特許 7209754 抗Ｂ型インフルエンザ抗体の中和及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-12

(45)【発行日】2023-01-20

(54)【発明の名称】抗Ｂ型インフルエンザ抗体の中和及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230113BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230113BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230113BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20230113BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230113BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/10

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P31/16

A61K39/395 S

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021018692

(22)【出願日】2021-02-09

(62)【分割の表示】P 2017523183の分割

【原出願日】2015-07-14

(65)【公開番号】P2021074013

(43)【公開日】2021-05-20

【審査請求日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】62/024,804

(32)【優先日】2014-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(73)【特許権者】

【識別番号】516097907

【氏名又は名称】ヒューマブス バイオメド エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(72)【発明者】

【氏名】コルティ，ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】ランザヴェッキア，アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】カールワード－リレイ，ニコル

(72)【発明者】

【氏名】ジュー，チン

(72)【発明者】

【氏名】ベンジャミン，エボニー

(72)【発明者】

【氏名】ウェヒター，レスリー

(72)【発明者】

【氏名】ユアン，アンディ

(72)【発明者】

【氏名】マコーリフ，ジョセフィン，メアリー

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０７０５６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／１３２００７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／００７７７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０１１３４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０８６０５２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Dreyfus et al.，Science，2012年，Vol. 337, No. 6100，pp. 1343-1348

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異Ｆｃ領域を含む単離された抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）の球状頭部に結合し、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡに結合し、２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和し、且つ少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和する能力があり、
前記抗体又はその抗原結合断片は、天然Ｆｃ抗体と比べて、増加した血清半減期を有し、
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４５のＨＣＤＲ－１、配列番号１４６のＨＣＤＲ－２、配列番号１４７のＨＣＤＲ－３、配列番号１４８のＬＣＤＲ－１、配列番号１４９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ－３を含む６つのＣＤＲセットを含む、
前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ、及び配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＬを含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、及び／又は
（ｂ）Ｂ／ＡＡ／９４（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／２／９４（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＹＳＩ／９８（ｃａ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＪＨＢ／９９（ｃａ Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＳＣ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＦＬ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ｙａｍａｇａｔａ））から選択されるＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（ｖｉｃｔｏｒｉａ））、Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＢＮＥ／０８（ｃａ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（ｖｉｃｔｏｒｉａ））から選択されるＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；Ｂ／ＡＡ／６６（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）；Ｂ／ＨＫ／７２（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５／７２）から選択される分岐前のＢ型インフルエンザ株；及びこれらの組み合わせに結合する能力がある、
前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

変異Ｆｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１、２２５、２２８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３０８、３１３、３１６、３１８、３２０、３２２、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４２８、４３３、４３４、４３５、４３６、４４０、及び４４３から選択される１つ以上の位置に修飾を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

修飾が、置換、挿入及び欠失から選択される、請求項５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

変異Ｆｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１Ｋ、２２１Ｙ、２２５Ｅ、２２５Ｋ、２２５Ｗ、２２８Ｐ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４Ｉ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３７Ｌ、２３７Ｍ、２３７Ｐ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５０Ｅ、２５０Ｑ、２５１Ｆ、２５２Ｌ、２５２Ｙ、２５４Ｓ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｆ、２５６Ｍ、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３Ｉ、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４Ｉ、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ａ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６８Ｅ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２９６Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ａ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５Ｉ、３０８Ｆ、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３１８Ａ、３１８Ｓ、３２０Ａ、３２０Ｓ、３２２Ａ、３２２Ｓ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２６Ａ、３２６Ｄ、３２６Ｅ、３２６Ｇ、３２６Ｍ、３２６Ｖ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１Ｉ、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３３Ａ、３３３Ｄ、３３３Ｇ、３３３Ｑ、３３３Ｓ、３３３Ｖ、３３４Ａ、３３４Ｅ、３３４Ｈ、３３４Ｌ、３３４Ｍ、３３４Ｑ、３３４Ｖ、３３４Ｙ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、４３３Ｋ、４３３Ｌ、４３４Ａ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｈ、４４０Ｙ及び４４３Ｗから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であって、変異Ｆｃ領域が、
（ａ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８、２３４、２３５及び３３１から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾；
（ｂ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８及び２３５から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾；
（ｃ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９、３３０及び３３２から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾；又は
（ｄ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２、２５４、及び２５６から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾
を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であって、変異Ｆｃ領域が、
（ａ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、及び３３１Ｓから選択される１つ以上の置換；
（ｂ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３５Ｅ及び２３５Ｙから選択される１つ以上の置換；
（ｃ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、及び３３２Ｅから選択される１つ以上の置換；
（ｄ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅから選択される１つ以上の置換；又は
（ｅ）Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの３つの置換２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ
を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

変異Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸。

【請求項12】

Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を産生するためのベクターであって、請求項１１に記載の単離核酸を含むベクター。

【請求項13】

Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を発現することが可能な宿主細胞であって、請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製するための方法であって、請求項１１に記載の核酸又は前記核酸を含むベクターを含む宿主細胞を、前記抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む組成物であって、
（ａ）被験体におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための；
（ｂ）被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための；及び／又は
（ｃ）被験体におけるＢ型インフルエンザ感染のインビトロ診断のための、
前記組成物。

【請求項17】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）抗体の１μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ ₅₀ でＡ型インフルエンザＨＡに結合する；及び／又は
（ｂ）マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和において、抗体の０．０１μｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌの範囲内でのＩＣ ₅₀ を有する、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して広範な中和活性を有する抗体及びかかる抗体の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）は、毎年のインフルエンザ流行病や偶発的な世界的大流行を引き起こし、世界規模で公衆衛生に多大な脅威をもたらしている。季節性インフルエンザ感染は、毎年、特に幼児、易感染性患者及び高齢者における２００，０００～５００，０００人の死亡に関連している。死亡率は、典型的には、パンデミックインフルエンザの大流行に伴い、季節を通じてさらに増加する。特に十分なサービスを受けていない集団においてインフルエンザ感染を予防し、治療するための強力な抗ウイルス薬という多くの満たされていない医学的需要が残っている。

【0003】

インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型及びＣ型の３つの型が存在する。インフルエンザ疾患の大部分は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＪＡＭＡ．２９２：１３３３－１３４０；及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７－１４３６）。Ａ型、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの全体構造は類似しており、中心コアを囲むウイルスエンベロープを含む。ウイルスエンベロープは、２つの表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含み、ＨＡはウイルスの標的細胞への結合及び標的細胞への侵入を媒介する一方、ＮＡは子孫ウイルスの感染細胞からの放出に関与する。

【0004】

ＨＡタンパク質は構造が三量体であり、タンパク質分解成熟時、球状頭部（ＨＡ１）及びストーク領域（ＨＡ２）を有するｐＨ依存性の準安定な中間体に切断される単一のポリペプチド前駆体ＨＡ０の３つの同一コピーを含む（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ．２８９：３６６－３７３）。膜遠位の球状頭部は、ＨＡ１構造の大部分を構成し、ウイルス侵入及び主要な抗原ドメインに対するシアル酸結合ポケットを有する。

【0005】

Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子における遺伝的変異に基づいたサブタイプに分類され得る。現在、季節性の流行病では、Ａ型インフルエンザＨ１及びＨ３のＨＡサブタイプが主にヒト疾患に関連する一方、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９及びＨ１０をコードするウイルスは、動物からの直接感染に起因する孤発性のヒトでの大流行に関連する。

【0006】

Ａ型インフルエンザウイルスに対して、Ｂ型インフルエンザウイルスは、２つの表面糖タンパク質に基づくサブタイプに分けられず、１９７０年代まで１つの均一なグループとして分類された。１９７０年代を通じて、Ｂ型インフルエンザウイルスは、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ系統と名付けられた２つの抗原的に識別可能な系統に、それら各々の最初の代表であるＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８の後から分岐し始めた（Ｂｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８（４）：１４２５－７；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０２１１６－０９．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊａｎ ２７）。Ｂ型インフルエンザウイルスはヒト感染に限定され、また両系統は毎年の流行病に寄与する。Ｂ型インフルエンザウイルスに起因する罹患率はＡ型インフルエンザＨ３Ｎ２に伴うものより低いが、Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１に伴うものより高い（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７－１４３６）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＪＡＭＡ．２９２：１３３３－１３４０

【文献】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７－１４３６

【文献】Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ．２８９：３６６－３７３

【文献】Ｂｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８（４）：１４２５－７；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０２１１６－０９．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊａｎ ２７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

インフルエンザウイルス感染によって誘導される中和抗体は通常、ウイルス受容体結合を阻止するため、可変ＨＡ１球状頭部に標的化され、通常は株に特異的である。１つ以上のサブタイプ又は系統を中和する広範に交差反応性の抗体は希少である。近年、両系統のＢ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを中和し得る数種のヒト抗体が発見されている（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６１００）：１３４３－８；及びＹａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ Ｐａｔｈ．９（２）：ｅ１００３１５０）。これらの抗体は多数のＢ型インフルエンザウイルスを認識するが、限られた適用範囲と効力を有し、またＡ型インフルエンザウイルス株をいずれも中和することがない。現在まで、すべてのＢ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和若しくは阻害するか又はＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を弱毒化する利用可能な抗体は存在しない。したがって、複数のインフルエンザウイルスに対して保護する新規抗体を同定する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書に記載の発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある。Ｙａｍａｇａｔａ系統として、限定はされないが、Ｂ／ＡＡ／９４（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／２／９４（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＹＳＩ／９８（ｃａ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＪＨＢ／９９（ｃａ Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＳＣ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＦＬ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ｙａｍａｇａｔａ））が挙げられる。Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統として、限定はされないが、Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（ｖｉｃｔｏｒｉａ））、Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＢＮＥ／０８（ｃａ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（ｖｉｃｔｏｒｉａ））が挙げられる。

【0010】

別の実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つ分岐前の（ｐｒｅ－ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）株におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「分岐前の」は、Ｂ型インフルエンザのＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統への分岐前に同定されたＢ型インフルエンザ株を指す。分岐前のＢ型インフルエンザ株として、限定はされないが、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；Ｂ／ＡＡ／６６（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）；及びＢ／ＨＫ／７２（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５／７２）が挙げられる。

【0011】

一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、抗体の約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ_５０でＢ型インフルエンザウイルスに結合する。別の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、実施例３に記載の通り、マイクロ中和アッセイにおけるＢ型インフルエンザウイルスの中和における、抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０μｇ／ｍｌ）として表される中和効力を有する。他のマイクロ中和アッセイもまた実施例１に記載されている。

【0012】

一実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合する能力がある。Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンは、サブタイプ１及びサブタイプ２のヘマグルチニンを含む。Ａ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びそれらの変異体を含む。Ａ型インフルエンザウイルスグループ２のサブタイプは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５並びにそれらの変異体を含む。一実施形態では、抗体は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプに結合する能力がある。別の実施形態では、抗体は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスグループ２のサブタイプに結合する能力がある。一実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプＨ９に結合する能力がある。一実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ、又はその組み合わせを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及び１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス又は少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス及び少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ１を中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプＨ９のヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプＨ９、又はそれらの組み合わせを中和する能力がある単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0013】

一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、抗体の約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ_５０でＡ型インフルエンザＨＡに結合する。別の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和において、抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内でのＩＣ_５０を有する。

【0014】

一実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、ＨＡの球状頭部領域に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＨＡの球状頭部領域に結合し、且つＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方からのＢ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。本発明の抗体は、抗Ｂ型インフルエンザＨＡ球状頭部に結合する抗体であり、公知の抗Ｂ型インフルエンザ抗体と比べて、Ｂ型インフルエンザウイルスに対するより広い適用範囲又はより優れた中和活性を示す。

【0015】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ－１、配列番号４のＨＣＤＲ－２、配列番号５のＨＣＤＲ－３、配列番号８のＬＣＤＲ－１、配列番号９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０のＬＣＤＲ－３；
（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ－１、配列番号１４のＨＣＤＲ－２、配列番号１５のＨＣＤＲ－３、配列番号１８のＬＣＤＲ－１、配列番号１９のＬＣＤＲ－２、配列番号２０のＬＣＤＲ－３；
（ｃ）配列番号２３のＨＣＤＲ－１、配列番号２４のＨＣＤＲ－２、配列番号２５のＨＣＤＲ－３、配列番号２８のＬＣＤＲ－１、配列番号２９のＬＣＤＲ－２及び配列番号３０のＬＣＤＲ－３；
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ－１、配列番号３４のＨＣＤＲ－２、配列番号３５のＨＣＤＲ－３、配列番号３８のＬＣＤＲ－１、配列番号３９のＬＣＤＲ－２及び配列番号４０のＬＣＤＲ－３；
（ｅ）配列番号４３のＨＣＤＲ－１、配列番号４４のＨＣＤＲ－２、配列番号４５のＨＣＤＲ－３、配列番号４８のＬＣＤＲ－１、配列番号４９のＬＣＤＲ－２及び配列番号５０のＬＣＤＲ－３；
（ｆ）配列番号５３のＨＣＤＲ－１、配列番号５４のＨＣＤＲ－２、配列番号５５のＨＣＤＲ－３、配列番号５８のＬＣＤＲ－１、配列番号５９のＬＣＤＲ－２及び配列番号６０のＬＣＤＲ－３；
（ｇ）配列番号６３のＨＣＤＲ－１、配列番号６４のＨＣＤＲ－２、配列番号６５のＨＣＤＲ－３、配列番号６８のＬＣＤＲ－１、配列番号６９のＬＣＤＲ－２及び配列番号７０のＬＣＤＲ－３；
（ｈ）配列番号７５のＨＣＤＲ－１、配列番号７６のＨＣＤＲ－２、配列番号７７のＨＣＤＲ－３、配列番号８３のＬＣＤＲ－１、配列番号８４のＬＣＤＲ－２及び配列番号８５のＬＣＤＲ－３；
（ｉ）配列番号９１のＨＣＤＲ－１、配列番号９２のＨＣＤＲ－２、配列番号９３のＨＣＤＲ－３、配列番号９９のＬＣＤＲ－１、配列番号１００のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０１のＬＣＤＲ－３；
（ｊ）配列番号１０７のＨＣＤＲ－１、配列番号１０８のＨＣＤＲ－２、配列番号１０９のＨＣＤＲ－３、配列番号１１５のＬＣＤＲ－１、配列番号１１６のＬＣＤＲ－２及び配列番号１１７のＬＣＤＲ－３；
（ｋ）配列番号１２１のＨＣＤＲ－１、配列番号１２２のＨＣＤＲ－２、配列番号１２３のＨＣＤＲ－３、配列番号１２４のＬＣＤＲ－１、配列番号１２５のＬＣＤＲ－２及び配列番号１２６のＬＣＤＲ－３；
（ｌ）配列番号１２７のＨＣＤＲ－１、配列番号１２８のＨＣＤＲ－２、配列番号１２９のＨＣＤＲ－３、配列番号１３０のＬＣＤＲ－１、配列番号１３１のＬＣＤＲ－２及び配列番号１３２のＬＣＤＲ－３；
（ｍ）配列番号１３３のＨＣＤＲ－１、配列番号１３４のＨＣＤＲ－２、配列番号１３５のＨＣＤＲ－３、配列番号１３６のＬＣＤＲ－１、配列番号１３７のＬＣＤＲ－２及び配列番号１３８のＬＣＤＲ－３；
（ｎ）配列番号１３９のＨＣＤＲ－１、配列番号１４０のＨＣＤＲ－２、配列番号１４１のＨＣＤＲ－３、配列番号１４２のＬＣＤＲ－１、配列番号１４３のＬＣＤＲ－２及び配列番号１４４のＬＣＤＲ－３；
（ｏ）配列番号１４５のＨＣＤＲ－１、配列番号１４６のＨＣＤＲ－２、配列番号１４７のＨＣＤＲ－３、配列番号１４８のＬＣＤＲ－１、配列番号１４９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ－３；
（ｐ）配列番号７８のＨＣＤＲ－１、配列番号７９のＨＣＤＲ－２、配列番号８０のＨＣＤＲ－３、配列番号８６のＬＣＤＲ－１、配列番号８７のＬＣＤＲ－２及び配列番号８８のＬＣＤＲ－３；
（ｑ）配列番号９４のＨＣＤＲ－１、配列番号９５のＨＣＤＲ－２、配列番号９６のＨＣＤＲ－３、配列番号１０２のＬＣＤＲ－１、配列番号１０３のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０４のＬＣＤＲ－３；
（ｒ）配列番号１１０のＨＣＤＲ－１、配列番号１１１のＨＣＤＲ－２、配列番号１１２のＨＣＤＲ－３、配列番号１１８のＬＣＤＲ－１、配列番号１１９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１２０のＬＣＤＲ－３；及び
（ｓ）１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む（ａ）～（ｒ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲセット
から選択される６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、ＨＣＤＲ－３、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３を含む。

【0016】

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から各々選択されるＶＨ及び／又はＶＬに対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及び／又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＬを有する。

【0017】

さらなる特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬを含む。

【0018】

一実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体は配列番号７１のＶＨアミノ酸配列を有し、ここで配列番号７１のＸａａ_１はＶａｌ又はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ_２はＬｅｕ又はＰｈｅであり；配列番号７１のＸａａ_３はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_４はＬｅｕ又はＳｅｒであり；配列番号７１のＸａａ_５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_６はＭｅｔ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_７はＰｈｅ又はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ_８はＨｉｓ又はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ_９はＳｅｒ又はＡｓｎであり；配列番号７１のＸａａ_１０はＡｒｇ又はＬｙｓであり；且つ配列番号７１のＸａａ_１１はＡｌａ又はＴｈｒであり；また配列番号７２のＶＬアミノ酸配列を有し、ここで配列番号７２のＸａａ_１はＰｈｅ又はＴｙｒである。一実施形態では、配列番号７１のＸａａ_９はＳｅｒである。別の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_４はＬｅｕである。さらに別の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_１はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ_５はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_６はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_７はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ_８はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ_１０はＬｙｓであり；配列番号７１のＸａａ_１１はＴｈｒであり、又はそれらの組み合わせである。別の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_１はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ_５はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_６はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_７はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ_８はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ_９はＳｅｒであり；配列番号７１のＸａａ_１０はＬｙｓであり；且つ配列番号７１のＸａａ_１１はＴｈｒである。

【0019】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単独ドメイン抗体、ダイアボディ抗体、多重特異性抗体、二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、及び二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体から選択される。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片はＦｃ領域を含む。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４又はその断片である。

【0020】

一実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスに結合し、且つＢ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統を中和する能力がある、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統の中で保存されるエピトープに結合する。一実施形態では、エピトープの１つ以上の接触残基は、Ｂ型インフルエンザＨＡの頭部領域内に位置する。一実施形態では、エピトープは、接触残基としてＨＡの頭部領域の配列の１２８、１４１、１５０及び２３５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（６）：３０１１－２０）。

【0021】

別の実施形態では、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つ、本発明の抗体と同じエピトープに結合するか又はＢ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合に対して本発明の抗体と競合する、２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から選択されるアミノ酸配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合に対して同抗体と競合する。

【0022】

本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸、並びにかかる単離された核酸を含むベクター及びかかる核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。別の実施形態では、ベクターは非天然の組換えベクターである。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。一実施形態では、ベクター又はプラスミドは、１つ以上の発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、選択可能なマーカー遺伝子、又はその組み合わせに作動可能に連結された、本発明の抗体分子又はその抗原結合断片、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメイン、又はその一部、あるいは重鎖又は軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ベクター又はプラスミドは、少なくとも１つの異種発現制御エレメント、選択可能なマーカー、又はその組み合わせを含む。

【0023】

一実施形態では、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を、本明細書に記載の宿主細胞を抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養することにより作製するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、抗体又はその抗原結合断片を宿主細胞培養物から単離するステップを含む。一実施形態では、宿主細胞は、細胞が天然に見出される組織から単離される。例えば、宿主細胞は、生物から単離され、細胞培養下、生体外で維持され得る。

【0024】

本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、本組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片並びにｐＨ６．０での２５ｍＭのＨｉｓ及び０．１５ＭのＮａＣｌを含む。

【0025】

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、被験者におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療において用いられる。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療において用いられる。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、被験者におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の製造において用いられる。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の製造において用いられる。

【0026】

一実施形態では、本発明は、被験者におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、本発明の抗体又はその抗原結合断片を被験者に有効量で投与するステップを含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、本発明の抗体又はその抗原結合断片を被験者に有効量で投与するステップを含む、方法を提供する。

【0027】

一実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、被験者におけるＢ型インフルエンザ感染のインビトロ診断用に用いられる。別の実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染のインビトロ診断用に用いられる。さらに別の実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染及びＢ型インフルエンザ感染のインビトロ診断用に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】Ｂ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）とのインキュベーション後のＮＫ細胞活性化と抗ＨＡ抗体ＦＢＤ－９４及びＦＢＣ－３９並びにＦｃエフェクター機能が欠如した変異体（ＦＢＤ－９４ ＬＡＬＡ及びＦＢＣ－３９ ＬＡＬＡ）の連続希釈により測定される場合の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。

【図2】様々な濃度のＦＢＣ－３９（Ａ及びＣ）、ＦＢＤ－９４（Ｂ及びＤ）及び非関連対照抗体が、致死量のＢ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（Ｙａｍａｇａｔａ）（Ａ及びＢ）又はＢ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｃ及びＤ）インフルエンザウイルスによる感染の４時間前に投与された生存動物の百分率を示す。

【図3】致死量のＢ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（Ｙａｍａｇａｔａ）（Ａ及びＢ）又はＢ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｃ及びＤ）による感染を受け、様々な用量のＦＢＣ－３９（Ａ及びＣ）又はＦＢＤ－９４（Ｂ及びＤ）、又は非関連対照抗体で感染後の２日目に治療された生存動物の百分率を示す。

【図4】致死量のＢ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を受け、３ｍｇ／ｋｇのＦＢＣ－３９（Ａ）又はＦＢＤ－９４（Ｂ）、又は非関連対照抗体で感染後の１、２、３、又は４日目に治療された生存動物の百分率を示す。

【図5A】Ｋａｂａｔ及びＩＭＧＴ付番システムを用いての抗Ｂ型インフルエンザ抗体ＦＢＤ－５６、ＦＢＤ－９４、ＦＢＣ－３９、ＦＢＣ－３９ＬＳＬ、ＦＢＣ－３９ＦＳＬ、ＦＢＣ－３９ＬＴＬ、ＦＢＣ－３９ＦＴＬ、ＦＢＣ－３９ＦＳＳ、ＦＢＣ－３９ＬＴＳ、及びＦＢＣ－３９ＦＴＳのＶＨ及びＶＬ配列内部のＣＤＲ（枠内）を示す。ＶＨ及びＶＬ配列内部の修飾アミノ酸は太字と下線で示される。

【図5B】図５Ａの続きである。

【図5C】図５Ａの続きである。

【図6】ＦＢＣ－３９の重鎖アミノ酸配列（配列番号２２）に基づく、一般名としての抗Ｂ型インフルエンザ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号７１）を示し、ここでＸａａ_１はＶａｌ又はＧｌｕであり得；Ｘａａ_２はＬｅｕ又はＰｈｅであり得；Ｘａａ_３はＴｈｒ又はＳｅｒであり得；Ｘａａ_４はＳｅｒ又はＬｅｕであり得；Ｘａａ_５はＴｈｒ又はＳｅｒであり得；Ｘａａ_６はＴｈｒ又はＭｅｔであり得；Ｘａａ_７はＴｙｒ又はＰｈｅであり得；Ｘａａ_８はＧｌｎ又はＨｉｓであり得；Ｘａａ_９はＡｓｎ又はＳｅｒであり得；Ｘａａ_１０はＬｙｓ又はＡｒｇであり得；且つＸａａ_１１はＴｈｒ又はＡｌａであり得る。

【図7】ＦＢＣ－３９の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２７）に基づく、一般名としての抗Ｂ型インフルエンザ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号７２）を示し、ここでＸａａ_１はＰｈｅ又はＴｙｒであり得る。

【図8】モノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）の単離において用いられるウイルスからのＨＡ１タンパク質の整列化を示す。ＭＡＲＭの選択を通じて接触残基であることが見出されたアミノ酸位置が枠で囲まれる。

【発明を実施するための形態】

【0029】

導入
本発明は、本明細書に記載の通り、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する、ヒト型を含む抗体、並びに抗原結合断片、誘導体／コンジュゲート及びそれらの組成物を提供する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の通り、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和するもので、かかる抗Ｂ型インフルエンザ抗体及びその断片は本明細書中で本発明の抗体と称される。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ、又はその組み合わせを中和する。かかる抗Ｂ型インフルエンザ抗体及びその断片もまた、本明細書中で本発明の抗体と称される。

【0030】

本明細書で用いられるとき、用語「中和する」は、抗体又はその抗原結合断片が感染病原体、例えばＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに結合し、且つ生物学的活性、例えば感染病原体の病原性を低下させる能力を指す。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス、又はその組み合わせの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。さらなる特定の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）の少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。別のさらなる特定の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡ球状頭部の少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。

【0031】

抗体は、感染病原体、例えばＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスの活性を、ウイルスの生活環の期間中の様々な時点で中和し得る。例えば、抗体は、ウイルスと１つ以上の細胞表面受容体との相互作用に干渉することにより、ウイルスの標的細胞への付着に干渉し得る。或いは、抗体は、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスによるウイルス内部移行に干渉することにより、ウイルスとその受容体との１つ以上の付着後の相互作用に干渉し得る。

【0032】

本明細書で使用されるとき、免疫グロブリンとしても知られる「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望される生物学的活性を呈する抗体断片（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、及び上記のいずれかのエピトープ－結合断片を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子、を含む。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ又はｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、又はｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２又は３））であってもよい。

【0033】

ヒト抗体は通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖を含む。各軽鎖は１つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖に連結される一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内のジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それにいくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の１番目の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づきλ鎖又はκ鎖のいずれかに分類される。κ軽鎖の可変ドメインはまた、本明細書中でＶＫとして表され得る。

【0034】

本発明の抗体は、完全長抗体又はインタクトな抗体、抗原結合断片を含む抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト抗体、ヒト化抗体、翻訳後修飾抗体、キメラ又は融合抗体、イムノコンジュゲート、及びそれらの機能断片を含む。抗体は、Ｆｃ領域内を修飾することで、所望されるエフェクター機能又は血清半減期を供することができる。下記のセクション内でより詳細に考察されるように、適切なＦｃ領域とともに、細胞表面上に結合されたネイキッド抗体は、例えば抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）における補体を動員することにより、又はＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス上の結合された抗体を認識する１つ以上のエフェクターリガンドを発現し、その後に抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）における細胞の食作用を引き起こす非特異的細胞毒性細胞を動員することにより、細胞毒性、又はいくつかの他の機構を誘発し得る。或いは、副作用又は治療合併症を最小化するようにエフェクター機能を排除又は低減することが望ましい場合、特定の他のＦｃ領域を使用してもよい。Ｆｃエフェクター機能を増強するだけでなく、低減又は排除するための方法が本明細書に記載される。さらに、本発明の抗体のＦｃ領域は、修飾により、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増強し、ひいては血清半減期を増加させ得る。或いは、Ｆｃ領域は、ＰＥＧ又はアルブミンにコンジュゲートすることで血清半減期が増加し得、又はいくつかの他のコンジュゲーションにより所望される効果がもたらされる。

【0035】

一実施形態では、本抗体は、哺乳動物におけるＢ型インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を診断、予防、治療及び／又は軽減するのに有用である。別の実施形態では、本抗体は、動物におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を診断、予防、治療及び／又は軽減するのに有用である。本明細書で用いられるとき、用語「動物」は、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、マウス、及びラットを含む哺乳類；並びに限定はされないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、及びウズラなどのトリ種を含む非哺乳類種を指す。

【0036】

本発明は、本発明の抗体及び担体を含む組成物を提供する。Ｂ型インフルエンザウイルス感染の予防又は治療を意図して、かかる治療を必要とする患者に組成物が投与され得る。一実施形態では、本組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染；Ｂ型インフルエンザウイルス感染；及びこれらの組み合わせを予防又は治療するため、患者に投与され得る。本発明はまた、本発明の抗体及び担体を含む製剤を提供する。一実施形態では、本製剤は、薬学的に許容できる担体を含む治療製剤である。

【0037】

特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＢ型インフルエンザ感染を予防又は治療するのに有用な方法であって、抗体を治療有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＡ型インフルエンザ感染；Ｂ型インフルエンザ感染；及びこれらの組み合わせを予防又は治療するのに有用な方法であって、抗体を治療有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、方法を提供する。抗体治療組成物は、医師による指示通りに、短期間（急性的に）、慢性的に、又は断続的に投与され得る。

【0038】

特定の実施形態では、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体を含む製品、例えば滅菌剤形及びキットを提供する。キットは、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおける、インビトロでのインフルエンザウイルスの検出及び定量を意図した抗体を有するように提供され得る。検出に有用なかかる抗体は、蛍光又は放射標識などの標識とともに提供してもよい。

【0039】

用語法
本発明を詳細に記載する前に、この発明が具体的な組成物又は方法ステップに限定されるものでなく、それ自体変わり得ることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。

【0040】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ（２００２）２ｎｄ ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．（１９９９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ（２０００）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、この発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

【0041】

アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される、その一般に公知の３文字記号又は１文字記号のいすれかによって指すことができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められた１文字コードによって指すことができる。

【0042】

抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体
特定の実施形態では、抗体は、単離及び／又は精製された抗体及び／又はパイロジェンフリーの抗体である。用語「精製された」は、本明細書で使用されるとき、その天然環境の構成成分から同定され、分離され、及び／又は回収されている他の分子、例えばポリペプチド、核酸分子を指す。従って、一実施形態では、本発明の抗体は、その天然環境の１つ以上の構成成分から分離されている精製抗体である。用語「単離抗体」は、本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体分子から実質的に遊離された抗体を指す（例えば、Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する単離抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡ抗体の抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体から実質的に遊離している）。従って、一実施形態では、本発明の抗体は、異なる特異性を有する抗体から分離されている単離抗体である。典型的には、単離抗体は、モノクローナル抗体である。さらに、本発明の単離抗体は、１つ以上の他の細胞物質及び／又は化学物質から実質的に遊離していてもよく、本明細書中で、単離され、精製された抗体を指す。本発明の一実施形態では、「単離」モノクローナル抗体の組み合わせは、異なる特異性を有し、且つ十分に規定された組成物中で組み合わされている抗体に関する。抗体の産生方法及び精製／単離方法は、以下により詳細に記載される。

【0043】

本発明の単離抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコードされた本明細書に開示される抗体アミノ酸配列、又は任意の単離若しくは配合された抗体を含む。

【0044】

本発明の抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に特異的な、少なくとも１つの特定のエピトープに免疫特異的に結合する。用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、抗体に結合する能力があるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖の側鎖など、分子の化学的活性表面群（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、また通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造（ｎｏｎ－ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点から区別される。

【0045】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも２つの系統学的に異なるＢ型インフルエンザ系統に存在するエピトープに結合する。さらなる特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ株中に存在するエピトープに結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザウイルス中に存在するエピトープに結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザ中に保存されるエピトープに結合する。

【0046】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ株に、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌ未満の最大半量の有効濃度（ＥＣ_５０）で結合する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザウイルス中に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で結合する。

【0047】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で；またＢ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で結合する。

【0048】

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で；Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で；またＡ型インフルエンザＨＡ上のエピトープに、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの間、又は約５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で結合する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で；Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に存在するエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で；またＡ型インフルエンザＨ９ ＨＡ上のエピトープに、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの間、又は約５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０で結合する。

【0049】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、線状エピトープ、又は連続的エピトープのいずれかであるエピトープを認識する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、非線状又は立体構造的エピトープを認識する。一実施形態では、本エピトープは、Ｂ型インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の糖タンパク質上に位置する。さらなる特定の実施形態では、本エピトープは、Ｂ型インフルエンザのＨＡ糖タンパク質の頭部領域上に位置する。一実施形態では、本エピトープは、接触残基としてＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域内の位置１２８、１４１、１５０若しくは２３５（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（６）：３０１１－２０に記載のＨ３付番システムに従って付番される）に１つ以上のアミノ酸を含む。一実施形態では、本エピトープは、接触残基としてＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域の配列のアミノ酸１２８を含む。別の実施形態では、本エピトープは、接触残基としてＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域の配列のアミノ酸１４１、１５０及び２３５を含む。

【0050】

本発明の抗体又はその抗原結合断片によって認識される１つ若しくは複数のエピトープは、多数の用途を有し得る。例えば、精製又は合成形態のエピトープは、免疫応答を高める（すなわち、ワクチンとして、又は他の用途を意図して抗体を産生するため）か、又はエピトープと免疫反応する抗体について血清をスクリーニングするために、使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープ、又はかかるエピトープを有する抗原は、免疫応答を高めるためのワクチンとして使用してもよい。別の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片を使用して、ワクチンの質を、例えばワクチン中の抗原が正しい立体構造中に正確な免疫原性エピトープを含むか否かを判定することにより、監視することができる。

【0051】

可変領域
本明細書で使用されるとき、用語「親抗体」は、本明細書で定義される、変異体又は誘導体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体を指す。親ポリペプチドは、天然抗体配列（すなわち、天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、天然に存在するもの）又は天然に存在する配列の既存のアミノ酸配列修飾（他の挿入、欠失及び／又は置換など）を有する抗体配列を含み得る。親抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、親抗体の変異体である。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換の理由で、アミノ酸配列が「親」抗体アミノ酸配列と異なる抗体を指す。

【0052】

抗体の抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を含む。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって実行され得ることは示されている。抗体の用語「抗原結合部分」の内部に包含される結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、つまりＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、つまりヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ．３４１：５４４－５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合し、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照のこと）を形成するような単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結され得る。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」の範囲内に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、また断片は、有用性について、インタクトな抗体の場合と同様な方法でスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断により、産生することができる。

【0053】

本発明の抗体は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、それは本明細書に記載のＶＨ及びＶＬドメインを含む。典型的なＶＨ及びＶＬドメインは下の表１に示される。

【0054】

【表1】

【0055】

特定の実施形態では、精製抗体は、本明細書に開示されるＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも１つに対して所与のパーセント同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む。本明細書で使用されるとき、用語「パーセント（％）配列同一性」（「相同性」も含む）は、最大のパーセント配列同一性を得るため、必要に応じて、配列を整列し、ギャップを導入した後の（ここでは配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮しない）、参照配列、例えば親抗体配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率と定義される。比較のための配列の最適な整列は、手作業に加えて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性探索方法によるか、又はこれらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）を用いるコンピュータープログラムによって、生成することができる。

【0056】

本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＨアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含んでもよい。他の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＨアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を有してもよい。

【0057】

本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＬアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含んでもよい。他の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載されるＶＬアミノ酸配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を有してもよい。

【0058】

相補性決定領域（ＣＤＲ）
可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）が抗原結合領域を含む一方で、その可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖（ＶＬ又はＶＫ）及び重鎖（ＶＨ）可変ドメインの双方で相補性決定領域（ＣＤＲ）と称されるセグメント内に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主としてβシート構成をとる、３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲを含み、ＣＤＲが形成するループがこのβシート構造を接続し、ある場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一体に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、及びＨＣＤＲ－３と名付けられ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、及びＬＣＤＲ－３と名付けられる。

【0059】

一実施形態では、抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤに従って同定され得る。この付番システムを用いて、実の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ないか又は追加的なアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体に対して、抗体の配列の相同性領域での「標準の」Ｋａｂａｔ付番配列との整列化により決定してもよい。フレームワーク残基の最大整列化は、付番システムにおいて「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。さらに、任意の所与のＫａｂａｔ部位番号での特定の個別残基の同一性は、種間又は対立遺伝子の相違により、抗体鎖から抗体鎖にかけて変化する場合がある。

【0060】

Ｋａｂａｔらの付番システムによると、ＨＣＤＲ－１は、約３１のアミノ酸（すなわち、最初のシステイン残基後の約９残基）で開始し、約５～７のアミノ酸を含み、且つ次のチロシン残基で終結する。ＨＣＤＲ－２は、ＣＤＲ－Ｈ１の末端後の１５の残基で開始し、約１６～１９のアミノ酸を含み、次のアルギニン又はリジン残基で終結する。ＨＣＤＲ－３は、ＨＣＤＲ－２の末端後の約３３のアミノ酸残基で開始し、３～２５のアミノ酸を含み、且つ配列Ｗ－Ｇ－Ｘ－Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＬＣＤＲ－１は、約２４の残基（すなわちシステイン残基の後）で開始し、約１０～１７の残基を含み、次のチロシン残基で終結する。ＬＣＤＲ－２は、ＬＣＤＲ－１の末端後の約１６の残基で開始し、約７の残基を含む。ＬＣＤＲ－３は、ＬＣＤＲ－２の末端後の約３３の残基で開始し、約７～１１の残基を含み、且つ配列Ｆ－Ｇ－Ｘ－Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＣＤＲが抗体から抗体にかけて大幅に変化する（また定義によると、Ｋａｂａｔコンセンサス配列との相同性を呈することがない）ことに留意のこと。Ｋａｂａｔ系を用いて付番された本発明の抗体のＣＤＲ重鎖及び軽鎖配列は、下の表２及び３に示される。

【0061】

【表2】

【0062】

【表3】

【0063】

Ｋａｂａｔ付番スキームは広範に用いられるが、それは幾つかの欠点を有する。第１に、付番スキームは構造情報の不在下で配列データから開発されたことから、ＬＣＤＲ－１及びＨＣＤＲ－１において挿入が設けられる位置は、構造的な挿入位置に常に一致するとは限らない。したがって、これらのループ内の形態学的に等しい残基は、同じ番号が付されない場合がある。第２に、その付番システムは厳密であり、限られた数の挿入しか許容されない。挿入に対して割り当てられた付番システムより多い残基が存在する場合、それらを付番する標準的な方法がない。

【0064】

別の実施形態では、抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸は、免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７）を用いて同定され得る。ＩＭＧＴデータベースは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子についての配列情報を用いて開発されたものであり、抗体λ及びκ軽鎖、重鎖及びＴ細胞受容体鎖を通じて付番を統一し、すべてであるが異常に長い挿入に対する挿入コードの使用を回避する。ＩＭＧＴではまた、Ｋａｂａｔらからのフレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の定義、Ｃｈｏｔｈｉａらからの超可変ループの特徴づけ、並びにＸ線回折試験から得られた構造データが考慮され、組み合わされる。ＩＭＧＴ系を用いて付番された、本発明の抗体におけるＣＤＲ重鎖及び軽鎖配列は、下の表４及び５に示される。図５は、Ｋａｂａｔ及びＩＭＧＴにより同定されるものとして、ＣＤＲ配列を示すＦＢＤ－５６、ＦＢＤ－９４及びＦＢＣ－３９配列の整列化を提供する。

【0065】

【表4】

【0066】

【表5】

【0067】

本発明は、配列番号２；配列番号１２；配列番号２２；配列番号３２；配列番号４２；配列番号５２；配列番号６２；配列番号７４；配列番号９０；若しくは配列番号１０６のＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であり、且つ／又は配列番号７；配列番号１７；配列番号２７；配列番号３７；配列番号４７；配列番号５７；配列番号６７；配列番号８２；配列番号９８；若しくは配列番号１１４のＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一である配列内のアミノ酸を含む抗Ｂ型インフルエンザ抗体を中和することを包含する。別の実施形態では、本発明は、配列番号２；配列番号１２；配列番号２２；配列番号３２；配列番号４２；配列番号５２；配列番号６２；配列番号７４；配列番号９０；若しくは配列番号１０６のＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であり、且つ／又は配列番号７；配列番号１７；配列番号２７；配列番号３７；配列番号４７；配列番号５７；配列番号６７；配列番号８２；配列番号９８；若しくは配列番号１１４のＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である配列内のアミノ酸を含む抗Ｂ型インフルエンザ抗体を中和することを包含する。

【0068】

別の実施形態では、本発明は、表２～５に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、ＨＣＤＲ－３、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３を含む抗体及びその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、表２～５に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一である配列内のアミノ酸を含む６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、ＨＣＤＲ－３、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３を含む抗体及びその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、表２～５に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である配列内のアミノ酸を含む６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、ＨＣＤＲ－３、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３を含む抗体及びその抗原結合断片を提供する。

【0069】

フレームワーク領域
重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、可変ドメインのより高度に保存された部分である４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を含む。重鎖の４つのＦＲは、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４と名付けられ、また軽鎖の４つのＦＲは、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４と名付けられる。

【0070】

一実施形態では、Ｋａｂａｔ付番システムは、フレームワーク領域を同定するため、用いることができる。Ｋａｂａｔらによると、ＦＲ－Ｈ１は、位置１で開始して約３０のアミノ酸で終結し、ＦＲ－Ｈ２は約３６～４９のアミノ酸であり、ＦＲ－Ｈ３は約６６～９４のアミノ酸であり、またＦＲ－Ｈ４は約１０３～１１３のアミノ酸である。ＦＲ－Ｌ１はアミノ酸１で開始して約２３のアミノ酸で終結し、ＦＲ－Ｌ２は約３５～４９のアミノ酸であり、ＦＲ－Ｌ３は約５７～８８のアミノ酸であり、またＦＲ－Ｌ４は約９８～１０７のアミノ酸である。特定の実施形態では、フレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う置換、例えばＦＲ－Ｌ１内の１０６Ａに挿入を有してもよい。天然の置換に加えて、ＦＲ残基の１つ以上の改変（例えば置換）もまた、それが中和能力を保持するという条件で、本発明の抗体に導入してもよい。特定の実施形態では、これらは、抗体のＢ型インフルエンザウイルスＨＡに対する結合親和性における改善又は最適化をもたらす。修飾対象のフレームワーク領域残基の例として、抗原に直接的に非共有結合するもの（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３３：７４７－７５３）；ＣＤＲの立体構造に対して相互作用／作用するもの（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）；及び／又はＶＬ－ＶＨ界面に関与するもの（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）が挙げられる。他の実施形態では、フレームワーク領域は、ＩＭＧＴの付番システムを用いて同定され得る。

【0071】

別の実施形態では、ＦＲは、「ジャームライニング（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」を意図して１つ以上のアミノ酸変化を含んでもよい。例えば、選択された抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、生殖系列の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列と比較することができ、選択されたＶＬ及び／又はＶＨ鎖の特定のフレームワーク残基が、（例えば免疫グロブリンの体細胞突然変異の結果として）生殖系列の立体配置と異なる場合、生殖系列の立体配置に対して、選択された抗体の改変されたフレームワーク残基を「逆突然変異する」（すなわち、選択された抗体のフレームワークアミノ酸配列を、生殖系列のフレームワークアミノ酸配列と同じであるように改変する）ことが、例えば、免疫原性の機会を低減するために望ましい場合がある。フレームワーク残基のかかる「逆突然変異」（又は「ジャームライニング」）は、特異的突然変異の導入（例えば、部位特異的変異誘発；ＰＣＲ媒介性の突然変異誘発など）のための標準的な分子生物学的方法によって達成することができる。

【0072】

図６は、一般名としての抗Ｂ型インフルエンザ抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７１）を示し、ＦＢＣ－３９における非生殖系列残基（配列番号２２）はＸａａ_１－１１と名付けられた。一実施形態では、非生殖系列（Ｘａａ_１－１１）残基の１つ以上は、生殖系列に「逆突然変異」される。一実施形態では、配列番号７１のＸａａ_１はＶａｌ又はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ_２はＬｅｕ又はＰｈｅであり；配列番号７１のＸａａ_３はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_４はＬｅｕ又はＳｅｒであり；配列番号７１のＸａａ_５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_６はＭｅｔ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_７はＰｈｅ又はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ_８はＨｉｓ又はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ_９はＳｅｒ又はＡｓｎであり；配列番号７１のＸａａ_１０はＡｒｇ又はＬｙｓであり；また配列番号７１のＸａａ_１１はＡｌａ又はＴｈｒである。別の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_１はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ_５はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_６はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ_７はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ_８はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ_１０はＬｙｓであり；配列番号７１のＸａａ_１１はＴｈｒであり、又はその組み合わせである。さらなる特定の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_９はＳｅｒである。さらに別の実施形態では、配列番号７１のＸａａ_４はＬｅｕである。

【0073】

図７は、一般名としての抗Ｂ型インフルエンザ抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）を示し、ＦＢＣ－３９内の非生殖系列残基（配列番号２７）はＸａａ_１によって表される。一実施形態では、非生殖系列残基（Ｘａａ_１）は、生殖系列に「逆突然変異」される。一実施形態では、配列番号７２のＸａａ_１はＰｈｅ又はＴｙｒである。さらなる特定の実施形態では、配列番号７２のＸａａ_１はＴｙｒである。

【0074】

本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列
上記のアミノ酸配列に加えて、本発明はまた、アミノ酸配列に対応し且つ本発明のヒト抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。これらは、限定はされないが、上で参照したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。従って、本発明はまた、本明細書に記載される抗体のＣＤＲ及びＦＲを含むＶＨ及びＶＬフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列、並びに細胞（例えば、哺乳類細胞）でのその効率的発現のための発現ベクターを提供する。ポリヌクレオチドを使用して抗体を作製する方法は、以下により詳細に説明される。

【0075】

本発明はまた、例えば本明細書中で定義するとおりの、ストリンジェントな又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の下で、本明細書に記載される本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。用語「ストリンジェンシー」は、本明細書で使用されるとき、プローブとフィルタに結合した核酸との間の相同性の程度を表す、ハイブリダイゼーション実験の実験条件（例えば、温度及び塩濃度）を指し、ストリンジェンシーが高まると、プローブとフィルタに結合した核酸との間のパーセント相同性が高まる。

【0076】

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定はされないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのフィルタに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中約５０～６５℃での１回以上の洗浄、高度にストリンジェントな条件、例えば６×ＳＳＣ中約４５℃でのフィルタに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、続く０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中約６５℃での１回以上の洗浄、又は当業者に公知の任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹの６．３．１～６．３．６頁及び２．１０．３頁を参照のこと）が挙げられる。

【0077】

実質的に同一な配列は、多形配列、すなわち、集団内の代替配列又は対立遺伝子であってもよい。対立遺伝子の差異は、１つの塩基対と同程度に小さくてもよい。実質的に同一な配列はまた、サイレント突然変異を有する配列を含む、変異誘発された配列を含んでもよい。突然変異は、１つ以上の残基の変化、１つ以上の残基の欠失、又は１つ以上のさらなる残基の挿入を含んでもよい。

【0078】

当該技術分野で公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得て、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築してもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１７：２４２に記載のとおり）、それはつまり、抗体をコードする配列の一部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、同オリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、及びそれに続くＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。

【0079】

抗体をコードするポリヌクレオチドはまた、好適な供給源由来の核酸から作成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するか、或いは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は、抗体を発現する任意の組織若しくは細胞、例えば抗体を発現するために選択されるハイブリドーマ細胞から作成されるｃＤＮＡライブラリ、又はそれから単離される核酸、一実施形態ではポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、又は特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングし、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを同定することにより、入手してもよい。次に、ＰＣＲによって生成される増幅核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

【0080】

抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技法を参照のこと）を用いて操作し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成し、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせることができる。

【0081】

結合特性
上記の通り、本発明の抗体又は抗原結合断片は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質、ペプチド、サブユニット、断片、部分又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に、他のポリペプチドに対して排他的又は優先的に、免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のエピトープ又は抗原決定基は球状頭部である。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、本明細書で用いられるとき、抗体に結合することが可能なタンパク質決定基を指す。一実施形態では、用語「結合」は、本明細書中で特異的結合に関する。これらのタンパク質決定基又はエピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面グルーピングを含み、通常は特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体構造的及び非立体構造的エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。用語「不連続エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの分離領域から形成されるタンパク質抗原上の立体構造的エピトープを指す。

【0082】

抗原と抗体の間の相互作用は、他の非共有結合的なタンパク質－タンパク質相互作用の場合と同じである。一般に、４種の結合相互作用、すなわち、（ｉ）水素結合、（ｉｉ）分散力、（ｉｉｉ）ルイス酸とルイス塩基の間の静電力、及び（ｉｖ）疎水性相互作用が、抗原と抗体の間に存在する。疎水性相互作用は、抗体－抗原相互作用における主な駆動力であり、また分子間引力ではなく非極性基による水の反発に基づくものである（Ｔａｎｆｏｒｄ（１９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００：１０１２－８）。しかし、特定の物理的力はまた、抗原－抗体結合、例えば異なる抗体結合部位を有するエピトープ形状のフィット又は優遇（ｆｉｔ ｏｒ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）に寄与する。さらに、他の材料及び抗原は、抗体と交差反応し、それによって利用可能な遊離抗体と競合し得る。

【0083】

抗原と抗体との間の結合の親和性定数及び特異性の測定は、本発明の抗体を用いる予防、治療、診断及び研究方法の有効性を判定するのを補助し得る。「結合親和性」は、一般にある分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間での非共有相互作用全体の力を指す。特に指示されない限り、本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出される平衡解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１を参照のこと。低親和性抗体は一般に、抗原に徐々に結合し且つ容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般に、抗原により迅速に結合し且つ結合状態をより長く維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当該技術分野で公知であり、それらのいずれかは本発明の目的のために用いることができる。

【0084】

結合親和性を決定するための一方法は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１によって記載の目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって解離定数「Ｋｄ」を測定することを含む。あるいは、Ｋｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いることにより測定してもよい。オンレートが表面プラズモン共鳴アッセイにより１０^６Ｍ^－１Ｓ－１を超える場合、オンレートは、漸増濃度の抗原の存在下での蛍光発光強度の増加及び低下を測定する蛍光クエンチング技術を用いることにより決定され得る。「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋ_ｏｎ」はまた、上記と同じ表面プラズモン共鳴技術を用いて決定され得る。

【0085】

本発明の抗体、又はその改変／変異誘導体（ｍｕｔａｎｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）の結合特性の判定に適した方法及び試薬は、当該技術分野で公知であり、及び／又は市販されている（米国特許第６，８４９，４２５号明細書；同第６，６３２，９２６号明細書；同第６，２９４，３９１号明細書；同第６，１４３，５７４号明細書）。さらに、かかる動力学分析のために設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａ１００、及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器；Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。

【0086】

一実施形態では、本発明の抗体（その抗原結合断片又は変異体を含む）はまた、それらのＡ型インフルエンザウイルスポリペプチド；Ｂ型インフルエンザウイルスポリペプチド；又はそれらの組み合わせに対する結合親和性の観点で説明又は特定してもよい。典型的には、高親和性を有する抗体は、１０^－７Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、５×１０^－７Ｍ、１０^－７Ｍ、５×１０^－８Ｍ、１０^－８Ｍ、５×１０^－９Ｍ、１０^－９Ｍ、５×１０^－１０Ｍ、１０^－１０Ｍ、５×１０^－１１Ｍ、１０^－１１Ｍ、５×１０^－１２Ｍ、１０^－１２Ｍ、５×１０^－１３Ｍ、１０^－１３Ｍ、５×１０^－１４Ｍ、１０^－１４Ｍ、５×１０^－１５Ｍ若しくは１０^－１５Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。より特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド、その断片又は変異体；又はその組み合わせに、５×１０^－１０Ｍ、１０^－１０Ｍ、５×１０^－１１Ｍ、１０^－１１Ｍ、５×１０^－１２Ｍ若しくは１０^－１２Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；又はそれらの組み合わせに、個別の列挙される値のいずれかの間の範囲内にある解離定数すなわちＫｄで結合する抗体を包含する。

【0087】

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、５×１０^－２秒^－１、１０^－２秒^－１、５×１０^－３秒^－１若しくは１０^－３秒^－１、５×１０^－４秒^－１、１０^－４秒^－１、５×１０^－５秒^－１、若しくは１０^－５秒^－１、５×１０^－６秒^－１、１０^－６秒^－１、５×１０^－７秒^－１若しくは１０^－７秒^－１以下のオフレート（ｋ_ｏｆｆ）で結合する。より特定の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０^－４秒^－１、１０^－４秒^－１、５×１０^－５秒^－１、若しくは１０^－５秒^－１、５×１０^－６秒^－１、１０^－６秒^－１、５×１０^－７秒^－１若しくは１０^－７秒^－１以下のオフレート（ｋ_ｏｆｆ）で結合する。本発明はまた、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；又はそれらの組み合わせに、個々の列挙される値のいずれかの間の範囲内にあるオフレート（ｋ_ｏｆｆ）で結合する抗体を包含する。

【0088】

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、１０^３Ｍ^－１秒^－１、５×１０^３Ｍ^－１秒^－１、１０^４Ｍ^－１秒^－１、５×１０^４Ｍ^－１秒^－１、１０^５Ｍ^－１秒^－１、５×１０^５Ｍ^－１秒^－１、１０^６Ｍ^－１秒^－１、５×１０^６Ｍ^－１秒^－１、１０^７Ｍ^－１秒^－１、若しくは５×１０^７Ｍ^－１秒^－１以上のオンレート（ｋ_ｏｎ）で結合する。より特定の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、１０^５Ｍ^－１秒^－１、５×１０^５Ｍ^－１秒^－１、１０^６Ｍ^－１秒^－１、５×１０^６Ｍ^－１秒^－１、１０^７Ｍ^－１秒^－１若しくは５×１０^７Ｍ^－１秒^－１以上のオンレート（ｋ_ｏｎ）で結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザポリペプチド；Ｂ型インフルエンザポリペプチド；又はそれらの組み合わせに、個別の列挙される値のいずれかの間の範囲内にあるオンレート（ｋ_ｏｎ）で結合する抗体を包含する。

【0089】

一実施形態では、結合アッセイは、直接結合アッセイ又は競合結合アッセイのいずれかとして実施してもよい。結合は、標準ＥＬＩＳＡ又は標準フローサイトメトリーアッセイを用いて検出され得る。直接結合アッセイでは、候補抗体が、その同族抗原への結合について試験される。他方、競合結合アッセイでは、候補抗体が特定の抗原、例えばＢ型インフルエンザウイルスＨＡに結合する既知の抗体又は他の化合物と競合する能力が評価される。一般に、抗体の検出可能なＢ型インフルエンザウイルスＨＡとの結合を可能にする任意の方法は、抗体の結合特性を検出し、測定するための本発明の範囲で包含される。当業者はこれらの周知の方法を理解するであろうし、この理由については、ここで詳細に提示されることはない。これらの方法はまた、抗体のパネルを所望される特性を提供するものについてスクリーニングするため、利用される。

【0090】

一実施形態では、本発明の抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合し、且つＢ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに免疫特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに免疫特異的に結合する。

【0091】

別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡ及びＡ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合し、且つＢ型インフルエンザウイルス及びＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス及び少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプに免疫特異的に結合する。

【0092】

Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンサブタイプは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７を含むグループ１、並びにサブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５を含むグループ２として同定された、２つの主要な系統発生グルーピングに分類される。一実施形態では、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びＨ１７とそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプに対して結合し、且つ／又は中和する能力がある。別の実施形態では、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、Ｈ４、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５とそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスグループ２のサブタイプに対して結合し、且つ／又は中和する能力がある。一実施形態では、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプＨ９に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプＨ９に対して結合し、且つ中和する。

【0093】

一実施形態では、本発明の抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合し、且つＢ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合し、且つＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。中和アッセイは、本明細書の実施例セクションに記載の通りに又は当該技術分野で公知の他の方法を用いて実施され得る。用語「阻害濃度５０％」（「ＩＣ_５０」と略記）は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスの５０％中和にとって必要とされる阻害剤（例えば本発明の抗体）の濃度を表す。より低いＩＣ_５０値がより強力な阻害剤に対応することは、当業者によって理解されるであろう。

【0094】

一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける、約０．００１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は約０．００１μｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲内の抗体、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ_５０を有する。

【0095】

一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける、約０．００１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲内、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ_５０；及び、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和のための、約０．１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．１μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌの範囲内、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、若しくは０．５μｇ／ｍｌ未満の、Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ_５０を有する。

【0096】

一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける、約０．００１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲内、又は１０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ_５０；及び、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和のための、約０．０１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．０５μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．１μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌの範囲内、又は５０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、又は２μｇ／ｍｌ未満の、Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ_５０を有する。

【0097】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、細胞死を誘導しうる。「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を生育不能に至らしめるものである。細胞死は、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下でインビトロで測定し、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を区別することができる。従って、細胞死用のアッセイは、熱不活化血清を用いて（すなわち補体の不在下で）且つ免疫エフェクター細胞の不在下で実施してもよい。抗体が細胞死を誘導することができるか否かを判定するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１－１１を参照のこと）、７ＡＡＤの取り込み又は当該技術分野で周知の方法によって評価される膜完全性の欠損は、未処理細胞と比べて評価することができる。

【0098】

具体的な実施形態では、本発明の抗体は、アポトーシスを介して細胞死を誘導し得る。「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は（アポトーシス体と呼ばれる）膜小胞の形成によって判定されるプログラム細胞死を誘導するものである。アポトーシスに関連した細胞事象を評価するための様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座は、アネキシンの結合によって測定可能であり、ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダリングを通じて評価可能であり、またＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞での任意の増加によって評価可能である。一実施形態では、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比べて約２～５０倍、一実施形態では約５～５０倍、また一実施形態では約１０～５０倍のアネキシン結合の誘導をもたらすものである。

【0099】

別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を介して細胞死を誘導し得る。ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現は、一般に、抗体のＦｃ領域の、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞又は活性化マクロファージなどのエフェクター細胞の表面上に存在する抗体に対する受容体（以降「ＦｃγＲ」と称される）への結合を含む。様々な補体成分が結合され得る。その結合に関しては、抗体のヒンジ領域内の数個のアミノ酸残基及びＣ領域の２番目のドメイン（以降「Ｃγ２ドメイン」と称される）が重要であり（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（５）：１０９８－１０４；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８６（２）：３１９－３２４；Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６５：８８－１１０）、Ｃγ２ドメイン内の糖鎖（Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６５：８８－１１０）もまた重要であることが示唆されている。

【0100】

目的の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するため、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号明細書に記載のものを用いることができる。同アッセイはまた、市販のキット、例えばＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施してもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞として、限定はされないが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫ細胞株が挙げられる。トランスジェニックＦｃ受容体（例えばＣＤ１６）及び関連のシグナル伝達ポリペプチド（例えばＦＣεＲＩ－γ）を発現するＮＫ細胞株は、エフェクター細胞としても役立ち得る（国際公開第２００６／０２３１４８号パンフレット）。一実施形態では、ＮＫ細胞株は、ＣＤ１６を含み、且つＮＦＡＴプロモーター下でルシフェラーゼを有し、細胞溶解又は細胞死ではなくＮＫ細胞活性化を測定するために用いることができる。ＮＫ細胞の代わりにＪｕｒｋａｔ細胞を用いる類似の技術が、Ｐｒｏｍｅｇａにより販売されている（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ＃Ｇ７０１０）。例えば、任意の特定の抗体が補体活性化及び／又はＡＤＣＣにより溶解を媒介する能力はアッセイ可能である。目的の細胞はインビトロで成長し、標識され、抗体は、抗原抗体複合体により活性化され得る免疫細胞、すなわちＡＤＣＣ応答に関与するエフェクター細胞と組み合わせて細胞培養物に添加される。抗体はまた、補体活性化について試験され得る。いずれの場合でも、細胞溶解は溶解細胞からの標識の放出により検出される。細胞溶解の程度はまた、細胞質タンパク質（例えばＬＤＨ）の上清への放出を検出することにより判定してもよい。事実、抗体は、患者自身の血清を補体及び／又は免疫細胞の供給源として用いてスクリーニング可能である。次に、インビトロ試験においてヒトＡＤＣＣを媒介することが可能な抗体は、その特定の患者において治療的に用いることができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性はまた、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２－６５６に開示されたものなどの動物モデルで、インビボで評価され得る。さらに、抗体のＡＤＣＣ、及び任意選択的にはＣＤＣ活性のレベルを調節する（すなわち増加又は低下させる）ための技術は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；米国特許第６，１９４，５５１号明細書；米国特許第７，３１７，０９１号明細書）。本発明の抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを誘導する能力があり得るか、又はその能力を有するように修飾されていてもよい。ＡＤＣＣ機能を判定するためのアッセイは、ヒトＡＤＣＣ機能を評価するため、ヒトエフェクター細胞を用いて実行され得る。かかるアッセイはまた、壊死及び／又はアポトーシス機構により細胞死を誘導、媒介、増強、遮断する抗体についてスクリーニングするように意図されたものを含み得る。生存可能な色素を利用するアッセイ、カスパーゼを検出し、分析する方法、及びＤＮＡ切断を測定するアッセイを含むかかる方法は、目的の抗体とともにインビトロで培養された細胞のアポトーシス活性を評価するため、用いることができる。

【0101】

抗体の産生
以下は、本発明において有用な抗体の産生のための例示的技術を説明する。

【0102】

モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．）、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせを含めた、当該技術分野において公知の幅広い技術を用いて調製することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体又は単離抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個別の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤と対照的に、各モノクローナル抗体が抗原上の同じ決定基を標的とする。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の抗体による汚染なしに合成され得る点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。以下はモノクローナル抗体の代表的な産生方法の説明であり（この説明は限定することを意図するものではない）、例えばモノクローナル哺乳類抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン、ダイアボディ、ワクチボディ、線状抗体及び多重特異性抗体の産生に用いることができる。

【0103】

ハイブリドーマ技法
ハイブリドーマ技術を用いた特異的抗体の産生及びスクリーニング方法は、当該技術分野においてルーチンであり、周知されている。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫して、免疫化に用いた抗原に特異的に結合し得る抗体を産生する又はその産生能を有するリンパ球を誘導する。或いは、インビトロでリンパ球を免疫してもよい。免疫後、リンパ球を単離し、次に好適な融剤又は融合パートナー、例えばポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞株と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））。特定の実施形態では、選択される骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高度な抗体産生を支持し、且つ融合しなかった親細胞を選択外にする選択培地に対して感受性を有するものである。一態様において、骨髄腫細胞株はマウス骨髄腫株、例えば、ソーク研究所細胞頒布センター（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来するもの、並びにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２及び誘導体、例えばＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，））。

【0104】

所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、クローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準方法により成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、前掲）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば細胞をマウスに腹腔内注射することにより、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。

【0105】

サブクローンにより選択されたモノクローナル抗体は、好適には、従来の抗体精製手順、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧセファロース）又はイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティータグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等によって培養培地、腹水、又は血清と分離される。例示的な精製方法を以下にさらに詳細に記載する。

【0106】

組換えＤＮＡ技法
組換えＤＮＡ技術を用いた特異的抗体の産生及びスクリーニング方法は、当該技術分野においてルーチンであり、周知されている（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び／又は配列決定することができる。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次にその発現ベクターが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの、本来抗体タンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関するレビュー論文としては、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６－２６２及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８が挙げられる。ファージディスプレイにより作成される抗体及び抗体のヒト化について以下に記載するとおり、組換え抗体用のＤＮＡ又は遺伝物質をハイブリドーマ以外の１つ又は複数の供給源から入手して、本発明の抗体を作成することができる。

【0107】

抗体又はその変異体の組換え発現には、概して、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。従って本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体若しくはその一部分の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖若しくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号明細書；同第５，５９１，６３９号明細書；同第５，６５８，７５９号明細書及び同第５，１２２，４６４号明細書を参照のこと）、抗体の可変ドメインが、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖全体の双方の発現用のかかるベクターにクローニングされてもよい。

【0108】

従来技術によって発現ベクターが宿主細胞に移入されると、次にトランスフェクト細胞が従来技術によって培養され、抗体が産生される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体又はその断片、又はその重鎖又は軽鎖、又はその一部分、又は本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体を発現させる特定の実施形態では、以下に詳述するとおり、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターを、免疫グロブリン分子全体の発現用の宿主細胞で同時に発現させてもよい。

【0109】

組換え抗体の発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において周知されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、及び数多くの他の細胞株が挙げられる。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾について特徴的で特異的な機構を有する。発現させた抗体又はその一部分の正しい修飾及びプロセシングが確実となるように、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。このため、適切な一次転写物のプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。かかる哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ヒーラー、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる機能性免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。ヒトリンパ球を不死化することにより開発されたヒト細胞株を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，オランダ）を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。

【0110】

組換え抗体の発現用宿主として用いられ得るさらなる細胞株としては、限定はされないが、昆虫細胞（例えばＳｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）Ｂｔｉ－Ｔｎ５ｂ１－４）又は酵母細胞（例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書；他）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）；及びニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）が挙げられる。

【0111】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の安定発現を呈する細胞株で発現させる。安定発現は、組換えタンパク質の長期高収率産生に用いることができる。例えば、抗体分子を安定発現する細胞株を作成してもよい。宿主細胞を、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と、選択可能なマーカー遺伝子とを含む適切に操作されたベクターで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、細胞を１～２日間強化培地で成長させてもよく、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーが選択に対する耐性を付与し、プラスミドをその染色体に安定的に組み込んだ細胞の成長及びフォーカスの形成を可能にすることで、次にはそのフォーカスをクローニングし、細胞株へと拡大することができる。安定細胞株を高収率で作製する方法は当該技術分野において周知されており、概して試薬が市販されている。

【0112】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の一過性発現を呈する細胞株で発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入された核酸が当該細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込まれないプロセスである。それは実際、染色体外要素、例えばエピソームとして細胞に維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされるタンパク質が産生される。

【0113】

細胞株は、安定的にトランスフェクトされるものも、或いは一過性にトランスフェクトされるものも、モノクローナル抗体の発現及び産生をもたらす当該技術分野において公知の細胞培養培地及び条件に維持される。特定の実施形態では、哺乳類細胞培養培地は、例えばＤＭＥＭ又はＨａｍ Ｆ１２を含む市販の培地製剤をベースとする。他の実施形態では、細胞培養培地は、細胞成長及び生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように修飾される。本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養培地」、「培養培地」、及び「培地製剤」は、多細胞生物又は組織の外部の人工インビトロ環境で細胞を維持し、成長させ、増殖させ、又は拡大するための栄養溶液を指す。細胞培養培地は、例えば、細胞の成長を促進するように配合された細胞培養成長培地、又は組換えタンパク質産生を促進するように配合された細胞培養産生培地を含め、特定の細胞培養用途に最適化され得る。用語の栄養素、成分、及び構成成分は、本明細書では、細胞培養培地を構成する構成物を指して同義的に使用される。

【0114】

一実施形態では、細胞株は流加法を用いて維持される。本明細書で使用されるとき、「流加法」は、初めに基礎培地でインキュベートされた後、細胞培養物にさらなる栄養素が供給される方法を指す。例えば、流加法は、所与の時間内に所定の補給スケジュールに従い補足培地を添加することを含み得る。従って、「流加細胞培養物」は、細胞、典型的には哺乳類細胞、及び培養培地が培養槽に最初に供給され、且つ培養終了前の定期的な細胞及び／又は産物の回収を伴い、又は伴わずさらなる培養栄養素が培養中に培養物に対して連続的に、又は不連続に徐々に補給される細胞培養物を指す。

【0115】

使用される細胞培養培地及びそこに含まれる栄養素は、当業者に周知されている。一実施形態では、細胞培養培地は、基礎培地と、少なくとも１つの加水分解物、例えば、大豆ベースの加水分解物、酵母ベースの加水分解物、又はこれらの２種類の加水分解物の組み合わせとを含むことで、変法基礎培地をもたらす。別の実施形態では、さらなる栄養素は、濃縮基礎培地など、基礎培地のみを含んでもよく、又は加水分解物、若しくは濃縮加水分解物のみを含んでもよい。好適な基礎培地としては、限定はされないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、α－最小必須培地（α－ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）又はＣＨＯ細胞用タンパク質不含ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ無血清培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられる。本発明において用いられ得る基礎培地の他の例としては、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅａｇｌｅ，Ｈ（１９６５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９，３６もまた参照のこと）；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８：３９６；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１２：１８５．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ６：２，９３もまた参照のこと）；ＣＭＲＬ １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９５７）Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：３０３もまた参照のこと）が挙げられる。

【0116】

基礎培地は無血清、つまり培地は血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、又は当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないか、又は動物性タンパク質不含培地又は化学限定培地であってもよい。

【0117】

基礎培地は、様々な無機及び有機緩衝剤、１つ又は複数の界面活性剤、及び塩化ナトリウムなどの、標準的な基礎培地に見られる特定の非栄養成分を除去するため、修飾され得る。基礎細胞培地からかかる構成成分を除去することにより、残りの栄養成分の濃度を高めることができ、細胞成長及びタンパク質発現が全体的に向上し得る。加えて、取り除いた構成成分を、細胞培養条件の要件に応じて、変法基礎細胞培地を含有する細胞培養培地に加え戻してもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地は、変法基礎細胞培地と、以下の栄養素、すなわち、鉄源、組換え成長因子；緩衝剤；界面活性剤；容量オスモル濃度調節因子；エネルギー源；及び非動物性加水分解物の少なくとも１つとを含有する。加えて、変法基礎細胞培地は、場合により、アミノ酸、ビタミン、又はアミノ酸とビタミンとの両方の組み合わせを含有し得る。別の実施形態では、変法基礎培地は、グルタミン、例えば、Ｌ－グルタミン、及び／又はメトトレキサートをさらに含有する。

【0118】

抗体産生は、当該技術分野において公知の流加、バッチ、潅流又は連続供給バイオリアクター法を用いるバイオリアクタープロセスによって大量に行われ得る。大規模バイオリアクターは少なくとも１０００リットルの容量、一実施形態では約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。このようなバイオリアクターは撹拌機インペラを使用して酸素及び栄養素を分配し得る。小規模バイオリアクターは、概して容積が約１００リットル以下の細胞培養を指し、約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る。或いは、単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）が、大規模培養又は小規模培養のいずれにも用いられ得る。

【0119】

温度、ｐＨ、撹拌、曝気及び接種密度は、使用する宿主細胞及び発現させる組換えタンパク質に応じて異なり得る。例えば、組換えタンパク質細胞培養物は、摂氏３０℃～４５℃の温度に維持され得る。培養培地のｐＨは、培養プロセスの間、ｐＨが至適レベルに保たれるように監視されてもよく、至適レベルは、ある種の宿主細胞に対して６．０～８．０のｐＨ範囲内であり得る。かかる培養方法での撹拌には、インペラ駆動による混合が用いられ得る。インペラの回転速度は約５０～２００ｃｍ／秒の先端速度であってよく、しかしながら培養される宿主細胞の種類に応じて、当該技術分野で公知の他のエアリフト又は他の混合／曝気システムが用いられてもよい。十分な曝気を提供することにより、ここでもやはり培養される特定の宿主細胞に応じて、培養物中約２０％～８０％空気飽和の溶存酸素濃度が維持される。或いは、バイオリアクターにより空気又は酸素を培養培地中に直接拡散させてもよい。中空糸膜曝気装置を用いる無気泡曝気システムを含め、他の酸素供給方法が存在する。

【0120】

ファージディスプレイ技法
モノクローナル抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ．３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４－６２８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７に記載される技法を用いて作成される抗体ファージライブラリから単離することができる。かかる方法では、抗体は、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ ｃＤＮＡを使用して調製される組換えコンビナトリアル抗体ライブラリ、一実施形態ではｓｃＦｖファージディスプレイライブラリをスクリーニングによって単離することができる。かかるライブラリの調製及びスクリーニング方法は、当該技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリ作成用の市販のキットに加えて（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７－９４００－０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）、抗体ディスプレイライブラリの作成及びスクリーニングに特に適している方法及び試薬の例を、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書；米国特許第６，５４５，１４２号明細書；同第６，２９１，１５８号明細書；同第６，２９１，１５９号明細書；同第６，２９１，１６０号明細書；同第６，２９１，１６１号明細書；同第６，６８０，１９２号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第６，１７２，１９７号明細書；同第６，８０６，０７９号明細書；同第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第７，１９５，８６６号明細書に見出すことができる。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の産生及び単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に代わる実行可能な手法である。

【0121】

ファージディスプレイ方法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示される。詳細な実施形態において、かかるファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒト又はマウスのもの）から発現する抗原結合ドメインを提示することができる。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージを抗原により、例えば標識された抗原又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉されている抗原を使用して、選択又は同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現するｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。

【0122】

上記の参考文献に記載されるとおり、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを用いてヒト抗体、ヒト化抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を作成し、例えば以下に詳細に記載されるとおり、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片の組換え産生技法もまた、国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１２（６）：８６４－８６９；及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０：１０４１－１０４３に開示されるものなどの、当該技術分野において公知の方法を用いて採用することができる。

【0123】

単鎖Ｆｖ及び抗体の産生に用いることのできる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２５８，４９８号明細書に記載されるものが挙げられる。従って、上記に記載される技法及び当該技術分野において公知の技法を用いて、組換え抗体を作成することができ、ここで結合ドメイン、例えばＳｃＦｖは、ファージディスプレイライブラリから単離された。

【0124】

抗体の精製及び単離
組換え発現又はハイブリドーマ発現による産生後、抗体分子は、当該技術分野において公知の免疫グロブリン分子を精製する任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原プロテインＡ又はプロテインＧに対する親和性によるもの、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度の差によるか、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法により精製され得る。さらに、本発明の抗体又はその断片は、精製を促進することが知られる異種ポリペプチド配列（本明細書において「タグ」と称される）に融合されてもよい。

【0125】

組換え技術を用いるとき、抗体は細胞内に産生されるか、細胞膜周辺腔に産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程として、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかである粒子状デブリが、例えば遠心又は限外ろ過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：１６３－１６７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体の単離手順を記載している。抗体が培地中に分泌される場合、概して、初めにかかる発現系からの上清が、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮される。前述の工程のいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性汚染物の成長を防止してもよい。

【0126】

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを、単独で、或いは他の精製工程との組み合わせで用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存し、当業者は理解するであろう。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。コントロールド・ポア・グラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るより高い流量及びより短い処理時間を実現する。抗体がＣＨ_３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が有用である。他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収する抗体に応じて利用可能である。

【0127】

任意の予備的精製工程の後、目的の抗体及び汚染物を含む混合物を、ｐＨ約２．５～４．５の溶出緩衝液を使用する、且つ低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。

【0128】

したがって、特定の実施形態では、実質的に精製／単離された本発明の抗体が提供される。一実施形態では、これらの単離／精製された組換え的に発現された抗体は、予防又は治療効果を媒介するため、患者に投与してもよい。予防は、薬物療法であるか、又は疾患、障害若しくは感染を発症から予防するように設計され、用いられる治療である。治療は、特定の疾患、障害又は感染の治療に特異的に関連する。治療量は、特定の疾患、障害又は感染を治療するのに要求される量である。別の実施形態では、これらの単離／精製された抗体は、インフルエンザウイルス感染、例えばＢ型インフルエンザウイルス感染、又は他の実施形態ではＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルス感染を診断するのに用いてもよい。

【0129】

ヒト抗体
ヒト抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いて作成することができる。ヒト抗体は、マウス又はラット可変及び／又は定常領域を有する抗体に付随する問題の一部を回避する。かかるマウス又はラット由来のタンパク質が存在すると、抗体の急速なクリアランスが引き起こされ得るか、又は患者による抗体に対する免疫応答の発生が引き起こされ得る。

【0130】

ヒト抗体は、インビトロ方法によって得ることもできる。好適な例としては、限定はされないが、ファージディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ）、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ））、酵母ディスプレイなどが挙げられる。ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照のこと）を用いることにより、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体又は抗体断片を作製することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子がＭ１３又はｆｄなどの繊維状バクテリオファージの主要な或いはマイナーなコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として提示される。この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能特性に基づき選択すると、またそれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することになる。従って、ファージはＢ細胞のいくらかの特性を模倣する。ファージディスプレイは様々なフォーマットで実施することができ、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．３：５６４－５７１にレビューされている。いくつかのＶ遺伝子セグメント供給源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４－６２８は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。本質的にＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４によって記載される技術に従い、非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、及び抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書もまた参照のこと。

【0131】

上記に考察したとおり、ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により作成してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照のこと）。

【0132】

免疫グロブリン遺伝子は、可変領域におけるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント間の組換え、アイソタイプスイッチング、及び超突然変異を含め、免疫応答が成熟する間に様々な修飾を受ける。組換え及び体細胞超突然変異は抗体多様性及び親和性成熟を生じる基礎であるが、それらはまた配列ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）も生じ得るために、かかる免疫グロブリンの治療剤としての商業生産は困難となり、又は抗体の免疫原性リスクが増加し得る。一般に、ＣＤＲ領域における突然変異は親和性及び機能の向上に寄与するものと思われる一方、フレームワーク領域における突然変異は免疫原性リスクを増加させ得る。このリスクは、抗体の活性が悪影響を受けないことを確実にしながら、フレームワーク突然変異を生殖系列に復帰させることによって低減できる。多様化プロセスにより何らかの構造的ライアビリティが生じることもあり、又はそのような構造的ライアビリティが、重鎖及び軽鎖可変ドメインに寄与する生殖系列配列内に存在することもある。供給源にかかわらず、不安定性、凝集、産物の不均一性、又は免疫原性の増加をもたらし得る潜在的な構造的ライアビリティは除去することが所望され得る。望ましくないライアビリティの例としては、不対のシステイン（これはジスルフィド結合のスクランブリング、又は可変のスルフヒドリル付加物の形成を引き起こし得る）、Ｎ－結合型グリコシル化部位（構造及び活性の不均一性をもたらす）、並びにアミド分解（例えばＮＧ、ＮＳ）、異性化（ＤＧ）、酸化（露出したメチオニン）、及び加水分解（ＤＰ）部位が挙げられる。

【0133】

従って、免疫原性リスクを低減し、且つ薬学的特性を向上させるため、フレームワーク配列を生殖系列に復帰させ、ＣＤＲを生殖系列に復帰させ、及び／又は構造的ライアビリティを除去することが所望され得る。

【0134】

従って、一実施形態では、特定の抗体がその各々の生殖系列配列とアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列は、生殖系列配列に逆突然変異され得る。かかる修正的な突然変異は、標準的な分子生物学的技法を用いて、１つ、２つ、３つ若しくはそれより多くの位置で、又は突然変異した位置のいずれかの組み合わせにおいて発生し得る。

【0135】

抗体断片
特定の実施形態では、本抗体は、抗体断片又はそれらの断片を含む抗体である。抗体断片は、完全長抗体のうち、概してその抗原結合領域又は可変領域である一部分を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片が含まれる。ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書）及び一本鎖抗体分子である。

【0136】

伝統的には、これらの断片は、当該技術分野において公知の技法を用いたインタクトな抗体のタンパク質消化によって得られた。しかしながら、現在これらの断片は、組換え宿主細胞が直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞型で発現させて、そこから分泌させることができるため、これらの断片は大量産生が容易に可能である。一実施形態では、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的にカップリングすることにより、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２））Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：１６３－１６７。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を産生する他の技術が、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択される抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、抗体はＦａｂ断片でない。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する唯一の種である；従ってこれらは、インビボで使用する間の非特異的結合を低減するのに好適である。ｓｃＦｖのアミノ端又はカルボキシ端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合が生じるようにｓｃＦｖ融合タンパク質を構築してもよい。

【0137】

特定の実施形態では、本抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖可変（Ｖ_Ｈ）又は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域に対応する抗体の小さい機能的結合単位を含む抗体である。ドメイン抗体の例としては、限定はされないが、Ｄｏｍａｎｔｉｓのものが挙げられる（例えば、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット；国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット；国際公開第０４／００３０１９号パンフレット；国際公開第０３／００２６０９号パンフレット；米国特許第６，２９１，１５８号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，６９６，２４５号明細書；及び同第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと）。

【0138】

本発明の特定の実施形態では、本抗体は、線状抗体である。線状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１）を含む。Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２を参照のこと。

【0139】

他のアミノ酸配列修飾
上述のヒト抗体、ヒト化抗体及び／又はキメラ抗体に加えて、本発明はまた、可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメイン及び／又は可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメイン及び／又はＦｃ領域における１つ以上のアミノ酸残基及び／又はポリペプチド置換、付加及び／又は欠失、及び翻訳後修飾を含む本発明の抗体のさらなる修飾体、並びにその変異体及びその断片も包含する。これらの修飾体には、抗体がある部分に共有結合している抗体コンジュゲートが含まれる。抗体との結合に好適な部分としては、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、薬物、標識、及び細胞毒素が挙げられる。このような抗体に対する変化は、インフルエンザウイルス感染症の治療及び／又は診断に適切であるように抗体の（生化学的な、結合上の及び／又は機能的な）特性を改変し、又は微調整するために加えられ得る。コンジュゲートを形成し、アミノ酸及び／又はポリペプチド変化並びに翻訳後修飾を加える方法は、当該技術分野において公知であり、その一部を以下に詳述する。

【0140】

抗体に対するアミノ酸変化は、必然的に、上記に同定される抗体配列又は親抗体配列と１００％未満の同一性の配列をもたらす。特定の実施形態では、これに関連して抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と約２５％～約９５％の配列同一性を有し得る。従って、一実施形態では修飾抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、改変抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２、又はＣＤＲ－３のアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、改変抗体は、本明細書に記載されるとおりの抗体の重鎖又は軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４のアミノ酸配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。

【0141】

特定の実施形態では、改変抗体は、抗体の可変領域の１つ以上に導入された１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失及び／又は付加）により作成される。別の実施形態では、アミノ酸改変はフレームワーク領域に導入される。フレームワーク領域残基の１つ以上を改変すると、抗原に対する抗体の結合親和性の向上がもたらされ得る。これは特に、フレームワーク領域がＣＤＲ領域と異なる種から形成され得るヒト化抗体にそのような変化が加えられるときに該当し得る。修飾するフレームワーク領域残基の例には、抗原を直接非共有結合的に結合するもの（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３３：７４７－７５３）；ＣＤＲのコンホメーションと相互作用する／それを生じさせるもの（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）；及び／又はＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈ接合部に関与するもの（米国特許第５，２２５，５３９号明細書及び同第６，５４８，６４０号明細書）が含まれる。一実施形態では、約１～約５個のフレームワーク残基が改変され得る。ときにこれは、超可変領域残基が一つも改変されていない場合であっても、前臨床試験での使用に好適な抗体変異体を得るのに十分であり得る。しかしながら、通常は、改変抗体は１つ又は複数のさらなる超可変領域改変を含み得る。

【0142】

改変抗体の一つの有用な作成手順は、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４：１０８１－１０８５）。この方法では、超可変領域残基の１つ以上がアラニン又はポリアラニン残基に置換されることにより、標的抗原とのアミノ酸の相互作用が改変される。次に、置換に対して機能的感受性を示すそれらの１つ又は複数の超可変領域残基が、置換部位に、又は置換部位用の追加的な又は他の突然変異を導入することによって精緻化される。従って、アミノ酸配列変異の導入部位は予め決めておかれるが、突然変異の性質それ自体を予め決めておく必要はない。このように産生されたＡｌａ突然変異体は、本明細書に記載されるとおりのその生物活性についてスクリーニングされる。

【0143】

特定の実施形態において置換変異体には、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することが関わる。概して、さらなる展開用に選択される得られた１つ又は複数の変異体は、それが作成される元になった親抗体と比べて生物学的特性が向上したものであり得る。かかる置換変異体を作成するための好都合な方法には、ファージディスプレイを使用した親和性成熟が関わる（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：８８９－８９６及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０（４５）：１０８３２－１０８３７）。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７個の部位）を突然変異させることにより、各部位にあらゆる可能なアミノ酸置換が作成される。このように作成された抗体突然変異体が、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価の形で提示される。次に、ファージが提示する突然変異体が、本明細書に開示されるとおりその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0144】

抗体配列の突然変異には、置換、欠失（内部欠失を含む）、付加（融合タンパク質を生じる付加を含む）、又はアミノ酸配列内の及び／又はそれに隣接したアミノ酸残基の、但し変化が機能的に等価な抗体を生じる点で「サイレント」な変化をもたらす保存的置換が含まれ得る。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質の類似性を基準として作製されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられ；及び負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。加えて、グリシン及びプロリンは、鎖配向に影響を及ぼすことのできる残基である。非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを伴い得る。さらに、必要であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を置換又は付加として抗体配列に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、共通アミノ酸のＤ－異性体、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸ｓ、Ｎα－メチルアミノ酸、及び一般にアミノ酸類似体が挙げられる。

【0145】

別の実施形態では、抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、概してセリンと置換されてよく、それにより分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止し得る。逆に、１つ又は複数のシステイン結合を抗体に加えることで、その安定性を向上させてもよい（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。

【0146】

変異Ｆｃ領域
Ｆｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸置換及び／又は付加及び／又は欠失）は、抗体のエフェクター機能を増強又は減退させ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第６，５３８，１２４号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５３８，１２４号明細書；国際公開第０３／０７４６７９号パンフレット；国際公開第０４／０２９２０７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレット；国際公開第９９／５８５７２号パンフレット；米国特許出願公開第２００６／０１３４１０５号明細書；同第２００４／０１３２１０１号明細書；同第２００６／０００８８８３号明細書を参照）、及び抗体の薬物動態特性（例えば半減期）を改変し得る（米国特許第６，２７７，３７５号明細書及び同第７，０８３，７８４号明細書を参照）ことが知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の抗体は、改変されたＦｃ領域（本明細書では「変異Ｆｃ領域」とも称される）を含み、ここでは抗体の機能特性及び／又は薬物動態特性を変化させるため、Ｆｃ領域に１つ以上の改変が加えられている。かかる改変は、ＩｇＧに関して、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）又はＦｃγＲ結合、及び抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）の減少又は増加をもたらし得る。本発明は、エフェクター機能を増強するか又は減退させるかの微調整により所望のエフェクター機能が提供されるように変化を生じさせた変異Ｆｃ領域を有する本明細書に記載される抗体を包含する。従って、本発明の抗体は、変異Ｆｃ領域（すなわち、以下で考察するとおり改変されているＦｃ領域）を含む。変異Ｆｃ領域を含む本発明の抗体はまた、本明細書では「Ｆｃ変異抗体」とも称される。本明細書で使用されるとき、天然とは、修飾されていない親配列を指し、天然Ｆｃ領域を含む抗体は、本明細書では「天然Ｆｃ抗体」と称される。Ｆｃ変異抗体は、当業者に周知されている数多くの方法で作成することができる。非限定的な例としては、抗体コード領域を（例えばハイブリドーマから）単離し、その単離した抗体コード領域のＦｃ領域に１つ以上の所望の置換を作製することが挙げられる。或いは、抗体の抗原結合部分（例えば可変領域）を、変異Ｆｃ領域をコードするベクターにサブクローニングしてもよい。一実施形態では、変異Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較したとき同程度のエフェクター機能の誘導レベルを呈する。別の実施形態では、変異Ｆｃ領域は、天然Ｆｃと比較したときより高いエフェクター機能の誘導を呈する。変異Ｆｃ領域のいくつかの具体的な実施形態を以下に詳述する。エフェクター機能の計測方法は、当該技術分野において周知されている。

【0147】

抗体のエフェクター機能は、限定はされないが、アミノ酸置換、アミノ酸付加、アミノ酸欠失及びＦｃアミノ酸に対する翻訳後修飾（例えばグリコシル化）の変化を含め、Ｆｃ領域を変化させることにより修飾される。以下に記載される方法を用いることにより、本抗体のエフェクター機能、所望の特性を有する治療用抗体をもたらす、ＦｃＲに対するＦｃ領域の結合特性（例えば、親和性と特異性）の比率を微調整し得る。

【0148】

本明細書で使用されるとおりのＦｃ領域には、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を構成するポリペプチドが含まれることが理解される。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関しては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧに関しては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）、及びＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含み得る。

【0149】

Ｆｃ領域の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６又はＰ２３０からそのカルボキシル端を含むように定義され得、ここで付番は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスに基づく。Ｆｃは、単離におけるこの領域を指してもよく、又は抗体、抗体断片、若しくはＦｃ融合タンパク質の文脈におけるこの領域を指してもよい。限定はされないが、ＥＵインデックスにより付番するときの２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位、及び３５８位を含む複数の異なるＦｃ位置で多型が観察されており、従って提示される配列と先行技術の配列との間には、僅かな違いが存在し得る。

【0150】

一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は天然Ｆｃ抗体と比較したとき、限定はされないが、ＦｃＲｎ、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、及びＦｃγＲＩＣを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２、アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＣを含む）；及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢを含む）を含め、１つ以上のＦｃ受容体に対して改変された結合親和性を呈する。

【0151】

一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて１つ以上のＦｃリガンドに対する結合が増強されている。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、且つ最大２５倍、又は最大５０倍、又は最大７５倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００～２００倍高い又は低いＦｃリガンドに対する親和性の増加又は減少を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃリガンドに対する親和性を呈する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃリガンドに対する親和性が増加している。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃリガンドに対する親和性が低下している。

【0152】

具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対して増強された結合性を有する。別の具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対して増強された結合性を有する。さらに具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの双方に対して増強された結合性を有する。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対して増強された結合性を有するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比較したとき、ＦｃγＲＩＩＢ受容体との結合性の付随する増加を有しない。具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対して低下した結合性を有する。さらに具体的な実施形態において、Ｆｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対して低下した結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対して増強された結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べてＣ１ｑに対して改変された結合性を有する。

【0153】

一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大６０倍、又は最大７０倍、又は最大８０倍、又は最大９０倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００～２００倍高い又は低いＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を呈する。

【0154】

一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大６０倍、又は最大７０倍、又は最大８０倍、又は最大９０倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００倍～２００倍高い又は低いＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を呈する。

【0155】

一実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増加又は低下したＣ１ｑに対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大６０倍、又は最大７０倍、又は最大８０倍、又は最大９０倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００倍～２００倍高い又は低いＣ１ｑ受容体に対する親和性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％高い又は低いＣ１ｑに対する親和性を呈する。さらに別の具体的な実施形態において、Ｃｉｑに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対して増強された結合性を有する。さらに別の具体的な実施形態において、Ｃ１ｑに対して改変された親和性を呈するＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べてＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対して改変された結合性を有する。

【0156】

当該技術分野においてまとめて抗体エフェクター機能として知られる複数のプロセスを介して攻撃及び破壊を誘導する能力が抗体にあることは、当該技術分野において公知である。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」として知られるこれらのプロセスの一つは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保持細胞に特異的に結合させ、続いて細胞を細胞毒で死滅させることを可能にする細胞傷害性の一形態を指す。細胞の表面を指向する特異的高親和性ＩｇＧ抗体が細胞傷害性細胞を「装備」し、かかる死滅には必須である。細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞間接触が必要で、且つ相補体は関与しない。

【0157】

用語エフェクター機能に包含される別のプロセスは、補体依存性細胞傷害性（以下、「ＣＤＣ」と称する）であり、これは、補体系による細胞破壊の生化学的イベントを指す。補体系は、正常な血漿に認められるタンパク質の複合系であり、抗体と組み合わさって病原性細菌及び他の外来細胞を破壊する。

【0158】

用語エフェクター機能に包含されるさらに別のプロセスは、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）であり、これは、１つ以上のエフェクターリガンドを発現する非特異的細胞傷害性細胞が細胞上の結合した抗体を認識し、続いて細胞の食作用を生じる細胞媒介性反応を指す。

【0159】

Ｆｃ変異抗体は、１つ以上のＦｃγＲ媒介性エフェクター細胞機能を決定するためのインビトロ機能アッセイにより特徴付けられることが企図される。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、インビボモデル（本明細書に記載及び開示されるものなど）において、インビトロベースのアッセイの場合と同様の結合特性及びエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本発明は、インビトロベースのアッセイで所望の表現型を呈しないが、インビボで実に所望の表現型を呈するＦｃ変異抗体を除外しない。

【0160】

特定の実施形態では、Ｆｃ変異体を有する抗体は、天然Ｆｃ領域を含む抗体と比べて、細胞毒性又は食作用活性（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ）を増強している。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大７５倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００倍～２００倍高い細胞毒性又は食作用活性を有する。或いは、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、細胞毒性又は食作用活性を低下させている。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大７５倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００倍～２００倍低い細胞毒性又は食作用活性を有する。

【0161】

特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて低下したＡＤＣＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大７５倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００倍～２００倍低いＡＤＣＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低下したＡＤＣＣ活性を呈する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、検出不能なＡＤＣＣ活性を有する。具体的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性の低下及び／又は低減（ａｂｌａｔｅｍｅｎｔ）は、Ｆｃ変異抗体がＦｃリガンド及び／又は受容体に対して呈する低下した親和性に起因し得る。

【0162】

他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍高いＡＤＣＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％増強されたＡＤＣＣ活性を呈する。具体的な実施形態では、増強されたＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ変異抗体がＦｃリガンド及び／又は受容体に対して呈する増強された親和性に起因し得る。

【0163】

特定の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強し、且つＡＤＣＣ活性を増強している。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、増強されたＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期の双方を有する。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低下させ、且つＡＤＣＣ活性を低下させている。他の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、低下したＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期の双方を有する。

【0164】

特定の実施形態では、細胞毒性は、ＣＤＣによって媒介され、ここでＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、増強されるか又は低下したＣＤＣ活性のいずれかを有する。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の構成成分の、ある分子、例えば同種抗原と複合体を形成した抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３に記載のＣＤＣアッセイを実施してもよい。

【0165】

一実施形態では、本発明の抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性を呈する。別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体の場合と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍、又は最大５０倍、又は最大７５倍、又は最大１００倍、又は最大２００倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～５０倍、又は２５倍～１００倍、又は７５倍～２００倍、又は１００～２００倍高いＣＤＣ活性を呈する。さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％増強されたＣＤＣ活性を呈する。具体的な実施形態では、ＣＤＣ活性の増強は、Ｆｃ変異抗体がＣ１ｑに対して呈する増強された親和性に起因し得る。

【0166】

本発明の抗体は、抗体の主要な作用機構の一つであるＣＤＣを増強するＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｉｒｉｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のおかげで、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性を呈し得る。抗体のアイソタイプであるＩｇＧ３の一部分が、治療抗体における標準的アイソタイプであるＩｇＧ１の対応する領域内に導入される、アイソタイプキメラ（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ）と呼ばれる手法を用いて、ＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のいずれかの場合と比べてＣＤＣ活性を著しく増強し、他方でＩｇＧ１の所望される特徴、例えばＡＤＣＣ、ＰＫ特性及びプロテインＡ結合を保持する。さらに、ＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術はＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）技術と併用することができ、それにより、増強されたＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を伴うさらに優れた治療用Ｍａｂ（ＡＣＣＲＥＴＡＭＡＢ（登録商標））が創出される。

【0167】

本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。

【0168】

本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＣＤＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。

【0169】

本発明のＦｃ変異抗体は、天然Ｆｃ抗体と比べて増強されたＡＤＣＣ活性、増強されたＣＤＣ活性及び増加した血清半減期を有し得る。

【0170】

Ｆｃ領域を有するタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより、増加させることができる。用語「抗体半減期」は、本明細書で使用されるとき、抗体分子のその投与後の平均生存時間の尺度である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、例えば血清中（すなわち循環半減期）又は他の組織で計測するときに、既知量の免疫グロブリンの５０パーセントを患者の体内（又は他の哺乳類）又はその特定のコンパートメントから排出するのに必要な時間として表すことができる。半減期は免疫グロブリン毎又は免疫グロブリンのクラス毎に異なり得る。一般に、抗体半減期が増加すると、投与された抗体についての循環中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が増加する。

【0171】

半減期の増加により、患者に投与する薬物の量を低減するとともに投与頻度を低減することが可能になる。抗体の血清半減期を増加させるためには、例えば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるとおり、抗体（特に抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子の生体内血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。

【0172】

或いは、半減期が増加した本発明の抗体を、Ｆｃ受容体とＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると特定されたアミノ酸残基を修飾することにより作成してもよい（例えば、米国特許第６，８２１，５０５号明細書及び同第７，０８３，７８４号明細書；及び国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットを参照のこと）。加えて、本発明の抗体の半減期は、当該技術分野で広く利用されている技術によってＰＥＧ又はアルブミンとコンジュゲートすることにより増加させてもよい。一部の実施形態では、本発明のＦｃ変異領域を有する抗体は、天然Ｆｃ領域を有する抗体と比較したとき、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％又はそれ以上の半減期の増加を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ変異領域を有する抗体は、天然Ｆｃ領域を有する抗体と比較したとき、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍又はそれ以上、又は最大約１０倍、最大約２０倍、最大約５０倍、又は２倍～１０倍、又は５倍～２５倍、又は１５倍～５０倍の半減期の増加を有する。

【0173】

一実施形態では、本発明はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１、２２５、２２８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３０８、３１３、３１６、３１８、３２０、３２２、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４２８、４３３、４３４、４３５、４３６、４４０、及び４４３から選択される１つ以上の位置に修飾（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。場合により、Ｆｃ領域は、当業者に公知の追加的及び／又は代替的な位置に修飾を含み得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，０８３，７８４号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，２１７，７９７号明細書；同第７，２７６，５８５号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１４７３１１号明細書；同第２００４／０００２５８７号明細書；同第２００５／０２１５７６８号明細書；同第２００７／０１３５６２０号明細書；同第２００７／０２２４１８８号明細書；同第２００８／００８９８９２号明細書；国際公開第９４／２９３５１号パンフレット；及び国際公開第９９／５８５７２号パンフレットを参照のこと）。さらに、有用なアミノ酸位置及び特定の置換が、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２、及び表６～表１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に提示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、図１２、及び図１５に提示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、図９及び図１０に提示される表、並びに国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８～図１０、図１３及び図１４に提示される表に例示される。

【0174】

具体的な実施形態において、本開示はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２１Ｋ、２２１Ｙ、２２５Ｅ、２２５Ｋ、２２５Ｗ、２２８Ｐ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４Ｉ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３７Ｌ、２３７Ｍ、２３７Ｐ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５０Ｅ、２５０Ｑ、２５１Ｆ、２５２Ｌ、２５２Ｙ、２５４Ｓ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｆ、２５６Ｍ、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３Ｉ、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４Ｉ、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ａ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６８Ｅ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２９６Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ａ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５Ｉ、３０８Ｆ、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３１８Ａ、３１８Ｓ、３２０Ａ、３２０Ｓ、３２２Ａ、３２２Ｓ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２６Ａ、３２６Ｄ、３２６Ｅ、３２６Ｇ、３２６Ｍ、３２６Ｖ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１Ｉ、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３３Ａ、３３３Ｄ、３３３Ｇ、３３３Ｑ、３３３Ｓ、３３３Ｖ、３３４Ａ、３３４Ｅ、３３４Ｈ、３３４Ｌ、３３４Ｍ、３３４Ｑ、３３４Ｖ、３３４Ｙ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、４３３Ｋ、４３３Ｌ、４３４Ａ、４２４Ｆ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｈ、４４０Ｙ及び４４３Ｗから選択される少なくとも１つの置換を含む。場合により、Ｆｃ領域は、限定はされないが、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２、及び表６～表１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に提示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、図１２、及び図１５に提示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、図９及び図１０に提示される表、並びに国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８、図９及び図１０に提示される表に例示されるものを含む当業者に公知の追加的及び／又は代替的なアミノ酸置換を含み得る。

【0175】

具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８、２３４、２３５及び３３１から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、及び３３１Ｓから選択される少なくとも１つの置換である。

【0176】

別の具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、且つＫａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８及び２３５から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾を含む。さらに別の具体的な実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２２８Ｐ、２３５Ｅ及び２３５Ｙから選択される。

【0177】

別の具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９、３３０及び３３２から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２３９Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、及び３３２Ｅから選択される少なくとも１つの置換である。

【0178】

具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異抗体を提供し、ここではＦｃ領域が、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２、２５４、及び２５６から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含む。一実施形態では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅから選択される少なくとも１つの置換である。本発明の特に好ましい抗体では、修飾は、Ｋａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスにより付番したときの３つの置換２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（「ＹＴＥ」として公知）であり、米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照のこと。

【0179】

特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体により誘発されるエフェクター機能は、タンパク質のＦｃ領域に連結した炭水化物部分に強く依存する（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．９３：８５１－８６１）。従って、Ｆｃ領域のグリコシル化を、エフェクター機能が増加又は低下するように修飾することができる（例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６－３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；同第６，９４６，２９２号明細書；同第７，０６４，１９１号明細書；同第７，２１４，７７５号明細書；同第７，３９３，６８３号明細書；同第７，４２５，４４６号明細書；同第７，５０４，２５６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；同第２００３／０００３０９７号明細書；同第２００９／００１０９２１号明細書；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス）を参照のこと）。従って、一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化によりエフェクター機能が低下する。別の実施形態では、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化によりエフェクター機能が増加する。具体的な実施形態において、Ｆｃ領域はフコシル化が低下している。別の実施形態では、Ｆｃ領域は非フコシル化型である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号明細書を参照のこと）。一態様において、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ））で作成されるとおりの、エフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加したこれらの抗体は、親細胞によって産生される抗体と比較して、１００倍超高いＡＤＣＣを有する高度に脱フコシル化した抗体を産生するように操作される（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８８：９０１－９０８；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１５９１－７）。

【0180】

ＩｇＧ分子上のオリゴ糖類に対するシアル酸の付加は、その抗炎症活性を増進し、且つその細胞傷害性を改変し得る（Ｋｅｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１３：６７０－６７３；Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．４４（７）：１５２４－３４）。上記に参照する研究は、シアリル化を増加させたＩｇＧ分子が抗炎症特性を有する一方、シアリル化を低減したＩｇＧ分子は免疫賦活特性が増加する（例えば、ＡＤＣＣ活性が増加する）ことを実証している。従って、抗体を、特定の治療適用に適切なシアリル化プロファイルで修飾することができる（米国特許出願公開第２００９／０００４１７９号明細書及び国際公開第２００７／００５７８６パンフレット）。

【0181】

一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して改変されたシアリル化プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して増加したシアリル化プロファイルを含む。別の実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して減少したシアリル化プロファイルを含む。

【0182】

一実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７－４０；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ．３３２：５６３－５６４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７－２６６２；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：５３－５９；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．５７：１５３７－１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：１１９８０－１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１－１１７；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｆａｓｅｂ．Ｊ．９：１１５－１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５４：１０１－１０４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３－４９６９；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３－２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：１６－２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２５７１－２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２：５７－６５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第５，６７７，４２５号明細書；同第６，１６５，７４５号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第５，８６９，０４６号明細書；同第６，１２１，０２２号明細書；同第５，６２４，８２１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５２８，６２４号明細書；同第６，１９４，５５１号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書；同第６，１８０，３７７号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書；及び国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに開示されるものなどの他の公知のＦｃ変異体と組み合わされてもよい。Ｆｃドメインの他の修飾及び／又は置換及び／又は付加及び／又は欠失が、当業者には容易に明らかであろう。

【0183】

グリコシル化
グリコシル化が抗体のエフェクター機能を改変する能力に加えて、可変領域の修飾されたグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を改変することができる。一実施形態では、本抗体の可変領域におけるグリコシル化パターンが修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、この抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性が増加するように改変することができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変して達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該の部位のグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を作製することができる。かかる非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。かかる手法は、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域に存在するグリコシル化部位（例えば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換もまた作製することができる。さらには、非グリコシル化抗体は、必須のグリコシル化機構を欠く細菌細胞において産生され得る。

【0184】

抗体コンジュゲート
特定の実施形態では、本発明の抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて物質とコンジュゲート又は共有結合される。一実施形態では、結合される物質は、治療剤、検出可能標識（本明細書ではレポーター分子とも称される）又は固体支持体である。抗体との結合に好適な物質としては、限定はされないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成高分子、高分子マイクロパーティクル、生体細胞、ウイルス、フルオロフォア、発色団、色素、毒素、ハプテン、酵素、抗体、抗体断片、放射性同位元素、固体マトリックス、半固体マトリックス及びそれらの組み合わせが挙げられる。別の物質を抗体にコンジュゲート又は共有結合する方法は、当該技術分野において公知である。

【0185】

特定の実施形態では、本発明の抗体は固体支持体にコンジュゲートされる。抗体は、スクリーニング及び／又は精製及び／又は製造プロセスの一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。或いは本発明の抗体は、診断方法又は組成物の一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。本発明での使用に好適な固体支持体は、典型的には液相に対して実質的に不溶性である。多数の支持体が利用可能であり、当業者には周知されている。従って、固体支持体には、固体及び半固体マトリックス、例えばエーロゲル及びハイドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜被覆バイオチップを含む）、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも称される）、膜、導電性及び非導電性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）及び磁気支持体が含まれる。固体支持体のより具体的な例には、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖、例えばセファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが含まれる。

【0186】

一部の実施形態では、固体支持体は、限定はされないが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシド等を含めた、本発明の抗体を結合するための反応性官能基を含み得る。

【0187】

好適な固相支持体は、所望の最終用途及び様々な合成プロトコルの適合性を基準として選択することができる。例えば、本発明の抗体を固体支持体に結合するのにアミド結合形成が望ましい場合、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等から入手可能なＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，カナダから調達可能）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調達可能）、ポリエチレングリコールにグラフトされたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、又はＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調達可能）などの、概してペプチド合成に有用な樹脂が用いられ得る。

【0188】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体及び／又はそれに関連したリガンドが検出可能である診断及び他のアッセイを目的として、標識にコンジュゲートされる。抗体にコンジュゲートされ、また本明細書に記載される本方法及び本組成物で使用される標識は、２８０ｎｍを超える波長で最大吸収を呈し、且つ抗体に共有結合的に結合されるときにそのスペクトル特性を保持する、任意の化学的部分（有機的又は無機的）である。標識としては、限定はされないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、りん光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられる。

【0189】

特定の実施形態では、抗体はフルオロフォアにコンジュゲートされる。このように、本発明の抗体を標識するのに用いられるフルオロフォアには、限定なしに；ピレン（米国特許第５，１３２，４３２号明細書に開示される対応する誘導体化合物のいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール又はベンズインドール、オキサゾール又はベンゾオキサゾール、チアゾール又はベンゾチアゾール、４－アミノ－７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許第６，９７７，３０５号明細書及び同第６，９７４，８７３号明細書における任意の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７，２７５号明細書；米国特許第４，９８１，９７７号明細書；同第５，２６８，４８６号明細書；同第５，５６９，５８７号明細書；同第５，５６９，７６６号明細書；同第５，４８６，６１６号明細書；同第５，６２７，０２７号明細書；同第５，８０８，０４４号明細書；同第５，８７７，３１０号明細書；同第６，００２，００３号明細書；同第６，００４，５３６号明細書；同第６，００８，３７３号明細書；同第６，０４３，０２５号明細書；同第６，１２７，１３４号明細書；同第６，１３０，０９４号明細書；同第６，１３３，４４５号明細書；及び国際公開第０２／２６８９１号パンフレット、国際公開第９７／４０１０４号パンフレット、国際公開第９９／５１７０２号パンフレット、国際公開第０１／２１６２４号パンフレット；欧州特許出願公開第１ ０６５ ２５０ Ａ１号明細書における任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４，７７４，３３９号明細書；同第５，１８７，２８８号明細書；同第５，２４８，７８２号明細書；同第５，２７４，１１３号明細書；及び同第５，４３３，８９６号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号明細書；同第６，１３０，１０１号明細書；同第６，２２９，０５５号明細書；同第６，３３９，３９２号明細書；同第５，４５１，３４３号明細書；同第５，２２７，４８７号明細書；同第５，４４２，０４５号明細書；同第５，７９８，２７６号明細書；同第５，８４６，７３７号明細書；同第４，９４５，１７１；米国特許出願第０９／１２９，０１５号明細書及び同第０９／９２２，３３３号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）又はベンゾキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号明細書；同第５，４５９，２７６号明細書；同第５，５０１，９８０号明細書及び同第５，８３０，９１２号明細書に開示される対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号明細書及び同第４，８４９，３６２号明細書に開示される対応する化合物を含む）及びベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）及びこれらの誘導体が含まれる。本明細書で使用されるとき、オキサジンには、レゾルフィン（米国特許第５，２４２，８０５号明細書に開示される任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、及びこれらのベンゾ置換類似体が含まれる。

【0190】

具体的な実施形態において、本明細書に記載される抗体にコンジュゲートされるフルオロフォアには、キサンテン（ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、ローダミン、フルオレセイン及びこれらの誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン及びボラポリアザインダセンが含まれる。他の実施形態では、かかるフルオロフォアは、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン及びスルホン化シアニンである。また、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ、ＣＹ（登録商標）Ｄｙｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、オレゴングリーン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ）（登録商標）、パシフィックブルー（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＬＵＥ）（商標）、ＩＲＤＹＥ（登録商標）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、及びＲＯＸ（商標）の商標で販売され、且つそのように一般に知られている色素も含まれる。

【0191】

抗体に結合するフルオロフォアの選択が、コンジュゲート抗体の吸収及び蛍光発光特性を決定し得る。抗体及び抗体結合リガンドに用いることのできるフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定はされないが、スペクトル特性（吸収、発光及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光及び光退色速度、又はそれらの組み合わせが挙げられる。これらの物理的特性は全て、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するために用いることができ、従って多重化解析を可能にする。特定の実施形態では、フルオロフォアは４８０ｎｍより大きい波長に吸収極大を有する。他の実施形態では、フルオロフォアは、４８８ｎｍ～５１４ｎｍ若しくはその近傍（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に特に好適）又は５４６ｎｍ近傍（水銀アークランプによる励起に特に好適）を吸収する。他の実施形態ではフルオロフォアは、組織又は全生物体適用にＮＩＲ（近赤外領域）で発光することができる。蛍光標識の他の望ましい特性としては、例えば抗体の標識が細胞又は生物体（例えば、生きている動物）で実施される場合に、細胞透過性及び低毒性を挙げることができる。

【0192】

特定の実施形態では、酵素が標識であり、本明細書に記載される抗体にコンジュゲートされる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅を達成することができ、アッセイ感度の増加がもたらされるため、望ましい標識である。酵素それ自体は検出可能な反応を生じないが、適切な基質を接触させると基質を分解する働きをし、それにより変換された基質が蛍光、比色又は発光シグナルを生じる。標識試薬の一つの酵素が複数の基質についての検出可能なシグナルへの変換をもたらし得るため、酵素は検出可能なシグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい計測可能な生成物、例えば比色、蛍光又は化学発光生成物が得られるように選択される。かかる基質は当該技術分野で広範に用いられており、当業者には周知されている。

【0193】

一実施形態では、比色基質又は蛍光発生基質及び酵素の組み合わせは、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼと、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの識別性のある色（それぞれ褐色及び赤色）を生じる基質とを使用する。検出可能な生成物を生じる他の比色オキシドレダクターゼ基質としては、限定はされないが、２，２－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ－ジアニシジン、５－アミノサリチル酸、４－クロロ－１－ナフトールが挙げられる。蛍光発生基質としては、限定はされないが、ホモバニリン酸又は４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン及び還元型ベンゾチアジン、例えばＡｍｐｌｅｘ（登録商標）レッド試薬及びその変種（米国特許第４，３８４，０４２号明細書）及び還元型ジヒドロキサンテン、例えばジヒドロフルオレセイン（米国特許第６，１６２，９３１号明細書）及びジヒドロローダミン、例えばジヒドロローダミン１２３が挙げられる。チラミドであるペルオキシダーゼ基質（米国特許第５，１９６，３０６号明細書；同第５，５８３，００１号明細書及び同第５，７３１，１５８号明細書）は、酵素が作用する前に本質的に検出可能であり得るが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載される過程でペルオキシダーゼの作用によって「その場に固定」される点で、ペルオキシダーゼ基質のユニークなクラスに相当する。これらの基質は、細胞、組織又はアレイである試料中の抗原を、後に顕微鏡法、フローサイトメトリー、光学走査及び蛍光定量法によって検出するために標識するのに広範に利用されている。

【0194】

別の実施形態において、比色（及びある場合には蛍光発生）基質と酵素との組み合わせは、ホスファターゼ酵素、例えば酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ又はかかるホスファターゼの組換え型を、５－ブロモ－６－クロロ－３－インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、６－クロロ－３－インドリルリン酸、５－ブロモ－６－クロロ－３－インドリルリン酸、ｐ－ニトロフェニルリン酸、又はｏ－ニトロフェニルリン酸などの比色基質と組み合わせて、又は４－メチルウンベリフェリルリン酸、６，８－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－４－メチルクマリニルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号明細書）、フルオレセイン二リン酸、３－Ｏ－メチルフルオレセインリン酸、レゾルフィンリン酸、９Ｈ－（１，３－ジクロロ－９，９－ジメチルアクリジン－２－オン－７－イル）リン酸（ＤＤＡＯリン酸）、又はＥＬＦ ９７、ＥＬＦ ３９若しくは関連するリン酸（米国特許第５，３１６，９０６号明細書及び同第５，４４３，９８６号明細書）などの蛍光発生基質と組み合わせて用いる。

【0195】

グリコシダーゼ、特にβ－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ及びβ－グルコシダーゼが、さらなる好適な酵素である。適切な比色基質としては、限定はされないが、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）及び同様のインドリルガラクトシド、グルコシド、及びグルクロニド、ｏ－ニトロフェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及びｐ－ニトロフェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられる。一実施形態では、蛍光発生基質には、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びこれらの構造的変種（米国特許第５，２０８，１４８号明細書；同第５，２４２，８０５号明細書；同第５，３６２，６２８号明細書；同第５，５７６，４２４号明細書及び同第５，７７３，２３６号明細書）、４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号明細書）が含まれる。

【0196】

さらなる酵素としては、限定はされないが、コリンエステラーゼ及びペプチダーゼなどのヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼなどのオキシダーゼ、及びそれに対する好適な基質が知られるレダクターゼが挙げられる。

【0197】

一部のアッセイには、化学発光を生じる酵素及びその適切な基質が好ましい。それらとしては、限定はされないが、天然及び組換え形態のルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼに対する化学発光生成基質、例えば、安定ジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムエステルを含有するものが、さらに有用である。

【0198】

別の実施形態では、ビオチンなどのハプテンもまた標識として利用される。ビオチンは、酵素系において検出可能なシグナルをさらに増幅するよう機能することができ、且つ単離目的でアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するタグとして機能することができるため、有用である。検出目的では、アビジン－ＨＲＰなどの、ビオチンに対して親和性を有する酵素コンジュゲートが用いられる。続いてペルオキシダーゼ基質を添加すると、検出可能なシグナルが生成される。

【0199】

ハプテンにはまた、ホルモン、天然に存在する及び合成の薬物、汚染物、アレルゲン、作用因子分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなども含まれる。

【0200】

特定の実施形態では、蛍光タンパク質が標識として抗体にコンジュゲートされてもよい。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質及びこれらの誘導体が含まれる。蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識された標識試薬を作り出すのに特に有用である。このようなタンデム色素は、より大きいストークスシフトの達成を目的として蛍光タンパク質及びフルオロフォアを含み、ここでは発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらに遠くにシフトする。これは、試料中の低量の抗原を検出するのに特に有利であり、ここでは放たれる蛍光の光が最大限最適化され、換言すれば、放たれる光がほとんど乃至全く蛍光タンパク質に再吸収されない。これが機能するには、蛍光タンパク質とフルオロフォアとがエネルギー伝達対として働き、ここで蛍光タンパク質はフルオロフォアが吸収する波長で発光し、次にそのフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）が、その蛍光タンパク質のみで達成され得たより蛍光タンパク質からさらに遠い波長を発光する。特に有用な組み合わせは、米国特許第４，５２０，１１０号明細書；同第４，８５９，５８２号明細書；同第５，０５５，５５６号明細書に開示されるフィコビリタンパク質と、米国特許第５，７９８，２７６号明細書に開示されるスルホローダミンフルオロフォア、又は米国特許第６，９７７，３０５号明細書及び同第６，９７４，８７３号明細書に開示されるスルホン化シアニンフルオロフォア；又は米国特許第６，１３０，１０１号明細書に開示されるスルホン化キサンテン誘導体、及び米国特許第４，５４２，１０４号明細書に開示されるそれらの組み合わせである。或いは、フルオロフォアがエネルギー供与体として働き、且つ蛍光タンパク質がエネルギー受容体である。

【0201】

特定の実施形態では、標識は放射性同位体である。好適な放射性物質の例としては、限定はされないが、ヨウ素（^１２１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３５Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ，^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ及び^９７Ｒｕが挙げられる。

【0202】

治療及び使用
本発明の抗体及びその抗原結合断片並びにその変異体は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療のため、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の予防のため；Ｂ型インフルエンザウイルス感染の検出、診断及び／又は予後のため；あるいはそれらの組み合わせのため、用いてもよい。一実施形態では、本発明の抗体及びその抗原結合断片並びにその変異体は、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の治療のため、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの予防のため；Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の検出、診断及び／又は予後のため；あるいはそれらの組み合わせのため、用いてもよい。

【0203】

診断の方法は、抗体又は抗体断片を試料に接触させることを含んでもよい。かかる試料は、例えば、鼻道、洞腔（ｓｉｎｕｓ ｃａｖｉｔｉｅｓ）、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、目、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳又は皮膚から採取された組織試料であってもよい。検出、診断、及び／又は予後の方法もまた、抗原／抗体複合体の検出を含んでもよい。

【0204】

一実施形態では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、あるいは抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を有効量で被験者に投与することにより被験者を治療する方法を提供する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、実質的に精製される（すなわち、その効果を制限するか又は望ましくない副作用をもたらす物質から実質的に遊離される）。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露後、すなわち被験者がＢ型インフルエンザウイルスに曝露されてから又はＢ型インフルエンザウイルスに感染後、投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露後、すなわち被験者がＹａｍａｇａｔａ及び／若しくはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに曝露されてから又はＹａｍａｇａｔａ及び／若しくはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに感染後、投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露後、すなわち被験者が少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ；Ｙａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス、又はそれらの組み合わせに曝露されてから；あるいは少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ及び／又はＹａｍａｇａｔａ及び／若しくはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに感染後、投与される。

【0205】

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露前、すなわちＢ型インフルエンザウイルスにまだ曝露されていないか又はＢ型インフルエンザウイルスにまだ感染していない被験者に、投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露前、すなわちＹａｍａｇａｔａ及び／若しくはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスにまだ曝露されていないか又はＹａｍａｇａｔａ及び／若しくはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスにまだ感染していない被験者に、投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、曝露前、すなわちＡ型インフルエンザウイルス；Ｙａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；又はそれらの組み合わせにまだ曝露されていないか、又はＡ型インフルエンザウイルス；Ｙａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザ；又はそれらの組み合わせにまだ感染していない被験者に、投与される。

【0206】

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＢ型インフルエンザウイルスに対して血清陰性である被験者に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＢ型インフルエンザウイルス系統に対して血清陰性である被験者に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザのサブタイプ及び／又は１つ以上のＢ型インフルエンザウイルスに対して血清陰性である被験者に投与される。

【0207】

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＢ型インフルエンザウイルスに対して血清陽性である被験者に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＢ型インフルエンザウイルス系統に対して血清陽性である被験者に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ及び／又は１つ以上のＢ型インフルエンザウイルスに対して血清陽性である被験者に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、感染又は症状発症から１、２、３、４、５日以内に被験者に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、感染又は症状発症後の１、２、３、４、５、６、若しくは７日目、及び２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０日以内に被験者に投与され得る。

【0208】

一実施形態では、本方法は、被験者におけるＢ型インフルエンザウイルス感染を低下させる。別の実施形態では、本方法は、被験者におけるＡ型インフルエンザウイルス感染及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染を低下させる。別の実施形態では、本方法は、被験者におけるＢ型インフルエンザウイルス感染についてのリスク又は遅延を予防し、低下させる。別の実施形態では、本方法は、被験者におけるＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染についてのリスク又は遅延を予防し、低下させる。一実施形態では、被験者は動物である。一実施形態では、被験者は哺乳動物である。さらなる特定の実施形態では、被験者はヒトである。一実施形態では、被験者は、限定はされないが、Ａ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザのウイルス感染に対して特にリスクがあるか又は罹りやすい被験者、例えば易感染性の被験者などを含む。

【0209】

治療は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールが可能であり、また本発明の抗体又はその抗原結合断片は、受動免疫又は能動免疫で使用することができる。

【0210】

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上の抗ウイルス薬と組み合わせて被験体に投与される。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上の小分子抗ウイルス薬と組み合わせて被験体に投与される。小分子抗ウイルス薬は、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））などのノイラミニダーゼ阻害剤並びにアマンタジン及びリマンタジンなどのアダマンタンを含む。

【0211】

別の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の予防又は治療のための薬物として使用される組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、及び／又は、本発明の抗体又はその抗原結合断片が被験体の治療及び／又は被験体における診断のための薬物の作製において結合する対象のエピトープを含むタンパク質の使用を提供する。

【0212】

本発明に記載される抗体及びその断片はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染；Ｂ型インフルエンザウイルス感染；又はこれらの組み合わせの診断用のキットの中で使用してもよい。さらに、本発明の抗体に結合する能力があるエピトープは、ワクチン接種手順の有効性を、保護的な抗Ａ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することによって監視するためのキットの中で使用してもよい。本発明に記載される抗体、抗体断片、又はその変異体及び誘導体はまた、所望される免疫原性を伴うワクチン製造を監視するためのキットの中で使用してもよい。

【0213】

本発明はまた、医薬組成物を調製する方法であって、本明細書に記載される本発明に記載のモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体を、１つ以上の薬学的に許容できる担体と混合するステップを含む、方法を提供する。

【0214】

本発明の抗体又はその抗原結合断片を投与するため、限定はされないが、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへの封入、抗体又は抗体断片を発現することが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス、レトロウイルス又は他のベクターなどの一部としての核酸の構築を含む様々な送達系は公知であり、用いることができる。導入方法として、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。別の実施形態では、ワクチンは、例えば、限定はされないがインビボエレクトロポレーションを含むエレクトロポレーション技術を用いるＤＮＡワクチンとして投与され得る。組成物は、任意の便宜的な経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を通じた吸収により投与してもよく、また限定はされないが小分子抗ウイルス性組成物を含む他の生物活性剤とともに投与してもよい。投与は、全身性又は局所性であり得る。経肺投与はまた、例えば、吸入器又は噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤との調合により用いることができる。さらに別の実施形態では、組成物は、徐放システムにおいて送達され得る。

【0215】

本発明はまた、医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容できる担体を治療有効量で含む。用語「薬学的に許容できる」は、本明細書で使用されるとき、動物、より詳細にはヒトで使用するため、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって認可されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方において収載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を指す。かかる薬学的担体は、滅菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用に、液体担体として使用することができる。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、坐剤として、従来型の結合剤及びトリグリセリドなどの担体と配合することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準担体を含み得る。一実施形態では、医薬組成物は、患者に対する適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の抗体又はその抗原結合断片を、適量の担体とともに、好ましくは精製形態で含有する。製剤は、投与方法に適合させるべきである。

【0216】

典型的には、抗体治療薬においては、患者に投与される用量は、患者の体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。

【実施例】

【0217】

実施例１ メモリーＢ細胞から単離したヒトモノクローナル抗体の構築及び最適化
ＣＤ２２＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞を、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６ Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／ＦＬＡ／０６）及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／ＢＮＥ／０８）の双方に対する高い中和力価について選択した、ドナーの凍結保存した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から選別し、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド２００６及び支持細胞を用いて３細胞／ウェルで不死化した。抗体を含有する培養上清を１４日後に採取し、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ Ｂ型インフルエンザ系統の双方からウイルスを中和することができる抗体クローンを同定するため、読み出しとしてノイラミニダーゼ活性（ＮＡ）を用いる前述の促進的なウイルス阻害アッセイから改良したマイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）によりスクリーニングした（Ｈａｓｓａｎｔｏｕｆｉｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｖａｃｃｉｎｅ．２８：７９０－７）。

【0218】

つまり、１０μｌの培養上清を、４００ＴＣＩＤ_５０のインフルエンザＢ／ＢＮＥ／０８（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）又はＢ／ＦＬＡ／０６（Ｙａｍａｇａｔａ系統）とともに３７℃で１時間インキュベートした。Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をプレートに添加し（２０，０００細胞／ウェル）、４時間インキュベートし、ＴＰＣＫ－トリプシンを含有する培地で２回洗浄し、次に３７℃で２日間インキュベートした。インキュベーション後、蛍光標識基質としてメチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ΜＵ－ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を２５μｌ／ウェル（１０μＭ）で添加することによりＮＡ活性を測定し、プレートを蛍光光度計で読み取った。

【0219】

３つのＢ細胞クローン（ＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、及びＦＢＤ－９４）が、Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ系統の双方に対して中和活性を有することが見出された。これらのクローンのＶＨ及びＶＬ遺伝子を配列決定し、ＩｇＧ１発現ベクターにクローン化した。組換え抗体を、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する哺乳類細胞株への一過性遺伝子導入により産生した。遺伝子導入細胞からの上清を培養の７～１０日後に採取し、抗体（ＩｇＧ）をプロテインＡクロマトグラフィーにより親和性精製し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した。

【0220】

ヒト抗体生殖系列配列のデータベースに対してｍＡｂ配列を整列させるため、Ｉｇ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた。直近の生殖系列鋳型におけるＶＨ及びＶＬの遺伝子領域の各々について同定した（表６）。非生殖系列化（ｎｏｎ－ｇｅｒｍｌｉｎｅｄ）アミノ酸を、これらの参照配列に対して整列することにより同定した。

【0221】

【表6】

【0222】

ＦＢＣ－３９変異体の構築
ＦＢＣ－３９抗体ＶＬでは、軽鎖内の位置８７にわずか１つの非生殖系列フレームワーク残基：Ｆが存在したが、ここで生殖系列化アミノ酸は、Ｋａｂａｔによる付番によるとＹ（すなわちＬ８７Ｆ（Ｙ））である（ＩＭＧＴ付番では位置１０３）。生殖系列化配列は、本明細書中でＦＢＣ－３９－Ｌ８７Ｙと称する。非生殖系列化配列は、ＦＢＣ－３９－Ｌ８７Ｆと称する。

【0223】

ＦＢＣ－３９抗体ＶＨでは、１１のＫａｂａｔ定義の非生殖系列化フレームワーク残基、すなわち、Ｋａｂａｔによる付番によると、Ｈ６Ｖ（Ｅ）、Ｈ２７Ｌ（Ｆ）、Ｈ２８Ｓ（Ｔ）、Ｈ３０Ｌ（Ｓ）、Ｈ６８Ｓ（Ｔ）、Ｈ７７Ｍ（Ｔ）、Ｈ７９Ｆ（Ｙ）、Ｈ８１Ｈ（Ｑ）、Ｈ８２ａＳ（Ｎ）、Ｈ８３Ｒ（Ｋ）、及びＨ９３Ａ（Ｔ）が存在する。フレームワーク残基のＩＭＧＴ定義を用いる場合、７つの非生殖系列化残基：Ｈ６Ｖ（Ｅ）、Ｈ７７Ｓ（Ｔ）、Ｈ８６Ｍ（Ｔ）、Ｈ８８Ｆ（Ｙ）、Ｈ９０Ｈ（Ｑ）、Ｈ９２Ｓ（Ｎ）、及びＨ９５Ｒ（Ｋ）が存在する。

【0224】

変異体は、全部で１２のＫａｂａｔ定義の非生殖系列化フレームワーク残基が生殖系列アミノ酸に復帰されるように構築した。この抗体構築物は、Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに対する中和活性及び適用範囲における有意な低下を示し、これは１つ若しくは複数の非生殖系列残基の１つ以上が活性において重要であることを意味する。

【0225】

位置Ｈ２７、Ｈ２８、及びＨ３０に位置する非生殖系列化フレームワーク残基の３つは、ＩＭＧＴ系によりＨＣＤＲ－１の一部と考えられるが、Ｋａｂａｔ系によりＶＨフレームワーク１と定義される領域内に存在する。抗体変異体は、すべてのＫａｂａｔ定義の非生殖系列化フレームワークアミノ酸をそれらの各々の生殖系列残基に、これらの３つの位置：Ｈ２７Ｌ（Ｆ）、Ｈ２８Ｓ（Ｔ）、Ｈ３０Ｌ（Ｓ）（生殖系列残基と非生殖系列残基との間での「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅｄ）」）を例外として復帰することにより作製し、７つの重鎖変異体：ＦＢＣ－３９ＬＳＬ、ＦＢＣ－３９ＦＳＬ；ＦＢＣ－３９ＬＴＬ；ＦＢＣ－３９ＦＴＬ；ＦＢＣ－３９－ＦＳＳ；ＦＢＣ－３９－ＬＴＳ；ＦＢＣ－３９－ＦＴＳ（生殖系列残基は下線が引かれている）を、ＦＢＣ－３９ＦＴＳが３つの生殖系列化アミノ酸を有し、且つＦＢＣ－３９ＬＳＬが位置Ｈ２７、Ｈ２８、及びＨ３０に３つの野生型残基を有するように作製した。

【0226】

加えて、Ｈ８２での生殖系列残基Ｎ（Ｈ９２ＩＭＧＴ）は、ＶＨ内に有望な脱アミド部位（ＮＳ）を創出した。その結果、これは、７つ全部の変異体、ＦＢＣ－３９ＬＳＬ、ＦＢＣ－３９ＦＳＬ、ＦＢＣ－３９ＬＴＬ、ＦＢＣ－３９ＦＴＬ、ＦＢＣ－３９－ＦＳＳ、ＦＢＣ－３９－ＬＴＳ、及びＦＢＣ－３９－ＦＴＳにおいて、ＦＢＣ－３９の野生型Ｓと置換された。加えて、ＦＢＣ－３９変異体の７つ全部は、ＦＢＣ－３９軽鎖とは１つのアミノ酸だけ異なる、同じ軽鎖配列（ＦＢＣ－３９－Ｌ８７Ｙ）を共有する。

【0227】

得られた抗体変異体を、上記のように発現し、精製し、さらに特徴づけた。

【0228】

実施例２．単離された抗ＨＡ抗体は両方のＢ型インフルエンザＨＡ系統に結合する
単離された抗体の結合性及び交差反応性を判定するため、ＨＡ ＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施した。３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中のＹａｍａｇａｔａ系統株Ｂ／ＦＬＡ／０６又はＶｉｃｔｏｒｉａ系統株Ｂ／ＢＮＥ／０８由来の０．５μｇ／ｍｌの組換えＨＡで、４℃で一晩コーティングした。コーティングされていないタンパク質を除去するため、プレートを、０．１％ｖ／ｖツイーン－２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１％（ｗ／ｖ）カゼインを含有するブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間添加した。ブロッキング溶液を廃棄し、抗ＨＡ抗体（ＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、及びＦＢＤ－９４）の各々に対するＰＢＳ中の３倍連続希釈物を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、結合した抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて検出した。抗体結合活性を、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加後に化学発光シグナルを測定するか、又は１つの成分の基質としてのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ及びＰｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＫＰＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）とインキュベート後、２Ｎ硫酸の添加により反応を停止させた後、４５０ｎｍでの色変化を測定することにより、算出した。

【0229】

【表7】

【0230】

表７は、３つの独立実験から得た平均ＥＣ_５０を示す。３つすべての抗ＨＡ ＩｇＧ（ＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６及びＦＢＤ－９４）は、両方のＢ型インフルエンザ系統からの組換えＨＡに結合した。同様のＥＣ_５０値が、Ｙａｍａｇａｔａ（Ｂ／ＦＬ／０６）ＨＡに対する３つすべての抗体間で認められた。Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｂ／ＢＮＥ／０８）の場合、ＦＢＤ－５６又はＦＢＣ－３９のいずれかよりもＦＢＤ－９４に対してＥＣ_５０の低下が認められた。

【0231】

７つのＦＢＣ－３９抗体の生殖系列化変異体の結合活性について、ＥＬＩＳＡにより試験した。表８は、未精製抗ＨＡ ＦＢＣ－３９ ＩｇＧ変異体の結合性の結果を示し、ここでＦＢＣ－３９ ＦＴＳは、Ｋａｂａｔ定義のフレームワーク生殖系列化アミノ酸を有し、且つＦＢＣ－３９ ＬＳＬは、位置Ｈ２７、Ｈ２８、及びＨ３０（Ｋａｂａｔ付番）での野生型残基を除くＫａｂａｔ定義のフレームワーク生殖系列化アミノ酸を有する。これらの結果は、すべての変異体がＹａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／ＦＬ／０６）ＨＡタンパク質に結合したが、位置Ｈ３０にＳ残基を有する変異体がＶｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／ＢＮＥ／０８）ＨＡタンパク質への結合親和性を失ったことを示す。ＦＢＣ－３９ＬＳＬ、ＦＳＬ、ＬＴＬ、及びＦＴＬの４つの変異体が、両系統からのＨＡタンパク質に対するＦＢＣ－３９と同等の又はＦＢＣ－３９より優れた結合親和性を示した。

【0232】

【表8】

【0233】

実施例３．２つの異なる系統由来のウイルスに対する抗Ｂ型インフルエンザＨＡ ＩｇＧのインビトロでの交差反応中和活性
精製されたｍＡｂ活性について試験するため、実施例１に記載のように、類似のマイクロ中和アッセイを用いた。つまり、ＭＤＣＫ細胞を、抗生物質、グルタミン（完全ＭＥＭ培地）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。６０ＴＣＩＤ_５０（５０％の組織培養感染用量）のウイルスを、室温で３０分のインキュベーション後、二連ウェルで、０．７５ｕｇ／ｍｌのＴＰＣＫで処理したトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有する完全ＭＥＭ培地中、３８４ウェルプレート内の３倍希釈した抗体に添加し、２×１０^４個の細胞／ウェルをプレートに添加した。３３℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで約４０時間のインキュベーション後、ＮＡ活性を蛍光標識基質のメチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチルノイラミン酸（Μ－ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加することにより測定し、３７℃で１時間インキュベートした。ＮＡ活性によって表されるウイルス複製は、以下の設定、すなわち、励起３５５ｎｍ、放射４６０ｎｍ；１０フラッシュ／ウェルを用いてのＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光を読み取ることにより定量化した。中和力価（５０％阻害濃度［ＩＣ_５０］）は、蛍光シグナルを細胞対照ウェルと比べて５０％低下させた最終抗体濃度として表す。表９で用いるＢ型インフルエンザウイルス株は、以下に挙げる通り、すなわち、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；Ｂ／ＡＡ／６６（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）；Ｂ／ＨＫ／７２（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５／７２）；Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（ｖｉｃｔｏｒｉａ））、Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＢＮＥ／０８（ｃａ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＡＡ／９４（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／２／９４（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＹＳＩ／９８（ｃａ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＪＨＢ／９９（ｃａ Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＳＣ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＦＬ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ｙａｍａｇａｔａ））である。

【0234】

【表9】

【0235】

表９は、２つの独立実験からの平均ＩＣ_５０を示す。抗ＨＡ抗体は、試験したすべてのＢ型インフルエンザウイルスを中和した。ＦＢＤ－５６及びＦＢＤ－９４は、ＦＢＣ－３９より強力であったが、Ｂ／ＡＡ／９４株に対する活性の一部の低下を示した。ＦＢＣ－３９変異体、ＬＳＬ、ＦＳＬ、ＬＴＬ、及びＦＴＬは、すべてのウイルスをＦＢＣ－３９と同等の又はＦＢＣ－３９より低いＩＣ_５０まで中和した。

【0236】

実施例４．Ａ型インフルエンザＨ９ウイルス株の結合及び中和
ＨＡ結合ＥＬＩＳＡを、３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中、３μｇ／ｍｌのＡ型インフルエンザのサブタイプＨ９（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＨＫ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２））由来の組換えＨＡで、室温で２時間コーティングしたことを除き、実施例２などと同様の方法で実施した。その結果によると、ＦＢＣ－３９、及び生殖系列化変異体ＬＴＬが各々、６．２及び６．３μｇ／ｍｌの類似のＥＣ_５０値でＨ９ ＨＡに結合し、またＦＢＣ－３９ＬＳＬ及びＦＴＬが各々、４１．７及び４６．１μｇ／ｍｌのより高いＥＣ_５０で結合することが示された（表１０）。それに対して、ＦＢＣ－３９ＦＳＬは試験した最高用量の５０μｇ／ｍｌでも弱く結合したにすぎず、またＦＢＤ－５６及びＦＢＤ－９４では結合が見られなかった。

【0237】

【表10】

【0238】

Ａ型インフルエンザＨ９ ＨＡタンパク質の結合性が機能的に適切であることを確認するため、マイクロ中和アッセイを実施例３に記載と同様の方法を用いて実施した。このアッセイにおいては、低温に適応した（ｃａ）弱毒生インフルエンザワクチンウイルスを、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３０６：１８－２４）による記載と同様の方法を用いて、ｃａ Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ウイルスの６つの内部タンパク質遺伝子と関連した、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）ウイルス由来のウイルスＨＡ及びＮＡ遺伝子を有するように、逆遺伝学により作製した。マイクロ中和アッセイの結果を表１０に示す。結合特性と一致して、ＦＢＣ－３９及び変異体は、生物学的に適切なＩＣ_５０値でＨ９Ｎ２ウイルスを潜在的に中和した。ＦＢＣ－３９及びＦＢＣ－３９ ＬＴＬは各々、０．１７及び０．０９μｇ／ｍｌのＩＣ_５０値で最も強力な活性を有した。想定通り、ＦＢＤ－５６、ＦＢＤ－９４、及び対照抗体は、試験した最高濃度（５０μｇ／ｍｌ）で中和活性を全く示さなかった。

【0239】

実施例５．モノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）の選択によるエピトープの同定
Ｙａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６；Ｂ／ＦＬＡ／０６）及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｍａｌｙａｓｉａ／２５０６／２００４；Ｂ／ＭＹ／０４）を、ウイルス及び抗体の混合物を、１０×９６ウェルプレート内、３０，０００ＴＣＩＤ５０／ウェルでＭＤＣＫ細胞に吸着させ、ＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、及びＦＢＤ－９４（１０×ＩＣ_５０）の存在下で培養する前の１時間、高濃度のＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、及びＦＢＤ－９４（１２５×ＩＣ_５０）とともにインキュベートした。感染後の最大で３日、感染細胞上で細胞変性効果（ＣＰＥ）を呈する推定上のＭＡＲＭを単離した。ＨＡ遺伝子をＲＴ－ＰＣＲにより増幅し、その後配列決定し、次いで単離したウイルスにおける耐性をマイクロ中和アッセイにより確認した。ＭＡＲＭは、ＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、又はＦＢＤ－９４の存在下で培養した時、Ｂ／ＦＬＡ／０９ウイルスから全く単離されなかった。Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／ＭＹ／０４）ウイルスを用いた時、ＦＢＤ－５６及びＦＢＤ－９４の存在下であるがＦＢＣ－３９の不在下で、ＭＡＲＭを単離した。配列分析によると、２つのＦＢＤ－５６ ＭＡＲＭが位置１２８でグルタミン酸（Ｅ）からリジン（Ｋ）へ又はバリン（Ｖ）への単一アミノ酸置換を有することが示された（表１１）。ＦＢＤ－９４ ＭＡＲＭは、位置１２８でＥからＫへの単一アミノ酸置換を有した（表１１）。位置１４１でグリシン（Ｇ）からＥへの単一アミノ酸置換を有するＹａｍａｇａｔａ系統Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６の変異体（Ｂ／ＦＬＡ／０６ Ｇ１４１Ｅ）は、野生型ウイルス（Ｂ／ＦＬＡ／０６）と比べて、ＦＢＣ－３９の中和において８倍の低下を与えた。このＢ／ＦＬＡ／０９ Ｇ１４１Ｅ変異体及びＹａｍａｇａｔａ系統ウイルスＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３（Ｂ／ＪＩＮ／０３）、位置１４１にＲを有する（Ｇ１４１Ｒ）天然に循環するウイルスを用いて、ＭＡＲＭの単離をＦＢＣ－３９ ｍＡｂのみを用いて繰り返した。１つのＭＡＲＭウイルスを、位置２３５でのＧからアルギニン（Ｒ）への単一アミノ酸変化を伴うＢ／ＦＬＡ／０９Ｇ１４１Ｅウイルスを用いて単離した（表１１）。２つのＢ／ＪＩＮ／０３エスケープ突然変異体ウイルスを各々、位置１５０でのセリン（Ｓ）からイソロイシン（Ｉ）へ、又は位置２３５でのＥからロイシン（Ｌ）への単一アミノ酸置換とともに同定した（表１１）。これらのＢ型インフルエンザＭＡＲＭにおいて同定されたアミノ酸置換はＨＡの頭部領域内に位置し（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（６）：３０１１－２０）、これはＦＢＣ－３９、ＦＢＤ－５６、及びＦＢＤ－９４がＢ型インフルエンザウイルスのＨＡ頭部上のエピトープを認識するとともに、ＦＢＤ－５６及びＦＢＤ－９４が位置１２８に重要な接触を有し且つ重複エピトープを共有し、またＦＢＣ－３９が位置１４１、１５０、及び２３５に重要な接触残基を伴う立体構造的エピトープを有することが示唆される。

【0240】

【表11】

【0241】

実施例６．Ｂ型インフルエンザ抗ＨＡ抗体はＦｃエフェクター機能を呈する
抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用、及び補体依存性殺滅などのＦｃ－エフェクター機能を通じてウイルス感染細胞を排除する可能性を有する。抗ＨＡ抗体がＡＤＣＣ活性を呈したことを確認するため、我々は、ＡＤＣＣバイオアッセイを用いてＢ型インフルエンザウイルスの存在下でＮＫ細胞を活性化するその能力を試験した。このアッセイでは、Ｆｃエフェクター活性化を測定するため、ＮＦＡＴプロモーターの制御下でヒトＦｃｇＩＩＩＡ高親和性受容体及びルシフェラーゼ導入遺伝子を安定に遺伝子導入しているヒトＮＫ細胞株（ＮＫ９２）を用いる。９６ウェルプレートを、５．０×１０^４のＴＣＩＤ５０／ウェルのＢ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）ウイルスストックでコーティングした。連続希釈したＦＢＤ－９４、ＦＢＣ－３９並びにＦｃ領域内に２つの置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するＦｃエフェクターヌル変異体（ＦＢＤ－９４ＬＡＬＡ及びＦＢＣ－３９ＬＡＬＡ）（Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２４）：１２１６１）をウイルスに適用し、次にＮＫ細胞を５．０×１０^４個の細胞／ウェルで添加し、３７℃で４時間インキュベートした。ルシフェラーゼをＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加により検出し、エンビジョンプレートリーダーにより測定した。図１は、ＦＢＤ－９４及びＦＢＣ－３９の双方が用量依存性のＢ型インフルエンザのＡＤＣＣ活性を呈した一方で、ＬＡＬＡ変異体が同じ濃度で活性を示さなかったことを示す。

【0242】

実施例７．インフルエンザ感染の致死マウスモデルにおける抗Ｂ型インフルエンザＩｇＧのインビボでの予防及び治療効果
Ｂ型インフルエンザを中和するモノクローナル抗体の保護的有効性を、致死Ｂ型インフルエンザマウスモデルにおいて評価した。

【0243】

予防活性（図２Ａ～Ｄ）：予防的有効性を試験するため、６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）マウスの８つの群に、ＦＢＣ－３９又はＦＢＤ－９４抗体のいずれかの単回腹腔内（ＩＰ）注射を、１００μｌの容量、３、１、０．３、又は０．１ｍｇ／ｋｇの用量で施した。各試験においては、対照動物群に対して、１００μｌの容量、３ｍｇ／ｋｇでのヒトアイソタイプ非関連対照ＩｇＧを用いてＩＰ治療を行った。投与の４時間後、マウスの鼻腔内に、１５倍の５０パーセントマウス致死量（１５ＭＬＤ_５０）のＢ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（Ｙａｍａｇａｔａ）（Ｂ／Ｓｉｃ／９９）又は１０ＭＬＤ_５０のＢ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｂ／ＨＫ／０１）を５０μｌの容量で接種した。マウスを、ウイルス負荷の日に秤量し、体重減少及び生存について１４日間毎日監視した（体重減少≧２５％のマウスを安楽死させた）。ＦＢＣ－３９及びＦＢＤ－９４ ｍＡｂの双方は、用量依存性に保護を与えた。０．３ｍｇ／ｋｇ以上でのＦＢＣ－３９及びＦＢＤ－９４は、Ｂ／Ｓｉｃ／９９（図２Ａ及びＢ）及びＢ／ＨＫ／０１（図２Ｃ及びＤ）を負荷した動物に９０％～１００％の保護を供した。０．１ｍｇ／ｋｇのより低用量でのＦＢＣ－３９及びＦＢＤ９４もまた、各々の生存率が９０％及び８０％で、Ｂ／ＨＫ／０１に対して高度に保護的であった。予想通り、アイソタイプ対照ｍＡｂを３若しくは３０ｍｇ／ｋｇで受けたマウスの中で、Ｂ／Ｓｉｃ／９９又はＢ／ＨＫ／０１の負荷で各々生存したものはなかった。

【0244】

治療活性（図３Ａ～Ｄ並びに図４Ａ及びＢ）：抗体の治療効果を評価するため、マウスに１０ＭＬＤ_５０のＢ／Ｓｉｃ／９９（Ｙａｍａｇａｔａ）又は５ＭＬＤ_５０のＢ／ＨＫ／０１（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を接種し、感染後（ｐｉ）の２日目、１０、３、１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのＦＢＣ－３９又はＦＢＤ－９４を注射した。ＦＢＣ－３９及びＦＢＤ－９４は、１ｍｇ／ｋｇ以上で投与した時、Ｂ／Ｓｉｃ／９９を負荷した動物に完全な保護を供した（図３Ａ及びＢ）。Ｂ／ＨＫ／０１の感染においては、ＦＢＣ－３９及びＦＢＤ－９４は、０．３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ超の用量で、完全な保護を供した（図３Ｃ及びＤ）。予想通り、１０又は３０ｍｇ／ｋｇで投与したアイソタイプ対照ｍＡｂは、Ｂ／Ｓｉｃ／９９及びＢ／ＨＫ／０１感染に対する生存率が各々１０％又は２０％で、マウスを保護できなかった。

【0245】

Ｂ型インフルエンザ抗体が経時的に保護する能力を試験するため、マウスに５ＭＬＤ_５０のＢ／ＨＫ／０１を接種し、３ｍｇ／ｋｇのＦＢＣ－３９又はＦＢＤ－９４をＩＰ注射した（感染後の１、２、３、又は４日目に開始した）。ＦＢＣ－３９は、感染後の１日目に投与した時にマウスの１００％、また感染後の２日目及び３日目に各々８０％及び７０％を保護した（図４Ａ）。ＦＢＤ－９４は、感染後の１日目及び２日目に投与した時にマウスの１００％、また感染後の３日目及び４日目に各々８０％及び６０％を保護した（図４Ｂ）。予想通り、同じ用量の非関連アイソタイプ対照抗体で治療したマウスは、生存率が１０％で、マウスを保護することができなかった。

【0246】

実施例８．赤血球凝集阻害活性
本発明の抗体のＢ型インフルエンザ抗体の機能性について考えられる作用機序を判定するため、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを、Ｂ型インフルエンザウイルス株の多様な群を用いて実施した。ＨＡＩアッセイでは、細胞表面に発現されるシアル酸のウイルス受容体での会合を遮断する抗体を、ウイルス媒介性の赤血球凝集の阻害を測定することにより検出する。Ｂ型インフルエンザウイルス（下記の表１２のように略記）を、抗体の不在下での０．０５％シチメンチョウ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションにより決定した４ＨＡ単位に調整した。９６ウェルＵ底プレート内で、ＦＢＤ－９４及びＦＢＣ－３９ ＩｇＧを２倍増加で連続希釈し、希釈したウイルスをウェルに添加した。３０～６０分のインキュベーション後、５０ｕｌの０．０５％シチメンチョウ赤血球を添加した。プレートをさらに３０～６０分間インキュベートし、凝集について観察した。ＨＡＩ力価は、凝集を完全に阻害する抗体の最低有効濃度（ｎＭ）であるように決定した。表１２は、ＦＢＤ－９４及びＦＢＣ３９が試験したすべてのＢ型インフルエンザ株に対してＨＡＩ活性を有したことを示し、Ｂ型インフルエンザＨＡの球状頭部への結合の証拠を提供している。本発明の他の抗体は、ＨＡＩアッセイを用いると、同様の活性を示す。

【0247】

【表12】

【0248】

本願に記載のすべての出版物、特許及び特許出願は、個別の出版物、特許又は特許出願の各々が参照により本明細書に援用されるように詳細且つ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明は以下の態様も提供する。
１．Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、単離された抗体又はその抗原結合断片。
２．前記抗体が、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、上記１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
３．前記抗体又はその抗原結合断片が、Ｂ／ＡＡ／９４（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／２／９４（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＹＳＩ／９８（ｃａ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＪＨＢ／９９（ｃａ Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＳＣ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＦＬ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ｙａｍａｇａｔａ））から選択されるＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（ｖｉｃｔｏｒｉａ））、Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＢＮＥ／０８（ｃａ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（ｖｉｃｔｏｒｉａ））から選択されるＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；Ｂ／ＡＡ／６６（ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）；Ｂ／ＨＫ／７２（Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５／７２）から選択される分岐前のＢ型インフルエンザ株；及びこれらの組み合わせに結合する能力がある、上記１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
４．前記抗体又は抗原結合断片が、抗体の約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ _５０ でＢ型インフルエンザウイルスに結合する、上記１～３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
５．前記抗体又は抗原結合断片が、マイクロ中和アッセイにおけるＢ型インフルエンザウイルスの中和における、抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内の５０％阻害濃度（ＩＣ _５０ μｇ／ｍｌ）として表される中和効力を有する、上記１～４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
６．前記抗体がＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合する能力がある、上記１～５のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
７．前記抗体がＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ１又はサブタイプ２のヘマグルチニンに結合する能力がある、上記６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
８．前記抗体が、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６及びそれらの変異体から選択されるＡ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプに結合する能力がある、上記６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
９．前記抗体がＡ型インフルエンザウイルスグループ１のサブタイプＨ９に結合する能力がある、上記６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
１０．Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス又は少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス及び少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和する能力がある、単離された抗体又はその抗原結合断片。
１１．前記抗体又は抗原結合断片が、抗体の約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ _５０ でＡ型インフルエンザＨＡに結合する、上記６～１０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１２．前記抗体又は抗原結合断片が、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和において、抗体の約０．０１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌの範囲内でのＩＣ _５０ を有する、上記６～１０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１３．前記抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ－１、配列番号４のＨＣＤＲ－２、配列番号５のＨＣＤＲ－３、配列番号８のＬＣＤＲ－１、配列番号９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０のＬＣＤＲ－３；
（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ－１、配列番号１４のＨＣＤＲ－２、配列番号１５のＨＣＤＲ－３、配列番号１８のＬＣＤＲ－１、配列番号１９のＬＣＤＲ－２、配列番号２０のＬＣＤＲ－３；
（ｃ）配列番号２３のＨＣＤＲ－１、配列番号２４のＨＣＤＲ－２、配列番号２５のＨＣＤＲ－３、配列番号２８のＬＣＤＲ－１、配列番号２９のＬＣＤＲ－２及び配列番号３０のＬＣＤＲ－３；
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ－１、配列番号３４のＨＣＤＲ－２、配列番号３５のＨＣＤＲ－３、配列番号３８のＬＣＤＲ－１、配列番号３９のＬＣＤＲ－２及び配列番号４０のＬＣＤＲ－３；
（ｅ）配列番号４３のＨＣＤＲ－１、配列番号４４のＨＣＤＲ－２、配列番号４５のＨＣＤＲ－３、配列番号４８のＬＣＤＲ－１、配列番号４９のＬＣＤＲ－２及び配列番号５０のＬＣＤＲ－３；
（ｆ）配列番号５３のＨＣＤＲ－１、配列番号５４のＨＣＤＲ－２、配列番号５５のＨＣＤＲ－３、配列番号５８のＬＣＤＲ－１、配列番号５９のＬＣＤＲ－２及び配列番号６０のＬＣＤＲ－３；
（ｇ）配列番号６３のＨＣＤＲ－１、配列番号６４のＨＣＤＲ－２、配列番号６５のＨＣＤＲ－３、配列番号６８のＬＣＤＲ－１、配列番号６９のＬＣＤＲ－２及び配列番号７０のＬＣＤＲ－３
（ｈ）配列番号７５のＨＣＤＲ－１、配列番号７６のＨＣＤＲ－２、配列番号７７のＨＣＤＲ－３、配列番号８３のＬＣＤＲ－１、配列番号８４のＬＣＤＲ－２及び配列番号８５のＬＣＤＲ－３；
（ｉ）配列番号９１のＨＣＤＲ－１、配列番号９２のＨＣＤＲ－２、配列番号９３のＨＣＤＲ－３、配列番号９９のＬＣＤＲ－１、配列番号１００のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０１のＬＣＤＲ－３；
（ｊ）配列番号１０７のＨＣＤＲ－１、配列番号１０８のＨＣＤＲ－２、配列番号１０９のＨＣＤＲ－３、配列番号１１５のＬＣＤＲ－１、配列番号１１６のＬＣＤＲ－２及び配列番号１１７のＬＣＤＲ－３；
（ｋ）配列番号１２１のＨＣＤＲ－１、配列番号１２２のＨＣＤＲ－２、配列番号１２３のＨＣＤＲ－３、配列番号１２４のＬＣＤＲ－１、配列番号１２５のＬＣＤＲ－２及び配列番号１２６のＬＣＤＲ－３；
（ｌ）配列番号１２７のＨＣＤＲ－１、配列番号１２８のＨＣＤＲ－２、配列番号１２９のＨＣＤＲ－３、配列番号１３０のＬＣＤＲ－１、配列番号１３１のＬＣＤＲ－２及び配列番号１３２のＬＣＤＲ－３；
（ｍ）配列番号１３３のＨＣＤＲ－１、配列番号１３４のＨＣＤＲ－２、配列番号１３５のＨＣＤＲ－３、配列番号１３６のＬＣＤＲ－１、配列番号１３７のＬＣＤＲ－２及び配列番号１３８のＬＣＤＲ－３；
（ｎ）配列番号１３９のＨＣＤＲ－１、配列番号１４０のＨＣＤＲ－２、配列番号１４１のＨＣＤＲ－３、配列番号１４２のＬＣＤＲ－１、配列番号１４３のＬＣＤＲ－２及び配列番号１４４のＬＣＤＲ－３；
（ｏ）配列番号１４５のＨＣＤＲ－１、配列番号１４６のＨＣＤＲ－２、配列番号１４７のＨＣＤＲ－３、配列番号１４８のＬＣＤＲ－１、配列番号１４９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１５０のＬＣＤＲ－３；
（ｐ）配列番号７８のＨＣＤＲ－１、配列番号７９のＨＣＤＲ－２、配列番号８０のＨＣＤＲ－３、配列番号８６のＬＣＤＲ－１、配列番号８７のＬＣＤＲ－２及び配列番号８８のＬＣＤＲ－３；
（ｑ）配列番号９４のＨＣＤＲ－１、配列番号９５のＨＣＤＲ－２、配列番号９６のＨＣＤＲ－３、配列番号１０２のＬＣＤＲ－１、配列番号１０３のＬＣＤＲ－２及び配列番号１０４のＬＣＤＲ－３；
（ｒ）配列番号１１０のＨＣＤＲ－１、配列番号１１１のＨＣＤＲ－２、配列番号１１２のＨＣＤＲ－３、配列番号１１８のＬＣＤＲ－１、配列番号１１９のＬＣＤＲ－２及び配列番号１２０のＬＣＤＲ－３；及び
（ｓ）１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む（ａ）～（ｒ）のいずれか１つに記載の６つのＣＤＲセット
から選択される、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、ＨＣＤＲ－３、ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３を含む、上記１～１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１４．
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から選択されるＶＨ及び／又はＶＬに対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及び／又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＬを含む、上記１～１３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１５．
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、上記１～１４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１６．Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力があり、配列番号７１のＶＨアミノ酸配列及び配列番号７２のＶＬアミノ酸配列を含み、ここで配列番号７１のＸａａ _１ はＶａｌ又はＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ _２ はＬｅｕ又はＰｈｅであり；配列番号７１のＸａａ _３ はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _４ はＬｅｕ又はＳｅｒであり；配列番号７１のＸａａ _５ はＳｅｒ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _６ はＭｅｔ又はＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _７ はＰｈｅ又はＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ _８ はＨｉｓ又はＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ _９ はＳｅｒ又はＡｓｎであり；配列番号７１のＸａａ _１０ はＡｒｇ又はＬｙｓであり；且つ配列番号７１のＸａａ _１１ はＡｌａ又はＴｈｒであり；ここで配列番号７２のＸａａ _１ はＰｈｅ又はＴｙｒである、抗体又はその抗原結合断片。
１７．配列番号７１のＸａａ _９ がＳｅｒである、上記１６に記載の抗体又はその抗原結合断片。
１８．配列番号７１のＸａａ _４ がＬｅｕである、上記１６に記載の抗体又はその抗原結合断片。
１９．配列番号７１のＸａａ _１ がＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ _５ がＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _６ がＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _７ がＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ _８ がＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ _１０ がＬｙｓであり；配列番号７１のＸａａ _１１ がＴｈｒであり、又はその組み合わせである、上記６～８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
２０．配列番号７１のＸａａ _１ がＧｌｕであり；配列番号７１のＸａａ _５ がＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _６ がＴｈｒであり；配列番号７１のＸａａ _７ がＴｙｒであり；配列番号７１のＸａａ _８ がＧｌｎであり；配列番号７１のＸａａ _９ がＳｅｒであり；配列番号７１のＸａａ _１０ がＬｙｓであり；且つ配列番号７１のＸａａ _１１ がＴｈｒである、上記６～９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
２１．抗体又は抗原結合断片が、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単独ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、及び二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体からなる群から選択される、上記１～２０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
２２．Ｆｃ領域を含む、上記１～２１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
２３．前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４又はその断片である、上記１～２２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
２４．Ｂ型インフルエンザウイルスに結合し、且つＢ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統を中和する能力があり、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統の中で保存されるエピトープに結合する、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその抗原結合断片。
２５．前記エピトープの１つ以上の接触残基がＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域内に位置する、上記２４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
２６．前記エピトープが、接触残基としてＨＡの前記頭部領域の前記配列の１２８、１４１、１５０及び２３５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、上記２４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
２７．上記１～２６のいずれかに記載の抗体と同じエピトープに結合するか又はＢ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合に対して前記抗体と競合する、Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに結合し、且つ２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する抗体又はその抗原結合断片。
２８．
（ａ）配列番号２のＶＨ及び配列番号７のＶＬ、
（ｂ）配列番号１２のＶＨ及び配列番号１７のＶＬ、
（ｃ）配列番号２２のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
（ｄ）配列番号３２のＶＨ及び配列番号３７のＶＬ、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ及び配列番号４７のＶＬ、
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
（ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
（ｈ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
（ｉ）配列番号９０のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、並びに
（ｊ）配列番号１０６のＶＨ及び配列番号１１４のＶＬ
から選択されるアミノ酸配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか又はＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合に対して前記抗体と競合する、上記２７に記載の抗体又はその抗原結合断片。
２９．上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸。
３０．上記２９に記載の単離核酸を含むベクター。
３１．上記２９に記載の核酸又は上記３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
３２．上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製するための方法であって、上記３１に記載の宿主細胞を、前記抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
３３．前記宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップをさらに含む、上記３２に記載の方法。
３４．上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
３５．上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、並びに２５ｍＭ Ｈｉｓ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌをｐＨ６．０で含む組成物。
３６．被験体におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための、上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
３７．被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療における使用のための、上記１～２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
３８．被験者におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の製造における、上記１～２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
３９．被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の製造における、上記１～２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
４０．被験体におけるＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の有効量を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
４１．被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、上記１～２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を有効量で前記被験者に投与するステップを含む、方法。
４２．被験体におけるＢ型インフルエンザ感染のインビトロ診断における、上記１～２８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片の使用。

【0249】

配列表情報
配列番号１（ＦＢＤ－５６ ＶＨ ＤＮＡ）

【化1】

配列番号２（ＦＢＤ－５６ ＶＨタンパク質）

【化2】

配列番号３（ＦＢＤ－５６ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＤＹＡＭＮ
配列番号４（ＦＢＤ－５６ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＶＩＳＷＤＳＧＲＩＧＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号５（ＦＢＤ－５６ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＭＬＡＹＹＳＤＮＳＧＫＫＹＮＶＹＧＭＤＶ
配列番号６（ＦＢＤ－５６ ＶＬ ＤＮＡ）

【化3】

配列番号７（ＦＢＤ－５６ ＶＬタンパク質）

【化4】

配列番号８（ＦＢＤ－５６ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＡＳＱＳＶＳＴＦＬＡ
配列番号９（ＦＢＤ－５６ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＤＡＳＮＲＡＴ
配列番号１０（ＦＢＤ－５６ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＲＳＨＷＰＰＩ
配列番号１１（ＦＢＤ－９４ ＶＨ ＤＮＡ）

【化5】

配列番号１２（ＦＢＤ－９４ ＶＨタンパク質）

【化6】

配列番号１３（ＦＢＤ－９４ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＤＹＡＩＮ
配列番号１４（ＦＢＤ－９４ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＩＩＳＷＤＳＧＲＩＧＹＡＤＳＶＲＧ
配列番号１５（ＦＢＤ－９４ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＭＬＡＹＹＹＤＧＳＧＩＲＹＮＬＹＧＭＤＶ
配列番号１６（ＦＢＤ－９４ ＶＬ ＤＮＡ）

【化7】

配列番号１７（ＦＢＤ－９４ ＶＬタンパク質）

【化8】

配列番号１８（ＦＢＤ－９４ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＲＳＩＴＴＦＬＡ
配列番号１９（ＦＢＤ－９４ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＤＡＳＮＲＡＴ
配列番号２０（ＦＢＤ－９４ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＲＤＨＷＰＰＩ
配列番号２１（ＦＢＣ－３９ ＶＨ ＤＮＡ）

【化9】

配列番号２２（ＦＢＣ－３９ ＶＨタンパク質）

【化10】

配列番号２３（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号２４（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号２５（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号２６（ＦＢＣ－３９ ＶＬ ＤＮＡ）

【化11】

配列番号２７（ＦＢＣ－３９ ＶＬタンパク質）

【化12】

配列番号２８（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号２９（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号３０（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号３１（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＶＨ ＤＮＡ）

【化13】

配列番号３２（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＶＨタンパク質）

【化14】

配列番号３３（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号３４（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号３５（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号３６（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＶＬ ＤＮＡ）

【化15】

配列番号３７（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＶＬタンパク質）

【化16】

配列番号３８（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号３９（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号４０（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号４１（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＶＨ ＤＮＡ）

【化17】

配列番号４２（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＶＨタンパク質）

【化18】

配列番号４３（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号４４（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号４５（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号４６（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＶＬ ＤＮＡ）

【化19】

配列番号４７（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＶＬタンパク質）

【化20】

配列番号４８（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号４９（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号５０（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号５１（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＶＨ ＤＮＡ）

【化21】

配列番号５２（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＶＨタンパク質）

【化22】

配列番号５３（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号５４（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号５５（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号５６（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＶＬ ＤＮＡ）

【化23】

配列番号５７（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＶＬタンパク質）

【化24】

配列番号５８（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号５９（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号６０（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号６１（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＶＨ ＤＮＡ）

【化25】

配列番号６２（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＶＨタンパク質）

【化26】

配列番号６３（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号６４（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号６５（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号６６（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＶＬ ＤＮＡ）

【化27】

配列番号６７（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＶＬタンパク質）

【化28】

配列番号６８（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号６９（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号７０（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号７１（ＦＢＣ－３９ ＶＨタンパク質－可変アミノ酸を伴う）
（図６参照）
配列番号７２（ＦＢＣ－３９ ＶＬタンパク質－可変アミノ酸を伴う）
（図７参照）
配列番号７３（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＶＨ ＤＮＡ）

【化29】

配列番号７４（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＶＨタンパク質）

【化30】

配列番号７５（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号７６（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号７７（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号７８（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＦＳＦＳＮＡＷ
配列番号７９（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号８０（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号８１（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＶＬ ＤＮＡ）

【化31】

配列番号８２（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＶＬタンパク質）

【化32】

配列番号８３（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号８４（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号８５（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号８６（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号８７（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号８８（ＦＢＣ－３９ ＦＳＳ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ配列番号８９（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＶＨ ＤＮＡ）：

【化33】

配列番号９０（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＶＨタンパク質）：

【化34】

配列番号９１（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号９２（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号９３（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号９４（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＬＴＦＳＮＡＷ
配列番号９５（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号９６（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号９７（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＶＬ ＤＮＡ）

【化35】

配列番号９８（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＶＬタンパク質）

【化36】

配列番号９９（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号１００（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ配列番号１０１（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１０２（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１０３（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１０４（ＦＢＣ－３９ ＬＴＳ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１０５（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＶＨ ＤＮＡ）：

【化37】

配列番号１０６（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＶＨタンパク質）：

【化38】

配列番号１０７（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号１０８（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号１０９（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１１０（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＦＴＦＳＮＡＷ配列番号１１１（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１１２（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１１３（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＶＬ ＤＮＡ）

【化39】

配列番号１１４（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＶＬタンパク質）

【化40】

配列番号１１５（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－１－Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号１１６（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－２－Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ配列番号１１７（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－３－Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１１８（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１１９（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１２０（ＦＢＣ－３９ ＦＴＳ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１２１（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＬＳＦＬＮＡＷ
配列番号１２２（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１２３（ＦＢＣ－３９ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶＷ
配列番号１２４（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１２５（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１２６（ＦＢＣ－３９ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１２７（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＬＳＦＬＮＡＷ配列番号１２８（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１２９（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１３０（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１３１（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１３２（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１３３（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＦＳＦＬＮＡＷ配列番号１３４（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１３５（ＦＢＣ－３９ ＬＳＬ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１３６（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１３７（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１３８（ＦＢＣ－３９ ＦＳＬ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１３９（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＬＴＦＬＮＡＷ配列番号１４０（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１４１（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１４２（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１４３（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１４４（ＦＢＣ－３９ ＬＴＬ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１４５（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＧＦＴＦＬＮＡＷ配列番号１４６（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１４７（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＨＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１４８（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－１－ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１４９（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－２－ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１５０（ＦＢＣ－３９ ＦＴＬ ＬＣＤＲ－３－ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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