▶ モガム バイオテクノロジー リサーチ インスティチュートの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-10
(45)【発行日】2023-01-18
(54)【発明の名称】ＩＤＳを含む融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230111BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230111BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230111BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230111BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230111BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230111BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230111BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230111BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230111BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230111BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230111BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230111BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230111BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12P21/08
C12N9/16 Z
C12N15/55
C12N15/62 Z
A61K47/68
A61K38/02
A61K39/395 Y
A61P25/00
A61P25/08
A61P25/14
A61P35/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P9/00
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021517964
(86)(22)【出願日】2019-10-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 KR2019013730
(87)【国際公開番号】W WO2020085721
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2021-05-25
(31)【優先権主張番号】10-2018-0129201
(32)【優先日】2018-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】504385351
【氏名又は名称】モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＧＡＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】チョ， キ ジュン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ミジョン
(72)【発明者】
【氏名】ソン， ウン ジョン
(72)【発明者】
【氏名】キム， キ ス
(72)【発明者】
【氏名】カン， クァン ヨブ
(72)【発明者】
【氏名】チョ， ウイ チョル
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５０７１３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３７０３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１５２７１９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０３８２４３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン受容体に結合する抗体の断片を含む第１のドメインと、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を有するタンパク質を含む第２のドメインと、を含み、
前記第１のドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、並びに配列番号６、１０及び１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むか、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６又は８のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
融合タンパク質。
【請求項2】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記Ｆｃ領域がヘテロダイマーである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記第１のドメインが、インスリン受容体に結合する抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ領域である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ）由来である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ヘテロダイマーＦｃの一方がノブ構造を有し、他方がホール構造を有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記第１のドメインのＣ末端が前記Ｆｃ領域のＮ末端に結合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記第２のドメインのＣ末端が前記Ｆｃ領域のＮ末端に結合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記第２のドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
インスリン受容体とインスリンとの間の結合を阻害しない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項12】
前記中枢神経系疾患が、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）及び脳がんからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記リソソーム蓄積症が、ハンター症候群、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、ポンペ病、クラッベ病、ゴーシェ病、ファブリー病、ウォルマン病、モルキオ症候群、メンケス症候群、ガラクトシアリドーシス、糖原病、ファンコニ・ビッケル症候群、レッシュ・ナイハン症候群及びツェルウェーガー症候群からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
融合タンパク質を作製するための方法であって、インスリン受容体に結合する抗体の断片をＦｃ領域に結合させて、第１のモノマーを作製するステップと、
イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をヘテロダイマーＦｃ領域に結合させて、第２のモノマーを作製するステップと、
前記第１のモノマーを前記第２のモノマーと混合するステップと、を含み、
前記抗体断片が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、並びに配列番号６、１０及び１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むか、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６又は８のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
方法。
【請求項15】
前記第１のモノマーの前記Ｆｃ領域のＣＨ３がノブ構造を有する場合、前記第２のモノマーのＣＨ３がホール構造を有するか、又は、前記第１のモノマーの前記Ｆｃ領域のＣＨ３がホール構造を有する場合、前記第２のモノマーのＣＨ３がノブ構造を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＩＤＳが配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記第１のモノマーが、（ｉ）配列番号１２又は１６のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３、１８及び１９のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有する軽鎖とを含むか、
（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３又は１５のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むか、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
前記第２のモノマーが、配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
中枢神経系疾患を予防又は治療するための医薬の製造のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む融合タンパク質及びその使用、より詳細には、ＩＤＳ酵素とインスリン受容体に結合する抗体の断片とが融合している融合タンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）で生じる疾患の一つであり、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）の変異により引き起こされる。ＩＤＳは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に必須の酵素である。ＩＤＳの活性が低下しているか、又は失われている場合、ＧＡＧは組織及び細胞に蓄積し、これにより疾患が引き起こされる。現在、ヒュンタラーゼ及びエラプレースがハンター症候群の治療剤として用いられている。しかし、これらの中枢神経系疾患の治療剤は、治療剤の脳への送達が適切に達成されないという点で問題であり、これは、これらの治療剤が、患者の静脈内に注入された後、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しないためである。
【0003】
一方、脳血管細胞は、ＢＢＢを介して、血液と脳との間の物質の移動を制限し、それにより、脳を保護している。そのため、体内の血管を循環している物質、例えば抗体又は酵素を、中枢神経系（ＣＮＳ）で生じる疾患の治療剤として応用することは困難であり、これは、かかる物質が、一般的にＢＢＢを通過せず、そのため、脳への物質の移動が制限されるためである。
【0004】
次いで、トランスフェリン又はインスリンは、受容体介在性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）機構を用いて、脳血管細胞の表面に発現したタンパク質、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）又はインスリン受容体（ＩＲ）によって脳に送達され得ることが見出されている。この機構は、治療剤を脳に送達する方法を開発するために使用されている。近年、ＢＢＢを通過することができる抗ＴｆＲ抗体を用いて、種々の物質、例えばＩＤＳ治療剤を脳に送達することができる技術が開発されている（韓国特許出願公開第１０－２０１６－００１１１９８号及び第１０－２０１５－００３９７９８号）。
【0005】
したがって、ＢＢＢ受容体に対して高い親和性を有し、優れたＢＢＢ通過効率を有するＩＤＳ治療剤を開発することが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、本発明者らは、ＢＢＢを通過することができるＩＤＳ酵素治療剤を開発した。詳細には、本発明の目的は、インスリン受容体に結合する抗体の断片、ＩＤＳ酵素、及びＦｃ領域が融合した非対称融合タンパク質、並びにその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上述の目的を達成するために、本発明は、インスリン受容体に結合する抗体の断片を含む第１のドメインと、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を有するタンパク質を含む第２のドメインと、Ｆｃ領域とを含む融合タンパク質、及びそれを作製するための方法を提供する。
【0008】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
【0009】
さらに、本発明は、融合タンパク質を作製するための方法であって、インスリン受容体に結合する抗体の断片をＦｃ領域に結合させて、第１のモノマーを作製するステップと、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をヘテロダイマーＦｃ領域に結合させて、第２のモノマーを作製するステップと、第１のモノマーを第２のモノマーと混合するステップとを含む方法を提供する。
【0010】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための融合タンパク質の使用を提供する。
【0011】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための医薬の製造のための融合タンパク質の使用を提供する。
【0012】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための方法であって、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【0013】
本発明による融合タンパク質は、ＩＤＳ酵素治療剤が脳に送達されるように、ＢＢＢを効果的に通過することができる。そのため、融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物は、中枢神経系疾患の治療剤として使用することができる。特に、医薬組成物は、リソソームの蓄積によって引き起こされる種々の疾患を予防又は治療することができることが期待される。さらに、融合タンパク質が、動物ＢＢＢ受容体及びヒトＢＢＢ受容体との優れた交差反応性を示すという観点から、融合タンパク質は、種々の疾患動物モデルに適用された融合タンパク質が直接臨床試験に適用することができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】融合タンパク質の構造及び作用機構の概略図を示す。
【図2】インスリン受容体に結合する抗体（ＩＲ７３９）の変異導入部位を示す図である。
【図3】インスリン受容体に結合する抗体バリアント（Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ０１６、Ｌ１１３及びＨ１１８）のＣＤＲ３配列を示す図である。
【図4】ヒト、サル及びマウスにおけるＩＲ７３９の交差反応性を評価するためにＦＡＣＳ分析を行うことにより得られた結果を示す図である。
【図5】ヒトインスリン受容体及びマウスインスリン受容体に対するＩＲ７３９及びＩＲ７３９のバリアント（Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ０１６、Ｌ１１３及びＨ１１８）の結合親和性を比較することにより得られた結果を示す図である。
【図6】ヒトインスリン受容体及びマウスインスリン受容体に対するＩＲ７３９及び融合タンパク質（ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－Ｈ０３１）の結合親和性を比較することにより得られた結果を示す図である。
【図7】ＩＲ７３９濃度の変化に応じて、インスリン受容体に対するインスリンとＩＲ７３９との間の相互作用効果を比較することにより得られた結果を示す図である。
【図8】インスリン濃度の変化に応じて、インスリン受容体に対するインスリンとＩＲ７３９との間の相互作用効果を比較することにより得られた結果を示す図である。
【図9】マウス血液中のＩＲ７３９の半減期を示す図である。
【図10】マウス血液中のＩＤＳ及びＩＤＳ－ＨＬ００９の半減期を示す図である。
【図11】ＩＲ７３９の脳取り込み効率を示す図である。
【図12】ＩＲ７３９のバリアント（Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ１１３及びＨ１１８）の脳取り込み効率を比較することにより得られた結果を示す図である。
【図13】融合タンパク質の脳取り込み効率を比較することにより得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の一態様において、インスリン受容体に結合する抗体の断片を含む第１のドメインと、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を有するタンパク質を含む第２のドメインとを含む、融合タンパク質を提供する。
【0016】
本明細書中で使用する用語「インスリン受容体」は、細胞上に発現し、インスリンを輸送することができる膜貫通受容体タンパク質を指す。ここで、インスリン受容体は、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体の一つとして作用することができる。血液脳関門受容体としては、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ－Ｒ）、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）等が挙げられ、これらは、ＢＢＢを越えて分子を輸送することができるか、又は、投与された外因性分子を輸送するのに使用することができる細胞外膜貫通受容体タンパク質である。
【0017】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、ＢＢＢを通過することができ、それにより融合ＩＤＳは、脳に送達され得る。
【0018】
本明細書中で使用する用語「抗体」は、ある特定の抗原と免疫学的に反応するイムノグロブリン（Ｉｇ）分子を指し、該分子は、抗原を特異的に認識する受容体としての役割を果たすタンパク質分子である。抗体は、抗体全体及びその断片（抗体断片）の両方を包含する概念を意味する。
【0019】
本明細書中で使用する用語「イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）」は、リソソームグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に必須の酵素を指す。変異がＩＤＳに生じる場合か、又はＩＤＳの活性が低下するか、若しくは不活化する場合、ＧＡＧは殆どの組織及び細胞に蓄積し、これは、疾患を引き起こし得る。ここで、ＩＤＳは、配列番号２１のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0020】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃ領域をさらに含んでいてもよく、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ）由来であってもよい。さらに、Ｆｃ領域は、ヘテロダイマーであってもよく、ヘテロダイマーＦｃの一方はノブ構造を有していてもよく、他方はホール構造を有していてもよい。ノブ又はホール構造は、Ｆｃ領域のＣＨ３に位置していてもよい。
【0021】
本明細書中で使用する用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の一部を含有するイムノグロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、通常、抗体重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３を含む。さらに、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。
【0022】
本発明の一実施形態において、第１のドメインは、インスリン受容体に結合する抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ領域であってもよい。本明細書中で使用する用語「Ｆａｂ」は、軽鎖の可変及び定常領域と、重鎖の可変及びＣＨ１領域とを含むものを指す。本明細書中で使用する用語「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含むものを指し、「軽鎖可変領域（ＶＬ）－リンカー－重鎖可変領域（ＶＨ）」で構成されていてもよい。リンカーは、人工的に重鎖可変領域を軽鎖可変領域へと連結させるように機能する、ある特定の長さを有するアミノ酸配列を指す。
【0023】
第１のドメインは、ＣＤＲを含み、これらのＣＤＲは、ある特定の抗原に対する結合特異性を付与し、ここで、ＣＤＲのセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、抗原に対する結合部位を供給してもよい。
【0024】
本発明の一実施形態において、第１のドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、並びに配列番号５、７及び９のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、並びに配列番号６、８、１０及び１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含んでいてもよい。好ましくは、第１のドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含んでいてもよい。
【0025】
本発明の一実施形態において、第１のドメインのＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に結合させることにより得られる第１のモノマーは、配列番号１２、１４、１６及び１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有する重鎖と、配列番号１３、１５、１８及び１９のアミノ酸配列からなる群から選択される任意の１つを有する軽鎖とを有していてもよい。
【0026】
本発明の一実施形態において、第２のドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を有していてもよい。本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、第２のドメインのＣ末端がＦｃ領域のＮ末端に結合している構造を有していてもよく、上述の結合によって得られる第２のモノマーは、配列番号２０のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0027】
より詳細には、第１のドメイン及びＦｃ領域は、リンカーを介して互いに結合していてもよい。さらに、第２のドメイン及びＦｃ領域は、リンカーを介して互いに結合していてもよい。リンカーとしては、ペプチド結合によって互いに接合された５～２０アミノ酸からなる、一本鎖ペプチドリンカーを使用してもよい。アミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択される１つ又は複数であってもよい。詳細には、リンカーは、グリシン及びセリンからなっていてもよく、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１～５である）のリンカーであってもよい。本発明の一実施形態において、リンカーは、配列番号２２のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0028】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、第１のドメインのＣ末端がダイマーＦｃ領域のいずれか一方のＮ末端に結合しており、第２のドメインのＣ末端がダイマーＦｃ領域の他方のＮ末端に結合している、非対称構造を有していてもよい。融合タンパク質は非対称構造を有するため、二価抗体が分解経路に偏向する可能性が高いという問題を防止することが可能である。
【0029】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であってもよい。用語「ヒト抗体」は、構造及びＣＤＲ領域がイムノグロブリン配列由来である可変領域を有するインタクトな抗体を指し、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体のイムノグロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体を指し、用語「キメラ抗体」は、異なる哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はヒトの組合せに由来する抗体を指す。
【0030】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、当技術分野で一般的に行われる方法、例えばノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）法（Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６１７～６２１（１９９６））、ファージ抗体ライブラリー法（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１））、融合法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５１１～５１９（１９７６））及び組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。
【0031】
本発明の一実施形態において、ＩＤＳ融合の融合タンパク質（ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－Ｈ０３１）は、ファージ抗体ライブラリー法及びノブインホール法を用いて作製した。融合タンパク質は、インスリン受容体に結合し、受容体介在性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）機構を介してＢＢＢを通過することができるため、ＩＤＳ融合の融合パートナー部位は、脳内の標的に対して作用することができる（図１）。
【0032】
ＲＭＴ機構を介してＢＢＢを通過する抗体については、そのＢＢＢ受容体に対する親和性が非常に重要である。詳細には、親和性が適当なレベルよりも低い場合、ＢＢＢに対する結合効率が低下するという問題がある。一方、親和性が適当なレベルよりも高い場合、ＢＢＢを通過した後に治療剤が放出される速度が低下し、結果としてＢＢＢ通過効率が低下する。
【0033】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、インスリン受容体に対するインスリンの結合を阻害しないものであってもよい。
【0034】
さらに、本発明の一態様において、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、融合タンパク質を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【0035】
本明細書中で使用する用語「中枢神経系（ＣＮＳ）」は、生体機能を制御する神経組織の複合体を指し、脳と脊髄とを含む。中枢神経系疾患は、ＣＮＳに影響を与える、及び／又はＣＮＳに病因を有する疾患又は障害を指す。疾患の具体例としては、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）及び脳がんが挙げられる。リソソーム蓄積症の具体例としては、ハンター症候群、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、ポンペ病、クラッベ病、ゴーシェ病、ファブリー病、ウォルマン病、モルキオ症候群、メンケス症候群、ガラクトシアリドーシス、糖原病、ファンコニ・ビッケル症候群、レッシュ・ナイハン症候群及びツェルウェーガー症候群等が挙げられる。
【0036】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。経口投与用には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定剤、懸濁化剤、着色剤及び香味剤等を使用してもよい。注入用には、緩衝剤、保存剤、無痛化薬、可溶化剤、等張剤及び安定剤等を混合し、使用してもよい。局所投与用には、基剤、賦形剤、滑沢剤及び保存剤等を使用してもよい。
【0037】
医薬組成物は、上述の薬学的に許容される担体と混合されることによって種々の製剤で作製されてもよい。注入用には、医薬組成物は、単位投与量アンプル又は多回投与量形態で作製されてもよい。
【0038】
さらに、医薬組成物は、その膜透過性を増強することができる界面活性剤を含んでいてもよい。この界面活性剤としては、ステロイド、カチオン性脂質由来のもの、例えばＮ－［１－（２，３－ジオレオイル）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）又は種々の化合物、例えばヘミコハク酸コレステロール及びホスファチジルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
医薬組成物の投与経路及び投与量については、投与は、個体の状態及び有害作用の有無に応じて種々の方法及び量で行ってもよく、最適な投与方法及び投与量は、当業者が適当な範囲で選択してもよい。
【0040】
詳細には、非経口投与については、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、細動脈内、脳室内、病巣内、くも膜下腔内及び局所投与並びにそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つの経路によって投与されてもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、組成物の一日投与量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであり、投与量は、一日に一回～数回投与されるのが好ましい。しかし、投与量は、個体の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて変動し得る。
【0041】
医薬組成物は、非経口投与する場合、種々の製剤で投与されてもよく、製剤に作製される場合、医薬組成物は、一般的に用いられる希釈剤又は賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤を用いて作製してもよい。非経口投与用の製剤としては、滅菌水溶液剤、非水溶液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が挙げられ得る。さらに、非水溶液剤又は懸濁剤については、植物油、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びオリーブ油、並びに注入可能なエステル、例えばオレイン酸エチル等を使用してもよい。坐剤の基剤については、ウイテプゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ ６１、カカオバター、ラウリン脂肪、又はグリセロゼラチン等を使用してもよい。
【0042】
本明細書中で使用する用語「個体」は、医薬組成物の投与によって、緩和、抑制、又は治療することができる状態又は疾患に罹患しているか、又は発症する危険性がある、哺乳類、好ましくはヒトを指す。
【0043】
本明細書中で使用する用語「予防」は、医薬組成物を用いて、疾患を防ぐか、又は疾患の症候を抑制若しくは遅延させる、任意の行為を指す。
【0044】
本明細書中で使用する用語「治療」は、医薬組成物を用いて疾患を改善させるか、又は有益なように変化させる、任意の行為を指す。
【0045】
さらに、本発明の一態様において、融合タンパク質を作製するための方法であって、インスリン受容体に結合する抗体をＦｃ領域に結合させて、第１のモノマーを作製するステップと、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をヘテロダイマーＦｃ領域に結合させて、第２のモノマーを作製するステップと、第１のモノマーを第２のモノマーと混合するステップとを含む方法を提供する。
【0046】
本発明の一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ）由来であってもよい。
【0047】
本発明の一実施形態において、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、並びに配列番号５、７及び９のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、並びに配列番号６、８、１０及び１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含んでいてもよい。詳細には、抗体断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含んでいてもよい。
【0048】
本発明の一実施形態において、第１のモノマーのＦｃ領域のＣＨ３がノブ構造を有する場合、第２のモノマーのＣＨ３は、ホール構造を有していてもよいか、又は、第１のモノマーのＦｃ領域のＣＨ３がホール構造を有する場合、第２のモノマーのＣＨ３はノブ構造を有していてもよい。
【0049】
本発明の一実施形態において、ＩＤＳは、配列番号２１のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0050】
本発明の一実施形態において、第１のモノマーは、配列番号１２、１４、１６及び１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有する重鎖と、配列番号１３、１５、１８及び１９のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか１つを有する軽鎖とを含んでいてもよく、第２のモノマーは、配列番号２０のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0051】
より詳細には、本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－ＩＲ７３９は、配列番号１２又は１６のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0052】
本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－ＨＬ００９は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0053】
本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－Ｈ０３１は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0054】
本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－Ｈ１１８は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0055】
本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－Ｌ０１６は、配列番号１２又は１６のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0056】
本発明による融合タンパク質ＩＤＳ－Ｌ１１３は、配列番号１２又は１６のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む第１のモノマー、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のモノマーを含んでいてもよい。
【0057】
本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための融合タンパク質の使用を提供する。
【0058】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防又は治療するための医薬の製造のための融合タンパク質の使用を提供する。
【0059】
さらに、本発明は、中枢神経系疾患を予防若しくは治療するための方法、及び／又は治療効果を増強する方法であって、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【0060】
個体は、中枢神経系疾患に罹患している個体であってもよい。さらに、個体は、哺乳類、好ましくはヒトであってもよい。
【0061】
融合タンパク質又は医薬組成物の投与経路、投与量、及び投与頻度については、対象への投与は、対象の状態及び有害効果の有無に応じて種々の方法及び量で行ってもよく、最適な投与方法、投与量及び投与頻度は、当業者が適当な範囲で選択してもよい。さらに、融合タンパク質又は医薬組成物は、治療する疾患について治療効果が知られている他の薬剤若しくは生理学的に活性な物質と組み合わせて投与してもよく、又は他の薬剤との組合せ製剤の形態で製剤化してもよい。
【実施例】
【0062】
以後本明細書において、本発明を以下の実施例によって、より詳細に記載する。しかし、以下の実施例は例示目的のみのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【0063】
作製例１．ＩＲ７３９抗体の作製
ヒト合成ｓｃＦｖライブラリー（ＭＩＤＡＳ、ＭＯＧＡＭ）を用いて、抗ＩＲ抗体を作製した。ＭＩＤＡＳのファージライブラリーを５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＩＲでコーティングしたチューブに入れ、処理を３７℃で２時間行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したＰＢＳ緩衝液で洗浄を４回行った。次いで、１％ ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）緩衝液での処理を室温で１０分間行って、ＩＲに結合したファージを溶出した。溶出したファージを、７０μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、これを用いて事前に培養した９ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ）を３０分間感染させた。ファージ感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅに、ＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）培地、テトラサイクリン及びカルベニシリンを添加し、培養を３７℃で１時間行った。次いで、培養物にヘルパーファージを添加した。培養をさらに１時間行った。培養物に培地を最大１００ｍｌ添加し、培養を３７℃で一晩行った。
ヒト合成ｓｃＦｖライブラリー（ＭＩＤＡＳ、ＭＯＧＡＭ）を用いて、抗ＩＲ抗体を作製した。ＭＩＤＡＳのファージライブラリーを５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＩＲでコーティングしたチューブに入れ、処理を３７℃で２時間行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したＰＢＳ緩衝液で洗浄を４回行った。次いで、１％ ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）緩衝液での処理を室温で１０分間行って、ＩＲに結合したファージを溶出した。溶出したファージを、７０μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、これを用いて事前に培養した９ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ）を３０分間感染させた。ファージ感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅに、ＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）培地、テトラサイクリン及びカルベニシリンを添加し、培養を３７℃で１時間行った。次いで、培養物にヘルパーファージを添加した。培養をさらに１時間行った。培養物に培地を最大１００ｍｌ添加し、培養を３７℃で一晩行った。
【0064】
培養培地を遠心分離により回収し、ファージを２０％ＰＥＧ溶液で沈殿させた。遠心分離後、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ溶液を用いてファージを収集した。ファージを収集した溶液を用いて、マウスＩＲコートチューブ及びヒトＩＲコートチューブを交互に用いて、パニングプロセスを最大４回繰り返した。三次ファージ及び四次ファージ感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅコロニーのそれぞれを培養して、各ファージ含有培養液を得た。培養液及びＩＲコートプレートを用いて、ヒトＩＲとマウスＩＲとに同時に結合する、ファージ発現ＸＬ１－ＢｌｕｅクローンをＥＬＩＳＡにより選択した。選択したクローンのプラスミドを配列決定して、ＶＨ及びＶＬ配列を得た。これらの配列に基づいて、従来のＩｇＧ形態を有する抗体を作製した。
【0065】
下記実験例１の交差反応性評価により、ＭＩＤＡＳヒトｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングにより得られた抗体の中から、ヒトＩＲ、サルＩＲ及びマウスＩＲのいずれにも結合する抗体である、ＩＲ７３９を選択した。上述のように作製したＩＲ７３９のタンパク質配列を下記表１に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
作製例２．ＩＲ７３９抗体のバリアントの作製
ランダム変異誘発を用いて、ＬＣＤＲ３のＡｓｎ－Ａｓｎ配列及びＨＣＤＲ３のＳｅｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ配列に変異を導入した（図２）。変異を導入するために、ＩＲ７３９の遺伝子を、対応する配列のコドンをＮＮＫ縮重コドン（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ、及びＫ＝Ｇ又はＴ）に置き換えることにより得られたプライマーを用いたＰＣＲに供して、変異体ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を作製した。エレクトロポレーションにより、変異体ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片のそれぞれをライゲーションした１μｇのｐＣＩｗベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１００μｌのＸＬ１－Ｂｌｕｅに形質転換した。次いで、生成物を１０ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）培地に入れ、培養を３７℃で１時間行った。
ランダム変異誘発を用いて、ＬＣＤＲ３のＡｓｎ－Ａｓｎ配列及びＨＣＤＲ３のＳｅｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ配列に変異を導入した（図２）。変異を導入するために、ＩＲ７３９の遺伝子を、対応する配列のコドンをＮＮＫ縮重コドン（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ、及びＫ＝Ｇ又はＴ）に置き換えることにより得られたプライマーを用いたＰＣＲに供して、変異体ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を作製した。エレクトロポレーションにより、変異体ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片のそれぞれをライゲーションした１μｇのｐＣＩｗベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１００μｌのＸＬ１－Ｂｌｕｅに形質転換した。次いで、生成物を１０ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）培地に入れ、培養を３７℃で１時間行った。
【0068】
培養物に１０ｍｌのヘルパーファージを添加し、培養を３７℃で１時間行った。次いで、培養物にテトラサイクリン及びカルベニシリンを補充した８０ｍｌの培地をさらに添加し、培養を一晩行った。変異を導入したＸＬ１－Ｂｌｕｅの培養液を遠心分離により回収し、ファージを２０％ＰＥＧ溶液で沈澱させた。遠心分離後、１％ ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）緩衝液を用いた培養を室温で１０分間行って、ＩＲに結合したファージを溶出した。溶出したファージを７０μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和し、これを用いて事前に培養した９ｍｌの大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ）を３０分間感染させた。ファージ感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅに、ＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）培地、テトラサイクリン及びカルベニシリンを添加し、培養を３７℃で１時間行った。次いで、培養物にヘルパーファージを添加した。培養をさらに１時間行った。培養物に培地を最大１００ｍｌ添加し、培養を３７℃で一晩行った。
【0069】
培養培地を遠心分離により回収し、ファージを２０％ＰＥＧ溶液で沈殿させた。遠心分離後、１％ ＢＳＡを添加したＰＢＳ溶液を用いてファージを収集した。ファージを収集した溶液を用いて、マウスＩＲコートチューブ及びヒトＩＲコートチューブを交互に用いて、パニングプロセスを最大４回繰り返した。三次ファージ及び四次ファージ感染ＸＬ１－Ｂｌｕｅコロニーのそれぞれを培養して、各ファージ含有培養液を得た。培養液及びＩＲコートプレートを用いて、ＩＲ７３９よりも高いか、又は低い吸光度を有するクローンをＥＬＩＳＡにより選択した。選択したクローンを配列決定して特有の配列を選択し（図３）、クローニングして、従来のＩｇＧ形態を有するバリアントであるＨ０３１、Ｈ１１８、ＨＬ００９、Ｌ０１６及びＬ１１３を作製した。
【0070】
作製例３．非対称融合抗体の作製
１つのＦａｂがＩＤＳに置き換えられているＩＤＳ融合タンパク質のそれぞれ（ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－Ｈ０３１、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－８Ｄ３）を作製するために、ノブインホールをイムノグロブリンの重鎖に導入した。ノブを導入した重鎖において、Ｌｙｓ４０９をＴｒｐ４０９に置き換え、ホールを導入した重鎖において、Ａｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５をそれぞれ、Ｖａｌ３９９及びＴｈｒ４０５に置き換えた。クローニングにより、ＩＲ７３９、ＨＬ００９及び８Ｄ３のＶＨを、ホールを導入した重鎖のＶＨに置き換え、ＩＤＳのＣ末端を、ノブを導入した重鎖のＣＨ２のＮ末端に融合した。トランスフェリン受容体に対する抗体である８Ｄ３を対照として用いた。
１つのＦａｂがＩＤＳに置き換えられているＩＤＳ融合タンパク質のそれぞれ（ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－Ｈ０３１、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－８Ｄ３）を作製するために、ノブインホールをイムノグロブリンの重鎖に導入した。ノブを導入した重鎖において、Ｌｙｓ４０９をＴｒｐ４０９に置き換え、ホールを導入した重鎖において、Ａｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５をそれぞれ、Ｖａｌ３９９及びＴｈｒ４０５に置き換えた。クローニングにより、ＩＲ７３９、ＨＬ００９及び８Ｄ３のＶＨを、ホールを導入した重鎖のＶＨに置き換え、ＩＤＳのＣ末端を、ノブを導入した重鎖のＣＨ２のＮ末端に融合した。トランスフェリン受容体に対する抗体である８Ｄ３を対照として用いた。
【0071】
ホールを導入した軽鎖及び重鎖を発現するプラスミド、並びにノブを導入し、ＩＤＳを融合したＣＨ２－ＣＨ３を発現するプラスミドをＣＨＯ細胞に共トランスフェクトした。培養を３７℃で１０日間行った。培養液を遠心分離により分離した。次いで、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９、ＩＤＳ－Ｈ０３１及びＩＤＳ－８Ｄ３をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて精製した。ＩＤＳ融合抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムから、１Ｍ Ｌ－アルギニン溶液（ｐＨ４）を用いて溶出した。上述のように作製した非対称融合抗体の構造を図１（左）に示す。
【0072】
実験例１．交差反応性評価
ヒトＩＲ、サルＩＲ及びマウスＩＲのそれぞれを過剰発現させたそれぞれのＥｘｐｉ－２９３細胞を回収し、５×１０６細胞／ｍｌでそれぞれのチューブに入れた。次いで、チューブを、ＭＩＤＡＳヒトｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングにより得られた１μｇ／ｍｌの抗体それぞれで処理した。培養を４℃で３０分間行い、次いで、冷ＰＢＳによる洗浄を、遠心分離機を用いて３回行った。培養物に３％ ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中の蛍光色素標識した抗ヒト抗体（ＦＩＴＣ－結合抗ヒトＩｇＧ）を添加し、培養を４℃で３０分間、暗所で行った。３％ ＢＳＡ／１％ アジ化ナトリウム／ＰＢＳの冷緩衝液による洗浄を、遠心分離機を用いて３回行った。分析は、ＦＡＣＳ機器を用いて行った。結果として、抗体ＩＲ７３９は、ヒトＩＲ、サルＩＲ及びマウスＩＲの全てに結合することが特定された（図４）。
ヒトＩＲ、サルＩＲ及びマウスＩＲのそれぞれを過剰発現させたそれぞれのＥｘｐｉ－２９３細胞を回収し、５×１０６細胞／ｍｌでそれぞれのチューブに入れた。次いで、チューブを、ＭＩＤＡＳヒトｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングにより得られた１μｇ／ｍｌの抗体それぞれで処理した。培養を４℃で３０分間行い、次いで、冷ＰＢＳによる洗浄を、遠心分離機を用いて３回行った。培養物に３％ ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中の蛍光色素標識した抗ヒト抗体（ＦＩＴＣ－結合抗ヒトＩｇＧ）を添加し、培養を４℃で３０分間、暗所で行った。３％ ＢＳＡ／１％ アジ化ナトリウム／ＰＢＳの冷緩衝液による洗浄を、遠心分離機を用いて３回行った。分析は、ＦＡＣＳ機器を用いて行った。結果として、抗体ＩＲ７３９は、ヒトＩＲ、サルＩＲ及びマウスＩＲの全てに結合することが特定された（図４）。
【0073】
実験例２．ＩＲに対する結合親和性の評価
実験例２．１．ＩＲ７３９の結合親和性の評価
ＩＲ７３９のＩＲに対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。１μｇ／ｍｌのヒトＩＲ又はマウスＩＲをＣＭ５センサーチップ上にアセテート（ｐＨ４．０）を用いて固定化した。ＩＲ７３９を、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ又は１．５６３ｎＭの濃度で、ヒトＩＲ又はマウスＩＲを固定化したＣＭ５センサーチップ上に流し、同時にその結合及び解離を測定した。測定条件については、流速を３０μｌ／分に設定し、結合時間及び解離時間を、それぞれ１２０秒及び６００秒に設定した。再生のために、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間流した。ＩＲ７３９のヒトＩＲ及びマウスＩＲに対する結合親和性の結果を下記表２に示す。
実験例２．１．ＩＲ７３９の結合親和性の評価
ＩＲ７３９のＩＲに対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。１μｇ／ｍｌのヒトＩＲ又はマウスＩＲをＣＭ５センサーチップ上にアセテート（ｐＨ４．０）を用いて固定化した。ＩＲ７３９を、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ又は１．５６３ｎＭの濃度で、ヒトＩＲ又はマウスＩＲを固定化したＣＭ５センサーチップ上に流し、同時にその結合及び解離を測定した。測定条件については、流速を３０μｌ／分に設定し、結合時間及び解離時間を、それぞれ１２０秒及び６００秒に設定した。再生のために、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間流した。ＩＲ７３９のヒトＩＲ及びマウスＩＲに対する結合親和性の結果を下記表２に示す。
【0074】
【表2】
【0075】
実験例２．２．ＩＲ７３９及びＩＲ７３９のバリアントの結合親和性の比較
ＥＬＩＳＡを行って、ＩＲ７３９及びそのバリアントのＩＲに対する結合親和性を比較した。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のＩＲ７３９及びそのバリアントで処理した。処理を３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ７３９及びそのバリアントを検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。発色をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行い、４５０ｎｍにおける吸光度を分析した。結果として、Ｈ０３１及びＨＬ００９は、ヒトＩＲ及びマウスＩＲに対して、ＩＲ７３９よりも高い結合親和性を有し、Ｌ０１６及びＨ１１８は、ＩＲ７３９よりも低い結合親和性を有していた。Ｌ１１３は、ＩＲ７３９と同等の結合親和性を示した（図５）。
ＥＬＩＳＡを行って、ＩＲ７３９及びそのバリアントのＩＲに対する結合親和性を比較した。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のＩＲ７３９及びそのバリアントで処理した。処理を３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ７３９及びそのバリアントを検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。発色をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行い、４５０ｎｍにおける吸光度を分析した。結果として、Ｈ０３１及びＨＬ００９は、ヒトＩＲ及びマウスＩＲに対して、ＩＲ７３９よりも高い結合親和性を有し、Ｌ０１６及びＨ１１８は、ＩＲ７３９よりも低い結合親和性を有していた。Ｌ１１３は、ＩＲ７３９と同等の結合親和性を示した（図５）。
【0076】
実験例２．３．非対称融合抗体の結合親和性の評価
ＥＬＩＳＡを行って、ＩＤＳ－ＨＬ００９のＩＲに対する結合親和性を特定した。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９又はＩＤＳ－Ｈ０３１で処理した。処理を３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ－７３９、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－Ｈ０３１を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。発色をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行い、４５０ｎｍにおける吸光度を分析した。結果として、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－Ｈ０３１及びＩＤＳ－ＨＬ００９は、ヒトＩＲ及びマウスＩＲに対して、ＩＲ７３９よりも低い結合親和性を有しており、これは、かかる抗体において、１つのＦａｂのＩＤＳによる置き換えにより、アビディティ効果が除かれたためである（図６）。
ＥＬＩＳＡを行って、ＩＤＳ－ＨＬ００９のＩＲに対する結合親和性を特定した。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９又はＩＤＳ－Ｈ０３１で処理した。処理を３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ－７３９、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－Ｈ０３１を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。発色をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行い、４５０ｎｍにおける吸光度を分析した。結果として、ＩＤＳ－ＩＲ７３９、ＩＤＳ－Ｈ０３１及びＩＤＳ－ＨＬ００９は、ヒトＩＲ及びマウスＩＲに対して、ＩＲ７３９よりも低い結合親和性を有しており、これは、かかる抗体において、１つのＦａｂのＩＤＳによる置き換えにより、アビディティ効果が除かれたためである（図６）。
【0077】
実験例３．ＩＲに対するインスリンとＩＲ７３９との間の競合の特定
ＩＲに対するＩＲ７３９とインスリンとの間の相互作用を特定するために、競合ＥＬＩＳＡを行った。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングした。次いで、それぞれのウェルに、種々の濃度のＩＲ７３９とビオチン化インスリンとの混合物を添加した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ７３９を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンによる処理を行って、ビオチン化インスリンを検出した。
ＩＲに対するＩＲ７３９とインスリンとの間の相互作用を特定するために、競合ＥＬＩＳＡを行った。５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３％スキムミルクで１時間ブロッキングした。次いで、それぞれのウェルに、種々の濃度のＩＲ７３９とビオチン化インスリンとの混合物を添加した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ＩＲ７３９を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行い、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンによる処理を行って、ビオチン化インスリンを検出した。
【0078】
インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、発色をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。４５０ｎｍにおける吸光度を分析した。結果として、ＩＲ７３９のＩＲに対する結合パターンは、インスリン濃度の変化による影響を受けなかった。詳細には、インスリン濃度が０．６ｎＭ～１５０ｎＭまで変化する間、それぞれの濃度のＩＲ７３９についての結合曲線に変化は観察されなかった（図７）。さらに、インスリンのＩＲに対する結合パターンも、ＩＲ７３９濃度の変化による影響を受けず、詳細には、ＩＲ７３９濃度が０．０３ｎＭ～７ｎＭまで変化する間、それぞれのインスリン濃度についての結合曲線に変化は観察されなかった（図８）。
【0079】
実験例４．マウス血液中の薬物動態の評価
実験例４．１．マウス血液中のＩＲ７３９の薬物動態の評価
マウス血液中のＩＲ７３９の安定性を分析するために、５ｍｇ／ｋｇのＩＲ７３９、又は対照である８Ｄ３抗体（抗ＴｆＲ抗体）を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間のそれぞれにおいて、５０μｌの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡ用に、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、１／１０希釈した５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。処理を３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１０，０００ｎｇ／ｍｌ～４．５ｎｇ／ｍｌ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３，３３３ｎｇ／ｍｌ、１，１１１ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、１２３ｎｇ／ｍｌ、４１．２ｎｇ／ｍｌ、１３．７ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ）のＩＲ７３９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＲ７３９は、約２４時間の半減期を有することが特定された（図９）。
実験例４．１．マウス血液中のＩＲ７３９の薬物動態の評価
マウス血液中のＩＲ７３９の安定性を分析するために、５ｍｇ／ｋｇのＩＲ７３９、又は対照である８Ｄ３抗体（抗ＴｆＲ抗体）を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間のそれぞれにおいて、５０μｌの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡ用に、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、１／１０希釈した５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。処理を３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１０，０００ｎｇ／ｍｌ～４．５ｎｇ／ｍｌ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３，３３３ｎｇ／ｍｌ、１，１１１ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、１２３ｎｇ／ｍｌ、４１．２ｎｇ／ｍｌ、１３．７ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ）のＩＲ７３９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＲ７３９は、約２４時間の半減期を有することが特定された（図９）。
【0080】
実験例４．２．マウス血液中のＩＤＳ－ＨＬ００９の薬物動態の評価
マウス血液中のＩＤＳ－ＨＬ００９の安定性を分析するために、５ｍｇ／ｋｇのＩＤＳ、ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９又はＩＤＳ－８Ｄ３を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間のそれぞれにおいて、５０μｌの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡ用に、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、１／１０希釈した５０μｌの上清で処理した。
マウス血液中のＩＤＳ－ＨＬ００９の安定性を分析するために、５ｍｇ／ｋｇのＩＤＳ、ＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９又はＩＤＳ－８Ｄ３を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間のそれぞれにおいて、５０μｌの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡ用に、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、１／１０希釈した５０μｌの上清で処理した。
【0081】
インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。処理を３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１０，０００ｎｇ／ｍｌ～４．５ｎｇ／ｍｌ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３，３３３ｎｇ／ｍｌ、１，１１１ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、１２３ｎｇ／ｍｌ、４１．２ｎｇ／ｍｌ、１３．７ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ）のＩＲ７３９、ＩＤＳ－ＨＬ００９及びＩＤＳ－８Ｄ３でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＤＳ濃度を測定するために、抗ＩＤＳ ＩｇＧでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で、ビオチン結合抗ＩＤＳ及びＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＩＤＳ－ＨＬ００９は、約１４時間の半減期を有することが特定された（図１０）。
【0082】
実験例５．脳取り込みの評価
実験例５．１．ＩＲ７３９の脳取り込み効率の評価
ＩＲ７３９の脳取り込み効率を分析するために、陰性対照ＩｇＧ（抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ＩｇＧ）、８Ｄ３又はＩＲ７３９を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。ここで、抗メソテリンＩｇＧを陰性対照として使用し、８Ｄ３を陽性対照として使用した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３及びＩＲ７３９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＲ７３９は、８Ｄ３よりも低い脳取り込み効率を示し、一方、抗ＭＳＬＮ ＩｇＧよりも高い脳取り込み効率を示した（図１１）。
実験例５．１．ＩＲ７３９の脳取り込み効率の評価
ＩＲ７３９の脳取り込み効率を分析するために、陰性対照ＩｇＧ（抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ＩｇＧ）、８Ｄ３又はＩＲ７３９を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。ここで、抗メソテリンＩｇＧを陰性対照として使用し、８Ｄ３を陽性対照として使用した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行い、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３及びＩＲ７３９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＲ７３９は、８Ｄ３よりも低い脳取り込み効率を示し、一方、抗ＭＳＬＮ ＩｇＧよりも高い脳取り込み効率を示した（図１１）。
【0083】
実験例５．２．ＩＲ７３９のバリアントの脳取り込み効率の評価
ＩＲ７３９のバリアントの脳取り込み効率を分析するために、抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３、ＩＲ７３９、Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ１１３又はＨ１１８を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコートし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３、ＩＲ７３９、Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ１１３及びＨ１１８でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。分析の結果として、バリアントの中で、ＨＬ００９は、ＩＲ７３９よりも高い脳取り込み効率を示し、一方、Ｈ０３１、Ｌ１１３及びＨ１１８は、ＩＲ７３９よりも低い脳取り込み効率を示した（図１２）。
ＩＲ７３９のバリアントの脳取り込み効率を分析するために、抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３、ＩＲ７３９、Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ１１３又はＨ１１８を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコートし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＭＳＬＮ ＩｇＧ、８Ｄ３、ＩＲ７３９、Ｈ０３１、ＨＬ００９、Ｌ１１３及びＨ１１８でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。分析の結果として、バリアントの中で、ＨＬ００９は、ＩＲ７３９よりも高い脳取り込み効率を示し、一方、Ｈ０３１、Ｌ１１３及びＨ１１８は、ＩＲ７３９よりも低い脳取り込み効率を示した（図１２）。
【0084】
実験例５．３．ＩＤＳ－ＨＬ００９の脳取り込み効率の評価
ＩＤＳ－ＨＬ００９の脳取り込み効率を分析するために、ＩＤＳ－ＨＬ００９を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）のＩＤＳ－ＨＬ００９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＤＳ－ＨＬ００９は、ＩＤＳ、ＩＤＳ－ＩＲ７３９及びＩＤＳ－Ｈ０３１よりも高い脳取り込み効率を示した（図１３）。
ＩＤＳ－ＨＬ００９の脳取り込み効率を分析するために、ＩＤＳ－ＨＬ００９を５ｍｇ／ｋｇで各マウスの尾静脈に注入した。１時間及び２４時間後に、各物質について３匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳１００ｍｇ当たり１ｍｌの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧでコーティングし、３％スキムミルクでブロッキングし、次いで、５０μｌの上清で処理した。インキュベーションを３７℃で１時間行、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ ＩｇＧによる処理を行った。インキュベーションを３７℃で１時間行った。次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ溶液による洗浄を３回行い、検出をＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、１，０００ｎｇ／ｍｌ～０．４５ｎｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ、３３３ｎｇ／ｍｌ、１１１ｎｇ／ｍｌ、３７．０ｎｇ／ｍｌ、１２．３ｎｇ／ｍｌ、４．１２ｎｇ／ｍｌ、１．３７ｎｇ／ｍｌ、０．４５ｎｇ／ｍｌ）のＩＤＳ－ＨＬ００９でＥＬＩＳＡを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。ＩＤＳ－ＨＬ００９は、ＩＤＳ、ＩＤＳ－ＩＲ７３９及びＩＤＳ－Ｈ０３１よりも高い脳取り込み効率を示した（図１３）。
【0085】
実験例６．ＩＤＳ－ＨＬ００９の特徴の評価
ＩＤＳ及びＩＤＳ－ＨＬ００９の特徴を分析するために、１０ｎｇ／ｍｌのＩＤＳ又は１０μｌのＩＤＳ－ＨＬ００９及び０μｌの１００ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノースイズロン酸－２－スルフェート（４ＭＵ－α－ＩｄｏｐｙｒａＡ－２）を９６ウェルプレート（黒色）に入れ、インキュベーションを３７℃で４時間行った。２０μｌのＰｉ／Ｃｉ溶液（ｐＨ４．５）の添加により反応を停止し、反応物に１０μｌの２５μｇ／ｍｌ組換えヒトα－Ｌ－イズロニダーゼを添加した。インキュベーションを３７℃で２４時間行った。次いで、反応物に２００μｌの０．２５Ｍ炭酸／炭酸水素ナトリウム（ｐＨ１０．０）を添加し、蛍光を測定した（吸光３５５ｎｍ／発光４６０ｎｍ）。４－メチルウンベリフェロンを標準として用いて活性を分析し、結果を下記表３に示す。
ＩＤＳ及びＩＤＳ－ＨＬ００９の特徴を分析するために、１０ｎｇ／ｍｌのＩＤＳ又は１０μｌのＩＤＳ－ＨＬ００９及び０μｌの１００ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノースイズロン酸－２－スルフェート（４ＭＵ－α－ＩｄｏｐｙｒａＡ－２）を９６ウェルプレート（黒色）に入れ、インキュベーションを３７℃で４時間行った。２０μｌのＰｉ／Ｃｉ溶液（ｐＨ４．５）の添加により反応を停止し、反応物に１０μｌの２５μｇ／ｍｌ組換えヒトα－Ｌ－イズロニダーゼを添加した。インキュベーションを３７℃で２４時間行った。次いで、反応物に２００μｌの０．２５Ｍ炭酸／炭酸水素ナトリウム（ｐＨ１０．０）を添加し、蛍光を測定した（吸光３５５ｎｍ／発光４６０ｎｍ）。４－メチルウンベリフェロンを標準として用いて活性を分析し、結果を下記表３に示す。
【0086】
【表3】
【0087】
表３に示すように、ＩＤＳ－ＨＬ００９のＩＤＳ活性は、タンパク質１μｇに対して、ＩＤＳ：ＩＤＳ－ＨＬ００９＝５１．４：１３．０ｎｍｏｌ／分であることが示され、かつ、タンパク質１ｍｏｌに対して、ＩＤＳ：ＩＤＳ－ＨＬ００９＝３，０８４：２，１０５ｎｍｏｌ／分であることが示された。上の結果から、ＩＤＳ－ＨＬ００９は、タンパク質１ｍｏｌに対して、ＩＤＳに対して約７０％のＩＤＳ活性を有することが特定できた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】