(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-04
(45)【発行日】2023-01-13
(54)【発明の名称】ポリマー溶融物内の超安定型インスリン類似体のカプセル化
(51)【国際特許分類】
A61K 38/28 20060101AFI20230105BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230105BHJP
A61K 9/00 20060101ALI20230105BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20230105BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230105BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230105BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20230105BHJP
C12N 15/17 20060101ALN20230105BHJP
【ＦＩ】
A61K38/28
A61K47/34
A61K9/00
A61K9/70
A61K9/10
A61P3/10
C07K14/62 ZNA
C12N15/17
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2018524288
(86)(22)【出願日】2016-12-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-02-07
(86)【国際出願番号】 US2016068572
(87)【国際公開番号】W WO2017112952
(87)【国際公開日】2017-06-29
【審査請求日】2019-12-19
(31)【優先権主張番号】62/387,459
(32)【優先日】2015-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500429332
【氏名又は名称】ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＥ ＷＥＳＴＥＲＮ ＲＥＳＥＲＶＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】ワイス、マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ポコルスキ、ジョン
【審査官】淺野 美奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５２９６９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／０８１８２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５２１６２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３０７０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０１００４８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Protein Sci. (2013), 22 (3), p.296-305
【文献】J. BIOL. CHEM. (2008), 283 (21), p.14703-14716
【文献】AAPS PharmSciTech (2012), 13 (1), p.313-322
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／２８
Ａ６１Ｋ ４７／３４
Ａ６１Ｋ ９／００
Ａ６１Ｋ ９／７０
Ａ６１Ｋ ９／１０
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ｃ０７Ｋ １４／６２
Ｃ１２Ｎ １５／１７
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン類似体とポリマー混合物とを有するインスリン組成物であって、前記インスリン類似体は、野生型インスリンと比較してＢ４およびＡ１０残基に対応する位置におけるシステイン置換と、前記インスリン類似体のＡドメインとＢドメインとの間の５～１１アミノ酸の連結ドメインと、野生型インスリンの位置Ａ８に対応する位置におけるアルギニンまたはヒスチジンによる置換と、野生型インスリンの位置Ａ１４に対応する位置におけるチロシン残基またはグルタミン酸による置換と、および野生型インスリンの位置Ｂ２９に対応する位置におけるグルタミン酸、アルギニン、またはプロリンによる置換と、を含み、前記インスリン類似体は、前記インスリン組成物を提供するために、９０～１２０℃の温度範囲内で１つまたはそれ以上のステップを含む製造プロセスに曝露後、活性を維持する、インスリン組成物。
【請求項2】
請求項１記載のインスリン組成物において、前記ポリマーは、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬ－ＧＡ）からなるインスリン組成物。
【請求項3】
請求項２記載のインスリン組成物において、前記ポリマーは、ＰＬの割合が２５％～７５％である乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬ－ＧＡ）からなるインスリン組成物。
【請求項4】
請求項３記載のインスリン組成物において、前記ポリマーは、ＰＬの割合が５０％である乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬ－ＧＡ）からなるインスリン組成物。
【請求項5】
請求項２記載のインスリン組成物であって、ポリエチレングリコールをさらに有するインスリン組成物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン組成物において、前記インスリン類似体は、連結ペプチドの初めの２つの位置のうち少なくとも１つにグルタミン酸を有するインスリン組成物。
【請求項7】
請求項６記載のインスリン組成物において、前記インスリン類似体は、配列ＩＤ番号：１０、１２、および１５からなる群から選択される配列を有するインスリン組成物。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン組成物において、前記インスリン類似体は配列ＩＤ番号：５を有するインスリン組成物。
【請求項9】
請求項８記載のインスリン組成物であって、配列ＩＤ番号：６をさらに有するインスリン組成物。
【請求項10】
インスリン類似体とポリマー混合物とを有するインスリン組成物であって、前記インスリン類似体は、野生型インスリンと比較してＡ１０残基に対応する位置におけるシステイン置換を含むインスリンＡ鎖ポリペプチドと、野生型インスリンと比較してＢ４残基に対応する位置におけるシステイン置換を含むインスリンＢ鎖ポリペプチドと、野生型インスリンの位置Ａ８に対応する位置におけるアルギニンまたはヒスチジンによる置換と、野生型インスリンの位置Ａ１４に対応する位置におけるチロシン残基またはグルタミン酸による置換と、および野生型インスリンの位置Ｂ２９に対応する位置におけるグルタミン酸、アルギニン、またはプロリンによる置換と、を含み、前記インスリン類似体は、前記インスリン組成物を提供するために、９０～１２０℃の温度範囲内で１つまたはそれ以上のステップを含む製造プロセスに曝露後、活性を維持する、インスリン組成物。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン組成物において、局所適用のためにマイクロニードルパッチへと加工されているインスリン組成物。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン組成物において、皮下注射のためにマイクロビーズの懸濁液へと加工されているインスリン組成物。
【請求項13】
薬剤として使用するための請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン類似体。
【請求項14】
糖尿病治療用の薬剤の製造のための、請求項１～５のいずれかに記載のインスリン類似体の使用。
【請求項15】
糖尿病治療用の請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１５年１２月２３日に出願された係属中の米国仮出願第６２／３８７，４５９号の利益を主張する。
【0002】
連邦政府により助成される研究または開発に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金第ＤＫ０４０９４９号及び第ＤＫ０７４１７６号のもとの、並びに、Ｎａｔｉｏａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより授与された助成金第ＤＭＲ０４２３９１４号による、政府支援でなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金第ＤＫ０４０９４９号及び第ＤＫ０７４１７６号のもとの、並びに、Ｎａｔｉｏａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより授与された助成金第ＤＭＲ０４２３９１４号による、政府支援でなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
本発明は、凝集共役性ミスフォールディングと室温より高い温度での熱フィブリル化とに対する強化された耐性を含む、増強された熱及び熱力学的安定性を呈する、ポリペプチドホルモン類似体のポリマーカプセル化に関する。そのような増強された安定性は、ホルモン類似体が、９０～１２０℃の範囲の温度を要するステップを伴う製造プロセスの後に、活性を維持することを可能にする。より具体的には、本発明は、２つまたはそれ以上の安定化要素からなる超安定型インスリン類似体の、ポリマー溶融物でのカプセル化に関する。安定化要素の１つは、Ｂ４及びＡ１０残基間の追加のジスルフィド架橋である。第二の要素は、以下（ａ）～（ｅ）の群から選択される１つまたはそれ以上の要素からなる：（ａ）ＡドメインとＢドメインとの間の短縮型連結（Ｃ）ドメインと、（ｂ）αヘリックスＣ－ＣＡＰ位置Ａ８における非ベータ分岐性アミノ酸置換と、（ｃ）Ａ１４における非ベータ分岐性の酸性または極性側鎖と、（ｄ）ＰｈｅＢ２４の芳香環の、芳香族側鎖のオルト位における、ハロゲン修飾（環の６つの位置のうちの位置２；ハロゲンはフッ素、塩素、または臭素の群から選択される）と、および／または（ｅ）ＬｙｓＢ２９の、アルギニン、グルタミン酸、または中性脂肪族側鎖を伴う天然型アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕの群から選択される）、または中性脂肪族側鎖を伴う非天然型アミノ酸側鎖（アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、またはノルロイシン）による置換。任意で、二鎖または単鎖類似体のいずれかにおいて、Ｂ鎖（またはＢドメイン）からＮ末残基（Ｂ１残基、Ｂ１及びＢ２残基、またはＢ１－Ｂ３残基を有する）が欠失していてもよく、またＡｓｎＡ２１は、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒにより任意で置換されてもよい。ＳＣＩ、Ａ鎖、またはＢ鎖のＮ末端は、ポリマー混合物中のより均一な分布を確実にするため、開示されるように（Ｌｅｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１５：１３３２－７（２０１５）、任意でＰＥＧ化により任意で修飾されてもよい。
【0004】
インスリンの投与は、糖尿病のための治療法として長く確立されてきた。糖尿病を有する患者における従来型インスリン補充療法の主な目標は、ヒト健常者特有の正常範囲より上または下への変動を防止するための、血液グルコース濃度の制御である。正常範囲より下への変動は、即座に現れるアドレナリン様または神経低糖症の症状と関連付けられ、それは重い発作では痙攣、昏睡状態、及び死に至らしめる。正常範囲より上への変動は、網膜症、失明、及び腎不全を含む微小血管障害の長期的リスクの上昇と関連付けられている。１型糖尿病の治療は、通常、皮下注射により投与される基礎インスリン製剤（または長時間作用型インスリン類似体製剤）とプランディアルインスリン製剤（または速効型インスリン類似体製剤）との組合せを要する一方、多くの場合２型糖尿病は、基礎インスリン製剤（または長時間作用型インスリン類似体製剤）のみで治療されうる。本発明は、そのような基礎インスリン療法に関する。
【0005】
インスリンは、脊椎動物での代謝における中心的な役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖、及び３０残基を含有するＢ鎖の二鎖を含有する。そのホルモンは、膵β細胞中にＺｎ２＋安定化六量体として貯蔵されているが、血流中ではＺｎ２＋なし単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリンにおいては、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）をＡ鎖のＮ末端残基へと連結させる（図１Ａ）。様々な証拠が、プロインスリンはインスリン様コアと無秩序な連結ペプチドとからなることを示す（図１Ｂ）。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６－Ａ１１、Ａ７－Ｂ７、及びＡ２０－Ｂ１９；図１Ａ及び１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役すると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ体への輸出の直後、可溶性Ｚｎ２＋配位六量体を形成するように集合する。エンド型タンパク質分解性消化、及びインスリンへの変換は、未熟な分泌顆粒中で起こり、続いて形態学的濃縮が起こる。成熟貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン六量体の結晶配列は、電子顕微鏡法（ＥＭ）により可視化されてきた。インスリンの配列は図１Ｃ中に図式的に示される。個々の残基は、アミノ酸の識別（一般には標準的な三文字コードを使用）、鎖、及び配列位置（一般には上付き文字）により示される。本発明は、ヒトプロインスリンの特徴である３６残基の野生型Ｃドメインの代わりの、６－１１残基超の新規の短縮型Ｃドメインの発明に関する。
【0006】
液体または微結晶製剤中のインスリン及び従来型インスリン類似体は、物理的分解と化学的分解との両者に敏感である。物理的分解はフィブリルの形成をもたらす一方、化学的分解には、分子内における原子の再編成の損失を伴う化学結合の切断、または異なるインスリン分子間の化学結合の形成が関与する。物理的及び化学的分解は、室温より高い温度では著しく加速し、５５℃より高い温度ではなおさらである。そのような分解は、生物活性を損なわせる。液体または微結晶製剤中のインスリン及び従来型インスリン類似体の、様々な形態の分解に対する感受性は、現在、９０～１２０℃の温度範囲における１つまたはそれ以上の製造ステップを要する、ポリマー溶融物内のカプセル化を妨げる。そのようなポリマー溶融物の例は、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬ－ＧＡ；５０：５０を含むがこれに限定されない様々な分子比にある）により提供され、乳酸グリコール酸共重合体は、ボールミルまたは乳鉢及び乳棒によりすり砕かれ、固体状にある凍結乾燥ＳＣＩ（または従来型二鎖インスリン類似体）と混合されうる。（超安定型インスリン類似体が積載された）混合された粉末は、少なくとも１０分にわたり９０～１２０℃の温度範囲にて溶融プロセスにおいて押し出され、室温にて固体化されうる。そのようなポリマー溶融物は、皮膚への適用のためのマイクロニードル、及び皮下注射のためのマイクロペレットを含有する、シートを含む、さまざまな形へと成形されうる。ＰＬ－ＧＡは、当技術分野において、非毒性であり、体内で非毒性分解産物へのゆっくりとした分解を受けることが知られている。このことは、様々な医療装置及び医薬送達システムにおけるＰＬ－ＧＡの使用を可能にする（Ａｈｍｅｄ，Ｔ．（２０１５）；Ｏｒｔｅｇａ－Ｏｌｌｅｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）；及びＲａｈｉｍｉａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照）。ＰＬ－ＧＡの医療装置における使用は、ゆえに、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ & Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより承認されている。
【0007】
本発明は、糖尿病の治療のためのインスリン補充療法の利便性、安全性、及び効能を向上させるために、基礎的な週一回、隔月、または月一回のインスリン類似体送達を工学操作する、医学的及び社会的需要により動機付けられた。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 国際公開第２０１１／１６１１２４号
（特許文献２） 国際公開第２０１１／１６１１２５号
（特許文献３） 国際公開第２０１５／０１０９２７号
（特許文献４） 国際公開第２０１０／０１４９４６号
（特許文献５） 国際公開第２０１３／０１００４８号
（特許文献６） 国際公開第２００７／０８１８２４号
（特許文献７） 国際公開第２００９／１３２１２９号
（特許文献８） 国際公開第２００８／０４３０３３号
（特許文献９） 国際公開第２００５／０５４２９１号
（特許文献１０） 国際公開第２００７／０９６３３２号
（特許文献１１） 国際公開第２０１４／０７１４０５号
（特許文献１２） 国際公開第２０１０／０１４９４６号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＶＩＮＴＨＥＲ Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ ｈａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，Ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ ２９６－３０５
（非特許文献２） ＶＩＮＴＨＥＲ Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ： Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏｌ．２４，ｐａｇｅｓ ７７９－７８８
（非特許文献３） ＷＥＩＳＳ Ｍ．Ａ．，"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｓｔａｂｌｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｗｏｒｌｄ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｊｕｌｙ ２０１３，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ５９－７０
（非特許文献４） ＨＵＡ，Ｑ－Ｘ．ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｎａｌｏｇ"，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．２１，ｐａｇｅｓ １４７０３－１４７１６
（非特許文献５） ＬＥＥ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，"ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍｅｌｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ"，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１０，ｐａｇｅｓ １３３２－１３３７
（非特許文献６） "Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｇｌａｒｇｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｇｅｌｓ，"ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍａＳｃｉＴｅｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１，Ｍａｒｃｈ ２０１２
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 国際公開第２０１１／１６１１２４号
（特許文献２） 国際公開第２０１１／１６１１２５号
（特許文献３） 国際公開第２０１５／０１０９２７号
（特許文献４） 国際公開第２０１０／０１４９４６号
（特許文献５） 国際公開第２０１３／０１００４８号
（特許文献６） 国際公開第２００７／０８１８２４号
（特許文献７） 国際公開第２００９／１３２１２９号
（特許文献８） 国際公開第２００８／０４３０３３号
（特許文献９） 国際公開第２００５／０５４２９１号
（特許文献１０） 国際公開第２００７／０９６３３２号
（特許文献１１） 国際公開第２０１４／０７１４０５号
（特許文献１２） 国際公開第２０１０／０１４９４６号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＶＩＮＴＨＥＲ Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ ｈａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，Ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ ２９６－３０５
（非特許文献２） ＶＩＮＴＨＥＲ Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ： Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏｌ．２４，ｐａｇｅｓ ７７９－７８８
（非特許文献３） ＷＥＩＳＳ Ｍ．Ａ．，"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｓｔａｂｌｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｗｏｒｌｄ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｊｕｌｙ ２０１３，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ５９－７０
（非特許文献４） ＨＵＡ，Ｑ－Ｘ．ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｎａｌｏｇ"，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．２１，ｐａｇｅｓ １４７０３－１４７１６
（非特許文献５） ＬＥＥ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，"ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍｅｌｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ"，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１０，ｐａｇｅｓ １３３２－１３３７
（非特許文献６） "Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｇｌａｒｇｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｇｅｌｓ，"ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍａＳｃｉＴｅｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１，Ｍａｒｃｈ ２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
従って、９０～１２０℃の温度範囲内の１つまたはそれ以上の必須のステップを含む製造プロセスの後に生物活性を維持するのに十分な熱及び熱力学的安定性を有する二鎖または単鎖インスリン類似体のポリマー溶融物を提供することは、本発明の一態様である。より具体的には、本発明は、２つまたはそれ以上の安定化要素からなる超安定型インスリン類似体の、ポリマー溶融物を用いるカプセル化に関する。その安定化要素のうち一つは、Ｂ４及びＡ１０残基間の追加のジスルフィド架橋である。第二の要素は、以下（ａ）－（ｅ）の群から選択される一つまたはそれ以上の要素からなる：（ａ）Ａ及びＢドメイン間の短縮型連結（Ｃ）ドメインと、（ｂ）αヘリックスＣ－ＣＡＰ位置Ａ８における非ベータ分岐性アミノ酸置換と、（ｃ）Ａ１４における非ベータ分岐性の酸性または極性側鎖と、（ｄ）ＰｈｅＢ２４の芳香環の、芳香族側鎖のオルト位（環の６つの位置のうちの位置２；ハロゲンはフッ素、塩素、もしくは臭素の群から選択される）における、ハロゲン修飾と、および／または（ｅ）ＬｙｓＢ２９の、グルタミン酸、または中性脂肪族側鎖を伴う天然型アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕの群から選択される）、または中性脂肪族側鎖を伴う非天然型アミノ酸側鎖（アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、またはノルロイシン）による置換。任意で、二鎖または単鎖類似体のいずれかにおいて、Ｂ鎖（またはＢドメイン）からＢ１またはＢ２残基が欠失していてもよく、またＡｓｎＡ２１は、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒにより任意で置換されてもよい。
【0009】
本発明の類似体は、位置Ｂ１０においてヒスチジンを含有し、そのため、この位置における酸性置換（アスパラギン酸またはグルタミン酸）に関連する発癌についての懸念を回避する。ＩＲ－Ａ及びＩＲ－Ｂに対する二鎖または単鎖インスリン類似体の絶対的ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性が、野生型ヒトインスリンと比較して５－１５０％の範囲にあり、そのためホルモン－受容体複合体において顕著に延長された滞留時間はまず呈さないであろうことは、本発明の追加の態様である。
【0010】
ゆえに本発明は、一つまたはそれ以上の改変（ｂ－ｅ）を含有する三つのジスルフィド架橋（天然型架橋Ｂ７－Ａ７、Ｂ１９－Ａ２０、工学操作された架橋Ｂ４－Ａ１０；及び加えてＡ鎖内のシステインＡ６－Ａ１１）により連結される二つのポリペプチド鎖（Ａ及びＢと呼ばれる）からなるインスリン類似体の、ポリマー溶融物を用いるカプセル化を想像する。あるいは、本発明の範囲は、四つのジスルフィド架橋（Ｂ４－Ａ１０、Ｂ７－Ａ７、Ｂ１９－Ａ２０、及びＡ６－Ａ１１）、並びに一つまたはそれ以上の改変（ａ－ｅ）を含有する単鎖インスリン類似体（ＳＣＩｓ）のポリマー溶融物カプセル化を含む。ＳＣＩは、Ｎ末端二残基が少なくとも一つの酸性残基を含有する５－１１残基長の短縮型連結ドメインを含有する。本発明のポリマー溶融物内に含有される二鎖または単鎖インスリン類似体は、任意で、ＡまたはＢドメイン中の他の箇所おいて標準型または非標準型アミノ酸置換を含有しうる。
【0011】
位置Ｂ４とＡ１０（野生型二鎖インスリンにおいて定義される）との間の第四のジスルフィド架橋自体の実行可能性は、当技術分野においては活性ＳＣＩの文脈では知られていない。そのような第四のジスルフィド架橋を含有するインスリン類似体もまた、二鎖または単鎖類似体のいずれにおいても、ポリマーカプセル化の目的のための別の安定化要素との組合せでは知られていない。
【0012】
治療薬及びワクチンを含む非標準型タンパク質の工学操作は、幅広い医学的及び社会的利益を有しうる。人間、他の哺乳類、脊椎生物、無脊椎生物、または真核細胞一般のゲノム中にコードされる天然型タンパク質は、しばしば複数の生物活性を与える。非標準型タンパク質の利益は、生物活性を失うことなくポリマー溶融物内のカプセル化を許容するのに十分な熱及び熱力学的安定性を実現することであろう。その製造プロセスは、９０～１２０℃の温度範囲内の１つまたはそれ以上のステップを含有する。さらに別の社会的利益の例は、ヒト患者、または糖尿病を有するイヌまたはネコなど（だがそれらに限定されない）などの他の動物における糖尿病の治療のために、そのようなポリマー溶融物の輸送、流通、及び使用を促進するための、そのようなインスリン類似体含有性ポリマー溶融物の使用であろう。インスリン類似体含有性ポリマー溶融物は、マイクロニードルのゆっくりとした分解が、少なくとも一週間にわたるまた任意で最長一ヶ月の期間にわたる皮下インスリン投与の長期的方法を提供するような、皮膚へと適用されるマイクロニードルパッチへと加工されうる。あるいは、インスリン類似体含有性ポリマー溶融物は、皮下注射のための注射可能かつ分解可能なマイクロペレットへと加工されうる。皮下スペース内でのそのゆっくりとした分解は、同様に、少なくとも一週間、また任意で最長一ヶ月にわたるインスリンの徐放デポを提供するであろう。
【0013】
本発明の社会的利益は、電気及び冷蔵が一貫しては利用可能でない発展途上界の地域において特に顕著であろう。インスリン及びインスリン類似体の液体及び微結晶製剤の物理的分解により課される課題は、１９３０年代に初めて認識された。この課題の重大性は、アフリカ及びアジアにおける糖尿病の未解決な流行により、過去十年のうちにより深まった。少なくとも一つの他の安定化要素との組合せでの、位置Ｂ４とＡ１０との間における第四のジスルフィド架橋を含有する超安定型二鎖インスリン類似体、または超安定型ＳＣＩのポリマーカプセル化は、そのような課題に直面している地域においてインスリン補充療法の安全性及び効果を増強しうる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図2】図２は、第四ジスルフィド架橋により安定化されるＳＣＩの３Ｄモデルである。アスタリスクは、Ｂ４－Ａ１０ジスルフィド架橋を示す。二鎖インスリン類似体中の対応する工学操作されたシステイン（つまり、二つのポリペプチド鎖それぞれにおける位置Ｂ４とＡ１－との間）は、位置Ａ８、Ａ１４、Ｂ２４、またはＢ２９における少なくとも一つの追加の安定化改変と組み合わせられうる。
【図3A-3C】図３Ａは、第四ジスルフィド架橋混合物ストリップを有するＳＣＩを含む改変インスリンのタンパク質－ポリマー混合物を含有するバイアル瓶の写真である（底部の親指／指は縮尺のため）。 図３Ｂは、図３Ａにおいて示されるタンパク質－ポリマー混合物からの第四ジスルフィド架橋を含有しない回収されたＳＣＩに対する応答における、ラットの血液グルコースレベルを示すグラフである 。 図３Ｃは、図３Ａにおいて示されるタンパク質－ポリマー混合物からの第四ジスルフィド架橋を含有する回収された改変ＳＣＩに対する応答における、ラットの血液グルコースレベルを示すグラフである。
【図4】図４は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４かつ３７℃）中でのＰＬＧＡポリマー（５０－５０％）からの超安定型単鎖類似体（ＳＣＩ）の溶出を示すグラフである。横軸は、浸漬時間を示す。縦軸は、インスリン類似体（濃灰色三角）、または、ニワトリ卵白リゾチーム（薄灰色四角）を含有する、もしくはタンパク質を含有しない（濃灰色ひし形）コントロールポリマー中の相対Ｂｒａｄｆｏｒｄ活性性材料のナノグラムを示す。後者は、非タンパク質性材料ゆえ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ解析のバックグラウンドシグナルを意味する。第１０－１５日における横軸方向のプラトーは、ポリマーからさらなるタンパク質溶出がないことを意味する。第１－１０日の間のＳＣＩ溶出のほぼ線形の速度を最適化するため、試料は５％ＰＥＧ（平均分子質量８ｋＤａ）を使用して作成された。材料の一部の即刻のバースト放出は示されない。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、二鎖または単鎖インスリン類似体のポリマー溶融物を含有する組成物を対象とする。そのインスリン類似体は、（ａ）哺乳類の真皮内または皮下スペース内におけるポリマー分解に際し生物活性が失われることなく、または（ｂ）３７℃における穏やかな攪拌を伴うインキュベーションの際に生理学的緩衝液中または希釈酸性溶液上においてｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリマー分解に際し生物活性が失われることなく、インスリン類似体が、少なくとも１０分にわたり温度範囲９０～１２０℃にあるポリマー溶融プロセスにかけられうるような、熱及び熱力学的安定性の顕著な増大を呈する。
【0016】
インスリン類似体の等電点が（ｉ）中性ｐＨにおいて溶液としての可溶性製造中間体を許容するように３．０－６．０の範囲にある、または（ｉｉ）可溶性製剤が酸性条件（ｐＨ３．０－５．５）下で得られうるように６．５及び８．０の範囲にある、のいずれかでありうることは、本発明の特徴である。後者の類似体は、ポリマー溶融物から体内で放出されると、ｐＨの中性付近へのシフトゆえ、皮下デポ中で等電沈殿を受けることが予期されるであろう。元のポリマー溶融物のバルク特性により、一つまたはそれ以上のマイクロニードルまたはマイクロペレットが急にまたは予期されるより迅速に分解する場合には、そのような沈殿はポリマー装置の安全性を増強しうる。
【0017】
一実施形態においては、ポリマーは、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸、キトサン、ポリセバシン酸、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、乳酸カプロラクトン共重合体、ポリヒドロキシブチレート－バレレート、及び混合物、並びにそれからの共重合体なる群から選択されうる。これに加え、あるいはこの代わりに、ポリマー組成物からのインスリンの放出速度を調節するために、ポリエチレングリコールなどのポロゲン、ＮａＣｌ、及び／または糖が任意で存在しうる。
【0018】
ポリマー分子量は、特定の適用の要件、及びインスリン放出の望ましい速度にしたがい、選択されうる。一実施形態においては、ポリエチレングリコールの分子量などのポリマー分子量は、平均分子量が２００ダルトンより小さい、２００ダルトンと１０００ダルトンとの間、１０００ダルトンと４５００ダルトンとの間、４５００ダルトンと９０００ダルトンとの間、９０００ダルトンと１５０００ダルトンとの間、１５０００ダルトンと２５０００ダルトンとの間、または２５０００ダルトンより大きい平均分子量を有しうる。特定の一実施形態においては、約８０００ダルトンのＰＥＧが使用されうる。
【0019】
非限定的な例としてはブタ、ウシ、ウマ、及びイヌインスリンなどの、動物インスリン由来のＡ及びＢ配列を用いて、単鎖または二鎖インスリン類似体が作成されうることが想像される。これに加え、または、本発明のインスリン類似体は、残基Ｂ１、残基Ｂ１－Ｂ２、または残基Ｂ１－Ｂ３の欠失を含有してもよく、あるいは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅ、または他の酵母発現種もしくは株における酵母生合成において前駆体ポリペプチドのリシンを標的とするタンパク質分解を回避するためにリシンを欠く変異Ｂ鎖と組み合わせられてもよい。理論に拘束されることは望まないが、我々は、位置Ａ８における非ベータ分岐性置換が、二鎖インスリン類似体及びＳＣＩを、そのアルファヘリックス内および／またはアルファヘリックスのＣ末端位置におけるより最適な特性ゆえ、物理的及び化学的分解から保護すると想像する。Ａ８置換を安定化させる例は、アルギニン、グルタミン酸、及びヒスチジンにより提供されるが、これらに限定されない。理論により拘束されることは望まないが、我々は、位置Ａ１４における帯電性または極性の非ベータ分岐性置換は、二鎖インスリン類額及びＳＣＩを、野生型ヒトインスリンにおけるＴｙｒＡ１４の溶媒露出に関連する逆疎水性効果の軽減ゆえ、物理的及び化学的両者の分解から保護すると想像する。前述された安定化要素のセットのなかでは、我々は、ＰｈｅＢ２４の環位置２におけるハロゲン修飾（つまり、オルト－Ｆ－ＰｈｅＢ２４、オルト－Ｃｌ－ＰｈｅＢ２４、またはオルト－Ｂｒ－ＰｈｅＢ２４；熱力学的安定性及びフィブリル化に対する耐性を向上させることが意図される）は、化学的分解及び物理的分解の両者から保護する分子メカニズムを提供するとも想像する。我々は同様に、（ＬｙｓＢ２９により提供される）位置Ｂ２９における天然型の正電荷の除去は、高温において、システインＢ４－Ａ１０を含有する二鎖インスリン類似体の、またはシステインＢ４－Ａ１０を含有するＳＣＩの、フィブリル化に対する耐性を漸増的に向上させるであろうと想像する。Ｂ２９置換は、グルタミン酸、または中性の脂肪族の標準型もしくは非標準型アミノ酸でありうる。標準型の中性脂肪族残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕからなる群から選択されるであろう。非標準型のそのような残基は、アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、またはノルロイシンの群から選択されるであろう。
【0020】
さらに、ヒトおよび動物インスリン間の類似性、並びに糖尿病を有するヒト患者における動物インスリンの過去の使用の観点から、インスリンの配列中の他の小さな改変、とくに「保存的」と見なされる置換が導入されうることもまた想像される。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸群内でのアミノ酸の追加の置換も、本発明から逸脱することなくなされうる。これらは、中性疎水性アミノ酸である、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、及びメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、及びアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内で互いに置換されうる。塩基性アミノ酸は、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及びヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むとみなされる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）及びグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別に記されない限り、あるいは文脈から明らかであるいずれの場合も、本明細書に記されるアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であるとみなされるべきである。標準型アミノ酸は、同じ化学的クラスに属する非標準型アミノ酸により置換されてもまたよい。比限定的な例としては、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖長の塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）により置換されうる。Ｌｙｓは中性脂肪族アイソスターであるノルロイシン（Ｎｌｅ）により置換されてもよく、次いでより短い脂肪族側鎖を含有する類似体（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）により置換されてもよい。
【実施例1】
【0021】
例としては、タンパク質－ＰＧ－ＬＡポリマー混合物は、インスリンｌｉｓｐｒｏ（配列ＩＤ番号：２及び１３）、ＣｙｓＡ１０、ＣｙｓＢ４置換を追加で含有するｌｉｓｐｒｏインスリン（ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９－ヒトインスリン）の類似体（配列番号：２及び１４）、５９アミノ酸残基のＳＣＩ（配列ＩＤ番号：９）、及び残基Ｂ４とＡ１０との間に第四ジスルフィド架橋を含有するようにＣｙｓＡ１０、ＣｙｓＢ４置換で改変された対応する５９マーＳＣＩ（配列ＩＤ番号：１０）を含有するように調製された。これらのＳＣＩは、配列ＥＥＧＳＲＲＳＲのＣドメインを含有した。Ａドメインは、Ａ８においてトレオニンの代わりにアルギニンを含有するように改変された。Ｂドメインは、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてプロテアーゼ消化を回避するように、リシンの代わりにアルギニンを含有するように改変された。このＳＣＩの等電点はゆえに、６．５－７．５の範囲にあるが、ｐＨ範囲２－４において容易に可溶である。インスリン受容体のＡ及びＢアイソフォームに対するその親和性は、野生型ヒトインスリンと比較して１０－１５０％の範囲にあるが、一方で１型ＩＧＦ受容体に対する親和性は、野生型インスリンのそれと比較して１０倍低い。このＳＣＩ及びシステインＢ４－Ａ１０の予測位置の三次元モデルが、図２に示される。
【0022】
上の三つのポリマー混合物は、ストリップ状に成形された（図３Ａ）。ポリマーは、機能的ホルモンの潜在的回収を評価するため、２日にわたり０．０１％トリフルオロ酢酸中で２０℃にて分解させられた。活性ｌｉｓｐｒｏは回収されなかったのに対し、ラットでの試験は、～４０％のＳＣＩ回収（図３Ｂ）、及び第四ジスルフィド架橋を含有する機能的改変ＳＣＩの本質的には完全な回収（図３Ｃ）を示した。この「超安定型」インスリン類似体の高温タンパク質－ポリマー混合物への押出物の頑強さは、糖尿病の治療のための長期分解可能型治療ポリマー混合物を提供する技術としての格別な保証である。本例がｐＨ７．４付近の等電点を呈する単鎖インスリン類似体を利用することは特筆されるべきである。このことは、その根本的なＰＫ／ＰＤ特性を将来の安全メカニズムとして活用することが可能であることを示す。もしもマイクロニードルが砕けて皮下で迅速に分解するならば、放出される類似体は、沈殿を経て急性低血糖症を回避する。
【0023】
ｐＨ７．４におけるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのインスリン類似体タンパク質のポリマー溶融物からの溶出もまた、調べられた。試験用円筒形ポリマーが、残基Ｂ４とＡ１０との間の第四ジスルフィド架橋により安定化された、２５重量／重量％の単鎖インスリン（ＳＣＩ）類似体を含有する５０％－５０％ＰＬＧＡを用いて調製された。類似体（４ＳＳ－８１－０６と命名；配列ＩＤ番号：１２）は、配列ＥＥＧＰＲＲの六残基リンカー、Ａドメインにおける二つの置換（ＴｈｒＡ８のＨｉｓによる置換、及びＴｙｒＡ１４のＧｌｕによる置換）、並びにＢドメインにおける一つの置換（ＬｙｓＢ２９のＧｌｕによる置換）を含有する。混合された粉末は、摂氏９５度まで１０分にわたり加熱され、それから特別なシリンジ押出装置を使用して力により迅速に押し出し通された。押し出されたポリマー円筒物（直径１ｍｍ及び長さ８ｍｍ；１０ｍｇ）は、０、５、または１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；平均分子質量８ｋＤａ）を含有するＰＬ、ＧＡ、及びＳＣＩ粉末の混合物を使用して調製された。ポリマーからのＳＣＩの放出速度に対する遊離ＰＥＧ分子の影響を調べるため、円筒物は、ｐＨ７．４かつ３７℃にあるリン酸緩衝生理食塩水中に、穏やかな振盪を伴いながら、配置された。緩衝液は毎日置換された。５００マイクロリットルの溶液は毎日回収され、５００μＬの新しい（０．１％）アジ化ナトリウムを有するＰＢＳと置換された。ポリマーは第０日の午後の間に溶液中に配置され、試料はおおよそ２４時間毎に回収された。第０日試料は、ポリマーが溶液中に浸漬された直後（<５分）に回収された。
【0024】
ＰＥＧの非存在（０％）下では１０日間にわたり殆どタンパク質が放出されなかったのに対し、１０％ＰＥＧの添加は、１～２日にわたり相当な放出をもたらした。５％ＰＥＧの添加は、１０日間にわたり、搭載タンパク質の約半分の線形に近い放出をもたらした（図４中の三角；インスリン類似体濃度は、ＥＬＩＳＡによりキャリブレーションされたＢｒａｄｆｏｒｄ解析により測定された）。インスリン類似体の代わりにニワトリ卵白リゾチームを含有する類似の共重合体のコントロール実験においては、類似の溶出特性が観察された（図４中の四角；任意単位）。両方の場合において、横軸方向のプラトーが第１０～１５日の間に観察され、このことはポリマーからタンパク質の更なる放出がないことを示す。放出されたタンパク質の累計量もまた、以下の表１において提供される。この表においては、Ｂｒａｄｆｏｒｄ解析に対応するマイクログラムのインスリンはＥＬＩＳＡにより確認されたが、リゾチームについての読み値は、独立の解析によってはキャリブレーションされていない。
【表1】
【0025】
放出ＳＣＩホルモン類似体の（５％ＰＥＧで調製されたポリマー溶融物中における）生物活性が、糖尿病を有する雄Ｌｅｗｉｓラット（平均重量約３００グラム、ストレプトゾトシンにより糖尿病に罹らせられ、平均血糖約４００ｍｇ／ｄｌを伴う）において試験され、未加工のＳＣＩの血液グルコース低下活性が第１日及び第５日の後に溶出されたタンパク質の活性と比較された。これら三つの試料の生物活性は区別不可能であった。このことは、体温における生理学的緩衝液中での、熱溶融物押出、及び徐放のプロセスは、有効性の損失とは関係ないことを示す。
【表2】
【0026】
５７マーＳＣＩ（本明細書においては８１－０４と記される；配列ＩＤ番号：１６）、及び第四ジスルフィド架橋を含有するその誘導体（４ＳＳ ８１－０４；配列ＩＤ番号：１５）の生物活性が、比較された。３００グラムのラットあたりに２０マイクログラム用量を与え、生物活性は本質的に同一である（図５）。８１－０４の配列は、ＣｙｓＡ１０、ＣｙｓＢ４の非存在を除けば配列ＩＤ番号：１２のそれと類似しており、さらに残基Ｂ２８はアスパラギン酸であり、残基Ｂ２９はプロリンである。このことは、単鎖インスリン類似体分子への第四ジスルフィド架橋の導入は、ＳＣＩの根本的な生物活性を変化させないこと示す。これは、先行技術を観ると驚くべきことである。先行技術は、二鎖類似体においては、第４ジスルフィド架橋を導入すると薬力学的応答の著しい延長が起こることを示した。
【0027】
類似体８１－０４、及び類似体４ＳＳ ８１－０４の受容体結合親和性もまた、決定された。４ＳＳ ８１－０４のインスリン受容体のＡアイソフォームに対する親和性は、ヒトインスリンと比較して１２０±２０パーセントであると決定された（また、エラーが存在するとすれば、実際には野生型ヒトインスリンと同じであるかもしれない；データ表示なし）。インスリン受容体のＢアイソフォームに対する親和性は、野生型ヒトインスリンと比較して五倍と十倍との間、低下させられる。Ａアイソフォームに対する優先性は、元の類似体８１－０４のそれと類似する。さらに、４ＳＳ ８１－０４の分裂促進性ＩＧＦ Ｉ型受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）親和性に対する親和性は、野生型ヒトインスリンと比較して五倍と十倍との間、低下させられる（データ表示なし）。そのようなＩＧＦ－１Ｒに対する損なわれた結合は、長期使用における潜在的発癌の観点からは望ましい。
【0028】
本明細書において開示されるポリペプチドの配列は、以下に提供される。ヒトプロインスリンのアミノ酸配列は、比較の目的のため、配列ＩＤ番号：１として提供される。
【0029】
配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0030】
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：２として提供される。
【0031】
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0032】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：３として提供される。
【0033】
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ
【0034】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：４において提供され、位置Ｂ４及びＡ１０において第四のシステインを含有し、また、ＳＣＩが示される位置のうち一つまたはそれ以上において少なくとも一つの他の安定化改変を含有するような長さ５６、５７、５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のポリペプチドに対応する。
【0035】
配列ＩＤ番号：４
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ－［短縮型Ｃドメイン］－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｘａａ４－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｘａａ５
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ－［短縮型Ｃドメイン］－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｘａａ４－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｘａａ５
【0036】
配列中、Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、またはオルトもしくは環位置２におけるハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒ）によるＰｈｅの修飾型を表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ノルロイシン、アミノプロピオン酸、またはアミノ酪酸を表わし、Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、または、別の非ベータ分岐型極性もしくは帯電性アミノ酸であり、Ｘａａ４は、Ｔｙｒ（野生型インスリンにおいてと同様）、Ｇｌｕ、または別の非ベータ分岐型の極性もしくは帯電性アミノ酸であり、かつ任意でＸａａ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐ、またはＳｅｒである。括弧入りの用語「短縮型Ｃドメイン」は、第一（Ｎ末端）または第二ペプチド位置（つまり、単鎖インスリン類似体の残基３１または３２）において酸性残基を含有する、５－１１残基長の連結ペプチドドメインを指す。任意で、ｄｅｓ－Ｂ１類似体を生じるようにＰｈｅＢ１が欠失させられてもよく、また、ｄｅｓ－［Ｂ１、Ｂ２］類似体を生じるようにＰｈｅＢ１とＶａｌＢ２との両者が除かれてもよい。
【0037】
本発明の二鎖インスリン類似体のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：５－８において提供され、完全なインスリン類似体が、位置Ｂ４とＡ１０との間の第四のジスルフィド架橋、並びに指定される位置において少なくとも一つの他の安定化改変を含有するように、位置Ｂ４においてシステインを含有するＢ鎖（配列ＩＤ番号：５、７、及び８）、並びに位置Ａ１０においてシステインを含有するＡ鎖（配列ＩＤ番号：６）に対応する。
【0038】
配列ＩＤ番号：５（変異型Ｂ鎖）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
【0039】
配列中、Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、またはオルトもしくは環位置２におけるハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、もしくはＢｒ）によるＰｈｅの修飾型を表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ノルロイシン、アミノプロピオン酸、またはアミノ酪酸を表わす。
【0040】
配列ＩＤ番号：６（変異型Ａ鎖）
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｘａａ４－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｘａａ５
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｘａａ４－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｘａａ５
【0041】
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、または、別の非ベータ分岐型の極性もしくは帯電性アミノ酸であり、Ｘａａ４は、Ｔｙｒ（野生型インスリンにおいてと同様）、Ｇｌｕ、または別の非ベータ分岐型極性もしくは帯電性アミノ酸であり、かつ任意でＸａａ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐ、またはＳｅｒである。
【0042】
配列ＩＤ番号：７（変異型ｄｅｓ－［Ｂ１］－Ｂ鎖）
Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
【0043】
配列中、Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、またはオルトもしくは環位置２におけるハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、もしくはＢｒ）によるＰｈｅの修飾型を表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ノルロイシン、アミノプロピオン酸、またはアミノ酪酸を表わす。
【0044】
配列ＩＤ番号：８（変異型ｄｅｓ－［Ｂ１、Ｂ２］－Ｂ鎖）
Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｘａａ１－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ２－Ｔｈｒ
【0045】
配列中、Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、またはオルトもしくは環位置２におけるハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、もしくはＢｒ）によるＰｈｅの修飾型を表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ノルロイシン、アミノプロピオン酸、またはアミノ酪酸を表わす。
【0046】
単鎖インスリン（ＳＣＩ）類似体は、配列ＩＤ番号：９－１２、１５、及び１６として提供される。
【0047】
配列ＩＤ番号：９
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0048】
配列ＩＤ番号：１０
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0049】
配列ＩＤ番号：１１
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0050】
配列ＩＤ番号：１２（８１－０６６－４ＳＳ）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0051】
配列ＩＤ番号：１３（ヒトＢ鎖、ＫＰ）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
【0052】
配列ＩＤ番号：１４（ヒトＢ鎖、Ｃｙｓ Ｂ４、ＫＰ）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
【0053】
配列ＩＤ番号：１５（４ＳＳ ８１－０４；５７マー）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0054】
配列ＩＤ番号：１６（８１－０４；５７マー）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
【0055】
以上の開示内容に基づけば、提供される単鎖インスリン類似体が本明細書において上で述べられた目的を実施するであろうことはもう明らかであるはずである。つまり、これらのインスリン類似体は、（より延長された作用を与える）望ましい薬物動態及び薬力学的特性を保持し、かつ野生型インスリンの生物活性の少なくとも一部を維持しつつ、フィブリル化に対する増強された耐性を呈する。従って、特許請求の範囲に係る本発明の範囲内に明らかに入るあらゆる変化、またゆえに特定の成分要素の選択は、本明細書で開示及び記述された本発明の真髄から逸れることなく決定されうると理解されるべきである。
【0056】
本明細書において開示される試験及び解析法が当業者により理解されるであろうことを示すために、以下の文献が引用される。
Ａｈｍｅｄ，Ｔ．２０１５．Ｒｅｖｉｅｗ：ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ＰＬＧＡ ｂａｓｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｉｎｉｔｉａｌ ｂｕｒｓｔ．Ｐａｋ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２８：６５７－６５．
Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．，& Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．２０１２．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６．８０９－１５．
Ｈｕａ， Ｑ．Ｘ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．Ｈ．，Ｊｉａ，Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｈｕ，Ｓ．& Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２００８）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３－１４７１６．
Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｓ．，Ｈａｃｈ，Ｍ．，Ｗｉｂｅｒｇ，Ｆ．Ｃ．，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｌ．，& Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，Ｔ．１９９５．Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ／ｉｎｓｕｌｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｂｉｎｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５，９８１－６．
Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｃ．，& Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｗ．２０００．Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４０８，４８３－８． Ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ：Ｌｅｅ ＨＣ，Ｋｉｍ ＫＳ，Ｓｈｉｎ ＨＣ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４５８，６００．
Ｌｅｅ，Ｐ，Ｔｏｗｓｌｅｅ Ｊ，Ｍａｉａ Ｊ，ａｎｄ Ｐｏｋｏｒｓｋｉ Ｊ．２０１５． ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍｅｌｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１５：１３３２－７．
Ｏｒｔｅｇａ－Ｏｌｌｅｒ，Ｉ，Ｐａｄｉａｌ－Ｍｏｌｉｎａ Ｍ，Ｇａｌｉｎｄｏ－Ｍｏｒｅｎｏ Ｐ，Ｏ'Ｖａｌｌｅ Ｆ，Ｊｏｄａｒ－Ｒｅｙｅｓ ＡＢ，ａｎｄ Ｐｅｕｌａ－Ｇａｒｃｉａ ＪＭ． ２０１５．Ｂｏｎｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＰＧＬＡ Ｍｉｃｒｏ－Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１５：４１５２８９．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，Ｉｓｍａｉｌ－Ｂｅｉｇｉ，Ｆ．，& Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２０１２）Ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ： ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｔｏ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａ ｐｕｍｐ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６，２７７－２８８．
Ｒａｈｉｍｉａｎ，Ｓ．，Ｆｒａｎｓｅｎ ＭＦ，Ｋｌｅｉｎｏｖｉｎｋ ＪＷ，Ａｍｉｄｉ Ｍ，Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ Ｆ，ａｎｄ Ｈｅｎｎｉｎｋ ＷＥ．２０１５．Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｏｌｙ（Ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－Ｇｌｙｃｏｌｉｃ）Ａｃｉｄ（ｐＬＧＡ）ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２１：４２０１－１６．
Ｖｉｎｔｈｅｒ ＴＮ，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｉ，Ｈｕｕｓ Ｋ，Ｓｃｈｌｅｉｎ Ｍ， Ｓｔｅｅｎｓｇａａｒｄ ＤＢ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ａ，Ｊｅｎｓｅｎ ＫＪ，Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｔ，ａｎｄ Ｈｕｂａｌｅｋ Ｆ．２０１５．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｉｓｕｌｉｎ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２４：７７９－８８．
Ｖｉｎｔｅｒ ＴＮ， Ｎｏｒｒｍａｎ Ｍ，Ｒｉｂｅｌ Ｕ，Ｈｕｕｓ Ｋ，Ｓｃｈｌｅｉｎ Ｍ，Ｓｔｅｅｎｓｇａａｒｄ ＤＢ， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＴＡ，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｉ，Ｌｕｄｖｉｇｓｅｎ Ｓ，Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｔ，Ｊｅｎｓｅｎ ＫＪ，ａｎｄ Ｈｕｂａｌｅｋ Ｆ．２０１３．Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｈａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２：２９６－３０５．
Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｘ．，１９９５．Ａｎ ｅｘａｃｔ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６０：１１１－１１４．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２－２０９３６．
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A-3C】
【図4】
【図5】
【配列表】