の１４日目におけるインデルの百分率は、１匹のマウスから単離された細胞から作製した培養物毎に著しく異なり、これらの条件下で得られるオリゴ細胞の拡大の性質を反映している。このデータは、６３０１４／６５７２２ ＺＦＮにより媒介されるＢＣＬ１１Ａエンハンサー改変が赤血球系分化中に著しく変化しなかったことを示す。血液及び骨髄試料で観察されたのと同様に、ＰＢ－ＭＲ－００４由来細胞の赤血球系後代試料は、ＰＢ－ＭＲ－００３由来細胞の赤血球系後代よりも高い改変の平均レベルを示した。

【0236】

インビトロの赤血球系分化の１４日目に細胞から単離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ解析により、種々のグロビンｍＲＮＡの相対的なレベルを判定した。このデータを図１３Ａに示す。ここで、γグロビン対βグロビンｍＲＮＡ及びγグロビン対αグロビンｍＲＮＡの相対的な比（図１３Ｂ）は、各群で５つの赤血球系培養物について平均したものである。トランスフェクトしていない試料及び６３０１４／６５７２２処置試料の両方において、γグロビン対βグロビンまたはγグロビン対αグロビンのｍＲＮＡ比は、同じ群の個々のマウスの赤血球系後代同士の間で大きく異なる。ドナーＰＢ－ＭＲ－００４由来の培養物は、ドナーＰＢ－ＭＲ－００３由来のものと比べて低い平均γグロビン比を示し、ＰＢ－ＭＲ－００４由来試料でより良好な成熟化が観察されたことと一致している。しかしながら、このばらつきにもかかわらず、ＺＦＮ処置試料の平均は、それぞれに対応するトランスフェクトしていない試料と比較すると、γグロビンｍＲＮＡレベルの約１．５～２倍の上昇を示す。

【0237】

グロビンタンパク質レベルをＨＰＬＣ解析によって鑑定した。図１４は、分化の１６日目に採取した試料のグロビンタンパク質の解析を示す。ガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対アルファグロビンの比、ならびにガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）対ベータ様グロビンの比（Ａガンマ、Ｇガンマ、ベータ及びデルタの各グロビンのピークの和）を判定した。各群の平均が各バーの上に示されている。ＰＢ－ＭＲ－００３由来試料の不十分な赤血球系分化と一致して、このドナーに由来するトランスフェクトしていない細胞中のガンマグロビンレベルは非常に高く（約３０％）、したがってＺＦＮ処置は、ガンマグロビンレベルの１．２倍の上昇しかもたらさなかった。ＰＢ－ＭＲ－００４はトランスフェクションなしでより典型的なレベル（約９％）を示し、マウス継代の１２週間後にガンマグロビンタンパク質レベルの約２倍の上昇を呈した。

【0238】

＞８．６％のγグロビンを自然に有する患者は、γグロビンレベルが＜８．６％の患者と比較して有利であると考えられている（Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３３０：１６３９－４４）。実際、編集された細胞の生着によって非鎌状赤血球ＲＢＣのキメラの１０～２０％の百分率が達成されれば、臨床的改善につながり得る（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ４：１３７－１４８．ｄｏｉ １０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１６．１２．００９）。よって、インビトロでの赤血球系分化プロセスを経る必要があるにもかかわらず、このキメラ細胞の百分率、及び検出されているγ－グロビンタンパク質のレベルは、治療効力を示している。

【0239】

本明細書で言及される特許、特許出願、及び公開文献は全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0240】

明確に理解できるように実例及び例により多少詳細に開示を行ったが、本開示の趣旨または範囲を逸脱することなく種々の変更及び改変が実施され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、前出の記述及び例は限定的なものと解釈されるべきではない。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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