特許 7208133 酸性αグルコシダーゼ変異体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-10

(45)【発行日】2023-01-18

(54)【発明の名称】酸性αグルコシダーゼ変異体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230111BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 3/08 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230111BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20230111BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20230111BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N9/26 Z

C12N15/56

C12N15/12

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A61K38/47

A61K48/00

A61P1/16

A61P3/08

A61P9/00

A61P21/00

C07K14/47

C07K19/00

【請求項の数】 29

(21)【出願番号】P 2019513434

(86)(22)【出願日】2017-09-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-11-28

(86)【国際出願番号】 EP2017072942

(87)【国際公開番号】W WO2018046772

(87)【国際公開日】2018-03-15

【審査請求日】2020-06-17

(31)【優先権主張番号】16306148.4

(32)【優先日】2016-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】503197304

【氏名又は名称】ジェネトン

(73)【特許権者】

【識別番号】518059934

【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ

【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】514280282

【氏名又は名称】デユーク・ユニバーシテイ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ミンゴッツィ，フェデリコ

(72)【発明者】

【氏名】ロンジッティ，ジュゼッペ

(72)【発明者】

【氏名】コーベル，ドゥワイト・ディー

(72)【発明者】

【氏名】ハン，サン－オ

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】Sun et al.，Enhanced Efficacy of an AAV Vector Encoding Chimeric, Highly Secreted Acid α-Glucosidase in Glycogen Storage Disease Type II，Molecular Therapy， Volume 14, Issue 6，2006年09月20日，Pages 822-830

【文献】Corti M et al.，Evaluation of Readministration of a Recombinant Adeno-Associated Virus Vector Expressing Acid Alpha-Glucosidase in Pompe Disease: Preclinical to Clinical Planning，Hum Gene Ther Clin Dev.，26(3)，2015年09月，p.185-93

【文献】Doerfler PA et al，Copackaged AAV9 Vectors Promote Simultaneous Immune Tolerance and Phenotypic Correction of Pompe Disease，Hum Gene Ther.，27(1)，2016年01月，p.43-59

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ ９／２６

Ｃ１２Ｎ １５／５６

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／８６７

Ｃ１２Ｎ １５／８６４

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ａ６１Ｋ ３８／４７

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ４７／６４

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ３／０８

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ２１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項2】

機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸分子。

【請求項3】

ヒトα－１－アンチトリプシンタンパク質のシグナルペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２記載の核酸分子。

【請求項4】

プロモーターに作動可能に連結された核酸分子を含む発現カセットである、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子を含む、核酸構築物。

【請求項5】

該核酸構築物が、さらにイントロンを含む、請求項４記載の核酸構築物。

【請求項6】

プロモーターが、α－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターからなる群より選択される、請求項４又は５記載の核酸構築物。

【請求項7】

イントロンが、ヒトβグロビンｂ２（又はＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリβ－グロビンイントロン、又は配列番号８の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１０の改変されたＦＩＸイントロン、又は配列番号１２の改変されたニワトリβ－グロビンイントロンから選択される改変されたイントロンからなる群より選択されるイントロンである、請求項４～６のいずれか一項記載の核酸構築物。

【請求項8】

エンハンサー；イントロン；プロモーター；キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子；及びポリアデニル化シグナルをこの順序で含む、請求項４～６のいずれか一項記載の核酸構築物。

【請求項9】

プロモーターが、肝特異的プロモーターである、請求項８記載の核酸構築物。

【請求項10】

ＡｐｏＥ制御領域；ＨＢＢ２イントロン；ｈＡＡＴプロモーター；キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子；及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをこの順序で含む、請求項８又は９記載の核酸構築物。

【請求項11】

配列番号１３又は配列番号１４の核酸配列を含む、請求項１０記載の核酸構築物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸構築物を含むベクター。

【請求項13】

ＡＡＶベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１２記載のベクター。

【請求項14】

レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１２記載のベクター。

【請求項15】

一本鎖又は二本鎖の自己相補性ＡＡＶベクターである、請求項１２又は１３記載のベクター。

【請求項16】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、変異ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、変異ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、変異ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、変異ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｉ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８から選択されるＡＡＶに由来のキャプシド、及びブタＡＡＶキャプシド、又はキメラキャプシドを有するＡＡＶベクターである、請求項１２記載のベクター。

【請求項17】

ＡＡＶ１０キャプシドが、ＡＡＶｃｙ１０及びＡＡＶｒｈ１０キャプシドである、請求項１６記載のベクター。

【請求項18】

ブタＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６キャプシドである、請求項１６記載のベクター。

【請求項19】

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシドを有する、請求項１５記載のベクター。

【請求項20】

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４キャプシドを有する、請求項１９記載のベクター。

【請求項21】

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８キャプシドを有する、請求項２０記載のベクター。

【請求項22】

請求項１～３のいずれか一項の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項の核酸構築物、又は請求項１２～２１のいずれか一項のベクターを用いて形質転換された細胞。

【請求項23】

細胞が、肝細胞又は筋肉細胞である、請求項２２記載の形質転換された細胞。

【請求項24】

薬学的に許容される担体に、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞を含む、医薬組成物。

【請求項25】

医薬品としての使用のための、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞。

【請求項26】

糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤＩＩＩ）（コーリ病）、糖原病ＩＶ型（ＧＳＤＩＶ）、糖原病Ｖ型（ＧＳＤＶ）、糖原病ＶＩ型（ＧＳＤＶＩ）、糖原病ＶＩＩ型（ＧＳＤＶＩＩ）、糖原病ＶＩＩＩ型（ＧＳＤＶＩＩＩ）、及び心臓の致死性先天性糖原病から選択される糖原病を処置するための方法に使用するための、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞。

【請求項27】

ＧＳＤＩ、ＧＳＤＩＩ又はＧＳＤＩＩＩから選択される糖原病を処置するための方法に使用するための、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞。

【請求項28】

ＧＳＤＩＩ又はＧＳＤＩＩＩから選択される糖原病を処置するための方法に使用するための、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞。

【請求項29】

ＧＳＤＩＩから選択される糖原病を処置するための方法に使用するための、請求項１～３のいずれか一項記載の核酸分子、請求項４～１１のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１２～２１のいずれか一項記載のベクター、又は請求項２２又は２３記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酸性αグルコシダーゼ変異体及びその使用に関する。該変異体は、配列が最適化されている及び／又は異種シグナルペプチドに連結されている。

【0002】

糖原病（ＧＳＤ）ＩＩ型及び酸性マルターゼ欠損症としても知られるポンペ病は、リソソーム酵素の酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損症によって引き起こされる常染色体劣性代謝性筋疾患である。ＧＡＡは、リソソーム内でグリコーゲンをグルコースに加水分解するエキソ－１，４及び１，６－α－グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠損によりリソソーム内にグリコーゲンが蓄積され、呼吸筋、心筋及び骨格筋への進行的な傷害が引き起こされる。該疾患は、通常は１～２歳までに致命的となる急速に進行する乳児型の経過から、小児及び成人におけるかなりの罹患率及び早期死亡率を引き起こす、より緩徐に進行する異質な経過まで多岐にわたる。Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill); Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008)。

【0003】

ポンペ病を処置するためのヒトにおける現在の治療法は、別名酵素補充療法（ＥＲＴ）と呼ばれる組換えヒトＧＡＡの投与を含む。ＥＲＴは、重度の乳児型糖原病ＩＩ型に対して有効性を実証した。しかしながら、酵素療法の利点は、頻繁な注入の必要性及び組換えｈＧＡＡに対する阻害抗体の発生によって制限される（Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138）。さらに、ＥＲＴは全身を効果的に修復しない。これはおそらく、末梢静脈から送達後のタンパク質の不十分な体内分布、いくつかの組織からの取り込みがなされないこと、及び高い免疫原性の組合せのためである。

【0004】

ＥＲＴの代わりの又は補助としての、糖原病ＩＩ型を処置するための遺伝子療法アプローチの実現可能性が研究されている（Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446, Fraites, T. J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616）。しかしながら、遺伝子異常を修復するための筋肉に指向された遺伝子導入は、疾患が全身性であることの限界、及び、導入遺伝子の筋肉における発現が他の組織と比べてより免疫原性が高くなる傾向があるという事実に直面しなければならない。

【0005】

Doerfler et al., 2016は、ヒトコドン最適化ＧＡＡをコードしている２つの構築物（一方は、肝特異的プロモーターの制御下にあり、他方は筋肉特異的プロモーターの制御下にある）の組合せ投与を記載している。肝臓特異的プロモーターにより駆動されるＧＡＡの発現が、Ｇａａ^－/－マウスモデルにおいてＧＡＡに対する免疫寛容を促進するために使用され、一方、筋肉特異的プロモーターにより駆動されるＧＡＡの発現が、療法のために標的化された組織の部分における治療用タンパク質の発現を提供する。しかしながら、この戦略は、複数の構築物の使用を必要とし、これによりＧＡＡが全身に発現されるわけではないという点で、完全に満足のいくものではない。

【0006】

リソソーム蓄積症の処置を改善するために、過去に、改変されたＧＡＡタンパク質が提案されている。特に、国際公開公報第２００４０６４７５０号の出願及びSun et al. 2006は、分泌経路へのタンパク質の標的化を増強するための方法として、ＧＡＡに作動可能に連結させたシグナルペプチドを含む、キメラＧＡＡポリペプチドを開示している。

【0007】

しかしながら、患者に利用可能な治療法は全く申し分がないわけではなく、改善されたＧＡＡポリペプチド及びＧＡＡの生成は依然として当技術分野において必要である。特に、ＧＡＡによる長期の処置効力、高いレベルのＧＡＡ生成、生成されたＧＡＡポリペプチドに対する改善された免疫寛容、並びにそれを必要とする細胞及び組織によるＧＡＡの取り込みの改善の必要性が依然としてある。さらに、国際公開公報第２００４０６４７５０号及びSun et al. 2006では、そこに開示されたキメラＧＡＡポリペプチドの組織分布は全く申し分がないわけではない。それ故、関心対象の全ての組織ではなくても大半の組織におけるグリコーゲン蓄積の修復を可能とすることによって、完全に治療するであろうＧＡＡポリペプチドが依然として必要である。

【0008】

発明の要約
本発明は、野生型ＧＡＡタンパク質と比較して高いレベルで発現及び分泌され、全身におけるグリコーゲンの病的蓄積の改善された修復を惹起し、これによりＧＡＡに対する免疫寛容を誘導する、ＧＡＡ変異体に関する。

【0009】

１つの態様によると、本発明は、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一率を有するヌクレオチド配列を含み、機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている、核酸分子に関する。この態様の特定の実施態様では、核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0010】

別の態様によると、本発明は、キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を提供し、ここでのＧＡＡタンパク質の内因性シグナルペプチドは、ヒトα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）タンパク質のシグナルペプチドにより置換されている。それ故、該核酸分子は、機能的ＧＡＡポリペプチドに融合したｈＡＡＴシグナルペプチドを含むキメラＧＡＡポリペプチドをコードしている。コードされたキメラポリペプチドは、機能的ＧＡＡタンパク質であり、ここでのＧＡＡの天然シグナルペプチドに対応するアミノ酸配列は、ｈＡＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列によって置換されている。特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、天然ＧＡＡシグナルペプチドとは異なるシグナルペプチド、すなわちｈＡＡＴシグナルペプチドを含み、そのＮ末端に融合している、機能的形態のＧＡＡポリペプチドであるキメラポリペプチドをコードしている。特定の実施態様によると、本発明の核酸分子は、配列番号４のｈＡＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様では、ＧＡＡコード配列は、インビボにおける導入遺伝子の発現のために配列が最適化されている。

【0011】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含む核酸構築物を提供する。本発明の核酸構築物は発現カセットであり得る。発現カセットは、プロモーター、イントロン、ポリアデニル化シグナル及び／又はエンハンサー（例えばシス調節モチーフ、すなわちＣＲＭ）などの１つ以上の調節配列に作動可能に連結させた本発明の核酸分子を含み得る。例示的なプロモーターとしては、肝特異的プロモーター、例えばα－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターからなる群より選択されたプロモーターが挙げられる。別の特定の実施態様では、該プロモーターは筋肉特異的プロモーター、例えばＳｐｃ５－１２、ＭＣＫ及びデスミンプロモーターである。別の実施態様では、該プロモーターは、偏在性プロモーター、例えばＣＭＶ、ＣＡＧ及びＰＧＫプロモーターである。本発明の核酸構築物はさらに、イントロン、特にヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリβ－グロビンイントロン、及びＳＶ４０イントロンからなる群より選択されたイントロンを含み得る。さらに、該イントロンは、改変されたイントロン、例えば配列番号８の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１０の改変されたＦＩＸイントロン、又は配列番号１２の改変されたニワトリβ－グロビンイントロンであり得る。本発明の具体的な実施態様では、本発明の核酸構築物は、エンハンサー；イントロン；プロモーター、特に肝特異的プロモーター；キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸配列；及びポリアデニル化シグナルを好ましくはこの順序で含む。具体的な実施態様では、本発明の核酸構築物は、ＡｐｏＥ制御領域；ＨＢＢ２イントロン、特に改変されたＨＢＢ２イントロン；ｈＡＡＴプロモーター；キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子；及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを特にこの順序で含む。特定の実施態様では、核酸構築物は、配列番号１３又は配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。

【0012】

さらなる態様では、本発明はまた、上記に定義されているような核酸分子又は核酸構築物を含むベクターも提供する。特定の実施態様では、該ベクターは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。特に、該ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。本発明において装備され得る例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、変異ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、変異ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、変異ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、変異ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えばＡＡＶｃｙ１０及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、及びブタＡＡＶ、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６の血清型に由来するキャプシドを有するＡＡＶベクターが挙げられる。より具体的には、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを有する。

【0013】

さらに、本発明は、上記のような核酸分子、核酸構築物、又はベクターを含む細胞を提供する。該細胞は、例えば、肝細胞又は筋肉細胞であり得る。

【0014】

別の態様によると、本発明はまた、本明細書に記載のような核酸分子によってコードされるキメラＧＡＡポリペプチドも提供する。

【0015】

本発明のさらなる目的は、薬学的に許容される担体に、本発明の核酸分子、本発明の核酸構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、又は本発明のキメラＧＡＡポリペプチドを含む、医薬組成物である。

【0016】

本発明はまた、医薬品としての使用のための、上記のような核酸分子、核酸構築物、ベクター、細胞又はキメラＧＡＡポリペプチドを提供する。

【0017】

本発明はまた、糖原病を処置するための方法に使用するための、上記のような核酸分子、核酸構築物、ベクター、細胞又はキメラＧＡＡポリペプチドも提供する。特定の実施態様では、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型、糖原病ＩＩＩ型、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、又は心臓の致死性先天性糖原病である。より特定の実施態様では、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型、糖原病ＩＩＩ型からなる群より、より特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択される。さらなるより特定の実施態様では、糖原病は糖原病ＩＩ型である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】配列最適化と効果的なシグナルペプチドの組合せは、インビトロにおけるｈＧＡＡの分泌を増加させる。ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を、対照プラスミド（ＧＦＰ）、肝特異的プロモーターの転写制御下にある野生型ｈＧＡＡを発現しているプラスミドを用いてリポフェクタミン（商標）によってトランスフェクトした。ｈＧＡＡ導入遺伝子は、天然シグナルペプチド（ｐＡＡＶ－ＬＳＰ－ｓｐ１－ｈＧＡＡ）又はα－１アンチトリプシンのシグナルペプチド（ｐＡＡＶ－ＬＳＰ－ｓｐ２－ｈＧＡＡ）のいずれかを有していた。ｓｐ１－ｈＧＡＡ及びｓｐ２－ｈＧＡＡをコードしている同ｃＤＮＡも、配列を最適化した（それぞれ、ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｓｐ１－ｈＧＡＡｃｏ１及びｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｓｐ２－ｈＧＡＡｃｏ１）。トランスフェクションから４８時間後、培養培地中のｈＧＡＡの活性を、蛍光発生酵素アッセイによって測定し、組換えｈＧＡＡの標準曲線に対するＧＡＡ活性を評価した。ヒストグラムプロットは、ｓｐ１シグナルペプチドと融合させたｈＧＡＡ又はｈＧＡＡｃｏ１において測定されたレベルに対して標準化された分泌ｈＧＡＡレベルの増加倍数の平均値±標準偏差を示す。３回の異なる実験から導かれたデータ。統計分析は対応のあるｔ検定によって実施された（示されているように^＊＝ｐ＜０．０５）。

【図2】ｈＧＡＡ配列の様々な配列最適化アルゴリズムと効果的なシグナルペプチドの組合せは、インビトロにおける分泌を有意に増加させる。ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を、対照プラスミド（ＧＦＰ）、ｓｐ１シグナルペプチドに融合させた肝特異的プロモーターの転写制御下にある野生型ｈＧＡＡ（ｗｔ）、又はｓｐ２に融合させた２つの異なるアルゴリズムに従って最適化させたｈＧＡＡ配列（それぞれｃｏ１及びｃｏ２）を発現しているプラスミドを用いてリポフェクタミン（商標）によってトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、培養培地中のｈＧＡＡの活性を、蛍光発生酵素アッセイによって測定した。ヒストグラムプロットは、３回の異なる実験から導かれた分泌されたｈＧＡＡのレベルの平均値±標準誤差を示す。統計分析は分散分析によって実施された（ｓｐ１ｗｔに対して^＊＝ｐ＜０．０５）。

【0019】

発明の詳細な説明
本発明の態様は、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一率を有し、機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。配列番号１及び配列番号２は、その前駆体型の天然で野生型のｈＧＡＡポリペプチドをコードしている最適化された核酸配列である（すなわち、それはそのシグナルペプチドを含まないｈＧＡＡをコードしている）。

【0020】

リソソームの酸性αグルコシダーゼすなわち「ＧＡＡ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）（１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ）は、オリゴ糖のα－１，４結合及びα－１，６結合の両方を加水分解することによりグルコースを遊離する、エキソ－１，４－α－Ｄ－グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠損症により、ポンペ病とも呼ばれる糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）が起こる（この用語は正式には乳児期発症型の疾患を指す）。それはグリコーゲンの完全分解を触媒し、分岐点では緩徐である。第１７番染色体上の２８ｋｂのヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子は３．６ｋｂのｍＲＮＡをコードし、これは９５１アミノ酸ポリペプチドを生成する（Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; Martiniuk et al., (1990) DNA and Cell Biology 9: 85）。該酵素は、小胞体において同時翻訳的なＮ結合グリコシル化を受ける。それは１１０ｋＤａの前駆体型として合成され、十分なグリコシル化修飾、リン酸化によって、及びタンパク質分解プロセシングによって約９０ｋＤａのエンドソーム内の中間体を通して最終的なリソソーム内の７６及び６７ｋＤａ型へと成熟する（Hoefsloot, (1988) EMBO J. 7: 1697; Hoefsloot et al., (1990) Biochem. J. 272: 485; Wisselaar et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2223; Hermans et al., (1993) Biochem. J. 289: 681）。

【0021】

糖原病ＩＩ型患者における酸性αグルコシダーゼ欠損症は、リソソーム内のグリコーゲンの大量の蓄積を引き起こし、細胞機能を破壊する（Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001), in The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease, (eds, Scriver, C. R. et al.) pages 3389-3419 (McGraw-Hill, New York）。最も頻度の高い乳児型では、患者は、進行的な筋肉の変性及び心筋症を示し、２歳になる前に死亡する。若年発症型及び成人発症型においては重度な衰弱が存在する。

【0022】

さらに、他の糖原病を有する患者は、最適化された形態のＧＡＡの投与から恩恵を受け得る。例えば、ＧＡＡの投与が、糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩＩ）患者由来の初代筋芽細胞におけるグリコーゲンを減少させることが示されている（Sun et al. (2013) Mol Genet Metab 108(2): 145；国際公開公報第２０１０／００５５６５号）。

【0023】

本明細書において使用する「ＧＡＡ」又は「ＧＡＡポリペプチド」という用語は、成熟した（約７６又は約６７ｋＤａ）及び前駆体の（例えば約１１０ｋＤａ）ＧＡＡ、特に前駆体型のＧＡＡ、並びに、ＧＡＡの機能的誘導体である、すなわち、ＧＡＡの生物学的機能を保持している（すなわち、天然ＧＡＡタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有する、例えば、上記に定義されているようにグリコーゲンを加水分解することができる）改変された又は突然変異した（挿入（群）、欠失（群）及び／又は置換（群）によって）ＧＡＡタンパク質又はその断片及びＧＡＡ変異体（例えば、Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269によって記載されているようなＧＡＡ ＩＩ；ＧＡＡ多型及びＳＮＰは、Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001) In The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease (Scriver, C. R. , Beaudet, A. L., Sly, W. S. & Valle, D. Eds. ), pp. 3389- 3419. McGraw-Hill, New York, see pages 3403-3405によって記載されている）を包含する。当技術分野において公知である任意のＧＡＡコード配列を使用し得、例えば、配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１５２及びHoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697及びVan Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65（ヒト）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８０６４（マウス）、並びにKunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269（ウズラ）を参照されたい。

【0024】

ＧＡＡポリペプチドのコード配列は、トリ及び哺乳動物種をはじめとする任意の入手源から得ることができる。本明細書において使用する「トリ」という用語は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、及びキジを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト、サル、及び他の非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含むがこれらに限定されない。本発明の実施態様では、本発明の核酸は、ヒト、マウス、又はウズラ、特にヒトのＧＡＡポリペプチドをコードする。さらなる特定の実施態様では、本発明の核酸分子によってコードされるＧＡＡポリペプチドは、配列番号１５又は１９に示されるアミノ酸配列を含み、これはそのシグナルペプチドを含まない２つのｈＧＡＡ変異体に相当する（注目すべきは、ｈＧＡＡの天然シグナルペプチドは、配列番号１６又は配列番号１８におけるアミノ酸１～２７に相当し、これはその天然シグナルペプチドを含む以外は配列番号１５及び１９の２つのｈＧＡＡ変異体に相当する）。したがって、本発明の特定の実施態様では、本発明の核酸によってコードされるＧＡＡポリペプチドは、配列番号１９又は配列番号１５のアミノ酸配列に融合した配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

本発明の核酸分子は好ましくは、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一率、特に少なくとも９５％の同一率、例えば少なくとも９８、９９、又は１００％の同一率を有する。

【0026】

本発明の別の実施態様では、本発明の核酸分子は、野生型ｈＧＡＡコード配列の配列である、配列番号３に示される配列のヌクレオチド８２～２８５９に対して少なくとも７５％（例えば少なくとも７７％）、少なくとも８０％又は少なくとも８２％（例えば少なくとも８３％）の同一率を有する（ヌクレオチド１～８１は、ｈＧＡＡの天然シグナルペプチドをコードしている部分である）。

【0027】

「同一な」という用語及びその派生語は、２つの核酸分子間の配列同一性を指す。２つの比較される両方の配列における位置が、同じ塩基によって占められている場合、例えば、２つのそれぞれのＤＮＡ分子における位置がアデニンによって占められている場合、該分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一率は、２つの配列によって共有される一致している位置の数を、比較される位置の数で割り、これに１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列における１０中６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％同一である。一般的に、最大同一率が得られるように２つの配列をアラインさせて比較される。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの、当業者には公知である様々なバイオインフォマティクスツールを使用して、核酸配列をアラインさせることができる。

【0028】

特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に示される核酸配列を含むか、実質的にからなるか、又はからなる、機能的ＧＡＡをコードしている核酸配列を含む。

【0029】

さらに、本発明の核酸分子は、機能的ＧＡＡタンパク質をコードし、すなわち、それは発現されると野生型ＧＡＡタンパク質の機能を有する、ヒトＧＡＡタンパク質をコードしている。上記に定義されているように、野生型ＧＡＡの機能は、オリゴ糖及び多糖、より特定するとグリコーゲンのα－１，４結合及びα－１，６結合の両方を加水分解することによりグルコースを遊離することである。本発明の核酸によってコードされる機能的ＧＡＡタンパク質は、配列番号１～３の核酸配列によってコードされる野生型ＧＡＡタンパク質と比較して、グリコーゲンに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は少なくとも１００％の加水分解活性を有し得る。本発明の核酸によってコードされるＧＡＡタンパク質の活性は、配列番号１～３の核酸配列によってコードされる野生型ＧＡＡタンパク質の活性に対して、１００％を超えることさえあり得、例えば１１０％、１２０％、１３０％、１４０％を超え、又はさらには１５０％を超えることさえあり得る。

【0030】

当業者は、本発明に記載の核酸が機能的ＧＡＡタンパク質を発現するかどうかを容易に決定することができる。適切な方法は、当業者には明らかであろう。例えば、１つの適切なインビトロでの方法は、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターに核酸を挿入する工程、２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞などの宿主細胞又はＨｕｈ７などの他の細胞をベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入する工程、及びＧＡＡ活性についてアッセイする工程を含む。あるいは、適切なインビボでの方法は、核酸を含有しているベクターをポンペ病又は別の糖原病のマウスモデルに形質導入する工程、並びにマウスの血漿中の機能的ＧＡＡ及び組織中のＧＡＡの存在についてアッセイする工程を含む。適切な方法は、以下の実験部においてより詳細に記載されている。

【0031】

本発明者らは、上記の核酸分子が、野生型ＧＡＡ ｃＤＮＡと比較して驚くべき程に高いレベルの機能的ＧＡＡタンパク質の発現を引き起こすことを発見した。このことは、この核酸分子を使用することにより高いレベルのＧＡＡタンパク質を生成し得、ＧＡＡの発現及び／又は活性が欠損している状況、あるいは高い発現レベルのＧＡＡが糖原病などの疾患を寛解することができる状況において、特に関心が持たれることを意味する。特に、糖原病は、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、又は心臓の致死性先天性糖原病であり得る。より特定すると、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択され、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択される。さらにより特定した実施態様では、糖原病は糖原病ＩＩ型である。特に、本発明の核酸分子は、ＧＡＡ欠損容態、又はグリコーゲンの蓄積を伴う他の容態、例えば糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型を処置するための遺伝子療法において有用であり得る。さらにより特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、糖原病ＩＩ型を処置するための遺伝子療法において有用であり得る。

【0032】

機能的ＧＡＡをコードしている本発明の核酸分子の配列は、インビボにおけるＧＡＡポリペプチドの発現のために最適化されている。配列の最適化は、コドン最適化、ＧＣ含量の増加、ＣｐＧアイランドの数の低減、代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数の低減、並びにスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位の数の低減をはじめとする、核酸配列における多くの変化を含み得る。遺伝子コードの縮重のために、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードし得る。また、様々な生物の遺伝子コードは、他のアミノ酸よりも同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの１つを使用することに偏ることが多いことも周知である。コドンの最適化を通して、所与の細胞状況に存在するコドンバイアスを利用した変化をヌクレオチド配列に導入し、これにより、結果として得られたコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、このような所与の細胞状況において、コドンの最適化されていない配列と比較して比較的高いレベルで発現される可能性がより高くなる。本発明の好ましい実施態様では、機能的ＧＡＡをコードしているこのような配列の最適化されたヌクレオチド配列は、例えばヒトに特異的なコドン使用頻度バイアスを利用することによってコドンが最適化されることにより、同じＧＡＡタンパク質をコードしているコドンの最適化されていないヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞におけるその発現が改善されている。

【0033】

特定の実施態様では、最適化されたＧＡＡコード配列は、配列番号３の野生型ｈＧＡＡコード配列のヌクレオチド８２～２８５９と比較して、コドンが最適化されている、並びに／あるいは、増加したＧＣ含量を有する、並びに／あるいは代替オープンリーディングフレームの数が減少している、並びに／あるいはスプライスドナー部位及び／又はスプライスアクセプター部位の数が減少している。例えば、本発明の核酸配列では、野生型ＧＡＡ配列の配列と比較して、ＧＡＡ配列内のＧＣ含量が少なくとも２、３、４、５、又は１０％増加している。特定の実施態様では、本発明の核酸配列では、野生型ＧＡＡヌクレオチド配列の配列と比較して、ＧＡＡ配列内のＧＣ含量は２、３、４、又はより特定すると５％若しくは１０％（特に５％）増加している。特定の実施態様では、機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている本発明の核酸配列は、配列番号３に示される配列のヌクレオチド８２～２８５９に対して「実質的に同一」である、すなわち、約７０％同一、より好ましくは約８０％同一、さらにより好ましくは約９０％同一、さらにより好ましくは約９５％同一、さらにより好ましくは約９７％、９８％、又はさらには９９％同一である。上記のように、ＧＣ含量及び／又はＡＲＦの数に加えて、配列の最適化はまた、配列内のＣｐＧアイランドの数の低減並びに／あるいはスプライスドナー部位及びアクセプター部位の数の低減も含み得る。勿論、当業者には周知であるように、配列の最適化は、これら全てのパラメーター間のバランスであり、このことは、上記の少なくとも１つのパラメーターが改善されていれば、他のパラメーターの１つ以上が改善されていなくても、最適化された配列により、インビボにおける導入遺伝子の改善、例えば改善された発現及び／又は導入遺伝子に対する免疫応答の低減などがもたらされる限り、配列は最適化されたと考えられ得ることを意味する。

【0034】

さらに、ヒト細胞のコドン使用頻度に対する、機能的ＧＡＡをコードしているヌクレオチド配列の適応性は、コドン適応指標（codon adaptation index）（ＣＡＩ）として表現され得る。コドン適応指標は本明細書において、高度に発現されているヒト遺伝子のコドン使用頻度に対する、遺伝子のコドン使用頻度の相対的適応性の尺度として定義される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、同じアミノ酸に対する最も豊富なコドンの使用頻度に対する、各コドンの使用頻度の比である。ＣＡＩは、これらの相対的な適応値の幾何学的平均値として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝子コードに依存）は除外される。ＣＡＩ値の範囲は０～１であり、より高い数値は、最も豊富なコドンの比率がより高いことを示す（Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295参照； Kim et al, Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede et al, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635も参照）。好ましくは、ＧＡＡをコードしている核酸分子は、少なくとも０．７５（特に０．７７）、０．８、０．８５、０．９０、０．９２、又は０．９４のＣＡＩを有する。

【0035】

１つの実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、０～５０、０～３０、０～２０、０～１５、０～１０、又は０～５個のアミノ酸変化を有するタンパク質をコードしている。さらに、本発明の核酸によってコードされるＧＡＡタンパク質は、当技術分野において公知であるＧＡＡ変異体であり得、ここでの本発明の核酸分子は、当技術分野において公知であるＧＡＡタンパク質に対して０～５０、０～３０、０～２０、０～１５、０～１０、又は０～５個のアミノ酸変化を有するタンパク質をコードしている。ＧＡＡタンパク質の機能的変異体を設計するための基盤としての役目を果たし得る、当技術分野において公知であるこのようなＧＡＡタンパク質は特に、ＵｎｉｐｒｏｔへのＧＡＡの登録に見られ得る（アクセッション番号Ｐ１０２５３；ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６８７６３．１に対応；配列番号１６）。さらなる特定の実施態様では、本発明の核酸配列のＧＡＡ部分は、変異ＧＡＡポリペプチド、又は本明細書において定義されているようなこのようなペプチドの機能的変異体、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５２５０６．１（配列番号２０）、ＥＡＷ８９５８３．１（配列番号２１）及びＡＢＩ５３７１８．１（配列番号２２）として同定されたポリペプチドからなる群より選択されたものをコードしている。他の変異ＧＡＡポリペプチドとしては、国際公開公報第２０１２／１４５６４４号、国際公開公報第００／３４４５１号及び米国特許第６，８５８，４２５号に記載のものが挙げられる。特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１６又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列から誘導された親ＧＡＡポリペプチドをコードしている。

【0036】

特定の実施態様では、本発明の核酸分子によってコードされるＧＡＡポリペプチドは機能的ＧＡＡであり、配列番号１６又は配列番号１８に示されるｈＧＡＡタンパク質のアミノ酸残基２８～９５２に対して、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、９０％、９５％、より特定すると少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一率を有する。特定の実施態様では、本発明の核酸分子によってコードされるＧＡＡタンパク質は、配列番号１６又は配列番号１８のアミノ酸残基２８～９５２の配列を有する。

【0037】

「核酸配列」（又は核酸分子）という用語は、本発明に記載のＧＡＡポリペプチドをコードしている、一本鎖又は二本鎖の形態のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、特にＤＮＡを指す。

【0038】

本発明はまた、ＧＡＡポリペプチドに連結されたｈＡＡＴシグナルペプチドを含む、キメラの機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子にも関する。

【0039】

特に、本発明者らはさらに驚くべきことに、配列最適化とシグナルペプチドの置換の組合せにより、機能的タンパク質のより高い発現レベルの生成及びより高い分泌が生じることを示した。それ故、本発明の核酸分子は、キメラＧＡＡポリペプチドをコードし得、ここでの該核酸分子は、２つの部分を含む：
－シグナルペプチドをコードしている部分（別名「シグナルペプチド部分」とも呼ばれる）、及び
－上記に定義されているような機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている部分。

【0040】

本発明の核酸分子によってコードされるキメラＧＡＡポリペプチドでは、シグナルペプチド部分は、ｈＡＡＴタンパク質のシグナルペプチドをコードしている。特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、ＧＡＡポリペプチドに作動可能に連結させたｈＡＡＴのシグナルペプチドを含む、キメラＧＡＡポリペプチドをコードしている最適化された配列であり得る。

【0041】

野生型ＧＡＡポリペプチドと比較して、野生型ＧＡＡの内因性シグナルペプチドは、外因性シグナルペプチド、すなわち、ｈＡＡＴのシグナルペプチドであるＧＡＡとは異なるタンパク質に由来するシグナルペプチドを用いて置換されている。ＧＡＡタンパク質の残りに融合させた外因性シグナルペプチドは、その天然シグナルペプチドを含む対応するＧＡＡポリペプチドと比較して、結果として得られたキメラＧＡＡポリペプチドの分泌を増加させる。さらに、本発明の特定の実施態様によると、ｈＡＡＴタンパク質のシグナルペプチドに対応するヌクレオチド配列は、上記に提供されているような最適化された配列であり得る。

【0042】

細胞から分泌される新規に合成されたＧＡＡの相対的比率は、当技術分野において公知であり実施例に記載されているような方法によって慣用的に決定され得る。分泌されたタンパク質は、細胞培養培地、血清、ミルクなどの中の、タンパク質それ自体を直接測定することによって（例えばウェスタンブロットによって）又はタンパク質活性アッセイ（例えば酵素アッセイ）によって検出され得る。

【0043】

当業者はさらに、例えば、制限酵素部位の付加などの核酸構築物の操作の結果として、これらの追加のアミノ酸によりシグナルペプチド又はＧＡＡポリペプチドが非機能的とならない限り、キメラＧＡＡポリペプチドは追加のアミノ酸を含有することができることを理解するだろう。追加のアミノ酸は切断されても、又は、保持することで非機能的なポリペプチドとならない限り、成熟ポリペプチドによって保持されていてもよい。

【0044】

本発明はまた、本発明の核酸分子を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、１つ以上の発現制御配列、及び／又は導入遺伝子の発現を改善する他の配列、及び／又はコードされているタンパク質の分泌を増強する配列、及び／又はコードされているタンパク質の取り込みを増強する配列に作動可能に連結させた、本発明の核酸配列を含む、発現カセットに対応し得る。本明細書において使用する「作動可能に連結された」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチド配列の連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーター、又は別の転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に作動可能に連結されている。このような発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー（例えばシス調節モジュール（ＣＲＭ））、イントロン、ポリＡシグナルなどは当技術分野において公知である。

【0045】

特に、発現カセットは、プロモーターを含み得る。該プロモーターは、遍在的又は組織特異的プロモーター、特にＧＡＡの発現が望ましい細胞又は組織、例えばＧＡＡ欠損患者においてＧＡＡの発現が望ましい細胞又は組織において発現を促進することのできるプロモーターであり得る。特定の実施態様では、該プロモーターは、肝特異的プロモーター、例えばα－１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号５）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＬＳＰプロモーター（甲状腺ホルモン結合性グロブリンプロモーター配列、２コピーのα１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー配列、及びリーダー配列を含む、34.Ill, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30）などである。他の有用な肝特異的プロモーターも当技術分野において公知であり、例えば、コールドスプリングハーバーラボラトリーの編纂した肝特異的遺伝子プロモーターデータベース（http://rulai.cshl.edu/LSPD/）に列挙されているものなどである。本発明の脈絡における好ましいプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターである。別の実施態様では、該プロモーターは、関心対象のある組織又は細胞（例えば筋肉細胞）及び肝細胞における発現を指令するプロモーターである。例えば、ある程度までは、デスミン、Ｓｐｃ５－１２、及びＭＣＫプロモーターなどの筋肉細胞に特異的なプロモーターは、肝細胞への幾分の発現の漏出を呈し得、これは、本発明の核酸から発現されるＧＡＡタンパク質に対する被験者の免疫寛容を誘導するのに有益であり得る。

【0046】

他の組織特異的なプロモーター又は組織特異的ではないプロモーターも本発明の実施に有用であり得る。例えば、発現カセットは、肝特異的プロモーターとは異なるプロモーターである組織特異的プロモーターを含み得る。例えば、該プロモーターは、筋肉特異的プロモーター、例えばデスミンプロモーター（及びデスミンプロモーター変異体、例えば天然又は人工のエンハンサーを含むデスミンプロモーター）、ＳＰｃ５－１２又はＭＣＫプロモーターであり得る。別の実施態様では、該プロモーターは、他の細胞系統に特異的なプロモーター、例えば赤血球系統の細胞に由来するＧＡＡポリペプチドの発現のためのエリスロポエチンプロモーターである。

【0047】

別の実施態様では、該プロモーターは偏在性プロモーターである。代表的な偏在性プロモーターとしては、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなどが挙げられる。

【0048】

さらに、該プロモーターはまた、内因性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター又はＧＡＡプロモーターであり得る。

【0049】

特定の実施態様では、該プロモーターは、エンハンサー配列、例えばシス調節モジュール（ＣＲＭ）又は人工エンハンサー配列に結合している。例えば、該プロモーターは、エンハンサー配列、例えばヒトＡｐｏＥ制御領域（又はヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ－Ｉ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ－１－Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２５１０、配列番号６に示される）に結合していてもよい。特定の実施態様では、ＡｐｏＥ配列などのエンハンサー配列は、肝特異的プロモーター、例えば上記に列挙されているプロモーター、特に例えばｈＡＡＴプロモーターに結合している。本発明の実施に有用な他のＣＲＭとしては、Rincon et al., Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52, Chuah et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13又はNair et al., Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9に記載のものが挙げられる。

【0050】

別の特定の実施態様では、核酸構築物は、イントロン、特にプロモーターとＧＡＡコード配列の間に配置されたイントロンを含む。イントロンは、ｍＲＮＡの安定性及びタンパク質の生成を増加させるために導入され得る。さらなる実施態様では、核酸構築物は、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）イントロン、ＳＶ４０イントロン、又はニワトリβ－グロビンイントロンを含む。別のさらなる実施態様では、本発明の核酸構築物は、該イントロンに見られる代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるために又はさらには完全に除去するために設計された改変されたイントロン（特に改変されたＨＢＢ２又はＦＩＸイントロン）を含有している。好ましくは、その長さが５０ｂｐにわたり、開始コドンを有する読み枠内に終始コドンを有するＡＲＦが除去される。ＡＲＦは、イントロンの配列を改変することによって除去されてもよい。例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失を用いて、好ましくはヌクレオチドの置換によって改変が行なわれ得る。一例として、関心対象のイントロン配列に存在するＡＴＧ又はＧＴＧ開始コドンにおける１つ以上のヌクレオチド、特に１つのヌクレオチドを置換することにより、非開始コドンがもたらされ得る。例えば、ＡＴＧ又はＧＴＧを、関心対象のイントロンの配列内の、開始コドンではない、ＣＴＧによって置換し得る。

【0051】

核酸構築物に使用される古典的なＨＢＢ２イントロンを配列番号７に示す。例えば、このＨＢＢ２イントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、構築物に含まれる改変されたＨＢＢ２イントロンは、配列番号８に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なＦＩＸイントロンは、ヒトＦＩＸの第一イントロンから得られ、配列番号９に示されている。ＦＩＸイントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたＦＩＸイントロンは、配列番号１０に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なニワトリ－βグロビンイントロンは、配列番号１１に示される。ニワトリ－βグロビンイントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたニワトリ－βグロビンイントロンは、配列番号１２に示される配列を有する。

【0052】

本発明者らは以前に、国際公開公報第２０１５／１６２３０２号において、このような改変されたイントロン、特に改変されたＨＢＢ２イントロン又はＦＩＸイントロンが有益な特性を有し、導入遺伝子の発現を有意に改善させることができることを示した。

【0053】

特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、場合によりエンハンサーが前に存在するプロモーター、本発明のコード配列（すなわち、最適化された本発明のＧＡＡコード配列、本発明のキメラＧＡＡコード配列、または本発明のキメラかつ最適化されたＧＡＡコード配列）、及びポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、又は別の天然に存在するか若しくは人工のポリアデニル化シグナル）を含む、発現カセットである。特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、場合によりエンハンサー（例えばＡｐｏＥ制御領域）が前に存在するプロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。さらなる特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥ制御領域などのエンハンサー、プロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。本発明のさらなる特定の実施態様では、発現カセットは、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥ制御領域、ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター、ＨＢＢ２イントロン（特に上記に定義されているような改変されたＨＢＢ２イントロン）、本発明のコード配列、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、例えばそれぞれ配列番号１及び配列番号２の配列の最適化されたＧＡＡ核酸分子を含む配列番号１３及び配列番号１４に示される核酸構築物を含む。

【0054】

特定の実施態様では、発現カセットは、ＡｐｏＥ制御領域、ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター、コドン最適化ＨＢＢ２イントロン、本発明のコード配列、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。

【0055】

本発明の核酸構築物の設計の際に、当業者は、該構築物を細胞又は器官に送達するために使用されるベクターのサイズ限界を配慮することに気を付けるだろう。特に、当業者は、ＡＡＶベクターの主な限界はその積載能であり、これはＡＡＶ血清型によって異なり得るが、ほぼ親ウイルスゲノムのサイズが限界であると考えられている。例えば、５ｋｂが、ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされると通常考えられている最大のサイズである。（Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33）。したがって、当業者は、本発明の実施の際に、ＡＡＶ５’－及び３’－ＩＴＲをコードしている配列を含む、結果として得られる核酸配列が、装備されるＡＡＶベクターの積載能の好ましくは１１０％を超えないように、特に好ましくは５．５ｋｂを超えないように、本発明の核酸構築物の成分を選択するように気を付けるだろう。

【0056】

本発明はまた、本明細書に開示されているような核酸分子又は構築物を含むベクターにも関する。特に、本発明のベクターは、タンパク質の発現に、好ましくは遺伝子療法に使用するのに適したベクターである。１つの実施態様では、該ベクターはプラスミドベクターである。別の実施態様では、該ベクターは、本発明の核酸分子、特に本発明のＧＡＡポリペプチドをコードしているメッセンジャーＲＮＡを含有している、ナノ粒子である。別の実施態様では、該ベクターは、活動亢進スリーピングビューティ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゾン系（Mates et al. 2009）などの、標的細胞のゲノム内への本発明の核酸分子又は構築物の組み込みを可能とする、トランスポゾンに基づいた系である。別の実施態様では、該ベクターは、肝組織又は肝細胞、筋肉細胞、ＣＮＳ細胞（例えば脳細胞）、又は造血幹細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば赤血球）などの関心対象の任意の細胞を標的化する、遺伝子療法に適したウイルスベクターである。この場合、本発明の核酸構築物は、当技術分野において周知であるような、効果的なウイルスベクターを生成するのに適した配列も含有している。特定の実施態様では、該ウイルスベクターは、組込み用ウイルスから得られる。特に、該ウイルスベクターは、レトロウイルス又はレンチウイルスから誘導され得る。さらなる特定の実施態様では、該ウイルスベクターはＡＡＶベクター、例えば肝組織又は肝細胞を形質導入するのに適したＡＡＶベクター、より特定するとＡＡＶ－１、－２及びＡＡＶ－２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ－２）、ＡＡＶ－３及びＡＡＶ－３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴ変異体）、ＡＡＶ－３Ｂ及びＡＡＶ－３Ｂ変異体、ＡＡＶ－４、－５、－６、及びＡＡＶ－６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ－７、－８、－９、－１０、例えばＡＡＶ－ｃｙ１０及び－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６などのベクター又はレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター及びα－レトロウイルスである。当技術分野において公知であるように、使用するのに考えられる具体的なウイルスベクターに応じて、追加の適切な配列が、機能的なウイルスベクターを得るために本発明の核酸構築物に挿入されるだろう。適切な配列としては、ＡＡＶベクター用のＡＡＶ ＩＴＲ、又はレンチウイルスベクター用のＬＴＲが挙げられる。したがって、本発明はまた、それぞれの側においてＩＴＲ又はＬＴＲによってフランキングされた、上記のような発現カセットにも関する。

【0057】

ウイルスベクターの利点は、この開示の以下の部分において考察されている。ウイルスベクターが、本発明の核酸分子又は構築物を送達するのに好ましく、例えば、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又は非病原性パルボウイルス、より好ましくはＡＡＶベクターがある。ヒトパルボウイルスアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、感染した細胞のゲノムに組み込むことにより潜伏感染を確立することのできる、天然では複製欠損であるディペンドウイルスである。最後の特性は、哺乳動物ウイルスの中では独特なようである。なぜなら、組込みが、第１９番染色体（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）上に位置するＡＡＶＳ１と呼ばれるヒトゲノム内の特定の部位で起こるからである。

【0058】

それ故、ＡＡＶベクターは、ヒト遺伝子療法のためのベクター候補としてかなりの関心を集めた。ウイルスの好ましい特性には、あらゆるヒト疾患を伴わないこと、分裂中の細胞及び分裂していない細胞の両方に感染することができること、及び様々な組織に由来する多種多様な細胞株に感染することができることがある。

【0059】

ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され十分に特徴付けられたＡＡＶの血清型の中で、ヒト血清型２は、遺伝子導入用ベクターとして開発された最初のＡＡＶである。他の現在使用されているＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ－２）、ＡＡＶ－３及びＡＡＶ－３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴ変異体）、ＡＡＶ－３Ｂ及びＡＡＶ－３Ｂ変異体、ＡＡＶ－４、－５、－６、及びＡＡＶ－６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ－７、－８、－９、－１０、例えばＡＡＶ－ｃｙ１０及び－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６、並びにチロシン、リジン、及びセリンキャプシド突然変異体のＡＡＶ血清型などが挙げられる。さらに、他の非天然の工学操作された変異体及びキメラＡＡＶも有用であり得る。

【0060】

ＡＡＶウイルスを慣用的な分子生物学技術を使用して工学操作し得、これにより、核酸配列を細胞特異的に送達するために、免疫原性を最小限とするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効果的な分解のために、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することが可能となる。

【0061】

ベクターへの構築のための望ましいＡＡＶ断片は、キャップタンパク質（ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３を含む）及び超可変領域、ｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含む）及びこれらのタンパク質をコードしている配列を含む。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用され得る。

【0062】

Ｒｅｐタンパク質を欠失しているＡＡＶ系組換えベクターは、低い効率で宿主のゲノムに組み込み、標的細胞内で数年間におよび持続し得る安定な環状エピソームとして主に存在する。ＡＡＶ天然血清型を使用する代わりに、天然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを含むがこれに限定されない、人工的なＡＡＶ血清型を本発明の脈絡において使用し得る。このような人工的なキャプシドは、選択された異なるＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続的部分から、ＡＡＶではないウイルス入手源から、又はウイルスではない入手源から得ることのできる異種配列と組み合わせた、選択されたＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を使用して、任意の適切な技術によって作製され得る。人工的なＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得るがこれらに限定されない。

【0063】

したがって、本発明は、本発明の核酸分子又は構築物を含むＡＡＶベクターに関する。本発明の脈絡において、ＡＡＶベクターは、関心対象の標的細胞、特に肝癌細胞に形質導入することのできるＡＡＶキャプシドを含む。特定の実施態様によると、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、－２、ＡＡＶ－２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ－２）、ＡＡＶ－３及びＡＡＶ－３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴ変異体）、ＡＡＶ－３Ｂ及びＡＡＶ－３Ｂ変異体、ＡＡＶ－４、－５、－６、及びＡＡＶ－６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ－７、－８、－９、－１０、例えばＡＡＶ－ｃｙ１０及び－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６、並びにチロシン、リジン、及びセリンキャプシド突然変異体のＡＡＶ血清型などのものである。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型のものである（すなわち、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型のキャプシドを有する）。さらなる特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは偽型ベクターであり、すなわち、そのゲノム及びキャプシドは、異なる血清型のＡＡＶに由来する。例えば、偽型ＡＡＶベクターは、そのゲノムが上記の１つのＡＡＶ血清型に由来し、そのキャプシドが別の血清型に由来する、ベクターであり得る。例えば、偽型ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型に由来するキャプシドを有し得、そのゲノムは異なる血清型に由来し得る。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４血清型、特にＡＡＶ８又はＡＡＶ９血清型、より特定するとＡＡＶ８血清型のキャプシドを有する。

【0064】

ベクターは、導入遺伝子を筋肉細胞に送達するのに使用するためのものである具体的な実施態様では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群より選択され得る。ベクターは、導入遺伝子を肝細胞に送達するのに使用するためのものである別の具体的な実施態様では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０及びＡＡＶ３Ｂからなる群より選択され得る。

【0065】

別の実施態様では、キャプシドは改変されたキャプシドである。本発明の脈絡において、「改変されたキャプシド」は、キメラキャプシド、又は１つ以上の野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質に由来する１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質を含むキャプシドであり得る。

【0066】

特定の実施態様では、ＡＡＶベクターはキメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰキャプシドタンパク質を含むか、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域若しくはドメインと組み合わせた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。肝細胞を形質導入するのに有用なこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、Shen et al., Molecular Therapy, 2007及びTenney et al., Virology, 2014に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシド配列と、ＡＡＶ８血清型とは異なるＡＡＶ血清型の配列、例えば上記に具体的に記載されているもののいずれかとの組合せから得ることができる。別の実施態様では、ＡＡＶベクターのキャプシドは、国際公開公報第２０１５０１３３１３号に記載のものなどの１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質、特に、高い肝指向性を示す、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４及びＲＨＭ１５－６キャプシド変異体を含む。

【0067】

別の実施態様では、改変されたキャプシドはまた、エラープローンＰＣＲ及び／又はペプチド挿入（例えばBartel et al., 2011に記載のような）によって挿入されたキャプシド改変に由来し得る。さらに、キャプシド変異体は、チロシン突然変異体などの単一アミノ酸変化を含み得る（例えば、Zhong et al., 2008に記載のような）。

【0068】

さらに、ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれかであり得る（McCarty et al., Gene Therapy, 2003）。自己相補性二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復配列の１つから末端解離部位（ｔｒｓ）を欠失させることによって作製される。これらの改変されたベクター（その複製ゲノムは、野生型ＡＡＶゲノムの半分の長さである）は、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向を有する。好ましい実施態様では、本発明の実施に装備されるＡＡＶベクターは一本鎖ゲノムを有し、さらに好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含む。

【0069】

特に好ましい実施態様では、本発明は、一本鎖又は二本鎖の自己相補性ゲノム（例えば一本鎖ゲノム）に、本発明の核酸構築物を含む、ＡＡＶベクターに関する。１つの実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含む。さらなる特定の実施態様では、該核酸は、プロモーター、特に偏在性プロモーター又は肝特異的プロモーターに作動可能に連結されている。特定の変異体の実施態様によると、該プロモーターは、遍在性プロモーター、例えばサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーターである。特定の変異体では、該偏在性プロモーターはＣＡＧプロモーターである。別の変異体によると、該プロモーターは肝特異的プロモーター、例えばα－１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。特定の変異体では、肝特異的プロモーターは、配列番号５のｈＡＡＴ肝特異的プロモーターである。さらなる特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクターのゲノムに含まれる核酸構築物はさらに、上記のようなイントロン、例えばプロモーターと、ＧＡＡコード配列をコードしている核酸配列（すなわち、本発明の最適化されたＧＡＡコード配列、本発明のキメラＧＡＡコード配列、または本発明のキメラかつ最適化されたＧＡＡコード配列）との間に配置されたイントロンを含む。ＡＡＶベクターゲノム内に導入された核酸構築物内に含まれ得る代表的なイントロンとしては、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、及びニワトリβ－グロビンイントロンが挙げられるがこれらに限定されない。ＡＡＶベクターのゲノム内の該イントロンは、古典的な（すなわち改変されていない）イントロンであっても、又は、該イントロン内の代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるために若しくはさらには完全に除去するために設計された改変されたイントロンであってもよい。本発明の核酸がＡＡＶベクター内に導入されている、この実施態様の実施に使用され得る、改変されたイントロン及び改変されていないイントロンは、上記に徹底的に記載されている。特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含むＡＡＶベクターは、そのゲノム内に、改変された（すなわち最適化された）イントロン、例えば配列番号８の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１０の改変されたＦＩＸイントロン、及び配列番号１２の改変されたニワトリβ－グロビンイントロンを含む。さらなる特定の実施態様では、本発明のベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含み、５’から３’の方向に、ＡＡＶ ５’－ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ）；ＡｐｏＥ制御領域；ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター；ＨＢＢ２イントロン（特に上記に定義されているような改変されたＨＢＢ２イントロン）；本発明のＧＡＡコード配列；ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；及びＡＡＶ ３’－ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ）を含有しているゲノム、例えばＡＡＶ ５’－ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ）及びＡＡＶ ３’－ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ）によってフランキングされている配列番号１３に示される核酸構築物を含むゲノムを含む、ＡＡＶベクターである。

【0070】

本発明の特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、上記のような肝特異的プロモーターを含み、該ベクターは、上記のような肝組織又は肝細胞を形質導入することのできるウイルスベクターである。この実施態様のお蔭で、肝癌細胞において分泌可能な形態のＧＡＡを発現させ、かつタンパク質に対する免疫寛容を誘発するための高度に効果的かつ最適化されたベクターを開発する際に、肝臓の免疫寛容誘発特性及び代謝特性が有利には装備される。

【0071】

さらに、さらなる特定の実施態様では、本発明は、関心対象の細胞における遺伝子送達及び処置効力を改善するための、２つのベクター、例えば２つのウイルスベクター、特に２つのＡＡＶベクターの組合せを提供する。例えば、２つのベクターは、これらの２つのそれぞれのベクター内に、１つの異なるプロモーターの制御下にある、本発明のＧＡＡタンパク質をコードしている本発明の核酸分子を有し得る。特定の実施態様では、一方のベクターは、肝特異的プロモーターであるプロモーター（例えば上記のようなものの１つ）を含み、他方のベクターは、糖原病の処置のための関心対象の別の組織に特異的であるプロモーター、例えば筋肉特異的プロモーター、例えばデスミンプロモーターを含む。この実施態様の特定の変異体では、このベクターの組合せは、国際公開公報第２０１５１９６１７９号に記載のように作製された、複数の共パッケージングされたＡＡＶベクターに相当する。

【0072】

別の態様では、本発明はキメラＧＡＡポリペプチドを提供し、ここでの天然に存在するＧＡＡシグナルペプチドは、ｈＡＡＴタンパク質のシグナルペプチドで置換されている。特定の実施態様では、キメラＧＡＡポリペプチドは、配列番号１７に示された配列を有するか、又は、配列番号１７に示された配列に対して少なくとも９０％の同一率、特に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一率を有するその機能的誘導体である。

【0073】

本発明はまた、エクスビボにおける遺伝子療法の場合と同様に、本発明の核酸分子又は構築物を用いて形質転換された細胞、例えば肝細胞に関する。本発明の細胞は、それを必要とする被験者、例えばＧＡＡ欠損患者に、任意の適切な投与経路によって、例えば該被験者の肝臓又は血流への注射を介して送達され得る。特定の実施態様では、本発明は、本発明の核酸を、肝細胞、特に処置される予定の被験者の肝細胞に導入する工程、及び該核酸が導入されている形質転換された該肝細胞を被験者に投与する工程を含む。有利には、この実施態様は、該細胞からＧＡＡを分泌するのに有用である。特定の実施態様では、肝細胞は、処置される予定の患者に由来する肝細胞であるか、又は、患者へのその後の投与のために、さらに形質転換されそしてインビトロにおいて肝細胞へと分化させた肝幹細胞である。

【0074】

本発明はさらに、そのゲノム内に、本発明に記載のＧＡＡタンパク質をコードしている核酸分子又は構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物に関する。特定の実施態様では、動物はマウスである。

【0075】

以下の実施例において具現化された具体的な送達システムとは別に、様々な送達システムが知られており、これを使用して本発明の核酸分子又は構築物を投与することができ、例えば、本発明のコード配列を発現することのできる組換え細胞をリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内に封入、受容体媒介エンドサイトーシス、レトロウイルス若しくは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などがある。

【0076】

１つの実施態様によると、本発明のキメラＧＡＡポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、又は細胞を被験者の肝臓に任意の適切な経路によって導入することが望ましくあり得る。さらに、ミニサークル及びトランスポゾンなどの裸ＤＮＡを、送達又はレンチウイルスベクターのために使用することができる。さらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を使用して、本発明のコード配列を送達することもできる。

【0077】

本発明はまた、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド、又は細胞を含む、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の治療薬（本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞）及び薬学的に許容される担体を含む。具体的な実施態様では、「薬学的に許容される」という用語は、動物及びヒトへの使用について、米国政府若しくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は米国薬局方若しくは欧州薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指し、これと共に治療薬が投与される。このような薬学的担体は、無菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物油、植物油、又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には水が好ましい担体である。食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射液用に使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

【0078】

所望であれば、該組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤も含有し得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの剤形をとり得る。経口用製剤は、標準的な担体、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、治療有効量の治療薬、好ましくは精製形の治療薬を、適切な量の担体と一緒に含有することにより、被験者への適切な投与のための剤形を提供するだろう。特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、リン酸緩衝食塩水を含みかつ０．２５％のヒト血清アルブミンの補充された組成物に製剤化される。別の特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター、又は細胞は、乳酸リンゲル液及び非イオン性界面活性剤、例えばプルロニックＦ６８を、全組成物の重量に対して、０．０１～０．０００１％の最終濃度で、例えば０．００１％の濃度で含む組成物に製剤化される。該製剤はさらに、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、例えば０．２５％のヒト血清アルブミンを含み得る。保存又は投与のいずれかのための他の適切な製剤は当技術分野において、特に国際公開公報第２００５／１１８７９２号又はAllay et al., 2011から公知である。

【0079】

好ましい実施態様では、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として慣用的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張緩衝水溶液中の溶液である。必要であれば、該組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位における疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。

【0080】

１つの実施態様では、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞は、小胞で、特にリポソームで送達され得る。さらに別の実施態様では、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞は、放出制御システムで送達され得る。

【0081】

本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞の投与法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、投与は、静脈内又は筋肉内経路を介する。本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞（ベクター化されていようがいまいが）は、任意の簡便な経路によって、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜裏打ち（例えば口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸管粘膜など）を通した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身性であっても、局所的であってもよい。

【0082】

具体的な実施態様では、本発明の医薬組成物を処置の必要な領域、例えば肝臓に局所的に投与することが望ましくあり得る。これは、例えば、埋込剤を用いることによって成し遂げられ得、該埋込剤は、多孔性、無孔性、又はゲル状材料、例えば膜、例えばシリコンゴム膜、又は繊維である。

【0083】

糖原病の処置に有効であろう本発明の治療薬（すなわち、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞）の量は、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビボ及び／又はインビトロアッセイを場合により使用することにより、至適用量範囲を予測するのを補助し得る。製剤中に使用される予定の正確な用量はまた、投与経路及び疾患の深刻度にも依存し、医師の判断及び各患者の環境に従って決断されるべきである。それを必要とする被験者に投与される、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド又は細胞の用量は、投与経路、処置される具体的な疾患、被験者の年齢、又は治療効果を得るために必要とされる発現レベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に基づいて変更されるだろう。当業者は、この分野におけるその知識に基づいて、これらの因子及びその他の因子に基づいて必要とされる用量範囲を容易に決定することができる。被験者にＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを投与する工程を含む処置の場合、ベクターの典型的な用量は、体重１kgあたり少なくとも１×１０^８個のベクターゲノム（vg/kg）、例えば少なくとも１×１０^９vg/kg、少なくとも１×１０^１０vg/kg、少なくとも１×１０^１１vg/kg、少なくとも１×１０^１２vg/kg、少なくとも１×１０^１３vg/kg、又は少なくとも１×１０^１４vg/kgである。

【0084】

本発明はまた、治療有効量の本発明の核酸、ベクター、キメラポリペプチド、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む、糖原病を処置するための方法にも関する。

【0085】

本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、導入遺伝子に対して（すなわち本発明のキメラＧＡＡポリペプチドに対して）全く免疫応答を誘発しないか、又は、導入遺伝子に対して低減された免疫応答を誘発し、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む。本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞の、それを必要とする被験者への反復投与を含む。この態様では、本発明の核酸分子又は核酸構築物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含み、これにより、それから生成された発現されたキメラＧＡＡポリペプチドに対する免疫寛容が可能となる。同様に、この態様では、この態様において使用される医薬組成物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含む核酸分子又は核酸構築物を含む。肝細胞の送達の場合、該細胞は、処置を必要とする被験者から事前に回収され、その中に本発明の核酸分子又は核酸構築物を導入することによって、それらが本発明のキメラＧＡＡポリペプチドを生成することを可能とするように工学操作された細胞であり得る。反復投与を含む態様における１つの実施態様によると、該投与は、少なくとも１回以上繰り返され得、さらには週１回、月１回、又は年１回などの周期的計画に従って実施されることが考えられ得る。周期的計画はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年間毎に１回、又は１０年間以上毎に１回の投与も含み得る。別の特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターの各投与の投与は、それぞれの連続した投与について異なるウイルスを使用して実施され、これにより、以前に投与されたウイルスベクターに対する起こり得る免疫応答による効力の減少は回避される。例えば、ＡＡＶ８キャプシドを含むウイルスベクターの１回目の投与に続いて、ＡＡＶ９キャプシドを含むベクターの投与が行なわれ得、又はさらにはレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクターなどのＡＡＶに関連性のないウイルスの投与が行なわれ得る。

【0086】

本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、導入遺伝子に対して（すなわち本発明のキメラＧＡＡポリペプチドに対して）全く免疫応答を誘発しないか、又は、導入遺伝子に対して低減された免疫応答を誘発し、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む。導入遺伝子を使用して高いレベルのＧＡＡタンパク質を生成し得、免疫抑制剤による処置に頼ることを回避する、低用量の免疫抑制剤による処置を可能とする、及びそれを必要とする被験者への本発明の核酸分子の反復投与を可能とするなどの治療利点を提供する。それ故、本発明の核酸分子は、ＧＡＡタンパク質が免疫応答を誘発するか又はＧＡＡの発現及び／若しくは活性が欠損している状況、あるいは、ＧＡＡの高い発現レベルが糖原病などの疾患を寛解することができる状況において特に関心が持たれる。本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞の、それを必要とする被験者への反復投与を含む。この態様では、本発明の核酸分子又は核酸構築物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含み、これにより、それから生成された発現されたキメラＧＡＡポリペプチドに対する免疫寛容が可能となる。同様に、この態様では、この態様において使用される医薬組成物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含む核酸分子又は核酸構築物を含む。肝細胞の送達の場合、該細胞は、処置を必要とする被験者から事前に回収され、その中に本発明の核酸分子又は核酸構築物を導入することによって、それらが本発明のキメラＧＡＡポリペプチドを生成することを可能とするように工学操作された細胞であり得る。反復投与を含む態様における１つの実施態様によると、該投与は、少なくとも１回以上繰り返され得、さらには週１回、月１回、又は年１回などの周期的計画に従って実施されることが考えられ得る。周期的計画はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年間毎に１回、又は１０年間以上毎に１回の投与も含み得る。別の特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターの各投与の投与は、それぞれの連続した投与について異なるウイルスを使用して実施され、これにより、以前に投与されたウイルスベクターに対する起こり得る免疫応答による効力の減少は回避される。例えば、ＡＡＶ８キャプシドを含むウイルスベクターの１回目の投与に続いて、ＡＡＶ９キャプシドを含むベクターの投与が行なわれ得、又はさらにはレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクターなどのＡＡＶに関連性のないウイルスの投与が行なわれ得る。

【0087】

本発明によると、処置は、治癒効果、寛解効果、又は予防効果を含み得る。したがって、治療処置及び予防処置は、特定の糖原病の症状の寛解、又は特定の糖原病を発症するリスクの予防若しくはさもなくば低減を含む。「予防」という用語は、特定の容態の重症度又は発症を低減させることと考えられ得る。「予防」はまた、容態を有すると事前に診断された患者における特定の容態の再発を予防することも含む。「治療」はまた、既存の容態の重症度を低減させ得る。「処置」という用語は本明細書において、動物、特に哺乳動物、より特定するとヒト被験者に恩恵をもたらし得る任意の処方計画を指すために使用される。

【0088】

本発明はまた、本発明の核酸分子又は核酸構築物を、それを必要とする患者の単離された細胞、例えば単離された造血幹細胞に導入する工程、及び該細胞をそれを必要とする該患者に導入する工程を含む、糖原病の処置のためのエクスビボにおける遺伝子療法に関する。この態様の特定の実施態様では、核酸分子又は構築物は、上記に定義されているようなベクターを用いて細胞に導入される。特定の実施態様では、ベクターは組込み用ウイルスベクターである。さらなる特定の実施態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。例えば、van Til et al., 2010, Blood, 115(26), p. 5329に開示されているようなレンチウイルスベクターを、本発明の方法における実施に使用し得る。

【0089】

本発明はまた、医薬品としての使用のための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド、又は細胞にも関する。

【0090】

本発明はまた、ＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患を処置するための方法において、特にポンペ病を処置するための方法において使用するための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド、又は細胞にも関する。本発明はさらに、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型などの糖原病を処置するための方法に使用するための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド、又は細胞に関する。本発明のキメラＧＡＡポリペプチドは、それを必要とする患者に、酵素補充療法（ＥＲＴ）に使用するために、例えば、糖原病の１つ、例えば糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）であるが、しかしまた糖原病ＩＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型、及びＡＭＰ活性化型プロテインキナーゼγサブユニット２欠損症に起因する心臓糖原病の酵素補充療法にも使用するために投与され得る。

【0091】

本発明はさらに、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型などの糖原病の処置に有用な医薬品の製造における、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、キメラＧＡＡポリペプチド、又は細胞の使用にも関する。

【0092】

実施例
本発明は、以下の実験実施例及び添付の図面を参照することによりさらに詳述されている。これらの実施例は、説明のためだけに提供され、制限する意図はない。

【0093】

材料及び方法
ＧＡＡ活性
凍結した組織試料を蒸留水中でホモジナイズした後にＧＡＡ活性を測定した。５０～１００mgの組織を秤量し、ホモジナイズし、次いで、１００００×ｇで２０分間遠心分離にかけた。反応を、９６ウェルプレートにおいて１０μlの上清及び２０μlの基質（４ＭＵα－Ｄ－グルコシド）を用いて組み立てた。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１５０μlの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）の添加によって停止した。標準曲線（０～２５００pmol/μlの４ＭＵ）を使用して、個々の反応混合物から放出された蛍光４ＭＵを、４４９nm（発光）及び３６０nm（励起）でＥｎＳｐｉｒｅアルファプレートリーダー（パーキンエルマー社）を使用して測定した。清澄化した上清のタンパク質濃度をＢＣＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって定量した。ＧＡＡ活性を計算するために、放出された４ＭＵ濃度を試料のタンパク質濃度で割り、活性をnmol/時間/mg（タンパク質）として報告した。

【0094】

結果
ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）の分泌を増加させるために、本発明者らは、肝臓に高度に分泌されているタンパク質に由来するシグナルペプチドと、導入遺伝子の配列の最適化を組み合わせた。本発明者らは、５つの異なる構築物を比較した：
１．ｐＡＡＶ－ＬＳＰ－ｓｐ１－ｈＧＡＡ：α１－ミクログロブリンエンハンサー及びチロキシン結合性グロブリンプロモーターによって構成される肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）の転写制御下にある野生型シグナルペプチド（ｓｐ１）を有するヒトＧＡＡを発現しているプラスミド。
２．ｐＡＡＶ－ＬＳＰ－ｓｐ２－ｈＧＡＡ：ＬＳＰの転写制御下にあるヒトα－１－アンチトリプシンシグナルペプチド（ｓｐ２）を有するヒトＧＡＡを発現しているプラスミド。
３．ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｓｐ１－ｈＧＡＡｃｏ１：ヒトα－１－アンチトリプシンアポリポタンパク質Ｅ肝癌細胞制御領域エンハンサー（ｈＡＡＴ）プロモーターの転写制御下にある天然シグナルペプチドｓｐ１を有する配列最適化形のｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ１）を発現しているプラスミド。
４．ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｓｐ２－ｈＧＡＡｃｏ１：ｈＡＡＴプロモーターの転写制御下にあるα－１－アンチトリプシンシグナルペプチドｓｐ２を有する配列最適化形のｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ１）を発現しているプラスミド。
５．ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｓｐ２－ｈＧＡＡｃｏ２：ｈＡＡＴプロモーターの転写制御下にあるα－１－アンチトリプシンシグナルペプチドｓｐ２を有する異なる配列最適化形のｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ２）を発現しているプラスミド。

【0095】

野生型ｈＧＡＡ配列のアミノ酸１～２７（ここではｓｐ１として定義される）を、ヒトα－１－アンチトリプシン配列（ＮＰ＿０００２８６．３）のアミノ酸１～２４（ここではｓｐ２として定義される）によって置換した。ｈＧＡＡ配列を、２つの異なるアルゴリズムに従って最適化した（それぞれ配列ｃｏ１及びｃｏ２を生じる）。本発明者らはまず、インビトロにおいて上記の最初の４つの構築物のｈＧＡＡ分泌効率を評価した。プラスミドを、肝癌細胞由来の細胞株であるＨｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、本発明者らは、培地中のｈＧＡＡ活性を測定した。データは、野生型ｈＧＡＡ配列へのｓｐ２シグナルペプチドの付加が、その分泌プロファイルを変化させないことを示す。驚くべきことに、同じ戦略が、最適化されたｈＧＡＡ配列に適用された場合、本発明者らは統計学的に有意な分泌増加を観察した（図１）。これらのデータは、効果的なシグナルペプチドと配列最適化の組合せが、ｈＧＡＡの分泌を増加させることを示す。

【0096】

次いで、本発明者らは、２つの最適化されたｈＧＡＡ配列を用いて得られたｈＧＡＡの分泌レベルをインビトロで比較した。本発明者らは、野生型ｈＧＡＡ、又はｓｐ２シグナルペプチドと融合させた２つの明確に異なるアルゴリズムに従って最適化されたｈＧＡＡ配列（それぞれｃｏ１及びｃｏ２）を発現しているプラスミドを用いてＨｕｈ－７細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、本発明者らは、培養培地中のｈＧＡＡのレベルを測定した。本発明者らは、ｈＧＡＡを発現しているプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞の培地中に上昇したレベルのｈＧＡＡを観察した。驚くべきことに、ｓｐ２と融合させた最適化されたｈＧＡＡを有する両方の構築物が、培地中で有意に増加したｈＧＡＡの分泌を示した。この２つの構築物間には有意差は全く観察されなかった（ｐ＝０．１８７）。これらのデータは、効果的なシグナルペプチドと２つの異なる最適化配列の組合せが、ｈＧＡＡの分泌を改善させることを示す。注目すべきは、２つの最適化配列は、ＧＣ含量、代替オープンリーディングフレーム、選択的スプライシング部位、及びＣＡＩの点で異なる特徴を有するが、それらはインビトロにおいて類似した効力を示すことである（表１）。

【0097】

【表1】

【0098】

さらに、本発明者らのベクターを用いての肝臓への形質導入が、導入遺伝子に対する体液性応答を誘発するかどうかを試験する。マウスに、肝特異的プロモーターの転写制御下にあるｓｐ２と融合させたｈＧＡＡｃｏ１又はｈＧＡＡｃｏ２を発現しているＡＡＶ８ベクターを静脈内注射する。構成性プロモーター（ＣＡＧ、ニワトリβアクチンプロモーター及びサイトメガロウイルスエンハンサー）の転写制御下にあるｈＧＡＡｃｏを発現しているＡＡＶ９を筋肉内注射されたマウスは、ｈＧＡＡ導入遺伝子に対して特異的な非常に高いレベルの全ＩｇＧを示し、一方、肝臓において同じタンパク質を発現しているベクターは、ｈＧＡＡ導入遺伝子に対する低いレベルの体液性応答を示す。これらのデータは、肝臓における導入遺伝子の発現が、末梢性免疫寛容の誘発に必要であることを示す。それらは、高度に分泌可能なｈＧＡＡ導入遺伝子が、それらの野生型対応物よりも免疫原性が低いという見通しを提供する。

【図1】

【図2】

【配列表】

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