特許 7204004 肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出する試薬キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-04

(45)【発行日】2023-01-13

(54)【発明の名称】肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出する試薬キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20230105BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230105BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230105BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230105BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z ZNA

C12Q1/686 Z

G01N33/53 M

C12N15/12

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021554770

(86)(22)【出願日】2021-01-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-14

(86)【国際出願番号】 CN2021070914

(87)【国際公開番号】W WO2021139783

(87)【国際公開日】2021-07-15

【審査請求日】2021-12-03

(31)【優先権主張番号】202010029160.4

(32)【優先日】2020-01-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518318761

【氏名又は名称】厦門艾徳生物医薬科技股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】江風閣

(72)【発明者】

【氏名】黄蛤目

(72)【発明者】

【氏名】陳寧

(72)【発明者】

【氏名】李碩卿

(72)【発明者】

【氏名】蔡阿沙

(72)【発明者】

【氏名】鄭偉偉

(72)【発明者】

【氏名】林小洪

(72)【発明者】

【氏名】宋慶涛

(72)【発明者】

【氏名】鄭立謀

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５２６５６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３２４３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２４０５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０２９０５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１５３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１８１２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３４８０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７８４１７９３（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４８１８３１８（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４８１８３２０（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０９７０６２３２（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１４８４９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Yuan Li et al.，Psammoma bodies in lung adenocarcinoma: Incidence and association with ALK/ROS1/RET fusions.，Laboratory Investigation，2015年01月30日，Vol. 95, Suppl. 1，p. 483A, Abstract No. 1937，DOI:10.1038/labinvest.2015.24

【文献】Kengo Takeuchi et al.，RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer，NATURE MEDICINE，2012年03月，Vol. 18, No. 3，p. 378-381，DOI:10.1038/nm.2658

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｇ０１Ｎ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｍ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キットにおいて、
肺癌の遺伝子融合のＡ１群部位を検出するための試薬であって、前記Ａ１群部位が、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１からＥＭＬ４－ＡＬＫ－３、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－６からＥＭＬ４－ＡＬＫ－１４、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１７からＥＭＬ４－ＡＬＫ－２１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－２、ＫＬＣ１－ＡＬＫ、ＴＦＧ－ＡＬＫ、ＳＴＲＮ－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－２、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－３、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－１、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－２、ＮＢＡＳ－ＡＬＫ－１、ＴＦＧ－ＡＬＫ－２、ＰＰＭ１Ｂ－ＡＬＫ－１、ＥＩＦ２ＡＫ３－ＡＬＫ－１、ＢＣＬ１１Ａ－ＡＬＫ－１、ＢＩＲＣ６－ＡＬＫ－１、ＣＥＢＰＺ－ＡＬＫ－１、ＣＬＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＣＯＬ２５Ａ１－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－２、ＬＭＯ７－ＡＬＫ－１、ＰＩＣＡＬＭ－ＡＬＫ－１、ＰＨＡＣＴＲ１－ＡＬＫ－１、ＴＰＲ－ＡＬＫ－１、ＭＰＲＩＰ－ＡＬＫ－１、ＴＮＩＰ２－ＡＬＫ－１、ＤＣＴＮ１－ＡＬＫ－１、ＳＱＳＴＭ１－ＡＬＫ－１、を含む試薬と、
肺癌の遺伝子融合のＡ５群部位を検出するための試薬であって、前記Ａ５群部位がＲＯＳ１－Ｍ１からＲＯＳ１－Ｍ１０を含む試薬と、
肺癌の突然変異遺伝子のＢ１群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ１群部位が、Ｅ－１９－Ｍ１からＥ－１９－Ｍ２１、Ｅ－１９－Ｍ２４からＥ－１９－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ２を含む試薬と、
肺癌の突然変異遺伝子のＢ２群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ２群部位が、Ｅ－２１－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ２、Ｅ－１８－Ｍ３を含む試薬と、
肺癌の突然変異遺伝子のＢ３群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ３群部位が、Ｅ－２０－Ｍ１、Ｅ－２１－Ｍ２を含む試薬、を含むことを特徴とする試薬キット。

【請求項2】

前記試薬キットの反応系は、
（１）精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとする逆転写反応系と、
（２）精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとするＰＣＲ反応系、を含むことを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項3】

前記試薬の組み合わせには、肺癌の遺伝子融合のＡ１群部位を検出するための試薬の組み合わせ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項4】

前記試薬の組み合わせには、肺癌の遺伝子融合のＡ５群部位を検出するための試薬の組み合わせ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項5】

前記試薬の組み合わせには、肺癌の遺伝子融合のＢ１群部位を検出するための試薬の組み合わせ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項6】

前記試薬の組み合わせには、肺癌の遺伝子融合のＢ２群部位を検出するための試薬の組み合わせ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項7】

前記試薬の組み合わせには、肺癌の遺伝子融合のＢ３群部位を検出するための試薬の組み合わせ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項8】

肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キットにおいて、
ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１からＥＭＬ４－ＡＬＫ－３、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－６からＥＭＬ４－ＡＬＫ－１４、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１７からＥＭＬ４－ＡＬＫ－２１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－２、ＫＬＣ１－ＡＬＫ、ＴＦＧ－ＡＬＫ、ＳＴＲＮ－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－２、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－３、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－１、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－２、ＮＢＡＳ－ＡＬＫ－１、ＴＦＧ－ＡＬＫ－２、ＰＰＭ１Ｂ－ＡＬＫ－１、ＥＩＦ２ＡＫ３－ＡＬＫ－１、ＢＣＬ１１Ａ－ＡＬＫ－１、ＢＩＲＣ６－ＡＬＫ－１、ＣＥＢＰＺ－ＡＬＫ－１、ＣＬＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＣＯＬ２５Ａ１－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－２、ＬＭＯ７－ＡＬＫ－１、ＰＩＣＡＬＭ－ＡＬＫ－１、ＰＨＡＣＴＲ１－ＡＬＫ－１、ＴＰＲ－ＡＬＫ－１、ＭＰＲＩＰ－ＡＬＫ－１、ＴＮＩＰ２－ＡＬＫ－１、ＤＣＴＮ１－ＡＬＫ－１、ＳＱＳＴＭ１－ＡＬＫ－１、を含むＡ１群部位を検出するための試薬と、
ＮＴＲＫ１－Ｅ９－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ３、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ５からＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ９、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１２、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１４、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１５、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１７、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ３、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ４、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１２、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１４、を含むＡ２群部位を検出するための試薬と、
ＮＴＲＫ２－Ｅ１５－Ｍ１、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ１、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ３、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ７、ＮＴＲＫ２－Ｅ１７－Ｍ２、を含むＡ３群部位を検出するための試薬と、
ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ１、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ２、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ３、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ４、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ７、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ１、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ２、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ３、を含むＡ４群部位を検出するための試薬と、
ＲＯＳ１－Ｍ１からＲＯＳ１－Ｍ１０を含むＡ５群部位を検出するための試薬と、
ＲＯＳ１－Ｍ１１、ＲＯＳ１－Ｍ１２、ＲＯＳ１－Ｍ１３、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１からＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ４、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ６、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ８からＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１１、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１３、を含むＡ６群部位を検出するための試薬と、
ＭＥＴ－Ｍ１を含むＡ７群部位を検出するための試薬と、
ＲＥＴ－Ｍ２、ＲＥＴ－Ｍ５、ＲＥＴ－Ｍ１５、ＲＥＴ－Ｍ１６、ＲＥＴ－Ｍ１７、ＲＥＴ－Ｍ１９、ＬＲＥＴ－Ｍ２２、ＬＲＥＴ－Ｍ３２、ＬＲＥＴ－Ｍ４０、ＬＲＥＴ－Ｍ４１、ＬＲＥＴ－Ｍ４２、ＬＲＥＴ－Ｍ４４、ＬＲＥＴ－Ｍ４５、ＬＲＥＴ－Ｍ４９、ＬＲＥＴ－Ｍ５５、ＬＲＥＴ－Ｍ５７、ＬＲＥＴ－Ｍ５８、ＬＲＥＴ－Ｍ５９、を含むＡ８群部位を検出するための試薬と、
Ｅ－１９－Ｍ１からＥ－１９－Ｍ２１、Ｅ－１９－Ｍ２４からＥ－１９－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ２を含むＢ１群部位を検出するための試薬と、
Ｅ－２１－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ２、Ｅ－１８－Ｍ３を含むＢ２群部位を検出するための試薬と、
Ｅ－２０－Ｍ１、Ｅ－２１－Ｍ２を含むＢ３群部位を検出するための試薬と、
Ｅ－２０－Ｍ４、Ｅ－２０－Ｍ５、Ｅ－２０－Ｍ８、Ｅ－２０－Ｍ９、Ｅ－２０－Ｍ１３、Ｅ－２０－Ｍ１４、Ｅ－２０－Ｍ２０、Ｅ－２０－Ｍ２１、Ｅ－２０－Ｍ２３、Ｅ－２０－Ｍ２４、Ｅ－２０－Ｍ２８からＥ－２０－Ｍ３１、Ｅ－２０－Ｍ３６からＥ－２０－Ｍ４１、Ｅ－２０－Ｍ４４、Ｅ－２０－Ｍ４８、Ｅ－２０－Ｍ５０からＥ－２０－Ｍ５３、ＢＲＡＦ－Ｍ１、を含むＢ４群部位を検出するための試薬と、
Ｅ－２０－Ｍ３、Ｅ－２０－Ｍ１０、Ｅ－２０－Ｍ１２、Ｅ－２０－Ｍ１５からＥ－２０－Ｍ１９、Ｅ－２０－Ｍ２２、Ｅ－２０－Ｍ２５からＥ－２０－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ３２からＥ－２０－Ｍ３５、Ｅ－２０－Ｍ４２、Ｅ－２０－Ｍ４３、Ｅ－２０－Ｍ４５からＥ－２０－Ｍ４７、Ｅ－２０－Ｍ４９、Ｅ－２０－Ｍ５５からＥ－２０－Ｍ５７、ＫＲＡＳ－Ｍ６、を含むＢ５群部位を検出するための試薬と、
ＨＥＲ２－Ｍ１からＨＥＲ２－Ｍ３、ＨＥＲ２－Ｍ８、ＨＥＲ２－Ｍ９、ＨＥＲ２－Ｍ１５からＨＥＲ２－Ｍ２６、ＫＲＡＳ－Ｍ２、ＫＲＡＳ－Ｍ３、ＫＲＡＳ－Ｍ５、ＫＲＡＳ－Ｍ１４、を含むＢ６群部位を検出するための試薬と、
ＨＥＲ２－Ｍ４、ＨＥＲ２－Ｍ６、ＨＥＲ２－Ｍ７、ＨＥＲ２－Ｍ１０、ＫＲＡＳ－Ｍ１、ＫＲＡＳ－Ｍ４、を含むＢ７群部位を検出するための試薬、という１５個の組み合わせを含む試薬キット。

【請求項9】

前記試薬キットの反応系は、
（１）精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとする逆転写反応系と、
（２）精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとするＰＣＲ反応系、を含むことを特徴とする請求項８に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項10】

前記試薬の組み合わせには、
肺癌の遺伝子融合のＡ１群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、
肺癌の遺伝子融合のＡ２群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、
肺癌の遺伝子融合のＡ３群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、
肺癌の遺伝子融合のＡ４群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、
肺癌の遺伝子融合のＡ５群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、
肺癌の遺伝子融合のＡ６群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、
肺癌の遺伝子融合のＡ７群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、
肺癌の遺伝子融合のＡ８群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４、
肺癌の遺伝子融合のＢ１群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、
肺癌の遺伝子融合のＢ２群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７、
肺癌の遺伝子融合のＢ３群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８、
肺癌の遺伝子融合のＢ４群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、
肺癌の遺伝子融合のＢ５群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４、
肺癌の遺伝子融合のＢ６群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２、
肺癌の遺伝子融合のＢ７群部位を検出するための試薬：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３、のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項８に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項11】

更に、サンプルの品質管理に用いられる外部コントロール試薬の組み合わせを含むことを特徴とする請求項８に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項12】

前記試薬の組み合わせには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１のプライマー及びプローブが含まれることを特徴とする請求項１１に記載の肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キット。

【請求項13】

肺癌の複数遺伝子突然変異を検出するための組成物であって、
当該組成物は、下記表に示す２８１個の配列のプライマー及びプローブを含み、且つ、当該２８１個の配列は、２本のＰＣＲ ８連チューブで下記の表のようにグループ分けされて充填されることを特徴とする組成物。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【請求項14】

前記プライマー及びプローブの反応系は、
（１）精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとする逆転写反応系と、
（２）精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとするＰＣＲ反応系、を含むことを特徴とする請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

請求項１３に記載の２８１個の配列のプライマー及びプローブを含む試薬キット。

【請求項16】

前記試薬キットは２種類のＰＣＲ ８連チューブを含み、当該２種類のＰＣＲ ８連チューブは、肺癌のＲＮＡ遺伝子融合及び肺癌のＤＮＡ遺伝子突然変異をそれぞれ検出することを特徴とする請求項１５に記載の試薬キット。

【請求項17】

前記ＰＣＲ ８連チューブ内で肺癌のＲＮＡ遺伝子融合を検出するための検出試薬は、ＡＬＫ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２及びＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出試薬を各１本、ＲＯＳ１融合遺伝子の検出試薬を２本、ＭＥＴエクソン１４スキッピング遺伝子突然変異の検出試薬を１本、ＲＥＴ融合遺伝子の検出試薬を１本含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の試薬キット。

【請求項18】

前記ＰＣＲ ８連チューブ内で肺癌のＤＮＡ遺伝子突然変異を検出するための検出試薬は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ／ＫＲＡＳ、ＨＥＲ２／ＫＲＡＳ、ＨＥＲ２／ＫＲＡＳ突然変異遺伝子の検出試薬を各１本、外部コントロールの検出試薬を１本含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の試薬キット。

【請求項19】

請求項１５～１８のいずれか１項に記載の試薬キットの使用方法であって、
（１）検出サンプルのＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、前記検出サンプルには、新鮮な病理組織、パラフィン包埋組織又はパラフィン切片組織が含まれており、
（２）前記ＲＮＡと逆転写酵素を混合し、逆転写反応液をそれぞれ加えてｃＤＮＡを取得し、
（３）前記ＤＮＡと前記ｃＤＮＡをそれぞれ混合酵素と混合して、ＰＣＲ ８連チューブに投入し、
（４）蛍光ＰＣＲ増幅装置を用いて増幅させたあと、表示されたＣｔ値から検出結果を判定することを特徴とする使用方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、より具体的には、肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出するプライマー、プローブ、検出システム及び試薬キットに関する。

【背景技術】

【0002】

肺癌は、ヒトの健康を深刻に阻害する一般的な悪性腫瘍の１つであり、８０～８５％の肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣ患者には複数種類の遺伝子突然変異のタイプが存在し、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の頻度は、それぞれ、約１０～５０％、１～４％、５～２５％、１～２％となっている。また、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３遺伝子の融合発生頻度は、それぞれ、約３～７％、１％、１％、０．１２％、０．０２％、０．０８％、ＭＥＴエクソン１４スキッピングの遺伝子突然変異の発生頻度は約１％となっている。膨大な臨床研究の結果、ドライバー遺伝子の突然変異状態は、標的薬物療法にとって重要な治療効果予測因子となることが明らかとなっている。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ遺伝子に突然変異が見られる患者は、対応するチロシンキナーゼ阻害薬治療において効果を得ることができ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３遺伝子に融合が見られる患者も、チロシンキナーゼ阻害薬治療において効果を得ることができる。また、ＭＥＴエクソン１４スキッピングの遺伝子突然変異が見られる患者は、ＭＥＴ阻害剤治療において効果を得ることができる。「ＮＣＣＮ非小細胞肺癌ガイドライン」では、標的治療に先立ち、遺伝子の突然変異状態を検出すべき旨を明確に指摘しており、且つ、より幅広く有効遺伝子の状態検出を行うよう強く推奨している。そこで、ＮＳＣＬＣ患者に対する複数遺伝子突然変異複合検出によれば、より的確な治療を患者に提供可能となる。ただし、試薬キットによるこの検出結果は臨床上の参考にすぎず、患者のカスタマイズ治療における唯一の根拠とすべきではない。臨床医は、患者の病状、薬物の適応症、治療反応及びその他の実験室検査指標等の要素を組み合わせて、検出結果を総合的に判断すべきである。

【0003】

上記の遺伝子突然変異又は融合状態は標的薬物の治療効果に関連しており、複数遺伝子の複合検出によって予後の予測精度を更に高めることが可能となる。しかし、現在の大多数の試薬キットは、１回ごとに１種類又は数種類の遺伝子突然変異を検出することしかできない。そのため、検出スループットが低く、所要時間が長くかかり、サンプルの必要量が多くなる。現在、市場において科学研究に用いられているＮＧＳ Ｐａｎｅｌでも上記１１種類の遺伝子を一括で検出することは可能であるが、ＮＧＳは、高価、操作が煩雑、データ分析が複雑、サンプル使用量が多い等の要因から利用普及が阻まれている。また、今のところ、臨床では、これら１１種類の注目遺伝子の検出を同時に一括で完了可能なＰＣＲ試薬キットは存在しない。そこで、本発明は、１１種類の肺癌遺伝子を一括検出する高感度且つ高特異性のプライマー、プローブ、試薬キット及びプライマーの割当方式を提供する。当該検出用試薬キットは、ＤＮＡ及びＲＮＡサンプルを使用して、遺伝子突然変異及び遺伝子融合の検出をそれぞれ実施する。当該試薬キットは、検出の特異性及び感度が高く、検出結果の再現性に優れ、操作が簡便且つスピーディーであり、臨床において、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３及びＭＥＴという１１種類の遺伝子突然変異／融合の検出のために迅速且つ確実な検出方法を提供する。当該方法によって、ＰＣＲプラットフォームは、肺癌の１１種類の遺伝子を一括で検出可能となる。また、当該方法は、上市済み及び今後３～５年のうちに上市見込みの肺癌標的薬物における重要遺伝子標的の全てをカバーしている。よって、当該方法は、臨床において、最短時間且つ最少のサンプル数で、患者がプレシジョン・メディシンから利益を得られるよう資するものである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的の１つは、肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キットを提供することである。当該試薬キットは、肺癌の遺伝子融合のＡ１群部位を検出するための試薬であって、前記Ａ１群部位が、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１からＥＭＬ４－ＡＬＫ－３、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－６からＥＭＬ４－ＡＬＫ－１４、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１７からＥＭＬ４－ＡＬＫ－２１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－２、ＫＬＣ１－ＡＬＫ、ＴＦＧ－ＡＬＫ、ＳＴＲＮ－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－２、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－３、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－１、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－２、ＮＢＡＳ－ＡＬＫ－１、ＴＦＧ－ＡＬＫ－２、ＰＰＭ１Ｂ－ＡＬＫ－１、ＥＩＦ２ＡＫ３－ＡＬＫ－１、ＢＣＬ１１Ａ－ＡＬＫ－１、ＢＩＲＣ６－ＡＬＫ－１、ＣＥＢＰＺ－ＡＬＫ－１、ＣＬＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＣＯＬ２５Ａ１－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－２、ＬＭＯ７－ＡＬＫ－１、ＰＩＣＡＬＭ－ＡＬＫ－１、ＰＨＡＣＴＲ１－ＡＬＫ－１、ＴＰＲ－ＡＬＫ－１、ＭＰＲＩＰ－ＡＬＫ－１、ＴＮＩＰ２－ＡＬＫ－１、ＤＣＴＮ１－ＡＬＫ－１、ＳＱＳＴＭ１－ＡＬＫ－１、を含む試薬と、肺癌の遺伝子融合のＡ５群部位を検出するための試薬であって、前記Ａ５群部位がＲＯＳ１－Ｍ１からＲＯＳ１－Ｍ１０を含む試薬と、肺癌の突然変異遺伝子のＢ１群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ１群部位が、Ｅ－１９－Ｍ１からＥ－１９－Ｍ２１、Ｅ－１９－Ｍ２４からＥ－１９－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ２を含む試薬と、肺癌の突然変異遺伝子のＢ２群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ２群部位が、Ｅ－２１－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ２、Ｅ－１８－Ｍ３を含む試薬と、肺癌の突然変異遺伝子のＢ３群部位を検出するための試薬であって、前記Ｂ３群部位が、Ｅ－２０－Ｍ１、Ｅ－２１－Ｍ２を含む試薬、を含む。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の上記５種類の組み合わせは、融合遺伝子（ＲＮＡ部分のＡ１及びＡ５。Ａ１は肺癌遺伝子におけるＡＬＫ遺伝子の４６種類の融合をカバーしており、Ａ５はＲＯＳ１遺伝子の１０種類の融合をカバーしている）と突然変異遺伝子（ＤＮＡ部分のＢ１、Ｂ２、Ｂ３は、ＥＧＦＲ遺伝子の３４種類の突然変異をカバーしている）を分割し、ＤＮＡ突然変異とＲＮＡ融合を別々に装置にかけて検出可能とするものである。当該設計方式は、ＤＮＡ突然変異もしくはＲＮＡ融合サンプルのみを検出したい場合にいっそうユーザフレンドリーとなり、反応試薬の無駄が回避される。また、操作もより簡便化され、同一の反応チューブ内で絶えずサンプルを交換することに伴う投入ミスや投入漏れが回避される。

【0006】

ＡＬＫ及びＲＯＳ１融合は、それぞれ独立した１本のチューブで検出し、ＥＧＦＲは３本のチューブに分けて検出する。これにより、貴重な臨床サンプルが最大限節約されるとともに、異なる遺伝子及び同一遺伝子の異なる突然変異タイプを効果的に区分可能となるため、臨床応用に一段と良好に適用し得る。

【0007】

更に、本発明のもう１つの目的は、肺癌の遺伝子突然変異を検出する試薬キットであって、以下の１５個の組み合わせを含む試薬キットを提供することである。当該１５個の組み合わせは、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１からＥＭＬ４－ＡＬＫ－３、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－６からＥＭＬ４－ＡＬＫ－１４、ＥＭＬ４－ＡＬＫ－１７からＥＭＬ４－ＡＬＫ－２１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－１、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ－２、ＫＬＣ１－ＡＬＫ、ＴＦＧ－ＡＬＫ、ＳＴＲＮ－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－２、ＨＩＰ１－ＡＬＫ－３、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－１、ＰＲＫＡＲ１Ａ－ＡＬＫ－２、ＮＢＡＳ－ＡＬＫ－１、ＴＦＧ－ＡＬＫ－２、ＰＰＭ１Ｂ－ＡＬＫ－１、ＥＩＦ２ＡＫ３－ＡＬＫ－１、ＢＣＬ１１Ａ－ＡＬＫ－１、ＢＩＲＣ６－ＡＬＫ－１、ＣＥＢＰＺ－ＡＬＫ－１、ＣＬＩＰ１－ＡＬＫ－１、ＣＯＬ２５Ａ１－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－１、ＧＣＣ２－ＡＬＫ－２、ＬＭＯ７－ＡＬＫ－１、ＰＩＣＡＬＭ－ＡＬＫ－１、ＰＨＡＣＴＲ１－ＡＬＫ－１、ＴＰＲ－ＡＬＫ－１、ＭＰＲＩＰ－ＡＬＫ－１、ＴＮＩＰ２－ＡＬＫ－１、ＤＣＴＮ１－ＡＬＫ－１、ＳＱＳＴＭ１－ＡＬＫ－１、を含むＡ１群部位を検出するための試薬と、ＮＴＲＫ１－Ｅ９－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ３、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ５からＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ９、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１２、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１４、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１５、ＮＴＲＫ１－Ｅ１０－Ｍ１７、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ３、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ４、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１１、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１２、ＮＴＲＫ１－Ｅ１２－Ｍ１４、を含むＡ２群部位を検出するための試薬と、ＮＴＲＫ２－Ｅ１５－Ｍ１、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ１、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ３、ＮＴＲＫ２－Ｅ１６－Ｍ７、ＮＴＲＫ２－Ｅ１７－Ｍ２、を含むＡ３群部位を検出するための試薬と、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ１、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ２、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ３、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ４、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１４－Ｍ７、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ１、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ２、ＮＴＲＫ３－ＥＸ１５－Ｍ３、を含むＡ４群部位を検出するための試薬と、ＲＯＳ１－Ｍ１からＲＯＳ１－Ｍ１０を含むＡ５群部位を検出するための試薬と、ＲＯＳ１－Ｍ１１、ＲＯＳ１－Ｍ１２、ＲＯＳ１－Ｍ１３、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１からＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ４、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ６、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ８からＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１１、ＲＯＳ１－ＥＸ３５－Ｍ１３、を含むＡ６群部位を検出するための試薬と、ＭＥＴ－Ｍ１を含むＡ７群部位を検出するための試薬と、ＲＥＴ－Ｍ２、ＲＥＴ－Ｍ５、ＲＥＴ－Ｍ１５、ＲＥＴ－Ｍ１６、ＲＥＴ－Ｍ１７、ＲＥＴ－Ｍ１９、ＬＲＥＴ－Ｍ２２、ＬＲＥＴ－Ｍ３２、ＬＲＥＴ－Ｍ４０、ＬＲＥＴ－Ｍ４１、ＬＲＥＴ－Ｍ４２、ＬＲＥＴ－Ｍ４４、ＬＲＥＴ－Ｍ４５、ＬＲＥＴ－Ｍ４９、ＬＲＥＴ－Ｍ５５、ＬＲＥＴ－Ｍ５７、ＬＲＥＴ－Ｍ５８、ＬＲＥＴ－Ｍ５９、を含むＡ８群部位を検出するための試薬と、Ｅ－１９－Ｍ１からＥ－１９－Ｍ２１、Ｅ－１９－Ｍ２４からＥ－１９－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ２を含むＢ１群部位を検出するための試薬と、Ｅ－２１－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ１、Ｅ－１８－Ｍ２、Ｅ－１８－Ｍ３を含むＢ２群部位を検出するための試薬と、Ｅ－２０－Ｍ１、Ｅ－２１－Ｍ２を含むＢ３群部位を検出するための試薬と、Ｅ－２０－Ｍ４、Ｅ－２０－Ｍ５、Ｅ－２０－Ｍ８、Ｅ－２０－Ｍ９、Ｅ－２０－Ｍ１３、Ｅ－２０－Ｍ１４、Ｅ－２０－Ｍ２０、Ｅ－２０－Ｍ２１、Ｅ－２０－Ｍ２３、Ｅ－２０－Ｍ２４、Ｅ－２０－Ｍ２８からＥ－２０－Ｍ３１、Ｅ－２０－Ｍ３６からＥ－２０－Ｍ４１、Ｅ－２０－Ｍ４４、Ｅ－２０－Ｍ４８、Ｅ－２０－Ｍ５０からＥ－２０－Ｍ５３、ＢＲＡＦ－Ｍ１、を含むＢ４群部位を検出するための試薬と、Ｅ－２０－Ｍ３、Ｅ－２０－Ｍ１０、Ｅ－２０－Ｍ１２、Ｅ－２０－Ｍ１５からＥ－２０－Ｍ１９、Ｅ－２０－Ｍ２２、Ｅ－２０－Ｍ２５からＥ－２０－Ｍ２７、Ｅ－２０－Ｍ３２からＥ－２０－Ｍ３５、Ｅ－２０－Ｍ４２、Ｅ－２０－Ｍ４３、Ｅ－２０－Ｍ４５からＥ－２０－Ｍ４７、Ｅ－２０－Ｍ４９、Ｅ－２０－Ｍ５５からＥ－２０－Ｍ５７、ＫＲＡＳ－Ｍ６、を含むＢ５群部位を検出するための試薬と、ＨＥＲ２－Ｍ１からＨＥＲ２－Ｍ３、ＨＥＲ２－Ｍ８、ＨＥＲ２－Ｍ９、ＨＥＲ２－Ｍ１５からＨＥＲ２－Ｍ２６、ＫＲＡＳ－Ｍ２、ＫＲＡＳ－Ｍ３、ＫＲＡＳ－Ｍ５、ＫＲＡＳ－Ｍ１４、を含むＢ６群部位を検出するための試薬と、ＨＥＲ２－Ｍ４、ＨＥＲ２－Ｍ６、ＨＥＲ２－Ｍ７、ＨＥＲ２－Ｍ１０、ＫＲＡＳ－Ｍ１、ＫＲＡＳ－Ｍ４、を含むＢ７群部位を検出するための試薬、である。

【0008】

本発明の試薬キットにおける１５種類の試薬の組み合わせは、７種類の融合遺伝子ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴと、４種類の突然変異遺伝子ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２について、全１１９種類の遺伝子融合及び１１２種類の遺伝子突然変異をカバーする。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子の８３種類の突然変異、ＫＲＡＳ遺伝子の７種類の突然変異、ＢＲＡＦ遺伝子の１種類の突然変異、ＨＥＲ２遺伝子の２１種類の突然変異、及びＡＬＫ遺伝子の４６種類の融合、ＲＯＳ１遺伝子の２３種類の融合、ＲＥＴ遺伝子の１８種類の融合、ＮＴＲＫ１遺伝子の１８種類の融合、ＮＴＲＫ２遺伝子の５種類の融合、ＮＴＲＫ３遺伝子の８種類の融合、及びＭＥＴ遺伝子の１種類のスキッピング突然変異を含む（詳細は、表５、表６を参照）。

【0009】

現在、市場で承認されている肺癌の複数遺伝子複合検出用試薬キット（ＰＣＲ法）、又は許可されている複数遺伝子複合検出用試薬キットは、いずれもＰＣＲ ８連チューブ又は１２連チューブを１つ使用する。突然変異及び融合を検出するためには、それぞれを同一の反応チューブの異なる位置に投入し、装置で検出する際には、反応チューブ全体をＰＣＲ装置に投入して増幅させる必要がある。

【0010】

これに対し、本発明の試薬キットでは、１５種類の組み合わせに更に外部コントロールを１つ加え、２つの８連ＰＣＲ反応チューブに分割可能としている。即ち、試薬キットの１人あたりの試薬に対し２つの８連ＰＣＲ反応チューブを含んでおり、融合遺伝子（ＲＮＡ部分）と突然変異遺伝子（ＤＮＡ部分）をそれぞれ別個に１つの８連ＰＣＲ反応チューブに分割して、ＤＮＡ突然変異とＲＮＡ融合を装置において独立して検出可能としている。当該設計方式は、ＤＮＡ突然変異もしくはＲＮＡ融合サンプルのみを検出したい場合にいっそうユーザフレンドリーとなり、反応試薬の無駄が回避される。また、操作もより簡便化され、同一の反応チューブ内で絶えずサンプルを交換することに伴う投入ミスや投入漏れが回避される。このほか、８連反応チューブは消耗品としての適用性が広く、必要な計器及びデバイスがよりシンプルとなるため、臨床における使用普及がより容易である。

【0011】

試薬キットについて、検出部位を組み合わせてチューブにまとめる際には、遺伝子の臨床的意義、製薬メーカーの要望、操作の簡便さ、異なる遺伝子間の相互作用、方法論的実行可能性、各遺伝子部位の最適性能指標など、いくつかの方面から総合的に考慮する。例えば、異なる遺伝子、同一遺伝子の異なるエクソン、異なるコドンが異なる臨床的意義を有しているか否かを考慮して、臨床的意義が同一の遺伝子／部位をできるだけまとめるとともに、臨床的意義の異なる部位を独立させて区分する必要がある。例えば、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する患者は、第１世代のＥＧＦＲ－ＴＫＩを使用した場合の客観的反応率及び無増悪生存期間が、その他のＥＧＦＲ感受性突然変異の場合よりも著しく劣るが、第３世代のＥＧＦＲ阻害剤オシメルチニブに対しては感受性が高い。また、例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、ＴＫＩ系標的薬物の治療効果に影響を及ぼす不利な因子である。そのため、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を有するだけで、一般的なＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１等の遺伝子を対象とする標的薬物は使用できなくなる。このほか、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を有する肺癌患者については、化学療法薬の効果が芳しくないことが多く、ペメトレキセド、パクリタキセル等の第一選択薬にプラチナ系化学療法を組み合わせた場合の効果がＫＲＡＳ突然変異を有さない患者に比べて低い。しかし、ここ数年は、複数の標的薬物や免疫治療薬が、ＫＲＡＳ突然変異患者、特に、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃに対して優れた臨床データを示している。ＡＭＧ５１０は、ここ数年で最初に臨床段階まで到達したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ阻害剤である。ＡＭＧ５１０のフェーズＩの研究結果によれば、ＡＭＧ５１０でＫＲＡＳ突然変異を治療したＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）患者の総ＯＲＲ（全奏効率）は４８％、ＤＣＲ（病勢コントロール率）は９６％であった。また、９６０ｍｇのＡＭＧ５１０を投与した１３名のＮＳＣＬＣ患者について、ＯＲＲが５４％、ＤＣＲが１００％となったため、正式に臨床試験が開始される見込みである。よって、試薬キットを設計する際には、この種の部位を独立させ、単独の１つのチューブとして検出するとともに、区分可能とする必要がある。

【0012】

【表1】

【0013】

【表2】

【0014】

本発明の更なる目的は、肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出するための組成物を提供することである。当該組成物は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴ等の突然変異遺伝子のプライマー、プローブを含む。前記プライマー及びプローブは、２本のＰＣＲ ８連チューブを用い、表３～７のようにグループ分けして充填する。

【0015】

【表3】

【0016】

【表4】

【0017】

【表5】

【0018】

【表6】

【0019】

【表7】

【0020】

更に、本発明は、前記プライマー及びプローブの反応系を提供する。当該反応系は、以下を含む。

【0021】

（１）逆転写反応系：精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとする。

【0022】

（２）ＰＣＲ反応系：精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとする。

【0023】

本発明のもう１つの目的は、試薬キットを提供することである。当該試薬キットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８１の配列を含む。具体的に、当該試薬キットは２種類のＰＣＲ ８連チューブを含む。２種類のＰＣＲ ８連チューブは、肺癌のＲＮＡ遺伝子融合及び肺癌のＤＮＡ遺伝子突然変異をそれぞれ検出する。当該試薬キットは、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴ等の遺伝子の特異的プライマー及び特異的プローブを含むほか、更に、ＰＣＲ緩衝液、ＵＮＧ酵素等を含む。

【0024】

更に、当該ＰＣＲ ８連チューブ内で肺癌のＲＮＡ遺伝子融合を検出するための検出試薬は、ＡＬＫ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２及びＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出試薬を各１本、ＲＯＳ１融合遺伝子の検出試薬を２本、ＭＥＴエクソン１４スキッピング遺伝子突然変異の検出試薬を１本、ＲＥＴ融合遺伝子の検出試薬を１本含む。当該８連チューブにおける１～４番目のチューブは、それぞれ、ＡＬＫ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２及びＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出試薬で構成され、５番目及び６番目のチューブはＲＯＳ１融合遺伝子の検出試薬で構成され、７番目のチューブはＭＥＴエクソン１４スキッピング突然変異の検出試薬で構成され、８番のチューブは、ＲＥＴ融合遺伝子の検出試薬と内部コントロールの検出試薬で構成される。１～８番目のチューブにおける融合遺伝子の検出試薬はＦＡＭ信号で示される。また、１～８番目のチューブにおける内部コントロールの検出試薬は、サンプルＲＮＡの品質及び投入状況を監視するために用いられ、ＶＩＣ信号で示される。

【0025】

当該ＰＣＲ ８連チューブ内で肺癌のＤＮＡ遺伝子の突然変異を検出するための検出試薬は、ＥＧＦＲ突然変異遺伝子の検出試薬を３本、ＥＧＦＲ／ＢＲＡＦ突然変異遺伝子の検出試薬を１本、ＥＧＦＲ／ＫＲＡＳ突然変異遺伝子の検出試薬を１本、ＨＥＲ２／ＫＲＡＳ突然変異遺伝子の検出試薬を２本、外部コントロールの検出試薬を１本含む。当該８連チューブのうち、１～５番目のチューブのＦＡＭ信号と、１～３番目のチューブのＲＯＸ信号は、ＥＧＦＲ遺伝子における異なる突然変異位置をそれぞれ示す。また、４番目のチューブのＲＯＸ信号はＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ突然変異を示し、６～７番目のチューブのＦＡＭ信号はＨＥＲ２遺伝子の異なる突然変異位置を示す。また、５～７番目のチューブのＲＯＸ信号は、ＫＲＡＳ遺伝子の異なる突然変異位置をそれぞれ示す。１～７番目のチューブにおける内部コントロール検出試薬は、サンプルの投入状況を検出するために用いられ、ＶＩＣ信号で示される。８番目のチューブは、ヒトゲノムの保存領域を増幅するための検出試薬で構成されており、サンプルのＤＮＡ品質を監視するために用いられ、ＦＡＭ及びＲＯＸ信号で示される。

【0026】

１つのサンプルを検出するためには、２つのＰＣＲ ８連チューブが必要である。試薬キットの構成の詳細については、表８、表９及び表１０を参照する。

【0027】

【表8】

【0028】

【表9】

【0029】

【表10】

【0030】

【表11】

【0031】

【表12】

【0032】

【表13】

【0033】

【表14】

【0034】

【表15】

【0035】

本発明の更なる目的は、当該試薬キットの使用方法を提供することである。当該使用方法は、以下のステップを含む。

【0036】

（１）検出サンプルのＤＮＡ及びＲＮＡを抽出する。当該検出サンプルには、新鮮な病理組織、パラフィン包埋組織又はパラフィン切片組織が含まれる。

【0037】

（２）前記ＲＮＡと逆転写酵素を混合し、逆転写反応液をそれぞれ加えてｃＤＮＡを取得する。

【0038】

（３）前記ＤＮＡと当該ｃＤＮＡをそれぞれ混合酵素と混合して、ＰＣＲ ８連チューブに投入する。

【0039】

（４）蛍光ＰＣＲ増幅装置を用いて増幅させたあと、表示されたＣｔ値から検出結果を判定する。

【発明の効果】

【0040】

本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0041】

１．本発明では、特異的プライマー及びプローブ技術と、３色の蛍光チャンネル検出パターンを利用して、リアルタイムＰＣＲシステムを構築した。これにより、７種類の融合遺伝子ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴと、４種類の突然変異遺伝子ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２について、全１１９種類の遺伝子融合及び１１２種類の遺伝子突然変異を同時に検出可能である。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子の８３種類の突然変異、ＫＲＡＳ遺伝子の７種類の突然変異、ＢＲＡＦ遺伝子の１種類の突然変異、ＨＥＲ２遺伝子の２１種類の突然変異、及びＡＬＫ遺伝子の４６種類の融合、ＲＯＳ１遺伝子の２３種類の融合、ＲＥＴ遺伝子の１８種類の融合、ＮＴＲＫ１遺伝子の１８種類の融合、ＮＴＲＫ２遺伝子の５種類の融合、ＮＴＲＫ３遺伝子の８種類の融合、及びＭＥＴ遺伝子の１種類のスキッピング突然変異を含む（詳細は、表１１～１５を参照）。

【0042】

２．本発明では、検出する複数の突然変異／融合部位の検出難易度、プライマー間の相互作用、競合など多方面の総合的要素に基づいて、２８１個の配列（プライマー及びプローブを含む）をグループ分けして、２つのＰＣＲ ８連チューブに充填する。これによる利点は次の通りである。

【0043】

（１）２重又は３重ＰＣＲを使用し、複数の突然変異タイプをチューブにまとめるとともに、異なる蛍光標識のプローブを用いて区分することで、１つのチューブ内で複数の突然変異タイプの検出を実現可能となる。このことは、顧客にとって操作しやすいだけでなく、検出コスト及び検出サンプルの節約となる。

【0044】

（２）突然変異タイプをチューブにまとめる際には、技術的な取りまとめの難易度を考慮するほか、薬物の違いによるニーズにも配慮する。同一の薬物については、薬物に対応する標的をできるだけ同一の反応チューブに配置するか、異なる反応チューブの同一の蛍光チャンネルに配置することで、結果を分析しやすくする。

【0045】

（３）試薬キットは、２３１種類の突然変異／融合部位を一括検出可能である。且つ、各反応チューブの操作方法／増幅手順は基本的に同一のため、操作しやすく、時間の節約となり、臨床応用に都合がよい。

【0046】

（４）各反応系には、更に、内部コントロール検出システムが含まれている。融合反応チューブの内部コントロールは、ＲＮＡサンプルの品質及び操作、計器の異常有無の管理に用いられ、突然変異反応チューブの内部コントロールは、ＤＮＡサンプルの品質及び操作、計器の異常有無の管理に用いられる。また、外部コントロールは、サンプルのＤＮＡ品質を判断するために用いられるとともに、結果の判定にも関与する。

【0047】

（５）感度が高く、１％の遺伝子突然変異ＤＮＡ及び１２５コピーの融合遺伝子プラスミドＤＮＡを検出可能である。

【0048】

（６）検出時間が短く、わずか３時間で検出過程を完了させられる。

【0049】

（７）予め分割充填した設計であり、且つ密封処理しているため、運送過程での安全性が向上し、一段と操作に都合がよい。

【0050】

３．本発明で提供する試薬キットがカバーする検出部位は、各遺伝子の全突然変異タイプの９５％以上を占めている。また、非小細胞肺癌患者の総突然変異率については７０％にも達する。よって、当該試薬キットは、現在のところ、突然変異遺伝子を最も多く検出し、突然変異タイプが最も整った蛍光ＰＣＲ製品である。当該試薬キットは、臨床医が肺癌患者に対し腫瘍標的薬物療法を選択するにあたり包括的な基準を提供するものである。

【0051】

４．ＮＧＳ法と比較して、本発明で提供する試薬キットは、操作が容易且つスピーディーであり、感度が高く、特異性に優れ、結果の判定が客観的である等の理由から、臨床での普及性に最も優れた第１の検出方法である。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】図１は、実施例１におけるＡＬＫ融合遺伝子－ＥＭＬ４ ｅｘｏｎ１３、ＡＬＫ ｅｘｏｎ２０の感度図である。

【図2】図２は、実施例１におけるＲＯＳ１融合遺伝子－ＣＤ７４ ｅｘｏｎ６、ＲＯＳ１ ｅｘｏｎ３２の感度図である。

【図3】図３は、実施例１におけるＲＥＴ融合遺伝子－ＫＩＦ５Ｂ ｅｘｏｎ１６、ＲＯＳ１ ｅｘｏｎ１２の感度図である。

【図4】図４は、実施例１におけるＮＴＲＫ１融合遺伝子－ＣＤ７４ ｅｘｏｎ８、ＮＴＲＫ１ ｅｘｏｎ１０の感度図である。

【図5】図５は、実施例１におけるＮＴＲＫ２融合遺伝子－ＴＲＩＭ２４ ｅｘｏｎ１２、ＮＴＲＫ２ ｅｘｏｎ１５の感度図である。

【図6】図６は、実施例１におけるＮＴＲＫ３融合遺伝子－ＥＴＶ６ ｅｘｏｎ５、ＮＴＲＫ３ ｅｘｏｎ１５の感度図である。

【図7】図７は、実施例１におけるＭＥＴスキッピング突然変異－ＭＥＴ ｅｘｏｎ１４ ｓｋｉｐｐｉｎｇの感度図である。

【図8】図８は、実施例１におけるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異－１９ｄｅｌの感度図である。

【図9】図９は、実施例１におけるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異－Ｌ８５８Ｒの感度図である。

【図10】図１０は、実施例１におけるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異－Ｔ７９０Ｍの感度図である。

【図11】図１１は、実施例１におけるＫＲＡＳ遺伝子の突然変異－Ｇ１２Ｄの感度図である。

【図12】図１２は、実施例１におけるＫＲＡＳ遺伝子の突然変異－Ｇ１２Ｃの感度図である。

【図13】図１３は、実施例１におけるＢＲＡＦ遺伝子の突然変異－Ｖ６００Ｅの感度図である。

【図14】図１４は、実施例１におけるＨＥＲ２遺伝子の突然変異－Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶの感度図である。

【図15】図１５は、実施例１におけるＨＥＲ２遺伝子の突然変異－Ａ７７５＿Ｇ７７６ｉｎｓＹＶＭＡの感度図である。

【図16】図１６は、実施例２における臨床陽性サンプルのＡＬＫ融合遺伝子の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図17】図１７は、実施例２における臨床陽性サンプルのＲＯＳ１融合遺伝子の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図18】図１８は、実施例２における臨床陽性サンプルのＲＥＴ融合遺伝子の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図19】図１９は、実施例２における臨床陽性サンプルのＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図20】図２０は、実施例２における臨床陽性サンプルのＭＥＴスキッピング突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図21】図２１は、実施例２における臨床陽性サンプルのＥＧＦＲ １９ｄｅｌ遺伝子突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図22】図２２は、実施例２における臨床陽性サンプルのＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ遺伝子突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図23】図２３は、実施例２における臨床陽性サンプルのＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ遺伝子突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図24】図２４は、実施例２における臨床陽性サンプルのＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図25】図２５は、実施例２における臨床陽性サンプルのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ遺伝子突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図26】図２６は、実施例２における臨床陽性サンプルのＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【図27】図２７は、実施例２における臨床陽性サンプルのＨＥＲ２遺伝子の突然変異の検出結果のＰＣＲチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0053】

上記の図面において、各図中の横座標はいずれもサイクル数（ｃｙｃｌｅｓ）、縦座標はいずれも蛍光値Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ｄＲ）である。

【0054】

以下に、具体的実施例を組み合わせて、本発明につき更に詳述する。これらの実施例は本発明を説明するためのものにすぎず、本発明を制限するものと解釈すべきではない。また、実施例において具体的な技術又は条件を明記していないものについては、当該分野の文献に記載されている技術又は条件、或いは製品説明書に基づき実施する。また、使用する試薬や計器について、メーカーを明記していないものについては、いずれも市販のものを購入して得られる一般的な製品とすればよい。

【実施例1】

【0055】

Ｃｏｓｍｉｃデータが公表しているヒトＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３及びＭＥＴの野生型遺伝子配列に基づき、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３及びＭＥＴの駆動的突然変異部位及び融合部位をベースとして、特異的プライマー及びプローブを設計した（詳細は、表１、表１６及び表１７を参照）。

【0056】

【表16】

【0057】

【表17】

【0058】

本実施例では、ＡＬＫ融合遺伝子ＥＭＬ４ ｅｘｏｎ１３、ＡＬＫ ｅｘｏｎ２０、ＲＯＳ１融合遺伝子ＣＤ７４ ｅｘｏｎ６、ＲＯＳ１ ｅｘｏｎ３２、ＲＥＴ融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ ｅｘｏｎ１６、ＲＯＳ１ ｅｘｏｎ１２、ＮＴＲＫ１融合遺伝子ＣＤ７４ ｅｘｏｎ８、ＮＴＲＫ１ ｅｘｏｎ１０、ＮＴＲＫ２融合遺伝子ＴＲＩＭ２４ ｅｘｏｎ１２、ＮＴＲＫ２ ｅｘｏｎ１５、ＮＴＲＫ３融合遺伝子ＥＴＶ６ ｅｘｏｎ５、ＮＴＲＫ３ ｅｘｏｎ１５、ＭＥＴスキッピング突然変異遺伝子ＭＥＴ ｅｘｏｎ１４ ｓｋｉｐｐｉｎｇ、ＥＧＦＲ突然変異遺伝子１９ｄｅｌ、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、ＫＲＡＳ突然変異遺伝子Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、ＢＲＡＦ突然変異遺伝子Ｖ６００Ｅ、ＨＥＲ２突然変異遺伝子Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ、Ａ７７５＿Ｇ７７６ｉｎｓＹＶＭＡを例示して、本発明における上記肺癌遺伝子の蛍光ＰＣＲ検出について詳述する。

【0059】

実験には、上記融合遺伝子のＴ７ ＲＮＡと各突然変異を含むプラスミド鋳型を使用した。当該鋳型の蛍光ＰＣＲ検出には以下のステップが含まれていた。

【0060】

（一）プラスミド、Ｔ７ ＲＮＡの処理及び抽出：
プラスミドに天根生化社製のミニプラスミドキット（製品番号：ＤＰ１０３）を用いてＤＮＡ抽出を行った。また、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｉｄ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品番号：Ｋ０４４１）を用いてプラスミドを転写し、Ｔ７ ＲＮＡを取得した。具体的な操作手順はキットの説明書に従った。ＤＮＡとＲＮＡの抽出を終えたあと、直ちにＵＶ分光光度計を用いてＤＮＡとＲＮＡの濃度及び純度を測定した。ＤＮＡとＲＮＡのＯＤ_２６０／ＯＤ_２８０は１．７～２．１の間とし、ＲＮＡ濃度は１０～１００ｎｇ／μＬとした。

【0061】

（二）ＰＣＲ増幅反応系の作製：
上記で取得した鋳型をリアルタイム蛍光ＰＣＲ増幅の鋳型とし、下記の増幅系でＰＣＲ増幅を行った。

【0062】

逆転写反応系：精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとした。

【0063】

ＰＣＲ反応系：精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとした。

【0064】

逆転写反応条件：４２°Ｃで６０ｍｉｎ、９５°Ｃで５ｍｉｎ、１サイクルとした。

【0065】

Ｓ－ｃＤＮＡ１及びＳ－ｃＤＮＡ２を取得し、酵素と混合したあと、検出チューブＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～４及び検出チューブＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－５～８にそれぞれ投入するとともに、ＤＮＡサンプルを検出チューブＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～８に投入してＰＣＲ増幅を行った。

【0066】

リアルタイムＰＣＲの反応条件は下記の通りとした。

【0067】

第１段階：４２°Ｃで５ｍｉｎ、９５°Ｃで５ｍｉｎ、１サイクルとした。
第２段階：９５°Ｃで２５ｓ、６４°Ｃで２０ｓ、７２°Ｃで２０ｓ、１０サイクルとした。
第３段階：９３°Ｃで２５ｓ、６０°Ｃで３５ｓ、７２°Ｃで２０ｓ、３６サイクルとした。

【0068】

信号収集：第３段階の６０°Ｃ時点で、ＦＡＭ／ＶＩＣ／ＲＯＸ信号を収集し、リアルタイムＰＣＲを実行してファイルを保存した。

【0069】

（三）検出結果の判定：蛍光ＰＣＲ増幅装置に示されたＣｔ値に基づいて、検出結果を判定した（詳細は、表１８、表１９を参照）。

【0070】

１．補正用蛍光リファレンスを選択していないことを確認し、チューブ番号順に検出反応チューブを１つずつ選択して分析した。陽性対照反応チューブ、サンプル反応チューブ及び陰性対照チューブを選択したあと、ユーザは、実際の状況に応じて増幅曲線の上昇の変曲点を特定することで、各反応チューブのＣｔ値を取得可能であった。

【0071】

２．陰性対照のＦＡＭ、ＶＩＣ及びＲＯＸ信号の増幅曲線：
陰性対照のＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～８のＦＡＭ信号と、ＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～７のＦＡＭ及びＲＯＸ信号には増幅曲線の上昇が存在しないはずである。そのため、いずれかのチューブの上記信号に増幅曲線の上昇が見られた場合には、今回の実験結果を無効とし、再検出することを推奨した。

【0072】

３．陽性対照のＦＡＭ、ＶＩＣ及びＲＯＸ信号の増幅曲線：
（１）陽性対照のＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～８と、ＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～８のＦＡＭ信号には、全て増幅曲線の上昇が存在するはずであり、且つ、Ｃｔ値は一般的に２５未満となるはずである。ただし、閾値設定の違いによって変動が生じることもある。

【0073】

（２）陽性対照のＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～８のＲＯＸ信号には全て増幅曲線の上昇が存在するはずであり、且つ、Ｃｔ値は２５未満となるはずである。

【0074】

（３）陽性対照のＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～８と、ＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～７のＶＩＣ信号には、全て増幅曲線の上昇が存在するはずであり、且つ、Ｃｔ値は２５未満となるはずである。

【0075】

４．サンプルのＲＮＡ遺伝子融合の陰性・陽性判定：
（１）サンプルのＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～８のＶＩＣ信号の増幅曲線：

【0076】

ａ．８つのチューブのＣｔ値がいずれも＜３６であり、且つ、いずれかのチューブのＣｔ値が＜２６の場合には、分析を継続した。

【0077】

ｂ．８つのチューブのＣｔ値がいずれも≧２６であるか、いずれかのチューブのＣｔ値が≧３６の場合には、ＲＮＡの断片化又はＲＮＡ分解の恐れ、或いはサンプルに阻害剤が存在するか投入漏れの可能性があるため、再検出するか、ＲＮＡを再抽出して検出し直すことを推奨した。

【0078】

（２）サンプルのＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～８のＦＡＭ信号の増幅曲線：
ａ．いずれかのチューブのＦＡＭ信号のＣｔ値が陽性領域（詳細は表１８を参照）に位置していた場合には、当該サンプルについて、当該反応チューブは陽性であると判定した。

【0079】

ｂ．全てのチューブのＦＡＭ信号のＣｔ値がいずれも陰性領域（詳細は表１８を参照）に位置していた場合には、当該サンプルについて、陰性であるか、当該試薬キットの検出下限を下回っていると判定した。

【0080】

【表18】

【0081】

５．サンプルのＤＮＡ遺伝子突然変異の陰性・陽性判定：ＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異について、まず、サンプルの１～７番目のチューブのＦＡＭ及びＲＯＸ信号それぞれのＣｔ値を特定したあと、当該サンプルの８番目のチューブにおけるＦＡＭ及びＲＯＸ信号のＣｔ値を特定した。サンプルの突然変異の含有量パーセンテージはそれぞれ異なるため、得られる突然変異のＣｔ値もそれぞれ異なる。そこで、突然変異のＣｔ値の違いによって、サンプルの検出結果を、陰性、陽性Ａ領域及び陽性Ｂ領域に区分した。具体的な判定の詳細については、表１９を参照する。

【0082】

（１）サンプルのＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異１～７番チューブのＶＩＣ信号の増幅曲線：
ａ．１～７番目のチューブのＣｔ値がいずれも＜３６の場合には、分析を継続した。

【0083】

ｂ．１～７番目のいずれかのチューブのＣｔ値が≧３６の場合には、ＤＮＡの断片化又はＤＮＡ分解の恐れ、或いはサンプルに阻害剤が存在するか投入漏れの可能性があるため、再検出するか、ＤＮＡを再抽出して検出し直すことを推奨した。

【0084】

（２）サンプルのＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異１～８番チューブのＦＡＭ及びＲＯＸ信号の増幅曲線：
ａ．１９≦８番目のチューブにおけるＦＡＭ及びＲＯＸ信号のＣｔ値が≦２５の場合には、分析を継続した。

【0085】

ｂ．８番目のチューブにおけるＦＡＭ及びＲＯＸ信号のＣｔ値が＜１９の場合には、投入したＤＮＡが過剰なことを意味するため、ＤＮＡの投入量を減らして再実験するものとした。ただし、突然変異信号に上昇が存在しないか、陰性領域に位置する場合には、当該実験結果は信用可能であるとした。

【0086】

【表19】

【0087】

ｃ．８番目のチューブにおけるＦＡＭ及びＲＯＸ信号のＣｔ値＞２５の場合には、投入したＤＮＡに断片化又は分解が存在するか、阻害剤が存在するか、投入漏れの恐れがあることを意味する。ただし、突然変異信号に上昇が見られ、且つ陽性Ａ領域に位置する場合には実験結果を信用可能とし、そうでない場合には、ＤＮＡサンプル量を増加するか、新たにＤＮＡを再抽出して検出し直すことを推奨した。

【0088】

ｄ．サンプルの１～７番目のチューブのＦＡＭ及びＲＯＸ信号について、各チューブのＣｔ値がいずれも陰性臨界値以上である場合（即ち、陰性領域に位置する場合）、当該サンプルは陰性であるか、当該試薬キットの検出下限を下回っているとした。

【0089】

ｅ．サンプルの１～７番目のチューブのＦＡＭ及びＲＯＸ信号について、いずれかの反応チューブのＣｔ値が陰性臨界値よりも小さい場合には、下記の判定を行った。

【0090】

ｉ．いずれかの反応チューブのＣｔ値が陽性臨界値よりも小さい場合（即ち、陽性Ａ領域に位置する場合）には、当該サンプルについて、当該反応チューブに対応する突然変異が陽性であるとした。

【0091】

ｉｉ．いずれかの反応チューブのＣｔ値が陽性臨界値よりも大きく、且つ陰性臨界のＣｔ値よりも小さい場合（即ち、陽性Ｂ領域に位置する場合）には、当該反応チューブのΔＣｔ値を算出した。そして、反応チューブのΔＣｔ値が対応するΔＣｔ Ｃｕｔ－ｏｆｆ値よりも小さい場合には、当該サンプルについても、当該反応チューブに対応する突然変異が陽性、即ち陽性Ｂ領域であるとしたが、そうでない場合には、陰性であるか、当該試薬キットの検出下限を下回っているとした。

【0092】

（３）ΔＣｔ値の算出：ΔＣｔ値＝突然変異のＦＡＭ（ＲＯＸ）のＣｔ値－外部コントロールのＦＡＭ（ＲＯＸ）のＣｔ値とした。突然変異のＦＡＭ（ＲＯＸ）のＣｔ値とは、サンプルの突然変異信号の１～７番目のチューブ（ＦＡＭ又はＲＯＸ信号）に対応するＣｔ値のことであり、外部コントロールのＣｔ値とは、サンプルの外部コントロール信号の８番目のチューブ（ＦＡＭ又はＲＯＸ信号）に対応するＣｔ値のことである。

【0093】

６．いずれかのＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ陽性サンプルは、個々の突然変異反応チューブ間に交差信号を示す可能性がある。そこで、サンプルが２つ又は２つ以上の反応チューブにおいて陽性結果を示した場合（表１９より判別）には、まず、突然変異反応チューブにおけるＣｔ値が最小のものを真陽性と特定したあと、各反応チューブのΔＣｔ値を算出した（突然変異のＣｔ値－外部コントロールのＣｔ値）。そして、表２０～表２２に示す交差信号の閾値から、その他の反応チューブについて交差信号か否かを判定した。

【0094】

（１）ΔＣｔ値が交差信号の閾値よりも小さい場合には、真陽性信号であるとみなし、当該突然変異反応チューブを陽性であると判定可能とした。

【0095】

（２）ΔＣｔ値が交差閾値以上の場合には、交差信号であるとみなし、当該突然変異反応チューブを陰性であると判定可能とした。

【0096】

【表20】

【0097】

【表21】

【0098】

【表22】

【0099】

７．１つのサンプルが、２つ又は複数の融合或いは突然変異のタイプを同時に含む場合があった。

【0100】

（四）感度分析：ＤＮＡ及びＲＮＡのプラスミドをそれぞれ採取して段階希釈を行った。各種遺伝子は、いずれも最終的に少なくとも２種類の濃度を有し、これにより検出限界の考察を行った。その結果、本発明の蛍光ＰＣＲ法は感度が高く、１％の遺伝子突然変異ＤＮＡ及び２５コピー／μＬの融合遺伝子プラスミドを検出可能なことが分かった。結果の一部を図１～図１５に示す。

【0101】

検出結果から明らかなように、本発明の検出システムは、肺癌の１１種類の遺伝子を一括で正確に検出することが可能であった。また、検出感度は、１％の遺伝子突然変異ＤＮＡ及び２５コピー／μＬの融合遺伝子ＲＮＡに達し得た。

【実施例2】

【0102】

本発明を利用して臨床サンプルを検出した。２０１９年１１月に、１７２例の臨床ＮＳＣＬＣ ＦＦＰＥサンプルについて、肺癌の１１種類の遺伝子突然変異／融合を検出するとともに（結果が既知の一部臨床サンプルを含む）、ＮＧＳ法と比較した。

【0103】

一、検出サンプルのＤＮＡ及びＲＮＡの抽出：ＤＮＡとＲＮＡの抽出には、厦門艾徳生物医薬科技股 有限公司の核酸抽出試薬（型番：ＦＦＰＥ ＤＮＡ／ＲＮＡ、医療機器番号： 厦械備２０１５００８２号、製品番号：８．０２２３６０１Ｘ０３６Ｇ）を使用した。ＤＮＡとＲＮＡの抽出を終えたあと、微量ＵＶ分光光度計を用いてＤＮＡとＲＮＡの濃度及び純度を測定した。ＲＮＡ濃度は１０ｎｇ／μＬよりも大きく、ＤＮＡ濃度は２ｎｇ／μＬよりも大きく、ＤＮＡ及びＲＮＡのＯＤ_２６０／ＯＤ_２８０は１．７～２．１の間とした。上記で抽出したＤＮＡとＲＮＡを肺癌の１１種類の遺伝子を検出するための増幅鋳型とした。

【0104】

二、上記で抽出したＤＮＡとＲＮＡについて、それぞれ以下の増幅系でＰＣＲ増幅を行った。

【0105】

逆転写反応系：精製水を５～２５μＬ、５×逆転写緩衝液を５～１５μＬ、各プライマーを２０～１５０μｍｏｌ、逆転写酵素を１００～２００Ｕとし、総体積を２０～３０μＬとした。

【0106】

ＰＣＲ反応系：精製水を１５～４５μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５～１５μＬ、ＭｇＣｌ_２を１～１０ｍｍｏｌ、各対プライマーを１～２０ｐｍｏｌ、各対プローブを１～２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを１０～１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑ酵素を１～１０Ｕとし、総体積を３０～５０μＬとした。また、逆転写反応条件を、４２°Ｃで６０ｍｉｎ、９５°Ｃで５ｍｉｎ、１サイクルとした。

【0107】

Ｓ－ｃＤＮＡ１及びＳ－ｃＤＮＡ２を取得し、酵素と混合したあと、検出チューブＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子融合－１～４及び５～８にそれぞれ投入するとともに、ＤＮＡサンプルを検出チューブＬＥＴ ＰＣＲ ８連チューブ－遺伝子突然変異－１～８に投入してＰＣＲ増幅を行った。

【0108】

リアルタイムＰＣＲの反応条件は下記の通りとした。

【0109】

第１段階：４２°Ｃで５ｍｉｎ、９５°Ｃで５ｍｉｎ、１サイクルとした。
第２段階：９５°Ｃで２５ｓ、６４°Ｃで２０ｓ、７２°Ｃで２０ｓ、１０サイクルとした。
第３段階：９３°Ｃで２５ｓ、６０°Ｃで３５ｓ、７２°Ｃで２０ｓ、３６サイクルとした。

【0110】

信号収集：第３段階の６０°Ｃ時点で、ＦＡＭ／ＶＩＣ／ＲＯＸ信号を収集し、リアルタイムＰＣＲを実行してファイルを保存した。

【0111】

三、検出結果の判定：蛍光ＰＣＲ増幅装置に示されたＣｔ値に基づいて、検出結果を判定した（判定方法については実施例１を参照）。

【0112】

四、ＮＧＳ検出：合格ＤＮＡサンプルを抽出し、断片化後に末端修復及びアダプターライゲーションを行った。次に、艾徳社のヒト汎腫瘍１１６遺伝子パネルキャプチャープローブを使用してターゲット領域をキャプチャーし、品質管理に合格したキャプチャー後のライブラリをイルミナ社のＮｏｖａｓｅｑ ６０００シーケンスプラットフォームでシーケンシングした。そして、艾徳社のヒト汎腫瘍１１６遺伝子突然変異複合検出データ分析システム（ＡＤＸＰＡＮ１１６－ｔＭｕｔ＿ｖ０．２．０）を使用して、シーケンシングデータを分析することで、１１６種類の遺伝子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴ等を含む）の遺伝子突然変異結果を取得した。

【0113】

１７２例の臨床サンプルについて、本発明の試薬キットでは、全部で１２５例の陽性サンプルが検出された。サンプルの突然変異状況分布の詳細については、表２３、表２４及び図１６～図２７を参照する。

【0114】

【表23】

【0115】

【表24】

【0116】

一致しなかった１サンプルについて、上市済みのヒトＥＧＦＲ遺伝子突然変異検出用試薬キット（蛍光ＰＣＲ法）（国機注準２０１４３４０２００１）用いて検証した結果、ＥＧＦＲ １９ｄｅｌは陽性であり、本発明の検出結果と一致していた。

【0117】

２種類の方法で検出したデータを分析したところ、下記の通りとなった。

【0118】

陽性一致率＝１２４／１２４＝１００．００％（９５％ＣＩ：９７．６４％、１００．７６％）
陰性一致率＝４７／４８＝９７．９２％（９５％ＣＩ：９３．８８％、１０１．９６％）
総一致率＝１７１／１７２＝９９．４２％（９５％ＣＩ：９８．２８％、１００．５５％）

【0119】

また、Ｋａｐｐａ値＝０．９８５、標準誤差Ｓ_Ｋ＝０．０１４５、Ｚ値＝６７．９６５であった。Ｚ値に基づき、ν＝∞としてｔ境界値表を確認したところ、ｔ臨界値は１．９６（両側０．０５）又は１．６４（片側０．０５）であった。Ｚ＝６７．９６５＞１．９６、Ｐ＜０．０５であったため、Ｋａｐｐａ値は統計学的に有意であるとみなすことができた。よって、２種類の試薬キットの検出結果には一致性が存在していた。

【0120】

当該蛍光ＰＣＲ法とＮＧＳの結果の総一致率は９９．４２％にも達しており、蛍光ＰＣＲの感度及び選択的検出能力はＮＧＳに相当していた。また、ＮＧＳと比較して、ＰＣＲ法は１１種類の遺伝子を容易且つ迅速に検出可能であり、所要時間が短く、サンプルの節約にもなるため、臨床における使用普及にいっそう有利である。

【0121】

以上は本発明の好ましい実施例にすぎないため、これらにより本発明の実施範囲を限定すべきではない。即ち、本発明の権利範囲及び明細書の内容に基づき実施される等価の変形及び補足は、いずれも本発明がカバーする範囲に属する。

【産業上の利用可能性】

【0122】

本発明は、肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出する試薬キットを開示する。当該試薬キットは、肺癌のＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＭＥＴ遺伝子の突然変異を検出するためのプライマー、プローブ及び割当方式を含む。本発明では、ＰＣＲ ８連チューブ設計を採用し、２つのＰＣＲ ８連チューブごとに１つのサンプルの１１種類の遺伝子突然変異／融合状態を検出する。一方のＰＣＲ ８連チューブ内には対応する融合検出試薬と内部コントロール試薬を充填し、他方のＰＣＲ ８連チューブ内には対応する突然変異検出試薬を充填する。本発明では、蛍光ＰＣＲ法を使用して肺癌の１１９種類の遺伝子融合及び１１２種類の遺伝子突然変異のタイプを一括検出可能である。よって、検出時間が大幅に短縮されるとともに、操作しやすく、結果が正確であり、産業上の実用性を有している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

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