特許 7206424 ｍＲＮＡを増幅する方法及び完全長ｍＲＮＡライブラリを調製する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-06

(45)【発行日】2023-01-17

(54)【発明の名称】ｍＲＮＡを増幅する方法及び完全長ｍＲＮＡライブラリを調製する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230110BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20230110BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20230110BHJP

   C12Q 1/6811 20180101ALI20230110BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALI20230110BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALI20230110BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230110BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230110BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20230110BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6806 Z ZNA

C12Q1/6811 Z

C12Q1/6853 Z

C12Q1/6855 Z

C12N15/11 Z

C12N15/10 Z

C40B40/08

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2021569082

(86)(22)【出願日】2020-12-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-28

(86)【国際出願番号】 EP2020087393

(87)【国際公開番号】W WO2021130151

(87)【国際公開日】2021-07-01

【審査請求日】2022-01-31

(31)【優先権主張番号】19219326.6

(32)【優先日】2019-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20158810.0

(32)【優先日】2020-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】509122120

【氏名又は名称】ベースクリック ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】フリッシュムート， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】セルジュコフ， サシャ

(72)【発明者】

【氏名】フェアトゥル， ジェシカ

(72)【発明者】

【氏名】グラーフ， ビルギット

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０２６８５３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１８／０７５７８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】欧州特許出願公開第０３４６１８３２（ＥＰ，Ａ１）

【文献】Journal of molecular biology，2015年，Vol.427，p.2610-2616

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８４４

Ｃ１２Ｑ １／６８０６

Ｃ１２Ｑ １／６８１１

Ｃ１２Ｑ １／６８５３

Ｃ１２Ｑ １／６８５５

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｎ １５／１０

Ｃ４０Ｂ ４０／０８

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

Ｃ１２Ｑ １／６８６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡを増幅及び／又は配列決定する方法であって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含む少なくとも１つの第１プライマーを用意し、少なくとも１つの第１プライマーを少なくとも１つのＲＮＡにハイブリダイズできる条件下で上記少なくとも１つの第１プライマーを上記サンプルに添加する工程；
ｂ）逆転写酵素及びヌクレオチドを上記サンプルに添加することを含む条件下で上記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写して、上記少なくとも１つのＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを得る工程；
ｃ）少なくとも過剰なヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｄ）アジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチドと、テンプレート非依存的ポリメラーゼとを添加して、工程ｂ）で得られたｃＤＮＡの３’末端に単一の３’－アジド又は３’－アルキン修飾ジデオキシヌクレオチドを結合させる工程；
ｅ）少なくとも、工程ｄ）で添加した過剰な修飾ジデオキシヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｆ）ポリヌクレオチド配列と、その５’末端に結合した上記アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーとを含むアダプター分子を、クリック反応を実施し、且つトリアゾール結合の形成下、工程ｄ）で得られた３’修飾ｃＤＮＡに上記アダプター分子をライゲーションするための条件下で添加する工程；及び
ｇ）上記アダプター分子の５’末端のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端に、上記ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマーを添加して、上記トリアゾール結合と重なる位置で、工程ｆ）で得られたライゲーションされたアダプター／ｃＤＮＡ分子に上記第２プライマーをハイブリダイズ及び結合させる工程；
を有し、さらに、
工程ｇ）に続いて、
ｈ）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させることで、工程ｂ）で得られた全ｃＤＮＡと相補的な配列を含む第二鎖ＤＮＡを生成する工程；及び
ｉ）工程ｈ）に続いて、工程ｈ）の上記第二鎖ＤＮＡを配列決定する工程；若しくは
ｊ）工程ｈ）に続いて、上記第１プライマーの少なくとも一部と同一である第３プライマーを添加し、上記完全長ｃＤＮＡを増幅して完全長ＲＮＡライブラリを得る工程；
を有するか、又は
工程ｇ）に続いて、
ｈ’）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させると共に、上記第二鎖ＤＮＡ及び上記全ｃＤＮＡの配列を決定する工程
を有する方法。

【請求項2】

サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡを増幅及び／又は配列決定する方法であって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含み、且つその５’末端にアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーによる修飾を含む少なくとも１つの第１プライマーを用意し、少なくとも１つの第１プライマーを少なくとも１つのｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下で上記少なくとも１つの第１プライマーを上記サンプルに添加する工程；
ｂ）逆転写酵素及びヌクレオチドを上記サンプルに添加することを含む条件下で上記少なくとも１つのｍＲＮＡを逆転写して、上記少なくとも１つのｍＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを得る工程；
ｃ）少なくとも過剰なヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｄ）アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチドと、テンプレート非依存的ポリメラーゼとを添加して、工程ｂ）で得られたｃＤＮＡの３’末端に単一の３’－アジド又は３’－アルキン修飾ジデオキシヌクレオチドを結合させる工程；
ｅ）少なくとも、工程ｄ）で添加した過剰な修飾ジデオキシヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｆ）クリックライゲーション反応を実施して、トリアゾール結合の形成下、環状一本鎖ｃＤＮＡを生成する工程；
ｇ）上記第１プライマーの５’末端のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端に、上記ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマーを添加して、上記トリアゾール結合と重なる位置で、工程ｆ）で得られたライゲーションされた環状第１プライマー／ｃＤＮＡ分子に上記第２プライマーをハイブリダイズ及び結合させる工程；
及び、
ｈ）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させた後、上記完全長ｃＤＮＡを増幅する工程、又は
ｈ’）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させると共に、上記全ｃＤＮＡを含む上記環状一本鎖ＤＮＡの配列を決定する工程
を有する方法。

【請求項3】

前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

工程ａ）において、上記少なくとも１つの第１プライマーとして２～５０個のヌクレオチドの５’伸長を含むポリ（ｄＴ）プライマーを用意し、上記サンプル中に存在する上記少なくとも１つのｍＲＮＡのポリＡ鎖にハイブリダイズできる条件下で上記サンプルに添加する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項5】

第１プライマーがアンカー配列である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程ｄ）において、上記ジデオキシヌクレオチドとして、３’－アルキン若しくは３’－アジド修飾ｄｄＧＴＰ、又は３’－アルキン若しくは３’－アジド修飾ｄｄＣＴＰを使用する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

工程ｄ）において、上記ジデオキシヌクレオチドとして３’－アジド修飾ｄｄＧＴＰを使用する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

工程ｄ）において、上記ジデオキシヌクレオチドとして３’－アジド－２’，３’－ジデオキシＧＴＰ（ＡｚｄｄＧＴＰ）を使用する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

工程ｇ）において、３’末端にｄＣ又はｄＧを含む第２プライマーを添加する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

工程ｇ）において、３’末端にｄＣを含む第２プライマーを添加する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

工程ｇ）において、上記ヌクレオチド配列の３’末端の２位にｄＣ又はｄＧを含む第２プライマーを添加する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

工程ｇ）において、上記ヌクレオチド配列の３’末端の２位にｄＣを含む第２プライマーを添加する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

工程ｄ）において、上記テンプレート非依存的ポリメラーゼとして、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用する、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

工程ｆ）において、上記アダプター分子の５’末端にアルキンを結合させる、請求項１及び３～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

工程ｆ）において、上記クリック反応は、銅触媒によるアジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）又は歪み促進型銅フリークリックライゲーション（ＳＰＡＡＣ）を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

複数のｍＲＮＡ分子を含むサンプルから完全長ｍＲＮＡライブラリを調製するための、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法の使用。

【請求項17】

上記複数のｍＲＮＡ分子を含むサンプルは、１種以上の細胞の全ｍＲＮＡ又は生物の全エクソームを含む、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

サンプルに含まれる複数のｍＲＮＡ、１種以上の細胞の全ｍＲＮＡ、又は個体の全エクソームを配列決定する方法であって、上記複数のｍＲＮＡ、上記全細胞ｍＲＮＡ、又は個体のエクソームを含むサンプルを用意する工程；請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法を実施することで、又は請求項１６に記載の使用に従って、完全長ｍＲＮＡのライブラリを調製する工程；及び増幅されたｍＲＮＡ又は得られたｍＲＮＡライブラリの配列を決定する工程を有する方法。

【請求項19】

ロングリードシーケンシング技術を適用する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

複合疾患のバリアントマッピング、遺伝子異常の調査のための、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡを増幅するためのキットであって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）ポリヌクレオチド配列と、その５’末端に結合した上記アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーとを含むアダプター分子；
ｆ）上記アダプター分子の５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー；
ｇ）上記第１プライマーの少なくとも一部と同一である第３プライマー
を含むキット。

【請求項22】

サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡを増幅及び／又は配列決定するためのキットであって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含み、且つその５’末端にアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーによる修飾を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）上記第１プライマーの５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー
を含むキット。

【請求項23】

前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２１または２２に記載のキット。

【請求項24】

ｈ）ＲＮａｓｅ；
ｉ）全４種の天然由来ヌクレオチド；
ｋ）バッファ及び溶媒；
のうち少なくとも１つを更に含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、特に少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅する方法、複数のＲＮＡ分子を含むサンプルから完全長ＲＮＡライブラリを調製するための当該方法の使用、特定の細胞の全ＲＮＡ又は生物の全エクソームを配列決定する方法、及び遺伝子診断の方法に関する。本発明は更に、本発明の方法の少なくとも１つを実施するための試薬を含むキットに関する。

【背景技術】

【0002】

近年のあらゆる技術的進歩にもかかわらず、ＲＮＡシーケンシング、特に完全長ｍＲＮＡシーケンシング又はトランスクリプトーム若しくはエクソームシーケンシングは、依然として非常に大きな課題となっている。エクソームは、生物のゲノムのうち、エクソンに含まれ、遺伝情報の転写及びＲＮＡスプライシングによるイントロンの除去を経て、当該生物の最終的なタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡとなる全ての部分を含む。一方、トランスクリプトームは、１つの細胞又は特定の細胞集団の全てのＲＮＡ、特に対応する全てのｍＲＮＡを含む。

【0003】

全エクソームシーケンシングは、一般的な疾患の他、希少疾患の理解にも大きく貢献する。特定のタンパク質の機能に影響を与えたり、更には機能を喪失させたりする変異がメンデル疾患の主な原因であることが知られている。例えば、非特許文献１及び非特許文献２は、メンデル疾患及び非メンデル疾患に関与する遺伝的変異を決定するための全エクソームキャプチャー及び超並列ＤＮＡシーケンシングについて報告している。

【0004】

特にがん細胞のトランスクリプトームは、発がんの理解を深めるために特に重要である。しかし、幹細胞のような他の細胞型における分子メカニズムや細胞経路の解析も、様々な各種用途のためのバイオマーカーの発見と同様、常に研究の焦点となっている。

【0005】

ヒトや動物のエクソーム及びトランスクリプトームは、特に疾患の治療又は予防を前進させる目的で注目されているが、植物細胞の場合、標的変異や遺伝子工学による作物の改良のためなど、植物遺伝学の理解を深めることにも関心が寄せられている。

【0006】

遺伝物質の迅速な分析には、使いやすく効率的で信頼性の高いツールが必要である。主な問題は、患者の血液等の少量の生体試料等のソースにおいて目的のＤＮＡ又はＲＮＡを直接検出する必要があることである。これらからは、遺伝物質の様々な成分を微量しか得られない。必要な感度を達成するためには、通常、分析前にサンプル中の核酸量を増やす増幅工程が必要である。あるいは、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析物から直接得られる微小な検出信号を増幅する検出方法を適用する。

【0007】

核酸を増幅する方法には、ＰＣＲ増幅法等の核酸増幅プロトコルが含まれる。ＰＣＲ増幅法は、生体物質から得られた各種ＤＮＡ鎖のプール中で、目的のＤＮＡ配列のみが増幅されるという大きな利点がある。これが、複雑な生体試料中の単一遺伝子の信頼性の高い分析の根幹をなしている。ここ数年、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術やＲＮＡシーケンシングに焦点が移っている。ＲＮＡを直接配列決定する堅牢な方法は存在しないため、全てのライブラリ調製法は、ｍＲＮＡをＤＮＡに逆転写することから始まる。その後、得られた一本鎖ｃＤＮＡは、通常、オリゴヌクレオチドをシーケンシング装置に適合させるいわゆる「第二鎖合成」中に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換される。更に、配列決定手順にはアダプター配列が必要である。これらのアダプターは、タグメンテーション（トランスポザーゼを介したＤＮＡ断片化及びプライマー付加）又は酵素ライゲーションによってのみｄｓＤＮＡへ効率的に導入できる。このような一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡへの変換プロセスが、現在のＲＮＡライブラリ調製法が複雑であることの理由である。

【0008】

近年、特許文献１は、ｄｓＤＮＡに対してリガーゼが示すのと同じような効率で一本鎖ＤＮＡを化学的にライゲーションできる化学ライゲーション法を開示した。この方法では、２００１年／２００２年にＳｈａｒｐｌｅｓｓ及びＭｅｌｄａｌのグループによって独立して定義されたクリックケミストリーの概念が使用されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。アジドとアルキンを銅触媒により反応させて１，２，３－トリアゾール（ｔｒａｉｚｏｌｅ）を得る方法は、Ｈｕｉｓｇｅｎ１，３－双極子環化付加（非特許文献６）の変形形態であり、クリック反応を実施するのに最も広く用いられる方法となっている。この反応は、その温和な条件と高い効率から、例えば様々な目的でのＤＮＡ標識など、生物学及び材料科学において無数の用途が見出されている（非特許文献７）。

【0009】

このような化学ライゲーションの原理に促されて、様々なグループが酵素ライゲーションを用いないライブラリ調製法を開発している（非特許文献８、特許文献２、非特許文献９）。例えば、第二鎖合成が不要になったり、人工的な組み換えやプライマーの二量体形成が抑制されたりなどして、プロトコルの工程数が低減する利点はあるものの、従来のプロトコルに比べて感度が若干低下することが認められた。更に、逆転写の際に人工ヌクレオチドを取り込む必要があり、且つ得られた骨格模倣体は標準的なライブラリ調製法で採用されている全てのポリメラーゼにより許容されないため、この新しいプロトコルの広い商業的適用を欠いている。

【0010】

従って、ｍＲＮＡの増幅、及び完全長ライブラリ、特にサンプル（例えば、全エクソーム調製物又は個体の特定の細胞型の全ｍＲＮＡ）に含まれる複数のｍＲＮＡの完全長ライブラリの調製のための改良された概念を提供することを本発明の目的とした。本発明者らが実施した研究の別の態様は、他のＲＮＡ、特にウイルスＲＮＡの配列決定又は増幅を容易にすることであった。更に、一本鎖ＤＮＡを連結するための化学ライゲーション法の効率を利用するが、ライブラリワークフローにおける標準的な酵素に適合する方法を提供することを目的とした。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】国際公開第２０１９／０６３８０３号

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１２７８１６号明細書（Ａ１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０６（４５），ｐ．１９０９６－１９１０１（２００９）

【文献】Ｂａｍｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，７４５－７５５（２０１１）

【文献】Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，２７０８，

【文献】Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６

【文献】Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，３０５７

【文献】Ｒ．Ｈｕｉｓｇｅｎ，１，３，－Ｄｉｐｌｏａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ａ Ｐａｄｗａ），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４

【文献】Ｇｒａｍｌｉｃｈ，Ｐ．Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，８３５０

【文献】Ｒｏｕｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２７，２６１０－２６１６（２０１５）

【文献】Ｍｉｕｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１６，ｅ９５（２０１８）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを増幅及び／又は配列決定するための、特に、特定の細胞の全ｍＲＮＡ又は生物の全エクソームの完全長ｍＲＮＡライブラリを調製するための改良された方法を提供することで、上記問題を解決する。

【0014】

第１の態様において、本発明は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを増幅及び／又は配列決定する方法であって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含む少なくとも１つの第１プライマーを用意し、少なくとも１つの第１プライマーを少なくとも１つのＲＮＡにハイブリダイズできる条件下で上記少なくとも１つの第１プライマーを上記サンプルに添加する工程；
ｂ）逆転写酵素及びヌクレオチドを上記サンプルに添加することを含む条件下で上記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写して、上記少なくとも１つのＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを得る工程；
ｃ）少なくとも過剰なヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｄ）アジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチドと、テンプレート非依存的ポリメラーゼとを添加して、工程ｂ）で得られたｃＤＮＡの３’末端に単一の３’－アジド又は３’－アルキン修飾ジデオキシヌクレオチドを結合させる工程；
ｅ）少なくとも、工程ｄ）で添加した過剰な修飾ジデオキシヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｆ）ポリヌクレオチド配列と、その５’末端に結合した上記アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーとを含むアダプター分子を、クリック反応を実施し、且つトリアゾール結合の形成下、工程ｄ）で得られた３’修飾ｃＤＮＡに上記アダプター分子をライゲーションするための条件下で添加する工程；
ｇ）上記アダプター分子の５’末端のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端に、上記ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマーを添加して、上記トリアゾール結合と重なる位置で、工程ｆ）で得られたライゲーションされたアダプター／ｃＤＮＡ分子に上記第２プライマーをハイブリダイズ及び結合させる工程；
あるいは、
ｈ）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させることで、工程ｂ）で得られた全ｃＤＮＡと相補的な配列を含む第二鎖ＤＮＡを生成する工程；及び
ｉ）工程ｈ）の上記第二鎖ＤＮＡを配列決定する工程；若しくは
ｊ）上記第１プライマーの少なくとも一部と同一である第３プライマーを添加し、上記完全長ｃＤＮＡを増幅して完全長ＲＮＡライブラリを得る工程；
又は
ｈ’）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させると共に、上記第二鎖ＤＮＡ及び上記全ｃＤＮＡの配列を決定する工程
を有する方法に関する。

【0015】

第２の態様において、本発明は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを増幅及び／又は配列決定する方法であって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含み、且つその５’末端にアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーによる修飾を含む少なくとも１つの第１プライマーを用意し、少なくとも１つの第１プライマーを少なくとも１つのｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下で上記少なくとも１つの第１プライマーを上記サンプルに添加する工程；
ｂ）逆転写酵素及びヌクレオチドを上記サンプルに添加することを含む条件下で上記少なくとも１つのｍＲＮＡを逆転写して、上記少なくとも１つのｍＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを得る工程；
ｃ）少なくとも過剰なヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｄ）アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチドと、テンプレート非依存的ポリメラーゼとを添加して、工程ｂ）で得られたｃＤＮＡの３’末端に単一の３’－アジド又は３’－アルキン修飾ジデオキシヌクレオチドを結合させる工程；
ｅ）少なくとも、工程ｄ）で添加した過剰な修飾ジデオキシヌクレオチドから上記サンプルを精製する工程；
ｆ）クリックライゲーション反応を実施して、トリアゾール結合の形成下、環状一本鎖ｃＤＮＡを生成する工程；
ｇ）上記第１プライマーの５’末端のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端に、上記ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマーを添加して、上記トリアゾール結合と重なる位置で、工程ｆ）で得られたライゲーションされた環状第１プライマー／ｃＤＮＡ分子に上記第２プライマーをハイブリダイズ及び結合させる工程；
及び、
ｈ）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させた後、上記完全長ｃＤＮＡを増幅する工程；又は
ｈ’）ＤＮＡポリメラーゼを添加して上記第２プライマーを鎖伸長させると共に、上記全ｃＤＮＡを含む上記環状一本鎖ＤＮＡの配列を決定する工程
を有する方法に関する。

【0016】

第３の態様において、本発明は、複数のｍＲＮＡ分子を含むサンプルから完全長ｍＲＮＡライブラリを調製するための当該本発明の方法の使用に関する。

【0017】

第４の態様において、本発明は、生物の１種以上の細胞の全ｍＲＮＡ又は生物の全エクソームを配列決定する方法であって、当該エクソーム又は全細胞ｍＲＮＡを含むサンプルを用意する工程；本明細書中に記載した本発明に係る方法を実施することで完全長ｍＲＮＡのライブラリを調製する工程；及び得られた全細胞ｍＲＮＡ又はエクソームの配列を決定する工程を有する方法に関する。

【0018】

第５の態様において、本発明は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを増幅及び／又は配列決定するためのキットであって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）ポリヌクレオチド配列と、その５’末端に結合した上記アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーとを含むアダプター分子；
ｆ）上記アダプター分子の５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー；
ｇ）上記第１プライマーの少なくとも一部と同一である第３プライマー
を含むキットに関する。

【0019】

本発明の第６の態様は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを増幅及び／又は配列決定するためのキットであって、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含み、且つその５’末端にアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーによる修飾を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）上記第１プライマーの５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー
を含むキットである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

天然由来の完全長ＲＮＡ、特に完全長ｍＲＮＡ、特定の細胞若しくは細胞型の全ｍＲＮＡ、更には生物の全エクソーム、すなわちタンパク質をコードする遺伝子の完全なコード領域を、一般的に用いられている方法で増幅することは、依然として複雑で時間のかかる手順である。本発明では、いわゆる「クリックケミストリー」を採用することで完全長ＲＮＡの増幅を容易にし、サンプルに含まれる複数又は多数のＲＮＡの増幅でさえ、１つの単一手順で実施できる。ＲＮＡ配列の決定は、増幅後でも、ＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡの第二鎖合成中でさえも実施できる。

【0021】

原則として、本発明の方法は、ＲＮＡ、特に任意の種類のＲＮＡを含む混合物の増幅及び／又は配列決定が望まれる場合、あらゆる種類のＲＮＡに適用できる。本発明の方法をｍＲＮＡに適用することが好ましく、そのような方法に含まれる別の好ましいＲＮＡは、任意の形態のウイルスＲＮＡであり、すなわち、宿主のゲノムに組み込まれるウイルスＲＮＡでもある。以下における本発明の方法の詳細な例示的説明では主にｍＲＮＡについて言及することが多いが、同じ手段及び工程を実施して、同じようにしてウイルスＲＮＡ又は他のＲＮＡを増幅又は配列決定することもできることを理解されたい。

【0022】

本発明の全体的な文脈において、ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、すなわち、細胞又は生物に含まれるＤＮＡによってコードされ、細胞メカニズムによってタンパク質に翻訳され得るリボ核酸を指す。加えて、ここで定義されているように、ＲＮＡ及びｍＲＮＡという用語は、修飾されたヌクレオチドを含む合成リボ核酸又はｍＲＮＡをも包含し得る。更に、ＲＮＡ又はｍＲＮＡは、糖部分の類似体を含む核酸を含むことを意図している。天然のＲＮＡ及びｍＲＮＡは、アデニン、ウラシル、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を含むが、非天然塩基も含まれ得る。

【0023】

本発明の方法は、１種類のＲＮＡ又はｍＲＮＡのみを含むサンプルに適用できる。これは、サンプルが、同じヌクレオチド配列及び同じ数のヌクレオチドを有する核酸のみを含むことを意味する。本発明の他の実施形態において、サンプルは２種以上の異なるＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ、好ましくは２種以上の異なるｍＲＮＡを含んでいてもよい。本発明の文脈において、「異なるＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ」という語は、異なるヌクレオチド配列を有する核酸だけでなく、同じヌクレオチド配列を有するが、何らかの理由で異なる数のヌクレオチドを含むＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡも含むことを意図している。

【0024】

本発明の文脈中で使用される「クリックケミストリー」又は「クリック反応」等の用語は、当該技術分野や、上記「背景技術」で言及した例示的な刊行物に記載されている全ての対応する方法を指すことが意図されている。特に、国際公開第２０１９／０６３８０３号（Ａ１）が参照され、その開示は、特にクリック反応を実施するための条件、試薬及び方法に関する限り、本発明の目的のために具体的に含まれる。工程ｆ）の文脈において、銅触媒によるアジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を実施するのが好ましく、国際公開第２０１９／０６３８０３号（Ａ１）に記載の条件下で実施するのが最も好ましい。しかしながら、本発明の文脈において、アルキン修飾及びアジド修飾核酸をライゲーションするための更によく知られた方法である歪み促進型銅フリークリックライゲーション（ＳＰＡＡＣ）を実施することも可能であり、好ましい（例えば、Ｉ．Ｓ．Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１１ ２２（７）：１２５９－１２６４；Ｍ．Ｓｈｅｌｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． ｏｍｍｕｎ．２０１２，４８，１１１８４－１１１８６；Ｍ．Ｓｈｅｌｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１，４７，６２５７－６２５９）。クリック反応で使用するためのヌクレオチド及び核酸の修飾に適したアルキン残基及びアジド残基は従来技術に記載されており、当業者には周知である。クリック可能な５’－アルキン又はアジド修飾オリゴヌクレオチドの例も図７に概説している。アルキン三重結合又はアジドモチーフとこのように修飾されたヌクレオチドとの間のスペーサーの長さは様々であり、アルキン分子－アジド分子ペアのクリック反応から生じるトリアゾール結合を含む各テンプレートを読み過ごすＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の能力によってのみ制限される。本発明の好ましい実施形態において、スペーサーは少なくとも１つの原子を含み、最大で３０個の原子、より好ましくは最大で２０個の原子、最も好ましくは最大で１０個の原子を含む。スペーサーはＣ原子を含むが、ヘテロ原子であるＮ及び／又はＯを含んでもよい。

【0025】

簡単に要約すると、本発明の第１の態様は、１つ以上の（ｍ）ＲＮＡテンプレートから逆転写によってｃＤＮＡを調製することを含み、その間又はその後、得られた１つ以上のｃＤＮＡは、アルキン修飾又はアジド修飾を含むようにその３’末端で修飾される。より具体的には、クリック反応に関与する分子ペアの一方のパートナーをｃＤＮＡに結合させる。続いて、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド配列と、その３’末端にある上記分子ペアの第２パートナーとを含むアダプターをクリック反応によってｃＤＮＡにライゲーションする。このアダプター及び特定の第２プライマーを使用することで、ｃＤＮＡを非常に効果的に増幅したり、ｃＤＮＡを直接配列決定したりすることができる。

【0026】

このような第１の本発明の方法は、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な第１プライマーを、（ｍ）ＲＮＡを含むサンプルに添加する最初の工程ａ）を含む。このような第１プライマーのサンプルへの添加は、第１プライマーを相補的な（ｍ）ＲＮＡ配列にハイブリダイズできる条件下で行われる。

【0027】

少なくとも１つの第１プライマーは、各標的（ｍ）ＲＮＡと相補的な核酸を、プライマーを（ｍ）ＲＮＡへ効果的にハイブリダイズできるような十分な数で含む。第１プライマーは、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅手順において有用だと考えられる任意の数のヌクレオチドを含むことができる。好ましい実施形態において、第１プライマーは、少なくとも５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０個又は少なくとも１５個のヌクレオチドで構成される。そのような好ましい実施形態において、第１プライマーは更に、最大で６０個のヌクレオチド、好ましくは最大で５０個のヌクレオチド、最も好ましくは最大で４５個のヌクレオチドで構成される。少なくとも１つの第１プライマーを少なくとも１つのｍＲＮＡへハイブリダイズさせるための条件又はハイブリダイズさせるのに有利な条件は当業者によく知られており、例えば、Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９９，３３７，２３１－２４１に記載のものが挙げられる。特に好ましい条件についても、当業者が予備試験によって容易に決定できる。

【0028】

このような第１の本発明の方法の第２の工程ｂ）では、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーの３’末端から出発して、（ｍ）ＲＮＡは、逆転写酵素及びヌクレオチドをサンプルに添加することを含む条件下で逆転写されて、少なくとも１つのｍＲＮＡの完全長ｃＤＮＡが得られる。本発明の文脈では、通常、天然由来の４種類のヌクレオチドであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが採用されるが、本発明の方法の別工程のｃＤＮＡ形成を損なわない限り、人工ヌクレオチドが含まれていてもよい。工程ａ）については、逆転写の条件も当業者にはよく知られている。

【0029】

中間工程ｃ）では、少なくとも工程ｂ）で使用した過剰なヌクレオチドを除去する。本発明の好ましい実施形態では、残存する（ｍ）ＲＮＡ、過剰な逆転写酵素、及び過剰な第１プライマーもこの工程中に除去できる。特に好ましい実施形態では、当該技術分野で知られている方法に従ってｃＤＮＡの精製を実施し、精製されたｃＤＮＡが本方法の別工程に含まれる。

【0030】

次の工程ｄ）では、アジド／アルキンクリック反応ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）と、テンプレート非依存的ポリメラーゼとをサンプルに添加する。「ジデオキシヌクレオチド」又はｄｄＮＴＰという語は、２’－ヒドロキシル基も３’－ヒドロキシル基も有さないヌクレオチドを表す。本発明の文脈において、ｄｄＮＴＰは、アデニン、チミン、シトシン又はグアニン塩基のうち１つを含む。修飾されたジデオキシヌクレオチドは、ポリメラーゼによってｃＤＮＡ配列にその３’末端で付加され、また、ジデオキシヌクレオチドは必要な３’－ヒドロキシル基を含まないので、それ以上の鎖伸長は起こらず、結合したアジド基又はアルキン基は、ｃＤＮＡの３’末端と第２のクリック反応パートナーとの反応に利用できる。本発明の好ましい実施形態において、アルキン基又はアジド基は、ｄｄＮＴＰのデオキシリボース部分の３’位に結合されており、また、ｄｄＮＴＰは分子に結合したアジド基を含むことも好ましい。

【0031】

別の中間工程ｅ）では、少なくとも、工程ｄ）で使用した過剰な修飾ジデオキシヌクレオチドを除去する。本発明の好ましい実施形態では、この工程中も、最終的に残存する（ｍ）ＲＮＡ、過剰な逆転写酵素、及び過剰な第１プライマー、並びに／又は工程ｄ）で使用したようなテンプレート非依存的ポリメラーゼを除去することができる。

【0032】

工程ｆ）では、アダプター分子を第２のクリック反応パートナーとしてサンプルに添加すえる。アダプター分子は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列を有し、その５’末端に結合したアジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含む。アルキン基とアジド基との間で起こるクリック反応によって、トリアゾール結合の形成下、アダプター分子をｃＤＮＡの３’末端にライゲーションする。アダプター分子は、本発明の方法の次の工程においてハイブリダイゼーション及びそれに続く増幅によって第２プライマーを結合するのに役立つ。従って、アダプター分子は、そのような第２プライマーの結合を可能にするのに十分な数のヌクレオチドを含み、通常は少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、アダプター分子は、最大で１００個、より好ましくは最大で８０個又は６０個のヌクレオチドを含む。更に、その５’末端に結合したアルキンを含むアダプター分子を工程ｅで使用することも、本発明の好ましい実施形態と考えられる。

【0033】

次の工程ｇ）では、アダプター分子の全部又は一部と相補的なヌクレオチド配列を含む上記第２プライマーを添加する。第２プライマーのヌクレオチド配列は、アダプター分子のヌクレオチド配列の５’末端の少なくとも６個のヌクレオチドと相補的であり、その３’末端に、ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含んでいる。従って、第２プライマーは、クリック反応で形成されたトリアゾール結合と重なる位置で、ライゲーションされたアダプター／ｃＤＮＡ分子にハイブリダイズ及び結合する。

【0034】

別の工程では、ＤＮＡポリメラーゼを添加することで、第２プライマーが伸長される。１つ以上のＲＮＡの増幅が望ましい限り、第１プライマーの少なくとも一部と同一である１つ以上の第３プライマーを添加することができ、その後、得られたｃＤＮＡを公知の方法に従って増幅できる。この選択肢は、工程ｈ）及びｊ）で定義される。第３プライマーは、例えば、第１プライマーよりも少ないヌクレオチドを含んでもよいが、依然としてハイブリダイゼーションを確保する。また、第３プライマーは、ハイブリダイゼーションを確保する特定の配列と、少なくとも１つのｍＲＮＡ上の第１プライマーの標的配列と相補的ではない別の配列とを含んでもよい。

【0035】

１つ以上のＲＮＡの配列決定が望まれる限り、本発明の文脈において異なる選択肢がある。まず、工程ｇ）後、ＤＮＡポリメラーゼを添加して第２プライマーを鎖伸長させることで、工程ｂ）で生成された全ｃＤＮＡと相補的な配列を含む「完全長」第二鎖ＤＮＡを生成することができる。これらの第二鎖ＤＮＡは、単一分子の配列決定のための公知の方法（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｂ．ｃｏｍ／）等から入手可能なシステム及びキット）に従って増幅することなく配列決定できる。この選択肢は、工程ｈ）及びｉ）で定義される。

【0036】

別の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを添加した後、第２プライマーの鎖伸長と同時に配列決定を実施できる。この別の選択肢は、工程ｈ’）で定義される。配列決定は、例えば、よく知られているサンガーシーケンシング法若しくはこの原理に基づいて開発された方法、又はｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／）等から入手可能なシステム及びキット）に従って実施できる。

【0037】

本発明の方法では、一般的に用いられるプロセス（そのうちの１つを図１に模式的に示す）で必要とされていたようなＲＮＡの断片化やランダムプライミングを必要とすることなく、特定のＲＮＡサンプルについて増幅ｃＤＮＡを生成することが初めて可能となる。そのような従来技術の増幅プロセスと比較して、本発明の方法では、重複するフラグメントの配列データを整列させる必要なしに、目的の完全なｍＲＮＡ等を完全に代表するｃＤＮＡライブラリに到達するのに必要なプロセス工程が少なくなる。また、本発明の方法では、ランダムプライミング又は特異的プライミングのいずれかから完全長ライブラリを生成する。加えて、本発明の方法は、ライブラリ調製ワークフロー用の標準的なポリメラーゼを用いて実施できる。ポリ（ｄＴ）プライミングを用いる本発明の方法の模式図を図２に示す。

【0038】

第１プライマーとしては、本発明の文脈において様々な各種代替物及び各ポリヌクレオチドを検討できる。第一に、従来技術の方法で知られている通り、ランダムプライマーを使用できる。この第１の代替物については、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ内のランダムな部分にハイブリダイズするランダム配列を有する短めのヌクレオチド配列を採用できる。そのようにランダムな第１プライマーを使用するプロセスの生成物は長さが異なる。

【0039】

第２の代替物及び本発明の好ましい実施形態では、ランダムプライマーの代わりに特異的プライマーを使用する。この代替物は、サンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡの配列又は同一性が既知である場合に特に適用可能である。サンプル中に存在し得る１つ以上の既知の（ｍ）ＲＮＡの有無についてサンプルを分析する場合、対応する特異的プライマーを使用して、そのような既知の（ｍ）ＲＮＡを検出することができる。

【0040】

本発明の好ましい実施形態でもある別の代替物では、ｍＲＮＡ増幅用の少なくとも１つの第１プライマーとしてポリ（ｄＴ）プライマーを使用する。ポリ（ｄＴ）プライマーは、通常、６～３０個のｄＴヌクレオチドを含む。プライマーは、サンプル中の少なくとも１つのｍＲＮＡのポリＡ鎖にハイブリダイズできる条件下でサンプルに添加される。全てのｍＲＮＡ分子は、その３’末端に、複数のアデノシン一リン酸で構成されたポリＡ鎖を含む。ポリ（Ａ）鎖は、遺伝子の転写が完了した後に起こるポリアデニル化によって真核生物のＲＮＡに付加される。しかしながら、ポリ（Ａ）鎖は、翻訳時にコーディング機能は持たない。従って、ポリＡ鎖は、プライマーのハイブリダイゼーションの理想的な標的であり、対応するポリ（ｄＴ）プライマーを得るには、標的ｍＲＮＡの配列に関する知識は必要ない。更に、ポリ（ｄＴ）プライマーを使用すると、サンプルに含まれるｍＲＮＡの完全なコード配列を逆転写及び増幅できる。

【0041】

特定の実施形態において、本発明はまた、異なる種類のプライマー、すなわち、ランダムプライマー及び特異的プライマー、ランダムプライマー及びポリ（ｄＴ）プライマー、又は特異的プライマー及びポリ（ｄＴ）プライマーの使用を含む。これは、プライマーが特定のアンカー配列又は捕捉配列も含む場合に特に有用である。例えば、サンプル中の既知のｍＲＮＡの存在を検出するための特異的プライマーが含まれてもよい。例えば、そのような特異的プライマーの５’末端に結合した捕捉配列が存在すると、増幅後の工程において、このような既知のｍＲＮＡについて得られた増幅ｃＤＮＡを固体支持体に結合させ、固体支持体に結合したｃＤＮＡを他の増幅産物から分離し、そのようなｃＤＮＡの存在を検出するという選択肢が得られる。第１プライマーに結合した捕捉配列又はアンカー配列が含まれることで得られる他の有用な選択肢は、当業者によって容易に認識でき、これらも本発明の文脈に包含される。

【0042】

ｍＲＮＡ増幅について本発明の特に好ましい実施形態では、アンカー配列を含むポリ（ｄＴ）プライマーが少なくとも１つの第１プライマーとして使用される。このアンカー配列によって、通常は２～５０個のヌクレオチドからなる追加の５’末端伸長が得られる。アンカー配列は、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個のヌクレオチドを含む。更に好ましい実施形態において、アンカー配列は、最大で４０個、より好ましくは最大で３０個のヌクレオチドを含む。このようなアンカー配列が存在すると、例えば、本発明の方法で使用されるポリ（ｄＴ）プライマーの均一な位置決めを確保できる可能性が得られる。

【0043】

更に好ましい実施形態では、本発明の方法の工程ｄ）において、３’－アルキン若しくは３’－アジド修飾ｄｄＧＴＰ又は３’－アルキン若しくは３’－アジド修飾ｄｄＣＴＰが添加される。ｃＤＮＡの３’末端にＧ又はＣ塩基のいずれかが存在すると、次の工程ｇ）において第２プライマーが特に効率的にハイブリダイズ及び結合されることが観察された。最良の結合結果は、工程ｄ）において３’－アルキン又は３’－アジド修飾ｄｄＧＴＰをｃＤＮＡに添加することによって、ｃＤＮＡの３’末端がＧを含むように修飾された場合に得られ、最も好ましい修飾ジデオキシヌクレオチドは３’－アジド－２’，３’－ジデオキシＧＴＰ（ＡｚｄｄＧＴＰ）であった。

【0044】

工程ｄ）について上述した好ましい実施形態と対応して、工程ｇ）における第２プライマーがその３’末端にｄＧ又はｄＣ、最も好ましくはｄＣを含むことが更に好ましい。本発明の方法では、第２プライマーがその３’末端に、ｃＤＮＡの３’末端のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む必要がある。従って、工程ｄ）でアルキン修飾又はアジド修飾ｄｄＧＴＰを使用する好ましい実施形態において、第２プライマーはその３’末端にｄＣを含む。工程ｄ）においてアルキン修飾又はアジド修飾ｄｄＣＴＰが含まれる他の好ましい実施形態において、第２プライマーはそれに対応して３’末端にｄＧを含む。上記修飾ｄｄＧＴＰを使用する上で開示した最も好ましい実施形態に沿って、そのような最も好ましい実施形態では、その３’末端にｄＣを含む第２プライマーが使用される。本発明の更に好ましい実施形態において、第２プライマーは、その３’末端の２位にｄＣを含む。本発明者らは、第２プライマーがクリック反応で形成されたトリアゾール結合と重なるこの位置にｄＣが存在すると、プライマー結合及びその後のプライマー伸長が大きく改善されることに気づいた。

【0045】

工程ｄ）におけるテンプレート非依存的ポリメラーゼとして、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を使用するのが好ましい。該酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＸファミリーのメンバーであり、ＤＮＡ分子の３’末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。他の大部分のＤＮＡポリメラーゼと異なり、ＴｄＴはテンプレートを必要としない。好ましい基質として３’－オーバーハングにヌクレオチドを付加することができるが、平滑又は陥凹３’末端にヌクレオチドを付加する際も良好に働く。従って、分子生物学、すなわち、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、ＰＣＲ、つい最近では酵素を用いたｄｅ ｎｏｖｏ遺伝子合成において重要かつ広範な用途が見出されている。

【0046】

本発明の文脈において、検出可能な標識又はタグを有するか、又は固体支持体への固定化を可能とする部分を含むプライマー及びアダプター分子の少なくとも１つを含むことも選択肢であり、好ましい実施形態でもある。そのような選択肢の１つは、第１プライマーについて既に上述した。このような部分は、例えば、固体支持体と直接的に又は別の分子を介して間接的に共有結合を形成できるものであってもよい。例えば、増幅された核酸を捕捉して更に検出又は配列決定することが意図される場合、固体支持体への固定化が非常に有利な場合があり、自動配列決定法において一般的に使用される。そのような実施形態に沿って、本発明で使用するプライマー又はアダプターの１つは、固体支持体に既に結合した状態であってもよく、本方法はそのような固体支持体の存在下で実施できる。固体支持体として、結合した分子を反応混合物から捕捉及び分離できる任意の材料が、直接又は後の段階で含まれても、添加されてもよい。固体支持体として、様々な材料及び分子が本発明の文脈において含まれ、使用されてもよい。例えば、平面又は三次元の面を固体支持体とすることができ、例えば、プライマー又はアダプターが結合しているか、その後の結合反応で結合されるビーズを本文脈で有利に使用できる。更に、プライマー又はアダプターの１つを標識された形態で、すなわち、増幅産物の検出を可能とする検出可能な標識又はタグを含む形態で使用することもできる。特に特異的プライマーを使用する場合、それに対応して増幅ｃＤＮＡの存在を検出することは、当業者に知られている方法で容易に実施できる。

【0047】

また、上で概説した選択肢を組み合わせて、増幅ｃＤＮＡを捕捉及び検出することができる。本発明の特に好ましい別の実施形態において、本発明の方法で使用されるプライマー又はアダプターの少なくとも１つは、固体支持体に結合しているか、又は固体支持体への結合を容易にする分子に接続又は結合しており、プライマー及びアダプター分子の他の少なくとも１つは、検出可能な標識、又は検出可能な標識がそれを介して結合できる分子を含む。本発明のこれらの実施形態によれば、増幅産物、従って、分析対象のサンプル中の特定のｍＲＮＡの存在を簡単に、好ましくは自動でも検出することができる。

【0048】

上述の好ましい例は、本発明の方法の考えられる全ての変形形態及び利点を網羅的に列挙することはできないが、当業者であれば、研究又は診断の特定の目的に最も適するように本方法を容易に適合させることができる。従って、特に本発明の方法と別の公知手順との組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。

【0049】

本発明の方法の変形形態及び本発明の第２の態様を図９に示す。そのような代替法では、第１プライマーとして、様々な各種代替物及び各ポリヌクレオチドが本発明の文脈において検討される。第一に、５’末端においてアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーで修飾されたプライマーを公知の固相法で調製し、工程ａ）及びｂ）で上述した通り逆転写に使用することができる。工程ｃ）で精製し、工程ｄ）でテンプレート非依存的ポリメラーゼを介して（アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを有するように修飾された）ｄｄＮＴＰを付加した後、その末端にアジド残基及びアルキン残基を含むｃＤＮＡが生成され得る。過剰なヌクレオチドを除去した後、クリックライゲーションを実施して、クリック条件下で環状一本鎖ｃＤＮＡを生成できる（例えば、Ｖ．Ｃａｓｓｉｎｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１５，５４，７７９５－７７９８）。連結を防ぐために、二重修飾ｃＤＮＡを、前述した通り、クリックライゲーション前に希釈する（Ｒ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２１），６８５９－６８６４）。続いて、ローリングサークル増幅でテンプレートを増幅又は配列決定するために、工程ｇ）の第２プライマーの代わりに、第１プライマーの少なくとも一部と相補的な別の第２プライマーを使用できる（ＢＧＩ ｇｅｎｏｍｉｃｓのＮＧＳ法）。従って、この代替法では、第１の本発明の方法について記載した大部分の態様が依然として適用されるが、本発明の第１の態様の工程ｆ）で記載したアダプター分子の添加は適用可能ではないか、又はもはや必要とされない。しかしながら、別の第２プライマーは、その３’末端に、（クリック反応による環化の前に）ｃＤＮＡの３’末端のジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドも含み得る。

【0050】

本発明の方法の文脈及び上述した本発明の第２の態様において、工程ｈ）を介して増幅を実施する代わりに、工程ｈ’）において公知の方法に従って配列決定を直接実施することも可能である。例えば、本発明の方法の工程ｇ）で得られた生成物、又は代替法について図９の下部で示すような環状ＤＮＡ／プライマーコンストラクトを用いて、サンガーシーケンシングを直接実施できる。また、本発明の方法の工程ｇ）の生成物又は代替法の環状ＤＮＡ／プライマーコンストラクトを鎖伸長して得られた生成物を用いて、一塩基配列決定法を適用できる。

【0051】

本発明の別の主題及び第３の態様は、完全長ｍＲＮＡライブラリを調製するためのサンプルに含まれる１つ以上のｍＲＮＡを増幅するための上述した本発明の方法の使用である。特に、少なくとも１つの第１プライマーとしてポリ（ｄＴ）プライマーが使用される本発明の好ましい実施形態の文脈において、本方法によれば、サンプルに含まれる完全なｍＲＮＡ配列を増幅できる。これは、サンプルが生物の１種以上の細胞の全ｍＲＮＡ、更には生物の全エクソーム、つまり、特定の細胞又は生物においてタンパク質に翻訳されることになる全ｍＲＮＡを含む場合に、特に有用である。

【0052】

本発明の別の第４の主題は、上記に詳述したような本発明の方法及び使用に関し、更に、増幅ｍＲＮＡ又は得られたｍＲＮＡライブラリの配列を決定することを含む。このような方法によれば、生物の細胞の全ｍＲＮＡ、更には生物の全エクソームを高い信頼性で配列決定でき、ｍＲＮＡプール中の希少な転写物の検出も確保できる。このような方法の提供は、医学研究や臨床診断において、例えば、複合疾患のバリアントマッピング、遺伝子異常の調査、疾患の遺伝的基盤の決定、又はメンデル障害の診断等の用途に特に有用である。

【0053】

更に、本発明の第５及び第６の主題は、上述した本発明の方法及び使用の少なくとも１つを実施するためのキットを提供する。

【0054】

本発明の第１の態様に従ってサンプルに含まれる少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの増幅及び／又は配列決定を可能にするキットは、
ａ）増幅対象である少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）ポリヌクレオチド配列と、その５’末端に結合した上記アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーとを含むアダプター分子；
ｆ）上記アダプター分子の５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー；
ｇ）必要に応じて、上記第１プライマーの少なくとも一部と同一である第３プライマー
を含む。

【0055】

本発明の第２の態様に従ってサンプルに含まれる少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの増幅及び／又は配列決定を実施するのに有用なキットは、
ａ）増幅対象である少なくとも１つのｍＲＮＡの３’末端又はその近傍に位置する配列と相補的な配列を含み、且つその５’末端にアジド分子－アルキン分子ペアの第１パートナーによる修飾を含む第１プライマー；
ｂ）逆転写酵素；
ｃ）アジド分子－アルキン分子ペアの第２パートナーを含むように３’位で修飾されたジデオキシヌクレオチド；
ｄ）テンプレート非依存的ポリメラーゼ；
ｅ）上記第１プライマーの５’部分のヌクレオチドのうち少なくとも６個と相補的であり、且つその３’末端にｃ）の上記ジデオキシヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する第２プライマー
を含む。

【0056】

更に、本発明の好ましい実施形態において、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための別の有用な試薬、特に、
ｈ）ＲＮａｓｅ；
ｉ）全４種の天然由来ヌクレオチド；
ｊ）クリック反応を実施するための試薬；
ｋ）バッファ及び溶媒；
ｌ）ｃＤＮＡ増幅を実施するための試薬；
ｍ）精製用試薬
のうち少なくとも１つを含んでもよい。

【0057】

このような方法を実施するためのキットに含まれる試薬について、当業者であれば、追加の試薬を含めたり、特定の方法に必要のない試薬を除外したりするよう容易に適合させることができる。

【0058】

本発明の１つの主題に関して上記で開示された全ての情報は、当該情報が、はっきりと繰り返されていないとしても、本発明の文脈において認識可能な関連性を有する他の主題の文脈においても同様に適用されると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】ライブラリ調製のためのＲＮＡの一般的な従来技術のＰＣＲ増幅の模式図を表す。ＲＮＡサンプルを超音波装置を用いて断片化し、フラグメントを（ランダムに）プライミングし、逆転写酵素を用いて第一鎖合成（ｃＤＮＡ合成）を実施する。ｄＴＴＰの代わりにウラシルを取り込んだ第二鎖を生成し、二本鎖ＤＮＡフラグメントを精製及び平滑末端化する。ｄＡテーリングを実施して、その後の酵素アダプターライゲーション工程の効率を向上させる。サイズ選択を含む別のクリーンアップ工程を実施し、Ｕ含有鎖を除去してからＰＣＲ濃縮する。

【図2】ポリ（ｄＴ）プライミングによってｍＲＮＡを増幅し、完全長ｍＲＮＡライブラリを得る工程を含む本発明の方法の模式図を表す。

【図3】図３Ａは、本発明の方法によって生成されたクリックライゲーションｃＤＮＡプールから生成された完全長ＰＣＲフラグメントを表す。１つのプライマーはクリックライゲーションアダプターに結合し（アダプタープライマー１）、第２のプライマーは、逆転写のプライミングに使用されるポリ（ｄＴ）の一部（ポリ（ｄＴ）リバースプライマー）である。伸長時間（１～１０分）に応じて、ＰＣＲフラグメントの分布はより長い増幅物側にシフトする。図３Ｂ及び図３Ｃは、バイオアナライザ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた完全長ＰＣＲフラグメントの分析結果を表す。ＰＣＲ時の伸長時間３分（Ｃ）のサンプルの場合のｄｓＤＮＡサイズの分布は、伸長時間１分（Ｂ）と比べてより大きなサイズへ明らかにシフトする。

【図4】本発明の方法によって生成されたクリックライゲーションｃＤＮＡプールから生成されたＰＣＲフラグメントを表す。プライマーは転写物のちょうど５’末端をカバーする。ＧＡＰＤＨやβ－Ｇａｌ等のハウスキーピング遺伝子の次に、ｅＧＦＰ、Ｃａｓ９、及びＦｌｕｃのｍＲＮＡを、内部コントロールとしてＪｕｒｋａｔ細胞全ｍＲＮＡプールにスパイクした。

【図5】本発明の方法によって生成されたクリックライゲーションｃＤＮＡプールから生成されたＰＣＲフラグメントを表す。１つのプライマーはクリックライゲーションアダプターに結合し、第２のプライマーは遺伝子特異的な逆相補鎖（図４の内部リバース等）に結合する。人工的に生成されたβ－Ｇａｌ遺伝子フラグメントを除き、全てのＰＣＲ産物は図４と比較して予想通り大きい。

【図6】本発明の方法のための一本鎖ｃＤＮＡの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介した３’末端標識のためのクリック可能なヌクレオチドを例示する。

【図7】本発明の方法のためのアダプターオリゴヌクレオチドのクリック可能な５’末端を例示する。

【図8】天然のホスホジエステル（左）と比較した本発明の方法のためのトリアゾール骨格バージョンを例示する。

【図9】完全長ｍＲＮＡの配列決定のための別のワークフローの模式図を表す。５’－アルキン／アジド修飾プライマーを逆転写に使用し、得られたｃＤＮＡを精製する。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によってアジド／アルキンヌクレオチドを３’末端に取り込み、過剰なヌクレオチドを除去してからクリックライゲーションを実施して、環状ｓｓＤＮＡを生成する。少なくとも一部が相補的なプライマーを最初のプライマーに適用することで、環状ｓｓＤＮＡの増幅、更には配列決定が可能となり得る。

【図10】プライミングされたモデルＲＮＡ（Ａ）に対して実施したトリアゾール読み通しのＰＣＲ産物（Ｂ）である。３’－アジドｄｄＡＴＰを含むヌクレオチドミックスでモデルＲＮＡを逆転写し、ヌクレオチドを除去し、ｃＤＮＡを５’－アルキンアダプター（アルキン－オリゴ１）にクリックライゲーションした。粗クリック反応ミックスは、様々なテンプレート量、ポリメラーゼ、及びサイクル条件を用いたＰＣＲのテンプレートとして使用した。

【図11】未修飾オリゴヌクレオチド（オリゴ２）へのＴｄＴを介したＡｚｄｄＮＴＰ取り込みと、それに続くアルキンオリゴヌクレオチド短鎖モデル（アルキン－オリゴ３）とのクリックの結果を、２つの合成的に調製したオリゴヌクレオチド（３’－Ｎ_３－Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、アルキンオリゴ３及びアジド－オリゴ２）間でのクリックと比較して表す。

【図12】本発明の方法に従って処理されたＰＣＲフラグメント（図５、レーン４）から生成されたサンガーシーケンシングのキャピラリー電気泳動トレースを表す。この配列決定によって、プロトコル後、ｍＲＮＡの５’末端は元の状態のままであることが分かる。ここでは、逆転写前にＲＮＡプールにスパイクしたＦｌｕｃ ｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ）について実施した。平均品質値スコア（ＱＶ）は５４．３４であり、すなわち特定の配列に対して＞９９．９９９％の確実性である。

【0060】

以下の実施例により、本発明を更に説明する。

【実施例】

【0061】

実施例１（図３に関連）
内部コントロールとして、ＧＡＰＤＨ等のハウスキーピング遺伝子の次に、ｅＧＦＰ（Ｂａｓｅｃｌｉｃｋ）、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）Ｃａｓ９（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）β－Ｇａｌ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、及びＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）Ｆｌｕｃ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）のｍＲＮＡ（０．１μｇ）を２μｇのＪｕｒｋａｔ細胞全ＲＮＡプールにスパイクした。このＲＮＡプールに、１μＬのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）及び２μＬのポリ（ｄＴ）プライマー（１００μＭ）を合わせて、ＲＮａｓｅを含まないＨ_２Ｏで総体積を１３μＬにした。混合物を６５℃で５分間インキュベートし、０℃まで３分間冷却してハイブリダイズした。ｃＤＮＡ合成では、４μＬの５×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶバッファ、１μＬのジチオスレイトール（１００ｍＭ）、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素を添加し、ＲＮａｓｅを含まない水でフィルアップして総体積を２０μＬにした。混合物を５０℃で２０分間、８０℃で１０分間インキュベートし、４℃まで３分間冷却した。ｃＤＮＡ合成後、３μＬの１０×ＲＮａｓｅ Ｈバッファ、１μＬのＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１．４μＬのＲＮａｓｅ Ｈ（５Ｕ／μＬ）、及び４μＬのシュリンプアルカリフォスファターゼ（１Ｕ／μＬ）、及び０．６μＬのｄＨ_２Ｏを添加して、ＲＮＡ及び過剰のヌクレオチドを除去した。混合物を３７℃で２５分間、６５℃で１５分間インキュベートし、０℃まで３分間冷却した後、ＰＣＲ産物用のメーカー説明書に従ってスピンカラム法（ＢａｓｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）で浄化し、１７μＬのｄＨ_２Ｏで溶出した。

【0062】

精製した混合物は、３’－Ｎ_３－ｄｄＧＴＰを用いたアジド伸長にそのまま使用した。１７μＬの精製ｃＤＮＡ混合物に、５μＬの５×ＴｄＴバッファ、１μＬの３’－Ｎ_３－ｄｄＧＴＰ（１０ｍＭ）、及び２μＬの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（２０Ｕ／μＬ）を添加した。この溶液を３７℃で１時間インキュベートし、０℃まで３分間冷却した。修飾されたｃＤＮＡをＰＣＲ産物用のメーカー説明書に従ってスピンカラム法（ＢａｓｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）で精製し、９μＬで溶出した。

【0063】

９μＬの精製したアジド修飾ｃＤＮＡ、０．５μＬのアルキンアダプター（１００μＭ）、２．５μＬのＡｃｔｉｖａｔｏｒ^２ _４０（ｂａｓｅｃｌｉｃｋ ＧｍｂＨ）、０．５μＬのｄＨ_２Ｏ、及び２つのリアクターペレットを用いてクリックライゲーションを実施した。反応混合物を４５℃、６００ｒｐｍで４０分間インキュベートした。反応後、上清を新しいバイアルに移した。ペレットを１２．５μＬの水で洗浄し、上清を前の上清に移した。クリックライゲーションされたｃＤＮＡをＰＣＲ産物用のメーカー説明書に従ってスピンカラム法（ＢａｓｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）で浄化し、１０μＬで溶出した。

【0064】

クリックライゲーション後、ｃＤＮＡプールを非標的プライマー（アダプタープライマー１及びポリ（ｄＴ）リバースプライマー）を用いて増幅して、完全長ｍＲＮＡライブラリを得た。２００μＬの反応バイアル中で、１１．５μＬのｄＨ_２Ｏ、４μＬの５×ＯｎｅＴａｑバッファ、１μＬのアダプタープライマー１（１０μＭ）、１μＬのポリ（ｄＴ）リバースプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、２μＬの精製クリックライゲーション混合物、及び０．１３μＬのＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５０００Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を合わせた。このサンプルをサーモサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ）で熱サイクルプログラムにかけた。

【0065】

標準的なサイクルとして、様々な伸長時間で以下の条件を用いた（工程４）。

【0066】

【表1】

【0067】

ＰＣＲ混合物をＰＣＲ産物用のメーカー説明書に従ってスピンカラム法（ＢａｓｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）で浄化し、１０μＬのｄＨ_２Ｏで溶出した。図３Ａでは、ＴＡＥバッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ酢酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製した１．５％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）で各ＰＣＲ反応の３μＬアリコートを分析した。

【0068】

図３Ｂ及び図３Ｃに示すバイオアナライザ測定では、ｍＲＮＡプールから生成した完全長ＰＣＲフラグメントの１μＬの精製アリコート（図３Ａのレーン１の伸長時間１分、レーン２の伸長時間３分）を、ＤＮＡ１０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びバイオアナライザ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００）を用いて測定した。

【0069】

【表2】

【0070】

修飾：

【化1】

【0071】

実施例２（図４に関連）
クリックライゲーション（実施例３に記載の手順）後、特定のＰＣＲフラグメントが得られる標的プライマー（各種の内部リバース及びフォワードプライマー、下記表を参照）を用いて、ｃＤＮＡプールから特定の遺伝子を増幅した。２００μＬの反応バイアル中で、１１．５μＬのｄＨ_２Ｏ、４μＬの５×ＯｎｅＴａｑ標準反応バッファ、１μＬの内部リバースプライマー（１０μＭ）、１μＬの内部フォワードプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、２μＬの精製クリックライゲーションｃＤＮＡ混合物、及び０．１３μＬのＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５０００Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を合わせた。このサンプルをサーモサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ）で熱サイクルプログラムにかけた。

【0072】

【表3】

【0073】

ＴＡＥバッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ酢酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製した１．５％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）で各ＰＣＲ増幅の５μＬの未精製アリコートを分析した。

【0074】

【表4】

【0075】

実施例３（図５及び図１２に関連）
クリックライゲーション（図３の例に記載の手順）後、特定のＰＣＲフラグメントが得られる遺伝子特異的プライマー及び一般的なアダプタープライマー標的プライマー（各種の内部リバースプライマー及びアダプタープライマー１、下記表を参照）を用いて、ｃＤＮＡプールから特定の遺伝子を増幅した。２００μＬの反応バイアル中で、１１．５μＬのｄＨ_２Ｏ、４μＬの５×ＯｎｅＴａｑ標準反応バッファ、１μＬの内部リバースプライマー（１０μＭ）、１μＬのアダプタープライマー１（１０μＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、２μＬの精製クリックライゲーションｃＤＮＡ混合物、及び０．１３μＬのＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５０００Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を合わせた。このサンプルをサーモサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ）で熱サイクルプログラムにかけた。

【0076】

【表5】

【0077】

ＴＡＥバッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ酢酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製した１．５％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）で各ＰＣＲ増幅の５μＬの未精製アリコートを分析した。

【0078】

図１２に示すようなサンガーシーケンシングの場合、生成したＦｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）のＰＣＲフラグメントをＰＣＲ産物用のメーカー説明書に従ってスピンカラム法（ＢａｓｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）で浄化し、２０μＬのｄＨ_２Ｏで溶出した。このテンプレート及び特異的プライマー（ＦＬＵＣ内部リバースプライマー）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ドイツ、エーバースベルク）に従って調製し、そこへ送付してサンガーシーケンシングを実施した。

【0079】

【表6】

【0080】

実施例４（図１０に関連）
トリアゾール読み通しの実現可能性を、モデルＲＮＡ配列の逆転写について例示した。ＲＮＡをプライマー１にハイブリダイズさせた後、２００μＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及び３’－アジド－ｄｄＡＴＰの存在下、ＭｕＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写した。メーカー説明書に従い、ヌクレオチド除去キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＤＮＡを精製して、ヌクレオチド及び酵素を除去した。

【0081】

単一のリアクターペレット（６００～８００μｍ、元素銅を含む）を入れた２００μＬ反応バイアル中、合計１２．５μＬの反応ミックスとし、精製ｃＤＮＡにアルキンオリゴ１をクリックし、４５℃で６０分間インキュベートした。反応ミックスは、８００μＭのＴＨＰＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５％ＤＭＳＯ、７μＭのアルキンオリゴ１、及び約４μＭの精製ｃＤＮＡで構成した。必要に応じて、ｄＨ_２Ｏを用いて最終体積を１２．５μＬに調整した。

【0082】

インキュベーション後、サンプルを短時間スピンダウンし、上清を新しいバイアルに移して反応を停止した。粗クリック反応物を１：１０００、１：５０００、及び１：１００００（最大で４ｎＭ、０．８ｎＭ、及び０．４ｎＭ）に希釈して、更に精製することなくＰＣＲ増幅を実施した。

【0083】

２００μＬ反応バイアル中で、総体積２０μＬのＰＣＲ増幅物を調製した。クリック反応希釈液を２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー２及びプライマー３、並びに１Ｕのポリメラーゼと合わせた。各種ポリメラーゼについて、メーカーの推奨に従ってＰｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｑ５、Ｏｎｅ Ｔａｑ、及びＤｒｅａｍ Ｔａｑの各バッファを使用した。このサンプルをサーモサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ）で熱サイクルプログラムにかけた。

【0084】

標準的なサイクル条件として以下の条件を用いた。

【0085】

【表7】

【0086】

Ｐｆｕポリメラーゼでは、異なるテンプレート希釈液及び別のサイクル条件を検討した。

【0087】

【表8】

【0088】

インキュベーション後、サンプルを短時間スピンダウンし、ＴＡＥバッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ酢酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製した３％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）でアリコートを分析した。

【0089】

サンプルは、２０％の紫色ローディング色素（ＮＥＢ）で調製し、それに合わせて低分子量ＤＮＡラダー（２５～７６６ｂｐ、ＮＥＢ、Ｎ３２３３）を調製した。通常、０．５μＬのマーカーを５μＬのローディング体積で使用した。ゲルは、６０分間、定電力（１０Ｗ、最大５００Ｖ、最大１００ｍＡ）をかけてＴＡＥバッファ中で泳動させた。その後、新たに調製した１：１００００のエチジウムブロマイド希釈液でゲルを１５分間インキュベートしてから、ｄＨ_２Ｏで１５分間脱色した。可視化にはＧｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を使用した。

【0090】

【表9】

【0091】

逆転写後に得られたｃＤＮＡ：（配列番号２０）

【数1】

【0092】

得られたクリック生成物：（配列番号２１）

【数2】

ＡＴ＝ＡとＴを骨格模倣体で結合

【0093】

得られたＰＣＲ産物：（配列番号２２）

【数3】

【0094】

修飾：

【化2】

【0095】

実施例５（図１１に関連）
最終体積２５μＬのサンプルは、１×末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼバッファ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭカコジル酸カリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＣｏＣｌ_２）中、１μＭのオリゴ２、１ｍＭの３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－トリフォスフェート又は３’－アジド－２’，３’－ジデオキシウリジン、及びＴｄＴ－酵素（２Ｕ／μｌ）を含み、ＴｄＴ－反応を実施した。反応物を３７℃で一晩（１２～１５時間）インキュベートし、７０℃まで１０分間加熱して停止した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを用いて混合物を精製し、３０μＬの水で溶出した。

【0096】

２００μＬ反応バイアル中で、２つのリアクターペレット（６００～８００μｍ、元素銅を含む）を１２．５μＬの反応ミックスと合わせ、４５℃で６０分間インキュベートした。クリック反応混合物は、８００μＭのＴＨＰＴＡ、４０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯのＨ_２Ｏ溶液、１μＭのアルキン－オリゴ３、及びＴｄＴ反応で得た約０．３μＭの精製アジドオリゴヌクレオチドで構成した。リファレンスとして、８００μＭのＴＨＰＴＡ、４０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯのＨ_２Ｏ溶液、１μＭのアルキン－オリゴ３、及び約１μＭのアジド－オリゴ２で構成した反応混合物を混合した。

【0097】

インキュベーション後、サンプルを短時間スピンダウンし、上清を新しいバイアルに移して反応を停止した。サンプルは２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。リファレンスとして低分子量ＤＮＡラダー（２５～７６６ｂｐ、ＮＥＢ、Ｎ３２３３）を使用した。

【0098】

オリゴヌクレオチドの変性ＰＡＧＥでは、サンプルを尿素（５０ｖ／ｖ）と混合し、２０％変性ポリアクリルアミドゲル（７．５ｍＬのＲｏｔｉｐｈｏｒｅｓｅ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｅｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、７５０μＬのＲｏｔｉｐｈｏｒｅｓｅ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２．０９ｍＬの再蒸留水、３ｍＬの６Ｍ尿素溶液、１．５ｍＬの１０×Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファ（１Ｍ Ｔｒｉｓ、１Ｍ Ｈ_３ＢＯ_３、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）、１５０μＬの過硫酸アンモニウム（１０％（ｗ／ｖ））、１０μＬのテトラメチルエチレンジアミン（Ｗ×Ｄ×Ｈ＝７．５×０．１×８．３ｃｍ））にロードした。ゲル電気泳動は、０．５×ＴＢＥバッファ中、１５０Ｖで２時間実施した。ゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色し、水で洗浄した。その後、ＢｉｏＲａｄ社のＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ Ｓｙｓｔｅｍを用いてバンドを可視化し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）ソフトウェアを用いて解析した。

【0099】

【表10】

【0100】

修飾：

【化3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

0007206424000001.app