(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-05
(45)【発行日】2023-01-16
(54)【発明の名称】血清中で安定なプロセレンテラジン類似体
(51)【国際特許分類】
C07D 487/04 20060101AFI20230106BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230106BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20230106BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230106BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230106BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20230106BHJP
【ＦＩ】
C07D487/04 144
C07D487/04 CSP
A61K49/00
C12Q1/6897 Z
C12Q1/06
G01N33/48 M
G01N33/483 C
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020500213
(86)(22)【出願日】2018-06-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-08-31
(86)【国際出願番号】 US2018040440
(87)【国際公開番号】W WO2019010094
(87)【国際公開日】2019-01-10
【審査請求日】2021-06-09
(31)【優先権主張番号】62/529,152
(32)【優先日】2017-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】593089149
【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100183379
【弁理士】
【氏名又は名称】藤代 昌彦
(72)【発明者】
【氏名】チョウ ウェンフイ
(72)【発明者】
【氏名】ビンコウスキー ブロック
(72)【発明者】
【氏名】マイゼンハイマー ポンチョ
(72)【発明者】
【氏名】ナイルズ アンドリュー エル
(72)【発明者】
【氏名】カップチョ ケヴィン
(72)【発明者】
【氏名】アンク ジェイムズ
【審査官】大木 みのり
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０３４８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１５９７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／００７５３０９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／０２０３８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／０３９４１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】LEVI, Jelena; et al.，JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY，2007年12月09日，129，11900-11901，http://dx.doi.org/10.1021/ja073936h
【文献】ELLIS, Elizabeth E.; et al.，CHEMBIOCHEM，2013年，14，1134-1144，DOI:10.1002/cbic.200300085
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ ４９／００
Ｃ１２Ｑ １／６８９７
Ｃ１２Ｑ １／０６
Ｇ０１Ｎ ３３／４８
Ｇ０１Ｎ ３３／４８３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩ）の化合物：［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、それぞれ置換されていてもよく、Ａｒ4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
【請求項2】
Ａｒ1がフェニルであり、Ａｒ2がフリルであり、Ａｒ3がフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ａｒ4が、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ａ）を有するか［式中、Ａｒ1、及びＡｒ2は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ4は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］；又は、
前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｂ）を有するか
［式中、Ａｒ2は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ａｒ4は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］；又は、
前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｃ）を有する
［式中、Ａｒ4は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］、請求項１に記載の化合物。
【請求項5】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート、（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項6】
式（ＩＩＩ）の化合物：［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、それぞれ置換されていてもよく、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
【請求項7】
Ａｒ1がフェニルであり、Ａｒ2がフリルであり、Ａｒ3がフェニルであり、及び／又は、任意に、ＲCが、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択されてもよい、請求項６に記載の化合物。
【請求項8】
前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ａ）を有するか［式中、Ａｒ1、及びＡｒ2は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］；又は、
前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｂ）を有するか
［式中、Ａｒ2は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］；又は、
前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｃ）を有する
［式中、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］、請求項６に記載の化合物。
【請求項9】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネートからなる群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物を含むキットであって、任意に前記キットがルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼをさらに含み、及び／又は、任意に、緩衝試薬をさらに含む、キット。
【請求項11】
脱保護酵素をさらに含み、かつ、任意に、前記脱保護酵素がエステラーゼを含んでもよい、請求項１０に記載のキット。
【請求項12】
試料中の発光を検出するための方法であって、試料を請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物と接触させることと、前記試料中に脱保護酵素が存在しない場合、前記試料を脱保護酵素と接触させることと、前記試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、前記試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含み、任意に脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記方法。
【請求項13】
前記試料が生細胞を含み、任意に、前記試料が、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含んでもよい、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
トランスジェニック動物の発光を検出するための方法であって、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０１７年７月６日出願の米国特許仮出願第６２／５２９，１５２号の利益を主張する。
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０１７年７月６日出願の米国特許仮出願第６２／５２９，１５２号の利益を主張する。
【0002】
本開示は、プロセレンテラジン類似体、プロセレンテラジン類似体の製造方法、及びルシフェラーゼを用いた生細胞アッセイにおけるプロセレンテラジン類似体の使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
生物発光アッセイは、細胞生理学、特に遺伝子発現に関連するプロセスの研究において広く用いられている。特に、ルシフェラーゼレポーター酵素はこの分野において極めて有用なツールであり、生物発光アッセイにおいて有用な、小分子でかつ環境に左右されないルシフェラーゼを得るためにタンパク質工学による重点的な取り組みが今日まで行われてきた。全細胞バイオセンサー測定、高スループットスクリーニングによる薬剤探査、ならびに生細胞、アポトーシス、及び細胞生存率におけるタンパク質－タンパク質相互作用の研究を可能とするインビボイメージングを実現する、多くの効率的なルシフェラーゼレポーターまたはフラグメント補完されたルシフェラーゼが存在している。セレンテラジン及びセレンテラジン類似体を用いたルシフェラーゼは、その輝度及び全細胞用途で受け容れられていることから最も広く使用されている系の１つである。
【発明の概要】
【0004】
多くの既知のセレンテラジン類似体は培地または血清を含む培地中で速やかに分解し、ルシフェラーゼの基質としての有用性が制限されている。アッセイの感度及び持続時間は、活性セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体の不安定性のためにバックグラウンドによってしばしば制限される。エステル保護されたセレンテラジンまたはフリマジン化合物のようなプロセレンテラジン類似体が、細胞内に存在するエステラーゼを用いてプロセレンテラジン類似体からエステルまたは炭酸基を除去して活性セレンテラジンまたはフリマジン基質を時間の経過とともに放出させることによってアッセイの性能を向上させるために生細胞で導入されている。しかしながら、これらのプロセレンテラジン類似体では、特定の生細胞アッセイで必要とされる、特定の持続時間にわたったシグナルの安定性は依然として大きな課題となっている。
【0005】
短い検出期間は、レポーター遺伝子アッセイ、生死細胞アッセイ、細胞アポトーシス、タンパク質－タンパク質相互作用、細菌、真菌、もしくはカビの検出、またはインビトロもしくは細胞内での対象とする標的酵素の活性の検出などの生細胞アッセイにおける実用的な応用をしばしば制限する。したがって、生細胞アッセイで必要とされる妥当な輝度を維持しながら、安定性の向上したプロセレンテラジン類似体が求められている。
【0006】
一態様では、式（Ｉ）の化合物：
（Ｉ）、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲAは、Ｃ2～Ｃ10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Ｒx1、Ｒx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたＣ1～Ｃ6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲAは、Ｃ2～Ｃ10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Ｒx1、Ｒx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたＣ1～Ｃ6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
【0007】
他の態様では、式（ＩＩ）：
（ＩＩ）、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、Ａｒ4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、Ａｒ4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
【0008】
式（ＩＩＩ）の化合物も開示される：
（ＩＩＩ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
【0009】
前記化合物の製造方法、前記化合物を含むキット、ルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて前記化合物をルシフェラーゼ基質として使用する方法も開示する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1-1】図１Ａ及び１Ｂは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８（図１Ａ）、及びＷＺ－０３１０（図１Ｂ）の経時的な純度の変化を示す。
【図1-2】図１Ｃ及び１Ｄは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３１５（図１Ｃ）、及びＷＺ－０４１５（図１Ｄ）の経時的な純度の変化を示す。
【図1-3】図１Ｅ及び１Ｆは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの血清中で不安定な化合物ＷＺ－０４２９（図１Ｅ）、及びＷＺ－０４３９（図１Ｆ）の経時的な純度の変化を示す。
【図1-4】図１Ｇ及び１Ｈは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの血清中で不安定な化合物ＷＺ－０４５４（図１Ｇ）、及びＷＺ－０４４１（図１Ｈ）の経時的な純度の変化を示す。
【図2-1】図２Ａ及び２Ｂは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０３２３（図２Ａ）、及びＷＺ－０３２４（図２Ｂ）の経時的な純度の変化を示す。
【図2-2】図２Ｃ及び２Ｄは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０３３６（図２Ｃ）、及びＷＺ－０４５１（図２Ｄ）の経時的な純度の変化を示す。
【図2-3】図２Ｅ及び２Ｆは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０４６７（図２Ｅ）、及びＷＺ－０４２０（図２Ｆ）の経時的な純度の変化を示す。
【図2-4】図２Ｇ及び２Ｈは、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＤＭＥＭ培地、または（３）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）中、４０μＭの開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０４６１（図２Ｇ）、及びＷＺ－０４１６（図２Ｈ）の経時的な純度の変化を示す。
【図3-1】図３Ａ及び３Ｂは、外因性エステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を加えた／加えない１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＣＭＶプロモーター－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子（Ｎｌｕｃ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（図３Ａ及び３Ｂ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、血清中で不安定な、または安定性の低い化合物であるＷＺ－０３０８（図３Ａ）の結果、及び従来の生細胞のプロ基質であるＰＢＩ－４３７７（図３Ｂ）の結果を含む。
【図3-2】図３Ｃ及び３Ｄは、外因性エステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を加えた／加えない１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＣＭＶプロモーター－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子（Ｎｌｕｃ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（図３Ｃ）、または４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｄ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、血清中で不安定な、または安定性の低い化合物であるＷＺ－０４１５（図３Ｄ）の結果、及び開示される血清中で安定な化合物であるＷＺ－０３２４（図３Ｃ）の結果を含む。
【図3-3】図３Ｅ及び３Ｆは、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｅ及び３Ｆ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、血清中で不安定な、または安定性の低い化合物であるＷＺ－０４２９（図３Ｅ）、及びＷＺ－０４３９（図３Ｆ）の結果を含む。
【図3-4】図３Ｇ及び３Ｈは、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｇ及び３Ｈ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、血清中で不安定な、または安定性の低い化合物であるＷＺ－０４５４（図３Ｇ）、及びＷＺ－０４４１（図３Ｈ）の結果を含む。
【図3-5】図３Ｉ及び３Ｊは、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｉ及び３Ｊ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、開示される血清中で安定な化合物であるＷＺ－０４５１（図３Ｉ）、及びＷＺ－００４１６（図３Ｊ）の結果を含む。
【図3-6】図３Ｋ及び３Ｌは、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｋ及び３Ｌ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、開示される血清中で安定な化合物であるＷＺ－０４２０（図３Ｋ）、及びＷＺ－０４６１（図３Ｌ）の結果を含む。
【図3-7】図３Ｍは、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＮｌｕｃに対するＰＫＡ ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ポジティブコントロールペアを発現するＨＥＫ２９３細胞（図３Ｍ）１０ｎｇ／ウェルにおける経時的な発光シグナルの減衰を示す。これらは、開示される血清中で安定な化合物であるＷＺ－０４１９（図３Ｍ）の結果を含む。
【図4-1】図４Ａ及び４Ｂは、３．５時間（図４Ａ）、及び７．０時間（図４Ｂ）の異なる処理時間で、ＴＲＡＩＬ（外因性のアポトーシス誘導物質）が化合物ＷＺ－０３３６による発光に用量依存的な増大を生じたことを示す。
【図4-2】図４Ｃ及び４Ｄは、２４時間（図４Ｃ）、及び３０時間（図４Ｄ）の異なる処理時間で、ＴＲＡＩＬ（外因性のアポトーシス誘導物質）が化合物ＷＺ－０３３６による発光に用量依存的な増大を生じたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書では、プロセレンテラジン類似体のエステルまたは炭酸誘導体を開示する。これらの化合物は、非発光酵素の基質及び発光タンパク質のプロ基質となりうる。対象とする非発光酵素が作用すると、誘導体は発光タンパク質の基質となることができる。開示される化合物は、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ならびに刺胞動物（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）、クラゲ（例えば、オワンクラゲ由来のエクオリン）及び十脚目ルシフェラーゼ（発光エビのルシフェラーゼ複合体）などのさまざまな海洋生物に見られる発光タンパク質を含む、セレンテラジンを利用して発光を生じるタンパク質（「セレンテラジン利用酵素」）の有用なプロ基質となりうるものである。
【0012】
開示される化合物は、血清中で予想外の安定性を示すことができる。開示される血清中で安定な化合物は、多くの生細胞生物発光アッセイ、生細胞イメージング、または生物発光細胞分取法において最大２４時間の持続時間にわたる発光シグナルを与えることができる。開示される化合物は、血清中安定性の大幅な改善によって新たなアッセイを実現することにより多大な可能性をもたらすものである。この予想外の効果は、輝度、溶解度、及び／または細胞透過性を必要に応じて向上させることにより、血清ライアビリティー及び／または関連するエステラーゼ活性を微調整することによって生物発光アッセイの性能の将来的な向上につながる多大な可能性をもたらすものである。
【0013】
１．定義
別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。矛盾が生じる場合、定義を含む本文書が優先するものとする。下記では好ましい方法及び材料を記載するが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料を本発明の実施及び試験において用いることが可能である。本明細書で触れるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献はそれらの全容を参照により援用するものとする。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例はあくまで説明のためのものであって、限定することを目的としない。
別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。矛盾が生じる場合、定義を含む本文書が優先するものとする。下記では好ましい方法及び材料を記載するが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料を本発明の実施及び試験において用いることが可能である。本明細書で触れるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献はそれらの全容を参照により援用するものとする。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例はあくまで説明のためのものであって、限定することを目的としない。
【0014】
本明細書で使用するところの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びそれらの変化形は、追加的な行為または構造の可能性を除外しないオープンエンドの移行句、用語、または語であることを意図している。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されないかぎり、複数の指示対象が含まれる。本開示は、明示的に記載されているか否かによらず、本明細書に示される実施形態または要素を「含む」、それ「からなる」、及びそれ「から本質的になる」、他の実施形態も想到している。
【0015】
量との関連で用いられる「約」なる修飾語は、記載される値を包含し、文脈によって規定される意味を有する（例えば、特定の量の測定にともなう誤差の程度を少なくとも含む）。「約」なる修飾語は、２つの端点の絶対値によって規定される範囲を開示するものとしてもみなされるべきである。例えば、「約２～約４」という表現は、「２～４」の範囲も開示する。「約」なる語は、示される数値の±１０％のことを指す場合もある。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示し、「約１」は０．９～１．１を示しうる。「約」の他の意味は、例えば四捨五入など、文脈より明らかとなる場合もあり、例えば「約１」は０．５～１．４も意味しうる。
【0016】
特定の官能基及び化学用語の定義について、下記により詳細に述べる。本開示の目的では、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５th Ｅｄ．の表紙裏に従って特定され、特定の官能基はそこに記載されるように一般的に定義される。さらに、有機化学の一般原理、ならびに特定の官能部分及び反応性については、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されており、当該文献のそれぞれの全容を参照により本明細書に援用するものである。
【0017】
本明細書で使用するところの「アセトキシ」なる用語は、カルボニル基を介して結合される場合のアルコールを意味する。
【0018】
本明細書で使用するところの「アルコキシ」なる用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルコキシの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ、及びｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられる。
【0019】
本明細書で使用するところの「アルキル」なる用語は、１～１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を意味する。本明細書で使用するところの「低級アルキル」または「Ｃ1～Ｃ6アルキル」なる用語は、１～６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。本明細書で使用するところの「Ｃ1～Ｃ3アルキル」なる用語は、１～３個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、及びｎ－デシルが挙げられる。
【0020】
本明細書で使用するところの「アルケニル」なる用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する、２～１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を意味する。アルケニル基は、置換または非置換であってよい。例えば、アルケニル基は、フェニルなどのアリール基で置換されてもよい。
【0021】
本明細書で使用するところの「アルキニル」なる用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する、２～１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を意味する。アルキニル基は、置換または非置換であってよい。例えば、アルキニル基は、フェニルなどのアリール基で置換されてもよい。
【0022】
本明細書で使用するところの「アルコキシアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。
【0023】
本明細書で使用するところの「アルキレン」なる用語は、１～１０個の炭素原子、例えば２～５個の炭素原子からなる直鎖または分枝鎖の炭化水素から誘導される二価の基を指す。アルキレンの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、－ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、及び－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－が挙げられる。
【0024】
本明細書で使用するところの「アミド」なる用語は、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）ＮＨ－またはＣＨ3ＣＨ2ＣＯＮＨ－など、カルボニル基を介して結合された場合の－ＮＨ－を意味する。
【0025】
「アミノ酸」なる用語は、天然及び非天然アミノ酸の両方を指す。アミノ酸には、保護された天然及び非天然アミノ酸も含まれる。
【0026】
本明細書で使用するところの「アリール」なる用語は、フェニル基、または二環式アリールもしくは三環式アリール縮合環系を指す。二環式縮合環系は、親分子部分に付加され、フェニル基と縮合されたフェニル基に例示される。三環式縮合環系は、親分子部分に付加され、２個の他のフェニル基と縮合されたフェニル基に例示される。二環式アリールの代表的な例としては、これに限定されるものではないが、ナフチルが挙げられる。三環式アリールの代表的な例としては、これに限定されるものではないが、アントラセニルが挙げられる。単環式、二環式、及び三環式アリールは、環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【0027】
本明細書で使用するところの「アリールアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ1～Ｃ6アルキルであってよい。
【0028】
本明細書で使用するところの「炭酸エステル」なる用語は、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－を意味する。
【0029】
本明細書で使用するところの「カルボキシアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加されたカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ1～Ｃ6アルキルであってよい。
【0030】
本明細書で使用するところの「シクロアルキル」なる用語は、３～１０個の炭素原子、０個のヘテロ原子、及び０個の二重結合を有する炭素環式環系のことを指す。シクロアルキルの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、及びシクロデシルが挙げられる。
【0031】
本明細書で使用するところの「カルボキシアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなカルボキシ基を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ1～Ｃ6アルキルであってよい。
【0032】
本明細書で使用するところの「シクロアルケニル」なる用語は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有し、好ましくは環当たり５～１０個の炭素原子を有する非芳香族の単環式または多環式環系を意味する。代表的な単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、またはシクロヘプテニルが挙げられる。
【0033】
本明細書で使用するところの「フルオロアルキル」なる用語は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の水素原子がフッ素に置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を意味する。フルオロアルキルの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及び、３，３，３－トリフルオロプロピルなどのトリフルオロプロピルが挙げられる。
【0034】
本明細書で使用するところの「アルコキシフルオロアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなフルオロアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。
【0035】
本明細書で使用するところの「フルオロアルコキシ」なる用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるような少なくとも１つのフルオロアルキル基を指す。フルオロアルコキシの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、及び２，２，２－トリフルオロエトキシが挙げられる。
【0036】
本明細書で使用するところの「ハロゲン」または「ハロ」なる用語は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＦを意味する。
【0037】
本明細書で使用するところの「ハロアルキル」なる用語は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の水素原子がハロゲンに置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を意味する。
【0038】
本明細書で使用するところの「ハロアルコキシ」なる用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるような少なくとも１つのハロアルキル基を指す。
【0039】
本明細書で使用するところの「ヘテロアルキル」なる用語は、１個以上の炭素原子が、Ｓ、Ｓｉ、Ｏ、Ｐ及びＮから選択されるヘテロ原子に置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を意味する。ヘテロ原子は酸化されうる。ヘテロアルキルの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、アルキルエーテル、第二級及び第三級アルキルアミン、アミド、及びアルキルスルフィドが挙げられる。
【0040】
本明細書で使用するところの「ヘテロアリール」なる用語は、芳香族単環式環または芳香族二環式環系または芳香族三環式環系のことを指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１個、２個、３個、または４個のヘテロ原子）を含む５員または６員環である。５員の芳香族単環式環は２個の二重結合を有し、６員の芳香族単環式環は３個の二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、親分子部分に付加され、本明細書で定義されるような単環式シクロアルキル基、本明細書で定義されるような単環式アリール基、本明細書で定義されるような単環式ヘテロアリール基、または本明細書で定義されるような単環式複素環と縮合された単環式ヘテロアリール環に例示される。三環式ヘテロアリール基は、親分子部分に付加され、本明細書で定義されるような単環式シクロアルキル基、本明細書で定義されるような単環式アリール基、本明細書で定義されるような単環式ヘテロアリール基、または本明細書で定義されるような単環式複素環のうちの２個と縮合された単環式ヘテロアリール環に例示される。単環式ヘテロアリールの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、フリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、及び２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジニルが挙げられる。二環式ヘテロアリールの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、クロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、チエノピロリル、チエノチエニル、イミダゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、イミダゾピリジン、ベンゾオキサジアゾリル、及びベンゾピラゾリルが挙げられる。三環式ヘテロアリールの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられる。単環式、二環式、及び三環式ヘテロアリールは、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【0041】
本明細書で使用するところの「ヘテロアリールアルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるようなヘテロアリール基を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ1～Ｃ6アルキルであってよい。
【0042】
本明細書で使用するところの「複素環」または「複素環式」なる用語は、単環式複素環、二環式複素環、または三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む３員環、４員環、５員環、６員環、７員環または８員環である。３員環または４員環は、０個または１個の二重結合と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子とを有する。５員環は、０個または１個の二重結合と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個、２個または３個のヘテロ原子とを有する。６員環は、０個、１個または２個の二重結合と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個、２個または３個のヘテロ原子とを有する。７員環及び８員環は、０個、１個、２個、または３個の二重結合と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個、２個または３個のヘテロ原子とを有する。単環式複素環の代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、１，３－ジメチルピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル及びトリチアニルが挙げられる。二環式複素環は、フェニル基と縮合された単環式複素環、または単環式シクロアルキルと縮合された単環式複素環、または単環式シクロアルケニルと縮合された単環式複素環、または単環式複素環と縮合された単環式複素環、またはスピロ複素環基、または架橋された単環式複素環系であって、環の２個の隣接していない原子が、１個、２個、３個または４個の炭素原子からなるアルキレン架橋、または２個、３個または４個の炭素原子からなるアルケニレン架橋によって連結されたものである。二環式複素環の代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。三環式複素環は、フェニル基と縮合された二環式複素環、または単環シクロアルキルと縮合された二環式複素環、または単環シクロアルケニルと縮合された二環式複素環、または単環式複素環と縮合された二環式複素環、または二環式複素環であって、二環式環の２個の隣接していない原子が、１個、２個、３個または４個の炭素原子からなるアルキレン架橋、または２個、３個または４個の炭素原子からなるアルケニレン架橋によって連結されたものに例示される。三環式複素環の例としては、これらに限定されるものではないが、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及びオキサ－アダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられる。単環式、二環式、及び三環式複素環は、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【0043】
本明細書で使用するところの「複素環式アルキル」なる用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義されるような複素環を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ1～Ｃ6アルキルであってよい。
【0044】
本明細書で使用するところの「ヒドロキシル」なる用語は、－ＯＨ基を意味する。
【0045】
本明細書で使用するところの「ヒドロキシポリエチレングリコキシアルキル」なる用語は、アルキル基を介して親分子部分に付加されたＨ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯ－部分を指し、式中、ｎ＝１～１００である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～１０、１～２０、または１～５０である。
【0046】
本明細書で使用するところの「メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル」なる用語は、アルキル基を介して親分子部分に付加されたＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯ－部分を指し、式中、ｎ＝１～１００である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～１０、１～２０、または１～５０である。
【0047】
いくつかの実施形態では、ヒドロカルビル置換基（例えば、アルキルまたはシクロアルキル）の炭素原子の数は、「Ｃx－Ｃy－」によって示され、式中、ｘは置換基の炭素原子の最小数であり、ｙは最大数である。したがって、炭素原子、「Ｃ1～Ｃ3－アルキル」とは、１～３個の炭素原子を有するアルキル置換基を指す。
【0048】
「置換された」なる用語は、１つ以上の非水素置換基でさらに置換されてもよい基を指す。置換基としては、これらに限定されるものではないが、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、－ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート及びアシルが挙げられる。
【0049】
本明細書に記載される化合物において、化合物の基及び置換基は、原子及び置換基の許容される価数に基づいて選択することができ、その選択及び置換によって、例えば、転位、環化、脱離などによって自然に変化しないような安定した化合物を生じる。
【0050】
本明細書における数値範囲の記載において、その範囲内に介在する同じ精度のそれぞれの数値が明示的に想到される。例えば、６～９の範囲では、数値７及び８が６及び９に加えて想到され、また、６．０～７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想到される。
【0051】
２．化合物
式（Ｉ）の化合物：
（Ｉ）、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲAは、Ｃ2～Ｃ10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Ｒx1、Ｒx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたＣ1～Ｃ6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
式（Ｉ）の化合物：
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲAは、Ｃ2～Ｃ10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Ｒx1、Ｒx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたＣ1～Ｃ6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
【0052】
式（ＩＩ）の化合物：
（ＩＩ）、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、Ａｒ4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、Ａｒ4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
【0053】
式（ＩＩＩ）の化合物：
（ＩＩＩ）、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
または、その互変異性体、またはその塩が開示される［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、場合によりそれぞれ置換され、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
【0054】
特定の実施形態では、Ａｒ1はフェニルであり、Ａｒ2はフリルであり、Ａｒ3はフェニルである。
【0055】
特定の実施形態では、Ｒx1はメチルである。特定の実施形態では、Ｒx2はメチルである。特定の実施形態では、Ｒx1及びＲx2の両方がメチルである。
【0056】
特定の実施形態では、ＲAはＲBＣＨ2－であり、ＲBは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環アルキルからなる群から選択される。
【0057】
特定の実施形態では、ＲAはＲCＯ－であり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される。
【0058】
特定の実施形態では、ＲAはＲCＣ（Ｏ）ＮＨ－であり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される。
【0059】
特定の実施形態では、ＲAはＲCＣ（Ｏ）Ｏ－であり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される。
【0060】
特定の実施形態では、ＲAは、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯ－であり、ｎは０～１０の任意の数である。
【0061】
特定の実施形態では、ＲAは、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯ－であり、ｎは０～１０の任意の数であり、Ａｒ1はフェニルであり、Ａｒ2はフリルであり、Ａｒ3はフェニルである。
【0062】
特定の実施形態では、ＲAはＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2－であり、ｎは０～１０の任意の数であり、Ａｒ1はフェニルであり、Ａｒ2はフリルであり、Ａｒ3はフェニルである。
【0063】
特定の実施形態では、Ｒx1及びＲx2はメチルであり、ＲAは、上記に定義されるＲBＣＨ2－、ＲCＯ－、ＲCＣ（Ｏ）ＮＨ－、ＲCＣ（Ｏ）Ｏ－、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯ－、またはＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2－である。
【0064】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は下式を有する：
［式中、Ｒy1、Ｒy2、Ｒz1、及びＲz2は、それぞれの場合において、水素と、ハロ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたＣ1～Ｃ6アルキルとからなる群からそれぞれ独立して選択され、ｎは０～１０の任意の数であり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルから選択される］。
【0065】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は下式を有する：
［式中、Ｒy1、Ｒy2、Ｒz1、及びＲz2は、上記に定義された通りである］。
【0066】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は下式を有する：
［式中、ｎは０～１０である］。
【0067】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は下式を有する：
［式中、Ｒy1、Ｒy2、Ｒz1、及びＲz2は、上記に定義された通りであり、ｎは０～１０である］。
【0068】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は下式を有する：
［式中、ｎは０～１０である］。
【0069】
特定の実施形態では、ＲA－Ｃ（Ｒx1Ｒx2）－は、以下からなる群から選択される：
【0070】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ａ）を有する：
（Ｉ－ａ）
［式中、ＲA、Ｒx1、Ｒx2、Ａｒ1、及びＡｒ2は、上記に定義された通りである］。
［式中、ＲA、Ｒx1、Ｒx2、Ａｒ1、及びＡｒ2は、上記に定義された通りである］。
【0071】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｂ）を有する：
（Ｉ－ｂ）
［式中、ＲA、Ｒx1、Ｒx2、及びＡｒ2は、上記に定義された通りである］。
［式中、ＲA、Ｒx1、Ｒx2、及びＡｒ2は、上記に定義された通りである］。
【0072】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｃ）を有する：
（Ｉ－ｃ）
［式中、ＲA、Ｒx1、及びＲx2は、上記に定義された通りである］。
［式中、ＲA、Ｒx1、及びＲx2は、上記に定義された通りである］。
【0073】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｄ）を有する：
（Ｉ－ｄ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、Ａｒ3、及びｎは、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、Ａｒ3、及びｎは、上記に定義された通りである］。
【0074】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｅ）を有する：
（Ｉ－ｅ）
［式中、ｎは、上記に定義された通りである］。いくつかの実施形態では、ｎは０～１０の任意の数である。
［式中、ｎは、上記に定義された通りである］。いくつかの実施形態では、ｎは０～１０の任意の数である。
【0075】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｆ）を有する：
（Ｉ－ｆ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、Ａｒ3、及びｎは、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、Ａｒ3、及びｎは、上記に定義された通りである］。
【0076】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｇ）を有する：
（Ｉ－ｇ）
［式中、ｎは、上記に定義された通りである］。いくつかの実施形態では、ｎは０～１０の任意の数である。
［式中、ｎは、上記に定義された通りである］。いくつかの実施形態では、ｎは０～１０の任意の数である。
【0077】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｈ）を有する：
（Ｉ－ｈ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、上記に定義された通りである］。
【0078】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｉ）を有する：
（Ｉ－ｉ）。
【0079】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｊ）を有する：
（Ｉ－ｊ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ3は、上記に定義された通りである］。
【0080】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｋ）を有する：
（Ｉ－ｋ）。
【0081】
特定の実施形態では、Ａｒ4は、１つ以上のアルコキシ置換基で場合により置換された、フェニル、フラン、またはチオフェンである。
【0082】
特定の実施形態では、Ａｒ4は、１つ以上のアルコキシ置換基で場合により置換された、フェニル、フラン、またはチオフェンであり、Ａｒ1はフェニルであり、Ａｒ2はフリルであり、Ａｒ3はフェニルである。
【0083】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ－ａ）を有する：
（ＩＩ－ａ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ4は、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＡｒ4は、上記に定義された通りである］。
【0084】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ－ｂ）を有する：
（ＩＩ－ｂ）
［式中、Ａｒ1、及びＡｒ4は、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、及びＡｒ4は、上記に定義された通りである］。
【0085】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ－ｃ）を有する：
（ＩＩ－ｃ）
［式中、Ａｒ4は、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ4は、上記に定義された通りである］。
【0086】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は炭酸エステルであり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される。
【0087】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は炭酸エステルであり、ＲCは、Ｃ1～Ｃ9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Ａｒ1はフェニルであり、Ａｒ2はフリルであり、Ａｒ3はフェニルである。
【0088】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ａ）を有する：
（ＩＩＩ－ａ）
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＲCは、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ1、Ａｒ2、及びＲCは、上記に定義された通りである］。
【0089】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ｂ）を有する：
（ＩＩＩ－ｂ）
［式中、Ａｒ2及びＲCは、上記に定義された通りである］。
［式中、Ａｒ2及びＲCは、上記に定義された通りである］。
【0090】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ｃ）を有する：
（ＩＩＩ－ｃ）
［式中、ＲCは、上記に定義された通りである］。
［式中、ＲCは、上記に定義された通りである］。
【0091】
式（Ｉ）の化合物の代表的な例としては、これに限定されるものではないが、以下が挙げられる。すなわち、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２３）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２４）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－メトキシエトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３３３）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１３，１３－ジメチル－２，５，８，１１－テトラオキサテトラデカン－１４－エート（ＷＺ－０３３６）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１６，１６－ジメチル－２，５，８，１１，１４－ペンタオキサヘプタデカン－１７－エート（ＷＺ－０３６４）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－メトキシ－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４５１）、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－アセトアミド－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４６７）。
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２３）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２４）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－メトキシエトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３３３）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１３，１３－ジメチル－２，５，８，１１－テトラオキサテトラデカン－１４－エート（ＷＺ－０３３６）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１６，１６－ジメチル－２，５，８，１１，１４－ペンタオキサヘプタデカン－１７－エート（ＷＺ－０３６４）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－メトキシ－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４５１）、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－アセトアミド－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４６７）。
【0092】
式（ＩＩ）の化合物の代表的な例としては、これに限定されるものではないが、以下が挙げられる。すなわち、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート（ＷＺ－０４２０）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート（ＷＺ－０４６１）、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート（ＷＺ－０４１６）。
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート（ＷＺ－０４２０）、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート（ＷＺ－０４６１）、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート（ＷＺ－０４１６）。
【0093】
式（ＩＩＩ）の化合物の代表的な例としては、これに限定されるものではないが、以下が挙げられる。すなわち、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネート（ＷＺ－０４１９）。
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネート（ＷＺ－０４１９）。
【0094】
化合物名は、ＣＨＥＭＤＲＡＷ（登録商標）ＵＬＴＲＡ ｖ．１２．０の一部としてのＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅ命名アルゴリズムにより指定した。
【0095】
化合物は、不斉中心またはキラル中心を有する立体異性体として存在しうる。立体異性体は、キラル炭素原子を中心とした置換基の配置に応じて「Ｒ」または「Ｓ」となる。本明細書で使用するところの「Ｒ」及び「Ｓ」なる用語は、ＩＵＰＡＣ １９７４，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）４５：１３－３０に定義されている配置である。本開示はさまざまな立体異性体及びそれらの混合物を想到するものであり、これらは本発明の範囲内に具体的に含まれる。立体異性体には、エナンチオマー及びジアステレオマー、ならびにエナンチオマーまたはジオステレオマーの混合物が含まれる。化合物の個々の立体異性体は、不斉中心またはキラル中心を有する市販の出発物質から合成により調製するか、またはラセミ混合物を調製した後、当業者には周知の分割法を行って調製することができる。これらの分割法は、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，“Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５th ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されるように、エナンチオマーの混合物をキラル補助剤に結合させ、得られたジアステレオマーの混合物を再結晶化またはクロマトグラフィーにより分離し、必要に応じて光学的に純粋な生成物を補助剤から遊離させること、または（２）光学エナンチオマーの混合物をキラルクロマトグラフィーカラムで直接分離すること、または（３）分別再結晶法に例示される。
【0096】
化合物は、互変異性体及び幾何異性体の形も有する場合があり、これらもまた本発明の一態様を構成することを理解するべきである。
【0097】
本開示には、１個以上の原子が自然界で通常見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子で置換されている点以外は式（Ｉ）に記載されるものと同じである同位体標識された化合物も含まれる。本発明の化合物に含めるのに適当な同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素があり、例えば、これらに限定されるものではないが、それぞれ2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ、及び36Ｃｌなどがある。重水素（すなわち2Ｈ）のようなより重い同位体による置換は、代謝安定性が大きくなることによる特定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増大または必要用量の低減をもたらす可能性があり、そのため、特定の状況では好ましい場合もある。化合物は、受容体の分布を調べるための医療用イメージング及び陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）の研究用に陽電子放出同位体を取り込ませることができる。式（Ｉ）の化合物に取り込ませることができる適当な陽電子放出同位体としては、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、及び18Ｆがある。同位体標識された式（Ｉ）の化合物は一般的に、当業者には周知の従来法によって調製するか、あるいは同位体以外の方法で標識された試薬の代わりに適当な同位体標識試薬を用いて、付属の実施例に記載されるものと類似の方法によって調製することができる。
【0098】
Ａ．化合物の性質
式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、細胞内に存在するか、細胞外培地に加えられるか、または試料中の非ルシフェラーゼ酵素の作用によって発光を生じるためのルシフェラーゼのプロ基質となることで、所定の時間にわたってルシフェラーゼ基質（セレンテラジンまたはフリマジンなど）を放出することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、脱保護酵素（エステラーゼなど）と反応してルシフェラーゼ基質を放出することができる。化合物は、向上した安定性、向上した水溶性、向上した細胞透過性、低減された自家発光、及び／または低減された毒性を有しうる。いくつかの実施形態では、開示される化合物は、他のセレンテラジン及びフリマジンエステル類似体と比較して予想外に優れた血清中安定性を示しうる。詳細な実施形態では、開示される化合物は、血清を含有する培地中で安定であり、これによりさまざまな生細胞アッセイで２４時間以上にわたり安定したシグナルを与える。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、細胞内に存在するか、細胞外培地に加えられるか、または試料中の非ルシフェラーゼ酵素の作用によって発光を生じるためのルシフェラーゼのプロ基質となることで、所定の時間にわたってルシフェラーゼ基質（セレンテラジンまたはフリマジンなど）を放出することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、脱保護酵素（エステラーゼなど）と反応してルシフェラーゼ基質を放出することができる。化合物は、向上した安定性、向上した水溶性、向上した細胞透過性、低減された自家発光、及び／または低減された毒性を有しうる。いくつかの実施形態では、開示される化合物は、他のセレンテラジン及びフリマジンエステル類似体と比較して予想外に優れた血清中安定性を示しうる。詳細な実施形態では、開示される化合物は、血清を含有する培地中で安定であり、これによりさまざまな生細胞アッセイで２４時間以上にわたり安定したシグナルを与える。
【0099】
本明細書で使用されるプロセレンテラジン類似体には、発光性タンパク質と相互作用して発光しないようにセレンテラジン及びフリマジンからそれぞれ構造的に改変されたプロセレンテラジン及びプロフリマジン化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、構造的改変は、酵素で除去可能な基の付加でありうる（例えば、エステル基の形成）。プロセレンテラジン類似体の適当な酵素（エステラーゼなど）との相互作用によって、セレンテラジン、フリマジン、またはそれらの誘導体を含む活性発光団化合物を生じることができる。プロセレンテラジン類似体を発光団に変換する酵素は、好ましくは非発光性酵素である。いくつかの実施形態では、開示される式（Ｉ）の化合物にはプロセレンテラジンまたはプロフリマジン化合物が含まれ、これらをエステル保護された発光団に変換することができる。
【0100】
一般的に、「増大した」または「向上した」とは、特定の性質（発光、及びシグナル安定性など）が、参照ルシフェラーゼとセレンテラジン類似体との組み合わせ、または検討されるセレンテラジン類似体と比較して増大していることを意味し、増大は、参照ルシフェラーゼとセレンテラジンとの組み合わせまたは検討されるセレンテラジン類似体、またはメチレンエーテル結合を介してセレンテラジンに連結された参照非置換アセチルエステルよりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％大きい。
【0101】
「発光」とは、例えば、セレンテラジン類似体などの適当な基質の存在下など、適当な条件下でのルシフェラーゼの光出力のことを指す。光出力は、プロセレンテラジン基質の添加によって開始されうる発光反応の開始時における光出力の瞬間またはほぼ瞬間の尺度（「Ｔ＝０」の発光または「フラッシュ」としばしば呼ばれる）として測定することができる。さまざまな実施形態における発光反応は、溶液中で行われる。他の実施形態では、発光反応は固体支持体上で行われる。いくつかの実施形態では、溶液は原核または真核発現系の生細胞を含むことができる。他の実施形態では、発現は無細胞系で生じるか、またはルシフェラーゼタンパク質は細胞外培地中に分泌され、後者の場合ではライセートを作る必要がない。いくつかの実施形態では、反応は、例えばプロセレンテラジン類似体、緩衝液などの適当な材料を、エステル脱保護酵素及び発光タンパク質が入った反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェル）内に注入することによって開始される。さらなる他の実施形態では、ルシフェラーゼ及び／またはプロセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）は宿主に導入され、発光の測定は、宿主、または生物全体、またはその細胞、組織、外植片、もしくは抽出物を含みうる宿主の一部において行われる。反応チャンバは、例えばルミノメーターまたは光電子増倍管を使用して光出力を測定することができる読み取り装置内に置くことができる。光出力または発光は、例えば、同じ反応チャンバで秒単位、分単位、時間単位など、経時的に測定することも可能である。光出力または発光は、経時的な平均値、シグナルの減衰の半減期、所定時間にわたったシグナルの総和、またはピーク出力として報告することができる。発光は、相対発光量（ＲＬＵ、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ）で測定することができる。
【0102】
開示される化合物は、増大した物理的安定性または低減した自家発光などの性質を有しうる。本化合物の物理的安定性とは、化合物がルシフェラーゼによる基質として用いられる場合に発光する能力を維持するように特定の条件でどの程度安定であるかを指す。ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の活性に依存しない発光は、自家発光と呼ばれる。自家発光は、崩壊または分解の際に光の形で放出されるエネルギーによって発生する物質の発光である。例えば、自家発光は発光性基質であるセレンテラジンの自然酸化によって引き起こされうる。
【0103】
プロセレンテラジン化合物では、「安定性」とは、化合物が、ルシフェラーゼにより生細胞アッセイで使用される場合に所定の時間にわたって（例えば、生細胞酵素の作用によって）徐々にセレンテラジン基質を放出する能力を維持するように所定の条件でどの程度安定であるかも指す場合がある。開示されるプロセレンテラジン化合物の安定性は、特定の環境における特定の化合物の経時的な分解のパーセンテージによって示すことができる。特定の化合物の純度のパーセンテージは、当該技術分野では周知のさまざまな方法によって決定することができる。これらの方法としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【0104】
「血清中安定性」とは、血清を含む培地または培養物中の化合物の安定性のことを指す。本明細書で使用される血清には、これに限定されるものではないが、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれうる。本明細書で使用される、ある化合物の血清中安定性は、そのような化合物の所定の時間にわたった分解度によって一般的に特徴付けることができる。例えば、ある化合物は、２４時間以上の時間でＦＢＳ中で２５％未満、２０％未満、１５％未満、またはさらには１０％未満、分解しうる。生細胞アッセイにおいて、血清（ＦＢＳなど）は細胞の健康状態を維持するための成分である。ＤＭＳＯコントロール、またはＦＢＳを含む／含まないＤＭＥＭ培地中での開示される化合物または他のプロセレンテラジン類似体の分解度は、同じ条件下で特定の時点において、特定の溶出溶媒／緩衝液（例えば、０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル）を使用したＨＰＬＣによってモニタリングすることができる。純度のパーセンテージは、ＦＢＳを含む／含まない培地中、特定の時点における特定の吸光波長（例えば２６０ｎｍ）での対応する保持時間における試験化合物のピーク面積を、試験化合物及び分解化合物を含む総ピーク面積で割ることによって計算することができる。特定の化合物の純度の経時的な変化は、血清を含む／含まない培地／培養物中でのその化合物の不安定度を示す。例えば、スキーム１ａに列記される開示される化合物の分解は、スキーム１ｂに列記される他のプロセレンテラジンエステル類似体よりも有意に遅い。
スキーム１ａ．血清中で安定なプロフリマジンエステルの例
スキーム１ｂ．血清中で不安定な、または安定性の低い化合物の例
スキーム１ａ．血清中で安定なプロフリマジンエステルの例
【0105】
開示される化合物は、他のプロセレンテラジンエステル化合物と比較して予想外の優れた血清中安定性を示す。いくつかの実施形態では、本化合物は、改善された血清中安定性を有することができる（例えば、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で１２時間以上で分解するのは２０％未満、図２Ａ～図２Ｉ）。これに対して、他のエステル化合物（ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０３１０、ＷＺ－０３１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、及びＷＺ－０４４１など）は低い血清中安定性を示す（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で１２時間以上でも８０％超が分解、図１Ａ～図１Ｈ）。本化合物の優れた安定性は、生細胞アッセイにおいてさまざまな改善をもたらすものである。いくつかの実施形態では、開示される化合物は、ＦＢＳを含有する培地中でルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを発現する生細胞において少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間にわたって持続する安定した発光シグナルを与えることができる。本化合物はその改善された血清中安定性のため、発光アッセイに利用可能な活性フリマジンまたはセレンテラジン分子の長時間にわたった連続的な放出を可能とすることから、アッセイのシグナル持続時間を改善するものである。
【0106】
開示される血清中で安定な化合物は、濃度及びアッセイの必要に応じて、調整可能な反応性、調整可能なシグナル強度、及び調整可能なアッセイウインドウも示す。例えば、化合物ＷＺ－０４５１及びＷＺ－０４２０は、濃度が２０μＭ超である場合に１５時間以内に安定したシグナルを示し、シグナルの強度は従来のプロ基質であるＰＢＩ－４３７７よりも１０倍明るい（図３Ｉ及び図３Ｋ）。しかしながら、他の開示される化合物ＷＺ－０４１６及びＷＺ－０４６１は、２４時間にわたって、濃度にそれほど依存しない形で安定したシグナルを示すが、輝度は低く、化合物ＰＢＩ－４３７７と同等かまたはわずかに高い（図３Ｊ、図３Ｌ、図５Ｃ、及び図５Ｄ）。これに対して、血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、及びＷＺ－０４４１（図１Ａ～図１Ｈ）は、濃度とほとんど無関係に速やかなシグナルの減衰を示した（図３Ａ、図３Ｅ～図３Ｈ）。したがって、開示される血清中で安定なプロ基質は、所望のインキュベーション時間ウインドウにわたって持続可能な発光シグナルを維持することが可能であり、これは、細胞内のエステラーゼ活性に完全に依存する場合もよらない場合もあり、アッセイウインドウ及び／またはシグナルは細胞内のエステラーゼ活性のみに依存しうるという従来の予想にも反するものと考えられる。
【0107】
本化合物の優れた血清安定性に加えて、いくつかの実施形態では、化合物の溶解度及び／または細胞透過性を高めることによって生物発光生細胞アッセイを改善することができる。いくつかの実施形態では、本化合物は、さまざまな数の繰り返し単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。ＰＥＧ部分の長さは、生細胞アッセイにおける本化合物の細胞透過性及び溶解度を高めることができる。本化合物のＰＥＧ部分及び他の保護基は、生細胞アッセイ中の脱保護酵素（エステラーゼなど）により切断されることでルシフェラーゼ基質（フリマジンなど）を放出することができる。非限定的な例として、ＷＺ－０３０８、ＰＢＩ－４３７７、及び開示される化合物であるＷＺ－０３２４の３つの異なるプロフリマジンエステルの比較を、外因性のエステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を加えた／加えない１０％ＦＢＳの存在下でＤＭＥＭ培地中、１０ｎｇ／ウェルのＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたＣＭＶプロモーター－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を用いて行った。これらの結果は、血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８はＦＢＳの存在下で速やかにフリマジンを放出したが、発光シグナルは、外因性のＰＬＥを加えない場合でも長時間にわたって持続可能ではなかったことを示す（図３Ａ、最初の２～３時間の速やかなシグナル減衰）。これに対して、従来の生細胞プロ基質であるＰＢＩ－４３７７及び開示される化合物ＷＺ－０３２４はいずれも、外因性のＰＬＥエステラーゼの非存在下で２４時間以上にわたって安定したシグナルを示した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。ＰＢＩ－４３７７とＷＺ－０３２４の発光シグナルは同等であり、外因性エステラーゼの添加によってどちらも有意に増大した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。これらの結果もまた、ＰＬＥの添加後にＰＢＩ－４３７７で観察されたシグナル（図３Ｂ）はＷＺ－０３２４のシグナル（図３Ｃ）よりも概ね高かったことから、ＷＺ－０３２４がＰＢＩ－４３７７よりも低いエステラーゼ活性を有しうることを示唆するものである。さらに、これらの結果は、ＷＺ－０３２４がＰＢＩ－４３７７よりも高い細胞透過性を有しうることを示唆するものである（図３Ｂ及び３Ｃ、外因性のＰＬＥエステラーゼの非存在下でのＷＺ－０３２４のより高いシグナル）。これらの結果は、ＷＺ－０３２４が、ＰＢＩ－４３７７よりも向上した溶解度を有しうることを示唆するものである（５０μＭ超でＰＢＩ－４３７７で観察された濁りと７０μＭ超でＷＺ－０３２４で観察された濁り）。溶解度または細胞透過性は、ＰＥＧの長さを大きくするか、またはアミノ基またはヒドロキシル基のような他の水溶性基を組み込むことによってさらに高めることができ、これにより、外因性のエステラーゼを加える必要なく生細胞アッセイの性能をさらに改善することができる。
【0108】
「生体適合性」とは、プロセレンテラジンまたはプロフリマジン化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）に対する細胞（例えば、原核または真核）の耐性のことを指す。プロセレンテラジンまたはプロフリマジン化合物の生体適合性は、化合物が宿主細胞に対して生じるストレスに関係している。プロセレンテラジンまたはプロフリマジン化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）からの活性フリマジンまたはセレンテラジンのゆっくりとした放出は、いくつかの実施形態において、活性分子自体によって引き起こされる毒性を低減または防止し、これらの化合物に対する細胞の耐性を高めることができる。
【0109】
プロセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び式（ＩＩＩ）の化合物）の向上した生体適合性は、細胞生存率及び／または細胞の増殖速度を測定することによって決定することができる。例えば、プロセレンテラジン類似体の向上した生体適合性は、天然のまたは既知のセレンテラジンに対してプロセレンテラジン類似体に曝露した細胞のルシフェラーゼ発現の非存在下での細胞生存率を測定してセレンテラジン類似体が細胞にとってどの程度適合性であるか及び／または毒性であるかを調べることによって決定することができる。
【0110】
詳細には、向上した生体適合性は、細胞生存率分析（例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを用いた）、アポトーシスアッセイ（例えば、ＣＡＳＰＡＳＥ－ＧＬＯ（登録商標）技術を用いた）、または当該技術分野では周知の別の方法を用いて測定することができる。細胞生存率またはアポトーシスに対する開示される化合物の効果を、細胞生存率またはアポトーシスに対する天然のまたは既知のセレンテラジン類似体の効果と比較することができる。
【0111】
向上した生体適合性は、細胞増殖または遺伝子発現に対する開示される化合物（例えば、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物）の効果を測定することによって決定することもできる。例えば、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物の向上した生体適合性は、天然のまたは既知のセレンテラジン類似体に曝露した、またはセレンテラジンに曝露しない細胞と比較して、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物に曝露した細胞の試料中で、所定の時間後の細胞数を測定することによって、またはストレス応答遺伝子の発現を測定することによって決定することができる。細胞増殖または遺伝子発現に対する開示される化合物の効果を、天然のまたは既知のセレンテラジン類似体と比較することができる。
【0112】
Ｂ．合成法
式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物、ならびに他のフリマジン－Ｏ－メチルカルボキシルエステルは、スキーム２ａ及びスキーム２ｂに示されるようにして合成することができる。
スキーム２ａ．フリマジン－Ｏ－メチル Ｍｅ－ＰＥＧn－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート：ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３３３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６及びＷＺ－０３６４、ならびにフリマジン－Ｏ－メチル Ｍｅ－ＰＥＧn－ＯＣＨ2－プロパノエート：ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０３１０及びＷＺ－０３１５の合成
スキーム２ｂ．プロフリマジンＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４６７、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４１９、ＷＺ－０４１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１、ＷＺ－０４４０及びＷＺ－０４３０の合成
式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物、ならびに他のフリマジン－Ｏ－メチルカルボキシルエステルは、スキーム２ａ及びスキーム２ｂに示されるようにして合成することができる。
スキーム２ａ．フリマジン－Ｏ－メチル Ｍｅ－ＰＥＧn－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート：ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３３３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６及びＷＺ－０３６４、ならびにフリマジン－Ｏ－メチル Ｍｅ－ＰＥＧn－ＯＣＨ2－プロパノエート：ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０３１０及びＷＺ－０３１５の合成
【0113】
スキーム２ａに示されるように、フリマジン－Ｏ－メチル Ｍｅ－ＰＥＧn－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート：ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３３３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６、及びＷＺ－０３６４は、同様の方法を用いて合成することができる。一実施形態では、３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパン酸が市販されていることから化合物ＷＺ－０３２３を除き、化合物ＷＺ－０３３３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６、及びＷＺ－０３６４を４工程の合成法によって調製した。メチル３－ヒドロキシ－２，２－ジメチルプロパノエートを、乾燥ＤＭＦ中、０℃で水素化ナトリウムで脱プロトン化してから、ブロモ－ＰＥＧ1~4－Ｍｅエーテル化合物と反応させてメチルＭｅ－ＰＥＧ1~4－ジメチルプロピオネート（１ａ～４ａ）を生成した。次いで、化合物１ａ～４ａを、塩基性条件下、６５℃で加水分解して対応する酸を生成した。酸１ｂ～４ｂを、ｎ－テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩の存在下、０℃で弱塩基性条件下でクロロスルホン酸クロロメチルと反応させ、中間体のクロロメチルＭｅ－ＰＥＧｎ－ジメチルプロピオネート１ｃ～４ｃを得た。フリマジンを化合物０ｃ～４ｃでアルキル化して最終目的分子ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３３３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６、及びＷＺ－０３６４を得た。同様に、プロフリマジンＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４６７、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４１９、ＷＺ－０４１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１、ＷＺ－０４４０、及びＷＺ－０４３０を、各酸をそれらのクロロメチルエステルに変換した後、フリマジンのアルキル化を行うことにより、上記の方法を用いて合成することができる。
【0114】
各個別の工程の反応条件及び反応時間は、用いられる特定の反応物質及び用いられる反応物質中に存在する置換基に応じて異なりうる。本化合物を調製するための手順の非限定的な例を、実施例のセクションに示す。反応は、例えば、残渣から溶媒を除去し、結晶化、蒸留、抽出、摩砕、及びクロマトグラフィーを含む（ただし、これらに限定されない）当該技術分野で一般的に知られる方法に従ってさらに精製することなどにより、従来の方法でワークアップすることができる。出発物質及び試薬は、市販のものを用いるかまたは化学文献に記載される方法を用いて市販の材料から調製することができる。出発物質は市販されていない場合、標準的な有機化学の手法、既知の構造的に似た化合物の合成法に類似の手法、または上記のスキームに類似した手法もしくは合成例のセクションに記載される手順から選択される手順によって調製することができる。
【0115】
塩基性付加塩は、カルボキシル基と、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、またはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、または炭酸水素塩、または有機第一級、第二級、もしくは第三級アミンなどの適当な塩基との反応により、開示される化合物の最終的な単離及び精製時に調製することができる。メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルホルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェンアミン（ｅｐｈｅｎａｍｉｎｅ）及びＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、などから誘導されるものなどの第四級アミン塩を調製することができる。
【0116】
反応条件の適切な操作、合成経路の試薬及び順序、反応条件と適合性を有しえないあらゆる化学官能基の保護、ならびに方法の反応シークエンスの適当な点における脱保護を含む通常の実験は、本発明の範囲内に含まれる。適当な保護基、及びそのような適当な保護基を用いた異なる置換基を保護及び脱保護するための方法は当該技術分野では周知のものであり、その例は、その全容を参照によって本明細書に援用するところのＰＧＭ Ｗｕｔｓ ａｎｄ ＴＷ Ｇｒｅｅｎｅによる、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４th ｅｄ．）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００６））の表題のＧｒｅｅｎｅの著書に見ることができる。本発明の化合物の合成は、上記に述べた合成スキーム及び具体的な実施例に記載されるものに類似の方法によって実現することができる。
【0117】
開示される化合物の光学活性体が必要とされる場合、光学活性を有する出発物質（例えば、適当な反応工程の不斉誘導により調製される）を用いて本明細書に記載される手順の１つを行うことにより、または標準的な手順を用いた化合物または中間体の立体異性体の混合物の分割（クロマトグラフィー分離、再結晶化、または酵素分割など）により、得ることができる。
【0118】
同様に、ある化合物の純粋な幾何異性体が必要とされる場合、出発物質として純粋な幾何異性体を使用して上記の手順の１つを行うことにより、またはクロマトグラフィー分離などの標準的な手順を用いた化合物の幾何異性体または中間体の混合物の分割により、得ることができる。
【0119】
記載される合成スキーム及び具体的な実施例は説明を目的としたものであって、付属の特許請求の範囲において定義される発明の範囲を限定するものとして読むべきではない点は認識されよう。合成法及び具体的な実施例のすべての代替例、改変例、及び均等物は、特許請求の範囲内に含まれるものである。
【0120】
３．使用方法及びキット
本化合物は、これまでにルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が使用されてきたあらゆる方法で使用することができる。詳細には、本化合物は、レポーターアッセイ、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）アッセイ及びＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイ、Ａｎｎｅｘｉｎアッセイなどを含む生細胞アッセイで使用することができる。安定なプロセレンテラジンまたはプロフリマジンが生細胞アッセイで使用される場合、発光団の脱安定化によって発生する光が低減されることからアッセイの精度は大幅に高められる。
本化合物は、これまでにルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が使用されてきたあらゆる方法で使用することができる。詳細には、本化合物は、レポーターアッセイ、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）アッセイ及びＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイ、Ａｎｎｅｘｉｎアッセイなどを含む生細胞アッセイで使用することができる。安定なプロセレンテラジンまたはプロフリマジンが生細胞アッセイで使用される場合、発光団の脱安定化によって発生する光が低減されることからアッセイの精度は大幅に高められる。
【0121】
本化合物は、試料中の発光を検出するための方法であって、試料を本発明に開示される化合物と接触させることと、試料中に脱保護酵素が存在しない場合、試料を脱保護酵素と接触させることと、試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含む方法で使用することができる。
【0122】
本明細書で使用される脱保護酵素とは、プロセレンテラジンまたはプロフリマジン化合物を発光団化合物であるフリマジンまたはセレンテラジンに変換することが可能な酵素のことを指す。さまざまな脱保護酵素を脱保護酵素として使用することができる。いくつかの実施形態では、脱保護酵素として、これに限定されるものではないが、エステラーゼが挙げられる。
【0123】
特定の実施形態では、試料は生細胞を含む。生細胞は、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理学的液体（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物）、または細胞培養物に由来するものを含むことができる。
【0124】
特定の実施形態では、試料は、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含む。
【0125】
特定の実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンをアッセイ試薬として使用することができる。ルシフェラーゼを用いたアッセイは、当該技術分野では周知のものである。かかるアッセイは、生細胞における遺伝子の発現及び調節などの生物学的機構を分析するうえで特に有用である。一般的には、細胞にルシフェラーゼをコードする核酸をトランスフェクトし、プロセレンテラジン類似体を含む試薬を細胞に添加することにより、ルシフェラーゼの存在を判定する。プロセレンテラジンは、細胞内に存在する酵素により脱保護されて発光団を放出することができる。
【0126】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼを含む生細胞アッセイで使用される。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）またはウミシイタケルシフェラーゼがアッセイにおける唯一の発光タンパク質であってよく、生細胞中に存在するエステラーゼが脱保護酵素であってよい。
【0127】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、生細胞におけるレポーター遺伝子の発現及び調節に対するタンパク質－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）フラグメント相補性アッセイを含む生細胞アッセイで使用される。
【0128】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、タンパク質－タンパク質相互作用を調べるためのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）相補性アッセイ用のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）フラグメントと融合させた対象タンパク質を含む生細胞アッセイで使用される。
【0129】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、リアルタイムアポトーシスアッセイ用のアネキシン－相補性ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）フラグメントを含むリアルタイムアッセイで使用される。アネキシン類は、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーである。健康な細胞では、ホスファチジルセリンは細胞膜の細胞質側に沿って主に位置している。ホスファチジルセリンは、アポトーシスが誘導される結果として細胞外膜に能動的に移動する。このアポトーシスカスケードの初期のバイオマーカーは、ホスファチジルセリンと結合し、フリマジンまたはセレンテラジンと反応して発光によりアポトーシス細胞を検出することができるＮａｎｏＬｕｃ相補性フラグメント融合アネキシンＶタンパク質によって測定することができる。
【0130】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、生細胞生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）アッセイで使用される。ＢＲＥＴは、２個の分子が互いに結合することが可能であるかどうか、または細胞内で共局在化しているかどうかを調べることができる。ＢＲＥＴでは、２種類の生物発光分子、または１種類の生物発光分子と１種類の蛍光分子のいずれかを使用する。これらの分子は、ドナーの放射波長がアクセプターの励起スペクトル内にあるように選択される。さらに、２種類の分子の励起及び放射スペクトルは、重複するにしても重複は最小限である必要がある。分子同士が互いに近接している場合、ドナーの励起は発光ではなくアクセプターへのエネルギーの転移につながる。これにより、アクセプターは転移したエネルギーを光として放射する。したがって、分子同士が互いに近接している場合、ドナーから検出される光は低くなり、アクセプターから検出される光は高くなる。分子同士が互いに近接していない場合には、ドナーから検出される光は高くなり、アクセプターから検出される光は低くなる。ドナーを第１のタンパク質に連結し、アクセプターを第２のタンパク質に連結することにより、２つのタンパク質の相互作用をＢＲＥＴの検出により調べることができる。好ましい実施形態では、ドナーはＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼであり、アクセプターは赤色蛍光色素である。
【0131】
いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンまたはプロフリマジンは、脱保護酵素を外因性酵素としてアッセイ試薬の添加と共に加えることができるアッセイで使用される。かかるアッセイは、短時間で最大の輝度に達することが求められるが、所定の時間にわたって相応に安定したシグナルを維持することが求められる特定の生細胞アッセイにおいて試料中に活性発光団（例えば、セレンテラジンまたはフリマジン）を速やかに放出する方法において有用となりうる。
【0132】
特定の実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、インビトロまたはインサイチューの生細胞環境に限定されず、インビボでの実験に拡張することができる。プロセレンテラジンまたはプロフリマジンのインビボ発光分析への応用は、当業者には直ちに明らかであろう。
【0133】
ルシフェラーゼ、タンパク質融合ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼが細胞内で発現される実施形態では、細胞をプロフリマジンまたはプロセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物）で処理し、プロ基質が培養中の細胞に透過してフリマジンまたはセレンテラジンを放出した後、ルシフェラーゼ、タンパク質融合ルシフェラーゼ、または相補性ルシフェラーゼと反応し、発光を生じる。化学修飾によりプロ基質の細胞透過性を増大させることで、アッセイ性能を向上させることができる。
【0134】
生細胞アッセイが必要とされる実施形態では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が培地または培養中における細胞の健康状態を維持するうえで必要な成分となりうる。式（Ｉ）の化合物は、ＦＢＳを含有する培地中におけるその高い安定性のため、よりロバストな、生細胞ルシフェラーゼに基づいたアッセイで使用することができる。
【0135】
さらなる他の実施形態では、ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含有する試料（細胞、組織、動物などを含む）と、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物とを、さまざまな顕微鏡及びイメージング技術（例えば、インビボイメージング）を用いてアッセイすることができる。
【0136】
さらなる他の実施形態では、生細胞アッセイ系の一環として細胞内で分泌性ルシフェラーゼを発現させる。
【0137】
細胞透過性であることに加えて、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、細胞生存率に関して天然のセレンテラジンに対して同等の生体適合性を示しうる。
【0138】
特定の実施形態では、本化合物は、トランスジェニック動物において発光を検出するための方法で使用することができる。かかる方法は、本化合物のうちの化合物を、セレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含む。
【0139】
特定の実施形態では、本明細書に開示される式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物をキットの一部として提供することができる。かかるキットは、１種類以上のルシフェラーゼ（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはその両方の形態のもの）と、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）のプロフリマジンまたはプロセレンテラジン類似体を、ユーザーが本明細書に開示されるもののようなアッセイを行うことを可能とする適当な試薬及び使用説明書と共に含むことができる。キットは、本明細書に開示されるもののような１種類以上の緩衝液をさらに含むことができる。
【実施例】
【0140】
４．実施例
実施例１：フリマジンメチルＭｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２３）の合成
Ｍｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチル－ＣＯＯＣＨ2Ｃｌ（０ｃ）の合成：Ｍｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチルプロパン酸（１．０ｇ、７．５７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／水の２０ｍＬ／２０ｍＬ混合物中に希釈した。混合物を氷水浴中で冷却し、炭酸水素ナトリウム（２．５４ｇ、３０．２７ｍｍｏｌ、４当量）及びｎ－テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（０．１２８ｇ、０．３７８ｍｍｏｌ、０．０５当量）を加えた。５分間攪拌した後、クロロスルホン酸クロロメチル（１．３７ｇ、８．３２ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で加えた。溶液を一晩、激しく攪拌した。混合物をさらなるジクロロメタンとともに分液漏斗に移し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を７３．２％の収率（１．３７ｇ）で得た。この化合物をさらなる精製を行わずに次の工程で直接使用した。
実施例１：フリマジンメチルＭｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２３）の合成
Ｍｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチル－ＣＯＯＣＨ2Ｃｌ（０ｃ）の合成：Ｍｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチルプロパン酸（１．０ｇ、７．５７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／水の２０ｍＬ／２０ｍＬ混合物中に希釈した。混合物を氷水浴中で冷却し、炭酸水素ナトリウム（２．５４ｇ、３０．２７ｍｍｏｌ、４当量）及びｎ－テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（０．１２８ｇ、０．３７８ｍｍｏｌ、０．０５当量）を加えた。５分間攪拌した後、クロロスルホン酸クロロメチル（１．３７ｇ、８．３２ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で加えた。溶液を一晩、激しく攪拌した。混合物をさらなるジクロロメタンとともに分液漏斗に移し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を７３．２％の収率（１．３７ｇ）で得た。この化合物をさらなる精製を行わずに次の工程で直接使用した。
【0141】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２３）：Ｍｅ－ＰＥＧ0－ＯＣＨ2－ジメチル－ＣＯＯＣＨ2Ｃｌ（０ｃ）（０．３７８ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）及びＫＩ（０．３４８ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＦに加えた混合物をアルゴン下で３０分間攪拌した。フリマジン（０．２０ｇ、０．５２４ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（０．２９０ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物をさらに３０分間攪拌した。混合物を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、水及び食塩水で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した。溶離剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用したＥＳＣＯフラッシュクロマトグラフィーにより化合物を精製して所望の生成物を得た（９０ｍｇ、３３％）。1ＨＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．５２（ｓ，１Ｈ），８．００－８．２０（ｍ，２Ｈ），７．４０－７．７０（ｍ，６Ｈ），７．２０－７．３８（ｍ，３Ｈ），６．４８（ｄ，１Ｈ），６．２１（ｄ，１Ｈ），５．７４（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４９（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１８（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．３３（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2），３．０１（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）（Ｃ31Ｈ31Ｎ3Ｏ5）計算値５２５．２３、実測値５２６．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度１００％．
【0142】
実施例２：フリマジン－Ｏ－メチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３３３）の合成
メチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（１ａ）の合成：水素化ナトリウム（油中、６０重量％）（６．２８ｇ、ｍｍｏｌ）を、０℃の２０ｍｌ ＤＭＦ中のメチル３－ヒドロキシ－２，２－ジメチルプロパノエート（１０．４０ｇ、７８．６９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加え、５分後に、１－ブロモ－２－メトキシエタン（１０．９４ｇ、７８．６９ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を３時間攪拌した。反応を冷たい飽和ＮＨ4Ｃｌ（水溶液）（３０ｍＬ）で停止し、水層をＤＣＭ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出し、加え合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去した後、溶離剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用したＥＳＣＯフラッシュクロマトグラフィーにより化合物を精製して３３％の生成物（５．０ｇ）を得た。
メチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（１ａ）の合成：水素化ナトリウム（油中、６０重量％）（６．２８ｇ、ｍｍｏｌ）を、０℃の２０ｍｌ ＤＭＦ中のメチル３－ヒドロキシ－２，２－ジメチルプロパノエート（１０．４０ｇ、７８．６９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加え、５分後に、１－ブロモ－２－メトキシエタン（１０．９４ｇ、７８．６９ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を３時間攪拌した。反応を冷たい飽和ＮＨ4Ｃｌ（水溶液）（３０ｍＬ）で停止し、水層をＤＣＭ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出し、加え合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去した後、溶離剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用したＥＳＣＯフラッシュクロマトグラフィーにより化合物を精製して３３％の生成物（５．０ｇ）を得た。
【0143】
Ｍｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパン酸（１ｂ）の合成：２Ｍ ＫＯＨ水溶液（６０ｍＬ）中のメチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（５．０ｇ、０．０２８４ｍｍｏｌ）の懸濁液を、６５℃で７時間攪拌した。水層をＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄し、６Ｍ ＨＣｌ（水溶液）でｐＨ１～２に酸性化し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。加え合わせた有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過して、真空下で濃縮して所望の生成物を淡黄色の油状物（２．４２ｇ、４８％）として得た。
【0144】
クロロメチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（１ｃ）の合成：Ｍｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチル－プロパン酸（２．４２ｇ、１３．７３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／水の２０ｍＬ／２０ｍＬ混合物中に希釈した。混合物を氷水浴中で冷却し、炭酸水素ナトリウム（４．６１ｇ、５４．９３ｍｍｏｌ、４当量）及びｎ－テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（０．２３３ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、０．０５当量）を加えた。５分間攪拌した後、クロロスルホン酸クロロメチル（２．４９ｇ、１５．１１ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で加えた。溶液を一晩、激しく攪拌した。混合物をさらなるジクロロメタンとともに分液漏斗に移し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を６０．９％の収率（１．８８ｇ）で得た。この化合物をさらなる精製を行わずに次の工程で直接使用した。
【0145】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－メトキシエトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３３３）の合成：クロロメチルＭｅ－ＰＥＧ1－ＯＣＨ2－ジメチルプロパノエート（１ｃ）（０．５３ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）及びＫＩ（０．３９１ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＦに加えた混合物をアルゴン下で３０分間攪拌した。フリマジン（０．３０ｇ、０．７８６ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（０．４３５ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物をさらに３０分間攪拌した。混合物を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、水及び食塩水で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した。溶離剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用したＥＳＣＯフラッシュクロマトグラフィーにより化合物を精製して所望の生成物を得た（１２０ｍｇ、２７％）。1ＨＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．５９（ｓ，１Ｈ），８．１０－８．３０（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．７０（ｍ，６Ｈ），７．２０－７．３５（ｍ，３Ｈ），６．４６（ｄ，１Ｈ），６．２１（ｄ，１Ｈ），５．７５（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．３８（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１５（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．２０－３．４０（ｍ，６Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）（Ｃ33Ｈ35Ｎ3Ｏ6）計算値５６９．２５［Ｍ＋Ｈ］、実測値５７０．２；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９２．５％．
【0146】
化合物ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６ ＷＺ－０３６４、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４６７、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４１９、ＷＺ－０４１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１、ＷＺ－０４４０及びＷＺ－０４３０は、ＷＺ－０３３３の合成で用いたものと同様の方法を用いて合成した。
【0147】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート（ＷＺ－０３２４）．1ＨＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．６２（ｓ，１Ｈ），８．００－８．２０（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．６５（ｍ，６Ｈ），７．１０－７．３０（ｍ，３Ｈ），６．３８（ｄ，１Ｈ），６．１９（ｄ，１Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４５（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１９（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．２５－３．５０（ｍ，１０Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．０１（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）（Ｃ35Ｈ39Ｎ3Ｏ7）計算値６１３．２８、実測値６１４．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度１００％．
【0148】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１３，１３－ジメチル－２，５，８，１１－テトラオキサテトラデカン－１４－エート（ＷＺ－０３３６）．1ＨＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．５７（ｓ，１Ｈ），８．０－８．２５（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．６５（ｍ，６Ｈ），７．２０－７．３０（ｍ，３Ｈ），６．４２（ｄ，１Ｈ），６．２２（ｄ，１Ｈ），５．７５（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４３（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．２０（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．２０－３．５０（ｍ，１４Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）（Ｃ37Ｈ43Ｎ3Ｏ8）計算値６５７．３１、実測値６５８．３［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９９．６％．
【0149】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１６，１６－ジメチル－２，５，８，１１，１４－ペンタオキサヘプタデカン－１７－エート（ＷＺ－０３６４）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．５９（ｓ，１Ｈ），８．０－８．２（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．６０（ｍ，６Ｈ），７．２０－７．３０（ｍ，３Ｈ），６．３９（ｄ，１Ｈ），６．１８（ｄ，１Ｈ），５．７９（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４２（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１９（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．２２－３．５５（ｍ，１８Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）［Ｍ＋Ｈ］（Ｃ39Ｈ47Ｎ3Ｏ9）計算値７０１．３３、実測値７０２．３［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度１００％．
【0150】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－メトキシ－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４５１）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．６３（ｓ，１Ｈ），８．０－８．２（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．６０（ｍ，６Ｈ），７．１５－７．３５（ｍ，３Ｈ），６．３７（ｄ，１Ｈ），６．１９（ｄ，１Ｈ），５．８５（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．５０（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．２１（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．００（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ3），１．２５（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）（Ｃ30Ｈ29Ｎ3Ｏ5）計算値５１１．２１、実測値５１２．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９８％．
【0151】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－アセトアミド－２－メチルプロパノエート（ＷＺ－０４６７）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．７０（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０－８．２（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．６５（ｍ，６Ｈ），７．１５－７．３５（ｍ，３Ｈ），６．３８（ｄ，１Ｈ），６．２２（ｄ，１Ｈ），５．７６（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４９（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．２３（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），１．７４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3Ｃ＝Ｏ），１．２５（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）Ｃ31Ｈ30Ｎ4Ｏ5計算値５３８．２２、実測値５３９．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９９％．
【0152】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート（ＷＺ－０４２０）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．６０（ｓ，１Ｈ），７．８５－８．０５（ｍ，３Ｈ），７．１－７．６（ｍ，１０Ｈ），６．６１（ｄ，１Ｈ），６．３６（ｄ，１Ｈ），６．１８（ｄ，１Ｈ），５．９３（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４３（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１３（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2）．ＭＳ（ｍ／ｅ）Ｃ30Ｈ23Ｎ3Ｏ5計算値５０５．１６、実測値５０６．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９０％．
【0153】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート（ＷＺ－０４６１）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．７３（ｓ，１Ｈ），８．４１（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．８５－８．０５（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄ，１Ｈ），７．３－７．６（ｍ，６Ｈ），７．２－７．３（ｍ，３Ｈ），６．７６（ｄ，１Ｈ），６．３３（ｄ，１Ｈ），６．１４（ｄ，１Ｈ），５．９６（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４９（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１４（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2）．ＭＳ（ｍ／ｅ）Ｃ30Ｈ23Ｎ3Ｏ5計算値５０５．１６、実測値５０６．３［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９８．８％．
【0154】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート（ＷＺ－０４１６）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．５９（ｓ，１Ｈ），７．８－８．０（ｍ，４Ｈ），７．６－７．７（ｍ，１Ｈ），７．３－７．５（ｍ，８Ｈ），７．１－７．３（ｍ，３Ｈ），６．３８（ｄ，１Ｈ），６．１４（ｄ，１Ｈ），６．０（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４２（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１１（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2）．ＭＳ（ｍ／ｅ）Ｃ32Ｈ25Ｎ3Ｏ5計算値５１５．１８、実測値５１６．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９９．８％．
【0155】
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネート（ＷＺ－０４１９）．1ＨＮＭＲ（ｄ6－ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．６１（ｓ，１Ｈ），７．９－８．１（ｍ，２Ｈ），７．３－７．６（ｍ，６Ｈ），７．１－７．３（ｍ，３Ｈ），６．３８（ｄ，１Ｈ），６．１７（ｄ，１Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ2Ｏ－），４．４７（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），４．１６（ｓ，２Ｈ，－ＣＨ2），３．７１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3）．ＭＳ（ｍ／ｅ）Ｃ27Ｈ23Ｎ3Ｏ5計算値４６９．１６、実測値４７０．２［Ｍ＋Ｈ］；２６０ｎｍのＨＰＬＣ純度９７．８％．
【0156】
以下の化合物は、スキーム２ａ及びスキーム２ｂの一般的手順を用いて調製した。
【0157】
実施例３：ＤＭＳＯまたはウシ胎児血清を添加したかもしくは添加しない培地中でのプロフリマジンまたはプロセレンテラジンの安定性試験の一般的プロトコール
試験化合物を、２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯストック中に溶解した。このストック溶液を、ＤＭＳＯコントロールまたはＦＢＳを添加した／添加しないＤＭＥＭ培地中に４０μＭにさらに希釈した。各化合物の３つの４０ｕＭの希釈液を、特定の溶出溶媒／緩衝液（例えば、０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル）を使用し、同じ条件下で２４時間にわたってＨＰＬＣにより測定した。特定の時点における純度のパーセンテージを、対応する保持時間における２６０ｎｍでの試験化合物のピーク面積を、試験化合物及び分解化合物を含むすべての化合物の総ピーク面積で割ることによって計算した。試験化合物の純度の経時的な変化は、１０％のＦＢＳの存在下／非存在下における特定の環境中での化合物の不安定度を示した。図１Ａ～１Ｈは、化合物ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０３１０、ＷＺ－０３１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４３９及びＷＺ－０４４１では、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中での５時間後の分解率はおよそ５０％以上であり、低い血清中安定性を示したことを示している。ＷＺ－０４１５は、１０％ＦＢＳの存在下で１０時間後におよそ５０％の分解率であり、血清中安定性の向上を示した。これに対して、化合物ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４６７、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１、ＷＺ－０４１６、及びＷＺ－０４１９は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で１０時間またはそれ以降に分解したのは２０％未満であり、改善された血清中安定性を示した（図２Ａ～２Ｉ）。
試験化合物を、２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯストック中に溶解した。このストック溶液を、ＤＭＳＯコントロールまたはＦＢＳを添加した／添加しないＤＭＥＭ培地中に４０μＭにさらに希釈した。各化合物の３つの４０ｕＭの希釈液を、特定の溶出溶媒／緩衝液（例えば、０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル）を使用し、同じ条件下で２４時間にわたってＨＰＬＣにより測定した。特定の時点における純度のパーセンテージを、対応する保持時間における２６０ｎｍでの試験化合物のピーク面積を、試験化合物及び分解化合物を含むすべての化合物の総ピーク面積で割ることによって計算した。試験化合物の純度の経時的な変化は、１０％のＦＢＳの存在下／非存在下における特定の環境中での化合物の不安定度を示した。図１Ａ～１Ｈは、化合物ＷＺ－０３０８、ＷＺ－０３１０、ＷＺ－０３１５、ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４３９及びＷＺ－０４４１では、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中での５時間後の分解率はおよそ５０％以上であり、低い血清中安定性を示したことを示している。ＷＺ－０４１５は、１０％ＦＢＳの存在下で１０時間後におよそ５０％の分解率であり、血清中安定性の向上を示した。これに対して、化合物ＷＺ－０３２３、ＷＺ－０３２４、ＷＺ－０３３６、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４６７、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１、ＷＺ－０４１６、及びＷＺ－０４１９は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で１０時間またはそれ以降に分解したのは２０％未満であり、改善された血清中安定性を示した（図２Ａ～２Ｉ）。
【0158】
実施例４：生細胞レポーター遺伝子アッセイの一般的プロトコール
合成したプロセレンテラジン及びプロフリマジン化合物を生細胞レポーター遺伝子アッセイで評価した。図３Ａ～Ｃに示されるように、３つの代表的なプロセレンテラジン類似体、例えば、血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８、従来の生細胞プロ基質ＰＢＩ－４３７７、及び開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０３２４と共に、外因性のエステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を添加し／添加せずに、１０ｎｇ／ウェルのＣＭＶプロモーター－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子をトランスフェクトした、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＨＥＫ２９３細胞で、発光シグナルの減衰を経時的にモニタリングした。これらの評価は以下のプロトコールにより行った。
合成したプロセレンテラジン及びプロフリマジン化合物を生細胞レポーター遺伝子アッセイで評価した。図３Ａ～Ｃに示されるように、３つの代表的なプロセレンテラジン類似体、例えば、血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８、従来の生細胞プロ基質ＰＢＩ－４３７７、及び開示される血清中で安定な化合物ＷＺ－０３２４と共に、外因性のエステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を添加し／添加せずに、１０ｎｇ／ウェルのＣＭＶプロモーター－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子をトランスフェクトした、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のＨＥＫ２９３細胞で、発光シグナルの減衰を経時的にモニタリングした。これらの評価は以下のプロトコールにより行った。
【0159】
１日目：細胞の播種。ＨＥＫ２９３細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ））中で増殖させた。細胞を、継代６回目（約９５％コンフルエンス）に、ＤＰＢＳで洗浄し、細胞が剥がれるまでＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで細胞を処理し、４倍量の完全培地を加え、１８８×ｇで２分間ペレット化し、細胞を完全培地中に７．３５Ｅ４細胞／ｍＬにまで懸濁する手順によって回収した。細胞を９６ウェルプレートの内側の６０個のウェルにウェル当たり１００μＬで播種し（ウェル当たり細胞７，３５０個）、３６個の外側のウェルには１００μＬのＤＰＢＳを、ウェルの間には１００μＬのＤＰＢＳを加えた。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
【0160】
２日目：トランスフェクション。２つのマスターミックス（ＭＭ）を調製した。すなわち、ＭＭ＃１：１．６３μＬプレップ＃１、９．５μＬプレップ＃３、１．９ｍＬ ＯＭ１、及びＭＭ＃２：２．９ｕＬプレップ＃２、９．５μＬプレップ＃３、１．９ｍＬ ＯＭ１。３５．６μｌのＦｕＧＥＮＥ ＨＤを各ＭＭに加え、上下にピペッティングすることにより混合した。この混合物を室温で約１０分間インキュベートした。次いで、シングルチャネルリピーターピペットを用いて各ウェル当たり８μＬの混合物を加え、各条件につき、ｎ＝３とした。次いで、混合物を３７℃、５％ＣＯ2で約２４時間インキュベートした。
【0161】
３日目：生細胞アッセイ。ＤＭＳＯ（５００×）中の試験化合物のストックを、５０ｍＭのストックをＤＭＳＯで連続希釈することにより調製した。室温の培地＋／－ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）をＣＯ２ ＩＭ＋１０％ＦＢＳ中の１及び０．３３３ｕｇ／ｍｌのＰＬＥを加えることにより調製した。ＰＬＥを添加しないＣＯ２ ＩＭ＋１０％ＦＢＳも調製した。次いで、培地＋試験化合物溶液（室温）を、チャネル当たり２ｍＬの各培地を加え、チャネル当たり４μＬの各試験化合物ストックを加え、１０～１５回、上下にピペッティングして混合する工程により調製した。最終ＤＭＳＯ濃度は０．２％（ｖ／ｖ）であった。このＤＭＳＯ溶液をチャネルの底に滴下すると、より高い濃度で沈殿を示した。上下にピペッティングした後、最終濃度５０ｕＭ以上のＷＺ－０３２４との溶液は、いくつかの場合では３７℃での長時間のインキュベーション後にも顕著に濁っていた（１００ｕＭ＞７５ｕＭ＞５０ｕＭ）。各溶液を室温で１５～２０分間静置した後、細胞に加えた（Ｐ１－＞Ｐ２－＞Ｐ３）。
【0162】
培地を吸引し、２００μＬ／ウェルの各培地＋試験化合物溶液に置き換えた。ＤＰＢＳを外側の３６個のウェルに全体で２００μｌ加えた。この系を各ＧＭＭ＋に速やかに移動して３７℃でＲＬＵ測定を開始した。測定は以下の条件下で行った。すなわち、積分時間１秒、ＲＬＵ測定は１５分毎、終夜のＲＬＵ測定では蓋を外し、初期ＲＬＵ測定は、室温の培地の添加及びプレートの冷却のため、３７℃未満で行った。
【0163】
データ解析：ｎ＝３について平均のＲＬＵをプロットした。標準偏差として表される誤差がそれぞれの埋め込まれたＰｒｉｓｍファイルに含まれていたが、曲線の解釈を分かりやすくするために示していない。
【0164】
図３Ａに示されるように、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中の血清中で不安定な化合物ＷＺ－０３０８は、初期の時点で最も高いシグナルを示したが、外因性のＰＬＥを加えない場合でも最初の２～３時間で速やかに減衰した。この結果はＨＰＬＣによる安定性の結果と一致し、ＷＺ－０３０８がＦＢＳにより速やかにフリマジンを放出することを示したが、発光シグナルは長時間にわたって持続しなかった。図３Ｂ及び図３Ｃに示されるように、従来の生細胞プロ基質であるＰＢＩ－４３７７及び開示される化合物ＷＺ－０３２４はいずれも、外因性のＰＬＥエステラーゼを加えない場合でも２４時間以上にわたって安定したシグナルを示した。同じ量のＰＬＥエステラーゼを加えた後、ＰＢＩ－４３７７及びＷＺ－０３２４はいずれも、ＰＬＥを加えないものよりも有意に高い発光を示し、これらがいずれもＰＬＥの基質であり、外因性のエステラーゼの添加によって発光シグナルを直ちに増大させることができることを示した。ＰＬＥの添加後にＰＢＩ－３４７７で観察されたシグナル（図３Ｂ）は、ＷＺ－０３２４のシグナル（図３Ｃ）よりも概ね高かった。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、ＰＢＩ－４３７７は開示される化合物ＷＺ－０３２４よりもより良好な外因性ＰＬＥの基質またはより良好な生細胞エステラーゼの基質となりうると仮定される。しかしながら、外因性のＰＬＥエステラーゼの非存在下でのＷＺ－０３２４のより高いシグナル（図３Ｂ及び図３Ｃ）は、ＷＺ－０３２４がＰＢＩ－４３７７よりも高い細胞透過性を有しうることを示唆した。曇りがＰＢＩ－４３７７で５０μＭ超の濃度、ＷＺ－３２４で７０μＭ超の濃度で観察されたことは、ＷＺ－０３２４がＰＢＩ－４３７７よりも向上した溶解度を有する可能性を示唆した。
【0165】
化合物ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１及びＷＺ－０４１９を、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターを介して発現されるＳｍＢｉＴ－ＰＲＫＡＣＡ及びＬｇＢｉＴ－ＰＲＫＡＲ２ＡのプラスミドＤＮＡコンストラクトを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で試験し、発光シグナルの減衰を経時的にモニタリングした。図３Ｉ及び図３Ｋに示されるように、化合物ＷＺ－０４５１及びＷＺ－０４２０は、２０ｕＭ超の濃度で１５時間以内に安定したシグナルを示し、シグナルの強度は従来のプロ基質であるＰＢＩ－４３７７よりも１０倍明るい（図３Ｉ及び図３Ｋ）。しかしながら、化合物ＷＺ－０４１６及びＷＺ－０４６１は、２４時間以上にわたって、濃度にそれほど依存しない形で安定したシグナルを示したが、シグナル強度は低く、ＰＢＩ－４３７７と同等かまたはわずかに高い（図３Ｊ、図３Ｋ、ならびに図４及び図５）。これに対して、血清中で不安定な化合物ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、及びＷＺ－０４４１（図１Ａ～図１Ｈ）は、濃度とほとんど無関係に速やかなシグナルの減衰を示した（図３Ａ、図３Ｅ～図３Ｈ）。これらの結果は、血清中で安定な化合物は、濃度及びアッセイの必要に応じて、反応性を調整し、シグナル強度を調整し、アッセイウインドウを調整することが可能であるが、血清中で不安定な化合物はそうではないことを示す。化合物ＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１、ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４２０、ＷＺ－０４６１及びＷＺ－０４１９の評価を以下のプロトコールにより行った。
【0166】
１日目、細胞の播種。ＨＥＫ２９３細胞を、完全培地［ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１× ＮＥＡＡ］中で増殖させた。細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１７）に、ウェル（１００μＬ）当たりおよそ１０，０００個の細胞で播種した。
【0167】
２日目、一過性トランスフェクション。ＨＳＶ－ＴＫプロモーターを介して発現されるＳｍＢｉＴ－ＰＲＫＡＣＡ及びＬｇＢｉＴ－ＰＲＫＡＲ２ＡのプラスミドＤＮＡコンストラクトをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ中、６．２５ｎｇ／μＬに希釈し、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを３：１の脂質：ＤＮＡ比で加えた。室温で５～１０分間のインキュベーション後、８μｌの脂質：ＤＮＡ溶液をウェル毎に加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。
【0168】
３日目、生細胞アッセイ。各化合物をＤＭＳＯ中に最終濃度５０ｍＭとなるように溶解した。各化合物をＤＭＳＯ中に希釈して３３．３、１６．７及び６．７ｍＭのストックとした。ＤＭＳＯストック溶液を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ中に６６７倍に希釈して１倍溶液とした。完全培地を吸引し、７５、５０、２５または１０ｕＭのＷＺ－０４２９、ＷＺ－０４３９、ＷＺ－０４５４、ＷＺ－０４４１ＷＺ－０４５１、ＷＺ－０４１６、ＷＺ－０４２０及びＷＺ－０４１９のような各化合物（０．１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中、最終濃度）を含む（ただし、化合物ＷＺ－０４６１については４０、３０、２０または１０μＭを含む）各１倍溶液に置き換えた。積分時間１秒を用い、３７℃で１５分毎にＧｌｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｐｌｕｓルミノメーターで発光を測定した。
【0169】
実施例５：リアルタイムフォーマットでアポトーシスを検出するためのホスファチジルセリンに結合する相補的Ｎａｎｏｌｕｃフラグメント融合アネキシンＶ
プレート読み取りルミノメーターを用いたリアルタイムでのアポトーシスの検出用に、ルシフェラーゼの小さなフラグメント及び大きなフラグメントが、アネキシンＶと結合させた融合タンパク質として遺伝子操作によって作製されている。個々のアネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合体のペアは、互いに対して低い固有の親和性を有しており、そのため、培地中または非アポトーシス細胞の存在下では発光を生じないかまたは生じる発光は低いが、アネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質がアポトーシス細胞の表面に露出したホスファチジルセリンに近接して結合すると、ルシフェラーゼフラグメントは活性酵素を再構成して発光シグナルを発生する。アネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質とルシフェラーゼ基質とを組み合わせることにより、培養中の細胞に直接加えることで、蛍光アネキシンＶ結合アッセイで一般的に用いられている細胞洗浄工程を必要としない均質なアッセイを与える試薬が形成される。発光の経時的なモニタリングによって、非透過性の蛍光発生ＤＮＡ結合色素と複合体化させて膜の完全性を示すことにより、アポトーシスの開始が同じ試料から測定される二次壊死よりも先に生じることが示される。
プレート読み取りルミノメーターを用いたリアルタイムでのアポトーシスの検出用に、ルシフェラーゼの小さなフラグメント及び大きなフラグメントが、アネキシンＶと結合させた融合タンパク質として遺伝子操作によって作製されている。個々のアネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合体のペアは、互いに対して低い固有の親和性を有しており、そのため、培地中または非アポトーシス細胞の存在下では発光を生じないかまたは生じる発光は低いが、アネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質がアポトーシス細胞の表面に露出したホスファチジルセリンに近接して結合すると、ルシフェラーゼフラグメントは活性酵素を再構成して発光シグナルを発生する。アネキシンＶ－ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質とルシフェラーゼ基質とを組み合わせることにより、培養中の細胞に直接加えることで、蛍光アネキシンＶ結合アッセイで一般的に用いられている細胞洗浄工程を必要としない均質なアッセイを与える試薬が形成される。発光の経時的なモニタリングによって、非透過性の蛍光発生ＤＮＡ結合色素と複合体化させて膜の完全性を示すことにより、アポトーシスの開始が同じ試料から測定される二次壊死よりも先に生じることが示される。
【0170】
相補的ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）フラグメント融合アネキシンＶ結合の一般的プロトコール：ＤＬＤ－１細胞（１０，０００個／ウェル、１００μＬ）を培地＋１０％ＦＢＳ及び２× ＣｅｌｌＴｏｘ Ｇｒｅｅｎ中、ソリッド白９６ウェルプレートに播種した。細胞を付着させた後、１ｍＭ ＣａＣｌ2で強化した培地＋１０％ＦＢＳ中、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌの５０μＬの組換えヒトＴＲＡＩＬを加えた。直後に、５０μＬの４倍濃縮した最終濃度３０ｎＭ及び６０ｎＭのアネキシン－ＬｇＢｉＴ及びアネキシン－ＳｍＢｉＴを加え、次いで５０μＬの４倍濃縮した各試験化合物を、１ｍＭ ＣａＣｌ2で強化した培地＋１０％ＦＢＳ中、２倍の連続希釈で加えた。プレートを組織培養インキュベーター中、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートし、発光及び蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２０）を示した時点において速度論的に測定した。図４Ａ～図４Ｄは、ＴＲＡＩＬが、化合物ＷＺ－０３３６による発光を用量依存的に増大させたことを示している（それぞれ、ｔ＝３．５時間、７時間、２４時間、及び３０時間）。Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの蛍光の速度論的に先行する増大は細胞死を示す。このプロファイルは、初期のアポトーシスに続く二次的壊死を示している。
【0171】
図５Ａ～図５Ｄは、２４時間にわたる用量依存的ｒｈＴＲＡＩＬ処理を行った１０，０００個のＤＬＤ－１細胞におけるリアルタイムのアネキシンＶによるアポトーシス及び壊死の検出を示す。ＰＢＩ－４３７７のＲＬＵの読み取りデータ（図５Ａ）、ＰＢＩ－４３７７ ＣｙｔｏｔｏｘＧｒｅｅｎのＲＦＵの読み取りデータ（図５Ｂ）、ＷＺ－０４６１のＲＬＵの読み取りデータ（図５Ｃ）、及びＷＺ－０４６１ ＣｙｔｏｔｏｘＧｒｅｅｎのＲＦＵの読み取りデータ（図５Ｄ）。
【0172】
上記の詳細な説明及びそれにともなう実施例はあくまで説明を目的としたものであって、発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、発明の範囲は付属する請求項及びその均等物によってのみ定義されるものである。
【0173】
開示される実施形態に対するさまざまな変更及び改変は、当業者には自明となろう。限定されるものではないが、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成法、組成物、配合物、または発明の使用方法に関するものを含む、そのような変更及び改変は、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことが可能である。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式（Ｉ）の化合物：
（Ｉ）、
または、その互変異性体、またはその塩［式中、
Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、
Ｒ A は、Ｃ 2 ～Ｃ 10 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、
Ｒ x1 、Ｒ x2 は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよいＣ 1 ～Ｃ 6 の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
〔２〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕Ｒ x1 、Ｒ x2 がメチルである、前記〔１〕に記載の化合物。
〔４〕Ｒ A がＲ B ＣＨ 2 －であり、Ｒ B が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔５〕Ｒ A がＲ C Ｏ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔６〕Ｒ A がＲ C Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔７〕Ｒ A がＲ C Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔８〕Ｒ A がＲ B ＣＨ 2 －であり、Ｒ B がＣＨ 3 （ＯＣＨ 2 ＣＨ 2 ） n Ｏ－であり、ｎが０～１０の任意の数である、前記〔４〕に記載の化合物。
〔９〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキル、またはＣＨ 3 （ＯＣＨ 2 ＣＨ 2 ） n －であり、ｎが０～１０の任意の数である、前記〔５〕に記載の化合物。
〔１０〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔１１〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキルである、前記〔７〕に記載の化合物。
〔１２〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔８〕に記載の化合物。
〔１３〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔９〕に記載の化合物。
〔１４〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１０〕に記載の化合物。
〔１５〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１１〕に記載の化合物。
〔１６〕Ｒ A －Ｃ（Ｒ x1 Ｒ x2 ）－が下式である、前記〔１〕に記載の化合物：
〔１７〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｄ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｄ）
〔１８〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｅ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｅ）
〔１９〕Ｒ A －Ｃ（Ｒ x1 Ｒ x2 ）－が下式である、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２０〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｆ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｆ）
〔２１〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｇ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｇ）
〔２２〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｈ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｈ）
〔２３〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｉ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｉ）
〔２４〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｊ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｊ）
〔２５〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｋ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
（Ｉ－ｋ）
〔２６〕式（ＩＩ）の化合物：
（ＩＩ）
［式中、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、Ａｒ 4 は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
〔２７〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔２８〕Ａｒ 4 が、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔２９〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ａ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
（ＩＩ－ａ）
［式中、Ａｒ 1 、及びＡｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３０〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｂ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
（ＩＩ－ｂ）
［式中、Ａｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３１〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｃ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
（ＩＩ－ｃ）
［式中、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３２〕式（ＩＩＩ）の化合物：
（ＩＩＩ）
［式中、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３３〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔３４〕Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔３５〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ａ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
（ＩＩＩ－ａ）
［式中、Ａｒ 1 、及びＡｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３６〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｂ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
（ＩＩＩ－ｂ）
［式中、Ａｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３７〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｃ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
（ＩＩＩ－ｃ）
［式中、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３８〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－メトキシエトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１３，１３－ジメチル－２，５，８，１１－テトラオキサテトラデカン－１４－エート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１６，１６－ジメチル－２，５，８，１１，１４－ペンタオキサヘプタデカン－１７－エート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－メトキシ－２－メチルプロパノエート、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－アセトアミド－２－メチルプロパノエート
からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３９〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート
からなる群から選択される、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔４０〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネートからなる群から選択される、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔４１〕１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で少なくとも１２時間の血清中安定性を示す、前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４２〕前記〔１〕～〔３３〕のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
〔４３〕脱保護酵素をさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔４３〕に記載のキット。
〔４５〕ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼをさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４６〕緩衝試薬をさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４７〕試料中の発光を検出するための方法であって、試料を前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物と接触させることと、前記試料中に脱保護酵素が存在しない場合、前記試料を脱保護酵素と接触させることと、前記試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、前記試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含む、前記方法。
〔４８〕前記試料が生細胞を含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕前記試料が、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔５０〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔５１〕トランスジェニック動物の発光を検出するための方法であって、前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現する、前記方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式（Ｉ）の化合物：
または、その互変異性体、またはその塩［式中、
Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、
Ｒ A は、Ｃ 2 ～Ｃ 10 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、
Ｒ x1 、Ｒ x2 は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよいＣ 1 ～Ｃ 6 の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される］。
〔２〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕Ｒ x1 、Ｒ x2 がメチルである、前記〔１〕に記載の化合物。
〔４〕Ｒ A がＲ B ＣＨ 2 －であり、Ｒ B が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔５〕Ｒ A がＲ C Ｏ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔６〕Ｒ A がＲ C Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔７〕Ｒ A がＲ C Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の化合物。
〔８〕Ｒ A がＲ B ＣＨ 2 －であり、Ｒ B がＣＨ 3 （ＯＣＨ 2 ＣＨ 2 ） n Ｏ－であり、ｎが０～１０の任意の数である、前記〔４〕に記載の化合物。
〔９〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキル、またはＣＨ 3 （ＯＣＨ 2 ＣＨ 2 ） n －であり、ｎが０～１０の任意の数である、前記〔５〕に記載の化合物。
〔１０〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔１１〕Ｒ C が直鎖または分枝鎖のＣ 1 ～Ｃ 5 アルキルである、前記〔７〕に記載の化合物。
〔１２〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔８〕に記載の化合物。
〔１３〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔９〕に記載の化合物。
〔１４〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１０〕に記載の化合物。
〔１５〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔１１〕に記載の化合物。
〔１６〕Ｒ A －Ｃ（Ｒ x1 Ｒ x2 ）－が下式である、前記〔１〕に記載の化合物：
〔１８〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｅ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔１９〕Ｒ A －Ｃ（Ｒ x1 Ｒ x2 ）－が下式である、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２１〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｇ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２２〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｈ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２３〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｉ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２４〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｊ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２５〕前記式（Ｉ）の化合物が下式（Ｉ－ｋ）を有する、前記〔１〕に記載の化合物：
〔２６〕式（ＩＩ）の化合物：
［式中、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、Ａｒ 4 は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい、アリール、フラン、またはチオフェンである］。
〔２７〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔２８〕Ａｒ 4 が、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔２９〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ａ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
［式中、Ａｒ 1 、及びＡｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３０〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｂ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
［式中、Ａｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３１〕前記式（ＩＩ）の化合物が下式（ＩＩ－ｃ）を有する、前記〔２６〕に記載の化合物：
［式中、Ａｒ 4 は、１つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである］。
〔３２〕式（ＩＩＩ）の化合物：
［式中、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒ 1 、Ａｒ 2 、及びＡｒ 3 は、それぞれ置換されていてもよく、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３３〕Ａｒ 1 がフェニルであり、Ａｒ 2 がフリルであり、Ａｒ 3 がフェニルである、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔３４〕Ｒ C が、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔３５〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ａ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
［式中、Ａｒ 1 、及びＡｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３６〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｂ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
［式中、Ａｒ 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３７〕前記式（ＩＩＩ）の化合物が下式（ＩＩＩ－ｃ）を有する、前記〔３２〕に記載の化合物：
［式中、Ｒ C は、Ｃ 1 ～Ｃ 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される］。
〔３８〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－メトキシ－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル３－（２－メトキシエトキシ）－２，２－ジメチルプロパノエート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１３，１３－ジメチル－２，５，８，１１－テトラオキサテトラデカン－１４－エート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル１６，１６－ジメチル－２，５，８，１１，１４－ペンタオキサヘプタデカン－１７－エート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－メトキシ－２－メチルプロパノエート、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチル２－アセトアミド－２－メチルプロパノエート
からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３９〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－２－カルボキシレート、
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルフラン－３－カルボキシレート、及び
（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルベンゾエート
からなる群から選択される、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔４０〕（（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３－イル）オキシ）メチルメチルカーボネートからなる群から選択される、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔４１〕１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で少なくとも１２時間の血清中安定性を示す、前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４２〕前記〔１〕～〔３３〕のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
〔４３〕脱保護酵素をさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔４３〕に記載のキット。
〔４５〕ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼをさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４６〕緩衝試薬をさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４７〕試料中の発光を検出するための方法であって、試料を前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物と接触させることと、前記試料中に脱保護酵素が存在しない場合、前記試料を脱保護酵素と接触させることと、前記試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、前記試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含む、前記方法。
〔４８〕前記試料が生細胞を含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕前記試料が、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔５０〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔５１〕トランスジェニック動物の発光を検出するための方法であって、前記〔１〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現する、前記方法。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図3-7】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】