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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-04
(45)【発行日】2023-01-16
(54)【発明の名称】哺乳動物細胞用遺伝子導入ベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20230105BHJP
C12N 5/16 20060101ALI20230105BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20230105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12N5/16
A01K67/027
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2017239819
(22)【出願日】2017-12-14
(65)【公開番号】P2019103471
(43)【公開日】2019-06-27
【審査請求日】2020-10-26
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）公益財団法人実験動物中央研究所：平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、脳科学研究戦略推進プログラム、遺伝子改変マーモセットの汎用性拡大および作出技術の高度化とその脳科学への応用委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願；学校法人慶應義塾：平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、脳科学研究戦略推進プログラム、キメラ形成能を持つマーモセットＥＳ細胞を用いた新たな遺伝子改変技術の開発とマーモセットゲノム情報基盤の確立委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】390016470
【氏名又は名称】公益財団法人実験動物中央研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】899000079
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 えりか
(72)【発明者】
【氏名】高橋 司
(72)【発明者】
【氏名】後藤 元人
(72)【発明者】
【氏名】岡野 栄之
(72)【発明者】
【氏名】村山 綾子
(72)【発明者】
【氏名】前田 拓志
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１４８２５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５４５３７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１２６０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－２６７００１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５２７８６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－０１８９９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Huali Su et al.，piggyBac transposon-mediated transgenesis in the apicomplexan parasite Eimeria tenella.，PLoS One，2012年06月29日，Vol.7, Issue 6，e40075，doi: 10.1371/journal.pone.0040075
【文献】Guang-Hui Liu et al.，Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.，Nature，2012年10月17日，Vol.491, No.7425，p.603-607，doi: 10.1038/nature11557
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ａ０１Ｋ ６７／０２７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含む、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターであって；上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域が、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡ、及び（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含み、
上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が、（ｂ１）５’末端側と３’末端側とに付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含む
ことを特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。
【請求項2】
蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質が、蛍光標識タンパク質に加えて、さらに１又は２以上の目的タンパク質を含むことを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項3】
外来遺伝子導入判定領域が、さらに（ａ３）タンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１又は２記載のベクター。
【請求項4】
外来遺伝子導入判定領域の蛍光タンパク質が発する蛍光と蛍光標識タンパク質が発する蛍光が補色の関係にあることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載のベクター。
【請求項5】
請求項１～４いずれか記載のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキット。
【請求項6】
以下の（イ）～（ハ）の工程を備える外来遺伝子導入細胞を選択する方法。（イ）請求項１～４いずれか記載の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを哺乳動物細胞（ヒト受精卵、ヒトＥＧ細胞、ヒトＧＳ細胞を除く）に注入する工程；
（ハ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択する工程；
【請求項7】
外来遺伝子導入細胞が受精卵（ヒト受精卵を除く）であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項8】
請求項７記載の方法により外来遺伝子導入受精卵を選択する工程、及び当該外来遺伝子導入受精卵を非ヒト哺乳類動物仮母に移植し、産子を取得する工程を含むことを特徴とする非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターに関し、本発明によると、該ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを使用することにより、非ヒト哺乳動物初期胚等に遺伝子を導入して、ヒト疾患モデル動物として利用できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出し、また、スクリーニング用外来遺伝子導入細胞を調製することができる。
【背景技術】
【0002】
遺伝子導入法は、インビボやインビトロにおいて遺伝子やタンパク質の機能を研究する上で重要な手法であり、ヒトの疾患に関与する遺伝子を非ヒト動物に導入することによりノックイン非ヒト動物を作出すること、ヒトの疾患に関与する遺伝子の非ヒト動物における相同遺伝子をノックアウトすることによりノックアウト非ヒト動物を作出すること等の遺伝子操作により非ヒトトランスジェニック動物を作出し、これらの動物をヒト疾患モデル動物として利用することが広く行われている。とりわけ、マウスは、遺伝子ノックアウト・ノックイン技法の適用が容易な動物であり、ヒト疾患モデルマウスとして広く用いられている。
【0003】
しかしながら、げっ歯類と霊長類の間には、解剖学的相違、疾病に対する感受性の相違、認知機能の相違等があるため、ヒト疾患モデルマウスを用いて得られた結果をそのままヒトへ適用することは困難な場合がある。そこで、ヒトに近い霊長類をヒト疾患モデル動物として用いて、霊長類における共通のメカニズムに関わる、神経、臓器の再生医療に関する研究や脳の高次機能に関する分野の研究を行うことにより、より精度の高い有効性の評価を行うことが期待されている。モデルマウスの作出においては、遺伝子導入の成否を問わず母親の胎内に戻し、得られた多数の産子について遺伝子導入が行われているか否かを確認することが常法として行われているが、霊長類のモデル動物においては、外来遺伝子の初期胚への導入効率が低いうえに、倫理的観点から、少数の動物を長期飼育して最大の情報収集を得ることや、動物自体の福祉向上及び苦痛の軽減・排除が求められている。また、かかるトランスジェニック動物の作出においては、受精卵が胚盤胞に達する数日間のうちに遺伝子が導入されたか否かを判別する必要があり、インビトロでの細胞実験のように長期間の培養が必要な抗生物質の耐性遺伝子のマーカーとして利用は好ましくないとされる。
【0004】
これまで、外来遺伝子を霊長類のゲノムＤＮＡに導入する方法としては、げっ歯類同様受精卵注入用ＤＮＡ断片等の受精卵注入用ＤＮＡベクターをマイクロインジェクションする方法や、受精卵に注入する極細ピペットを用いて、顕微鏡下で未受精卵子に精子と一緒に目的外来遺伝子を注入するＩＣＳＩ－Ｔｒ（intracytoplasmic sperm injection mediated transgenesis）法や、霊長類動物初期胚をスクロース処理して囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモーターに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むレンチウイルスベクターを注入して外来遺伝子を導入することによりヒト疾患モデル霊長類動物を作出する方法（例えば、特許文献１等参照）が提案されてきたが、マイクロインジェクションやＩＣＳＩ－Ｔｒ法による場合は、その成功率は５％程度といわれており、また、ウイルスベクターとしてレンチウイルスベクターを用いた場合においても、その成功率は２０％程度にとどまっているとされる。また、かかるレンチウイルスベクター法は、８．５ｋｂ以上の外来遺伝子の導入が困難であるとされており、より大きな遺伝子を挿入することができる方法の開発が望まれている。
【0005】
一方、トランスポゾンは、Ｂ．マクリントックにより最初に明らかにされた染色体上を移動する遺伝子であり、このトランスポゾンに関して、トウモロコシの種子や植物体に含まれるアントシアニン遺伝子や、胚乳の黄色デンプンの遺伝子などの発現を変化させる制御遺伝子が、一つの染色体から他の染色体に移動していることが知られている。
【0006】
なかでも、鱗翅目昆虫ウイルス由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃは、腫瘍発生リスクを高めることがなく、ヒト・マウス・ラット由来細胞で使用できることが知られており、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを用いてカイコ染色体へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモデルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定に伝わることも確認されている（例えば、非特許文献１参照）。
【0007】
また、少なくとも１．５ｋｂのインサートを有するｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを細胞のゲノムＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法（例えば、特許文献２参照）が提案されているが、マウス生殖細胞系におけるｐｉｇｇｙＢａｃ転移の検討においては、トランスポゾンドナープラスミドとトランスポゼーズヘルパープラスミドの前核同時注入を行った場合の、トランスジェニックマウスにおける転移の解析において、創始系統の３４．８％（６２／１８４）がＰＢ［Ａｃｔ－ＲＦＰ］一重陽性であり、０．５％（１／１８４）がＡｃｔ－ＰＢアーゼ一重陽性であり、２．７％（５／１８４）が二重陽性であったことが示されており、１００％のトランスジェニック動物の取得率とはほど遠い状況であるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際公開ＷＯ２００９／０９６１０１号パンフレット
【文献】特開２００８－５４５３７５公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Nature Biotechnology 18,81-84,2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の課題は、より高度な機能に関連する遺伝子のトランスジェニック非ヒトモデル動物を作出するために、従来よりも大きい遺伝子を非ヒト動物細胞に導入することができ、かつ、トランスジェニック動物の取得率を１００％に近い値とする遺伝子導入手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上述のとおり、従来は、トランスポゾンを使用しても目的のトランスジェニック動物を取得できる確率は非常に低いものであった。その理由の一つとして、例えば、蛍光タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを導入することを目的として、トランスポゾンを含むプラスミドを細胞に注入した場合、宿主細胞のゲノムＤＮＡに導入する目的とされた蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入されないときでも、注入してしばらくは、細胞質や核内で蛍光タンパク質が蛍光を発するため、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された細胞を決定するためには、相当期間にわたり細胞の培養・増殖を継続することが必要であり、細胞が受精卵である場合には、適切な時期に蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された細胞を仮親等へ移植することは困難であった。
【0012】
例えば、従来のpiggyBac Transposon Vector Systemを用いた場合には、長期的に培養した場合に、結果的にＧＦＰが発現し続けている安定株を得ることはできる可能性があるが、ピューロマイシンの薬剤選抜によりＧＦＰ陽性株が得られているともいえ、ソーティングでＧＦＰ陽性細胞を選んできても、ピューロマイシンをかけなければそのうちＧＦＰ陰性の細胞がでてくることが予想される。しかし、より短期間で遺伝子導入細胞を選別できることが可能になれば、染色体への遺伝子導入前（エピソーマルな発現）と後での発現の違いを見たり、短期的な培養をする細胞や胚の遺伝子導入選別に特に有効となる。
【0013】
本発明者らは、外来タンパク質をコードするＤＮＡを宿主のゲノムＤＮＡに導入するために、５’末端側の末端逆位配列（ＩＴＲ；inverted terminal repeats）を含む５’末端側ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列と、３’末端側の末端逆位配列を含む３’末端側ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列との間に、哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと該プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスポゾン領域と、哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡの下流かつＩＴＲ配列の上流に判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを作動可能に連結したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを用いて検討を行った。上記外来タンパク質としてＧＦＰ（（Green Fluorescent Protein）を用い、判定用蛍光タンパク質としてＫＯ（Kusabira-Orange：クサビラオレンジ）を用いたトランスポゾンベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとともに、ヒト２９３Ｔ細胞に注入したところ、５日目ごろまでに判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞において、上記ＧＦＰをコードするＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに導入されていることを見いだした。
【0014】
同様の検討をマウスの受精卵や霊長類の受精卵について行ったところ、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを注入後、２４時間までに上記ＫＯの蛍光が急速に減衰し、ＧＦＰが発現し続けている細胞において、上記外来タンパク質であるＧＦＰをコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入されていることを確認した。また、トランスジェニック非ヒトモデル動物の作出において、ＫＯの蛍光が急速に減衰し、ＧＦＰが発現している胚を選択し、トランスポゾン注入後９６～１２０時間に仮親へ移植することにより、ＧＦＰをコードする遺伝子が受精卵細胞のゲノムに組み込まれたトランスジェニック非ヒトモデル動物の作出の成功率が飛躍的に上昇した。これまで、外来遺伝子が導入された細胞の選択は、不可能ではないもののその確率は低く、実験者の勘やノウハウに頼ることも多いものであったが、かかる方法を用いることにより、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択できる確率が顕著に高くなったことを確認して、本発明を完成するに至った。
【0015】
すなわち、本発明は以下の特許請求の範囲に記載された事項により特定される。
［１］（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含む、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターであって；
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域が、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡ、及び（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が、（ｂ１）５’末端側と３’末端側とに付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。
［２］蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質が、蛍光標識タンパク質に加えて、さらに１又は２以上の目的タンパク質を含むことを特徴とする上記［１］記載のベクター。
［３］外来遺伝子導入判定領域が、さらに（ａ３）タンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のベクター。
［４］外来遺伝子導入判定領域の蛍光タンパク質が発する蛍光と蛍光標識タンパク質が発する蛍光が補色の関係にあることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載のベクター。
［５］上記［１］～［４］いずれか記載のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキット。
［６］以下の（イ）～（ニ）の工程を備える外来遺伝子導入細胞を選択する方法。
（イ）上記［１］～［４］いずれか記載の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された外来遺伝子導入細胞として選択する工程；
［７］外来遺伝子導入細胞が受精卵であることを特徴とする上記［６］記載の方法。
［８］上記［７］記載の方法により選択された外来遺伝子導入受精卵を非ヒト哺乳類動物仮母に移植し、産子を取得する工程を含むことを特徴とする非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法。
［９］上記［８］記載の方法により作出された非ヒト哺乳類トランスジェニック動物から得られた、外来遺伝子を有し、生殖能・受精能を有する非ヒト哺乳類トランスジェニック動物細胞。
［１］（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含む、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターであって；
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域が、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡ、及び（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が、（ｂ１）５’末端側と３’末端側とに付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。
［２］蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質が、蛍光標識タンパク質に加えて、さらに１又は２以上の目的タンパク質を含むことを特徴とする上記［１］記載のベクター。
［３］外来遺伝子導入判定領域が、さらに（ａ３）タンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のベクター。
［４］外来遺伝子導入判定領域の蛍光タンパク質が発する蛍光と蛍光標識タンパク質が発する蛍光が補色の関係にあることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載のベクター。
［５］上記［１］～［４］いずれか記載のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキット。
［６］以下の（イ）～（ニ）の工程を備える外来遺伝子導入細胞を選択する方法。
（イ）上記［１］～［４］いずれか記載の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された外来遺伝子導入細胞として選択する工程；
［７］外来遺伝子導入細胞が受精卵であることを特徴とする上記［６］記載の方法。
［８］上記［７］記載の方法により選択された外来遺伝子導入受精卵を非ヒト哺乳類動物仮母に移植し、産子を取得する工程を含むことを特徴とする非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法。
［９］上記［８］記載の方法により作出された非ヒト哺乳類トランスジェニック動物から得られた、外来遺伝子を有し、生殖能・受精能を有する非ヒト哺乳類トランスジェニック動物細胞。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】外来遺伝子導入判定領域とｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含むベクターの模式図である。（ａ）は、ＣＭＶ－ｈ（humanized ：ヒト）ＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモーター－ｅＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲの構成であり、（ｂ）は、ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモータ－ｅＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲの構成である。
【図2】ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ含有環状ベクターとをトランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、ＥＧＦＰとＫＯの発現を経時的に観察した図である。倒立型蛍光顕微鏡による観察を（ａ１）及び（ｂ１）に示す。ＦＡＣＳ解析を（ａ２）及び（ｂ２）に示す。
【図3】マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした場合の倒立型蛍光顕微鏡により観察した図である。（ａ）は、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとをマイクロインジェクションした場合、（ｂ）は、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターをマイクロインジェクションした場合、（ｃ）は、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されたと推定される細胞を観察した図である。
【図4】ＥＧＦＰをコードするＤＮＡを含む（ａ）直鎖ベクター又は（ｂ）環状ベクターをマイクロインジェクションした場合の倒立型蛍光顕微鏡により観察した図である。
【図5】野生型（ネガティブコントロール）、トランスジェニックマーモセット仔１及び仔２の胎盤、仔１及び仔２の毛根、仔１及び仔２の皮膚、仔１及び仔２の血液のＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。
【図6】変異ＬＲＲＫ２含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構成を表す図である。
【図7】変異ＬＲＲＫ２含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとをコトランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、ＥＧＦＰとＫＯの発現を経時的に観察した図である。
【図8】G protein-coupled receptor 56（ｇｐｒ５６）ミニマムプロモーター含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構成を表す図である。
【図9】ｇｐｒ５６ミニマムプロモーター含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターとをコトランスフェクト後のマウスニューロスフェアについて、ＣｅｒｕｌｅａｎとＥＧＦＰとＫＯの発現を経時的に観察した図と発光を観察した図である。
【図10】ｇｐｒ５６ミニマムプロモーター含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡをマウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションし、蛍光発現を経時的に倒立型蛍光顕微鏡により観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターとしては、（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含むベクターであって、かつ、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ（トランスポゾン転移酵素）を使用することにより、公知のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン転移機構を利用して哺乳動物細胞（宿主細胞）ゲノムへの外来遺伝子ＤＮＡの組み込みを行うことができるベクターであり、上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域は、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡと、（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとを含み、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域は、（ｂ１）５’末端側と３’末端側に付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質とを含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする領域であれば特に制限されず、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域は、前記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域の上流又は下流に位置することができる。なお、本発明のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターは、該ｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキットとして使用されることもできる。
【0018】
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン転移機構によると、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが、上記（Ｂ）のトランスポゾン領域に存在する一対のトランスポゾン配列を認識して、トランスポゾン配列のＴＴＡＡ配列において、外来遺伝子ＤＮＡ配列を含む領域を切り取り、切り取られた外来遺伝子のＤＮＡを非ヒト哺乳動物（宿主）の細胞のゲノムＤＮＡにおけるＴＴＡＡ配列領域に挿入することにより、宿主細胞のゲノムＤＮＡに外来遺伝子を導入することができる。
【0019】
本発明において哺乳動物細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ等とともに、サル、マーモセット等の非ヒト霊長類動物、ヒトの細胞を例示することができる。
【0020】
また、安楽殺を防ぐことがコスト的にまた倫理的に強く要求されているという点で、非ヒト霊長類モデル動物の作出を目的として本発明のキットを用いる場合においては、上記哺乳動物細胞としては、テナガザル等のテナガザル科の霊長類、アカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル（Macaca fascicularis）等のオナガザル科に属する霊長類、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ピグミーマーモセット（Cebuella pygmaea)、ワタボウシパンシェ(Satuinus oedipus)、アカテタマリン（Sauinaus midas）、ゴールデンライオンタマリン（Leontopithecus rosalia）等のマーモセット科に属する霊長類、スローロリス(Nycticebus coucang)等のロリス科に属する霊長類などの霊長類動物を特に挙げることができるが、１歳半で性的に成熟し、１回の出産につき２～３匹の産子を取得でき、妊娠期間が平均１５０日で、授乳中も妊娠可能であるため年に２回の出産が可能であるマーモセット科の霊長類動物が好ましく、小型で育種が容易であるという点で、コモンマーモセットが特に好ましい。
【0021】
本発明における哺乳動物の細胞（宿主細胞）としては、本発明の効果を奏することができる細胞であれば特に制限されないが、一細胞である受精卵；かかる受精卵が１回以上体細胞分裂した２細胞期の胚、４細胞期の胚、８細胞期の胚、桑実胚及び／又は胚盤胞期等の初期胚；多能性幹細胞を好ましく挙げることができるが、モザイク胚の発生を防ぎ、単一胚から発生した疾患メカニズムの研究や創薬のための優れた疾患モデル動物を作出できる点で一細胞の、受精卵や多能性幹細胞が好ましい。
【0022】
上記一細胞である受精卵としては、精子が卵子内に進入し、精子の核と卵子の核が融合する受精より形成された、体細胞分裂により成長可能な一細胞を挙げることができ、さらに詳細には、体内受精後に体外へ採取（採卵）された体内受精による受精卵や、体外受精による受精卵や、これらの受精卵を凍結保存後解凍した受精卵を挙げることができる。
【0023】
上記多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、骨髄由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞等の間葉系幹細胞、さらには、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; ｉＰＳ細胞））を挙げることができ、通常、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）を例示することができるが、マーモセットでは、さらにＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８が必要であることも知られている。
【0024】
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとしては、鱗翅目（Lepidopteran）に属するイラクサギンウワバ（Trichopulsia ni）に感染する核多角体病ウイルス由来のトランスポゾンを挙げることができ、さらにその改変体を含めることができる。
【0025】
上記一対のトランスポゾン（ＴＲ）配列としては、ＴＴＡＡ配列を両端に有する、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する、５’末端側及び３’末端側に存在する一対のＩＴＲであれば特に制限されず、一対のトランスポゾン配列の一般式としては、５’末端側のトランスポゾン配列が、ＴＴＡＡに続くｎ個の塩基配列からなる相補的な二本鎖
５’－ＴＴＡＡＸ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－ＡＡＴＴＹ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’である場合に、
３’末端側のトランスポゾン配列は、以下のＴＴＡＡの上流のｍ個の塩基配列からなる相補的な二本鎖
５’－ＹｍＹｍ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１ＴＴＡＡ－３’
３’－ＸｍＸｍ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１ＡＡＴＴ－５’
（ただし、ｎ又はｍ個の塩基は、適当数の任意の塩基を挟んで存在することもでき、ｎ≠ｍ又はｎ＝ｍである）
として示すことができる。
５’－ＴＴＡＡＸ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－ＡＡＴＴＹ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’である場合に、
３’末端側のトランスポゾン配列は、以下のＴＴＡＡの上流のｍ個の塩基配列からなる相補的な二本鎖
５’－ＹｍＹｍ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１ＴＴＡＡ－３’
３’－ＸｍＸｍ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１ＡＡＴＴ－５’
（ただし、ｎ又はｍ個の塩基は、適当数の任意の塩基を挟んで存在することもでき、ｎ≠ｍ又はｎ＝ｍである）
として示すことができる。
【0026】
具体的なトランスポゾン配列としては、配列番号１に示される３１３塩基からなる５’末端側のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列（５’ＴＲ）や、配列番号２に示される２３５塩基からなる３’末端側のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列（３’ＴＲ）を例示することができる。各ＴＲ配列の詳細としては、５’ＴＲのＴＴＡＡの下流に位置する１３塩基のＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡ（配列番号３）のＩＴＲ及び３塩基挟んでさらにその下流に位置する１９塩基のＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ（配列番号４）のＩＴＲを含む配列と、３’ＴＲのＴＴＡＡの上流に位置する１３塩基ＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧ（配列番号５）のＩＴＲ及び３１塩基挟んでさらにその上流に位置する１９塩基のＣＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡ（配列番号６）のＩＴＲを含む配列を例示することができ、５’ＴＲと３’ＴＲとに挟まれているとが目的遺伝子が切り貼りされうるという、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズによるトランスポゾンの遺伝子導入作用を奏する配列である限りにおいて、上記例示された一対のトランスポゾン配列の一又は二以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含めることもできる。
【0027】
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域における、（ａ１）判定用プロモーターＤＮＡとしては、哺乳動物細胞で機能するプロモーターＤＮＡであれば特に制限されず、ＣＡＧ（ニワトリβアクチン）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ１α（エロンゲーションファクター１α）プロモーター等の哺乳動物細胞由来のプロモーターや、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター等のウイルスプロモーター、ＥＯＳ (Early Transposon promoter and Oct-4 (Pou5f1) and Sox2 enhancers)などを例示することができるが、ＣＡＧプロモーターやＣＭＶプロモーターが好ましい。
【0028】
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域における、（ａ２）判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとしては、前記（ａ１）のプロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記蛍光タンパク質としては、３９５ｎｍ前後の励起光を照射することにより緑色の蛍光を発するＧＦＰ、４８０～５００ｎｍ前後の励起光を照射することにより高感度緑色蛍光タンパク質を発するＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、５００～５３０ｎｍ前後の励起光を照射することにより黄色の蛍光を発するＹＦＰ、ＹＦＰの変異体であるＶｅｎｕｓ、５４０～５６０ｎｍ前後の励起光を照射することによりオレンジ色の蛍光を発するＫＯ１やＫＯ２等のＫＯ、４３０～４４０ｎｍ前後の励起光を照射することによりシアン色蛍光を発するＣｅｒｕｌｅａｎ等のＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）等を例示することができるが、遺伝子が発現している場合に長期間検出可能で、かつ胚発生を阻害しない点でＣｅｒｕｌｅａｎ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＫＯ等の蛍光タンパク質が好ましい。また、ルシフェラーゼ等の発光タンパク質も、ここでは便宜上、蛍光タンパク質に含めることができる。なお、ｈＫＯ（humanized Kusabira-Orange）は、マーモセットやマウス等においてもＫＯとしての効果を十分に奏することを本発明者らは確認している。
【0029】
本発明において、「作動可能に連結」とは、各ＤＮＡの配列が連続的に連結され、かつＤＮＡがタンパク質をコードしている場合、その読み枠が合っていることを意味し、各ＤＮＡの３’末端と、その下流のＤＮＡの５’末端とは、本発明の効果が得られる限り、直接連結していなくてもよいが、直接連結していることが好ましい。また、上記判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの下流に、ｍＲＮＡに安定性を付与し、翻訳を促進する作用を有するとされるポリＡ領域（ｐＡ）をさらに連結することもできる
【0030】
（Ａ）の外来遺伝子導入判定領域においては、さらに（ａ３）前記（ａ１）のプロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結しているタンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡ；をさらに含むことができる。タンパク質不安定化ペプチドの作用により、上記判定用蛍光タンパク質をより速く分解させることができる。
【0031】
本発明におけるタンパク質不安定化ペプチドとしては、標的とするタンパク質に融合することにより、かかるタンパク質の生体内における半減期を短縮する作用を有するペプチドであれば特に制限されず、かかる半減期を短縮する作用としては、標的とするタンパク質を含む融合タンパク質のペプチダーゼに対する感受性が高まり、標的とするタンパク質がペプチダーゼによってより速やかに分解されるため、結果として標的とするタンパク質の半減期を短縮させる作用を挙げることができる。かかるタンパク質不安定化ペプチドは、判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれにおいても融合することができ、リンカー配列などを介して融合することもできる。
【0032】
上記タンパク質不安定化ペプチドのアミノ酸配列としては、タンパク質分解シグナルとして作用するＰ；プロリン、Ｅ；グルタミン酸、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニンを多く含むＰＥＳＴ配列や、ウラシル透過酵素等短寿命タンパク質のＣ末端領域由来の配列、ＣＬ１配列を挙げることができる。具体的には配列番号７に示されるｄ２ＰＥＳＴ配列、配列番号８に示されるｄ４ＰＥＳＴ配列や、これらのペプチド配列の１又は２以上のアミノ酸が置換、付加、欠失若しくは挿入され、かつ前記ペプチドと実質的に同一のタンパク質不安定化活性を有するペプチド配列を例示することができる。ここで、ｄｎＰＥＳＴ配列の「ｄｎ」は、タンパク質分解時間を示し、ｎの値がより小さいとより早く分解することを示す。また蛍光タンパク質のＣ末端にＰＥＳＴドメインが存在するマウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）の一部を融合させて構築した不安定化蛍光タンパク質（クロンテック社製）等の市販品を用いることもできる。
【0033】
上記一対のトランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）外来タンパク質プロモーターＤＮＡとしては、哺乳動物細胞で機能するプロモーターＤＮＡ配列であれば特に制限されず、前記判定用プロモーターＤＮＡとして例示されたプロモーターを挙げることができ、プロモーター干渉によりいずれかのタンパク質の発現が顕著に低下するということがない限りにおいて、前記判定用プロモーターのＤＮＡと同一の配列を有するＤＮＡでも異なる配列を有するＤＮＡでもよい。
【0034】
上記一対のトランスポゾン配列間に配置された（ｂ３）外来タンパク質をコードするＤＮＡとしては、上記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記外来タンパク質としては、蛍光標識タンパク質のほか、宿主のインタクトな機能を変更することができる目的タンパク質を挙げることができ、外来タンパク質の構成としては、例えば、１）蛍光標識タンパク質、２）蛍光標識タンパク質と１又は２以上の目的タンパク質、３）１又は２以上の目的タンパク質等を含む構成を例示することができる。
【0035】
上記目的タンパク質の遺伝子としては、上記蛍光タンパク質以外のタンパク質であって、パーキンソン病の原因遺伝子とされる変異型αシヌクレイン遺伝子やＬＲＲＫ２（Homo sapiens leucine rich repeat kinase 2）の変異遺伝子、ＣＦＣ症候群原因遺伝子ＢＲＡＦの変異遺伝子、神経原性筋萎縮症の原因とされるＣａ非依存性グループ６ホスホリパーゼＡ２（Ｐｌａ２ｇ６）をコードするＤＮＡの変異遺伝子等遺伝子が過剰発現することが疾病の起因となる遺伝子や、ハンチントン病の原因遺伝子であるＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子、若年性成人発症型糖尿病の原因遺伝子であるＨＮＦ１αＰ２９１ｆｓｉｎｓＣ、レギュカルチンタンパク質等を例示することができる。
【0036】
上記ＬＲＲＫ２の遺伝子としては、NCBI Reference Sequence: NM_198578.3に示されるHomo sapiens leucine rich repeat kinase 2, mRNAの９２３９ｂｐの塩基配列で表すことができる遺伝子を例示することができる。
【0037】
上記ＬＲＲＫ２の変異遺伝子としては、ＬＲＲＫ２をコードするＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部が欠損、他の塩基配列が挿入又は他の塩基配列と置換等することによりＬＲＲＫ２が不活化されたパーキンソン病の原因となる遺伝子を挙げることができ、具体的には、ＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基に置換されている変異タンパク質をコードする変異遺伝子（配列番号９）を挙げることができる。
【0038】
かかる変異遺伝子を宿主の非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡに導入することにより、パーキンソン病モデル非ヒト哺乳動物を作出することができる。
【0039】
上記外来タンパク質プロモーターＤＮＡとしては、前記判定用プロモーターＤＮＡにおいて例示されたプロモーターを挙げることができる。また、非ヒト哺乳動物を作出する場合においては、前記ＥＯＳ等、胚では機能するが、成体では機能しなくなるプロモーターＤＮＡ１の下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質をコードするＤＮＡ（第一発現カセット）と、成体で機能するプロモーターＤＮＡ２の下流に作動可能に連結された目的タンパク質を含む外来遺伝子ＤＮＡ（第二発現カセット）を備えるトランスポゾン領域の構成とすると、胚においては蛍光標識タンパク質が発現している細胞を選択することができ、かつ、成体においては、蛍光標識タンパク質が発現しない非ヒト哺乳動物を作出できる点で優れている。
【0040】
上記蛍光標識タンパク質としては、前記判定用蛍光タンパク質において例示されている蛍光タンパク質から選択することができるが、判定用蛍光タンパク質における判定が効率的にまた迅速に行われるために、目視により又はＦＡＣＳ等の手段により蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質とを区別することができるように、判定用蛍光タンパク質が発する蛍光の波長とは異なる波長を発する蛍光標識タンパク質であることが必要であり、上記判定用蛍光タンパク質の色と補色の関係又は補色に近い関係にある色の蛍光タンパク質を蛍光標識タンパク質として選択して、蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質の好ましい組合せとして用いると、より容易に蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質とを目視にて区別することができる点で好ましい。
【0041】
上記蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質の具体的な組合せとしては、緑色の蛍光を発するＥＧＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、緑色の蛍光を発するＧＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、オレンジの蛍光を発するクサビラオレンジと緑色の蛍光を発するＥＧＦＰ、オレンジの蛍光を発するクサビラオレンジと緑色の蛍光を発するＧＦＰ、黄色の蛍光を発するＹＦＰとシアン蛍光を発するＣＦＰ、シアン色蛍光を発するＣＦＰと黄色の蛍光を発するＹＦＰ、シアン系蛍光を発するＣＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、オレンジの蛍光を示すクサビラオレンジとシアン系蛍光を発するＣＦＰ等の組合せ、また、これらの蛍光タンパク質と発光タンパク質ルシフェラーゼなどの各組合せを例示することができる。
【0042】
本発明における外来遺伝子含有ベクターの構成としては、例えばＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモータ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲ（図１（ａ））を含む構成を挙げることができるが、本発明における効果を奏する限りにおいて制限されず、他に例えば、ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモーター－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲ（図１（ｂ））や、ＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモーター－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲやＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲ、ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＡＧプロモーター－目的タンパク質をコードするＤＮＡ－２Ａ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲや、ＣＭＶ１プロモーター－Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ｈｇｐｒ５６－ｅＧＦＰ－ルシフェラーゼ－Ｉｎｓ－ＥＯＳ－ｈＫＯ１－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲを含むベクターを挙げることができる。
【0043】
本発明におけるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ（タンパク質）そのものの他、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列を含む環状又は直鎖状のベクターや、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ（ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡ）やｃＤＮＡ等のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現物を便宜上含めることができるが、発現がより早いことを期待でき、また、トランスポゼーズ自体がゲノムに組み込まれることは好ましくないため、一過性の発現のみで留めることが望まれる点で、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡを好適に挙げることができる。
【0044】
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現物を調製する方法としては、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡを含む環状ベクターを従来公知の方法により調製する方法や、かかる環状ベクターを適当な制限酵素を用いて直鎖状ベクターとして調製する方法や、かかる環状ベクター又は直鎖状ベクターを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズのコード領域を含むｍＲＮＡを作製する方法、又は大腸菌等によりタンパク質として発現させることにより組換ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズを調製する方法を例示することができる。
【0045】
本発明におけるトランスポゾンを用いる哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡへの外来遺伝子導入の態様は、ランダム挿入変異誘発系であり、受精卵の雄性前核もしくは受精卵の雌性前核又は受精卵細胞質に本発明におけるベクターキットを注入することにより、ヘミ接合体変異を創出することができる。
【0046】
本発明において、外来遺伝子導入細胞を選択する方法としては、以下の（イ）～（ニ）の工程を備える方法を例示することができ、かかる方法は、上記本発明の外来遺伝子導入用ベクターキットを用いて行うことが好ましい。
（イ）外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択する工程；
上記外来遺伝子導入細胞を選択する方法は、外来遺伝子導入細胞の選択確率を向上させる方法でもある。
（イ）外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択する工程；
上記外来遺伝子導入細胞を選択する方法は、外来遺伝子導入細胞の選択確率を向上させる方法でもある。
【0047】
上記（イ）の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程において、上記外来遺伝子導入用ベクターを作製する方法としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、Gatewayクローニングシステムを用いることができる。Gatewayクローニングシステムは、λファージが大腸菌染色体へ侵入する際に関与する部位特異的組換えシステムに基づくものであり、Gatewayシグナル（ａｔｔ）を用いることによって、発現ベクターの構築を容易にしたものである。ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２配列を有するドナーベクターと目的遺伝子の両端にａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２配列を付加したものとの間で反応（ＢＰ反応）させることにより、目的遺伝子が組み込まれたエントリーベクター（両端にａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２配列を有する）を作製し、次いで、このエントリーベクターと発現に必要なプロモーターが組み込まれたデスティネーションベクター（ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２配列を付加）と組みかえ反応（ＬＲ反応）することにより、目的遺伝子が挿入されたベクター（発現ベクター）を作製する方法である。具体的には、例えば、Add gene社より購入したトランスポゾン領域の入ったデスティネーションベクターであるＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖを用いることができ、また、ＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖにおけるプロモーターを改変し、及び／又は、Gateway部分を変更したベクターを使用することができる。また、Medical Research Council国立研究所（ＵＫ）が供給するＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いてＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖとプロモーターとＧＦＰが入っているエントリーベクターを作製することも可能である。また、胚の発生能を低下させることのないベクターを用いて作製する方法が好ましい。
【0048】
上記（ロ）の哺乳類動物の細胞を調製する工程において、従前公知の方法を用いて前記哺乳動物の細胞を調製することができ、非ヒト霊長類動物については、体外受精の方法や受精卵の採取の方法として、特開２０１２－１２５４１０やＷＯ２００９／０９６１０１に記載されている方法を例示することができる。
【0049】
上記（ハ）の細胞に外来遺伝子導入用ベクターと上記トランスポゼーズを注入する工程において、細胞に、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとともに注入する方法としては、外来遺伝子を細胞のゲノムに導入できる方法であれば特に制限されないが、例えば、外来遺伝子含有ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターもしくはトランスポゼーズベクターを鋳型として作製したｍＲＮＡと、ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Thermo Scientific社製）もしくは生理食塩水とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてリポフェクションする；マイクロインジェクションにより注入する；エレクトロポレーションする；等の方法を挙げることができ、細胞にベクターを注入する場合は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとをｏｐｔｉ－ＭＥＭ溶液を用いてリポフェクションする方法を好ましく挙げることができ、受精卵に注入する場合は、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡとを生理食塩水を用いてマイクロインジェクションする方法を好適に挙げることができ、ニューロスフィアに注入する場合は、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡとをエレクトロポレーションする方法を好適に挙げることができる。
【0050】
上記外来遺伝子含有ベクターを上記トランスポゼーズとともに注入する上記細胞の個所としては、本発明の効果を奏することができる部位であれば特に制限されないが、モザイク胚の発生を最小限とするために一細胞期の受精卵の雄性前核、雌性前核、細胞質等に注入することが好ましく、マイクロインジェクションの場合は、雄性前核が雌性前核と比較してより大きいため注入しやすいという操作性の点で、雄性前核注入を好適に挙げることができる。雄性前核とは、受精卵で形成される精子由来の核であって、受精卵の端部で形成された後、受精卵の中心部へ移動し、雌性前核と融合して、子の核が作られる。上記溶液の注入量としては、受精卵中の上記注入部位の体積を満たす程度であればよく、例えばマーモセットの受精卵中の注入個所が雄性前核である場合、１～１０ｐＬが好ましく、２～８ｐＬがより好ましく、３～７ｐＬがさらに好ましく、４～６ｐＬが特に好ましい。また、マイクロインジェクションにより細胞質に注入した場合でもトランスポゼーズの作用により外来遺伝子をゲノムＤＮＡへ導入することが可能であるため、前核が小さく注入が難しいマーモセット等の霊長類などには細胞質注入が有効である。
【0051】
上記（ニ）の外来遺伝子が導入された細胞を選択する工程としては、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を選択する工程であれば特に制限されず、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞としては、細胞内に注入された外来遺伝子含有ベクターのトランスポゾン配列をトランスポゼーズが認識して切り取ることにより、トランスポゾン領域が宿主細胞のゲノムＤＮＡに挿入される一方、挿入されなかった外来遺伝子導入判定領域における判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの発現による蛍光強度が、トランスポゼーズにより切り取られなかったベクターにおける判定用蛍光タンパク質の蛍光強度と比較して顕著に小さくなることを挙げることができる。具体的には、ヒト２９３Ｔ細胞の場合は、トランスポゾン領域が宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後５日目までは判定用蛍光タンパク質が発現し、１５日目までに徐々に減衰するのに対し、宿主細胞に導入されたときは、ベクター注入後５日目までに判定用蛍光タンパク質の蛍光がほぼ消滅する。また、マウス受精卵の場合は、トランスポゾン領域が宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後胚盤胞の段階に至る４日目から５日目まで判定用蛍光タンパク質が発現するのに対し、宿主細胞に導入されたときはベクター注入後１日目（２４時間）までに判定用蛍光タンパク質の蛍光が、蛍光顕微鏡を用いた目視において確認できなくなる。霊長類の受精卵の場合は、宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後胚盤胞の段階に至る１０日目まで判定用蛍光タンパク質が発現し、宿主細胞のゲノムに導入されたときはベクター注入後１日目（２４時間）までに判定用蛍光タンパク質の蛍光が、蛍光顕微鏡を用いた目視において確認できなくなる。したがって、外来遺伝子の導入を行った場合、判定用蛍光タンパク質の蛍光が、ベクター注入後７２時間以降、好ましくは４８時間以降、より好ましくは３６時間以降、さらに好ましくは２４時間以降等、早期に消失した細胞が、外来遺伝子導入が行われた細胞であると判定することができる。しかし、かかる判定用蛍光タンパク質の蛍光の減衰速度の加速化についてのメカニズムについてはいまだ明らかになっていない。
【0052】
上記（ニ）の外来遺伝子が導入された細胞を選択する工程において、外来遺伝子が上記蛍光標識タンパク質を含む場合には、外来遺伝子が宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞においては細胞の増殖に伴い蛍光標識タンパク質による蛍光が徐々に強くなる一方で、判定用蛍光タンパク質の蛍光は急速に減衰する。他方、外来遺伝子が宿主細胞に導入されない場合は、判定用蛍光タンパク質と蛍光標識タンパク質は暫時蛍光が持続するが、二種類の蛍光が増強することはなく徐々に減衰し、やがて消滅する。したがって、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞を選択することにより、蛍光標識タンパク質のみを使用する場合よりも、本発明の判定用蛍光タンパク質外来遺伝子を併用する本発明のキットを用いて遺伝子の導入を行う方が、外来遺伝子が導入された細胞の選択率は顕著に高くなる。
【0053】
上記蛍光強度の具体的な判定方法としては、蛍光顕微鏡による目視やＦＡＣＳによるフローサイトメトリー解析により行うことができる。目視の場合は、倒立型蛍光顕微鏡により、例えば、感度４００露光時間・１秒、又はこれと同等の効果を有する条件で観察した場合に、目視で蛍光が認められると判断することができる。
【0054】
前記非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法としては、採取した受精卵を子宮に戻し産子を取得する方法であれば特に制限されず、マウスの場合はゲノムＤＮＡに外来遺伝子が導入されたと判断される受精卵を、非ヒト哺乳類動物仮母として、偽妊娠マウス等の仮親マウスの卵管や子宮へ移植し、出産直前に帝王切開又は自然分娩を行い、新生子マウスを得、さらに里子操作を行うことにより、トランスジェニックマウスを得る方法を例示することができる。また、非ヒト霊長類動物の場合は、例えば、特開２０１２－１２５４１０やＷＯ２００９／０９６１０１に記載されている方法により体内に受精卵を戻し、トランスジェニックマーモセット等のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を得ることができる。
【0055】
トランスジェニックマーモセットの作出においては、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズを体外受精後１５～２時間のマーモセット受精卵の細胞質にマイクロインジェクションした後、マイクロインジェクション後４－５日（９６～１２０時間）目に６細胞期から１６細胞期まで発生した胚のうち、判定領域の蛍光タンパク質の蛍光が急速に（例えばマイクロインジェクション後２４時間までに）減衰し、蛍光標識タンパク質の発現が安定している細胞を仮親へ移植することが好ましい。
【0056】
上記非ヒト霊長類ランスジェニック動物細胞に、外来遺伝子が導入されているかどうかは、例えば、各外来タンパク質をコードするＤＮＡに対応するプライマーセットを用いてＰＣＲ法により、確認することができる。
【0057】
外来遺伝子が導入されたトランスジェニック動物について後代検定を行うことにより、外来タンパク質の発現が確認された非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を得ることができ、かかる動物から生殖能及び／又は受精能を有する非ヒト哺乳類トランスジェニック動物細胞を得ることができる。
【0058】
前記外来遺伝子導入細胞を選択する方法により選択された外来遺伝子導入細胞は、導入された外来遺伝子に因る疾病を改善するための薬剤をスクリーニングするためのスクリーニング用細胞として使用することもできる。
【0059】
例えば、外来遺伝子としてＬＲＲＫ２の変異遺伝子を導入した外来遺伝子導入細胞は、パーキンソン病の治療薬をスクリーニングするための細胞として用いることができる。例えば、ＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基となる変異により、ＬＲＲＫ２のもつセリン／スレオニンリン酸化活性が過剰にはたらくことでパーキンソン病の原因となっていることが示されており、かかるＬＲＲＫ２変異をもつ神経幹細胞では継代に依存してさまざまな基質が過剰にリン酸化されて、核膜の変形など表現型の原因になっている可能性があるとされている。したがって、継代を重ねた上記ＬＲＲＫ２変異を有する神経幹細胞であって、核膜の変形など表現型がある細胞について、被検物質を培地に添加することにより核膜の変形がレスキューされた場合に、当該被検物質をパーキンソン病治療薬の候補物質としてピックアップすることができる。
【0060】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【0061】
［実施例１］
［ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞への外来遺伝子導入］
ＫＯ／ＥＧＦＰ－ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクター（Medical Research Council(UK)社製）とを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入することを試みた。なお、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３細胞にＳＶ４０Ｔが導入された細胞である。
［ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞への外来遺伝子導入］
ＫＯ／ＥＧＦＰ－ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクター（Medical Research Council(UK)社製）とを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入することを試みた。なお、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３細胞にＳＶ４０Ｔが導入された細胞である。
【0062】
（ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞の調製）
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（Riken BioResource Center 社製）を１０％加熱不活化ウシ胎児血清と１％の抗真菌性抗生物質溶液（antibiotic-antimycotic solution）とを添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中において増殖させた。
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（Riken BioResource Center 社製）を１０％加熱不活化ウシ胎児血清と１％の抗真菌性抗生物質溶液（antibiotic-antimycotic solution）とを添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中において増殖させた。
【0063】
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの作製］
（外来遺伝子導入判定領域の調製）
判定用プロモーターＤＮＡとして、配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；さらにもう一度配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；をコードするＤＮＡ；及び配列番号１２に示されるポリＡのＤＮＡ配列；を順次連結することにより上記外来遺伝子導入判定領域とした。
（外来遺伝子導入判定領域の調製）
判定用プロモーターＤＮＡとして、配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；さらにもう一度配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；をコードするＤＮＡ；及び配列番号１２に示されるポリＡのＤＮＡ配列；を順次連結することにより上記外来遺伝子導入判定領域とした。
【0064】
上記ＰＥＳＴ配列の必要性については２９３Ｔ細胞を用いて事前検討を行った。外来遺伝子導入判定領域の判定用蛍光タンパク質としてＫＯを用い、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域の蛍光標識タンパク質としてＧＦＰを用いた場合、ＰＥＳＴ配列がないとＫＯの蛍光が強いまま、ＧＦＰのフィルターに漏れこみ、判定が困難になる場合があることを確認した。用いるプロモーターの種類により、ＧＦＰの発現強度が違うため、各種ベクター毎にＫＯｄ４ＰＥＳＴ又はＫＯｄ２ＰＥＳＴを選択することが好ましいことを確認している（データ示さず）。以下の検討では、ＫＯｄ２ＰＥＳＴを用いて行うこととした。
【0065】
（ＰＢトランスポゾン領域の調製）
次いで、Ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾンの５’末端のＤＮＡ配列であるＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）と、ＰＢトランスポゾンの３’末端のＤＮＡ配列ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）とが、一対の逆向き反復配列を構成しているＰＢトランスポゾン領域を含む環状ベクターを作製した。
次いで、Ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾンの５’末端のＤＮＡ配列であるＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）と、ＰＢトランスポゾンの３’末端のＤＮＡ配列ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）とが、一対の逆向き反復配列を構成しているＰＢトランスポゾン領域を含む環状ベクターを作製した。
【0066】
上記ＰＢトランスポゾン領域内の非ヒト霊長類動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡとして、配列番号１３に示されるＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ；上記ＣＭＶ２プロモーターの下流に作動可能に連結された外来タンパク質をコードするＤＮＡとして配列番号１４に示されるＥＧＦＰ遺伝子をコードするＤＮＡ；及び配列番号１２に示されるポリＡのＤＮＡ配列；を用いることにより、ＰＢ５’ＴＲＤＮＡ、ＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ、ポリＡＤＮＡ、ＰＢ３’ＴＲＤＮＡ、を５’末端から順次含むＥＧＦＰ含有ＰＢトランスポゾン領域とした。
【0067】
（ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの構成）
ＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖにおけるプロモーターを改変したディスティネーションベクターをバックボーンとして、ＣＭＶ－ｈＫＯとＣＭＶ－ＧＦＰ（エントリーベクターにのったもの）を挿入した ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶ２プロモーター－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクター（配列番号１６）の具体的な構成は、以下のとおりである。
ＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖにおけるプロモーターを改変したディスティネーションベクターをバックボーンとして、ＣＭＶ－ｈＫＯとＣＭＶ－ＧＦＰ（エントリーベクターにのったもの）を挿入した ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶ２プロモーター－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクター（配列番号１６）の具体的な構成は、以下のとおりである。
【0068】
判定用のＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ配列（配列番号１０）：
配列番号１６の第１９７８番から第２５６６番、及び第３５５１番から第４１３９番までの塩基配列；
ｈＫＯ１（配列番号１１）：
配列番号１６の第２５８４番から第３２３７番、及び第４１５７番から第４８１０番までの塩基配列；
ｄ２ＰＥＳＴ（配列番号７）：
配列番号１６の第３２４４番から第３３６７番、及び第４８１７番から第４９４０番までの塩基配列；
ポリＡ（配列番号１２）：
配列番号１６の第３３７１番から第３４９１番、及び第４９４４番から第５０６４番までの塩基配列；
ＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）：
配列番号１６の第５１９４番から第５５０６番までの塩基配列；
ＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ（配列番号１３）：
配列番号１６の第５５７２番から第６１００番までの塩基配列；
ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）：
配列番号１６の第６１２４番から第６８４１番までの塩基配列；
ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）：
配列番号１６の第７６０６番から第７８４０番までの塩基配列；
配列番号１６の第１９７８番から第２５６６番、及び第３５５１番から第４１３９番までの塩基配列；
ｈＫＯ１（配列番号１１）：
配列番号１６の第２５８４番から第３２３７番、及び第４１５７番から第４８１０番までの塩基配列；
ｄ２ＰＥＳＴ（配列番号７）：
配列番号１６の第３２４４番から第３３６７番、及び第４８１７番から第４９４０番までの塩基配列；
ポリＡ（配列番号１２）：
配列番号１６の第３３７１番から第３４９１番、及び第４９４４番から第５０６４番までの塩基配列；
ＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）：
配列番号１６の第５１９４番から第５５０６番までの塩基配列；
ＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ（配列番号１３）：
配列番号１６の第５５７２番から第６１００番までの塩基配列；
ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）：
配列番号１６の第６１２４番から第６８４１番までの塩基配列；
ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）：
配列番号１６の第７６０６番から第７８４０番までの塩基配列；
【0069】
（ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターの作製）
上記ＰＢトランスポゾン領域における一対の逆向き反復配列を認識するトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターをMedical Research Council (UK)から購入した。かかるベクターには、ＣＭＶ３プロモーターＤＮＡ配列（配列番号１７）の下流に、上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列として、Yusa et al, PNAS 2011に記載があり、Medical Research Council国立研究所（ＵＫ）が供給するＨｙＰＢａｓｅ（hyperactive piggybac transposase）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）、及びポリＡ（配列番号１２）が組み込まれている。
上記ＰＢトランスポゾン領域における一対の逆向き反復配列を認識するトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターをMedical Research Council (UK)から購入した。かかるベクターには、ＣＭＶ３プロモーターＤＮＡ配列（配列番号１７）の下流に、上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列として、Yusa et al, PNAS 2011に記載があり、Medical Research Council国立研究所（ＵＫ）が供給するＨｙＰＢａｓｅ（hyperactive piggybac transposase）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）、及びポリＡ（配列番号１２）が組み込まれている。
【0070】
（２９３Ｔ細胞へのコトランスフェクション）
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、合計１μｇ／ｍｌを上記２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした（Ｄａｙ０）。ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をネガティブコントロールとした。トランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてＫＯ１とＧＦＰを、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７１型、オリンパス社製；カメラＤＰ７３ 感度４００露光時間・１秒）で経時的に観察した。結果を図２の（ａ１）及び（ｂ１）に示す。ＥＧＦＰとｈＫＯ１のＦＡＣＳ解析も行った。結果を図２の（ａ２）及び（ｂ２）に示す。
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、合計１μｇ／ｍｌを上記２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした（Ｄａｙ０）。ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をネガティブコントロールとした。トランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてＫＯ１とＧＦＰを、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７１型、オリンパス社製；カメラＤＰ７３ 感度４００露光時間・１秒）で経時的に観察した。結果を図２の（ａ１）及び（ｂ１）に示す。ＥＧＦＰとｈＫＯ１のＦＡＣＳ解析も行った。結果を図２の（ａ２）及び（ｂ２）に示す。
【0071】
（結果）
図２（ａ１）及び（ａ２）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰ（緑）とｈＫＯ１（オレンジ）の発現が開始された。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の両方が強く発現していることが、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の蛍光の目視観察（ａ１）及びＦＡＣＳ解析（ａ２）から確認できる。しかし、Ｄａｙ１５では、ＥＧＦＰによる蛍光とｈＫＯ１による蛍光のいずれもがほとんど消滅した。
図２（ａ１）及び（ａ２）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰ（緑）とｈＫＯ１（オレンジ）の発現が開始された。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の両方が強く発現していることが、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の蛍光の目視観察（ａ１）及びＦＡＣＳ解析（ａ２）から確認できる。しかし、Ｄａｙ１５では、ＥＧＦＰによる蛍光とｈＫＯ１による蛍光のいずれもがほとんど消滅した。
【0072】
したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターが添加されず、トランスポゾン含有環状ベクターにおいて、トランスポゾン領域が切り出されない場合は、ＥＧＦＰとＫＯが共発現する状態が少なくともＤａｙ５までは続くこと、その後Ｄａｙ１５までには、ｈＫＯ１、ＥＧＦＰいずれの発現も消失することが確認された。図２（ａ２）のＦＡＣＳデータから明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターを添加しなかった細胞においては、ＥＧＦＰが導入された細胞は、ほぼなかった。２９３Ｔ細胞はランダムインテグレーションしやすいので、ＥＧＦＰもしくはｈＫＯ１のみ導入される細胞が存在する可能性があるが、その可能性を加味しても、ＥＧＦＰが導入された細胞はなかったといえる。
【0073】
一方、図２（ｂ１）及び（ｂ２）から明らかなとおり、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとをコトランスフェクトした細胞（ｂ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が観察できるが、Ｄａｙ５では、上記（ａ）細胞と比較して、ＧＦＰの緑色蛍光が強く、ＫＯ１のオレンジ色蛍光の強度は小さいことから、ＥＧＦＰのみが発現している細胞が存在することと、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方を発現している細胞とが混在していることが確認された。したがって、トランスポゼーズの作用によりＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＧＦＰの発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＫＯ１の発現は５日目ごろまでに急速に減衰することが確認された。Ｄａｙ１５においては、ＫＯ１の蛍光は観察されずＥＧＦＰのみが発現している細胞が多く観察され、ＥＧＦＰを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
【0074】
［実施例２］
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウス胚のゲノムＤＮＡへ挿入することを試みた。外来遺伝子含有ベクターとして、配列番号１６の第４１２番目と８０６５番目の塩基をＦｓｐＩで制限酵素処理することにより切断し、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを直鎖状にしたＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いた。また、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現ベクタ－を直鎖状にしたものを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡを作製した。
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウス胚のゲノムＤＮＡへ挿入することを試みた。外来遺伝子含有ベクターとして、配列番号１６の第４１２番目と８０６５番目の塩基をＦｓｐＩで制限酵素処理することにより切断し、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを直鎖状にしたＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いた。また、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現ベクタ－を直鎖状にしたものを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡを作製した。
【0075】
（マウス胚におけるトランスポゼーズの有無についての検討）
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとを、マイクロマニピュレータ（Leica社）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした場合の倒立型蛍光顕微鏡による観察の結果を図３（ａ）に示す。また、上記直鎖ベクターをマイクロインジェクションしたが、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡをマイクロインジェクションしなかった場合についても図３（ｂ）に示す。図３（ｃ）では、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されたと推定される細胞について、マイクロインジェクション後２４、４８、７２、９６時間後の細胞の様子を示す。なお、図中〇印のＮＣは、マイクロインジェクションを行っていない、ネガティブコントロールである。
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとを、マイクロマニピュレータ（Leica社）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした場合の倒立型蛍光顕微鏡による観察の結果を図３（ａ）に示す。また、上記直鎖ベクターをマイクロインジェクションしたが、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡをマイクロインジェクションしなかった場合についても図３（ｂ）に示す。図３（ｃ）では、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されたと推定される細胞について、マイクロインジェクション後２４、４８、７２、９６時間後の細胞の様子を示す。なお、図中〇印のＮＣは、マイクロインジェクションを行っていない、ネガティブコントロールである。
【0076】
（結果）
図３（ａ）及び（ｃ）から明らかなとおり、トランスポゾン機構が作用して、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された細胞（図３（ａ）の四角白矢印で示した緑色の細胞）においては、ＥＧＦＰの緑色蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始めたのに対し、ＫＯ１（オレンジ）は初めからほとんど発現することなかった。ＥＧＦＰ単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図３（ｃ））。したがって、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された場合、ゲノムＤＮＡに挿入されなかったＫＯ１は、ｄ２ｐｅｓｔの作用により予想されるＫＯ１の不安定化よりも急速に不活化されることが予想された。一方、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されなかった場合、ＥＧＦＰとＫＯ１は、Ｄａｙ４まで共発現していた（図３（ｂ））。
図３（ａ）及び（ｃ）から明らかなとおり、トランスポゾン機構が作用して、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された細胞（図３（ａ）の四角白矢印で示した緑色の細胞）においては、ＥＧＦＰの緑色蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始めたのに対し、ＫＯ１（オレンジ）は初めからほとんど発現することなかった。ＥＧＦＰ単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図３（ｃ））。したがって、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された場合、ゲノムＤＮＡに挿入されなかったＫＯ１は、ｄ２ｐｅｓｔの作用により予想されるＫＯ１の不安定化よりも急速に不活化されることが予想された。一方、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されなかった場合、ＥＧＦＰとＫＯ１は、Ｄａｙ４まで共発現していた（図３（ｂ））。
【0077】
したがって、はじめからＫＯ１が発現しない、又はマイクロインジェクション後７２時間までにＫＯ１が発現しなくなった胚において、目的遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入された可能性が大きいと考えることができた。
【0078】
［実施例３］
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
上記直鎖ベクターを用いた検討において、予想よりも胚発生率が低かったため、トランスポゾン含有直鎖ベクターよりも胚毒性が低いといわれているトランスポゾン環状ベクターを用いてマウス胚へのマイクロインジェクションを試みた。
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
上記直鎖ベクターを用いた検討において、予想よりも胚発生率が低かったため、トランスポゾン含有直鎖ベクターよりも胚毒性が低いといわれているトランスポゾン環状ベクターを用いてマウス胚へのマイクロインジェクションを試みた。
【0079】
ＥＧＦＰをコードするＤＮＡの、マウス胚のゲノムＤＮＡへの導入を試みた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来受精卵５１個について、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクター２ｎｇ／μＬと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ１ｎｇ／μＬとを、生理食塩水で溶解し、マウス胚雄性前核にマイクロインジェクションした。また、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来受精卵４９個について、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクター２ｎｇ／μＬと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ１ｎｇ／μＬとを生理食塩水で溶解し、マウス胚雄性前核にマイクロインジェクションした。結果を図４（ａ）（直鎖ベクターの場合）及び（ｂ）（環状ベクターの場合）に示す。
【0080】
図４（ａ）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いた場合には、緑色やオレンジ色の蛍光の発現が早く強く確認でき、蛍光を発現した胚は４３個中４２個と高い割合であった。しかし、オレンジを発現した胚が２１個と多く、さらに胚盤胞（９６時間）まで発生が進んだ胚は４個のみであった。図４（ａ）の９６ｈの図から明らかなとおり、胚盤胞まで発生が進んだ胚４個のうち、ＧＦＰの蛍光があり、ＫＯの蛍光はなかった胚は２個であり、かかる２個の胚において、目的のＧＦＰ遺伝子が細胞の遺伝子に導入されたと判断した。なお、他の２個については、ＧＦＰ、ＫＯいずれの蛍光もなかった。赤丸はネガティブコントロール（ＮＣ）である。一方、図４（ｂ）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いた場合には、蛍光発現が確認できる時期が遅くなり、かつ発現量が小さくなるものの、胚盤胞に達した胚は、９６時間で４１個中１４個であり、胚盤胞率が高くなった。また、ＥＧＦＰの緑色光を発現し、ＫＯの発現が見られない胚は３１個であり、ＥＧＦＰの発現率はやや低くなるものの、ＫＯの発現は全く見られなかった。
【0081】
以上の結果より、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いると、蛍光発現が確認できる時期が遅くなり、かつ発現量が小さくなるが、胚毒性が低く、かつＥＧＦＰのゲノムＤＮＡへの導入率が高くなったので、環状ベクターを用いることが好ましいと判断した。
【0082】
［実施例４］
（トランスジェニックマウスの作製）
マウスの受精卵にマイクロインジェクション法により上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡとを注入することによりトランスジェニックマウスを作製した。受精卵としては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスとＣ３Ｈ系マウスとの交配によって得られるＢ６Ｃ３系統の交雑系マウスＢ６Ｃ３Ｆ１受精卵を用いた。上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ（濃度比２：１）を受精後１０時間の受精卵の雄性前核もしくは細胞質に注入し、胚盤胞までマウス体外培養用培地であるｍＷＭ培地（アークリソース株式会社製）中で３７℃のインキュベーターで培養した。胚盤胞まで発生が進んだ各胚について倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、緑色蛍光のみが観察された胚を選別して（color selection＋）、もしくは蛍光発現による選別をせずに（color selection－）、非ヒト哺乳類動物仮母として、偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮に移植し、自然分娩もしくは帝王切開により新生子マウスを取得した。新生子マウスは、里子操作を行うことにより、離乳期（weaning）まで産子を育てた。
（トランスジェニックマウスの作製）
マウスの受精卵にマイクロインジェクション法により上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡとを注入することによりトランスジェニックマウスを作製した。受精卵としては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスとＣ３Ｈ系マウスとの交配によって得られるＢ６Ｃ３系統の交雑系マウスＢ６Ｃ３Ｆ１受精卵を用いた。上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ（濃度比２：１）を受精後１０時間の受精卵の雄性前核もしくは細胞質に注入し、胚盤胞までマウス体外培養用培地であるｍＷＭ培地（アークリソース株式会社製）中で３７℃のインキュベーターで培養した。胚盤胞まで発生が進んだ各胚について倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、緑色蛍光のみが観察された胚を選別して（color selection＋）、もしくは蛍光発現による選別をせずに（color selection－）、非ヒト哺乳類動物仮母として、偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮に移植し、自然分娩もしくは帝王切開により新生子マウスを取得した。新生子マウスは、里子操作を行うことにより、離乳期（weaning）まで産子を育てた。
【0083】
出生後２～３週間の間に、上記産子の尻尾を５ｍｍほど切り取り、マウスゲノムＤＮＡを抽出した。ＥＧＦＰ又はＫＯを特異的に検出することができる、以下に示す各プライマーセットを用いてＰＣＲ法によりトランスジェニックマウスの獲得率を調査した。結果を以下の表１に示す。
【0084】
ＥＧＦＰ：
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（フォワードプライマー）（配列番号１９）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２０）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（フォワードプライマー）（配列番号２１）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２２）
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（フォワードプライマー）（配列番号１９）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２０）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（フォワードプライマー）（配列番号２１）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２２）
【0085】
【表1】
【0086】
（結果１－Ｎｕｃｌｅａｒ １ｎｇ／μＬ・蛍光確認あり（＋））
９２個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核に５ｐＬマイクロインジェクションした胚盤胞（９６時間）に達した胚６６個（７５．０％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、５５個（８３．３％）であった。そのうち３９個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は５匹であり、離乳した産子は３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰを発現していた。しかしながら、そのうち１匹は、ＫＯについても発現していた。これは、ランダムインテグレーションが理由であると考えられる。以上より胚盤胞（９６時間）にＥＧＦＰによる蛍光が確認された胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
９２個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核に５ｐＬマイクロインジェクションした胚盤胞（９６時間）に達した胚６６個（７５．０％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、５５個（８３．３％）であった。そのうち３９個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は５匹であり、離乳した産子は３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰを発現していた。しかしながら、そのうち１匹は、ＫＯについても発現していた。これは、ランダムインテグレーションが理由であると考えられる。以上より胚盤胞（９６時間）にＥＧＦＰによる蛍光が確認された胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
【0087】
（結果２－Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ３ｎｇ／μＬ・蛍光確認あり（＋））
９５個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核期の細胞質に５ｐＬマイクロインジェクションした。胚盤胞（９６時間）に達した胚６４個（８５．３％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、２７個（４２．２％）であった。そのうち２６個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は３匹であり、離乳した産子も３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰが発現していたが、ＫＯの発現は認められなかった。したがって、ＥＧＦＰによる蛍光が確認され、かつＫＯの発現は認められなかった胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
９５個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核期の細胞質に５ｐＬマイクロインジェクションした。胚盤胞（９６時間）に達した胚６４個（８５．３％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、２７個（４２．２％）であった。そのうち２６個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は３匹であり、離乳した産子も３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰが発現していたが、ＫＯの発現は認められなかった。したがって、ＥＧＦＰによる蛍光が確認され、かつＫＯの発現は認められなかった胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
【0088】
（結果３－Ｎｕｃｌｅａｒ １ｎｇ／μＬ・蛍光確認なし（－））
７０個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は５０％であった。
７０個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は５０％であった。
【0089】
（結果４－Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ３ｎｇ／μＬ・蛍光確認なし（－））
７４個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を前核期の細胞質にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は８１．８％であった。
７４個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を前核期の細胞質にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は８１．８％であった。
【0090】
（まとめ）
以上のとおり、トランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核又は雄性前核期の細胞質にマイクロインジェクションし、胚盤胞において蛍光の有無を確認し、胚盤胞にＫＯの発現が消失し、ＥＧＦＰが発現している胚を選択するとＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたトランスジェニックマウスの産生率は顕著に高くなり、今回の検討では、１００％という値を得た。特に、前核が小さく、注入が困難な動物種には、トランスポゾンベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡの細胞質注入が有効であることが示された。
以上のとおり、トランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核又は雄性前核期の細胞質にマイクロインジェクションし、胚盤胞において蛍光の有無を確認し、胚盤胞にＫＯの発現が消失し、ＥＧＦＰが発現している胚を選択するとＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたトランスジェニックマウスの産生率は顕著に高くなり、今回の検討では、１００％という値を得た。特に、前核が小さく、注入が困難な動物種には、トランスポゾンベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡの細胞質注入が有効であることが示された。
【0091】
［実施例５］
（後代検定）
上記で得られたＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスについて後代検定を行った。実施例４で取得された、雄性前核にトランスポゾンとトランスポゼーズを注入した胚由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス２匹と、前核期受精卵の細胞質にトランスポゾンとトランスポゼーズｍＲＮＡを注入した受精卵由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス３匹、ファウンダーＢ６Ｃ３マウスのＦ１を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと掛け合わせた結果を以下の表２に示す。
（後代検定）
上記で得られたＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスについて後代検定を行った。実施例４で取得された、雄性前核にトランスポゾンとトランスポゼーズを注入した胚由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス２匹と、前核期受精卵の細胞質にトランスポゾンとトランスポゼーズｍＲＮＡを注入した受精卵由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス３匹、ファウンダーＢ６Ｃ３マウスのＦ１を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと掛け合わせた結果を以下の表２に示す。
【0092】
【表2】
【0093】
（結果）
上記表２のとおり、野生型マウスと掛け合わせることにより、Ｎｕｃｌｅａｒ３のＦ１系統（雄性前核期に注入）を除いて、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたＦ１マウスを取得することができた。したがって、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることにより細胞に導入されたＥＧＦＰをコードするＤＮＡは、生殖細胞においても発現し次世代に伝達することが確認された。
上記表２のとおり、野生型マウスと掛け合わせることにより、Ｎｕｃｌｅａｒ３のＦ１系統（雄性前核期に注入）を除いて、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたＦ１マウスを取得することができた。したがって、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることにより細胞に導入されたＥＧＦＰをコードするＤＮＡは、生殖細胞においても発現し次世代に伝達することが確認された。
【0094】
［実施例６］
［トランスジェニックマーモセット作出］
実中研において飼育管理しているコモンマーモセットからＥＧＦＰをコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニックマーモセットを作出した。
［トランスジェニックマーモセット作出］
実中研において飼育管理しているコモンマーモセットからＥＧＦＰをコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニックマーモセットを作出した。
【0095】
３ｎｇ／μＬのＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡ（２：１）を体外受精後１７時間のマーモセット受精卵の細胞質にマイクロインジェクションした。Ｂｌａｓｔ ａｓｓｉｓｔ培地（ORIGIO社製）にて３７℃にて培養した。ＧＦＰとＫＯは倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にて発現の観察を続け、マイクロインジェクション後４－５日（９６～１２０時間）目に６細胞期から１６細胞期まで発生した胚で、ＥＧＦＰの緑蛍光のみを発現している３０個を１９匹の仮親へ移植し３匹妊娠（１５．８％）し、そのうち１匹が出産し、仔１と仔２の２匹（６．７％）の産仔を獲得した。一方マイクロインジェクション後６－７日（１４４～１６８時間）目に桑実胚から胚盤胞まで発生した胚で、緑蛍光のみを発現している１９個を１２匹の仮親へ移植したところ４匹妊娠（３３．３％）したが全て流産した。流産の理由は明らかではないが、胚盤胞になるまで何度も蛍光観察をしたためＵＶ照射によるダメージがあった可能性も考えられる。
【0096】
【表3】
【0097】
上記得られた個体について、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡが導入されたか否かを確認するために、産仔である仔１と仔２の体組織よりＲＮＡを抽出し、ＥＧＦＰ又はＫＯを特異的に検出する以下のプライマーセットを用いてＲＴ－ＰＣＲ法によりｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇした。内在性コントロールとしてはβ－アクチンを、ネガティブコントロールとしては野生型マーモセットの皮膚より作製したｃＤＮＡを使用してＲＴ－ＰＣＲで比較した。
【0098】
１０μＬのＰＣＲ混合液は、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ９．０］，５０ｍＭのＫＣｌ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０μＭの各プライマーセット、及び１．０ＵのＫＯＤ－ＰＬＵＳ－ＮＥＯポリメラーゼを混合することにより作製された。９４℃にて２分の加熱処理；９８℃にて１０秒、６３℃にて３０秒のアニーリング、６８℃にて３０秒の伸長を１サイクルとして３０サイクル；の条件で増幅処理を行った。各プライマーセットは以下のとおりであった。ＲＴ－ＰＣＲの結果を図５に示す。
【0099】
ＥＧＦＰ：
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（配列番号１９）（フォワードプライマー）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（配列番号２０）（リバースプライマー）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２１）（フォワードプライマー）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（配列番号２２）（リバースプライマー）
β－アクチン：
５’－ＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴ－３’（配列番号２３）（フォワードプライマー）
５’－ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧ－３’（配列番号２４）（リバースプライマー）
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（配列番号１９）（フォワードプライマー）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（配列番号２０）（リバースプライマー）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２１）（フォワードプライマー）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（配列番号２２）（リバースプライマー）
β－アクチン：
５’－ＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴ－３’（配列番号２３）（フォワードプライマー）
５’－ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧ－３’（配列番号２４）（リバースプライマー）
【0100】
（結果）
図５において、左から、野生型（ネガティブコントロール）、仔１と仔２それぞれの胎盤、仔１と仔２それぞれの毛根、仔１と仔２それぞれの皮膚、仔１と仔２それぞれの血液のＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。仔１と仔２それぞれの胎盤、仔２の毛根と仔１と仔２それぞれの血液において、ＥＧＦＰが発現し、かつＫＯを発現していないことが確認された。なお、仔１と仔２の皮膚・仔１の毛根において、発現がなかったが、ファウンダー個体自体は通常モザイクであること、組織によってプロモーターの発現量が若干異なること等が理由として考えられる。
図５において、左から、野生型（ネガティブコントロール）、仔１と仔２それぞれの胎盤、仔１と仔２それぞれの毛根、仔１と仔２それぞれの皮膚、仔１と仔２それぞれの血液のＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。仔１と仔２それぞれの胎盤、仔２の毛根と仔１と仔２それぞれの血液において、ＥＧＦＰが発現し、かつＫＯを発現していないことが確認された。なお、仔１と仔２の皮膚・仔１の毛根において、発現がなかったが、ファウンダー個体自体は通常モザイクであること、組織によってプロモーターの発現量が若干異なること等が理由として考えられる。
【0101】
［実施例７］
［目的遺伝子導入実験－１］
哺乳類のゲノムＤＮＡに挿入する目的遺伝子として、パーキンソン病の原因となるＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基である変異体（ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ））（以下、「変異ＬＲＲＫ２」ともいう）を選択した。蛍光発現レポーターであるＥＧＦＰをコードする遺伝子ＤＮＡと、その上流の上記変異ＬＲＲＫ２をコードする遺伝子ＤＮＡとを２Ａで接合し、さらにその上流に非ヒト霊長類動物細胞で機能するＣＡＧプロモーターを連結した領域をＰＢトランスポゾンによる挿入領域とした。ＰＢ５’ＴＲの上流の外来遺伝子導入判定領域を付加した、ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＡＧプロモーター－ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）－２Ａ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃ環状ベクター（図６）を作製した。
［目的遺伝子導入実験－１］
哺乳類のゲノムＤＮＡに挿入する目的遺伝子として、パーキンソン病の原因となるＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基である変異体（ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ））（以下、「変異ＬＲＲＫ２」ともいう）を選択した。蛍光発現レポーターであるＥＧＦＰをコードする遺伝子ＤＮＡと、その上流の上記変異ＬＲＲＫ２をコードする遺伝子ＤＮＡとを２Ａで接合し、さらにその上流に非ヒト霊長類動物細胞で機能するＣＡＧプロモーターを連結した領域をＰＢトランスポゾンによる挿入領域とした。ＰＢ５’ＴＲの上流の外来遺伝子導入判定領域を付加した、ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＡＧプロモーター－ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）－２Ａ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃ環状ベクター（図６）を作製した。
【0102】
実施例１と同様の手順で、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの代わりに上記変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃ環状ベクターを用い、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとともにヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションした。トランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてＫＯ１とＥＧＦＰを、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で経時的に観察した。結果を図７の（ａ）及び（ｂ）に示す。
【0103】
（結果）
図７（ａ）から明らかなとおり、変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃベクターのみを添加した（Ｄａｙ０）ネガティブコントロール細胞（ａ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が開始した。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方が強く発現していることが確認できる。しかし、Ｄａｙ１０においては、ＥＧＦＰによる蛍光とＫＯによる蛍光のいずれもが、ほとんど消滅した。
図７（ａ）から明らかなとおり、変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃベクターのみを添加した（Ｄａｙ０）ネガティブコントロール細胞（ａ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が開始した。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方が強く発現していることが確認できる。しかし、Ｄａｙ１０においては、ＥＧＦＰによる蛍光とＫＯによる蛍光のいずれもが、ほとんど消滅した。
【0104】
一方、図７（ｂ）から明らかなとおり、上記変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとをコトランスフェクトした（Ｄａｙ０）細胞（ｂ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が観察できるが、Ｄａｙ５では、上記（ａ）細胞と比較して、ＥＧＦＰの緑色蛍光が強く、ＫＯ１のオレンジ色蛍光の強度が小さい細胞（青矢印）があることから、ＥＧＦＰのみが発現している細胞（白矢印）が存在することと、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方を発現している細胞とが混在していることが確認された。したがって、トランスポゼーズの作用によりＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＧＦＰの発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＫＯ１の発現は急速に（Ｄａｙ５ごろまでに）減衰することが確認された。Ｄａｙ１０においては、ＫＯ１の蛍光は観察されずＥＧＦＰのみが発現している細胞が多く観察され、ＬＲＲＫ２変異体遺伝子ＤＮＡとＥＧＦＰを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
【0105】
［実施例８］
［目的遺伝子導入実験－２］
（マウスニューロスフェアへの外来遺伝子導入）
哺乳類のゲノムＤＮＡに大型の遺伝子を挿入する目的遺伝子として以下のベクターを作製した。まず、神経幹細胞や神経前駆細胞で選択的に活性を有することが知られているG protein-coupled receptor 56（ｇｐｒ５６）ミニマムプロモーター（配列番号２５）（Bae et al., Science 2014等）の下流に蛍光レポーター遺伝子であるＥＧＦＰと発光レポーターであるLuciferase２を接合した（第二発現カセット）。しかし、上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚では活性をもたないため、導入部分を胚で選別しうるマーカーとして胚で活性を有するＥＯＳプロモーターとレポーター遺伝子ｈＫＯ１の第一発現カセットを第二発現カセットの下流に配置し、２つのカセットをインシュレーターで結合してＰＢトランスポゾンによる挿入領域（ＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域）とした。ＰＢ３’の上流の判定領域には挿入領域で使用していない青色蛍光を発現するＣｅｒｕｌｅａｎ（配列番号１５）をｄ２ＰＥＳＴと接合して、ＣＭＶプロモーター下に配置し、ＣＭＶ１プロモーター－Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ｈｇｐｒ５６－ｅＧＦＰ－ルシフェラーゼ－Ｉｎｓ－ＥＯＳ－ｈＫＯ１－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲを含む図８に示すＰＢトランスポゾン環状ベクターを作製した。なお、上記Ｉｎｓは、インシュレーターを意味する。この実験ではＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域がプロモーターと外来タンパク質を各々含む２つのカセットを有するため、カセット間の干渉を防ぐために使用されている。
［目的遺伝子導入実験－２］
（マウスニューロスフェアへの外来遺伝子導入）
哺乳類のゲノムＤＮＡに大型の遺伝子を挿入する目的遺伝子として以下のベクターを作製した。まず、神経幹細胞や神経前駆細胞で選択的に活性を有することが知られているG protein-coupled receptor 56（ｇｐｒ５６）ミニマムプロモーター（配列番号２５）（Bae et al., Science 2014等）の下流に蛍光レポーター遺伝子であるＥＧＦＰと発光レポーターであるLuciferase２を接合した（第二発現カセット）。しかし、上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚では活性をもたないため、導入部分を胚で選別しうるマーカーとして胚で活性を有するＥＯＳプロモーターとレポーター遺伝子ｈＫＯ１の第一発現カセットを第二発現カセットの下流に配置し、２つのカセットをインシュレーターで結合してＰＢトランスポゾンによる挿入領域（ＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域）とした。ＰＢ３’の上流の判定領域には挿入領域で使用していない青色蛍光を発現するＣｅｒｕｌｅａｎ（配列番号１５）をｄ２ＰＥＳＴと接合して、ＣＭＶプロモーター下に配置し、ＣＭＶ１プロモーター－Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ｈｇｐｒ５６－ｅＧＦＰ－ルシフェラーゼ－Ｉｎｓ－ＥＯＳ－ｈＫＯ１－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲを含む図８に示すＰＢトランスポゾン環状ベクターを作製した。なお、上記Ｉｎｓは、インシュレーターを意味する。この実験ではＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域がプロモーターと外来タンパク質を各々含む２つのカセットを有するため、カセット間の干渉を防ぐために使用されている。
【0106】
上記外来遺伝子導入判定領域にＣｅｒｕｌｅａｎを配置し、トランスポゾン領域にｇｐｒ５６ミニマムプロモーターを搭載したＰＢトランスポゾン環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクター（Medical Research Council(UK)社製）とを用いて、ｈｇｐｒ５６ｅ１ｍ－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２（第二発現カセット）とＥＯＳ－ｈＫＯ１（第一発現カセット）とをコードするＤＮＡをマウスニューロスフェアのゲノムＤＮＡに導入することを試みた。
【0107】
（マウスニューロスフェアの形成）
マウス胎仔脳線条体をｂＦＧＦ (basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)及びＢ２７を添加したＭＨＭ培地（Murayama et al., J Neurosci Res 2002）中において、浮遊培養法によって神経幹細胞・神経前駆細胞を増殖させてニューロスフェア形成させた。
マウス胎仔脳線条体をｂＦＧＦ (basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)及びＢ２７を添加したＭＨＭ培地（Murayama et al., J Neurosci Res 2002）中において、浮遊培養法によって神経幹細胞・神経前駆細胞を増殖させてニューロスフェア形成させた。
【0108】
（マウスニューロスフェアへのコトランスフェクション）
上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターを搭載したＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、上記マウスニューロスフェアにエレクトロポレーションした（Ｄａｙ０）。トランスポゼーズを加えず、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトしたニューロスフェアをネガティブコントロールとした。トランスフェクト後のニューロスフェアについて、励起光４５２ｎｍを用いてＣｅｒｕｌｅａｎを、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてｈＫＯ１を、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で経時的に観察した。また、Ｄａｙ５のニューロスフェアにBeetle Luciferin, Potassium Salt（Promega社製）を添加し、ルシフェラーゼの発現をＩＶＩＳ Spectrum In Vivo Imaging System（パーキンエルマー社製）で観察した結果を図９に示す。
上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターを搭載したＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、上記マウスニューロスフェアにエレクトロポレーションした（Ｄａｙ０）。トランスポゼーズを加えず、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトしたニューロスフェアをネガティブコントロールとした。トランスフェクト後のニューロスフェアについて、励起光４５２ｎｍを用いてＣｅｒｕｌｅａｎを、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてｈＫＯ１を、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で経時的に観察した。また、Ｄａｙ５のニューロスフェアにBeetle Luciferin, Potassium Salt（Promega社製）を添加し、ルシフェラーゼの発現をＩＶＩＳ Spectrum In Vivo Imaging System（パーキンエルマー社製）で観察した結果を図９に示す。
【0109】
（結果）
図９から明らかなとおり、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞（図９（ａ））においては、Ｄａｙ１とＤａｙ５において判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎと挿入領域のＫＯが同一細胞で発現していたのに対し、トランスポゼーズを導入した区では、Ｄａｙ５に判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎの発現が見られない細胞でＫＯが発現している細胞が見られた。一方ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターに接合したＥＧＦＰの発現はどちらの区でも観察されなかったものの、その下流のルシフェラーゼの発光がトランスポゼーズを導入した区でのみ観察された。
図９から明らかなとおり、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞（図９（ａ））においては、Ｄａｙ１とＤａｙ５において判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎと挿入領域のＫＯが同一細胞で発現していたのに対し、トランスポゼーズを導入した区では、Ｄａｙ５に判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎの発現が見られない細胞でＫＯが発現している細胞が見られた。一方ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターに接合したＥＧＦＰの発現はどちらの区でも観察されなかったものの、その下流のルシフェラーゼの発光がトランスポゼーズを導入した区でのみ観察された。
【0110】
したがって、トランスポゼーズの作用によりｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳ－ｈＫＯ１をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＯＳプロモーターが活性を持つ細胞においては、ｈＫＯ１の発現が安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＣｅｒｕｌｅａｎの発現は急速に（５日目ごろまでに）減衰することが確認された。また、トランスポゼーズをコトランスフェクションした区でのみ神経幹細胞や神経前駆細胞で活性を持つｇｐｒ５６下の発光レポーターの発現が観察されたことより、トランスポゾン領域が、ニューロスフェアのゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
【0111】
［実施例９］
上記ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳ－ｈＫＯ１含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクター７μｇ／μＬとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターから作製したｍＲＮＡ３．５μｇ／μＬを実施例１と同様にマイクロマニピュレータ（Leica社製）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした。胚発生過程における蛍光発現の変化を倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）により観察し、結果を図１０に示す。
上記ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳ－ｈＫＯ１含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクター７μｇ／μＬとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターから作製したｍＲＮＡ３．５μｇ／μＬを実施例１と同様にマイクロマニピュレータ（Leica社製）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした。胚発生過程における蛍光発現の変化を倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）により観察し、結果を図１０に示す。
【0112】
（結果）
図１０から明らかなとおり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン機構が作用して、ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳーｈＫＯ１がゲノムＤＮＡに挿入された胚（白矢印で示したオレンジの胚）においては、ｈＫＯ１のオレンジ蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始め、Ｃｅｒｕｌｅａｎの青色蛍光はＤａｙ１に弱く観察されたが（赤矢印で示した青色の胚）、その後発現は消失し、ｈＫＯ１単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図１０）。したがって、トランスポゼーズの作用によりＰＢトランスポゾンによる挿入領域がゲノムＤＮＡに導入された場合、ｈＫＯ１の発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＰＢ３’の上流のＣｅｒｕｌｅａｎの発現は急速に減衰することが確認された。Ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚で活性を持たないためＥＧＦＰとＬｕｃ２はマウス胚で観察されないが、同一ＰＢトランスポゾン挿入領域に搭載している、胚で活性を持つＥＯＳ－ｈＫＯの発現が確認できたことより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域がマウス胚ゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
図１０から明らかなとおり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン機構が作用して、ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳーｈＫＯ１がゲノムＤＮＡに挿入された胚（白矢印で示したオレンジの胚）においては、ｈＫＯ１のオレンジ蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始め、Ｃｅｒｕｌｅａｎの青色蛍光はＤａｙ１に弱く観察されたが（赤矢印で示した青色の胚）、その後発現は消失し、ｈＫＯ１単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図１０）。したがって、トランスポゼーズの作用によりＰＢトランスポゾンによる挿入領域がゲノムＤＮＡに導入された場合、ｈＫＯ１の発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＰＢ３’の上流のＣｅｒｕｌｅａｎの発現は急速に減衰することが確認された。Ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚で活性を持たないためＥＧＦＰとＬｕｃ２はマウス胚で観察されないが、同一ＰＢトランスポゾン挿入領域に搭載している、胚で活性を持つＥＯＳ－ｈＫＯの発現が確認できたことより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域がマウス胚ゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】