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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-16
(45)【発行日】2023-01-24
(54)【発明の名称】ＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230117BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20230117BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230117BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12Q1/6897 Z
G01N33/53 N
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020541205
(86)(22)【出願日】2019-09-02
(86)【国際出願番号】 JP2019034400
(87)【国際公開番号】W WO2020050208
(87)【国際公開日】2020-03-12
【審査請求日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】P 2018165733
(32)【優先日】2018-09-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019020595
(32)【優先日】2019-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業インキュベートタイプ（ＬＥＡＰ）」「リゾリン脂質メディエーター研究の医療応用」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】川嵜 淳史
(72)【発明者】
【氏名】保科 元気
(72)【発明者】
【氏名】青木 淳賢
(72)【発明者】
【氏名】川上 耕季
(72)【発明者】
【氏名】井上 飛鳥
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／００１８８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３９９７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２０４６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－００００２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１２８８９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５３７７０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－１１７１６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０２８６５４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Clinical Endocrinology, 1998, Vol.49, pp.577-581
【文献】J of Clinical Endocrinology and Metabolism, 2012, Vol.97, No.7, pp.E1080-1087
【文献】日薬理誌 (2010) Vol.136, pp.285-289
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００～３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする哺乳動物細胞中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体に対する自己抗体活性の測定方法。（ａ）ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼ、及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、自己抗体活性を算定する工程；
【請求項2】
自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項3】
３時間以内に完結させることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項4】
哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項5】
工程（ａ）の前に、哺乳動物細胞をインキュベーション用液中で平衡化処理する工程（ｐ）をさらに含み、工程（ａ）において、哺乳動物細胞及び血液試料を、インキュベーション用液中でインキュベートし、工程（ａ）及び（ｂ）を実施するために要する時間と、平衡化処理時間との合計が２時間以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項6】
哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項7】
ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼ、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体の両方を発現する哺乳動物細胞と、前記ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼの可視化及び／又は定量が可能な基質とを構成成分として含有することを特徴とする哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定用キット。
【請求項8】
自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする請求項７に記載の測定用キット。
【請求項9】
哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする請求項７又は８に記載の測定用キット。
【請求項10】
哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項に記載の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Thyroid Stimulating Hormone）受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の判定が可能な、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＳＨ受容体は、甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨの受容体である。脳下垂体から分泌されたＴＳＨがＴＳＨ受容体に結合すると、その刺激によりＴＳＨの分泌及び合成が行われる。甲状腺疾患の代表例であるバセドウ病（Basedow病；グレーブス病［Graves' disease］ともいう）は、ＴＳＨ受容体に対して刺激活性を有する自己抗体（Thyroid Stimulation Antibody；ＴＳＡｂ）が原因となって発症する疾患である。バセドウ病患者においては、ＴＳＡｂが、ＴＳＨ受容体を過剰に刺激することにより、甲状腺機能が亢進する。
【0003】
甲状腺疾患患者の血液試料中のＴＳＡｂ活性を測定する方法として、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を被験試料存在下でインキュベートし、被験試料中に含まれるＴＳＡｂがＣＨＯ細胞膜上に存在するＴＳＨ受容体を刺激することにより産生される環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の量を、レポーター遺伝子の酵素活性を介して測定することにより、ＴＳＡｂ活性を測定する方法が知られている。このとき、測定のバックグラウンド値を低減するために、細胞をコンフルーエントな単層を生じる細胞数まで増殖させてから、一度飢餓状態に導くことが行われていた（特許文献１）。しかしながら、特許文献１記載のバイオアッセイは、細胞増殖のための２４時間のインキュベート工程と、バックグラウンド低減のため成長培地から飢餓培地へと培地馴化を行う１６時間のインキュベート工程を要し、ＴＳＡｂ活性の測定工程においても、試料添加後に４時間のインキュベートを要する。特許文献１記載のバイオアッセイにおいては、これらの工程の合計で４４時間以上要することから、迅速化が課題とされていた。
【0004】
より迅速な甲状腺疾患患者の血液試料中のＴＳＡｂ活性を測定する方法として、例えば、ブタ甲状腺細胞を、当該患者由来の血清存在下でインキュベートし、血清中に含まれるＴＳＡｂが、ブタ甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨ受容体を刺激することにより産生される環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の量を測定することにより、ＴＳＡｂ活性を測定する方法が知られている。このとき、血清中には内因性ｃＡＭＰが含まれていることから、正確な定量を行うために、活性炭を用いた前処理により、内因性ｃＡＭＰの除去が行われていた（特許文献２）。しかしながら、特許文献２記載のバイオアッセイにおいても、甲状腺疾患患者の血液試料、及びブタ甲状腺細胞のインキュベーション工程と、産生されたｃＡＭＰの量を測定する工程の両工程で、合計５～６時間要することから、測定の迅速化は十分であるとは言い切れず、さらなる迅速化が課題とされていた。
【0005】
最近、特許文献２記載のバイオアッセイの改良法として、カルシウムイオンを介した発光によってｃＡＭＰ等のシグナルを検出するバイオアッセイ系と、それを利用したＴＳＡｂの測定法が報告されている（特許文献３～６）。しかしながら、これらの方法には、１）依然として前処理を必要とすること、２）時間短縮は図られているものの依然として４時間程度要すること、３）バセドウ病眼症を精度良く判定できるか否か明らかでないこと、等の問題点があり、必ずしも満足できる方法とはなりえなかった。このため、バセドウ病鑑別には、本来刺激抗体であるＴＳＡｂ活性を測定することが好ましいものの、臨床現場では、迅速性と細胞のインキュベーションの手間の点で、第一選択肢としてＴＳＡｂ活性ではなく、抗ＴＳＨ受容体抗体（ＴＲＡｂ）量の測定が実施されているのが現実である。
【0006】
一方、バセドウ病等のＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患において、ＴＳＨ受容体刺激後のシグナル伝達経路は、２つ以上存在する可能性が高いと考えられ、そのうちの１つとして、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によるシグナル伝達経路が考えられていた。また、１つのＧＰＣＲが複数のＧタンパク質を活性化する現象があることも多数報告されており、そのうちの１つとして、ＴＳＨ受容体が、３種類のＧタンパク質ファミリー（Ｇｓ、Ｇｑ、及びＧｉ）と共役することが報告されている（非特許文献１）。また、リガンドの種類によっては、ＧＰＣＲ活性化後の各シグナル伝達経路におけるシグナル強度が異なる現象（非特許文献２）である、いわゆるリガンドバイアスと称される現象が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特表２００４－５００５８０号公報
【文献】特開２０１６－７５７０７号公報
【文献】再表２０１２－０８６７５６号公報
【文献】特開２０１７－１９２３９６号公報
【文献】特開２０１６－３２４７２号公報
【文献】再表２０１６－０３５６７７号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Endocrinology, Volume 157, Issue 5, 1 May 2016
【文献】Proc Natl Acad Sci USA 104: 5443-8, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の課題は、細胞の培地馴化や血液試料（血液検体）の前処理といった時間を要する工程を行うことなく、もしくは当該工程が短時間で済み、かつ、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性を短時間で精度よく測定することができる方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、前述したリガンドバイアスと称される現象を応用することで、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性を短時間で精度よく測定できることを見いだし、本発明を完成させた。この方法は、血液検体の前処理及び細胞の平衡化処理が不要か、あるいは、当該処理が短時間で済み、さらに、測定自体も簡便な手段であるため、例えば３時間以内に測定を完結させることができ、さらに、市販の発光を測定する装置以外は、特別な装置も不要であるため、病院等の検査ラボでも十分利用可能な方法である。このため、本発明によると、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者（バセドウ病患者及び健常者）由来の血液検体存在下でインキュベートし、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルや、その経時変化を測定することにより、バセドウ病患者と健常者との判定、バセドウ病患者由来血液検体中の自己抗体の性質（刺激活性の強弱など）の検定、性質の異なる複数の自己抗体（刺激性自己抗体、阻害性自己抗体など）の同定等が可能となる。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする哺乳動物細胞中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体に対する自己抗体活性の測定方法。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、自己抗体活性を算定する工程；
〔２〕自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする上記〔１〕に記載の測定方法。
〔３〕３時間以内に完結させることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の測定方法。
〔４〕哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の測定方法。
〔５〕工程（ａ）の前に、哺乳動物細胞をインキュベーション用液中で平衡化処理する工程（ｐ）を任意でさらに含み、工程（ａ）において、哺乳動物細胞及び血液試料を、インキュベーション用液中でインキュベートし、工程（ａ）及び（ｂ）を実施するために要する時間と、平衡化処理時間との合計が２時間以内であることを特徴とする上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
〔６〕哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の測定方法。
〔７〕ｃＡＭＰバイオセンサー及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体の両方を発現する哺乳動物細胞と、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質とを構成成分として含有することを特徴とする哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定用キット。
〔８〕自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする上記〔７〕に記載の測定用キット。
〔９〕哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする上記〔７〕又は〔８〕に記載の測定用キット。
〔１０〕哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする上記〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の測定用キット。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする哺乳動物細胞中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体に対する自己抗体活性の測定方法。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、自己抗体活性を算定する工程；
〔２〕自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする上記〔１〕に記載の測定方法。
〔３〕３時間以内に完結させることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の測定方法。
〔４〕哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の測定方法。
〔５〕工程（ａ）の前に、哺乳動物細胞をインキュベーション用液中で平衡化処理する工程（ｐ）を任意でさらに含み、工程（ａ）において、哺乳動物細胞及び血液試料を、インキュベーション用液中でインキュベートし、工程（ａ）及び（ｂ）を実施するために要する時間と、平衡化処理時間との合計が２時間以内であることを特徴とする上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
〔６〕哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の測定方法。
〔７〕ｃＡＭＰバイオセンサー及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体の両方を発現する哺乳動物細胞と、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質とを構成成分として含有することを特徴とする哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定用キット。
〔８〕自己抗体活性が、刺激活性又は阻害活性であることを特徴とする上記〔７〕に記載の測定用キット。
〔９〕哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であることを特徴とする上記〔７〕又は〔８〕に記載の測定用キット。
〔１０〕哺乳動物細胞が、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であることを特徴とする上記〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の測定用キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明の測定方法は、細胞の培地馴化や血液検体の前処理が不要か短時間で済み、測定自体も簡便な手段で行うことができるため、例えば３時間以内に測定を完結させることができ、さらに、市販の発光を測定する装置以外は、特別な装置も不要であるため、病院等の検査ラボでも十分利用可能な方法である。また、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者（例えば、バセドウ病患者や健常者）由来の血液検体存在下でインキュベートし、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルやその継時変化を測定することにより、バセドウ病患者と健常者とを精度よく判定でき、患者由来の血液検体中の自己抗体の性質（刺激活性の強弱など）や性質の異なる複数の自己抗体（刺激性自己抗体、阻害性自己抗体など）の検定や同定も可能である。
【0013】
本発明の測定方法は、哺乳動物細胞としてヒト胎児腎細胞由来細胞株を用いた場合、特に高いｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを示す。これにより、甲状腺疾患患者の血液試料中に含まれるＴＳＡｂ活性が低値の場合でも、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを感度良く測定することができるため、検査の偽陰性率を低減することができ、バセドウ病患者と健常者とをより精度よく判定することができる。
【0014】
さらに、将来的には、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルやその継時変化を測定することにより、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の症状の重篤度を精度よく判定できることが期待され、例えば、上記甲状腺疾患に罹患している可能性が高い被験者を特定し、甲状腺疾患の重篤度に対応した治療処置（例えば、抗甲状腺疾患薬、アイソトープ治療［放射性ヨウ素治療］、甲状腺ホルモン産生組織の切除［手術］等）を施すことにより、上記甲状腺疾患を治療したり、上記甲状腺疾患の症状を軽減することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１Ａは、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞（以下、「ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞」ということがある）と、ｃＡＭＰバイオセンサーのみが発現し、ＴＳＨ受容体が発現しないＨＥＫ２９３細胞（以下、「ＴＳＨ受容体非発現ＨＥＫ２９３細胞」ということがある）とを、各種濃度（０ μＵ／ｍＬ、０．０１ μＵ／ｍＬ、０．１ μＵ／ｍＬ、１ μＵ／ｍＬ、１０ μＵ／ｍＬ、１００ μＵ／ｍＬ、１０００ μＵ／ｍＬ、及び２０００ μＵ／ｍＬ）のｂＴＳＨ存在下でインキュベートし、GloSensor（登録商標） cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。図１Ｂは、ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞及びＴＳＨ受容体非発現ＨＥＫ２９３細胞を、各種濃度（０ ｎｇ／ｍＬ、０．００１ ｎｇ／ｍＬ、０．０１ ｎｇ／ｍＬ、０．１ ｎｇ／ｍＬ、１ ｎｇ／ｍＬ、１０ ｎｇ／ｍＬ、１００ ｎｇ／ｍＬ、及び１０００ ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＴＳＨ存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。図１Ｃは、ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞及びＴＳＨ受容体非発現ＨＥＫ２９３細胞を、各種濃度（０ ｎｇ／ｍＬ、０．０００１ ｎｇ／ｍＬ、０．００１ ｎｇ／ｍＬ、０．０１ ｎｇ／ｍＬ、０．１ ｎｇ／ｍＬ、１ ｎｇ／ｍＬ、１０ ｎｇ／ｍＬ、及び１００ ｎｇ／ｍＬ）の抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、ｂＴＳＨ、ｒｈＴＳＨ、又は抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。
【図2】図２Ａは、ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、インキュベート用液下で０時間又は２時間平衡化処理した後、各種濃度（０ ｎｇ／ｍＬ、０．００１ ｎｇ／ｍＬ、０．０１ ｎｇ／ｍＬ、０．１ ｎｇ／ｍＬ、１ ｎｇ／ｍＬ、１０ ｎｇ／ｍＬ、１００ ｎｇ／ｍＬ、１０００ ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＴＳＨ存在下でインキュベートし、GloSensor（登録商標） cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。図２Ｂは、ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、インキュベート用液下で０時間又は２時間平衡化処理した後、各種濃度（０ ｎｇ／ｍＬ、０．０１ ｎｇ／ｍＬ、０．１ ｎｇ／ｍＬ、１ ｎｇ／ｍＬ、１０ ｎｇ／ｍＬ、及び１００ ｎｇ／ｍＬ）の抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、ｒｈＴＳＨ、又は抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。
【図3】ＴＳＨ受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞（図中の「ＨＥＫ２９３」）と、ＴＳＨ受容体及びＧαsを発現させたＧｓ欠損ＨＥＫ２９３細胞（図中の「ΔＧｓ」）を、各種濃度（０．００１ ｎｇ／ｍＬ、０．０１ ｎｇ／ｍＬ、０．１ ｎｇ／ｍＬ、１ ｎｇ／ｍＬ、１０ ｎｇ／ｍＬ、１００ ｎｇ／ｍＬ、及び１０００ ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＴＳＨ存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、血清試料の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。横軸の「Ｌｏｇ［ｒｈＴＳＨ（ｎｇ／ｍＬ）］」は、ｒｈＴＳＨ濃度の常用対数を示す。
【図4】図４Ａは、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法によって、各種濃度（７８．１ ｍＵ／Ｌ、１５６．３ ｍＵ／Ｌ、３１２５．５ ｍＵ／Ｌ、６２５ ｍＵ／Ｌ、１２５０ ｍＵ／Ｌ、２５００ ｍＵ／Ｌ、５０００ ｍＵ／Ｌ、１００００ ｍＵ／Ｌ）のＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204を測定した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、血清試料の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。図４Ｂは、ＥＩＡ法を用いた既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系によって、各種濃度（５０ ｍＵ／Ｌ、８０ ｍＵ／Ｌ、１００ ｍＵ／Ｌ、２００ ｍＵ／Ｌ、４００ ｍＵ／Ｌ、６００ ｍＵ／Ｌ、８００ ｍＵ／Ｌ、１０００ ｍＵ／Ｌ、２０００ ｍＵ／Ｌ、４０００ ｍＵ／Ｌ、６０００ ｍＵ／Ｌ、８０００ ｍＵ／Ｌ、１００００ ｍＵ／Ｌ）のＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204を測定した結果を示す図である。縦軸の「ＴＳＡｂ％」は、健常者血清検体のｃＡＭＰ濃度を１００としたときの、ＴＳＨ受容体刺激自己抗体含有検体のｃＡＭＰ濃度の相対値を示す。
【図5】ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、バセドウ病患者６名又は健常者４名由来の血清試料存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、血清試料の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。
【図6】ＴＳＨ受容体発現ＨＥＫ２９３細胞を、バセドウ病患者Ｐ１由来の血清試料、又はバセドウ病患者Ｐ５由来の血清試料存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、血清試料の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。
【図7】ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞と、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現するＣＨＯ細胞とを、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204（図中の「０８／２０４」）又はバセドウ病患者３名由来の血清試料（図中の「検体１～３」）存在下でインキュベートし、GloSensor cAMP Assayにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ルシフェラーゼ活性レベル」は、各試料の添加前のルシフェラーゼ活性レベルを１としたときの相対値として示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の測定方法は、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程（ａ）；工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程（ｂ）；及び工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、自己抗体活性を算定する工程（ｃ）；の工程（ａ）～（ｃ）を含む、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性を測定する方法（以下、「本件測定方法」ということがある）であり、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の判定方法（但し、医師による診断行為を含まない）に用いることもできる。
【0017】
また、本発明の測定用キットは、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞と、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質とを構成成分として含有する、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定に用いるためのキット（以下、「本件測定キット」ということがある）であり、本件測定キットは、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性の測定に用いるためのキットに関する用途発明であり、かかるキットは、一般にこの種の測定キットに用いられる成分、例えば、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、増感剤、希釈液の他、取扱説明書、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性を測定するための説明書等の添付文書を含んでもよい。
【0018】
本明細書において、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患としては、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体又はＴＳＨ受容体阻害性自己抗体によりＴＳＨ受容体が刺激又は阻害され、血液中の遊離型甲状腺ホルモン濃度の上昇又は低下に起因する甲状腺疾患であればよく、例えば、バセドウ病、ＴＳＨ産生腫瘍、妊娠甲状腺中毒症、甲状腺機能低下症、橋本病等を挙げることができ、バセドウ病を好適に例示することができる。
【0019】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に刺激（活性化）できる自己抗体（すなわち、測定対象の被験者の体内で産生され、かつ、当該被験者の体内に存在するタンパク質等の物質を標的とする抗体）、例えば、ＴＳＨ受容体に結合できるアゴニスト（例えば、アゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ抗体［ＴＳＡｂ］）を意味する。
【0020】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に阻害（不活性化）できる自己抗体、例えば、ＴＳＨのＴＳＨ受容体への結合を直接的又は間接的に阻害するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ抗体［ＴＳＢＡｂ］）を意味する。
【0021】
本明細書において、「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。
【0022】
上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、ｃＡＭＰに対する特異性が、ｃＧＭＰに対する特異性よりも高いものが好ましく、ここで、ｃＡＭＰに対する特異性を１としたときのｃＧＭＰの特異性は、例えば、１／１０以下、好ましくは１／３０以下、より好ましくは１／６０以下、さらに好ましくは１／１００以下である。
【0023】
上記哺乳動物細胞としては、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が、一過的（transient）又は安定的（stable）に発現する哺乳動物細胞であればよく、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、内在性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞（例えば、哺乳類甲状腺細胞）であっても、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、外来性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳類非甲状腺細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］）であってもよく、中でも、GloSensor cAMP（Promega社製）と組み合わせた際に高い発光値やシグナル誘導倍率を示すことから、ヒト胎児腎細胞由来細胞株を好適に例示することができる。ここで、「ヒト胎児腎細胞由来細胞株」とは、ヒト胎児の腎組織から採取された細胞又はその集団を、継代培養を繰り返す方法；アデノウイルスＥ１遺伝子、ＳＶ４０（Simian virus 40）Ｔ抗原等のウイルス遺伝子を利用して不死化を誘発する方法；テロメア逆転写タンパク質（ＴＥＲＴ）を発現させて不死化を誘発する方法；等の操作によって樹立された株化（すなわち、不死化）細胞を意味する。
【0024】
上記哺乳動物細胞としては、Ｇタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトした細胞株であってもよく、具体的にはＧＮＡＬ遺伝子（Ｇαｏｌｆタンパク質をコードする遺伝子）をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよく、ＧＮＡＳ遺伝子（Ｇαｓタンパク質をコードする遺伝子）をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよく、これら両方の遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよい。また、上記哺乳動物細胞としては、外来性のＧタンパク質、具体的には外来性のＧαｓ、あるいはＧαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３とのキメラＧαｓを発現した哺乳動物細胞であってもよい。ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患においては、複数のＧタンパク質が活性化される可能性が示唆されているが、上記遺伝子のノックアウト及び／又は外来性Ｇタンパク質あるいはキメラＧタンパク質の発現により、細胞中で発現するＧタンパク質を選択し、各Ｇタンパク質の活性化について詳細な調査が可能となることから、本発明はＧＰＣＲ活性化後の各シグナル伝達経路におけるシグナル強度の調査ツールとして有用である。
【0025】
ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞としては、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子にヌクレオチドを挿入したり、前記ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子のヌクレオチドを欠失することにより、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊した哺乳動物細胞であればよく、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊するために、相同組換えを利用してヌクレオチドを欠失させたり挿入したりすることにより遺伝子を破壊する方法を用いてもよいが、費用対効果や時間対効果の観点から、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（文献「Urnov, F.D. et al(2010) Nature Review Genetics. 11, 636-646」）や、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを改良したタンパク質（特開２０１３－９４１４８号公報）や、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（文献「Cong etal (2013) Science 339, 819-823」）等を用いて、ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子領域の２本鎖ＤＮＡを切断し、相同組換え修復時にヌクレオチドの欠失や挿入が起こることを利用して遺伝子を破壊する方法（遺伝子ターゲッティング法）を用いることが好ましく、特にｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法を用いることがより好ましい。
【0026】
なお、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊する際、標的とするヌクレオチド配列を選択するために、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクし、以下のGene IDを基に、ヒト由来のＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子の塩基配列情報を参照したり、これら遺伝子のオーソログ遺伝子（チンパンジー、マウス、ラット、ウシ等）を参照することができる。
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）
【0027】
外来性のｃＡＭＰバイオセンサー、外来性のＴＳＨ受容体、及び／又は外来性のＧタンパク質、例えばＧαｓを発現する哺乳動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子、ＴＳＨ受容体をコードする遺伝子、及び／又Ｇαｓをコードする遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子）を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。
【0028】
本明細書において、哺乳動物細胞としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、又はヒト由来の細胞を好適に例示することができる。
【0029】
上記血液試料としては、血液そのものや、血液から調製された血清又は血漿を挙げることができ、血清が好ましい。
【0030】
上記工程（ａ）において、哺乳動物細胞をインキュベートする方法としては、血液試料中に含まれる自己抗体が、ＴＳＨ受容体刺激性のものである場合、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体が、哺乳動物細胞におけるＴＳＨ受容体を刺激し、かかる刺激により細胞内に産生されたｃＡＭＰが、ｃＡＭＰバイオセンサーに結合し、ｃＡＭＰバイオセンサーを活性化できる条件下でインキュベートする方法であればよく、また、血液試料中に含まれる自己抗体が、ＴＳＨ受容体阻害性のものである場合、ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体が、哺乳動物細胞におけるＴＳＨ受容体を阻害し、かかる阻害により細胞内のｃＡＭＰ産生量が低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーに結合するｃＡＭＰ産生量が低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーを不活性化できる条件下でインキュベートする方法であればよく、インキュベート時間、インキュベート温度、インキュベート用液の種類等の条件は、哺乳動物細胞の性質や、測定対象の活性化レベルの性質も考慮して適宜選択することができる。
【0031】
上記インキュベート時間は、例えば、５分～２時間の範囲内、好ましくは１０分～１．５時間の範囲内、より好ましくは２０分～１時間の範囲内であり、上記インキュベート温度は、例えば、１４～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃の範囲内である。
【0032】
上記インキュベート用液としては、例えば、０．１～３０％（ｖ／ｖ）の血清（ウシ胎児血清［Fetalbovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する生理的水溶液、無血清の生理的水溶液を挙げることができる。かかる生理的水溶液としては、例えば、哺乳動物細胞培養用培養液；生理食塩水；リン酸緩衝化生理食塩水；トリス緩衝化生理食塩水；ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；５％グルコース水溶液を挙げることができる。また、上記哺乳動物細胞培養用培養液としては、具体的には、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等を挙げることができる。また、上記無血清の哺乳動物細胞培養用培養液としては、例えば、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記哺乳動物細胞培養用培養液を挙げることができる。さらに、インキュベート用液としては、特許文献１等のｃＡＭＰ検出系に関する公知文献にて慣用されている、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、3-イソブチル-1-メチルキサンチン［ＩＢＭＸ］やテオフィリン等）を含有したものであってもよいが、ホスホジエステラーゼ阻害剤の存在により、バックグラウンドの値が高くなり、十分なＳ／Ｎ比が確保されず、定量的な測定が困難になる場合は、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含有しないものが好ましい。
【0033】
上記インキュベート用液には、可視化（イメージング）及び／又は定量が可能なｃＡＭＰバイオセンサーに対する基質や触媒等が含まれる。例えば、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがアルカリホスファターゼの場合、上記インキュベート用液には、ｐ－ニトロフェニルリン酸等の基質が含まれ、LabAssay ALP（和光純薬工業社製）、QuantiChrom Alkaline Phosphatase Assay Kit（フナコシ社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調製してもよい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合、上記インキュベート用液には、Ｘ－ｇａｌ(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)、ＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）等の基質が含まれ、Ｘ－ｇａｌ（TaKaRa社製）、β-Galactosidase Enzyme Assay System（Promega社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調製してもよい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがルシフェラーゼである場合、上記インキュベート用液には、ルシフェリン、セレンテラジン等の基質が含まれ、GloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調製してもよい。なお、上記インキュベート用液には、上記基質の他、触媒（例えば、ＡＴＰ、マグネシウム）を添加してもよいが、哺乳動物細胞内にこれら触媒が十分ある場合は、添加しなくてもよい。
【0034】
上記工程（ａ）において、哺乳動物細胞と血液試料とは、上記インキュベート用液を含む容器（例えば、マルチウエルプレート、培養皿［シャーレ、ディッシュ］、フラスコ）内で接触させることができる。具体的には、血液試料を予め上記インキュベート用液中に添加・混合した後、かかる液を哺乳動物細胞に添加してもよいし、血液試料を、哺乳動物細胞を含む上記インキュベート用液に添加・混合してもよい。本件測定方法としては、上記工程（ａ）の前に、哺乳動物細胞を、インキュベート用液中で平衡化処理する工程（ｐ）をさらに含むものであってもよいし、時間対効果を得る観点から、当該工程（ｐ）を含まないものであってもよい。平衡化処理時間としては、例えば、５分以上、１０分以上、３０分以上であり、２．５時間以下、２時間以下、又は１時間以下である。すなわち、平衡化処理時間としては、例えば、５分～２．５時間の範囲内、１０分～２時間の範囲内、３０～１時間の範囲内である。また、平衡化処理の温度は、例えば、１４～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃の範囲内である。哺乳動物細胞内に発現するｃＡＭＰバイオセンサーは、細胞内に産生されたｃＡＭＰに対してのみ反応性を示し、細胞外のｃＡＭＰに対しては反応性を示さない。このため、哺乳動物細胞と血液試料とを接触させる前に、血液試料中に含まれるｃＡＭＰを予め除去する等の前処理や、哺乳動物細胞と血液試料とを接触させる前又は接触させた後に、哺乳動物細胞を溶解処理することを必要としない。なお、本工程は、公知のＴＳＡｂ活性測定法（特許文献２）と同様に、polyethylene glycol（ＰＥＧ）共存下で行ってもよく、非存在下で行ってもよい。
【0035】
上記工程（ｂ）において、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法は、測定対象の活性化レベルの性質に合わせて適切な方法を適宜選択することができ、例えば、活性化レベルが、ｐ－ニトロフェニルリン酸を基質として用いたアルカリホスファターゼの活性化レベルである場合、アルカリホスファターゼにより分解されるｐ－ニトロフェノール（４０５ｎｍ）の吸光度を、分光光度計により測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、ＯＮＰＧを基質として用いたβ－Ｄ－ガラクトシダーゼの活性化レベルである場合、β－Ｄ－ガラクトシダーゼにより分解されるｏ-ニトロフェノール（２０ｎｍ）の吸光度を、分光光度計により測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、ルシフェリンを基質として用いたルシフェラーゼの活性化レベルである場合、ルシフェラーゼにより生じる発光を、ルミノメーターにより測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、蛍光タンパク質の蛍光レベルである場合、蛍光レベルを蛍光顕微鏡で測定する方法を挙げることができる。
【0036】
上記工程（ｂ）において、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを、複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３４、少なくとも３６、少なくとも３８、少なくとも４０）の時点で測定することにより、上記活性化レベルの経時変化を測定することができる。上記活性化レベルの経時変化を測定するときの時点と時点の間の時間としては、特に制限されず、例えば、１～６０秒の範囲内、１～６０分の範囲内、１～２時間の範囲内である。また、上記活性化レベルの経時変化を測定するときの時点と時点の間隔としては、等間隔であっても、不等間隔であってもよい。
【0037】
上記工程（ｂ）において、被験者における活性化レベルを継時的に測定した場合、被験者における活性化レベルの増加をリアルタイムでモニタリングすることができるため、被験者における活性化レベルが増加するポイント（タイミング）で測定することにより、被験者における活性化レベルが、対照における活性化レベルよりも高いか否かを、正確かつ定量的に評価することができる。
【0038】
上記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、自己抗体活性を算定する。工程（ｂ）で測定した活性化レベルが、対照における活性化レベルと比べ、高い場合、被験者の血清試料中には、対照よりもＴＳＨ受容体に対して刺激性を示す自己抗体の割合が多い、及び／又は、対照よりもＴＳＨ受容体に対して阻害性を示す自己抗体の割合が少ないと判定（判断）することができ、工程（ｂ）で測定した活性化レベルが、対照における活性化レベルと比べ、低い場合、被験者の血清試料中には、対照よりもＴＳＨ受容体に対して刺激性を示す自己抗体の割合が少ない、及び／又は、対照よりもＴＳＨ受容体に対して阻害性を示す自己抗体の割合が多いと判定（判断）することができる。上記工程（ｃ）において、比較する両者（被験者における活性化レベル、及び対照における活性化レベル）は、互いに対応するものを用いる。対照における活性化レベルは、本件測定方法を実施する際、対照（例えば、健常者や、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患患者）から採取された血液試料を基に、その都度測定した値であってもよいが、予め測定した値であってもよい。また、比較する両者（被験者における活性化レベル、及び対照における活性化レベル）は、実質的に同じ方法により調製された血液試料や、実質的に同じ活性化レベルの測定方法により得られたものが好ましい。
【0039】
本件測定キットにおいて、ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質としては、例えば、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがアルカリホスファターゼの場合、ｐ－ニトロフェニルリン酸を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合、Ｘ－ｇａｌ(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)、ＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがルシフェラーゼである場合、ルシフェリン、セレンテラジンを挙げることができる。
【0040】
本件測定方法や本件測定キットを用いると、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体活性を迅速に測定することができる。本明細書において、「迅速」とは、測定時間、具体的には、上記工程（ａ）及び（ｂ）を実施するために要する時間と、上述の平衡化処理時間との合計（以下、「合計時間」ということがある）や、本件測定方法が完結される時間（以下、「完結時間」ということがある）が、比較的短時間であることを意味する。ここで合計時間において、比較的短時間としては、例えば、２時間以下、１時間３０分以下、１時間以下、又は３０分以下；５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、又は２５分以上であり、かつ、２時間以下、１時間３０分以下、１時間以下、又は３０分以下（すなわち、５分～２時間、５分～１時間３０分、５分～１時間、５～３０分間、１０分～２時間、１０分～１時間３０分、１０分～１時間、１０～３０分間、１５分～２時間、１５分～１時間３０分、１５分～１時間、１５～３０分間、２０分～２時間、２０分～１時間３０分、２０分～１時間、２０～３０分間、２５分～２時間、２５分～１時間３０分、２５分～１時間、２５～３０分間）；等を挙げることができ、２時間以下を好適に例示することができる。また、完結時間において、比較的短時間としては、例えば、３時間以下、２時間３０分以下、２時間以下、又は１時間３０分以下；５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、又は２５分以上であり、かつ、３時間以下、２時間３０分以下、２時間以下、又は１時間３０分以下（すなわち、５分～３時間、５分～２時間３０分、５分～２時間、５～１時間３０分間、１０分～３時間、１０分～２時間３０分、１０分～２時間、１０～１時間３０分間、１５分～３時間、１５分～２時間３０分、１５分～２時間、１５～１時間３０分間、２０分～３時間、２０分～２時間３０分、２０分～２時間、２０～１時間３０分間、２５分～３時間、２５分～２時間３０分、２５分～２時間、２５～１時間３０分間）；等を挙げることができ、３時間以下を好適に例示することができる。
【0041】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、細胞培養は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤ－ＭＥＭ培養液中で、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃条件下）内で行った。
【実施例】
【0042】
実施例１．ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度の定量
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を定量できるか否かを検討した。具体的には、以下の手順〔１〕～〔３〕の方法を行った。
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を定量できるか否かを検討した。具体的には、以下の手順〔１〕～〔３〕の方法を行った。
【0043】
１－１ 方法
〔１〕１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no.85120602）を、９６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質（ｃＡＭＰバイオセンサー）を発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）と、ヒトＴＳＨ受容体を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hTSHR）とを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした（図１の「ＴＳＨ受容体発現細胞」）。なお、比較対照として、ヒトＴＳＨ受容体遺伝子が挿入されていないｐｃＤＮＡ３．１（＋）と、pGloSenso-22Fとをトランスフェクションした実験も行った（図１の「ＴＳＨ受容体非発現細胞」）。
〔３〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で１時間平衡化処理を行った後、各種濃度（図１参照）の３種類のＴＳＨ受容体刺激物質（ウシＴＳＨ［ｂＴＳＨ、シグマアルドリッチ社製］、組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Tecan社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、上記３種類のＴＳＨ受容体刺激物質を添加する前のルシフェラーゼ活性レベルも測定した。また、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
〔１〕１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no.85120602）を、９６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質（ｃＡＭＰバイオセンサー）を発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）と、ヒトＴＳＨ受容体を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hTSHR）とを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした（図１の「ＴＳＨ受容体発現細胞」）。なお、比較対照として、ヒトＴＳＨ受容体遺伝子が挿入されていないｐｃＤＮＡ３．１（＋）と、pGloSenso-22Fとをトランスフェクションした実験も行った（図１の「ＴＳＨ受容体非発現細胞」）。
〔３〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で１時間平衡化処理を行った後、各種濃度（図１参照）の３種類のＴＳＨ受容体刺激物質（ウシＴＳＨ［ｂＴＳＨ、シグマアルドリッチ社製］、組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Tecan社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、上記３種類のＴＳＨ受容体刺激物質を添加する前のルシフェラーゼ活性レベルも測定した。また、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
【0044】
１－２ 結果
３種類のＴＳＨ受容体刺激物質（ｂＴＳＨ、ｒｈＴＳＨ、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体）の濃度に依存して、ルシフェラーゼ活性化レベルが上昇することが示された（図１参照）。かかる結果は、ｃＡＭＰバイオセンサー（GloSensor cAMP）及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体等のＴＳＨ受容体刺激性自己抗体存在下で培養すると、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を測定できることを示している。
３種類のＴＳＨ受容体刺激物質（ｂＴＳＨ、ｒｈＴＳＨ、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体）の濃度に依存して、ルシフェラーゼ活性化レベルが上昇することが示された（図１参照）。かかる結果は、ｃＡＭＰバイオセンサー（GloSensor cAMP）及びＴＳＨ受容体の両方を発現する哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体等のＴＳＨ受容体刺激性自己抗体存在下で培養すると、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を測定できることを示している。
【0045】
実施例２．哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理の検討
哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理の検討を行った。具体的には、以下の手順〔１〕、〔２〕を行った後、平衡化処理を行わない（処理時間が０時間）〔３－１〕、平衡化処理を行う（処理時間が２時間）〔３－２〕の方法を並行して行い、両者の測定結果を比較することで、平衡化処理の有無による測定結果への影響を検討した。
哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理の検討を行った。具体的には、以下の手順〔１〕、〔２〕を行った後、平衡化処理を行わない（処理時間が０時間）〔３－１〕、平衡化処理を行う（処理時間が２時間）〔３－２〕の方法を並行して行い、両者の測定結果を比較することで、平衡化処理の有無による測定結果への影響を検討した。
【0046】
２－１ 方法
〔１〕１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no.85120602）を、９６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質を発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）と、ヒトＴＳＨ受容体を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hTSHR）とを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。
〔３－１〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution
（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、直ちに各種濃度（図２参照）の２種類のＴＳＨ受容体刺激物質（組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
〔３－２〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で２時間平衡化処理を行った後、各種濃度（図２参照）の２種類のＴＳＨ受容体刺激物質（組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
〔１〕１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no.85120602）を、９６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質を発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）と、ヒトＴＳＨ受容体を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hTSHR）とを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。
〔３－１〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution
（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、直ちに各種濃度（図２参照）の２種類のＴＳＨ受容体刺激物質（組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
〔３－２〕２４時間培養後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で２時間平衡化処理を行った後、各種濃度（図２参照）の２種類のＴＳＨ受容体刺激物質（組換えヒトＴＳＨ［ｒｈＴＳＨ、サノフィ社製］、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体［アールエスアール社製］）（ＴＳＡｂ）を添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、上記ＴＳＨ受容体刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
【0047】
２－２ 結果
哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理の有無によらず、ＴＳＨ受容体刺激物質（ｒｈＴＳＨ、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体）の濃度に依存して、ルシフェラーゼ活性化レベルが上昇することが示された（図２参照）。かかる結果は、哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理を省略ないし短縮し、測定時間を短縮した（例えば、３０分以内）場合であっても、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を測定できることを示している。
哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理の有無によらず、ＴＳＨ受容体刺激物質（ｒｈＴＳＨ、及び抗ヒトＴＳＨモノクローナルＭ２２抗体）の濃度に依存して、ルシフェラーゼ活性化レベルが上昇することが示された（図２参照）。かかる結果は、哺乳動物細胞のインキュベート用液での平衡化処理を省略ないし短縮し、測定時間を短縮した（例えば、３０分以内）場合であっても、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体の濃度を測定できることを示している。
【0048】
実施例３．ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞の検討
ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体を感度よく測定するために、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞を検討した。具体的には、Ｇｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子）のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株（以下、「Ｇｓ欠損ＨＥＫ２９３細胞」ということがある）を、以下の［Ｇｓ遺伝子のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の作製］の項目に記載の方法に従って作製し、実施例１の「１－１ 方法」の項目に記載の方法に従って、２種類のベクター（pGloSenso-22F及びpcDNA3.1_hTSHR）と、ヒトＧαｓタンパク質を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hGαs）とをトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、野生株（ＨＥＫ２９３細胞）へ、上記２種類のベクターをトランスフェクションした実験も行った。
ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体を感度よく測定するために、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞を検討した。具体的には、Ｇｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子）のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株（以下、「Ｇｓ欠損ＨＥＫ２９３細胞」ということがある）を、以下の［Ｇｓ遺伝子のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の作製］の項目に記載の方法に従って作製し、実施例１の「１－１ 方法」の項目に記載の方法に従って、２種類のベクター（pGloSenso-22F及びpcDNA3.1_hTSHR）と、ヒトＧαｓタンパク質を発現するpcDNA3.1(+)（pcDNA3.1_hGαs）とをトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、野生株（ＨＥＫ２９３細胞）へ、上記２種類のベクターをトランスフェクションした実験も行った。
【0049】
３－１ 方法
［Ｇｓ遺伝子のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の作製］
〔１〕ゲノム中に存在するＧｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子［Gene ID2778］及びＧＮＡＬ遺伝子［Gene ID2774］）をノックアウトするために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の両方を発現させるｐＸ３３０ベクターを用い、文献（Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910-918 (2013).）や、国際公開第２０１５／１２８８９４号パンフレットに記載の方法に従ってプラスミドコンストラクト（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター）を作製した。
〔２〕ＨＥＫ２９３細胞を２×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培養液で懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレート（Grenier Bio-One社製）の各ウェルに１ｍＬずつ播種した。
〔３〕２４時間培養後、各ウェルに、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター５００ｎｇと、pGreenLantern-1（GIBCO BRL社製）１００ｎｇとを、LipofectAMINE 2000（Life Technologies社製）１．２５μＬを用いて、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。
〔４〕トランスフェクション２４時間後の細胞を、０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて細胞を剥がし、セルソーターSH800Z（Sony社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を分取することによりＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターが導入された細胞を選択した。なお、選択した細胞について、ゲノム中に存在するＧｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子）が組み換えによりノックアウトされていることは、組換えにより生じた制限酵素を用いて確認した。
［Ｇｓ遺伝子のノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の作製］
〔１〕ゲノム中に存在するＧｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子［Gene ID2778］及びＧＮＡＬ遺伝子［Gene ID2774］）をノックアウトするために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の両方を発現させるｐＸ３３０ベクターを用い、文献（Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910-918 (2013).）や、国際公開第２０１５／１２８８９４号パンフレットに記載の方法に従ってプラスミドコンストラクト（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター）を作製した。
〔２〕ＨＥＫ２９３細胞を２×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培養液で懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレート（Grenier Bio-One社製）の各ウェルに１ｍＬずつ播種した。
〔３〕２４時間培養後、各ウェルに、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクター５００ｎｇと、pGreenLantern-1（GIBCO BRL社製）１００ｎｇとを、LipofectAMINE 2000（Life Technologies社製）１．２５μＬを用いて、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。
〔４〕トランスフェクション２４時間後の細胞を、０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて細胞を剥がし、セルソーターSH800Z（Sony社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を分取することによりＣａｓ９ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡ発現ベクターが導入された細胞を選択した。なお、選択した細胞について、ゲノム中に存在するＧｓ遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子及びＧＮＡＬ遺伝子）が組み換えによりノックアウトされていることは、組換えにより生じた制限酵素を用いて確認した。
【0050】
３－２ 結果
Ｇｓ欠損ＨＥＫ２９３細胞を用いてアッセイした場合、ＨＥＫ２９３細胞を用いてアッセイした場合と比べ、５０％効果濃度（ＥＣ５０）が２４．７倍向上した（図３参照）。この結果は、例えば、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、外来性のＧαｓが発現し、かつ、Ｇｓ遺伝子がノックアウトした細胞を用いると、野生型の哺乳動物細胞と比べ、ＴＳＨ受容体のリガンド（ＴＳＡｂ）の検出感度が向上することを示し、目的とする試料の特性に応じて哺乳動物細胞を設計・選択することで、ＴＳＡｂ活性を精確に測定できることが示唆された。
Ｇｓ欠損ＨＥＫ２９３細胞を用いてアッセイした場合、ＨＥＫ２９３細胞を用いてアッセイした場合と比べ、５０％効果濃度（ＥＣ５０）が２４．７倍向上した（図３参照）。この結果は、例えば、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、外来性のＧαｓが発現し、かつ、Ｇｓ遺伝子がノックアウトした細胞を用いると、野生型の哺乳動物細胞と比べ、ＴＳＨ受容体のリガンド（ＴＳＡｂ）の検出感度が向上することを示し、目的とする試料の特性に応じて哺乳動物細胞を設計・選択することで、ＴＳＡｂ活性を精確に測定できることが示唆された。
【0051】
実施例４．既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系との反応性比較
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法が、既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と相関を有するか、検討した。
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法が、既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と相関を有するか、検討した。
【0052】
４－１ 材料
ＴＳＨ受容体刺激物質の陽性対照として、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204を利用した。
ＴＳＨ受容体刺激物質の陽性対照として、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204を利用した。
【0053】
４－２ 方法
上記「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、３種類のＴＳＨ受容体刺激物質に代えて、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC08/204を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、血清試料を添加してから４０秒間隔で３０回測定した。また、同じ試料を用いてＴＳＡｂキット「ヤマサ」ＥＩＡ（ヤマサ醤油株式会社製）により甲状腺刺激性自己抗体活性（ＴＳＡｂ％）を測定した。
上記「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、３種類のＴＳＨ受容体刺激物質に代えて、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC08/204を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、血清試料を添加してから４０秒間隔で３０回測定した。また、同じ試料を用いてＴＳＡｂキット「ヤマサ」ＥＩＡ（ヤマサ醤油株式会社製）により甲状腺刺激性自己抗体活性（ＴＳＡｂ％）を測定した。
【0054】
４－３ 結果
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法は、既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と同等の反応性を示した（図４参照）。この結果より、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法が既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と置換可能である可能性が示唆された。
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法は、既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と同等の反応性を示した（図４参照）。この結果より、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標としたＴＳＨ受容体刺激性自己抗体測定法が既存の甲状腺刺激性自己抗体活性測定系と置換可能である可能性が示唆された。
【0055】
実施例５．ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患の判定
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患を判定できるか否かを検討した。具体的には、以下の材料を用い、以下の方法を行った。
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患を判定できるか否かを検討した。具体的には、以下の材料を用い、以下の方法を行った。
【0056】
５－１ 材料
バセドウ病患者から血液を採取し、定法に従って血清試料を調製した。
バセドウ病患者から血液を採取し、定法に従って血清試料を調製した。
【0057】
５－２ 方法
上記「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、３種類のＴＳＨ受容体刺激物質に代えて、バセドウ病患者６名及び健常者４名から調製した血清試料を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した（図５参照）。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、血清試料を添加後のインキュベーションにおいて、４０秒間隔で３０回測定し、図５には３０回目の測定値を示す。また、互いに同程度の測定値を示したバセドウ病患者Ｐ１及びＰ５由来血清試料について、ルシフェラーゼ活性レベルの継時的変化を示す（図６参照）。これらの血清試料については、エクルーシス試薬ＴＲＡｂ（ロッシュ社製）により抗ＴＳＨ受容体抗体（ＴＲＡｂ）量を測定した（表１参照）。
上記「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、３種類のＴＳＨ受容体刺激物質に代えて、バセドウ病患者６名及び健常者４名から調製した血清試料を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した（図５参照）。なお、ルシフェラーゼ活性レベルは、血清試料を添加後のインキュベーションにおいて、４０秒間隔で３０回測定し、図５には３０回目の測定値を示す。また、互いに同程度の測定値を示したバセドウ病患者Ｐ１及びＰ５由来血清試料について、ルシフェラーゼ活性レベルの継時的変化を示す（図６参照）。これらの血清試料については、エクルーシス試薬ＴＲＡｂ（ロッシュ社製）により抗ＴＳＨ受容体抗体（ＴＲＡｂ）量を測定した（表１参照）。
【0058】
５－３ 結果
バセドウ病患者６名及び健常者４名から調製した血清試料のルシフェラーゼ活性レベルは、明確に区別された（図５参照）。この結果から、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患を判定できることが示唆された。
バセドウ病患者６名及び健常者４名から調製した血清試料のルシフェラーゼ活性レベルは、明確に区別された（図５参照）。この結果から、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患を判定できることが示唆された。
【0059】
また、バセドウ病患者Ｐ１及びＰ５については、定常状態でのルシフェラーゼ活性レベルは、両者で変わらなかったのに対して、ルシフェラーゼ活性レベルが定常状態に達するまでの時間は、バセドウ病患者Ｐ１と比べ、バセドウ病患者Ｐ５の方が短かった（図６参照）。一方、抗ＴＳＨ受容体抗体量を示すＴＲＡｂ値は、バセドウ病患者Ｐ１の値（１．１）と比べ、バセドウ病患者Ｐ５の値（１５．１）の方が高かった（表１参照）。かかるＴＲＡｂ値の結果を考慮すると、図６において、ルシフェラーゼ活性レベルが定常状態に達するまでの時間と、抗ＴＳＨ受容体抗体量濃度との間には、正の相関関係があると考えらえられる。また、図６において、ルシフェラーゼ活性の定常レベルは、抗ＴＳＨ受容体抗体の刺激活性の度合い（抗体濃度×抗体の親和性）を示していると考えられる。すなわち、バセドウ病患者Ｐ５においては、バセドウ病患者Ｐ１よりも刺激性が低い（ＴＳＨ受容体に対する親和性がバセドウ病患者Ｐ１よりもより低い）抗ＴＳＨ受容体抗体が、バセドウ病患者Ｐ１よりも多く存在したと推測される一方で、バセドウ病患者Ｐ５においては、バセドウ病患者Ｐ１よりも刺激性の強い（ＴＳＨ受容体に対する親和性がバセドウ病患者Ｐ１よりも高い）抗ＴＳＨ受容体抗体が、バセドウ病患者Ｐ１よりも少なく存在したと推測される。
【0060】
このように、本発明の方法を用いて、ルシフェラーゼ活性レベル（ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベル）が定常状態に達するまでの時間と、ルシフェラーゼ活性の定常レベル（ｃＡＭＰバイオセンサー活性の定常レベル）とを測定すると、バセドウ病患者の血液試料中の抗ＴＳＨ受容体抗体濃度と、抗ＴＳＨ受容体抗体のＴＳＨ受容体に対する親和性を算定することができ、バセドウ病の個体差（例えば、難治性か否かなど）が判定できることが期待される。
【0061】
【表1】
【0062】
実施例６．哺乳動物細胞の株種の検討１
哺乳動物細胞の株種の検討を行った。具体的には、以下の材料を用いて、以下の方法を行った。
哺乳動物細胞の株種の検討を行った。具体的には、以下の材料を用いて、以下の方法を行った。
【0063】
６－１ 材料
哺乳動物細胞として、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）とチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85050302）を用いた。測定試料として、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204（４００ ｍＵ／Ｌ）に加えて、バセドウ病患者３名から血液を採取し、定法に従って調製した血清試料を用いた。当該血清試料は、ＴＳＡｂキット「ヤマサ」ＥＩＡ（ヤマサ醤油株式会社製）により甲状腺刺激性自己抗体活性（ＴＳＡｂ％）が１２０％以上を示す検査陽性試料である。
哺乳動物細胞として、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）とチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85050302）を用いた。測定試料として、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204（４００ ｍＵ／Ｌ）に加えて、バセドウ病患者３名から血液を採取し、定法に従って調製した血清試料を用いた。当該血清試料は、ＴＳＡｂキット「ヤマサ」ＥＩＡ（ヤマサ醤油株式会社製）により甲状腺刺激性自己抗体活性（ＴＳＡｂ％）が１２０％以上を示す検査陽性試料である。
【0064】
６－２ 方法
実施例１の「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、ＨＥＫ２９３細胞に加えて、ＣＨＯ細胞についても同様に、２種類のベクター（pGloSenso-22F及びpcDNA3.1_hTSHR）をそれぞれ２µｇ及び０．０２µｇトランスフェクションし、測定試料を添加後２０分時点でのルシフェラーゼ活性レベルを測定した（図７参照）。
実施例１の「１－１ 方法」の項目に記載の方法において、ＨＥＫ２９３細胞に加えて、ＣＨＯ細胞についても同様に、２種類のベクター（pGloSenso-22F及びpcDNA3.1_hTSHR）をそれぞれ２µｇ及び０．０２µｇトランスフェクションし、測定試料を添加後２０分時点でのルシフェラーゼ活性レベルを測定した（図７参照）。
【0065】
６－３ 結果
ＣＨＯ細胞を用いた場合も、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204、及びバセドウ病患者３名由来の血清試料に依存して、ルシフェラーゼ活性レベルの上昇は認められたものの、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の方が、ＣＨＯ細胞を用いた場合よりも、ルシフェラーゼ活性は２～７倍高かった。この結果は、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、ＨＥＫ２９３細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株を用いると、ＣＨＯ細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株以外の細胞株を用いた場合と比べ、ＴＳＡｂの検出感度が向上することを示している。
ＣＨＯ細胞を用いた場合も、ＴＳＡｂ国際標準であるNIBSC 08/204、及びバセドウ病患者３名由来の血清試料に依存して、ルシフェラーゼ活性レベルの上昇は認められたものの、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の方が、ＣＨＯ細胞を用いた場合よりも、ルシフェラーゼ活性は２～７倍高かった。この結果は、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、ＨＥＫ２９３細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株を用いると、ＣＨＯ細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株以外の細胞株を用いた場合と比べ、ＴＳＡｂの検出感度が向上することを示している。
【0066】
実施例７．哺乳動物細胞の株種の検討２
さらに、哺乳動物細胞の株種の検討を行った。具体的には、以下の材料を用いて、以下の方法を行った。
さらに、哺乳動物細胞の株種の検討を行った。具体的には、以下の材料を用いて、以下の方法を行った。
【0067】
７－１ 材料
哺乳動物細胞として、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）とヒト骨腫瘍細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞）（ＥＣＡＣＣより入手、Cat no. 92022711）を用いた。測定試料として、ｒｈＴＳＨを用いた。
哺乳動物細胞として、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）とヒト骨腫瘍細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞）（ＥＣＡＣＣより入手、Cat no. 92022711）を用いた。測定試料として、ｒｈＴＳＨを用いた。
【0068】
７－２ 方法
〔１〕４×１０５個のＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞を６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕pGloSenso-22F（Promega社製）及びpcDNA3.1_hTSHRのプラスミド混合物を、下記の（１）～（４）の手順に従って、ＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞へトランスフェクションした。なお、各ウェル当たり、１μｇのpGloSenso-22Fと、０ｎｇ、４０ｎｇ又は２００ｎｇのpcDNA3.1_hTSHR（それぞれ、図８の「ＴＳＨＲ ０ｎｇ」、「ＴＳＨＲ ４０ｎｇ」、及び「ＴＳＨＲ ２００ｎｇ」）とトランスフェクションし、また、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Polysciences社製）は、その量（μＬ）がプラスミド量（μｇ）に対して、４倍又は８倍（それぞれ図８の「４：１」及び「８：１」）となるように用いた。
（１）ＰＥＩを、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、５分間室温で静置した。
（２）上記プラスミド混合物を、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加した後、プラスミド混合物を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭと、上記（１）で調製した、ＰＥＩを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭとを混合し、２０分間室温で静置した。
（３）上記（２）で調製した、プラスミド混合物及びＰＥＩを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μＬを、ＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞へ滴下した。
〔３〕２４時間培養後、アキュターゼ（ナカライテスク社製）を用いて細胞を剥離し、遠心し、上清を除去後、２５０μＬの反応緩衝液（０．０１％ＢＳＡ、１２５ｍＭ スクロース、１３．８ｍＭ 塩化ナトリウム、及び４％ ＰＥＧを含むＨＢＳＳ）を添加し、細胞を懸濁した。
〔４〕３０μＬの細胞懸濁液を、白色９６ウェルプレートに加えた後、上記反応緩衝液で希釈した８ｍＭ Ｄ－ルシフェリン１０μＬを添加し、２時間遮光しながら静置した後、各種濃度（図８参照）のリコンビナントヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）（サノフィ社製）１０μＬを添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Tecan社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、ｒｈＴＳＨを添加する前のルシフェラーゼ活性レベルも測定した。また、ルシフェラーゼ活性レベルは、ｒｈＴＳＨを添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
〔１〕４×１０５個のＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞を６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
〔２〕pGloSenso-22F（Promega社製）及びpcDNA3.1_hTSHRのプラスミド混合物を、下記の（１）～（４）の手順に従って、ＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞へトランスフェクションした。なお、各ウェル当たり、１μｇのpGloSenso-22Fと、０ｎｇ、４０ｎｇ又は２００ｎｇのpcDNA3.1_hTSHR（それぞれ、図８の「ＴＳＨＲ ０ｎｇ」、「ＴＳＨＲ ４０ｎｇ」、及び「ＴＳＨＲ ２００ｎｇ」）とトランスフェクションし、また、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Polysciences社製）は、その量（μＬ）がプラスミド量（μｇ）に対して、４倍又は８倍（それぞれ図８の「４：１」及び「８：１」）となるように用いた。
（１）ＰＥＩを、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、５分間室温で静置した。
（２）上記プラスミド混合物を、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加した後、プラスミド混合物を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭと、上記（１）で調製した、ＰＥＩを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭとを混合し、２０分間室温で静置した。
（３）上記（２）で調製した、プラスミド混合物及びＰＥＩを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μＬを、ＨＥＫ２９３細胞又はＵ２ＯＳ細胞へ滴下した。
〔３〕２４時間培養後、アキュターゼ（ナカライテスク社製）を用いて細胞を剥離し、遠心し、上清を除去後、２５０μＬの反応緩衝液（０．０１％ＢＳＡ、１２５ｍＭ スクロース、１３．８ｍＭ 塩化ナトリウム、及び４％ ＰＥＧを含むＨＢＳＳ）を添加し、細胞を懸濁した。
〔４〕３０μＬの細胞懸濁液を、白色９６ウェルプレートに加えた後、上記反応緩衝液で希釈した８ｍＭ Ｄ－ルシフェリン１０μＬを添加し、２時間遮光しながら静置した後、各種濃度（図８参照）のリコンビナントヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）（サノフィ社製）１０μＬを添加し、９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Tecan社製）を用いてルシフェラーゼ活性レベルを測定した。なお、比較対照として、ｒｈＴＳＨを添加する前のルシフェラーゼ活性レベルも測定した。また、ルシフェラーゼ活性レベルは、ｒｈＴＳＨを添加し、２０分間インキュベーションした後の値を測定した。
【0069】
７－３ 結果
Ｕ２ＯＳ細胞を用いた場合も、ＴＳＨ受容体の発現と、ｒｈＴＳＨ（すなわち、ＴＳＨ受容体刺激物質）に依存して、ルシフェラーゼ活性レベルの上昇は認められたものの、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の方が、Ｕ２ＯＳ細胞を用いた場合よりも、ルシフェラーゼ活性は３～４倍前後高かった。この結果は、上記実施例６の結果と同様に、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、ＨＥＫ２９３細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株を用いると、Ｕ２ＯＳ細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株以外の細胞株を用いた場合と比べ、ＴＳＡｂの検出感度が向上することを示している。
Ｕ２ＯＳ細胞を用いた場合も、ＴＳＨ受容体の発現と、ｒｈＴＳＨ（すなわち、ＴＳＨ受容体刺激物質）に依存して、ルシフェラーゼ活性レベルの上昇は認められたものの、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の方が、Ｕ２ＯＳ細胞を用いた場合よりも、ルシフェラーゼ活性は３～４倍前後高かった。この結果は、上記実施例６の結果と同様に、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞として、ＨＥＫ２９３細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株を用いると、Ｕ２ＯＳ細胞等のヒト胎児腎細胞由来細胞株以外の細胞株を用いた場合と比べ、ＴＳＡｂの検出感度が向上することを示している。
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明は、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の診断及び治療に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
