特許 7208323 Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸及びストレス誘発性代謝

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-10

(45)【発行日】2023-01-18

(54)【発明の名称】Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸及びストレス誘発性代謝

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230111BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230111BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230111BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 41/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 31/194 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 31/225 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20230111BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

C12Q1/02

A61P9/10

A61P7/06

A61P31/04

A61P11/00

A61P29/00

A61P9/00

A61P7/02

A61P11/06

A61P37/06

A61P35/00

A61P41/00

A61P43/00 105

A61K31/194

A61K45/00

A61K31/198

A61K31/225

A61K49/00

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021159462

(22)【出願日】2021-09-29

(62)【分割の表示】P 2017502940の分割

【原出願日】2015-03-27

(65)【公開番号】P2022008641

(43)【公開日】2022-01-13

【審査請求日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】61/972,091

(32)【優先日】2014-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー エム． イントルコファー

(72)【発明者】

【氏名】クレッグ ビー． トンプソン

【審査官】西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０７５０６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５０６８３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０８６３６５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Rakheja, D. et al.，Papillary thyroid carcinoma shows elevated levels of 2-hydroxyglutarate，Tumor Biology，Springer，2010年11月16日，Vol.32，pp.325-333

【文献】STRUYS, E.A. et al.，Measurement of Urinary D- and L-2-Hydroxyglutarate Enantiomers by Stable-Isotope-Dilution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry after Derivatization with Diacetyl-L-Tartaric Anhydride，Clinical Chemistry，2004年08月01日，Vol.50/No.8，pp.1391-1395

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

低酸素を処置する方法に使用するための、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸（（Ｓ）－２－ヒドロキシグルタル酸または「Ｌ－２ＨＧ」）代謝を調節する薬剤を含む組成物であって、前記組成物は、対象から得られた細胞を含有する生物学的試料中で測定されたＬ－２ＨＧのレベルが、正常酸素状態と相関する細胞を含有する対照生物学的試料中で測定されたＬ－２ＨＧのレベルと有意に異なる対象に投与される、組成物。

【請求項2】

Ｌ－２ＨＧ代謝を調節する前記薬剤が、α－ケトグルタル酸、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記組成物が、α－ケトグルタル酸の細胞透過性変異体を含む、請求項２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記組成物が、α－ケトグルタル酸ジメチルを含む、請求項３に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記対象から得られた細胞を含有する前記生物学的試料が、前記対照生物学的試料と比較して少なくとも２倍上昇したＬ－２ＨＧのレベルを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記対象から得られた細胞を含有する前記生物学的試料が、前記対照生物学的試料と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍上昇したＬ－２ＨＧのレベルを有する、請求項５に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイによって測定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液から得られた細胞を含有する生物学的試料中で測定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

低酸素誘発性傷害を処置するために有用な薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、
ｉ）対象となる細胞を含有する生物学的試料、または、対象となる組織または生体から得られた細胞を含有する生物学的試料を前記薬剤と接触させることと；
ｉｉ）前記薬剤と接触させた前記生物学的試料を、キラル誘導体化剤と接触させることと；
ｉｉｉ）前記薬剤が存在するときの前記生物学的試料中のＬ－２ＨＧのレベルを、前記薬剤が不在のとき、または、前記対象となる細胞、組織または生体におけるＬ－２ＨＧレベルに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定することと；
ｉｖ）前記薬剤が存在するときに測定された前記Ｌ－２ＨＧレベルが、前記薬剤が不在のときより高い場合、または、Ｌ－２ＨＧレベルを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたＬ－２ＨＧレベルと類似する場合、またはＬ－２ＨＧレベルを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたＬ－２ＨＧレベルを上回る場合に、低酸素誘発性傷害の前記処置において前記薬剤が有用であると決定することと
を含む、方法。

【請求項10】

前記低酸素誘発性傷害が、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌および外科的処置から選択される低酸素に関連する疾患、障害または病態を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記薬剤が、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸、ペプチド、またはペプチド模倣物である、請求項９または請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイによって測定される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記生物学的試料が、心臓、動脈、脳、腫瘍またはこれらの組み合わせに由来する組織から得られた細胞を含有する、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記低酸素誘発性傷害が慢性低酸素状態と関連付けられる、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記生物学的試料が、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液から得られた細胞を含有する、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記生物学的試料が血液試料から得られた細胞を含有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記血液試料が静脈血試料である、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本特許出願は、任意の及び全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込
まれる、２０１４年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７２，０９１号の
利益及びそれに対する優先権を主張する。

【0002】

政府支援
合衆国法典第３５巻第２０２条（ｃ）（６）に従い、本明細書に記載または特許請求す
る１つまたは複数の発明に関し、出願人は、本発明が、アメリカ国立衛生研究所による補
助金交付番号Ｒ０１ ＣＡ１６８８０２－０２の下に政府支援を伴って作成されたことを
述べる。米国政府は、本発明にある特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

ストレス、例えば、低酸素、感染、飢餓、温度、毒性等は、細胞の代謝に著しい影響を
及ぼし、主要な疾患に寄与する。例えば、大半の細胞は、生存及びそれらの機能を実行す
るために酸素を必要とし、低酸素は細胞の代謝経路に影響を及ぼし、しばしば低酸素誘発
性傷害を引き起こす。ストレスに対する細胞応答の研究における新たな発展は、ストレス
誘発性傷害を必然的に含む障害へに対するより良好な処置に導くだろう。ストレスに関連
する疾患を処置するための組成物またはシステムの開発を目的とした多くの努力がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、Ｌ－２ＨＧが組織低酸素において重要な役割を担うという認識を包含する。
本開示は、他の出願のなかでも、Ｌ－２ＨＧを、組織低酸素を診断するためのバイオマー
カーとして使用することができることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、
例えば、対象から採取された試料から細胞のＬ－２ＨＧを測定することにより、組織低酸
素を診断するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象から
のＬ－２ＨＧのレベルを、正常酸素状態の対照対象からのものと比較することができるこ
とを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ－２ＨＧのレベルを、
急性低酸素または慢性低酸素を有する患者からのものと比較することができることを記載
する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの異なる試料からのＬ－２ＨＧの比較
が、対象における低酸素を診断するために使用され得ることを記載する。いくつかの実施
形態では、本開示は、試料の低酸素状態は、Ｌ－２ＨＧレベルを測定することにより確認
され得ることを記載する。

【0005】

あるいはまたは加えて、本開示は、患者において低酸素誘発性傷害を診断することを記
載する。症候性または亜症候性（ｓｕｂ－ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）でない低酸素誘発性
傷害は、臨床的に診断することがしばしば難しい。本開示に従って試料からＬ－２ＨＧレ
ベルを測定することは、対象における低酸素誘発性傷害についての指標を与え得る。いく
つかの実施形態では、本開示は、例えば、対象から採取した試料からの細胞のＬ－２ＨＧ
を測定することにより組織低酸素を診断するためのシステムを記載する。いくつかの実施
形態では、試料は、例えば、血液試料または生検試料であり得る。いくつかの実施形態で
は、本開示は、対象からのＬ－２ＨＧのレベルを、正常酸素状態の対照対象からのものと
比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの
Ｌ－２ＨＧのレベルを、急性低酸素または慢性低酸素を有する患者からのものと比較する
ことができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの異なる試料
からのＬ－２ＨＧの比較が、対象における低酸素誘発性傷害を診断するために使用され得
ることを記載する。

【0006】

本開示は、Ｌ－２ＨＧが、低酸素または低酸素誘発性傷害を診断するための単一の代謝
産物として使用され得ることを記載する。あるいはまたは加えて、本開示は、それにより
Ｌ－２ＨＧを、診断のためにより広範なセットのバイオマーカーに統合することができる
方法を代替的にまたは追加的に記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、診断にお
いてバイオマーカーセットの一部としてＬ－２ＨＧを使用する方法を記載する。例えば、
いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカ
ーを測定する方法を記載し、ここで少なくとも２つのバイオマーカーのうちの１つはＬ－
２ＨＧである。

【0007】

本開示は、Ｌ－２ＨＧが、低酸素に関連する診断及び治療のための新規及び信頼できる
因子であることを記載する。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、本開示は
、Ｌ－２ＨＧ代謝を制御するある特定の酵素、例えば、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、
及びＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼが、Ｌ－２ＨＧを制御するメカニズ
ムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの酵素の調節は、予測可能な
様式でＬ－２ＨＧのレベルに影響を与え得ることを実証する。いくつかの実施形態では、
本開示は、低酸素に関連する診断及び治療のためにこれらの酵素を調節するためのシステ
ムを記載する。

【0008】

いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の酸素レベルの測定に従い、低酸素の診断
を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素が他の方法を介して診断するこ
とができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、慢性低酸素におけるＬ
－２ＨＧの使用を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、急性低酸素におけるＬ
－２ＨＧの使用を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、慢性または急性のいず
れかの、低酸素の根本的原因により引き起こされた低酸素におけるＬ－２ＨＧの使用を記
載する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本発明に従って、本明細書に記載するような１つまたは複数
の低酸素マーカーが、例えば、低酸素または低酸素に関連する疾患、障害、もしくは病態
を、診断するまたは処置する文脈において、検出または測定される。

【0010】

いくつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、例えば、敗血症
性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群
、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症
、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌、ならびに外科的処置中であるか、これを含む。

【0011】

本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害の処置において有用である薬剤を同定するま
たは特徴づけるためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ある特
定の新規パラメータが低酸素において重要な役割を担う可能性があることを記載する。例
えば、いくつかの実施形態では、このパラメータは、Ｌ－２ＨＧのレベルまたは動態であ
るかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、α－ケトグルタ
ル酸のレベルまたは動態であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパ
ラメータは、ＬＤＨＡのレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施
形態では、このパラメータは、ＬＤＨＡのレベルまたは活性であるかまたはこれからなる
。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＭＤＨ１のレベルまたは活性であるかま
たはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＭＤＨ２のレベルまた
は活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、Ｌ－
２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのレベルまたは活性であるかまたはこれから
なる。

【0012】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを使用することにより低酸素または低
酸素誘発性傷害の処置において有用である薬剤を同定するまたは特徴づけるためのシステ
ムを記載する。例えば、細胞、組織または生体中のＬ－２ＨＧのレベルは、薬剤が不在の
ときまたは組織もしくは生体中のＬ－２ＨＧレベルへの影響が知られている基準薬が存在
するときと比較して、薬剤が存在するときに測定することができる。いくつかの実施形態
では、薬剤が存在するときに測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものよ
り高い場合、Ｌ－２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定された
ものと類似する場合、Ｌ－２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに
測定されたものを超える場合に、薬剤は、低酸素誘発性傷害の処置において有用であると
同定されるまたは特徴づけられる。

【0013】

本開示は、例えば低酸素または低酸素誘発性傷害を診断することまたは処置することを
伴う、Ｌ－２ＨＧレベルに対して比較することができるパラメータを記載する。一例をあ
げると、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対
象のものと比較して上昇している対象へ低酸素治療を施すことによる低酸素の処置を記載
する。いくつかの実施形態では、Ｌ－２ＨＧのレベルの上昇は、正常酸素状態の対象につ
いて観察されるものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少
なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少
なくとも１０倍であるか、またはさらに高い。

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示は、患者集団を（例えば、低酸素治療での処置に対す
るそれらの候補性に関して）層別化するため、または１つまたは複数の対象に施したとき
の特定の治療の有効性をモニターするまたは調節するための技術を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、低酸素治療は、例えば、酸素補充療法、赤血球濃厚液の輸血
、カフェイン、ビタミン療法、機械的換気、陽圧療法、身体運動、または外科的介入であ
ってよいかまたはこれを含んでよい。

【0016】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するような低酸素マーカーは、患者試料中で
測定される。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、心臓、動脈、脳、腫瘍、または
それらの組み合わせからの組織試料であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの
実施形態では、試料は、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液であってよいかまたはこ
れを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、静脈血試料であってよいかまたはこ
れを含んでよい。

【0017】

いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を処置するための
新規システムを記載する。いくつかの実施形態では、傷害は、低酸素に関連する疾患、障
害もしくは病態を有する患者からの症状であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態
では、傷害は、虚血性組織傷害であるかまたはこれを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示は、組織中のまたは系統的にＬ－２ＨＧレベルを調節
する治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ－２ＨＧのレ
ベルを増加させる治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ
－２ＨＧのレベルを低減させる治療を記載する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝を調節する薬剤を含む組成物の投
与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する
経路を介した対象への組成物の投与を含む治療を記載する。

【0020】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧであるかまたはこれを含む薬剤を含む
組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧの
アンタゴニストであるかまたはこれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する
。

【0021】

いくつかの実施形態では、本開示は、限定されないが、α－ケトグルタル酸、α－ケト
グルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α－ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、
またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む治療を記載する。いくつかの実
施形態では、本開示は、α－ケトグルタル酸のアンタゴニストであるかまたはこれを含む
薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。

【0022】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、及びＬ－２－ヒ
ドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１つまたは複数の分子の
発現または活性に影響を及ぼす薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつか
の実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する経路を介した対象へのＬＤＨＡの阻
害剤の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２－ヒドロ
キシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターの投与を含む治療を記載する。

【0023】

いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素病態を適用することを必然的に含む用途を
記載する。例えば、低酸素は、幹細胞または前駆細胞の多能性を維持するなどのいくつか
の状況では望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素の恩恵を
受けることができる対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。

【0024】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の対象と比較し
て低い対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。いくつかの実施形
態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して、最大で５０
％である対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。いくつかの他の
実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して、最大
で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％、または最大で５％である対象に
おいて組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。

【0025】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞、組織または生体の多能性または自己複製を
維持するまたは促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態で
は、これらの組成物またはシステムは、インビボで使用するためのものである。いくつか
の実施形態では、これらの組成物及びシステムは、インビトロで使用するためのものであ
る。

【0026】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の多能性または自己複製を維持するまたは促
進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細
胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態では、これらの組成物またはシステムは、
細胞中のＬ－２ＨＧのレベルを調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は
、細胞をＬ－２ＨＧと接触させることを含む、Ｌ－２ＨＧのレベルを調節するための組成
物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２－ヒドロキシ
グルタル酸デヒドロゲナーゼ活性または発現を阻害するための組成物またはシステムを記
載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性または発現を促進するための
組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＤＨ１または
ＭＤＨ２活性または発現を促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの
実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを細胞に送達するための方法を記載する。いくつか
の実施形態では、本開示は、細胞中のα－ケトグルタル酸を枯渇させるための方法を記載
する。いくつかの実施形態では、細胞または組織の多能性または自己複製を維持するまた
は促進するために使用することができる方法は、細胞培養または組織培養に適用される。

【0027】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧの枯渇が細胞分化を促進することを記
載する。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞分化を促進するためのシステムを記
載する。いくつかの実施形態では、これらのシステムは、幹細胞または前駆細胞を有効量
のＬＤＨＡの阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、これらのシステ
ムは、幹細胞または前駆細胞を有効量のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ
のアクチベーターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、癌幹細胞
である。

【0028】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝におけるＬＤＨＡの重要性を記載
する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性の阻害に有用な薬剤を同定する
または特徴づけるための方法を記載する。いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤を、
ＬＤＨＡを発現する細胞を含有する試料またはＬＤＨＡを含有する無細胞溶液と接触させ
ること、その後薬剤が存在するときの試料中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のとき
、または試料中のＬ－２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比
較して測定すること、及び薬剤が存在するときの測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが
不在のときのものより低い場合、Ｌ－２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在す
るときに測定されたものと類似する場合、またはＬ－２ＨＧを増加させないと知られてい
る基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、ＬＤＨＡ活性の阻害において
薬剤が有用であると決定することを含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝におけるＬ－２－ヒドロキシグル
タル酸デヒドロゲナーゼの重要性を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－
２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進に有用な薬剤を同定するまたは特
徴づけるための方法を記載する。いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤を、Ｌ－２－
ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを発現する細胞を含有する試料またはＬ－２－ヒ
ドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを含有する無細胞溶液と接触させること、薬剤が存
在するときの試料中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のときまたは試料中のＬ－２Ｈ
Ｇに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定すること、及び
薬剤が存在するときの測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い
場合、Ｌ－２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものに
類似する場合、またはＬ－２ＨＧを低減させないと知られている基準薬が存在するときに
測定されたものより高い場合に、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の
促進において薬剤が有用であると決定することを含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝が、細胞のエピジェネティックな
変化に密接につながっているという新規知見を記載する。例えば、本開示は、Ｌ－２ＨＧ
蓄積がヒストンのメチル化を促進することを記載する。いくつかの実施形態では、ヒスト
ンのメチル化は、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を含む。いくつ
かの実施形態では、本開示は、細胞を、Ｌ－２ＨＧを含む組成物、ＬＤＨＡのアクチベー
ター、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、またはそれらの組み合
わせと接触させることを含む、細胞中でヒストンのメチル化を促進するためのシステムを
記載する。一方で、いくつかの他の実施形態では、本開示は、細胞を、α－ＫＧを含む組
成物、ＬＤＨＡの阻害剤、またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアク
チベーターと接触させることを含む、細胞中でヒストンのメチル化を阻害するためのシス
テムを記載する。

【0031】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを、癌表現型を区別するために使用す
ることができるという新規知見を代替的にまたは追加的に記載する。例えば、本開示は、
Ｌ－２ＨＧ代謝が、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍の高く相関する領域であるＨ３Ｋ９
ｍｅ３染色に影響を与えることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍異
質性を同定するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシステム
は、以下のパラメータ、すなわちＬ－２ＨＧレベル、α－ケトグルタル酸、ＬＤＨＡの発
現または活性、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの発現または活性、また
はＨ３Ｋ９ｍｅ３の少なくとも１つを測定することを含む。いくつかの実施形態では、腫
瘍は膠芽腫を有する患者からのものである。

【0032】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを、低酸素をイメージングするために
使用することができるという新規知見を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、
Ｌ－２ＨＧと反応する薬剤を含む組成物を試料または対象に投与するためのシステムを記
載する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｌ－２ＨＧに特異的に結合する抗体である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、イメージング技術によるその視覚化を可能にする別の
部分とコンジュゲートする。

【0033】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを正確に検出することができる組成物
またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧとＲ－２Ｈ
Ｇを区別できる組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、
ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイ
を含む組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、２ＨＧを
キラル誘導化試薬と接触させることにより２－ヒドロキシグルタル酸を処理するための組
成物またはシステムを記載する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
対象において組織低酸素を診断する方法であって、
（１）前記対象からの試料中のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸（（Ｓ）－２－ヒドロキシグルタル酸または「Ｌ－２ＨＧ」））のレベルを測定し；
（２）前記測定レベルと正常酸素状態に相関する基準レベルとを比較するステップを含み、組織低酸素は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、前記方法。
（項目２）
対象において低酸素誘発性傷害を診断する方法であって：
（１）前記対象からの試料中のＬ－２ＨＧのレベルを測定し；
（２）前記測定レベルと正常酸素状態に相関する基準レベルとを比較するステップを含み、低酸素誘発性傷害は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、前記方法。
（項目３）
（１）前記対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーを測定し、ここで前記少なくとも２つのバイオマーカーの１つはＬ－２ＨＧであり；及び
（２）前記測定レベルと低酸素または正常酸素状態を表す基準レベルとを比較するステップをさらに含み、組織低酸素または低酸素誘発性傷害は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
低酸素誘発性傷害の処置において有用な薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を対象となる細胞、組織または生体と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記組織中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記組織または生体中のＬ－２ＨＧレベルに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ－２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ－２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものを超す場合に、低酸素誘発性傷害の前記処置において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
（項目５）
前記傷害が、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌、または外科的処置中であるかまたはこれを含む、低酸素に関連する疾患、障害または病態を含む、項目２または４に記載の方法。
（項目６）
対象において組織低酸素またはその根本的原因を処置する方法であって、前記方法が、そのＬ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して少なくとも２倍である対象に、低酸素治療を施すことを含む、前記方法。
（項目７）
Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、正常酸素状態の対象と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍に上昇している、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記低酸素治療が、酸素補充療法、赤血球濃厚液の輸血、カフェイン、ビタミン療法、機械的換気、陽圧療法、身体運動、または外科的介入を含む群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記低酸素が慢性である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記治療が、慢性低酸素または慢性低酸素の根本的原因に向けられている、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
慢性低酸素の前記根本的原因が、慢性閉塞性肺障害、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、及び膿胞性線維症を含む群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
Ｌ－２ＨＧの前記測定が、組織試料から得られる、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記組織試料が、心臓の組織、動脈、脳、腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１４）
前記試料が、血液、尿、血清、リンパ及び脳脊髄液を含む群から選択される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
Ｌ－２ＨＧの前記測定が、血液試料から取得される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記血液試料が、静脈血試料である、項目１６に記載の方法。
（項目１７）
虚血性組織傷害を処置する方法であって、虚血性組織傷害を有する対象に、Ｌ－２ＨＧのレベルを調節する治療を施すことを含む、前記方法。
（項目１８）
前記治療が、前記対象におけるＬ－２ＨＧの前記レベルを増加させる、項目６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記治療が、前記対象におけるＬ－２ＨＧの前記レベルを低減させる、項目６または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記治療が、前記組織への送達を達成する経路を介した前記対象へのＬ－２ＨＧを含む組成物の投与を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記治療が、前記組織への送達を達成する経路を介した前記対象へのＬＤＨＡの阻害剤の投与を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記治療が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を調節する薬剤の投与を含む、項目６または１７に記載の方法。
（項目２３）
前記薬剤の前記投与が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を増加させる、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記薬剤の前記投与が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を低減させる、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記処置が、これらに限定されないが、α－ケトグルタル酸、α－ケトグルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α－ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記処置が、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を阻害することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記処置が、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を促進することを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
対象において組織低酸素を促進する方法であって、前記方法が、そのＬ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して最大で５０％である対象に治療を施すことを含む、前記方法。
（項目２９）
Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、正常酸素状態の基準対象と比較して、最大で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％、または最大で５％である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
幹細胞または前駆細胞である細胞の多能性または自己複製を維持するまたは促進する方法であって、前記細胞中のＬ－２ＨＧのレベルを調節することを含む、前記方法。
（項目３１）
Ｌ－２ＨＧのレベルを調節することが、前記細胞をＬ－２ＨＧと接触させることを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
Ｌ－２ＨＧのレベルを調節することが、前記細胞中のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を阻害することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
癌に罹患している対象において癌を処置する方法であって、１つまたは複数の用量のＬＤＨＡの阻害剤、または１つまたは複数の用量のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの刺激剤の投与を含む治療レジメンを前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目３４）
前記対象が、野生型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
腫瘍血管新生を阻害する方法であって、腫瘍を、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
（項目３６）
細胞分化を促進させる方法であって、幹細胞または前駆細胞である細胞を、有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
（項目３７）
前記細胞が癌幹細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
癌の処置において有用な薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、癌細胞を含む系と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記系中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記組織または生体中のＬ－２ＨＧレベルに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより低い場合、Ｌ－２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ－２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、癌の処置において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
（項目３９）
前記系が腫瘍であるかまたは腫瘍を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
敗血症性ショックの症状を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
（項目４１）
心筋梗塞の症状を有するまたは心筋梗塞のリスクがある対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
（項目４２）
虚血性脳卒中の症状を有するまたは虚血性脳卒中のリスクがある対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
（項目４３）
ＬＤＨＡ活性の阻害において有用である薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、ＬＤＨＡを発現する細胞を含有する試料またはＬＤＨＡを含有する無細胞溶液と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記試料中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記試料中のＬ－２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより低い場合、Ｌ－２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ－２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、ＬＤＨＡ活性の阻害において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
（項目４４）
Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進において有用である薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを発現する細胞を含有する試料またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを含有する無細胞溶液と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記試料中のＬ－２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記試料中のＬ－２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ－２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ－２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものに類似する場合、またはＬ－２ＨＧを低減させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより高い場合に、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
（項目４５）
細胞におけるヒストンのメチル化を促進する方法であって、前記細胞を、Ｌ－２ＨＧ、ＬＤＨＡのアクチベーター、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることを含む、前記方法。
（項目４６）
細胞におけるヒストンのメチル化を阻害する方法であって、前記細胞を、ＬＤＨＡの阻害剤、またはＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
（項目４７）
前記ヒストンのメチル化が、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を含む、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
組織における低酸素の異質性について試験する方法であって、
（１）前記組織の１つの領域内のＬ－２ＨＧのレベルを測定し；
（２）Ｌ－２ＨＧの前記測定レベルを、前記組織の少なくとも１つの異なる領域と比較するステップを含み、前記測定レベルがステップ（１）にて前記領域から測定された前記レベルから有意差を示すときに組織低酸素の異質性が診断される、前記方法。
（項目４９）
組織における低酸素の異質性について試験する方法であって、
（１）前記組織の１つの領域内のＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベルを測定し；
（２）Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の前記測定レベルを、前記組織の少なくとも１つの異なる領域と比較するステップを含み、前記測定レベルがステップ（１）にて前記領域から測定された前記レベルから有意差を示すときに組織低酸素の異質性が診断される、前記方法。
（項目５０）
前記組織が、腫瘍由来である、項目４８または４９に記載の方法。
（項目５１）
腫瘍が、膠芽腫を有する対象由来である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
組織中の低酸素をイメージングする方法であって、Ｌ－２ＨＧと反応する薬剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目５３）
低酸素の前記イメージングが、対象で実行される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記薬剤が、Ｌ－２ＨＧに特異的に結合する、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記薬剤が、臨床イメージング法によるその視覚化を可能にする部分を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
Ｌ－２ＨＧの前記レベルが、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイによって測定される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
Ｌ－２ＨＧの前記レベルの測定が、質量分析の使用を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記測定が、ガスクロマトグラフィー質量分析の使用を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
２－ヒドロキシグルタル酸をキラル誘導化試薬と反応させるステップをさらに含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記基準レベルが、正常酸素状態の個体対象に由来する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記正常酸素状態の個体対象が前記対象である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記基準レベルが、正常酸素状態の対象の集団に由来する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記基準レベルが、急性的に低酸素の対象に由来する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記基準レベルが、急性的に低酸素の対象の集団に由来する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記試料において測定された前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記レベルと前記基準レベルとの間の前記差が、前記対象における慢性低酸素の重症度と相関する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】低酸素に応答したＬ－２－ヒドロキシグルタル酸（Ｌ－２ＨＧ）の産生を示すＧＣ－ＭＳヒストグラム及びウェスタンブロット画像を示す。（Ａ）のパネルは、異なる細胞型での２ＨＧレベルを示す棒グラフである。指定の細胞を、２１％または０．５％酸素（Ｏ_２）中で２４～４８時間培養した。総細胞内２ＨＧをガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）によって測定し、入力を統制するために総タンパク質に対して正規化した。２１％Ｏ_２における各細胞型の２ＨＧレベルを、倍率変化を示すために任意に１と設定した。グラフは、３重の試料の平均＋／－標準偏差を示す。（Ｂ及びＣ）のパネルは、ウェスタンブロット及び異なるタンパク質の発現を示すこれらのブロットの定量化である。ＳＦ１８８細胞を、非標的ｓｈＲＮＡ（対照）、Ｄ２ＨＧＤＨ（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）を標的とするｓｈＲＮＡ、またはＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに安定定期に感染させた。細胞を２１％または０．５％Ｏ_２中で４８時間培養し、２ＨＧを（Ａ）のように測定した。ウェスタンブロットは、ＨＩＦ１α、Ｄ２ＨＧＤＨ、Ｌ２ＨＧＤＨ、及びＳ６タンパク質（負荷対照）の発現を示す。（Ｄ）のパネルは、時間の関数としてイオンの濃縮を示すＧＣ－ＭＳヒストグラムである。低酸素のＳＦ１８８細胞からの代謝産物を、４つの画分に分け、次いで、Ｄ－２ＨＧ、Ｌ－２ＨＧ、Ｄ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧの混合物の基準標準物質でスパイクするか、またはスパイクしないままにした。キラル誘導体化を行って、ＧＣ－ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。この図の各パネルでは、３つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。図６も参照されたい。

【図2】低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧがグルタミン由来のα－ケトグルタル酸を起源とすることを示すＧＣ－ＭＳヒストグラムの定量化結果を示す。（Ａ及びＢ）のパネルは、指定の時間で^１３Ｃにより標識された細胞内２ＨＧの割合を示す線図である。同位体追跡を、［Ｕ－^１３Ｃ］グルコースまたは［Ｕ－^１３Ｃ］グルタミンのいずれかを含有する培地内で培養されたＳＦ１８８細胞において行った。同様の標識パターンが、ＲＣＣ４及びＣＳ－１細胞で観察された（データは示さず）。（Ｃ）のパネルは、正規化２ＨＧを示す棒グラフである。ＳＦ１８８細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または５ｍＭのジメチル－α－ＫＧの存在下、２１％または０．５％Ｏ_２中で４８時間培養した。総細胞内２ＨＧをＧＣ－ＭＳにより評価した。グラフは、３重の試料の平均＋／－標準偏差を示す。３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。（Ｄ及びＥ）のパネルは、異なる条件における２ＨＧイオンを示すＧＣ－ＭＳヒストグラムである。ＳＦ１８８細胞を、（Ｃ）のように培養し、次いで代謝産物のキラル誘導体化を行って、ＧＣ－ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。（Ｄ）のパネルは、同じ目盛りで２ＨＧについてＧＣ－ＭＳヒストグラムのオーバーレイを示す。（Ｅ）のパネルは、異なる目盛りで２ＨＧについて個別のＧＣ－ＭＳヒストグラムを示す。（Ｄ）及び（Ｅ）についてのグラフの線のスタイルは、（Ｃ）に示すものと同じである。（図１Ｄ）のように、Ｌ－２ＨＧ（左）は、Ｄ－２ＨＧ（右）よりも短い保持時間で溶出する。５つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。

【図3】低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧがＬＤＨＡによる無差別な基質使用を介して生じることを示すウェスタンブロット画像を示す。（Ａ、Ｂ、Ｃ）のパネルは、ｓｉＲＮＡ実験後に示された様々なタンパク質のウェスタンブロット画像及び定量化である。ＳＦ１８８細胞を、（Ａ）ＩＤＨ１（ＩＤＨ１－ａ、－ｂ）またはＩＤＨ２（ＩＤＨ２－ａ、－ｂ）、（Ｂ）ＭＤＨ１（ＭＤＨ１－ａ、－ｂ）またはＭＤＨ２（ＭＤＨ２－ａ、－ｂ）、または（Ｃ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ－ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ）を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２１％または０．５％Ｏ_２にさらに２４～４８時間移し、その後、細胞内２ＨＧを測定した。ウェスタンブロットは、標的ノックダウン有効性を確かにし、ＨＩＦ１αの低酸素誘発性発現を示す。Ｓ６タンパク質またはα－チューブリンのいずれかの発現を、負荷対照として示す。各パネルについて、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。図７も参照されたい。パネル（Ｄ）は、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの酵素源をまとめる概略図である。

【図4】ＬＤＨＡの活性部位が、Ｌ－２ＨＧへの還元を受け入れられる幾何学におけるα－ＫＧの結合を立体的に受け入れることができることを示す構造モデルレンダリングを示す。（Ａ及びＣ）のパネルは、ＮＡＤＨを有するＬＤＨＡの活性部位にドッキングしたピルベート及びα－ＫＧのポーズの構造モデルである。（Ｂ及びＤ）のパネルは、ＮＡＤ＋を有するＬＤＨＡの活性部位にドッキングしたＬ－乳酸塩及びＬ－２ＨＧのポーズの構造モデルである。影付きの雲状部分は、基質結合性ポケット内で予測される空の空間を表す。予測される水素結合を青色で示す。線として示す残基は、Ａｒｇ１６８（パネルの右上角の細い灰色の線）、Ｔｈｒ２４７（パネルの左上角の太い灰色の線）、Ｈｉｓ１９２（底部中央の細い灰色の線）、Ａｒｇ１０５（背景中央の淡灰色の線）、Ａｓｎ１３７（上部中央の細い灰色の線）、及びＧｌｎ９９（淡灰色と黒色の間の上部中央の太い灰色の線）である。ドッキングは、ＰＤＢアクセッションコード１Ｉ１０（Ｒｅａｄら、２００１）を使用した。四角は、対応するα－ヒドロキシル酸のＬ－（Ｓ）－エナンチオマーを産生するように還元反応を拘束する、ＮＡＤＨのヒドリド基に関連して、各基質のカルボン酸頭部基及び隣接するカルボニル基の空間的立体配置を強調する。

【図5】Ｌ－２ＨＧが、低酸素に応答してヒストン３リジン９のトリメチル化を増強させることを示す免疫組織化学染色及びウェスタンブロット画像を示す。（Ａ）のパネルは、指定のタンパク質について染色されたヒト膠芽腫検体の免疫組織化学画像である。ＨＩＦ１α発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルを、生検において捉えた低酸素性領域を有する（ｎ＝２６）または有さない（ｎ＝２１）ヒト膠芽腫検体における免疫組織化学により評価した。パネル（Ｂ）は、ＨＩＦ１αを発現しない（－）または発現する（＋）生検内でのＨ３Ｋ９ｍｅ３染色強度（画素単位）の定量化を示す。値は、平均＋／－標準偏差を表し；^＊ｐ＝０．０１は、対応のない両側スチューデントのｔ検定により決定した。（Ｃ、Ｄ及びＥ）のパネルは、指定の条件下のＨ３Ｋ９ｍｅ３のウェスタンブロット画像及び定量化結果である。空のレンチウイルスベクター（ベクター）またはＬ２ＨＧＤＨをコードするレンチウイルスベクターに安定的に感染したＳＦ１８８膠芽腫細胞を、４８時間２１％または０．５％Ｏ_２内で培養し、その後ヒストン抽出を行い、ウェスタンブロットによりＨ３Ｋ９ｍｅ３を評価した。（Ｄ）非標的ｓｈＲＮＡ（対照）またはＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ１、Ｌ３）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに安定的に感染したＳＦ１８８膠芽腫細胞を、２１％または０．５％Ｏ_２内で培養し、その後ヒストン抽出を行い、ウェスタンブロットによりＨ３Ｋ９ｍｅ３を評価した。（Ｅ）のパネルでは、バルクヒストンを、α－ＫＧ（１ｍＭ）との反応混合物中で精製したヒトＫＤＭ４Ｃと、ならびに指定濃度のＬ－２ＨＧまたはＤ－２ＨＧとインキュベートした。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を、総Ｈ３を負荷対照として使用して、ウェスタンブロットにより評価した。（Ｃ）、（Ｄ）、及び（Ｅ）のパネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。

【図6】低酸素に応答したＬ－２ＨＧの選択的産生を示すＧＣ－ＭＳヒストグラムを示す。パネル（Ａ）は、Ｒ（－）－２－ブタノール及び酢酸無水物での連続的な誘導体化後のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸を示す概略図である（詳細については実験手法を参照されたい）。（Ｂ及びＣ）のパネルは、ＧＣ－ＭＳからのヒストグラムである。正常酸素状態（２１％Ｏ２）または低酸素（０．５％Ｏ２）で培養された（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（Ｃ）ＳＶ４０－不死化ＭＥＦからの代謝産物を、（Ａ）のようにキラル誘導体化に供して、ＧＣ－ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。図１Ｄに実証するように、Ｌ－２ＨＧ（左）は、Ｄ－２ＨＧ（右）よりも短い保持時間で溶出する。２つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。

【図7】低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの酵素源を示すウェスタンブロット画像を示す。上のパネルは、そのパネルの左側に指定された条件下のタンパク質のウェスタンブロット画像であり、下のパネルは、そのウェスタンブロットの定量化である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、（Ａ）ＩＤＨ１（ＩＤＨ１－ａ、－ｂ）またはＩＤＨ２（ＩＤＨ２－ａ、－ｂ）、（Ｂ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ－ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ）、または（Ｃ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ－ｂ、－ｄ）及びＭＤＨ２（ＭＤＨ２－ａ、－ｂ）の両方を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２１％または０．５％Ｏ２へとさらに２４～４８時間移し、その後細胞内２ＨＧを測定した。ウェスタンブロットは、負荷対照としてＳ６タンパク質またはα－チューブリンのいずれかの発現で標的ノックダウン有効性を確かにする。各パネルについて、２つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

定義
本出願では、文脈から別様に明確でない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくと
も１つ」を意味すると理解されてよく；（ｉｉ）「または」という用語は、「または」を
意味すると理解されてよく；（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それら単独かまたは１つまたは複数の追加の構成
要素またはステップと一緒に提示される、個条書きされた構成要素またはステップを包含
すると理解されてよく；（ｉｖ）「約」及び「おおよそ」という用語は、当業者に理解さ
れるであろう標準的な変動を許可すると理解されてよく；（ｖ）範囲が提供される場合、
端点を含む。

【0036】

活性化剤：本明細書で用いるとき、「活性化剤」という用語、またはアクチベーターは
、薬剤無し（または異なるレベルでの薬剤）で観察されるものと比較して、その存在また
はレベルが標的のレベルまたは活性の上昇と相関する薬剤を指す。いくつかの実施形態で
は、活性化剤は、その存在またはレベルが、特定の（例えば、既知の活性化剤、例えば陽
性対照、の存在下などの適切な基準条件下で観察される）基準レベルまたは活性と同等ま
たはそれらより大きい標的レベルまたは活性と相関するものである。

【0037】

投与：本明細書で用いるとき、「投与」という用語は、対象または系への組成物の投与
を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によるものであってよ
い。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、（気管支注入によるものを含む）気管支
、口腔、経腸、皮間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、
鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、経粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局
所、気管（気管内注入を含む）、経皮、膣及び硝子体であってよい。

【0038】

薬剤：「薬剤」という用語は、本明細書で用いるとき、例えば、ポリペプチド、核酸、
多糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む任意の化学クラスの化合
物または実体を指してよい。いくつかの実施形態では、薬剤は、自然に見いだされるまた
は自然から獲得されるという点で自然産物であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形
態では、薬剤は、ヒトの手の作用を通して設計され、操作され、もしくは産生されるかま
たは自然に見いだされるものではない点で人工である１つまたは複数の実体であるかまた
はこれを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、単離されたまたは純粋な形態において
活用されてよく、いくつかの実施形態では、薬剤は、粗形態で活用されてよい。いくつか
の実施形態では、潜在的な薬剤は、コレクションまたはライブラリーとして提供され、例
えばそれらは、それらの中の活性剤を同定または特徴づけるためにスクリーニングされて
よい。本発明に従って活用されてよい薬剤のいくつかの特定の実施形態には、小分子、抗
体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣
物等が含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリマーであるかまたはこれを含む
。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリマーではないかまたは実質的にいずれのポリマ
ーも含まない。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含有
する。いくつかの実施形態では、薬剤は、任意のポリマー部分を欠くか実質的に含まない
。

【0039】

動物：本明細書で用いるとき、「動物」という用語は、動物界の任意の成員を指す。い
くつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態
では、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、非ヒ
ト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒ
ツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類
、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。い
くつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、また
はクローンであってよい。

【0040】

アンタゴニスト：本明細書で用いるとき、「アンタゴニスト」という用語または阻害剤
は、ｉ）別の薬剤の効果を阻害する、低減するもしくは低下させる；またはｉｉ）１つま
たは複数の生物学的事象を阻害する、低減する、低下させる、もしくは遅らせる薬剤を指
す。アンタゴニストは、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、金属、
または関連する阻害活性を示す任意の他の実体を含む、任意の化学クラスの薬剤であって
よいかまたはこれらを含んでよい。アンタゴニストは、直接（その場合その影響をその標
的に直接及ぼす）または間接（その場合その標的に結合する以外で；例えば、標的のレベ
ルまたは活性が変化するように、例えば、標的の制御因子と相互作用することによって、
その影響を及ぼす）であってよい。

【0041】

おおよそ：本明細書で用いるとき、「おおよそ」及び「約」という用語は、それぞれ、
関連する文脈に適切であると当業者により理解されるであろう通常の統計学的変動を包含
すると意図される。ある特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、
別段の記載がない限り、または文脈からそうでないと明確でない限り（例えば、かかる数
字があり得る値の１００％を超す場合）、それぞれ、記した値のいずれかの方向（より多
いまたはより少ない）において２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５
％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、
３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す。

【0042】

と関連する：本用語が本明細書で用いられるとき、一方の存在、レベルまたは形態が他
方のものと相関する場合に、２つの事象または実体はお互いに「関連する」。例えば、特
定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベルまたは形態が、疾患、障害、ま
たは病態の（例えば、関連する集団にわたる）発生率または感受性と相関する場合に、特
定の疾患、障害、または病態と関連するとみなされる。いくつかの実施形態では、２つ以
上の実体は、物理的にお互いに近接し、近接したままであるようにそれらが直接的または
間接的に相互作用する場合、お互いに物理的に「関連」する。いくつかの実施形態では、
お互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、お互いに共有結合する；いくつかの実施形
態では、お互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、お互いに共有結合しないが、例え
ば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びこれらの組み
合わせにより、非共有結合的に関連する。

【0043】

生物学的に活性：本明細書で用いるとき、「生物学的に活性」という語句は、生物系内
（例えば、細胞内（例えば、培養物内、組織内、生体内に、単離された）、細胞培養物内
、組織内、生体内、等）における活性を有する物質を指す。例えば、生体に投与されたと
き、その生体上に生物学的効果を有する物質が、生物学的に活性であるとみなされる。し
ばしば生物学的に活性な物質の一部または断片のみが、活性を提示するために要求される
（例えば、必要及び十分である）ことが当業者により理解されるだろう；そのような環境
では、その部分または断片は「生物学的に活性な」部分または断片であるとみなされる。

【0044】

併用療法：本明細書で用いるとき、「併用療法」という用語は、対象が、２つ以上の治
療レジメン（例えば、２つ以上の治療剤）に同時に曝露される状況を指す。いくつかの実
施形態では、２つ以上の薬剤は、同時に投与されてよい；いくつかの実施形態では、かか
る薬剤は、順次投与されてよい；いくつかの実施形態では、かかる薬剤は、重複する投与
レジメンにおいて投与される。

【0045】

同等：「同等」という用語は、本明細書で用いるとき、お互いに同一ではないがその間
での比較を可能にし、結論を観察された差異または類似性に基づいて合理的に引き出し得
るのに十分に類似する２つ以上の薬剤、実体、状況、条件のセット等を指す。いくつかの
実施形態では、条件、環境、個体または集団の同等のセットは、複数の実質的に同一の特
性及び１つまたは少数の異なる特性によって特徴づけられる。当業者は、２つ以上のかか
る薬剤、実体、状況、条件のセット等が同等であるとみなされるには、任意の所与の環境
においてどの程度の同一性が必要とされるかを、文脈において、理解するだろう。例えば
、当業者は、異なる環境、個体、または集団のセットでまたはその下で、それらにより得
られた結果または観察された現象における差異が、変動したそれらの特性における変動性
により引き起こされるまたはそれを示すという、合理的な結論を保証するのに十分な数及
びタイプの実質的に同一の特性により特徴づけられるとき、環境、個体、または集団のセ
ットがお互いに同等であると理解するだろう。

【0046】

に対応する：本明細書で用いるとき、「に対応する」という用語は、しばしば、適切な
基準薬において存在するものと（例えば、３次元空間でまたは別の要素または部分に対し
て）位置を共有する対象となる薬剤の構造要素または部分を示すのに使用される。例えば
、いくつかの実施形態では、本用語は、ポリペプチド内のアミノ酸残基または核酸内のヌ
クレオチド残基などのポリマー内の残基の位置／同一性を指すために使用される。当業者
は、簡潔さを目的として、そのようなポリマー内の残基が基準に関連するポリマーに基づ
く規範的な番号付けシステムを使用してしばしば示される、ゆえに、基準ポリマー内の１
９０位の残基に「に対応する」第一のポリマー内の残基は、例えば、必ずしも実際に第一
ポリマーの１９０番目の残基である必要はなく、基準ポリマーの１９０番目の位置で見い
だされた残基に対応するということを理解するだろう；当業者は、ポリマー配列比較用に
特異的に設計された１つまたは複数の市販のアルゴリズムの使用を通すことを含む、「対
応する」アミノ酸を同定する方法を容易に理解する。

【0047】

誘導体：本明細書で用いるとき、「誘導体」という用語は、基準物質の構造類似体を指
す。つまり、「誘導体」は、基準物質との著しい構造類似性を示す、例えばコアまたはコ
ンセンサス構造を共有するが、同時にある特定の別々の方法で異なる物質である。いくつ
かの実施形態では、誘導体は、化学的操作により基準物質から生成されることができる物
質である。いくつかの実施形態では、誘導体は、基準物質を生成するものと実質的に類似
する（例えば、複数のステップを共有する）合成プロセスの遂行を通して生成されること
ができる物質である。

【0048】

設計された：本明細書で用いるとき、「設計された」という用語は、（ｉ）その構造が
人の手により選択されるまたはされた；（ｉｉ）人の手を要するプロセスにより産生され
た；または（ｉｉｉ）自然物質または他の既知の薬剤と異なる薬剤を指す。

【0049】

決定する：本明細書に記載の多くの方法が「決定する」ステップを含む。当業者は、本
明細書を読むと、そのような「決定すること」が、例えば、本明細書に明確に言及される
特定の技術を含む、当業者に利用可能な任意の様々な技術を活用することができるまたは
これらの使用を通して達成されることができることを理解するだろう。いくつかの実施形
態では、決定することは、身体的試料の操作を必然的に含む。いくつかの実施形態では、
決定することは、データまたは情報の考慮または操作、例えば、関連分析を実施するのに
適合したコンピュータまたは他の処理装置を活用することを必然的に含む。いくつかの実
施形態では、決定することは、供給源から関連情報や材料を受け取ることを必然的に含む
。いくつかの実施形態では、決定することは、試料または実体の１つまたは複数の特性を
同等の基準と比較することを必然的に含む。

【0050】

診断情報：本明細書で用いるとき、「診断情報」または「診断において使用するための
情報」は、患者が疾患、障害もしくは病態を有するかどうかの決定、または表現型カテゴ
リー、もしくは疾患、障害もしくは病態の予後に関して有意性を有する、または疾患、障
害もしくは病態の処置（一般的な処置または任意の特定の処置のいずれか）への可能性の
高い応答、任意のカテゴリーへの疾患、障害もしくは病態の分類において有用である情報
である。同様に、「診断」は、対象が疾患、障害もしくは病態（癌など）を有するまたは
発症する可能性が高いかどうか、対象において顕在化した疾患、障害もしくは病態の状態
、ステージ付けまたは特徴、腫瘍の特性または分類に関連する情報、予後に関する情報ま
たは適切な処置を選択するのに有用である情報を含むが、これに限定されない、任意の種
類の診断情報を提供することを指す。処置の選択は、特定の治療（例えば、化学療法）剤
、または他の処置法、例えば、外科手術、放射線等の選択、治療を控えるか送達するかに
関する選択、投与レジメン（例えば、１つまたは複数の用量の特定の治療剤または治療剤
の組み合わせの頻度またはレベル）に関連する選択、等を含んでよい。

【0051】

分化：「分化」という用語は、特殊化されていない（「未拘束の（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔ
ｅｄ）」）または比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞または筋細胞など
の特殊化された細胞の特性を獲得するプロセスである。分化細胞または分化を誘導された
細胞は、細胞の系統内でより特殊化された状況を呈している細胞である。分化のプロセス
に適用した際の「拘束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」という用語は、通常の環境下で特
定の細胞型または細胞型の小集合に分化し続けるだろう分化経路の点に進行しており、か
つ、通常の環境下では、異なる細胞型に分化するまたはより分化されていない細胞型に戻
ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（ま
たは拘束されて）いない位置に戻るプロセスを指す。本明細書で用いるとき、細胞の系統
は、細胞の遺伝、つまりその細胞がどの細胞から由来したか、またどの細胞を生じさせる
ことができるかを規定する。細胞の系統は、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を
位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異
的に関連した特徴を指し、対象とする系統への未拘束の細胞の分化を評価するために使用
することができる。

【0052】

投与レジメン：（または「治療レジメン」）は、本明細書で用いるとき、典型的には期
間を空けて、対象に個別に投与される単位用量（典型的には、１つより多い）のセットで
ある。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は、推奨される投与レジメンを有し、これ
には１つまたは複数の用量が必然的に含まれ得る。いくつかの実施形態では、投与レジメ
ンは、そのそれぞれがお互いに同じ長さの期間で離れている複数の用量を含む；いくつか
の実施形態では、投与レジメンは、複数の用量及び個別の用量を離す少なくとも２つの異
なる期間を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、所定の期間にわたって連続的に（
例えば、注入により）投与される。いくつかの実施形態では、治療剤は１日１回（ＱＤ）
または１日２回（ＢＩＤ）投与される。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、その
それぞれがお互いに同じ長さの期間で離れている複数の用量を含む；いくつかの実施形態
では、投与レジメンは、複数の用量及び個別の用量を離す少なくとも２つの異なる期間を
含む。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の全ての用量は、同じ単位用量の量のも
のである。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の異なる用量は、異なる量のもので
ある。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第一用量の量の第一用量、その後第一
用量の量とは異なる第二用量の量の１つまたは複数の追加の用量を含む。いくつかの実施
形態では、投与レジメンは、第一用量の量の第一用量、その後、第一用量の量と同じ第二
用量の量の１つまたは複数の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメン
は、適切な母集団全体に投与されたとき、所望のまたは有益な転帰と相関する（つまり、
治療的投与レジメンである）。

【0053】

低酸素：「低酸素」または「低酸素病態」という用語は、本明細書で用いるとき、哺乳
類の１つまたは複数の組織における酸素が生理学的なレベルを下回る、例えば、最適レベ
ル未満である状態または病態を指す。いくつかの実施形態では、低酸素は、ストレス、例
えば、有酸素運動、体重圧、麻酔、外科手術、貧血症、急性呼吸窮迫症候群、慢性疾病、
慢性疲労症候群、外傷、火傷、皮膚潰瘍、癌に起因する悪液質及び他の異化状態等から生
じ得る。いくつかの実施形態では、低酸素は、血管の狭窄または遮断に起因する血流の減
少のためにその組織が酸素欠乏である「虚血」または「虚血性病態」であるかまたはこれ
を含む。虚血または虚血性病態は、冠動脈疾患、アルコール性心筋症を含む心筋症、血管
形成術、ステント留置、バイパス手術または心臓修復手術（「開心術」）などの心臓手術
、臓器移植、組織への長期重圧（褥瘡または床ずれ）、移植された臓器または組織に損傷
を引き起こし得る虚血再灌流傷害、等により引き起こされるものを含む。本開示により提
供される技術は、例えば、低酸素に起因する１つまたは複数の症状を、その根本的原因に
かかわらず、診断する及び／または処置するのに有効であることができる。例えば、いく
つかの実施形態では、本明細書に記載の処置は、たとえそれらが根本的病態（例えば、数
例をあげると、ウイルス性または細菌性感染、細菌または他の毒素への暴露、低い赤血球
数、加齢、癌、運動の継続）の１つまたは複数の態様を処置しないとしても、例えば、低
酸素症に罹患している対象のエネルギーレベル、強さ及び／または健康状態を増加させ得
る。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素病態」という用語は、血液中の
酸素含有率が低い病態を指す。特定の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態
は、おおよそ８０ｍｍ Ｈｇ未満の動脈ＰＯ２値及びおおよそ３０ｍｍ Ｈｇ未満の静脈
ＰＯ２値により定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の
」病態は、おおよそ６０ｍｍ Ｈｇ未満の動脈ＰＯ２値により定義されてよい。ある特定
の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、おおよそ５０ｍｍ Ｈｇ未満の
動脈ＰＯ２値により定義されてよい。特定の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の
」病態は、おおよそ５０～２０ｍｍ Ｈｇ間の動脈ＰＯ２値により定義されてよい。ある
いはまたは加えて、「低酸素」または「低酸素の」病態は、動脈血液または組織から酸素
が存在しないまたはほとんど完全に存在しないとして定義される無酸素症と区別されてよ
い。いくつかの実施形態では、低酸素の型及び重症度は、２ＨＧの絶対的または相対的定
量化または定性化により定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「
低酸素の」病態は、約１０ｍｍ Ｈｇ未満の組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。
いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約５ｍｍ Ｈｇ未満の
組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または
「低酸素の」病態は、約１０ｍｍ Ｈｇ未満の腫瘍内ＰＯ２レベルにおより定義されてよ
い。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約５ｍｍ Ｈｇ未
満の腫瘍内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。「低酸素」または「低酸素の」病態は、
慢性または急性であってよい。「慢性低酸素」は、本明細書で用いるとき、２ＨＧ産生に
おいて測定可能な増加をもたらす持続的低酸素病態を指してよい。つまり、慢性低酸素は
、２ＨＧがベースラインレベルを超えて蓄積することを可能にするのに十分な期間の低酸
素病態として定義されてよい。いくつかの実施形態では、慢性低酸素は、３０分を超える
、１時間を超える、２時間を超える、３時間を超える、４時間を超える、５時間を超える
、１０時間を超える、１２時間を超える、２４時間を超える、１日を超える、または一週
間またはそれ以上の期間の低酸素病態である。いくつかの実施形態では、慢性低酸素は、
血液毛細血管と低酸素性領域との間の組織または腫瘍細胞による酸素の消費及び枯渇によ
り引き起こされる。慢性低酸素の持続的病態とは対照的に、急性低酸素は一過的である。
いくつかの実施形態では、急性低酸素は、組織または腫瘍において血管または微小血管の
一時的な停止があるときに生じる。いくつかの実施形態では、急性低酸素は、赤血球細胞
レベルにおける増減の結果として生じる。

【0054】

低酸素に関連する疾患：「低酸素に関連する疾患、障害または病態」という用語は、低
酸素を伴う（例えば、その発生率または重症度が、低酸素の１つまたは複数の態様と相関
する及び／またはそれを特徴とする）疾患、障害または病態である。いくつかの特定の実
施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、例えば、敗血症性ショック、虚
血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症
、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息
、膿胞性線維症、癌、ある特定の外科的処置であってよいかまたはこれを含んでよい。い
くつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、ストレス、例えば、
有酸素運動、体重圧、麻酔、外科手術、貧血症、急性呼吸窮迫症候群、慢性疾病、慢性疲
労症候群、外傷、火傷、皮膚潰瘍、癌に起因する悪液質及び他の異化状態等と関連する。
いくつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、血管の狭窄または
遮断に起因する血流の減少のためにその組織が酸素欠乏である「虚血」または「虚血性病
態」であるかまたはこれを含む。虚血または虚血性病態は、冠動脈疾患、アルコール性心
筋症を含む心筋症、血管形成術、ステント留置、バイパス手術または心臓修復手術（「開
心術」）などの心臓手術、臓器移植、組織への長期重圧（褥瘡または床ずれ）、移植され
た臓器または組織に損傷を引き起こし得る虚血再灌流傷害、等により引き起こされるもの
を含む。

【0055】

マーカー：マーカーは、本明細書で用いるとき、その存在またはレベルが特定の状態ま
たは事象の特徴である実体または部分を指す。いくつかの実施形態では、特定のマーカー
の存在またはレベルは、疾患、障害、または病態の存在またはステージの特徴であり得る
。一例をあげると、いくつかの実施形態では、本用語は、代謝産物、例えば、特定の低酸
素誘発性傷害等の特徴である、Ｌ－２ＨＧを指す。別の例をあげると、いくつかの実施形
態では、本用語は、遺伝子発現産物、例えば、特定の低酸素誘発性傷害の特徴である、Ｌ
ＤＨＡを指す。いくつかの実施形態では、マーカーは、特定の腫瘍、腫瘍サブクラス、腫
瘍のステージ、等と関連し得る。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、特定
のマーカーの存在またはレベルは、例えば、腫瘍の特定のクラス、例えば、膠芽腫の特徴
であり得る特定のシグナル伝達経路の活性（または活性レベル）と相関する。マーカーの
存在または不在の統計学的有意性は、特定のマーカーに依存して変動し得る。いくつかの
実施形態では、マーカーの検出は、腫瘍が特定のサブクラスのものである高い可能性をそ
れが反映するという点で非常に特異的である。そのような特異性は、感受性と引き換えに
なり得る（つまり、腫瘍がマーカーを発現すると予期され得る腫瘍であったとしても陰性
の結果が起こる可能性がある）。逆に、感受性の程度が高いマーカーは、感度が低いもの
よりもあまり特異的ではない可能性がある。本発明に従って、有用なマーカーは、１００
％の精度で特定のサブクラスの腫瘍を区別する必要はない。

【0056】

質量分析：質量分析は、気相イオンの質量対電荷比に変換することができるパラメータ
を測定する気相イオン分光計を用いた方法を指す。質量分析計は、一般に、イオン源及び
質量分析器を含む。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオ
ントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電場分析器型及びこれらの複合型である
。

【0057】

代謝産物：本明細書で用いるとき、「代謝産物」は、食事及び栄養素の消化、尿及び糞
を通した老廃物の排出、呼吸、血液循環、及び体温調節などのエネルギーを生成するまた
は使用する体内での物理的または化学的プロセス中に産生されるまたは使用される任意の
物質を指す。「代謝前駆体」という用語は、それから代謝産物が作られる化合物を指す。
「代謝産生物」という用語は、代謝経路の一部である任意の物質を指す（例えば、代謝物
、代謝前駆体）。

【0058】

調節物質：「調節物質」という用語は、対象となる活性が観察される系内のその存在ま
たはレベルが、調節物質が不在のときにそれ以外は同等の条件下で観察されるものと比較
して、その活性のレベルまたは特性における変化と相関する実体を指すために使用される
。いくつかの実施形態では、調節物質は、アクチベーターであり、調節物質が不在のとき
にそれ以外は同等の条件下で観察されるものと比較して、その活性がその存在において増
加する。いくつかの実施形態では、調節物質は、アンタゴニストまたは阻害剤であり、調
節物質が不在のときのそれ以外は同等の条件と比較して、その活性がその存在において低
下する。いくつかの実施形態では、調節物質は、その活性が対象となるものである標的実
体と直接相互作用する。いくつかの実施形態では、調節物質は、その活性が対象となるも
のである標的実体と間接的に（つまり、標的実体と相互作用する中間剤と直接的に）に相
互作用する。いくつかの実施形態では、調節物質は、対象となる標的実体のレベルに影響
を与える；あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、調節物質は、標的実体のレ
ベルに影響を与えることなく対象となる標的実体の活性に影響を与える。いくつかの実施
形態では、調節物質は、対象となる標的実体のレベル及び活性の両方に影響を与え、ゆえ
に活性において観察される差異は、レベルにおいて観察される差異により完全に説明され
ないかまたはそれに比例しない。

【0059】

正常酸素状態の：本明細書で用いるとき、「正常酸素状態の」という用語は、慢性的に
または急性的に低酸素ではない血清または組織ＰＯ２レベルを指す。本用語が「個体」ま
たは「対象」を修飾するように使用されるときは、本用語は、慢性または急性低酸素を有
さない個体または個体の群を指す。例えば、特定の実施形態では、正常酸素状態の個体は
、おおよそ８０～１００ｍｍ Ｈｇ間の動脈ＰＯ２またはおおよそ３０～５０ｍｍ Ｈｇ
間の静脈ＰＯ２を有する。「正常酸素状態」または「正常酸素状態の」は、インビボまた
はインビトロでおおよそ２１％の大気酸素分圧により代替的にまたは追加的に定義されて
よい。いくつかの実施形態では、正常酸素状態のレベルは、慢性または急性低酸素を有さ
ない個体の集団全体にわたってまたはその中で提示されるレベルを考慮することで確立さ
れる。例えば、いくつかの実施形態では、正常酸素状態のレベルは、そのような集団全体
にわたるまたはその中でのレベルの平均、中央値、または平均値を表し、典型的に統計学
的有意性を示す。いくつかの実施形態では、「正常酸素状態の」病態は、約１０ｍｍ Ｈ
ｇを超える組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。いくつかの実施形態では、

【0060】

栄養素：本明細書で用いるとき、「栄養素」という用語は：細胞、組織または生体の健
康に寄与するアミノ酸及びペプチド、ビタミン、ヌクレオチド、脂肪酸、炭水化物、ミネ
ラル及び他の物質または材料を指す。

【0061】

医薬組成物：本明細書で用いるとき、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の
薬学的に許容され得る担体と一緒に製剤化された活性剤を指す。いくつかの実施形態では
、活性剤は、適切な母集団に投与されたときに、所定の治療効果を達成する統計学的に有
意な可能性を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量の量で存在する。いくつか
の実施形態では、医薬組成物は、以下、すなわち経口投与、例えば、水薬（水系または非
水系液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を標的とするもの、
ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト；非経口投与、例えば、皮下、筋
肉内、静脈内または硬膜外注射によって、例えば、滅菌液剤または懸濁剤、または徐放性
製剤として；局所適用、例えば、皮膚、肺、または口腔に適用するクリーム、軟膏、また
は制御放出性パッチまたは噴霧剤として；膣内にまたは直腸内に、例えば、ペッサリー、
クリーム、または泡として；舌下；点眼；経皮；または経鼻、肺、及び他の粘膜表面に適
するものを含む固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得る。

【0062】

薬学的に許容され得る：「薬学的に許容され得る」という用語は、本明細書で用いると
き、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題
または合併症を伴わず、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、ヒトまたは動物の組
織との接触における使用に好適である薬剤を指す。

【0063】

薬学的に許容され得る担体：本明細書で用いるとき、「薬学的に許容され得る担体」と
いう用語は、対象化合物をある臓器、または身体の部分から、別の臓器または身体の部分
へと運ぶことまたは輸送することに関与する、薬学的に許容され得る材料、組成物または
ビヒクル、例えば、材料を封入した液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒
を指す。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で「許
容可能」でなくてはならない。薬学的に許容され得る担体として機能することができる材
料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；トウモロコ
シデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びカルボキシメチル
セルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末ト
ラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；落
花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油など
の油；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニト
ール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エ
チルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；
アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ｐＨ
緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリ無水物；及び医薬製剤に採用される
他の非毒性適合物質が挙げられる。

【0064】

予防：「予防」という用語は、本明細書で用いるとき、発症の遅延、または特定の疾患
、障害もしくは病態の１つまたは複数の症状の頻度もしくは重症度の低下を指す。いくつ
かの実施形態では、予防は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状の発症、頻度
、または強度において統計学的に有意な低減が、疾患、障害、または病態に感受性である
集団において観察される場合に、薬剤が特定の疾患、障害または病態を「予防する」とみ
なされるように集団に基づいて評価される。

【0065】

前駆細胞：本明細書で用いるとき、「前駆細胞」という用語は、より大きな発生能を有
する細胞、つまり、分化により生じることができる細胞と比較してより初期である（例え
ば、発生経路または進行に沿ってより初期段階である）細胞の表現型を指す。しばしば、
前駆細胞は、有意または非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、細胞が発生し分化する
発生経路及び環境に依存して、より低い発生能を有する、つまり、分化した細胞型の複数
の別個の細胞、または単一の分化した細胞型を生じさせることができる。

【0066】

基準：「基準」という用語は、それに対して対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列
または値が比較される、標準または対照の薬剤、個体、集団、試料、配列または値を記載
するために本明細書でしばしば使用される。いくつかの実施形態では、基準の薬剤、個体
、集団、試料、配列または値は、対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列または値の試
験または決定と実質的に同時に試験または決定される。いくつかの実施形態では、基準の
薬剤、個体、集団、試料、配列または値は、歴史的な基準であり、任意選択的に有形的表
現媒体において具体化される。典型的には、当業者によって理解され得るように、基準の
薬剤、個体、集団、試料、配列または値は、対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列ま
たは値の決定または特徴づけに活用されるものと同等の条件下で決定されるまたは特徴づ
けられる。

【0067】

応答：本明細書で用いるとき、処置に対する応答は、処置の結果として起こるまたは処
置に相関する対象の病態における任意の有益な変化を指してよい。そのような変化は、病
態の安定化（例えば、処置がなければ起こるだろう悪化の予防）、病態の症状の寛解、ま
たは病態の治癒への見込みにおける改善等を含んでよい。それは、対象の応答または腫瘍
の応答を指してよい。腫瘍または対象応答は、臨床的な判定基準及び客観的な判定基準を
含む、広範な判定基準に従って測定されてよい。応答を評価するための技術には、臨床検
査、ポジトロン放射断層法、胸部Ｘ線ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波検査、内視鏡検査、
腹腔鏡検査、対象から得られた試料における腫瘍マーカーの存在またはレベル、細胞学的
検査、ＧＣ－ＭＳ、または組織学的検査が含まれるがこれらに限定されない。厳密な応答
判定基準は、腫瘍または患者の群を比較するときは、比較される群は、応答率を決定する
ために同じまたは同等の判定基準に基づいて評価されるということを条件として、任意の
適切な様式で選択されることができる。当業者は、適切な判定基準を選択することができ
るだろう。

【0068】

リスク：文脈から理解され得るように、疾患、障害または病態の「リスク」は、特定の
個体が疾患、障害、または病態を発症し得る可能性の度合いである。いくつかの実施形態
では、リスクは、割合（％）として表現される。いくつかの実施形態では、リクスは、０
、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１００％までである。いくつかの
実施形態では、リスクは、基準試料または基準試料の群に関連するリスクに対するリスク
として表現される。いくつかの実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障
害、または病態の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、基準試料または基準
試料の群は、特定の個体と同等の個体からのものである。いくつかの実施形態では、相対
的リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。

【0069】

試料：本明細書で用いるとき、「試料」という用語は、典型的に、本明細書に記載のよ
うに、対象となる供給源から得られたまたはそれに由来する生体試料を指す。いくつかの
実施形態では、対象となる供給源は、動物またはヒトなどの生体を含む。いくつかの実施
形態では、生体試料は、生物学的組織または液体であるかまたはこれを含む。いくつかの
実施形態では、生物学的試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織または細針生検試料
；細胞を含有する体液；浮動性（ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ）核酸；喀痰；唾液；尿；
脳脊髄液、腹水；胸水；糞便；リンパ；婦人科学的流体；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔ス
ワブ；鼻スワブ；洗浄液または洗浄物、例えば腺管洗浄物または気管支肺胞（ｂｒｏｎｃ
ｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄物；吸引物；擦過物；骨髄検体；組織生検検体；外科的検
体；糞便、他の体液、分泌物または排出物；またはそれらに由来する細胞等であってよい
かまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、生体試料は、個体から得られた細
胞であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、得られた細胞は、試料を得た個
体から得られた細胞であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象
となる供給源から任意の適切な手段によって直接的に得られた「一次試料」である。例え
ば、いくつかの実施形態では、一次生体試料は、生検（例えば、細針吸引または組織生検
）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ、糞便等）の収集等からなる群から選択され
る方法によって得られる。いくつかの実施形態では、文脈から明らかであり得る通り、「
試料」という用語は、一次試料の処理によって（例えば、一次試料の１つまたは複数の構
成成分を除去することによって、または一次試料に１つまたは複数の薬剤を添加すること
によって）得られる調製物を指す。例えば、半透過膜を使用して濾過する。このような「
処理された試料」は、試料から抽出された、または一次試料を、ｍＲＮＡの増幅もしくは
逆転写、ある特定の構成成分の単離または精製などの技術に供することによって得られた
、例えば核酸またはタンパク質を含んでよい。

【0070】

小分子：本明細書で用いるとき、「小分子」という用語は、低分子量の有機化合物また
は無機化合物を意味する。一般に、「小分子」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未
満の分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、ま
たは約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）
、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未
満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００
ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００
ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマーではない。いくつ
かの実施形態では、小分子は、ポリマー部分を含まない。いくつかの実施形態では、小分
子は、タンパク質またはポリペプチドではない（例えば、オリゴペプチドまたはペプチド
ではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリヌクレオチドではない（例えば、
オリゴヌクレオチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、多糖類ではない。
いくつかの実施形態では、小分子は、多糖類を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテ
オグリカン、糖脂質等ではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、脂質ではない。
いくつかの実施形態では、小分子は、調節剤である。いくつかの実施形態では、小分子は
、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、小分子は、検出可能である（例えば
、少なくとも１つの検出可能な部分を含む）。いくつかの実施形態では、小分子は、治療
的である。

【0071】

特異的：「特異的」という用語は、活性を有する薬剤または実体を参照して本明細書で
用いるとき、当業者には、その薬剤または実体が、潜在的に可能な標的または状態の間の
違いを識別することを意味すると理解される。例えば、薬剤は、競合する代替標的の存在
下でその標的に優先的に結合する場合、その標的に「特異的に」結合するとされる。いく
つかの実施形態では、薬剤または実体は、その標的に結合する条件下では、競合する代替
標的に検出可能に結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤または実体は、競合する代
替標的（複数可）と比較して、その標的に対してより高いオン速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、
より低いオフ速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、増加した親和性、低減した解離性、または増加
した安定性を伴って結合する。

【0072】

ストレス誘発性障害：「ストレス誘発性障害」という用語は、生体がその恒常性を乱す
環境に置かれたときに生じるものを含む。疾病、疾患、生命を脅かす事象、飢餓、疲労、
低酸素等の事象は、全て生体に対するストレス因子であると理解される。いくつかの実施
形態では、ストレス誘発性障害は、低酸素により引き起こされる。

【0073】

幹細胞：「幹細胞」という用語は、自己複製し、分化して後代細胞を産生するという両
方の、単一細胞のレベルでのそれらの能力により定義される未分化細胞を含むがこれに限
定されない。後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が挙
げられる。例えば、「幹細胞」は、（１）全能性幹細胞；（２）多能性幹細胞；（３）複
能性幹細胞；（４）小能性幹細胞；及び（５）単能性幹細胞を含んでよい。

【0074】

対象：「対象」は、哺乳類（例えば、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態を含
むヒト）を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、関連性のある疾患、障害または
病態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態に感受性
である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症
状または特徴を呈している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態の
いずれの症状または特徴も呈さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害もし
くは病態に対する感受性、または疾患、障害もしくは病態のリスクに特徴的な１つまたは
複数の特徴を有するものである。対象は、患者であることができ、それは、疾患の診断ま
たは処置を提供する医師の診察を受けるヒトを指す。いくつかの実施形態では、対象は、
治療を施される個体である。

【0075】

実質的に：本明細書で用いるとき、「実質的に」という用語は、対象となる特徴または
特性の全てまたはほぼ全ての程度または度合いを呈する質的な状態を指す。生物学的分野
の当業者は、生物学的現象及び化学的現象が、完全であるかもしくは完全に至るまで進行
する、または絶対的な結果を達成するまたは回避することは、仮にあるとしてもめったに
ないことを理解するだろう。ゆえに、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの
生物学的現象及び化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される
。

【0076】

感受性である：疾患、障害または病態（例えば、インフルエンザ）に「感受性である」
個体は、その疾患、障害または病態を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、
疾患、障害または病態に感受性である個体は、その疾患、障害または病態のいずれの症状
も呈さない。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態に感受性である個体は、そ
の疾患、障害または病態を有していると診断されていない。いくつかの実施形態では、疾
患、障害または病態に感受性である個体は、その疾患、障害または病態の発症に関連する
条件に曝露されている個体である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態を発
症するリスクは、集団に基づくリスクである（例えば、疾患、障害または病態に罹患して
いる個体の家族）。

【0077】

症状が低下する：本発明に従い、特定の疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状
が大きさ（例えば強度、重症度等）または頻度において低下するとき、「症状が低下する
」。明確にする目的で、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度が低下する１つの形
態とみなされる。比較的小さい腫瘍を有する多くの癌患者は、症状がない。本発明は、症
状が排除される場合だけに限定されることを意図しない。本発明は、具体的には、１つま
たは複数の症状が、完全には排除されなくても低下する（及び対象の病態が、それによっ
て「改善される」）ように処置を企図する。

【0078】

治療剤：本明細書で用いるとき、「治療剤」という表現は、一般に、生体に投与される
と所望の薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、
適切な集団全体に統計学的に有意な効果があることを実証する場合に、治療剤であるとみ
なされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生体の集団であってよい。い
くつかの実施形態では、適切な集団は、例えば、ある特定の年齢群、性別、遺伝的背景、
既存の臨床状態等の様々な判定基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治
療剤は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状または特徴を、軽減する、寛解さ
せる、和らげる、阻害する、防止する、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる
、またはその発生率を低下させるために使用できる物質である。いくつかの実施形態では
、「治療剤」は、ヒトに投与するために販売され得る前に、政府機関によって承認されて
いるかまたは承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態では、「治療剤」は
、ヒトに投与するために医学的処方箋が必要とされる薬剤である。

【0079】

治療有効量：本明細書で用いるとき、それが投与されるものにとって所望の効果を産生
する量を意味する。いくつかの実施形態では、本用語は、治療投与レジメンに従って、疾
患、障害、または病態に罹患しているまたは感受性である集団に投与されたときに、該疾
患、障害、または病態を処置するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療有
効量は、疾患、障害、または病態の１つまたは複数の症状の、発生率または重症度を低下
させる、またはその発症を遅らせるものである。当業者は、「治療有効量」という用語が
、特定の個体において処置の成功が実際に達成されることを要しないことを理解するだろ
う。むしろ、治療有効量は、そのような処置を必要とする患者に投与されたとき、有意な
数の対象において特定の所望の薬理学的な応答を提供する量であってよい。いくつかの実
施形態では、治療有効量への言及は、１つまたは複数の特定の組織（例えば、疾患、障害
または病態に冒された組織）または液体（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿、等）
において測定される量への言及であってよい。当業者は、いくつかの実施形態では、治療
有効量の特定の薬剤または治療が、製剤化されてよいかまたは単回用量で投与されてよい
ことを理解するだろう。いくつかの実施形態では、治療的に有効な薬剤は、例えば、投与
レジメンの一部として、製剤化されてよいかまたは複数の用量で投与されてよい。

【0080】

処置：本明細書で用いるとき、「処置」（「処置する」または「処置すること」）とい
う用語は、特定の疾患、障害または病態（例えば、癌）の１つまたは複数の症状、特性ま
たは原因を、部分的または完全に軽減する、寛解させる、和らげる、阻害する、その発症
を遅延させる、その重症度を低下させる、またはその発生率を低下させる物質（例えば、
抗受容体チロシンキナーゼ抗体または受容体型チロシンキナーゼアンタゴニスト）の任意
の投与を指す。このような処置は、関連性のある疾患、障害もしくは病態の徴候を呈さな
い対象、または疾患、障害もしくは病態の初期徴候だけを呈する対象のものであってよい
。あるいはまたは加えて、このような処置は、関連性のある疾患、障害または病態の、１
つまたは複数の確立された徴候を呈する対象のものであってよい。いくつかの実施形態で
は、処置は、関連性のある疾患、障害または病態に罹患していると診断された対象のもの
であってよい。いくつかの実施形態では、処置は、関連性のある疾患、障害または病態が
発症するリスクの増加に統計的に相関している、１つまたは複数の感受性要因を有するこ
とが公知の対象のものであってよい。

【0081】

単位用量：「単位用量」という表現は、本明細書で用いるとき、医薬組成物の単回用量
としてまたは物理的に別個の単位で投与される量を指す。多くの実施形態では、単位用量
は、所定量の活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、単位用量は、薬剤の単回用量
全体を含有する。いくつかの実施形態では、１つより多いの単位用量が、全ての単回用量
を達成するために投与される。いくつかの実施形態では、意図した効果を達成するために
、複数の単位用量の投与が必要とされるか、または必要であると予測される。単位用量は
、例えば、所定量の１つまたは複数の治療剤を含有する液体（例えば、許容され得る担体
）の体積、固体形態の所定量の１つまたは複数の治療剤、所定量の１つまたは複数の治療
剤を含有する徐放製剤または薬物送達デバイス等であってよい。単位用量は、治療剤（複
数可）の代わりにまたはそれに加えて、様々な構成成分のいずれかを含む製剤内に存在し
てよいことが理解されるだろう。例えば、許容され得る担体（例えば、薬学的に許容され
得る担体）、希釈剤、安定剤、緩衝液、保存剤等が、下記のように、含まれてよい。多く
の実施形態では、特定の治療剤の適切な１日の総投与量は、一部または複数の単位用量を
含んでよく、例えば担当医によって健全な医学的判断の範囲内で決定されてよいことを、
当業者は理解するだろう。いくつかの実施形態では、任意の特定の対象または生体のため
の特定の有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される特定の活性化
合物の活性；採用される特定の組成物；対象の年齢、体重、全身健康状態、性別及び食事
；採用される特定の活性化合物の投与時間及び排出速度；処置期間；採用される特定の化
合物（複数可）と組み合わせてまたは同時に使用される薬物または追加の治療、及び医療
分野で周知の類似の因子を含む、様々な因子に依存してよい。

【0082】

ある特定の実施形態の詳細説明
本発明は、なかでも、低酸素と関連する病態を診断または処置するための組成物または
システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞多能性または分化を調節
するための組成物またはシステムも記載する。

【0083】

本発明の様々な態様は、以下の項において詳細に記載される。項の使用は、本発明の限
定を意図しない。各項は、本発明の任意の態様に適用されることができる。この出願では
、「または」の使用は、別段の指定がない限り、「または」を意味する。

【0084】

低酸素及びストレス誘発性代謝
ストレス、例えば、低酸素、感染、飢餓、温度、毒性等は、細胞の代謝に著しく影響を
与え、主要な疾患に寄与する。下記の実施例に示すように、本発明の実施形態は、ストレ
ス誘発性代謝の試験を包含する。いくつかの実施形態では、ストレスは、低酸素により引
き起こされる。

【0085】

低酸素は、様々な疾患プロセスに関与し、未処置のままにされた場合、著しい組織損傷
の原因となる。酸素の、定常的な不断の供給が生命を維持させるために不可欠である。低
酸素は、血液または組織中の酸素含有率が低い状態であり、酸素供給と需要の不均衡から
生じる。低酸素のいくつかの異なるサブタイプが知られている。例えば、貧血性低酸素は
、機能的ヘモグロビンの濃度の低減または赤血球細胞の数の減少による。低酸素性低酸素
は、肺内での酸素化の欠損メカニズムから生じ、これは低圧の酸素、肺機能の異常、気道
閉塞、または心臓における右から左短絡により引き起こされ得る。酸素親和性低酸素は、
酸素を還元するヘモグロビンの能力の低下による。組織または細胞の低酸素は、冠動脈血
流の中断または動脈血酸素分圧（ＰＯ２）における低下により引き起こされる。

【0086】

生命を維持するための酸素の必要性を考慮すると、生体は、多様なメカニズムを進化さ
せて、酸素利用可能度の急性及び慢性の両方の低減；つまり、急性及び慢性低酸素に対応
してきた。多細胞生体、特に哺乳類にとって、これらのメカニズムは、赤血球生成、血管
新生及び細胞の活性を最小許容可能レベルで維持するように設計された適応性の代謝変化
を含む。急性低酸素は、脳卒中、敗血症性ショック、心筋梗塞、及び外科的処置中などの
状況において生じる。一方で、慢性低酸素は、貧血症、うっ血性心不全、肺疾患、先天性
心疾患、ならびに癌と関連する。

【0087】

しかしながら、低酸素に関連する疾患の上記リストが低酸素に関与するすべての病態の
完全なリストではないことが理解されたい。当業者は、本開示の組成物またはシステムが
、上記リストにないものを含む任意の低酸素に関連する疾患、障害または病態に適用され
ることができることを知っている。

【0088】

低酸素条件下でのＬ－２ＨＧ代謝
栄養素及び代謝中間体が、細胞の成長及び増殖を促進することに加えて生理学的攪乱（
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）に対する細胞の応答に影響を与
えることができることが知られている（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎら、２００９；Ｗａ
ｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。本開示は、なかでも、Ｌ－２ＨＧ誘発を、低酸
素により強いられたストレスに対する新規の細胞の代謝的応答として同定する。

【0089】

本開示は、２ＨＧの以前の知識を大幅に拡張し、Ｌ－２ＨＧを細胞の代謝のある特定の
機能を制御する新規代謝産物として実証する。栄養素及び代謝産物は、基礎的な細胞のプ
ロセスに影響を与える（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｖａｎｄｅｒ
Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。α－ＫＧ及び２ＨＧ間の関係は、一つのそのような例とし
て提案されている。例えば、α－ＫＧは、ヒストン及びＤＮＡのジメチル化、ＨＩＦ１α
安定性の制御、及びコラーゲンの成熟化などの多様な機能に関与するおおよそ７０種の異
なる酵素に対する必須基質として機能する（Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３）
。これらの酵素的プロセスをα－ＫＧ利用能につなげることにより、細胞の代謝的適応は
、系統分化及び環境的ストレス要因への適応などの重要な細胞の「決断」に密接につなが
ることができる。「癌代謝物」Ｄ－２ＨＧによるα－ＫＧに依存する酵素活性の阻害は、
それによりＩＤＨ１／２における発癌性変異が正常な細胞の生理機能を崩壊させる主なメ
カニズムを表すと思われる（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｌｏｓｍａ
ｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３；Ｗａｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。

【0090】

２－ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）は、Ｄ－またはＬ－立体異性体のいずれでも存在
することができるキラル分子である。Ｌ－２ＨＧと比べて、Ｄ－２ＨＧは、集中的な研究
の対象となっている。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）におけ
る変異は、「癌代謝物」Ｄ－２－ヒドロキシグルタル酸（Ｄ－２ＨＧ、（Ｒ）－２－ヒド
ロキシグルタル酸としても知られる）の産生をもたらす。Ｄ－２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉ
ファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素を含む、α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）に依
存する酵素の競合阻害剤として機能することにより悪性細胞の分化を妨害する。

【0091】

ＩＤＨ１／２変異による悪性病変の分子病態におけるＤ－２ＨＧの役割の解明に焦点を
あてた集中的な研究努力とは対照的に、正常な細胞生理学におけるＤ－２ＨＧ及びＬ－２
ＨＧの制御された産生及び排除の潜在的な役割は、あまり注目されていない（Ｋｒａｎｅ
ｎｄｉｊｋら、２０１２）。癌関連ＩＤＨ１／２変異は、Ｄ－２ＨＧを排他的に産生する
が、生化学研究は、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸（Ｌ－２ＨＧ、（Ｒ）－２－ヒドロキ
シグルタル酸）が、α－ＫＧに依存する酵素のより強力な阻害剤として機能することを実
証している。しかしながら、Ｌ－２ＨＧの生物学的源または活性は未知のままである。両
方の２－ヒドロキシグルタル酸エナンチオマーの潜在的な生理学的役割は、Ｄ２ＨＧＤＨ
（Ｄ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）及びＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ－２－ヒドロ
キシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）として知られる進化的に保存されている「老廃物処理
」酵素の存在により示され、それらの唯一の機能は、それぞれＤ－２ＨＧまたはＬ－２Ｈ
Ｇをα－ケトグルタル酸に変換することである。

【0092】

本開示は、なかでも、Ｌ－２ＨＧ誘発を、低酸素により強いられた環境的ストレスに対
する新規の細胞の代謝応答として同定する。例えば、本発明者らは、低酸素におけるＬ－
２ＨＧの産生は、ＩＤＨ１／２とは独立して起こり、代わりに主にＬＤＨＡによるα－Ｋ
Ｇの無差別酵素的還元を介して生じることを発見した。

【0093】

本開示は、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２の機能喪失は、複数のタイプの細胞において低酸素
条件ではＬ－２ＨＧの産生を損なわないことを実証する。ゆえに、ＩＤＨ１／２酵素は、
基質結合の際の立体的拘束のために、α－ＫＧをＬ－２－ヒドロキシグルタル酸に還元さ
せることができない可能性が高い。本発明者らは、その主な触媒活性が、α－ＫＧ及びＬ
－２ＨＧに対する構造的類似性を伴ったα－ケト酸基質のＬ－ヒドロキシル酸への還元を
必然的に含む代謝酵素の要件を試験した。

【0094】

しかしながら、本開示は、際立って、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）が、低酸素誘発性
Ｌ－２ＨＧの産生に必要とされる主要な酵素であることを実証する。本開示は、低酸素誘
発性Ｌ－２ＨＧへのＭＤＨ１及びＭＤＨ２からの部分的な寄与を同定する。これらの所見
は、ＬＤＨＡ及びＭＤＨ２の組み合わせ除去が、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧのほぼ全ての抑
止も結果もたらしたときに確認された。本開示は、例えば、遺伝子操作（例えば、機能喪
失）及び構造生物学を含む、複数連の証拠からＬ－２ＨＧ代謝におけるＬＤＨＡの役割を
実証する。例えば、本発明者らは、ＬＤＨＡの活性部位が、Ｌ－２ＨＧへのα－ＫＧの還
元に対応することができることを発見した。まとめると、本開示からのこれらの知見は、
低酸素性細胞が、細胞基質のＭＤＨ１及びミトコンドリアのＭＤＨ２からの少しの寄与を
伴って、ＬＤＨＡによる乱雑な基質使用を介して細胞質でグルタミン由来のα－ＫＧの還
元からＬ－２ＨＧを産生することができることを示唆する。

【0095】

低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、利用できる酸素が制限されたときに、それにより細胞がα
－ＫＧに依存するプロセス（例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化）を抑圧し得る分子メ
カニズムを表す。本発明者らは、Ｌ－２ＨＧが、低酸素適応のα－ＫＧ依存性逆転を抑制
できることを発見した。ゆえに、本開示は、なかでも、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧが、それ
を通して細胞が低酸素適応に反作用し得るα－ＫＧに依存するプロセスの抑圧を維持する
ことができる手段を表すことを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２Ｈ
Ｇの低酸素誘発性蓄積がグルタミン依存性であることを実証し、これは、低酸素における
グルタミン依存性Ｌ－２ＨＧ産生と持続的なＨＩＦ１α誘発との間の連結を示す。

【0096】

いくつかの実施形態では、本開示は、環境的ストレス、具体的には低酸素が、Ｌ－２Ｈ
Ｇを制御する細胞のメカニズムを引き起こすことを記載する。それゆえ、本開示は、それ
により低酸素がＬ－２ＨＧ代謝に影響を与える分子メカニズムを解明した。

【0097】

低酸素及び低酸素誘発性傷害の診断
本発明は、なかでも、低酸素または低酸素誘発性傷害について診断する新規システムを
提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素に関連する疾患、障害または病態
を診断するためのシステムを記載する。通常条件下の哺乳類細胞及び体液中でめったに痕
跡量で見いだされない代謝産物である、Ｌ－２ＨＧが、不十分な酸素供給の条件下で再現
性よく有意に上昇し、低酸素または低酸素誘発性傷害のバイオマーカーとして十分に機能
することが、本発明に従って決定されている。

【0098】

Ｌ－２ＨＧが、ＬＤＨＡの作用を通してクエン酸回路中間体α－ケトグルタル酸の非カ
ルボキシル化還元から生じることが、本発明に従って決定された。本開示は、ＭＤＨ１ま
たはＭＤＨ２もこのプロセスに寄与することを実証する。通常条件下では、Ｌ－２ＨＧを
産生するこの反応の程度は最小であり、産生されるＬ－２ＨＧは、Ｌ－２ＨＧを酸化させ
てα－ケトグルタル酸へと戻すように機能する、Ｌ－２ＨＧデヒドロゲナーゼの酵素活性
のために実質的に蓄積しない。しかしながら、本明細書に開示するように、低酸素条件後
は、α－ケトグルタル酸の正常な酸化的代謝がヒト細胞中で抑制され、α－ケトグルタル
酸は、Ｌ－２ＨＧの蓄積をもたらす還元的代謝を優先的に受ける。

【0099】

Ｌ－２ＨＧ上昇は、低酸素と共に生じ、細胞レベルでの代謝における変化を反映する。
血清総２ＨＧ（両Ｌ－及びＤ－２ＨＧ）が上昇する低酸素とは独立した既知の状況は、生
殖細胞系列遺伝子変異を必然的に含む稀な代謝の先天異常、またはＩＤＨ１／２遺伝子内
の特定の体細胞変異を伴う骨髄性血液悪性腫瘍に限られる。これらの患者は、心肺疾患ま
たは組織低酸素を呈する数に対して稀であり、それらの症状は特有であり重複しない。そ
れゆえ、慢性低酸素のＬ－２ＨＧを試験することに伴う偽陽性のリクスは低い傾向にある
。

【0100】

実施例の項において論ずるように、Ｌ－２ＨＧは、低酸素のバイオマーカーであり、低
酸素の診断に使用することができると発見されている。Ｌ－２ＨＧレベルは、当業者に公
知の任意の方法で検出されてよい。様々な検出方法の非限定的な例を下記に論ずる。本発
明は、ガスクロマトグラフィー質量分析（「ＧＣ－ＭＳ」）、液体クロマトグラフィー質
量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、酵素アッセイ及び免疫系の方法などの方法が、Ｌ－２ＨＧレ
ベルの測定に使用されてよいという具体的な見識を提供する。本発明は、キラル誘導体化
が、Ｄ－２ＨＧとＬ－２ＨＧを区別するために使用されることができるということを提供
する。

【0101】

いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素及び低酸素誘発性傷害を診断するための方
法を記載する。ある特定の実施形態では、血液または組織中のＬ－２ＨＧのレベルを測定
することは、組織低酸素に感受性の及び特異的なバイオマーカーとして機能し得、低酸素
に関連する疾患、障害または病態の診断またはモニタリングについて潜在的な臨床的な関
連を伴う。

【0102】

本発明は、なかでも、低酸素が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、またはＬ－２ＨＧデ
ヒドロゲナーゼを含むがこれに限定されない、ある特定のＬ－２ＨＧ関連酵素の発現また
は活性により診断されることができることを提供する。これらの酵素が測定される実施形
態では、追加のマーカーが当業者に公知の任意の方法によって測定されてよい；例えば、
イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット法）、ハイブリダイゼーション（例えば、
ノーザンブロット法）、ＲＴ－ＰＣＲ、及び質量分析）。例えば、特定の実施形態では、
Ｌ－２ＨＧレベルは、ＧＣ－ＭＳによりアッセイされ、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、
またはＬ－２ＨＧデヒドロゲナーゼの、核酸またはイムノアッセイをベースとする測定と
組み合わせて評価または相関されてよい。

【0103】

いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ－２ＨＧのレベルは、正常酸素状態
対照対象からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、
本開示は、対象からのＬ－２ＨＧのレベルは、急性低酸素または慢性低酸素と診断された
患者からのものと比較することができることを記載する。

【0104】

本開示は、患者における低酸素誘発性傷害を診断するためのシステムを代替的にまたは
追加的に記載する。症候性または亜症候性でない低酸素誘発性傷害は、臨床的に診断する
ことがしばしば難しい。しかしながら、試料からＬ－２ＨＧレベルを測定することは、対
象における低酸素誘発性傷害についての指標を与え得る。

【0105】

本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を診断することまたは処置することを伴う、
それに対してＬ－２ＨＧレベルを比較することができるパラメータを記載する。一例をあ
げると、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対
象のものと比較して上昇している対象への低酸素治療を施すことによる低酸素の処置を記
載する。いくつかの実施形態では、Ｌ－２ＨＧのレベルの上昇は、正常酸素状態の対象に
ついて観察されるものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、
少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、
少なくとも１０倍であるか、またはさらに高い

【0106】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧが、低酸素または低酸素誘発性傷害を
診断するために単独で使用され得ることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は
、診断においてバイオマーカーセットの一部としてＬ－２ＨＧを使用する方法を記載する
。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの試料中の少なくとも２つのバ
イオマーカーを測定する方法を記載し、ここで少なくとも２つのバイオマーカーのうちの
１つはＬ－２ＨＧである。

【0107】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するような低酸素マーカーは、患者試料中で
測定される。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、心臓、動脈、脳、腫瘍、または
それらの組み合わせからの組織試料であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの
実施形態では、試料は、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液であってよいかまたはこ
れを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、静脈血試料であってよいかまたはこ
れを含んでよい。

【0108】

当業者は、低酸素性状態が、低酸素性傷害を有する組織、例えば、腫瘍、及び隣接する
または近接する組織の両方において見出され得ることを理解するだろう。例えば、慢性低
酸素は、血液毛細血管及び低酸素性領域間の腫瘍細胞による酸素の消費及び枯渇により引
き起こされ得る。ゆえに、組織または対象が低酸素であるかどうかを決定するためのＬ－
２ＨＧレベルの測定のための試料は、腫瘍そのものかまたは近接する組織から得てよい。

【0109】

くつかの実施形態では、本開示は、患者集団を（例えば、低酸素治療での処置に対する
それらの候補性に関して）層別化するため、または１つまたは複数の対象に施したときの
特定の治療の有効性をモニターするまたは調節するための技術を提供する

【0110】

いくつかの実施形態では、本開示は、治療的介入の臨床的評価のためのバイオマーカー
としてのＬ－２ＨＧの使用を記載する。例えば、血液からのＬ－２ＨＧのクリアランスは
、低酸素に関連する疾患、障害または病態に対する治療的介入の妥当性を評価するための
バイオマーカーとして使用することができる。適切な処置の特定もしくは選択、患者が処
置に陽性反応を有するかどうかの決定、または処置の最適化は、これらの方法で得られた
情報を使用して導くことができる。

【0111】

いくつかの実施形態では、本発明は、対照において、治療の有効性を評価する、治療に
対する応答性をモニタリングする、疾患経過の予後、疾患進行の測定のための方法を提供
する。例えば、１つまたは複数の時点の対象から得た生体試料について決定された好適な
バイオマーカー（例えば、Ｌ－２ＨＧ、またはＬＤＨＡの発現／活性）のレベルは、１つ
または複数の他の時点の対象からのレベルと比較される。

【0112】

Ｌ－２ＨＧの調節
本明細書で提供する方法及び組成物が、様々な低酸素に関連する疾患、障害または病態
のいずれかを処置するために使用されてよいことが企図される。Ｌ－２ＨＧが、コラーゲ
ン成熟化に関与する酵素の強力な阻害剤であると示されている（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２０１２）ため、Ｌ－２ＨＧの低酸素性誘発は、虚血性組織傷害後の組織修
復及び新血管形成に関与し得る。例えば、本開示は、Ｌ－２ＨＧ産生の治療的操作、例え
ば、ＬＤＨＡ活性（低酸素性Ｌ－２ＨＧの主な源）の調節、Ｌ－２ＨＧの外因性補充等が
、心筋梗塞または虚血性脳卒中などの病態において利益となり得ることを記載する。

【0113】

治療的使用は、単独で、またはかかる低酸素に関連する疾患、障害もしくは病態の処置
に使用されると知られている他の処置と組み合わせて、Ｌ－２ＨＧ代謝を調節する薬剤の
投与を含む。例えば、いくつかの実施形態では、癌を有する患者については、治療的使用
は、単独で、または化学療法等の癌療法と組み合わせて、Ｌ－２ＨＧ代謝を調節する薬剤
の投与を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を処置するための
新規組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素に関
連する疾患、障害または病態を処置するための組成物またはシステムを記載する。当業者
は、本開示により記載される組成物またはシステムが、任意の低酸素に関連する疾患、障
害または病態を処置するために使用されることができることを知るであろう。

【0115】

いくつかの実施形態では、本開示は、組織中のまたは系統的にＬ－２ＨＧレベルを調節
する治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ－２ＨＧのレ
ベルを増加させる治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ
－２ＨＧのレベルを低減させる治療を記載する。

【0116】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝を調節する薬剤を含む組成物の投
与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する
経路を介した対象への組成物の投与を含む治療を記載する。

【0117】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧであるかまたはそれを含む薬剤を含む
組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧの
アンタゴニストであるかまたはそれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する
。

【0118】

いくつかの実施形態では、本開示は、限定されないが、α－ケトグルタル酸、α－ケト
グルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α－ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、
またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む治療を記載する。いくつかの実
施形態では、本開示は、α－ケトグルタル酸のアンタゴニストであるかまたはそれを含む
薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。

【0119】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝を調節するための標的剤を記載す
る。原則として、そのレベル、形態、または活性がＬ－２ＨＧ代謝の特性と相関するまた
はそれを調節する（例えば、阻害するまたは増強する）任意の薬剤は、少なくとも本明細
書に記載のある特定の実施形態については、Ｌ－２ＨＧ標的剤であることができる。いく
つかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、及びＬ－２－ヒドロキ
シグルタル酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１つまたは複数の分子の発現ま
たは活性に影響を与える薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施
形態では、本開示は、それへのＬＤＨＡの阻害剤の投与を含む治療を記載する。いくつか
の実施形態では、本開示は、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベ
ーターの投与を含む治療を記載する。

【0120】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は
、小分子であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように
Ｌ－２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、ポリペプチドであるかまたはこれを含む。いくつか
の実施形態では、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、核酸であ
るかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代
謝を標的とする薬剤は、グリカンであるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、
本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、脂質であるかまたはそれを
含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする薬
剤は、（例えば、Ｌ－２ＨＧ代謝機構の構成成分に結合する）抗体薬であるかまたはこれ
を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする
薬剤は、（例えば、Ｌ－２ＨＧ代謝機構の構成成分、またはそれをコードするまたは補助
する遺伝子または遺伝子産物に結合する）核酸剤（例えば、アンチセンス、ｓｈＲＮＡま
たはｓｉＲＮＡ剤）であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、標的剤は、検
出可能部分であるか、それと関連する。いくつかの実施形態では、標的剤は、治療部分と
結合している。

【0121】

一般に、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝を標的とすることによりある特定の低酸素誘発性傷
害を処置することの望ましさ及び有効性を実証する。当業者は、そのような標的を実現す
るために任意の様々なアプローチが活用されてよいことを理解するだろう。

【0122】

本発明のシステムの様々な実施形態に従って、Ｌ－２ＨＧまたはＬ－２ＨＧ代謝を調節
する酵素を標的とする薬剤は、単独で、または組成物もしくは医薬品の構成成分として、
本明細書に記載のように対象に投与されることができる。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する薬剤は、生理学的に許容され得る担体ま
たは賦形剤と製剤化されて医薬組成物を調製することができる。いくつかの実施形態では
、そのような医薬組成物中で活用される担体、または組成物そのものは、無菌であること
ができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与の特定の様式用に製剤化される
。組成物を製剤化するためのシステムは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編集）（１
９８９）を参照されたい）。

【0124】

組成物または医薬品は、必要に応じて、タンパク質（特に、アルブミン）、ナノ粒子、
微小粒子、リポソーム、及びミセルのうちの１つまたは複数を、例えば担体として、特に
脂肪酸または脂質の送達用に、含有することができる。

【0125】

本明細書に記載の組成物は、任意の適切な経路で投与されてよい。いくつかの実施形態
では、組成物は皮下投与される。本明細書で用いるとき、「皮下組織」という用語は、皮
膚の直下にある疎性、不規則性結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、大
腿部、腹部、臀部、肩甲部を含むがこれらに限定されない、領域内に組成物を注射するこ
とにより実施されてよい。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与される。いく
つかの実施形態では、組成物は経口投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、心
臓または筋肉（例えば、筋肉内）、腫瘍（腫瘍内）、神経系（例えば、脳への直接注射；
脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与により投与される。あるいはまたは加えて
、組成物は、吸入、非経口、皮内、経皮、または経粘膜（例えば、経口または経鼻）によ
り投与されることができる。必要に応じて、１つより多い経路を同時に使用することがで
きる。

【0126】

いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量または特定の所望の転帰と相関する投
与レジメンに従って投与される。

【0127】

本開示に従って投与される特定の用量または量は、例えば、所望の転帰の特性もしくは
程度、投与の特定の経路もしくは時期、または１つまたは複数の特徴（例えば、体重、年
齢、病歴、遺伝的特徴、ライフスタイルパラメータ、またはそれらの組み合わせ）に依存
して変動してよい。そのような用量または量は、当業者により決定することができる。い
くつかの実施形態では、適切な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。
あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、望ましいまた
は最適な投与量範囲または投与するべき量の特定を助けるために、１つまたは複数のイン
ビトロまたはインビボアッセイの使用を通して決定される。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物は、医薬製剤として提供される。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、発生率または特定の終末点、例えば、腫瘍、心筋
梗塞等の発生率またはリスクの低下の達成と相関する投与レジメンに従って投与するため
の単位用量の量であるかまたはこれを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、Ｌ－２ＨＧ代謝機構のある特定の構成成分は、例えば、その
ような構成成分と直接相互作用する薬剤、またはそうでなければそのレベルまたは活性を
調節する、薬剤の使用を通して、標的とされる（例えば、ＬＤＨＡ）。様々な実施形態で
は、本明細書に記載のようにＬ－２ＨＧ代謝を標的とする治療法は、少なくとも２週間、
３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２
週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０
週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間の期間にわたって
、または治療的エンドポイントが観察されるまで、例えば、腫瘍縮小が観察されるで、ま
たは心機能が改善するまで、施される。

【0130】

Ｌ－２ＨＧ調節剤の同定及び／または特徴づけ
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｌ－２ＨＧ薬剤またはプロトコルを同定するまた
は特徴づけるための方法及びシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で
提供する方法及びシステムは、１つまたは複数の候補Ｌ－２ＨＧ調節剤またはプロトコル
を、細胞、組織または生体に投与すること、及びＬ－２ＨＧ応答についてアッセイするこ
とを含む。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、インビトロである。いくつかの
実施形態では、細胞または組織は、インビボである。いくつかの実施形態では、候補Ｌ－
２ＨＧ調節剤またはプロトコルは、細胞を含まない系に適用される。いくつかの実施形態
では、候補Ｌ－２ＨＧ調節剤またはプロトコルは、ハイスループットスクリーニング系の
成分として適用される。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、Ｌ－２ＨＧ増強剤
を選択する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、Ｌ－２
ＨＧ阻害剤を選択する。

【0132】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、１つまたは複数の
候補Ｌ－２ＨＧ調節剤またはプロトコルを、細胞、組織または生体に投与すること、及び
Ｌ－２ＨＧ代謝の下流効果についてアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、
Ｌ－２ＨＧ代謝の下流効果は、ヒストン３リジン９のトリメチル化である。いくつかの実
施形態では、Ｌ－２ＨＧ代謝の下流効果は、ヒストン３リジン２７のトリメチル化である
。

【0133】

いくつかの実施形態では、候補Ｌ－２ＨＧを増強する薬剤またはプロトコルは、細胞、
組織または生体への投与が、測定されたパラメータ、例えば、Ｌ－２ＨＧにおいて、薬剤
（複数可）またはプロトコル（複数可）に曝露されなかった同様の細胞、組織または生体
と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以
上の増加をもたらす場合に、Ｌ－２ＨＧを増強する薬剤またはプロトコルであるとみなさ
れる。

【0134】

いくつかの実施形態では、候補Ｌ－２ＨＧを阻害する薬剤またはプロトコルは、細胞、
組織または生体への投与が、測定されたパラメータ、例えば、Ｌ－２ＨＧにおいて、薬剤
（複数可）またはプロトコル（複数可）に曝露されなかった同様の細胞、組織または生体
と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以
上の低下をもたらす場合に、Ｌ－２ＨＧを阻害する薬剤またはプロトコルであるとみなさ
れる。

【0135】

Ｌ－２ＨＧ代謝に従って癌表現型を診断する
本明細書で提供する方法及び組成物が、組織における低酸素を検出またはイメージング
するために使用されてよいことが企図される。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍で
ある。いくつかの実施形態では、低酸素は、Ｌ－２ＨＧ、Ｌ－２ＨＧ代謝を制御するある
特定の酵素、またはＬ－２ＨＧにより影響されたある特定の下流のエピジェネティックな
変化、またはそれらの組み合わせにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施
形態では、低酸素は、Ｌ－２ＨＧにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施
形態では、低酸素は、ＬＤＨＡにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施形
態では、低酸素は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３により検出またはイメージングされる。いくつかの実
施形態では、低酸素は、少なくとも１つの追加の方法により検出またはイメージングされ
る。いくつかの実施形態では、この追加の方法は、遺伝子の変異である。

【0136】

本開示は、Ｌ－２ＨＧが、癌の細胞生物学において重要な役割を担うエピジェネティッ
クなシグナル伝達を直接調節することを実証する。生化学的に、Ｄ－２ＨＧ及びＬ－２Ｈ
Ｇの双方は、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素ＫＤＭ４Ｃを阻害
し、それは、トリメチル化ヒストン３リジン９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）の異常蓄積及び正常な
細胞の分化の機能障害をもたらすと報告されている（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｃｈｏｗｄ
ｈｕｒｙら、２０１１；Ｋａｔｓら、２０１４；Ｌｕら、２０１２；Ｒｏｈｌｅら、２０
１３；Ｓａｓａｋｉら、２０１２）。例えば、膠芽腫では、ＩＤＨ１／２変異は、腫瘍全
体にわたるＨ３Ｋ９ｍｅ３の拡散的増加を伴うが、一方でＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ＩＤＨ１／
２変異を伴わない腫瘍において領域による変動を示す（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）
。これらのデータは、ＩＤＨ１／２野生型膠芽腫におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３染色の変動性は
、低酸素の領域と相関する可能性があることを示す。

【0137】

本開示では、本発明者らは、ＨＩＦ１α発現とＨ３Ｋ９ｍｅ３との間の相関関係を、Ｉ
ＤＨ１／２について野生型であるヒト膠芽腫試料を用いた免疫組織化学により試験し、Ｈ
ＩＦ１α発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３が、高く統計学的に相関することを見出した。これらの
観察結果は、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧが、ヒト膠芽腫の血管性に易感染性の領域において
観察されたＨ３Ｋ９ｍｅ３の増強を媒介し得ることを示す。本発明者らは、低酸素誘発性
Ｌ－２ＨＧが抑止されたとき、低酸素誘発性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３において実質的な低下があっ
たことを発見した。逆に、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの結果としての増加を伴う、Ｌ２ＨＧ
ＤＨの除去は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加をもたらした。本発明者らは、たとえ比較的強くな
くても、同様のパターンをＨ３Ｋ２７ｍｅ３で観察した。それゆえ、本開示は、Ｌ－２Ｈ
Ｇが、エピジェネティックな修飾の形成（例えば、Ｈ３Ｋ９、及びＨ３Ｋ２７のトリメチ
ル化）を促進することを確立した。

【0138】

本開示は、膠芽腫を有する患者からの生検を使用することによって、本発明者らは、Ｌ
－２ＧＨの低酸素性誘発が、この腫瘍型におけるエピジェネティックな異質性の発達に寄
与することを発見したことを記載する。低酸素の影響下にある腫瘍細胞は、かかる条件を
伴わない腫瘍細胞と比較して異なる表現型を発達させるだろう。ゆえに、Ｌ－２ＨＧのレ
ベル、Ｌ－２ＨＧを制御する他の因子のレベルまたは活性は、癌表現型を区別するための
指標として使用することができる。

【0139】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧ代謝が、ＩＤＨ１／２変異を伴わない
腫瘍の高く相関する領域である、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色に影響を与えることを実証する。い
くつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、α－ケトグルタル酸、またはＨ３Ｋ９ｍｅ
３の発現または活性を使用して腫瘍表現型を区別するまたは腫瘍異質性を同定するための
システムを記載する。いくつかの実施形態では、腫瘍は膠芽腫を有する患者からのもので
ある。

【0140】

癌は、様々な既知の技術のいずれかを使用して本明細書に記載のような変異を検出する
ためにスクリーニングされてよい。いくつかの実施形態では、その特定の変異または発現
は、核酸レベルで（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて）検出される。いくつかの実施
形態では、かかる変異、またはその発現は、タンパク質レベル（例えば、癌細胞からのポ
リペプチドを含む試料において、その試料はポリペプチド複合体、または細胞、組織もし
くは臓器を含むがそれに限定されない他の高次構造であってよいかまたはこれを含んでよ
い）で検出される。

【0141】

いくつかの特定の実施形態では、検出は、核酸配列決定を必然的に含む。いくつかの実
施形態では、検出は、全エクソーム配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、
検出は、イムノアッセイを必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、アマイクロ
アレイ（ａｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）の使用を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検
出は、超並列（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ）エクソーム配列決定配列決定を
必然的に含む。いくつかの実施形態では、変異は、ゲノム配列決定により検出され得る。
いくつかの実施形態では、検出は、ＲＮＡ配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態
では、検出は、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形
態では、検出は、質量分析を必然的に含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、検出は、次世代配列決定（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を必
然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、ゲノム配列決定、ゲノム再配列決定、標
的配列決定パネル、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、ＤＮＡ
－タンパク質相互作用（ＣｈＩＰ－配列決定）、及び／またはエピゲノム特徴づけを必然
的に含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、検出は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン転写（Ｔｒａｎｆｅｒ）、
イムノアッセイ、質量分析、マイクロアレイ分析等の技術を使用することを必然的に含む
。

【0144】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般に
、この発明が属する分野の当業者に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載
のものと同様またはそれに相当する方法及び材料を、本発明の実施または試験において使
用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。

【0145】

細胞多能性及び自己複製を調節するシステム及びプロトコル
本開示は、なかでも、Ｌ－２ＨＧの低酸素誘発性レベルは、増強された抑圧的なヒスト
ンのメチル化をもたらすことを実証する。ＩＤＨ１／２変異によるＤ－２ＨＧの発癌性産
生が分化に対する癌促進遮断をもたらす一方で、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、幹／前駆細
胞分化の生理学的制御因子として機能し得る。低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、少なくとも一
部には、様々な幹細胞集団の自己複製を維持するための低酸素性ニッチ及びＬＤＨＡ両方
の重要性について説明し得る。具体的には、本開示は、低酸素性ニッチ内に存在する正常
な幹細胞は、分化に必要とされる遺伝子のサイレンシングを維持するのに十分なＬ－２Ｈ
Ｇを産生し得、ゆえに前駆／幹細胞運命を維持し得ることを記載する。

【0146】

Ｌ－２ＨＧを標的として、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製を維持する。
Ｌ－２ＨＧの低酸素性誘発は、胚肝細胞、造血幹細胞、または臓器幹細胞を含む、正常
な幹細胞の多能性及び自己複製を維持することに関与し得る。ゆえに、Ｌ－２ＨＧのＬＤ
ＨＡ媒介性産生またはＬ－２ＨＧの外因性補充を高めるための戦略は、組織操作または他
の幹細胞をベースとする治療にとって有益であり得る。

【0147】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞、組織または生体の多能性または自己複製を
維持するまたは促進するために使用することができるシステムまたはプロトコルを記載す
る。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、幹細胞または前駆
細胞の自己複製を維持するまたは促進するための使用することができる。いくつかの実施
形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、細胞中のＬ－２ＨＧのレベルを調節す
ることを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧのレベルを調節するため
のシステムまたはプロトコルであって、細胞をＬ－２ＨＧと接触させることを含む、前記
システムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２－ヒ
ドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性または発現を阻害するためのシステムまたはプ
ロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性または発現を促
進するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は
、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２活性または発現を促進するためのシステムまたはプロトコルを
記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧを細胞に送達するためのシス
テムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞中のα－ケ
トグルタル酸を枯渇させるためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施
形態では、細胞または組織の多能性または自己複製を維持するまたは促進するために使用
することができるシステムまたはプロトコルは、細胞培養または組織培養に適用される。

【0148】

いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製を促進
する薬剤を含む組成物を投与することにより、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製
を対象においてインビボで維持するためのシステムまたはプロトコルを記載する。

【0149】

Ｌ－２ＨＧを標的として、幹細胞及び前駆細胞の分化を促進する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ－２ＨＧの蓄積が、細胞の多能性をもたらすこ
とを記載する。一方で、他のメカニズムを通したＬ－２ＨＧの枯渇またはＬ－２ＨＧの阻
害は、細胞分化を促進する。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を促進す
るためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシス
テムまたはプロトコルは、幹細胞または前駆細胞を、有効量のＬＤＨＡの阻害剤と接触さ
せることを含む。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、幹細
胞または前駆細胞を有効量のＬ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベ
ーターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、癌幹細胞である。

【0150】

本発明の、多能性及び／もしくは自己複製する特徴を維持するためのシステムもしくは
プロトコル、または細胞分化を促進するためのシステムもしくはプロトコルは、任意の幹
細胞または前駆細胞に好適である。例示的な例として、任意の多能性ヒトＥＳＣまたはそ
れぞれの細胞株は、それぞれの方法において使用してよい。そのような細胞の集団を誘導
するための方法は、当該分野で十分に確立されている（参照。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，
Ｊ．Ａ．ら、［１９９８］Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，１１４５－１１４７またはＣｏｗａ
ｎ，ＣＡ．ら、［２００４］ＪＶ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３－１３５６
）。本方法が、前駆細胞について使用されることを意図する場合、任意の前駆細胞が本発
明のこの方法において使用されてよい。好適な前駆細胞の例には、神経前駆細胞、内皮前
駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞
、または造血前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。前駆細胞を獲得する方法
は、当該分野で周知である。２つの例示的な例として、巨核球前駆細胞を獲得する方法は
、米国特許出願２００５／０１７６１４２に開示されており、マウス肝臓前駆細胞株を獲
得する方法は、Ｌｉら、（（２００５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：
１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５－０１０８）により記載されている。

【0151】

いくつかの実施形態では、選択されたＬ－２ＨＧを制御する遺伝子（例えば、ＬＤＨＡ
、ＭＤＨ１／２、またはＬ－２ＨＧデヒドロゲナーゼ）、またはその機能的断片は、本発
明の方法の実施に十分な量で内因的に発現される。他の実施形態では、Ｌ－２ＨＧを制御
する遺伝子、またはその機能的断片は、所望の転写因子をコードする遺伝子を含む１つま
たは複数の組換えベクターを用いて細胞に導入されてよい。

【0152】

他の実施形態では、本開示は、本明細書に前述のように、それぞれの細胞を、Ｌ－２Ｈ
Ｇ代謝を調節する薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は
、Ｌ－２ＨＧである。いくつかの実施形態では、薬剤は、α－ＫＧである。

【0153】

本発明は、以下の実施例を参照することにより完全に理解されるだろう。しかしながら
、それらは、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

【0154】

本開示における全ての文献の引用は、参考文献により組み込まれる。

【実施例】

【0155】

以下の実施例は、例示のために提供され、いずれにしても本発明の範囲を制限しない。

【0156】

実施例１：低酸素性細胞内でのＬ－２－ヒドロキシグルタル酸（Ｈｙｄｒｏｘｇｌｕｔａ
ｒａｔｅ）の蓄積
背景：
特定の代謝産物が細胞応答性に与えることができる潜在的な影響は、様々なヒト癌にお
けるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１／２）の再発性体細胞変異の同定
により例証された（Ａｍａｒｙら、２０１１；Ｂｏｒｇｅｒら、２０１２；Ｃａｉｒｎｓ
ら、２０１２；Ｌｅｙら、２００８；Ｐａｒｓｏｎｓら、２００８；Ｐａｔｅｌら、２０
１２；Ｙａｎら、２００９）。ＩＤＨ１／２は、α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）へのイ
ソクエン酸の酸化的脱炭酸を通常触媒する、ＮＡＤＰ^＋依存性酵素である（Ｗａｒｄ及び
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。

【0157】

ＩＤＨ１／２における癌に関連する変異は、野生型酵素活性の喪失を、Ｄ－２－ヒドロ
キシグルタル酸（Ｄ－２ＨＧ）へのα－ＫＧの変換を可能にする活性の機能獲得を伴って
もたらす。（Ｄａｎｇら、２００９；Ｇｒｏｓｓら、２０１０；Ｗａｒｄら、２０１０）
。Ｄ－２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉヒストンリジン脱メチル化酵素を含む、多くのα－ＫＧ
依存性酵素を阻害するその能力を介して「癌代謝物」として機能すると提案されている。
（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｆｉｇｕｅｒｏａら、２０１０；Ｌｕら、２０１２
；Ｘｕら、２０１１）。具体的には、エピジェネティックな修飾酵素のＤ－２ＨＧ媒介性
阻害は、誘発性増殖因子／サイトカインに応答して正常な分化に必要とされる遺伝子の発
現を弱める抑圧的なクロマチン構造を促進する（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｆｉｇｕｅｒｏ
ａら、２０１０；Ｋａｔｓら、２０１４；Ｌｏｓｍａｎら、２０１３；Ｓａｓａｋｉら、
２０１２）。実際、ＩＤＨ１／２変異体酵素の小分子阻害剤は、Ｄ－２ＨＧ産生を遮断し
、抑圧的なクロマチンマークを逆転し、増殖因子／サイトカイン誘発性細胞の分化を回復
させることができる（Ｒｏｈｌｅら、２０１３；Ｗａｎｇら、２０１３）。

【0158】

留意されたいことには、２ＨＧは、Ｄ－（Ｒ）－またはＬ－（Ｓ）－エナンチオマーの
コンフォメーションのいずれでも存在することができるキラル分子である（Ｌｉｎｓｔｅ
ｒら、２０１３）。ＩＤＨ１／２変異体がＤ－２ＨＧを排他的に産生するが、生化学的証
拠は、Ｌ－２ＨＧはエピジェネティックな修飾因子を含む多くのα－ＫＧ依存性酵素を強
力に阻害することができることを示す（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎ
ｅｎら、２０１２；Ｘｕら、２０１１）。

【0159】

ＩＤＨ１／２変異を伴わない正常な細胞は、いまだあまり理解されていない代謝経路を
介してＤ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧの両方を少量産生する（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３）
。進化的に保存されたＤ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びＬ－２－ヒド
ロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ２ＨＧＤＨ及びＬ２ＨＧＤＨ）は、α－ＫＧに戻
るそれらの変換を触媒することにより、それぞれＤ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧの蓄積を予防
する（Ａｃｈｏｕｒｉら、２００４；Ｒｚｅｍら、２００４）。Ｄ２ＨＧＤＨまたはＬ２
ＨＧＤＨの同型接合性の生殖細胞系列の機能喪失変異は、Ｄ－２ＨＧまたはＬ－２ＨＧの
全身的上昇を特徴とする障害である、２ＨＧ酸性尿をもたらす（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら
、２０１２；Ｒｚｅｍら、２００４；Ｓｔｒｕｙｓら、２００５）。２ＨＧ酸性尿を有す
る患者は、早期死亡をもたらす重大な発生異常を患う（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１
２）。Ｌ２ＨＧＤＨの遺伝性変異から生じるＬ－２ＨＧの全身性上昇は、脳腫瘍と関連し
ている（Ｈａｌｉｌｏｇｌｕら、２００８；Ｍｏｒｏｎｉら、２００４）。同様に、腎臓
癌における再発性Ｌ２ＨＧＤＨ喪失の最近の特定は、代替的にまたは追加的に、調節解除
されたＬ－２ＨＧの潜在的な発癌性役割を支持する（Ｓｈｉｍら、２０１４）。

【0160】

２ＨＧ酸性尿は、生理学的Ｄ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧレベルが、２ＨＧ媒介性病理を予
防するためにＤ２ＨＧＤＨ及びＬ２ＨＧＤＨにより密接に制御されなければならないこと
を実証する（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２）。これらの知見は、Ｄ－２ＨＧまたは
Ｌ－２ＨＧの生理学的産生の制御が、特定の細胞機能を調節し得る可能性を高くした。

【0161】

前述の所見は、２ＨＧ、特に、低酸素の条件下などのストレス誘発性代謝における研究
下にあるＬ－２ＨＧの役割への継続した必要性の証拠を提供する。

【0162】

材料及び方法：
細胞培養：接着細胞株ＳＦ１８８、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、及びＳＶ４０－
不死化ＭＥＦは、高グルコースＤＭＥＭ中で維持され、一方で、造血細胞株３２Ｄ及びＦ
Ｌ５．１２は、ＲＭＰＩ中、１０％ＦＢＳ、グルコース２５ｍＭ、グルタミン４ｍＭ、ペ
ニシリン１００単位／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌで維持
され、培養密度に達するまで２～３日毎に分裂した。低酸素実験については、細胞を、０
．５％酸素の低酸素室（Ｃｏｙ）内で、２４～４８時間培養してから、回収した。ｓｉＲ
ＮＡ実験については、ＳＦ１８８またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を製造業者により説明される
ように、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）血清低減培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）中でリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と
混合したｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトした。Ｌ２ＨＧＤＨ ｃＤＮＡを、標準
的な方法により、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏベクター（ｐＣＤＨ）（
Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へとクローニングした。ｓｈＲＮＡ（ＰＬＫＯ
．１）、空ベクター（ｐＣＤＨ）、またはＬ２ＨＧＤＨ（ｐＣＤＨ）の安定的な発現を伴
うＳＦ１８８細胞株を生成するために、ヘルパーウイルス及びプラスミドでトランスフェ
クトされた２９３Ｔ細胞からの上清を、７２時間後に回収し、濾過し、ＳＦ１８８親細胞
に一晩適用した。ピューロマイシン耐性細胞を連続培養ピューロマイシン１μｇ／ｍｌか
ら選択した。

【0163】

ｓｈＲＮＡ実験：以下のＰＬＫＯ．１ベクター中のＴＲＣバージョン１のｓｈＲＮＡ（
Ｓｉｇｍａ）を使用した：ｓｈＬ２ＨＧＤＨ－１（Ｌ１）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４
８８４．１－１１１３ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡ
ＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番
号１）；ｓｈＬ２ＨＧＤＨ－２（Ｌ２）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１－１３
７０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡ
ＧＡＴＴＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２）；ｓｈＬ２
ＨＧＤＨ－３（Ｌ３）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１－１２１７ｓ１ｃ１、配
列：ＣＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡ
ＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号３）；ｓｈＬ２ＧＨＤＨ－４（Ｌ
４）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１－６７４ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＴ
ＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣ
ＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号４）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ－２（Ｄ２）＝クローンＩＤ
：ＮＭ＿１５２７８３．２－６３０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡ
ＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＴＴＴ
ＴＧ（配列番号５）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ－３（Ｄ３）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８
３．２－１２７０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡ
ＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号６
）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ－４（Ｄ４）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２－３１９ｓ
１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴ
ＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）；ｓｈＤ２ＨＧＤ
Ｈ－５（Ｄ５）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２－１０６６ｓ１ｃ１、配列：Ｃ
ＣＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＡ
ＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号８）。

【0164】

代謝産物抽出及びＧＣ－ＭＳ解析：代謝産物を、２マイクロモル重化水素化２－ヒドロ
キシグルタル酸（Ｄ－２－ヒドロキシグルタル－２，３，３，４，４－ｄ_５酸；重化水素
化－Ｄ－２ＨＧ）を内部標準として補充した１ｍＬの氷冷８０％メタノールで抽出した。
－８０°Ｃで一晩インキュベートした後、ライセートを回収し、超音波処理し、次いで２
１，０００ｇで、２０分間４℃で遠心分離して、タンパク質を除去した。抽出物をエバポ
レーター（Ｇｅｎｅｖａｃ ＥＺ－２ Ｅｌｉｔｅ）内で乾燥させ、３０℃で９０分間、
５０マイクロリットルのメトキシアミン塩酸塩４０ｍｇ／ｍＬを含むピリジン内でインキ
ュベートすることにより再懸濁した。代謝産物を、８０マイクロリットルのＭＳＴＦＡ＋
１％ＴＣＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び７０マイクロリットルの酢酸
エチル（Ｓｉｇｍａ）の添加により代替的にまたは追加的に誘導体化し、３７℃で３０分
間インキュベートした。試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７５Ｃ質量選択検出器に結合した
Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣを使用して解析した。ＧＣは、１ｍＬ／分の一定のヘ
リウムガス流でスプリットレスモードにて操作した。１マイクロリットルの誘導体化代謝
産物を、ＨＰ－５ＭＳカラムに注入し、ＧＣオーブン温度を６０℃から２９０℃に２５分
間にわたり上昇させた。対象の化合物を表すピークを抽出し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフ
トウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して積分し、次いで、内
部標準（重化水素化－Ｄ－２ＨＧ）ピーク面積及びタンパク質含有率の両方に正規化した
。代謝産物レベルの定量化に使用するイオンは、２ＨＧ ｍ／ｚ ２４７及び重化水素化
－２ＨＧ ｍ／ｚ ２５２であった。ピークを手動で検査し、各代謝産物について既知の
スペクトルに対して検証した。

【0165】

キラル誘導体化：いくつかの実験では、細胞を、内部標準を伴わない８０％メタノール
中で回収した。メタノールから抽出された代謝産物をエバポレーター（Ｇｅｎｅｖａｃ
ＥＺ－２ Ｅｌｉｔｅ）内で乾燥させ、水中に再懸濁し、ＡＧ １－Ｘ８アニオン交換カ
ラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を実行し、３Ｎ ＨＣｌで溶出し、４つの画分に分割し、Ｄ－（
Ｒ）－２ＨＧまたはＬ－（Ｓ）－２ＨＧ標準物質（Ｓｉｇｍａ）でスパイクするかまたは
スパイクしないままにし、エバポレーター内で乾燥させ、Ｒ（－）－２－ブタノール（Ｓ
ｉｇｍａ）、次いで、酢酸無水物（Ｓｉｇｍａ）で９５℃に加熱しながら順次誘導体化し
、窒素流下で乾燥させ、酢酸エチルに再懸濁し、上記のようにＧＣ－ＭＳにより解析した
。２ＨＧは、ｍ／ｚ １７３と同定した。この方法によるキラル誘導体化は、Ｌ－２ＨＧ
がＤ－２ＨＧよりも短い保持時間で溶出されることで、ガスクロマトグラフィーによるＬ
－２ＨＧ及びＤ－２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にする。

【0166】

結果：
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）における体細胞変異は、「
癌代謝物」Ｄ－２－ヒドロキシグルタル酸（Ｄ－２ＨＧ）の産生を介して癌の病理形成に
寄与する。上昇したＤ－２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化
酵素を含む、α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）依存性酵素の競合阻害剤として機能するこ
とにより悪性細胞の分化を遮断することができる。２ＨＧは、Ｄ－エナンチオマーまたは
Ｌ－エナンチオマーのいずれでも存在することができるキラル分子である。癌に関連する
ＩＤＨ１／２変異は、Ｄ－２ＨＧを排他的に産生するが、生化学的研究は、Ｌ－２ＨＧが
代替的にまたは追加的に、α－ＫＧに依存する酵素の強力な阻害剤として機能することを
実証している。

【0167】

以前の報告は、いくつかの細胞型が、酸素制限条件下で増加した総２ＨＧレベルを呈す
ることを示した（Ａｌｂｅｒｓら、１９９８；Ｗｉｓｅら、２０１１）。実際、本発明者
らは、哺乳類細胞は低酸素に応答して２ＨＧを蓄積するという一般化できる現象を同定し
た（図１Ａ）。本発明者らは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）を使用し
て正常酸素状態（２１％酸素）対低酸素（０．５％酸素）で培養されたＩＤＨ１／２野生
型細胞株における細胞内２ＨＧを測定した。全ての事例で、本発明者らは、細胞の種類に
応じて５～２５倍の範囲の、低酸素における２ＨＧの実質的な増加を観察した（図１Ａ）
。重要なことは、ＧＣ－ＭＳにより代謝産物を測定するための標準的な方法は、エナンチ
オマーの種を区別せず、ゆえに、これらのアッセイにおいて測定された総２ＨＧにはＤ－
２ＨＧ及びＬ－２ＨＧの両方が含まれる。

【0168】

本発明者らは、次に細胞内２ＨＧレベルに及ぼすＤ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨを操
作することの効果を調査した。Ｄ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨを標的とするｓｈＲＮＡ
を、代謝経路を研究するために広く使用されているＳＦ１８８膠芽腫細胞株に安定的に感
染させた（ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓら、２００７；Ｗｉｓｅら、２００８；Ｗｉｓｅら
、２０１１）。酸素の利用可能度にかかわらず、Ｄ２ＨＧＤＨの除去は、細胞内２ＨＧに
ほとんど効果を有さなかった（図１Ｂ）。しかしながら、Ｌ２ＨＧＤＨの除去は、低酸素
における２ＨＧの蓄積を大幅に増加させた。これは、Ｌ－２ＨＧが酸素制限に応答して蓄
積する２ＨＧの主要な形態を表すことを示す（図１Ｃ）。同様の結果が、Ｄ２ＨＧＤＨま
たはＬ２ＨＧＤＨを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞
を使用して得られた。

【0169】

低酸素において２ＨＧのどちらのエナンチオマーが蓄積するのか直接決定するために、
本発明者らは、代謝産物が、Ｒ（－）－２－ブタノール、その後酢酸無水物との連続的な
反応を受けるキラル誘導体化手法を活用した（図６Ａ）。それにより、ＧＣ－ＭＳにより
Ｄ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧを区別することを可能にした（Ｗａｒｄら、２０１２；Ｗａｒ
ｄら、２０１０）。キラル誘導体化の前に、低酸素性ＳＦ１８８細胞からの代謝産物抽出
物を、未操作のままにするか、または基準として、市販されている標準物質のＤ－２ＨＧ
、Ｌ－２ＨＧもしくはＤ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧの混合物でスパイクした。この技術は、
Ｌ－２ＨＧが、低酸素性細胞中に存在する２ＨＧの主要なエナンチオマー型であることを
実証した（図１Ｄ）。キラル誘導体化は、Ｌ－２ＨＧが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び不死化
マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）中で低酸素に応答して選択的に産生されたことを、代替的
または追加的に実証した（図６Ｂ及び６Ｃ）。

【0170】

実施例２：低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、グルタミン由来のα－ＫＧから生じる
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ－ＭＳ手法は実施例１に記載する。同位体追跡試験では、培地を指示
された時間で交換し、その後、^１２Ｃ－グルコース（Ｓｉｇｍａ）及び^１２Ｃ－グルタミ
ン（Ｇｉｂｃｏ）または各代謝産物の^１３Ｃバージョンである、［Ｕ－^１３Ｃ］グルコー
スまたは［Ｕ－^１３Ｃ］グルタミン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｓ）
を補充したグルコース及びグルタミンを含まないＤＭＥＭ培地を使用して回収した。試料
を、内部標準を伴わない８０％メタノール中で回収した。^１３Ｃの濃縮を、２ＨＧイオン
、ｍ／ｚ ３４９－３６２の存在量を定量化することにより評価した。自然同位体の存在
量の収集を、ＩｓｏＣｏｒソフトウェアを使用することにより実施した（Ｍｉｌｌａｒｄ
ら、２０１２）。

【0171】

結果
グルコース及びグルタミンは、増殖する細胞が取り込み、代謝する２つの主要な栄養素
を表す（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。本発明者らは、低酸素におけるＬ
－２ＨＧの産生に活用される炭素主鎖の源を同定するために、［Ｕ－^１３Ｃ］グルコース
または［Ｕ－^１３Ｃ］グルタミンのいずれかを補充されたＳＦ１８８細胞において代謝フ
ラックス解析を行った（図２Ａ及び２Ｂ）。正常酸素状態では、比較的少ない総２ＨＧ（
図１Ａ）が主にグルタミンから誘導され、グルコースからの寄与は少しであった（図２Ａ
及び２Ｂ）。対照的に、より多い低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧ（図１Ａ及び１Ｄ）はグルタミ
ンから排他的に誘導された（図２Ａ及び２Ｂ）。

【0172】

グルタミンの細胞代謝がα－ケトグルタル酸を生成する（Ｗｉｓｅ及びＴｈｏｍｐｓｏ
ｎ，２０１０）ので、本発明者らは、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧが、グルタミン由来のα－
ＫＧの酵素的還元から生じ得ると理由づけた。本発明者らは、α－ＫＧの細胞透過性形態
を細胞に補充することの効果を試験した。正常酸素状態におけるＳＦ１８８細胞への細胞
透過性ジメチル－α－ＫＧの添加により、細胞内２ＨＧは中程度に増加し、一方で低酸素
では、２ＨＧがほぼ１００倍増加した（図２Ｃ）。これは、キラル誘導体化によりＬ－２
ＨＧであると確認された（図２Ｄ及び２Ｅ）。Ｌ－２ＨＧ酸性尿を有する患者からの細胞
の以前の試験（Ｓｔｒｕｙｓら、２００７）と一致して、これらの知見は、低酸素誘発性
Ｌ－２ＨＧが、グルタミン由来のα－ＫＧの酵素的還元から生じることを示す。

【0173】

考察：
栄養素及び代謝産物は、根本的な細胞のプロセスに影響を与える（Ｋａｅｌｉｎ及びＭ
ｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。例えば、α－
ＫＧは、ヒストン及びＤＮＡの脱メチル化、ＨＩＦ１α安定性の調節、及びコラーゲンの
成熟化などの多様な機能に関与するおおよそ７０の異なる酵素の必須基質として機能する
（Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３）。これらの酵素的プロセスをα－ＫＧ利用
能につなげることにより、細胞の代謝的健全性は、系統分化及び環境的ストレス要因への
適応などの重要な細胞の「決断」に密接につながることができる。「癌代謝物」Ｄ－２Ｈ
Ｇによるα－ＫＧに依存する酵素活性の阻害は、それによりＩＤＨ１／２における発癌性
変異が正常な細胞の生理機能を攪乱させる主なメカニズムを表すと思われる（Ｋａｅｌｉ
ｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３；Ｗａｒ
ｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。同様に、Ｌ２ＨＧＤＨまたはＤ２ＨＧＤＨのいず
れかの両親対立遺伝子における機能喪失変異をもって産まれた子供は、それぞれＬ－２Ｈ
Ｇ及びＤ－２ＨＧを蓄積し、これは重度の発育障害をもたらす（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら
、２；Ｒｚｅｍら、２００４；Ｓｔｒｕｙｓら、２００５）。

【0174】

実施例３：低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、ＬＤＨＡによる無差別な基質使用から生じる
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ－ＭＳ手法を実施例１に記載する。

【0175】

ウェスタンブロット法：細胞ライセートを、１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ）中で抽出し、超音波処理し、１４，０００ｇで４℃にて遠心分離し、上清を
収集した。ヒストン酸抽出については、細胞を、低張性溶解バッファー（Ａｍｒｅｓｃｏ
）に１時間溶解した。Ｈ_２ＳＯ_４を、０．２Ｎに一晩４℃で回転させながら加え、上清を
遠心分離後に回収した。ヒストンを、３３％ＴＣＡ中に沈殿させ、アセトンで洗浄し、脱
イオン化した水中に再懸濁した。清澄化した細胞ライセートまたはヒストン調製物を、総
タンパク質濃度に正規化した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース
膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写し、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有
するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）にて調製された５％ミルク中で遮断し、一次抗体
を用いて一晩４℃でインキュベートし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
とコンジュゲートした二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３１Ｖ及びＮＡ９
３４Ｖ）を用いて、その翌日に１時間インキュベートした。ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適用した後、ＳＲＸ－１０１Ａ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ）
を使用してイメージングを行った。インビトロでのヒストン脱メチル化酵素アッセイにつ
いては、バルク仔ウシ胸腺ヒストン（Ｓｉｇｍａ）を、トリス－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ
８．０、プロテアーゼ阻害剤、α－ＫＧ １ｍＭ、ＦｅＳＯ４ １００マイクロモル、及
びアスコルビン酸 ２マイクロモルを含有する反応混合物中でＧＳＴタグ付きＫＤＭ４Ｃ
（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。反応混合物を、３７℃で４時
間、様々な濃度のＬ－２ＨＧまたはＤ－２ＨＧ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または不在下でイ
ンキュベートした。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３レベルを、総ヒストンＨ３を負荷対照として使用して
、ウェスタンブロットにより解析した。使用された一次抗体は：抗Ｌ２ＨＧＤＨ（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｔｅｃｈ，１５７０７－１－ＡＰ）、抗Ｄ２ＨＧＤＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ
，１３８９５－１－ＡＰ）、抗ＬＤＨＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１２）、
抗ＩＤＨ１（抗ＩＤＨ２（Ａｂｃａｍ，ａｂ５５２７１）、抗ＭＤＨ１（Ａｂｃａｍ，ａ
ｂ５５５２８）、抗ＭＤＨ２（Ａｂｃａｍ，ａｂ９６１９３）、抗チューブリン（Ｓｉｇ
ｍａ，Ｔ９０２６）、抗Ｓ６リボソームタンパク質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２
３１７）、抗ＨＩＦ１α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０９５９）、抗Ｈ３（Ｃ
ｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４４９９）、及び抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏ
ｔｉｆ，３９７６５）を含んだ。

【0176】

ｓｉＲＮＡ実験：以下のｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し
た：ｓｉＩＤＨ１－ａ＝Ｊ－００８２９４－１０、標的配列：ＧＣＡＵＡＡＵＧＵＵＧＧ
ＣＧＵＣＡＡＡ（配列番号９）；ｓｉＩＤＨ１－ｂ＝Ｊ－００８２９４－１１、標的配列
：ＧＣＵＵＧＵＧＡＧＵＧＧＡＵＧＧＧＵＡ（配列番号１０）；ｓｉＩＤＨ２－ａ＝Ｊ－
００４０１３－０９、標的配列：ＧＣＡＡＧＡＡＣＵＡＵＧＡＣＧＧＡＧＡ（配列番号１
１）；ｓｉＩＤＨ２－ｂ＝Ｊ－００４０１３－１２、標的配列：ＧＣＧＣＣＡＣＵＡＵＧ
ＣＣＧＡＣＡＡＡ（配列番号１２）；ｓｉＭＤＨ１－ａ＝Ｊ－００９２６４－１０、標的
配列：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＵＧＵＣＡＣＧＡＣＵ（配列番号１３）；ｓｉＭＤＨ１－ｂ＝
Ｊ－００９２６４－１２、標的配列：ＡＧＧＵＵＡＵＵＧＵＵＧＵＧＧＧＵＡＡ（配列番
号１４）；ｓｉＭＤＨ２－ａ＝Ｊ－００８４３９－１０、標的配列：ＧＡＵＣＵＧＡＧＣ
ＣＡＣＡＵＣＧＡＧＡ（配列番号１５）；ｓｉＭＤＨ２－ｂ＝Ｊ－００８４３９－１２、
標的配列：ＣＧＣＣＵＧＡＣＣＣＵＣＵＡＵＧＡＵＡ（配列番号１６）；ｓｉＬＤＨＡ－
ａ＝Ｊ－００８２０１－０５、標的配列：ＧＧＡＧＡＡＡＧＣＣＧＵＣＵＵＡＡＵＵ（配
列番号１７）；ｓｉＬＤＨＡ－ｂ＝Ｊ－００８２０１－０６、標的配列：ＧＧＣＡＡＡＧ
ＡＣＵＡＵＡＡＵＧＵＡＡ（配列番号１８）；ｓｉＬＤＨＡ－ｃ＝Ｊ－００８２０１－０
７、標的配列：ＵＡＡＧＧＧＵＣＵＵＵＡＣＧＧＡＡＵＡ（配列番号１９）；ｓｉＬＤＨ
Ａ－ｄ＝Ｊ－００８２０１－０８、標的配列：ＡＡＡＧＵＣＵＵＣＵＧＡＵＧＵＣＡＵＡ
（配列番号２０）

【0177】

結果：
低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの酵素源（複数可）を決定するために、本発明者らは、ｓｉＲ
ＮＡにより候補代謝酵素を除去した（図３）。ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のノックダウンは
、低酸素性ＳＦ１８８細胞におけるＬ－２ＨＧの産生を損なわなかった（図３Ａ）。同様
に、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、またはＩＤＨ１及びＩＤＨ２を両方一緒に、ｓｉＲＮＡを媒介
する除去に供したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、低酸素に応答するＬ－２ＨＧの産生に対してこ
れらの酵素への依存性を呈さなかった（図７Ａ）。これらの所見は、天然に生じるイソク
エン酸のα－ヒドロキシル基（２ＨＧのα－ヒドロキシル基に類似する）が、イソクエン
酸デヒドロゲナーゼにより触媒される酵素反応の立体化学のために、Ｄ－（Ｒ）－エナン
チオマーの立体構造内に常に存在するという事実と一致する（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、１
９６２；Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、１９６４）。ゆえに、ＩＤＨ１／２酵素は、基質結合の際
の立体的拘束に起因して、α－ＫＧをＬ－２－ヒドロキシグルタル酸に還元することがで
きない可能性が高い。

【0178】

代謝酵素は、「無差別の」触媒活性（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３）を呈することがで
き、以前の細胞分画試験は、細胞基質のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）及びミ
トコンドリアのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）を、Ｌ－２ＨＧの潜在的な酵素
源として関連づけた（Ｒｚｅｍら、２００７）。本発明者らは、その主な触媒活性が、α
－ケト酸基質のＬ－ヒドロキシル酸への還元に関与し、それぞれα－ＫＧ及びＬ－２ＨＧ
に対する構造類似性を有する、代謝酵素の要件を試験した（図３Ｄ）。ＳＦ１８８細胞で
は、本発明者らは、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧに対するＭＤＨ１及びＭＤＨ２から部分的な
寄与を特定した（図３Ｂ）。しかしながら、際立って、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）が
、ＳＦ１８８細胞における低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧに必要とされる主要な酵素として特定
された（図３Ｃ）。これらの所見は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において確認され、そこではＬ
ＤＨＡ及びＭＤＨ２の組み合わせ除去もまた、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧのほぼ全ての抑止
をもたらした（図Ｓ７Ｂ及びＳ７Ｃ）。まとめると、これらの知見は、低酸素性細胞は、
ＬＤＨＡによる無差別の基質使用を介して細胞質においてグルタミン由来のα－ＫＧの還
元からＬ－２ＨＧを産生することができ、それより少ない細胞基質のＭＤＨ１及びミトコ
ンドリアのＭＤＨ２からの寄与を伴う、ということを示す（図３Ｄ）。

【0179】

低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの抑止は、ＨＩＦ１αタンパク質レベルに大きな影響を与えな
かった（図３Ｂ及び３Ｃ）。以前の報告は、Ｌ－２ＨＧが、プロテアソーム分解のために
ＨＩＦ１αをマークするα－ＫＧ依存性プロリルヒドロキシラーゼのＥＧＬＮファミリー
の、Ｌ－２ＨＧ媒介性阻害を介して、正常酸素状態においてＨＩＦ１αを安定化させるこ
とができることを実証した（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２
０１２；Ｌｏｓｍａｎら、２０１３）。これらの所見と一致して、本発明者らは、（結果
として低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの増強を伴う）Ｌ２ＨＧＤＨの除去に供された低酸素性細
胞中のＨＩＦ１αタンパク質レベルにおいて軽微な増加を認めた（図１Ｃ）。しかしなが
ら、低下した酸素利用可能度（０．５％）が、Ｌ－２ＨＧにおける上昇がたとえ無くとも
、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラーゼの活性を弱めるのに十分であるように思われる（図
３Ｃ）。

【0180】

考察：
ＩＤＨ１／２変異による悪性病変の分子病態におけるＤ－２ＨＧの役割の解明に焦点を
当てた集中的な研究努力とは対照に、正常な細胞生理学におけるＤ－２ＨＧ及びＬ－２Ｈ
Ｇの制御された産生及び除去の潜在的な役割は、あまり注目されていない（Ｋｒａｎｅｎ
ｄｉｊｋら、２０１２）。本明細書に提示する知見は、低酸素により強いられた環境的ス
トレスに応答した新規の細胞の代謝応答としてＬ－２ＨＧ誘発を同定する。酸素制限条件
下では、細胞は、ＴＣＡ回路中間体ならびにＮＡＤＨの形態の細胞基質の及びミトコンド
リアの還元等価物を蓄積し（Ｂｅｎｓａａｄ及びＨａｒｒｉｓ，２０１４；Ｍｅｔａｌｌ
ｏら、２０１２；Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１３；Ｗｉｓｅら、２０１１；Ｚｈｄａｎｏｖら
、２０１４）、それは、α－ＫＧの酵素的還元を支持して本明細書に記載のＬ－２ＨＧを
産生するだろう。低酸素におけるＬ－２ＨＧの産生は、ＩＤＨ１／２とは独立して生じ、
代わりに主にＬＤＨＡによるα－ＫＧの無差別な酵素的還元を介して生じる。低酸素誘発
性Ｌ－２ＨＧは、それにより細胞が、制限された酸素利用可能度に直面したときに、α－
ＫＧに依存するプロセス（例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化）を抑圧し得る分子メカ
ニズムを表す。あるいはまたは加えて、Ｌ－２ＨＧは、低酸素適応のα－ＫＧ依存性逆転
を抑制することができる。α－ＫＧは、ＨＩＦ１αクリアランスを開始し、ヒストンのメ
チル化によりサイレンシングされた遺伝子の発現を回復させることが求められる（Ｋａｅ
ｌｉｎ及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ，２００８；Ｋｏｏｉｓｔｒａ及びＨｅｌｉｎ，２０１２
；Ｏｚｅｒ及びＢｒｕｉｃｋ，２００７；Ｔａｕｓｅｎｄｓｃｈｏｎら、２０１１）。ゆ
えに、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、それを通して低酸素適応に反作用し得るα－ＫＧに依
存するプロセスの抑圧を細胞が維持できる手段を表す。

【0181】

代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）または無差別な基質使用は、乳酸脱水素酵素を含
む多くの代謝酵素の十分に記載された特性である（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３；Ｍｅｉ
ｓｔｅｒ，１９５０；Ｓｃｈａｔｚ及びＳｅｇａｌ，１９６９）。低酸素においてＬ－２
ＨＧへのα－ＫＧの還元を触媒するＬＤＨＡの能力は、有意義な生物学的効果を媒介し得
る代替的な基質使用の例を表す。ＬＤＨＡによるＬ－２ＨＧの産生は、簡素なメカニズム
を表し、ここでは単一の酵素が、嫌気的解糖の媒介因子及び細胞の代謝状態についての情
報を核に伝達する代謝シグナル伝達経路の発動因子の両方として機能する。ＬＤＨＡ発現
は、低酸素においてＨＩＦ１αにより上方制御され（Ｈｕら、２００３）、その後のＬ－
２ＨＧへのαＫＧのＬＤＨＡ依存性変換は、低酸素適応を持続するために正のフィードバ
ックループを提供し得る。Ｚｈｄａｎｏｖら、（２０１４）は、近年、持続的な核ＨＩＦ
１αの蓄積は、低酸素適応中に進行しているグルタミン代謝に依存することを実証した。
これと一致して、本発明者らは、Ｌ－２ＨＧの低酸素誘発性蓄積もグルタミン依存性であ
ることを発見した。これらの知見は、低酸素におけるグルタミン依存性Ｌ－２ＨＧ産生と
持続的なＨＩＦ１α誘発との間のつながりを示す。

【0182】

低酸素におけるＬ－２ＨＧの選択的蓄積は、２ＨＧのエナンチオマー種を区別すること
の重要性を強調する（Ｔｅｒｕｎｕｍａら、２０１４）。Ｌ－２ＨＧは、ＨＩＦ１α分解
を開始し低酸素適応を終了させるその能力を抑制する、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラー
ゼの競合阻害剤として機能すると示されている。対照的に、Ｄ－２ＨＧは、ＨＩＦ１αの
水酸化及び分解を促進し、ゆえに低酸素適応を妨害する、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラ
ーゼに対する基質として作用することができる（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｌｏｓ
ｍａｎら、２０１３）。まとめると、本結果は、Ｄ－２ＨＧと共有されない特性である、
ＨＩＦ１α軸を強化し、低酸素への細胞の適応を維持することにおける低酸素誘発性Ｌ－
２ＨＧの支援的役割を、支持する。

【0183】

実施例４：ＬＤＨＡの活性部位は、Ｌ－２ＨＧへのα－ＫＧの還元に対応することができ
る
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ－ＭＳ手法を実施例１に記載する。

【0184】

推定ＬＤＨＡ基質の分子ドッキング：推定基質及び産物分子のドッキングをＭａｅｓｔ
ｒｏ ２０１４－３のＧｌｉｄｅを使用して行った（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４；Ｆ
ｒｉｅｓｎｅｒら、２００６；Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４；Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，
２０１４）。結晶水及びリガンドを、ＮＡＤＨを除いて除去した後にリガンドをＰＤＢ構
造１Ｉ１０の鎖Ａ内へとドッキングした（Ｒｅａｄら、２００１）。欠落している側鎖及
びループを、Ｐｒｉｍｅを使用して自動的に再構築した（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００２
；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００４）。ＰＲＯＰＫＡを、７のｐＨに適合するプロトン状態
を配置するために使用した（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄら、２
０１１）。ＮＡＤＨまたはＮＡＤ＋の結合次数は、ＰＲＯＰＫＡによる割り当てのミスを
避けるために手動で確認した。ＯＰＬＳ２００５を使用して制限最小化を行った（Ｂａｎ
ｋｓら、２００５）。結合部位定義を満たすための最小原子要件を確認するために架空の
原子を加えた後、オキサメートを基準リガンドとして使用して結合部位を定義した。ヒド
ロキシル及びチオール基を、グリッド生成中に回転させた。ピルベート及びα－ケトグル
タル酸を、結晶ＮＡＤＨの存在下でドッキングした。乳酸塩及びＬ－２－ヒドロキシグル
タル酸を、結合次数を変えることにより結晶ＮＡＤＨからモデル化されたＮＡＤ＋の存在
下でドッキングした。リガンドのカルボン酸部分を完全に脱プロトン化した。ドッキング
を、柔軟なリガンドを用いてＥｘｔｒａ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌｉｄｅを使用して行
った（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４；Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００６；Ｈａｌｇｒｅｎ
ら、２００４）。ドッキングポーズは、ドッキング後に最小化した。結果得られたコンフ
ォメーションは、１オングストロームのＲＭＳＤカットオフ内でクラスタリングした。こ
れは、それぞれのドッキングされたリガンドについて単一の代表的なポーズをもたらした
。全てのステップは、別段の注記がない限り、既定パラメータを使用した。ポーズ及び予
測された水素結合は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐ
ｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，バージョン１．７．０．０ Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ
）を用いて可視化された。

【0185】

結果：
ＬＤＨＡが、どのようにしてＬ－２ＨＧへのα－ＫＧの還元を触媒し得るかをよりよく
理解するために、本発明者らは、ＬＤＨＡの活性部位への推定基質の分子ドッキングを行
った。結果得られたドッキングポーズは、ピルベートが、カルボン酸頭部基及び隣接する
カルボニル基への水素結合により空間的に配位されたことを実証した。（図４Ａ）。ＮＡ
ＤＨからのヒドリド基によるピルベートのカルボニル炭素の求核攻撃は、還元反応が乳酸
塩のＬ－（Ｓ）－エナンチオマーを排他的に産生するように空間的に制限される（図４Ｂ
）。同様に、α－ケトグルタル酸の分子ドッキングは、カルボン酸頭部基及び隣接するカ
ルボニル基への同一の水素結合を介してピルベートへの類似した空間配位を有利に採択し
得ることを示した（図４Ｃ）。重要なことに、ＬＤＨＡの基質結合性ポケット内に、好ま
しくない立体相互作用を伴わずに、α－ケトグルタル酸のより長い尾に対応するために利
用可能なかなりの立体的空間があった（図４Ｃ）。Ｌ－乳酸塩へのピルベートの還元に類
似して、α－ＫＧのカルボニル炭素の求核攻撃は、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸が還元
反応の独占的な最終産物となり得るように空間的に制限された（図４Ｄ）。まとめると、
これらの知見は、代替的にまたは追加的に、ＬＤＨＡを低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの主要な
酵素源と同定する遺伝的データを支持する（図３Ｃ、Ｓ７Ｂ、Ｓ７Ｃ）。

【0186】

実施例５：Ｌ－２ＨＧは、低酸素に応答してエピジェネティックな変化を媒介する
材料及び方法：
ヒト膠芽腫検体：ヒト膠芽腫生検検体は、治験審査委員会からの承認後にペンシルベニ
ア大学から得た。全ての事例は、分析の前に非特定化し、以前に十分に特徴づけされた組
織マイクロアレイ（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）に含有した。

【0187】

免疫組織化学的分析：免疫組織化学試験及び定量化を、以前に記載されたように実施し
た（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ｂ）。要するに、免疫染色をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ
プロセッサ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。組
織切片を、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中の１０％正常ヤギ血清にて３０分間ブロックした。切
片を、１０マイクログラム／ｍｌのマウスモノクローナル抗ＨＩＦ１α（Ａｌｅｘｉｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ，ＡＬＸ－２１０－０６９）と、または０．１マイクログラム／ｍｌのウ
サギポリクローナル抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８８９８）と５時間インキ
ュベートした。次いで、組織切片をビオチン標識されたヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ，ＰＫ６１０２及びＰＫ６１０１）と１：２００希釈で６０
分間インキュベートした。ブロッカーＤ、ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＤＡＢ検出キ
ット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の使用説明書に
従って使用した。

【0188】

自動スコアリングのために、スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ Ｆｌａｓｈ ２５０ス
キャナー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して走査
し、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ｖｉｅｗｅｒソフトウェアプログラム（３Ｄ Ｈｉｓｔｅｃ
ｈ，マサチューセッツ州ウォルサム）を通して見た。実験計画を知らされていない個体は
、ＪＰＥＧ画像を１０倍の倍率でとらえた。各ＪＰＥＧでの免疫染色の定量化は、前述の
方法（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ｂ）に従って、Ｍａｔｌａｂの画像処理ツールボック
スを用いる自動解析プログラムを使用して実行した。アルゴリズムは、ＲＧＢの色区別を
伴うカラーセグメンテーション、Ｋ平均法及び大津の閾値を用いる背景前景分離を使用し
た。抽出された画素の数に、各コアのそれらの平均強度（画素単位で表される）を乗じて
、スコアに到達した。所与の事例及びマーカーについての最終スコアは、所与のマーカー
について（各事例の）２つのコアのスコアを平均化することにより算出された。

【0189】

結果：
生化学的に、Ｄ－２ＨＧ及びＬ－２ＨＧは両方とも、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒスト
ンリジン脱メチル化酵素ＫＤＭ４Ｃを阻害すると報告されており、それはトリメチル化ヒ
ストン３リジン９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）の異常蓄積及び正常な細胞の分化の機能障害を結果
もたらす（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋａｔｓら、２０
１４；Ｌｕら、２０１２；Ｒｏｈｌｅら、２０１３；Ｓａｓａｋｉら、２０１２）。膠芽
腫では、ＩＤＨ１／２変異は、腫瘍全体にわたるＨ３Ｋ９ｍｅ３の拡散的増加を伴うが、
一方でＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍において領域による変動を示
す（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）。

【0190】

上記の結果は、ＩＤＨ１／２野生型膠芽腫におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３染色の変動性は、低
酸素の領域と相関する可能性があることを示す。この考えを試験するために、本発明者ら
は、ＩＤＨ１／２について野生型である４７ヒト膠芽腫試料を使用して免疫組織化学によ
りＨＩＦ１α発現とＨ３Ｋ９ｍｅ３との間の相関関係を決定した（図５Ａ）。ＨＩＦ１α
発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３は、これらの試料において高く統計学的に相関した（ｐ＝０．０
１）（図５Ｂ）。

【0191】

これらの所見は、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧが、ヒト膠芽腫の血管性に易感染性の領域に
おいて観察されるＨ３Ｋ９ｍｅ３の増強を媒介し得ることを示す。この仮説を試験するた
めに、ヒト膠芽腫細胞株ＳＦ１８８を、Ｌ２ＨＧＤＨを発現するレンチウイルスまたは空
レンチウイルスベクターに安定的に感染させた。空ベクターに感染したＳＦ１８８膠芽腫
細胞は、低酸素に応答してＨ３Ｋ９ｍｅ３の増加した全体レベルを呈し（図５Ｃ）、これ
は原発性膠芽腫検体からの知見と一致した（図５Ａ及び５Ｂ）。しかしながら、低酸素誘
発性Ｌ－２ＨＧがＬ２ＨＧＤＨの過剰発現により抑止されたとき、低酸素誘発性Ｈ３Ｋ９
ｍｅ３において大幅な低下があった（図５Ｃ）。逆に、Ｌ２ＨＧＤＨの除去（結果として
低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧの増加を伴う）は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加をもたらした（図５Ｄ
）。同様のパターンが、比較的強くないが、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３で観察された（データは示
さず）。

【0192】

本発明者らは、インビトロでヒストン脱メチル化アッセイを行って、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に
与える効果が、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧによるＫＤＭ４Ｃの直接阻害を通して媒介され得
るかどうか決定した。ヒストン基質への精製したＫＤＭ４Ｃの添加は、用量依存的様式で
、Ｌ－２ＨＧによる阻害に感受性であるＨ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化をもたらした（図５
Ｄ）。これらの所見は、Ｌ－２ＨＧ及びＤ－２ＨＧによるＫＤＭ４Ｃのほぼ同等の阻害を
実証する以前の報告と一致する（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｌｕら、２０１２）
。ゆえに、Ｌ－２ＨＧの誘発は、低酸素に応答してＨ３Ｋ９ｍｅ３を増強すると思われる
。

【0193】

考察：
ＨＩＦ１αのＥＧＬＮ依存性プロリンヒドロキシル化を制御するそれらの異なる役割と
は対照的に、Ｌ－２ＨＧ及びＤ－２ＨＧは両方とも、ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤と
して機能する（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｌｕ
ら、２０１２；Ｘｕら、２０１１）。Ｄ－２ＨＧの発癌性レベルのように、Ｌ－２ＨＧの
低酸素誘発性性レベルは、増強された抑圧的なヒストンメチル化をもたらす。ＩＤＨ１／
２変異によるＤ－２ＨＧの発癌性産生が分化に対する癌促進遮断をもたらす一方で、低酸
素誘発性Ｌ－２ＨＧは、幹／前駆細胞分化の生理学的制御因子として機能し得る。低酸素
誘発性Ｌ－２ＨＧは、少なくとも一部には、様々な幹細胞集団の自己複製を維持するため
の低酸素性ニッチ及びＬＤＨＡ両方の重要性について説明し得る（Ｎｏｍｂｅｌａ－Ａｒ
ｒｉｅｔａら、２０１３；Ｓｉｍｏｎ及びＫｅｉｔｈ，２００８；Ｓｐｅｎｃｅｒら、２
０１４；Ｓｕｄａら、２０１１；Ｗａｎｇら、２０１４；Ｘｉｅら、２０１４）。具体的
には、低酸素性ニッチに存在する正常幹細胞は、分化に必要とされる遺伝子のサイレンシ
ングを維持するのに十分なＬ－２ＨＧを産生し得、ゆえに前駆／幹細胞運命を維持する。
これと一致して、Ｓｈｉｍら（２０１４）は、癌進行プロセス中のＬ２ＧＨＤＨの喪失が
、低酸素に応答して本明細書で観察されるものと類似した、Ｌ－２ＨＧの蓄積及び抑圧的
なヒストンのメチル化における変化をもたらすと近年示している。最後に、膠芽腫を有す
る患者からの生検を試験する我々の結果は、Ｌ－２ＧＨの低酸素性誘発が、この腫瘍型に
おけるエピジェネティックな異質性の発達に寄与する可能性があることを示す。これらの
結果が他の腫瘍型に当てはまるかどうかは、将来の臨床検査の対象とするところであるだ
ろう。

【0194】

本実施例は、それによりＩＤＨ１／２野生型細胞が低酸素中にα－ＫＧの酵素的還元を
介してＬ－２ＨＧを選択的に産生する新規代謝経路の本明細書に含まれる記載を支持する
。低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧは、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のいずれにも依存せず、代わりに
、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＭＤＨ１／２）からの追加的な寄与を伴う乳酸脱
水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）による無差別の基質使用を介して生じる。ＬＤＨＡの活性部位の
構造モデルは、α－ＫＧのＬＤＨＡ媒介性還元がどのようにＬ－２ＨＧを生じさせるかに
ついて指示する基質結合に対する空間的拘束を実証する。さらには、本開示は、Ｌ－２Ｈ
Ｇが、低酸素に応答して生じるヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を
増強することを示す。ゆえに、本開示は、低酸素誘発性Ｌ－２ＨＧが、核内のエピジェネ
ティックなマークの調節を介して細胞の代謝状態についての情報を運ぶ代謝シグナル伝達
中間体を表すことを実証する。
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Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｒ．，Ｙｅｏｈ，Ｋ．Ｋ．，Ｔｉａｎ，Ｙ．Ｍ．，Ｈｉｌｌｒｉｎ
ｇｈａｕｓ，Ｌ．，Ｂａｇｇ，Ｅ．Ａ．，Ｒｏｓｅ，Ｎ．Ｒ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｉ．Ｋ．，
Ｌｉ，Ｘ．Ｓ．，Ｗｏｏｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｔ
ｈｅ ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ．ＥＭＢＯ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ １２，４６３－４６９．
Ｄａｎｇ，Ｌ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｓ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｄ．
，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｆａｎｔｉｎ，Ｖ．Ｒ
．，Ｊａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｋｅｅｎａｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０
０９）．Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＩＤＨ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｐｒｏ
ｄｕｃｅ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４６２，７３９－７
４４．
ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｃｕｓｏ，Ａ．，Ｄａｉｋｈｉｎ，Ｅ．，
Ｎｉｓｓｉｍ，Ｉ．，Ｙｕｄｋｏｆｆ，Ｍ．，Ｗｅｈｒｌｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００７）．Ｂｅｙｏｎｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ
：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｅｎｇａｇｅ ｉｎ ｇｌｕｔａｍｉ
ｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｔｈａｔ ｅｘｃｅｅｄｓ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅ
ｎｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
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Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ａｂｄｅｌ－Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｗａｒｄ，
Ｐ．Ｓ．，Ｐａｔｅｌ，Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｂｈａｇｗａｔ，Ｎ．，Ｖ
ａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０
１０）．Ｌｅｕｋｅｍｉｃ ＩＤＨ１ ａｎｄ ＩＤＨ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓ
ｕｌｔ ｉｎ ａ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｄｉｓｒ
ｕｐｔ ＴＥＴ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｍｐａｉｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ
ｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８，５５３－５６
７．
Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｎｋｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｈａｌ
ｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｋｌｉｃｉｃ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｉｎｚ，Ｄ．Ｔ．，Ｒｅｐａｓｋｙ
，Ｍ．Ｐ．，Ｋｎｏｌｌ，Ｅ．Ｈ．，Ｓｈｅｌｌｅｙ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｊ．Ｋ．，ｅ
ｔ ａｌ．（２００４）．Ｇｌｉｄｅ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒａｐ
ｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ．１．Ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１７３９－１７４９．
Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｒｅｐａｓｋｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｆ
ｒｙｅ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｎ
ｓｃｈａｇｒｉｎ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ Ｍａｉｎｚ，Ｄ．Ｔ．（２００６）．Ｅｘｔｒａ
ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｌｉｄｅ：ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｉｎｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｅｎｃｌｏｓ
ｕｒｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９，６１７７－６１９６．
Ｇｒｏｓｓ，Ｓ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｒ．Ａ．，Ｍｉｎｄｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｄｒｉｇｇｅｒ
ｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｊａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ
．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｎｋｅｉｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｓｕ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２
０１０）．Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ２－ｈｙｄｒ
ｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇ
ｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ １ ａｎｄ ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０７，３３９－３４４．
Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂ
ｅａｒｄ，Ｈ．Ｓ．，Ｆｒｙｅ，Ｌ．Ｌ．，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄ Ｂａｎ
ｋｓ，Ｊ．Ｌ．（２００４）．Ｇｌｉｄｅ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒ
ａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ．２．Ｅｎｒｉ
ｃｈｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１７５０－１７５９
．
Ｈａｌｉｌｏｇｌｕ，Ｇ．，Ｊｏｂａｒｄ，Ｆ．，Ｏｇｕｚ，Ｋ．Ｋ．，Ａｎｌａｒ，Ｂ
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ｃ ａｃｉｄｕｒｉａ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ
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ｍａｇｉｎｇ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ３９，１１９－１
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ａｌｐｈａ）ａｎｄ ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｇｅｎｅ ｒｅｇ
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Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ
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ｃＬｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｄｏｏｌｉｎｇ，Ｄ．，Ｄｕｎｆｏｒｄ－
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ｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２７，８３６－８５２．
Ｌｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｌｏｏｐｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｐ．，Ｌｅｅ，
Ｓ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｋ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｃ．，Ｃｏｗｌｅｙ，Ｇ．Ｓ．
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Ｌｕ，Ｃ．，Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｋａｐｏｏｒ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｏｈｌｅ，Ｄ．，Ｔｕｒ
ｃａｎ，Ｓ．，Ａｂｄｅｌ－Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｈａｎｉ
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ａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，１４４－１５３．
Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｉｎ，Ｊ．Ｃ．，
Ｌｅａｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，Ｐ．，Ｍａｎｋｏｏ，Ｐ．，Ｃａｒｔｅｒ
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８１２．
Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｏｎｅｎ，Ｍ．，Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ｆｅｒｎａｎ
ｄｅｚ，Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｒａｃｅｖｓｋｉｓ，Ｊ．，Ｖａｎ Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇ
ｈｅ，Ｐ．，Ｄｏｌｇａｌｅｖ，Ｉ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．，Ａｍｉｎｏｖａ，Ｏ．，ｅ
ｔ ａｌ．（２０１２）．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅ
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ｄｉｃｉｎｅ ３６６，１０７９－１０８９．
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｖａｎｄｅｒｈｅｌｍ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｋ
．，ａｎｄ Ｍｉｎｋｉｎ，Ｊ．Ａ．（１９６２）．Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕ
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ
Ａｃｉｄ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８４，３０９－＆．
Ｒｅａｄ，Ｊ．Ａ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｖ．Ｊ．，Ｅｓｚｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｅｓｓｉｏｎ
ｓ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ Ｂｒａｄｙ，Ｒ．Ｌ．（２００１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂ
ａｓｉｓ ｆｏｒ ａｌｔｅｒｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍ－ ａｎｄ Ｈ－ｉｓ
ｏｚｙｍｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４３，１７５－１８５．
Ｒｏｈｌｅ，Ｄ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｉ－Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｐａｌａｓｋａｓ，Ｎ．，
Ｔｕｒｃａｎ，Ｓ．，Ｇｒｏｍｍｅｓ，Ｃ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｃ．，Ｔｓｏｉ，Ｊ．，Ｃ
ｌａｒｋ，Ｏ．，Ｏｌｄｒｉｎｉ，Ｂ．，Ｋｏｍｉｓｏｐｏｕｌｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ
．（２０１３）．Ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＩＤＨ１ ｄｅｌａ
ｙｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０，６２６－６３０．
Ｒｚｅｍ，Ｒ．，Ｖｅｉｇａ－ｄａ－Ｃｕｎｈａ，Ｍ．，Ｎｏｅｌ，Ｇ．，Ｇｏｆｆｅｔ
ｔｅ，Ｓ．，Ｎａｓｓｏｇｎｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｔａｂａｒｋｉ，Ｂ．，Ｓｃｈｏｌｌｅｒ，
Ｃ．，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｔ．，Ｖｉｋｋｕｌａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｖａｎ Ｓｃｈａｆ
ｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．（２００４）．Ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｕｔａｔｉ
ｖｅ ＦＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕ
ｔａｒｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０１，１６８４９－１６８５４．
Ｒｚｅｍ，Ｒ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｎ Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．，
ａｎｄ Ｖｅｉｇａ－ｄａ－Ｃｕｎｈａ，Ｍ．（２００７）．Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇ
ｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ，ａ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ
ｒｅｐａｉｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ ３０，６８１－６８９．
Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｋｎｏｂｂｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｎｄ，Ｅ
．Ｆ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．，Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｈｏ
ｌｍｅｓ，Ｒ．，Ｗａｋｅｈａｍ，Ａ．，Ｈａｉｇｈｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２
）．ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｍｕｒｉｎｅ ｈ
ａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｅｐｉ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４８８，６５６－６５９．
Ｓｃｈａｔｚ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｅｇａｌ，Ｈ．Ｌ．（１９６９）．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｂｙ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｌ
ａｃｔｉｃ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｘ ｏｆ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓ
ｕｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
４４，４３９３－４３９７．
Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ（２０１４）．Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１
４－３：Ｍａｅｓｔｒｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ ９．９，Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０１３）．ＨＩＦ－１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｈｙｐｏｘｉａ ａｎ
ｄ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２３，３６６４－３６７１．
Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｉｖｉ，Ｃ．Ｂ．，Ｒａｋｈｅｊａ，Ｄ．，Ｔａｎ，Ｊ．，Ｂｅ
ｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｖ．，Ｋｈｏ，Ｅ．Ｙ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｐ．，Ｋｉ
ｒｋｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｌｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．ｌ－２－Ｈｙｄｒｏｘ
ｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：Ａｎ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ ａｎｄ Ｐｕ
ｔａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４，１２９０－１２９８．
Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．（２００８）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏ
ｆ ｏｘｙｇｅｎ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９，２８５－２９６．
Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｃ．Ｒ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ．，Ｒｏｓｔｋｏｗｓｋ
ｉ，Ｍ．，ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．（２０１１）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ
Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｐＫ（ａ）Ｖａｌｕｅｓ．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ ７
，２２８４－２２９５．
Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｆ．，Ｒｏｕｓｓａｋｉｓ，Ｅ．，Ｋｌｅ
ｉｎ，Ａ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｒｕｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｚａｈｅｒ，Ｗ．，Ｍｏｒｔｅｎ
ｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．，Ａｌｔ，Ｃ．，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）
．Ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｃ
ｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｌｉｖｅ ａｎｉ
ｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５０８，２６９－２７３．
Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．（
１９６４）．Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｓｏｃｉ
ｔｒａｔｅ Ｌｙａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３９，４２６８－４２７１．
Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．（２０
０７）．Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａ
ｒｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ：ｍａｓｓ ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖ
ｅａｌ ２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ．Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ３０，
６９０－６９３．
Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｓａｌｏｍｏｎｓ，Ｇ．Ｓ．，Ａｃｈｏｕｒｉ，Ｙ．，Ｖａｎ
Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．，Ｇｒｏｓｓｏ，Ｓ．，Ｃｒａｉｇｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｖ
ｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ｎ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．（２００５）．Ｍｕｔａｔｉ
ｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｕｓｅ Ｄ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉ
ｄｕｒｉａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
７６，３５８－３６０．
Ｓｕｄａ，Ｔ．，Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０１１）
．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓ
ｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉｃ ｎｉｃｈｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ ９，２９８－３１０．
Ｔａｕｓｅｎｄｓｃｈｏｎ，Ｍ．，Ｄｅｈｎｅ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｒｕｎｅ，Ｂ．（２０
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Ｔｅｒｕｎｕｍａ，Ａ．，Ｐｕｔｌｕｒｉ，Ｎ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｐ．，Ｍａｔｈｅ，Ｅ
．Ａ．，Ｄｏｒｓｅｙ，Ｔ．Ｈ．，Ｙｉ，Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｔ．Ａ．，Ｉｓｓａｑ
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Ｖｅｎｎｅｔｉ，Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｅｌｌａ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｏｙｎｅ，Ｔ．，Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｏｒｏｖｅｔｓ，Ｄ．，Ｈｕｓｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｊ．
，Ｌｕ，Ｃ．，Ｔｉｈａｎ，Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１
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ｏｇｌｉｏｍａｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７２，２９８－３０６．
Ｖｅｎｎｅｔｉ，Ｓ．，Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｍ．，
Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｄ．，Ｈｕｓｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｈｅｇｕｙ，Ａ．，Ｓａｎｔｉ，Ｍ．，
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Ｋ２７Ｍ ｍｕｔａｎｔ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ
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Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｔｒａｖｉｎｓ，Ｊ．，ＤｅＬａＢａｒｒｅ，Ｂ．，Ｐｅｎａｒｄ－Ｌ
ａｃｒｏｎｉｑｕｅ，Ｖ．，Ｓｃｈａｌｍ，Ｓ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｅ．，Ｓｔｒａｌｅｙ
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Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｖ．Ｗ．，
Ｊｅａｎｓｏｎ，Ｎ．Ｔ．，Ｃｌｉｓｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｖａｎ
ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．（２０１４）．Ｃ
ｅｌｌ－ｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ
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１５８，１３０９－１３２３．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｗｅｉｇｅｒｔ，Ｏ．，Ａｂ
ｅｌ－Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｓ
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ｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３１，２４９１－
２４９８．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｔｅｌ，Ｊ．，Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，Ａｂｄｅｌ－Ｗａｈａｂ
，Ｏ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ａ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，
Ｆａｎｔｉｎ，Ｖ．Ｒ．，Ｈｅｄｖａｔ，Ｃ．Ｖ．，Ｐｅｒｌ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．
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ｏｍｏｒｐｈｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ａｌｐｈ
ａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｏ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １７，２２５－２３４．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１２）．Ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ａ ｃａｎｃｅｒ ｈａｌｌｍａｒｋ ｅｖｅｎ
ｗａｒｂｕｒｇ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｎｔｉｃｉｐａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ
２１，２９７－３０８．

Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｃｕｓｏ，Ａ．，Ｓ
ａｙｅｄ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｙ．，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｈ．Ｋ．，Ｎｉｓｓｉｍ，
Ｉ．，Ｄａｉｋｈｉｎ，Ｅ．，Ｙｕｄｋｏｆｆ，Ｍ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ
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ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａ
ｄｄｉｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ
ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ １０５，１８７８２－１８７８７．
Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１０）．Ｇｌｕｔａｍ
ｉｎｅ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉ
ｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
３５，４２７－４３３．
Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．
，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｃｈｄｅｖａ，Ｕ．Ｍ．，Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅ
Ｍａｔｔｅｏ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．
（２０１１）．Ｈｙｐｏｘｉａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈ
ａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｏ ｃｉｔｒａｔｅ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｃｅ
ｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８，１９６１１－１９６１６．
Ｘｉｅ，Ｈ．，Ｈａｎａｉ，Ｊ．，Ｒｅｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｋａｔｓ，Ｌ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ
，Ｋ．，Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｐ．，Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｂｉｌｌｉａｒｄ，Ｊ
．，Ｄｕｆｆｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｒａｎｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－－ａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔ
ｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏ
ｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔｓ ｔｕ
ｍｏｒ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９，
７９５－８０９．
Ｘｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｋｉｍ
，Ｓ．Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｘｉａｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｌ．Ｘ．，
ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕ
ｔａｒａｔｅ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｌｐ
ｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９，１７－３０．
Ｙａｎ，Ｈ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｊｉｎ，Ｇ．，ＭｃＬｅｎｄｏｎ，Ｒ．，Ｒ
ａｓｈｅｅｄ，Ｂ．Ａ．，Ｙｕａｎ，Ｗ．，Ｋｏｓ，Ｉ．，Ｂａｔｉｎｉｃ－Ｈａｂｅｒ
ｌｅ，Ｉ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｒｉｇｇｉｎｓ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）
．ＩＤＨ１ ａｎｄ ＩＤＨ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｔｈｅ
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０，７６５－
７７３．
Ｚｈｄａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｗａｔｅｒｓ，Ａ．Ｈ．，Ｇｏｌｕｂｅｖａ，Ａ．Ｖ．，ａ
ｎｄ Ｐａｐｋｏｖｓｋｙ，Ｄ．Ｂ．（２０１４）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｎ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ ＨＩＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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