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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-16
(45)【発行日】2023-01-24
(54)【発明の名称】グルカゴン受容体アゴニスト
(51)【国際特許分類】
C07K 14/605 20060101AFI20230117BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20230117BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230117BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20230117BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230117BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 5/48 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/08 20060101ALI20230117BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230117BHJP
【ＦＩ】
C07K14/605 ZNA
A61K38/26
A61K45/00
A61K38/22
A61K38/16
A61P3/10
A61P3/04
A61P1/16
A61P3/06
A61P3/00
A61P5/48
A61P3/08
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2018072110
(22)【出願日】2018-04-04
(62)【分割の表示】P 2017531687の分割
【原出願日】2016-10-14
(65)【公開番号】P2018135346
(43)【公開日】2018-08-30
【審査請求日】2019-10-11
(31)【優先権主張番号】62/246,199
(32)【優先日】2015-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100135943
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 規樹
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】コスカン，テイマー
(72)【発明者】
【氏名】アルシナ－フェルナンデス，ジョージ
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】特許第６３２１２９９（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特許第６３５４０１７（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】国際公開第２０１５／０９４８７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０８４８７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０９４８７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１２４６１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５２４４１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０２３８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２４４１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５３７１４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６６６２７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６４９９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０６７７１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Pocai A et al.，Glucagon-like peptide 1/glucagon receptor dual agonism reverses obesity in mice，Diabetes，2009年，Vol.58, No.10，p.2258-2266，doi:10.2337/db09-0278
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ４５／００－４５／０８
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式：ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号５）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩（ただし、
（ｉ）式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩、
（ｉｉ）式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１２））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩、及び
（ｉｉｉ）式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１１））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩
を除く）。
【請求項2】
配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択される構造を有するグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項3】
式：ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号５）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩を含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療するための医薬組成物（ただし、グルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩が
式：
ＹＸ １ ＱＧＴＦＸ ２ ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ ３ ＫＫＡＸ ４ ＥＦＶＸ ５ ＷＬＬＥＸ ６ Ｘ ７
式中、
Ｘ １ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ２ は、Ｔであり、
Ｘ ３ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ４ は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル） ２ －（γＧｌｕ） ａ －ＣＯ－（ＣＨ ２ ） ｂ －ＣＯ ２ Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ ５ は、Ｅであり、
Ｘ ６ は、Ｔであり、
Ｘ ７ は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩であるものを除く）。
【請求項4】
グルカゴン受容体アゴニストが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される構造を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
式：
ＹＸ １ ＱＧＴＦＸ ２ ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ ３ ＫＫＡＸ ４ ＥＦＶＸ ５ ＷＬＬＥＸ ６ Ｘ ７
式中、
Ｘ １ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ２ は、ＴまたはＬであり、
Ｘ ３ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ４ は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル） ２ －（γＧｌｕ） ａ －ＣＯ－（ＣＨ ２ ） ｂ －ＣＯ ２ Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ ５ は、ＥまたはＡであり、
Ｘ ６ は、ＴまたはＥであり、
Ｘ ７ は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号５）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩を含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療するための医薬組成物であって、前記治療が、１つ以上の追加の治療剤の有効量を投与することを含み、前記医薬組成物が前記１つ以上の追加の治療剤を含まない、医薬組成物。
【請求項6】
治療のための請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項7】
Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項8】
Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、及びインスリン受容体アゴニストからなる群から選択される１つ以上の追加の治療剤と組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項9】
Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、デュラグルチドと組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項10】
Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、配列番号１５の構造を有するＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストと組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項11】
請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項12】
追加の治療剤をさらに含む、請求項３、４または１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記追加の治療剤がＧＬＰ－１Ｒアゴニストである、請求項５または１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記追加の治療剤がＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである、請求項５または１２に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストが配列番号１５の構造を有している、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
グルカゴン受容体でのグルカゴン受容体アゴニストの活性が、ＧＬＰ－１受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの能力よりも少なくとも１００倍高い、請求項１または２に記載のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項18】
式：ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号５）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩を含む、非治療的体重減少を誘導するための医薬組成物（ただし、グルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩が
式：
ＹＸ １ ＱＧＴＦＸ ２ ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ ３ ＫＫＡＸ ４ ＥＦＶＸ ５ ＷＬＬＥＸ ６ Ｘ ７
式中、
Ｘ １ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ２ は、Ｔであり、
Ｘ ３ は、Ａｉｂであり、
Ｘ ４ は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル） ２ －（γＧｌｕ） ａ －ＣＯ－（ＣＨ ２ ） ｂ －ＣＯ ２ Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ ５ は、Ｅであり、
Ｘ ６ は、Ｔであり、
Ｘ ７ は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）
からなるグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩であるものを除く）。
【請求項19】
グルカゴン受容体アゴニストが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される構造を有する、請求項１８に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、天然型グルカゴンと比較し、グルカゴン受容体での作用期間が延長された化合物に関する。具体的には、長期間にわたり、グルカゴン受容体を選択的に刺激するよう天然型グルカゴンの構造に導入された修飾を有するグルカゴン受容体アゴニストが提供される。当該グルカゴン受容体アゴニストは、たとえば２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ：ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）及び／または肥満などの疾患を治療するための他の治療剤と併用して、またはたとえば肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ：ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び／もしくは夜間低血糖、ならびに乳牛の脂肪性肝症候群などの様々な疾患の治療のための単剤療法としてのいずれかで有用であり得る。
【背景技術】
【0002】
過去数十年にわたり、糖尿病の有病率は上昇し続けている。Ｔ２ＤＭは最も普遍的な糖尿病型であり、すべての糖尿病のうちのおよそ９０％を占める。Ｔ２ＤＭは、インスリン抵抗性に起因する高血糖を特徴としている。Ｔ２ＤＭに対する現在の標準的な治療として、食事療法と運動、ならびにたとえばグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１：ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体アゴニスト及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ：ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ）阻害剤などのインクレチンをベースとした療法をはじめとする、経口薬及び注射用グルコース降下薬を用いた治療が挙げられる。経口薬及びインクレチンをベースとした療法を用いた治療が不十分である場合、インスリンを用いた治療が検討される。インスリン療法が必要とされるまで疾患が進行した患者は、多くの場合、長期作用型の基礎インスリン（ｂａｓａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ）の毎日の単回注射を開始するが、一部の症例においては、必要に応じて、急速作用型インスリンの食事中の注射も含まれ得る。
【0003】
これら療法の効能に反し、Ｔ２ＤＭの多くの患者において、血糖値は制御不十分な状態が継続する。制御不能な糖尿病によって、患者の病的状態及び死亡に影響を与えるいくつかの状態が引き起こされる。Ｔ２ＤＭの主要なリスク因子のうちの１つが肥満である。Ｔ２ＤＭ患者の多く（約９０％）が、体重過多または太りすぎである。身体の脂肪が減少することにより、高血糖及び心血管系事象をはじめとする肥満関連の併存症の改善がもたらされることが実証されている。それゆえに、より良い疾患管理のためのグルコース制御及び体重減少に有効な療法が必要とされている。
【0004】
さらに、肝臓における脂肪の蓄積に関連した肝疾患群を指す非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ならびにたとえば炎症、肝細胞障害、及び線維化などの組織学的所見により特徴づけられるＮＡＬＦＤの重症型である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の有病率及び認知度も上昇し続けている。ＮＡＳＨは、西側諸国で最も普遍的な肝疾患であり、米国でも成人の３～５％が罹患している。治療には、一般的に、食事療法と運動における規定の変更が含まれ、ならびに肝脂肪を減らすための肥満症治療手術、ピオグリタゾン、スタチン類、オメガ３、及びビタミンＥ療法（非糖尿病性ＮＡＳＨ患者の場合において）が含まれ得るが、ＮＡＳＨに関連した炎症及び／または線維症に対処するために承認された治療剤は無い。ゆえに、さらなる療法が必要とされている。
【0005】
グルカゴンをはじめとする治療剤として入手可能な、及び／または開発中のいくつかのペプチドは、組織中で処理され数種の構造的に関連したペプチドを形成するポリペプチドである、プレ－プログルカゴン（ｐｒｅ－ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）に由来する。グルカゴンは２９アミノ酸のペプチドであり、これはプレ－プログルカゴンのアミノ酸５３～８１に相当し、以下のアミノ酸配列を有している：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号１）。グルカゴンは、肝細胞上のグルカゴン受容体に結合し、活性化することにより、グリコーゲンの形態で保存されていたグルコースをグリコーゲン分解と呼ばれるプロセスによって肝臓から放出させ、血中グルコース値を維持する。グリコーゲン貯蔵が枯渇すると、グルカゴンが肝臓を刺激し、糖新生によって新たなグルコースを合成させる。このグルコースは血流中に放出され、低血糖症の発現を防止する。グルカゴン投与は、急性低血糖症治療のための療法として確立されており、緊急のグルカゴン投与によって、投与の数分以内に正常なグルコース値が回復される。あるグルカゴンアナログは、溶解度と安定性の改善を示すことが報告されている。たとえば、ＷＯ２０１５０９４８７５、ＷＯ２０１５０９４８７６、ＷＯ２０１５０９４８７８を参照のこと。
【0006】
プレ－プログルカゴン由来の他のペプチドとしては、ＧＬＰ－１、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）、及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ：ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）が挙げられる。ＧＬＰ－１は３６アミノ酸のペプチドであり、その主要な生物学的活性断片（ＧＬＰ－１７－３６）は、プレ－プログルカゴンのアミノ酸９８～１２７に相当するＣ末端アミド化ペプチドである３０アミノ酸として産生され、以下のアミノ酸配列を有している：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号２）。グルカゴンはグルコースの放出を刺激し低血糖症を防止する一方で、ＧＬＰ－１（配列番号２）はインスリン合成及び分泌を刺激し、糖尿病において高血糖症を防止することが示されている。エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、及びデュラグルチドをはじめとする様々なＧＬＰ－１アナログが現在入手可能である。
【0007】
ＯＸＭは、オクタペプチドカルボキシ末端伸長（プレ－プログルカゴンのアミノ酸８２～８９であり、「介在ペプチド１：ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ１」またはＩＰ－１と名付けられている）を伴うグルカゴンの完全２９アミノ酸配列から構成されている３７アミノ酸ペプチドであり、以下のアミノ酸配列を有している：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３）。ＯＸＭは、グルカゴンとＧＬＰ－１の受容体の両方を活性化するが、ＧＬＰ－１受容体よりもグルカゴン受容体のほうが、若干効力が高い。グルカゴン受容体とＧＬＰ－１受容体の二重活性を有するＯＸＭのアナログが報告されている。たとえば、ＷＯ２０１１０８７６７２、ＷＯ２０１１０８７６７１を参照のこと。
【0008】
プレ－プログルカゴン由来ではないが、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）も、グルコース存在下で膵臓ベータ細胞からのインスリン分泌を刺激することによって、グルコースの恒常性に生理学的な役割を果たすもう１つのペプチドである。ＧＩＰは、以下のアミノ酸配列を有している４２アミノ酸ペプチドである：ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号４）。ＧＩＰのあるアナログは、ＧＩＰとＧＬＰ－１の受容体活性の両方を示すことが報告されている。たとえば、ＷＯ２０１５０６７７１５、ＷＯ２０１１１１９６５７、ＷＯ２０１３１６４４８３を参照のこと。
【0009】
さらに、上述のＯＸＭの二重活性と同様に、あるグルカゴンアナログは、グルカゴン受容体と、ＧＬＰ－１受容体またはＧＩＰ受容体のうちの１つ以上の両方の共アゴニスト活性を有していることが報告されている。たとえば、ＷＯ２０１１０７５３９３及びＷＯ２０１２１７７４４４は、グルカゴン受容体とＧＬＰ－１受容体の両方で活性を有するグルカゴンアナログを報告すると主張している。同様に、ＷＯ２０１３１９２１３０は、ＧＩＰ受容体でも活性を有するグルカゴンアナログを報告すると主張している。さらに、ＷＯ２０１５０６７７１６は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体の各々で、三重のアゴニスト活性を有するアナログを報告すると主張している。
【0010】
Ｔ２ＤＭ及び／または肥満の治療法として提案されている様々なペプチド及びタンパク質があるにもかかわらず、現在利用可能及び／または開発中の治療法には限界がある。特に、上述の二重アゴニストまたは三重アゴニストは、グルカゴン受容体アゴニストの代謝利益と共に、ＧＬＰ－１受容体及び／またはＧＩＰ受容体のグルコース低減特性をもたらすと述べられているが、それらが刺激する様々な各受容体でのかかるペプチドの活性レベルは固定されており、そのため、最小限の副作用で高い効能をｉｎ ｖｉｖｏで得るための理想的な受容体活性化バランスを得ることが困難となっている。さらに、グルカゴン受容体作動性が関与しない療法は、かかる作用メカニズムの潜在的な代謝利益を欠いている。
【0011】
グルカゴンの同時投与によってかかる制限の軽減が理論上可能であり得る一方で、現在利用可能なグルカゴン製品はかかる応用への使用に対して現実的ではない。特に、グルカゴンの血漿半減期は１時間未満であり、特に、利用可能な及び／または開発中の他の治療法との併用を含む実施形態において、多くのかかる治療法は１日１度の頻度での投与、及び一部では週に１度の頻度での投与が提案されるため、常用的な使用は現実的ではない。加えて、野生型のグルカゴンもまたＧＬＰ－１受容体で何らかの活性を有しているため、他の化合物がＧＬＰ－１受容体低下活性を有している併用療法においては、ＧＬＰ－１受容体活性に対するグルカゴンの適切なバランスを取る試みを複雑化させ得る。さらには、現在利用可能なグルカゴン製品の溶解性ならびに化学的及び物理的な安定特性もまた、かかる応用における常用的な使用に不適切であり、他の治療剤との合剤も困難である。
【0012】
従って、１日に１回、週に３回、週に２回、または週に１回の頻度での投与が可能となる、作用期間が延長されたグルカゴン受容体アゴニストに対するニーズが存在する。また、グルカゴン受容体での強力な活性を有し、ＧＬＰ－１受容体と比較し、グルカゴン受容体で高い選択活性を有するグルカゴン受容体アゴニストに対するニーズが存在する。また、他の治療剤と合剤に適した特性を有するグルカゴン受容体アゴニストに対するニーズも存在する。また、長期間の保管と使用が可能となる溶解性と安定性を有するグルカゴン受容体アゴニストに対するニーズも存在する。
【発明の概要】
【0013】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストはこれらニーズを満たすものである。従って、本発明は、１日に１回、週に３回、週に２回、または週に１回の頻度での投与が可能となる、作用期間が延長されたグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、たとえばＧＬＰ－１受容体及び／またはＧＩＰ受容体と比較し、グルカゴン受容体で最適かつ選択的な活性を有するグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、常用的な使用及び他の治療剤との合剤に適した物理的及び化学的特性を有するグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、他の糖尿病治療と併用して使用された場合に、グルコース制御の強化がもたらされ、たとえば体重減少などの代謝利益がもたらされ、及び／または他の糖尿病治療と併用して使用された場合にたとえばＰＣＳＫ９低下などの脂質利益がもたらされるグルカゴン受容体アゴニストを提供する。特に、ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストと本発明のグルカゴン受容体アゴニストの併用は、たとえば体重減少及び身体組成などの評価基準に対し、有益な相乗的効果を有している。本発明はまた、単剤療法として用いられた場合、及び／または他の療法と併用されて用いられた場合に、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、代謝異常、高インスリン血症、及び／または夜間低血糖をはじめとする他の疾患に対し効果的な治療を提供するものである。
【0014】
従って、本発明の実施形態は、以下の式Ｉ：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７ ［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、を含むグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７ ［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、を含むグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
【0015】
本発明の他の実施形態は、以下の式Ｉ：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、からなる式を含むグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、からなる式を含むグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
【0016】
本発明の他の実施形態は、以下の式Ｉ：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、からなるグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ]
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている（配列番号５）、からなるグルカゴン受容体アゴニスト、またはその医薬的に許容可能な塩を提供するものである。
【0017】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴである式Ｉの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＬである式Ｉの構造を有している。
【0018】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ５がＥである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ５がＡである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。
【0019】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ６がＴである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ６がＥである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。
【0020】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７がＧＰＳＳＧである上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７が存在しない上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。
【0021】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６～２０である上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６～１８である上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６である上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１８である上述の実施形態のうちのいずれかの構造を有している。
【0022】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、及びＸ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、ならびにＣ末端アミノ酸が、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号６）。
【0023】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸が、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号７）。
【0024】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＬであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、及びＸ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、ならびにＣ末端アミノ酸が、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号８）。
【0025】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、及びＸ７がＧＰＳＳＧであり、ならびにＣ末端アミノ酸が、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号９）。
【0026】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、及びＸ７がＧＰＳＳＧであり、ならびにＣ末端アミノ酸が、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号１０）。
【0027】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、及びＸ７が存在しない、式Ｉの構造を有している（配列番号１１）。
【0028】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、及びＸ７が存在しない、式Ｉの構造を有している（配列番号１２）。
【0029】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、ａが２であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＴであり、及びＸ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり、ならびにＣ末端アミノ酸がアミド化されている、式Ｉの構造を有している（配列番号１６）。
【0030】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、及びＸ７が存在しない、式Ｉの構造を有している（配列番号１７）。
【0031】
ある実施形態において、グルカゴン受容体でのグルカゴン受容体アゴニストの活性は、ＧＬＰ－１受容体での当該グルカゴン受容体アゴニストの活性よりも少なくとも１００倍高い。
【0032】
本発明の他の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療する方法を提供する。
【0033】
本発明の他の実施形態は、１つ以上の追加の治療剤の有効量と併用して、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療する方法を提供する。ある実施形態において、疾患はＴ２ＤＭである。ある実施形態において、疾患は肥満である。ある実施形態において、疾患は脂肪性肝疾患である。ある実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４：ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４）阻害剤、及びナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２：ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２）阻害剤からなる群から選択される。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストである。ある実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。ある実施形態において、追加の治療剤はＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである。ある実施形態において、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、配列番号１５の構造を有している。ある実施形態において、追加の治療剤はインスリン受容体アゴニストである。
【0034】
ある実施形態において、グルカゴン受容体アゴニストは、たとえばＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストなどの追加の治療剤と併用されて使用されたときに、体重減少と身体組成に対し相乗的効果を有している。
【0035】
本発明の他の実施形態は、治療における本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。本発明の他の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患の治療における、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。ある実施形態において、疾患はＴ２ＤＭである。ある実施形態において、疾患は肥満である。ある実施形態において、疾患は脂肪性肝疾患である。
【0036】
本発明の他の実施形態は、治療のための、１つ以上の追加の治療剤と併用した、同時の、別々の、または連続の使用のための、本発明グルカゴン受容体アゴニストを提供する。ある実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ－４阻害剤、及びナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤からなる群から選択される。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストである。ある実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。ある実施形態において、追加の治療剤はＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである。ある実施形態において、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、配列番号１５の構造を有している。
【0037】
本発明の他の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖の治療のための医薬の製造における本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。
【0038】
本発明の他の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト、及び医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、医薬組成物はさらに、追加の治療剤を含む。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ－４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤からなる群から選択される。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストである。ある実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。ある実施形態において、追加の治療剤はＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである。ある実施形態において、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、配列番号１５の構造を有している。ある実施形態において、追加の治療剤はインスリン受容体アゴニストである。
【0039】
本発明の他の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量の投与を含む、非治療的な体重減少を誘導する方法を提供する。
【0040】
本発明の他の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、その必要のあるウシに投与することを含む、ウシにおける脂肪性肝症候群を治療する方法を提供する。
【0041】
本発明の他の実施形態は、ウシにおける脂肪性肝症候群の治療のための、本発明のグルカゴン受容体アゴニストを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本明細書において用いられる場合、「グルカゴン受容体アゴニスト」という用語は、グルカゴン受容体に結合及び活性化し、ＧＬＰ－１受容体と比較し、グルカゴン受容体での選択活性を維持し、それによって単剤療法として投与されたときに血清グルコース値を上昇させる天然型ヒトグルカゴン（配列番号１）、グルカゴンアナログ、グルカゴン誘導体、またはグルカゴン融合タンパク質のアミノ酸配列を含む化合物を意味する。かかる結合特性及び薬力学的効果は、たとえば以下の実験において記載される方法などの公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ法及びｉｎ ｖｉｖｏ法を用いて測定され得る。グルカゴンアナログは、天然型ヒトグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列と比較し、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、逆位、または付加をはじめとする改変を有する分子である。グルカゴン誘導体は、天然型ヒトグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列またはグルカゴンアナログのアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖基、α炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の少なくとも１つの化学的修飾をさらに有する分子である。グルカゴン融合タンパク質は、グルカゴン、グルカゴンアナログ、またはグルカゴン誘導体と、たとえばイムノグロブリンＦｃ領域などの第二のポリペプチドを含む異種タンパク質である。
【0043】
また本発明のグルカゴン受容体アゴニストの活性は、ＧＬＰ－１受容体と比較し、グルカゴン受容体に対し選択的である。本明細書において用いられる場合、「～と比較し、選択的」、「選択性」、及び「～に対して選択的」という用語は、ＧＬＰ－１受容体よりもグルカゴン受容体に対し、５０、１００、２００、２５０、５００または１０００倍高い能力を示す化合物を指す。かかる選択性は、以下の実験において記載される方法などの公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて測定され得る。
【0044】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、１日に１回、週に３回、週に２回、または週に１回の頻度での投与を可能とする長時間作用プロファイルを有する。グルカゴン受容体アゴニストの時間作用プロファイルは、公知の薬物動態試験法を用いて測定され得る。
【0045】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストの長時間作用プロファイルは、２０位のリシンアミノ酸の側鎖のイプシロンアミノ基に結合された脂肪酸部分の使用を介して得られる。脂肪酸はリンカーを介してリシン側鎖のイプシロンアミノ基に結合され、当該リンカーは、［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａを含有しており、式中、ａは１または２である。脂肪酸及びリンカー中のガンマ－グルタミン酸はアルブミン結合剤として作用し、長期作用型化合物生成の潜在能力を提供する。リンカーを介して２０位のリシンアミノ酸の側鎖のイプシロンアミノ基に結合した脂肪酸は、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを含有し、この場合においてｂは１４～２４である。従って、完全なリンカー－脂肪酸構造は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを含有し、この場合においてａは１または２であり、ｂは１４～２４である。以下の実施例１～７の化学構造において示されるように、［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチルの第一の単位は、リシン側鎖のイプシロンアミノ基に連結されている。次いで、［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチルの第二の単位は、［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－アセチルの第一の単位アミノ基に付加される。次いで、γＧｌｕの第一の単位が、側鎖のγ－カルボキシル基を介して［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチルの第二の単位のアミノ基に付加される。ａ＝２である場合、γＧｌｕの第二の単位は、側鎖のγ－カルボキシル基を介してγＧｌｕの第一の単位のα－アミノ基に付加される。最後に、脂肪酸が、γＧｌｕの第一の単位（ａ＝１の場合）または第二の単位（ａ＝２の場合）のα－アミノ基に付加される。
【0046】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、好ましくは非経口経路（たとえば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）により投与される医薬組成物として製剤化される。かかる医薬組成物及び当該組成物を調製する方法は当分野に公知である。（たとえば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)を参照のこと）。好ましい投与経路は皮下である。
【0047】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、多くの無機酸または有機酸のいずれかと反応し、医薬的に許容可能な酸付加塩を形成してもよい。医薬的に許容可能な塩、及びそれらを調製するための普遍的な技法は当分野に公知である（たとえば、P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)を参照のこと）。本発明の医薬的に許容可能な塩としては、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。
【0048】
ＧＬＰ－１受容体よりもグルカゴン受容体へと指向する本発明のグルカゴン受容体アゴニストの選択性によりもたらされる注目すべき１つの利点は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストが追加の治療剤と併用されて投与されたときの、他の受容体（複数含む）（たとえば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ及び／またはインスリンの受容体）での活性とグルカゴン受容体での活性の比率といった、順応性のある治療選択を提供する能力である。従って、ある好ましい実施形態において、本発明は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、追加の治療剤と併用して、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者のＴ２ＤＭを治療する方法を提供する。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、またはインスリン受容体アゴニストからなる群から選択される。
【0049】
本明細書において用いられる場合、「追加の治療剤（複数含む）」という用語は、たとえばＴ２ＤＭ及び／または肥満に対する治療などの有益な治療効果を有することが知られている、現在入手可能及び／または開発中である、たとえばＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ－４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤などをはじめとする他の化合物（複数含む）を意味する。
【0050】
本明細書において用いられる場合、「併用されて」という用語は、１つ以上の追加の治療剤との同時投与、連続投与、または単一複合製剤でのいずれかの本発明のグルカゴン受容体アゴニストの投与を意味する。
【0051】
本明細書において用いられる場合、「ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、」という用語は、ＧＬＰ－１受容体での活性を維持している天然型ヒトＧＬＰ－１（配列番号２）、ＧＬＰ－１アナログ、ＧＬＰ－１誘導体、またはＧＬＰ－１融合タンパク質のアミノ酸配列を含む化合物を指す。ＧＬＰ－１受容体の活性は、ＧＬＰ－１受容体の結合活性または受容体活性化を測定するｉｎ ｖｉｖｏ実験及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの使用をはじめとする当分野に公知の方法により測定され得る。ＧＬＰ－１アナログは、天然型ヒトＧＬＰ－１のアミノ酸配列（配列番号２）と比較した場合に、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、逆位、または付加を含む改変を有する分子である。ＧＬＰ－１誘導体は、天然型ＧＬＰ－１のアミノ酸配列（配列番号２）またはＧＬＰ－１アナログのアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖基、α炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の少なくとも１つの化学的修飾をさらに有する分子である。ＧＬＰ－１融合タンパク質は、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１アナログ、またはＧＬＰ－１誘導体、及びたとえばイムノグロブリンＦｃ領域などの第二のポリペプチドを含む異種タンパク質である。現在入手可能及び／または開発中のＧＬＰ－１Ｒアゴニストとしては、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、及びセマグルチドが挙げられる。本発明のグルカゴン受容体アゴニストがＧＬＰ－１Ｒアゴニストと併用されて投与される、ある好ましい実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。たとえば、米国特許第７，４５２，９６６号を参照のこと。
【0052】
本明細書において用いられる場合、「ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト」という用語は、ＧＩＰ受容体とＧＬＰ－１受容体の両方で活性を有する化合物を指す。ＧＩＰ受容体及びＧＬＰ－１受容体の活性は、ＧＩＰ受容体及び／またはＧＬＰ－１受容体の結合活性または受容体活性化を測定するｉｎ ｖｉｖｏ実験及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの使用をはじめとする当分野に公知の方法により測定され得る。現在利用可能なＴ２ＤＭ治療剤としてのＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは無いが、複数のＧＩＰアナログが、ＧＩＰ受容体活性及びＧＬＰ－１受容体活性の両方を示すことが報告されている。たとえば、ＷＯ２０１３１６４４８３、ＷＯ２０１１１１９６５７を参照のこと。
【0053】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストがＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストと併用されて投与される、ある好ましい実施形態において、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは以下の構造を有しているか、またはその医薬的に許容可能な塩である：
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ （ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１０～２０であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅまたは１－ナフチルアラニン（１－Ｎａｌ）であり、
及びＣ末端アミノ酸は任意選択的にアミド化されている（配列番号１３）。
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ （ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１０～２０であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅまたは１－ナフチルアラニン（１－Ｎａｌ）であり、
及びＣ末端アミノ酸は任意選択的にアミド化されている（配列番号１３）。
【0054】
ある好ましい実施形態において、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ４は、１－Ｎａｌであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１４）。ある好ましい実施形態において、ａは１であり、ｂは１８であり、Ｘ４はＰｈｅであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１５）。かかるＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、以下のペプチド合成実施例において記載されているように、本発明のグルカゴン受容体アゴニストを調製するために用いられ得る技術などの技術を用いて調製され得る。
【0055】
本明細書において用いられる場合、「インスリン受容体アゴニスト」という用語は、ヒトインスリン、またはそのアナログもしくは誘導体、またはインスリン受容体に結合し活性化することができる任意の他のタンパク質を指す。インスリン受容体活性は、インスリン受容体の結合活性または受容体活性化を測定するｉｎ ｖｉｖｏ実験及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの使用をはじめとする当分野に公知の方法により測定され得る。インスリンアナログは、天然型ヒトインスリンと比較し、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、逆位、または付加を含む改変を有する分子であり、その構造は公知である。インスリン誘導体は、天然型ヒトインスリンまたはそのアナログのアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖基、α－炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の少なくとも１つの化学的修飾をさらに有する分子である。インスリン融合タンパク質は、インスリン、インスリンアナログ、またはインスリン誘導体部分と、第二のポリペプチドを含む異種タンパク質である。本発明のグルカゴン受容体アゴニストがインスリン受容体アゴニストと併用されて投与される実施形態における使用に対し、任意のインスリン受容体アゴニストが検討され得るが、好ましいインスリン受容体アゴニストは、定常的な、または延長された作用期間を有するアゴニストである。基礎的な活性を有する現在入手可能なインスリン受容体アゴニストとしては、インスリングラルギン、インスリンデテミル、及びインスリンデグルデクが挙げられ、それら各々は１日１回の投与が指定されている。
【0056】
ある実施形態において、本発明は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者のＴ２ＤＭの治療のための方法を提供する。
【0057】
ある実施形態において、本発明は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者の肥満の治療のための方法を提供する。
【0058】
ある実施形態において、本発明は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者の脂肪性肝疾患の治療のための方法を提供する。
【0059】
ある実施形態において、本発明は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者のＮＡＳＨの治療のための方法を提供する。
【0060】
他の実施形態において、本発明はまた、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、たとえばＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ－４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤などの１つ以上の追加の治療剤と併用して、かかる治療の必要がある患者に対し投与することを含む、患者のＴ２ＤＭの治療方法を提供する。
【0061】
本明細書において用いられる場合、「その必要のある患者」という用語は、たとえばＴ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ及び／またはメタボリック症候群などをはじめとする、治療を必要としている疾患または状態を有する哺乳類、好ましくはヒトまたはウシを指す。
【0062】
本明細書において用いられる場合、「有効量」という用語は、患者に対する単回投与または複数回投与で、診断された患者または治療中の患者に所望される効果をもたらす本発明のグルカゴン受容体アゴニストもしくはその医薬的に許容可能な塩の量または投与量を指す。有効量は、公知技術の使用を介して、及び類似の環境下で得られた結果を観察することにより、当分野の当業者により容易に決定することができる。患者の有効量決定において、限定されないが、哺乳類の種類；その大きさ、年齢及び一般健康状態；関与する具体的な疾患または障害；疾患または障害の程度または関与または重篤度；個々の患者の反応性；投与される特定のグルカゴン受容体アゴニスト；投与様式、投与される調製物の生体利用効率の特徴；選択された用法；併用薬の使用；及び他の関連する状況をはじめとする多くの因子が考慮される。
【0063】
本発明のあるグルカゴン受容体アゴニストは、一般的に、広範な用量範囲にわたり有効である。たとえば週１回投与の用量は、週当たり、約０．０１～約３０ｍｇ／ヒトの範囲内にあり得る。本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、毎日、週に３回、週に２回、または週に１回投与されてもよい。週に１回の投与が好ましい。
【0064】
本明細書において用いられる場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ、またはｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語は、既存の症状もしくは疾患の進行または重篤度を抑えること、減速させること、停止させること、または反転させることを含む。
【0065】
本発明のアミノ酸配列は、２０個の天然型アミノ酸に対する標準的な一文字または三文字のコードを含む。さらに、「Ａｉｂ」は、アルファアミノイソ酪酸である。本発明はまた、本発明のグルカゴン受容体アゴニストまたはその医薬的に許容可能な塩の合成に有用な新規中間体及び方法を包含する。本発明の中間体及びグルカゴン受容体アゴニストは、当分野に公知の様々な手順により調製され得る。特に、化学合成を用いる方法を、以下の実施例において解説する。記載される各経路の特定の合成工程を異なる方法で組み合わせ、本発明のグルカゴン受容体アゴニストを調製してもよい。試薬及び開始材料は、当分野の当業者が容易に入手可能である。
【0066】
本発明を以下の実施例によりさらに解説するが、それらは限定と見なされるべきではない。
【実施例】
【0067】
ペプチド合成
実施例１
実施例１は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）。
実施例１
実施例１は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）。
【0068】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例１の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化1】
【0069】
実施例１のペプチドは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ自動化ペプチド合成器（ＰＴＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）上で、ＲＡＰＰ ＡＭ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂から開始し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で活性化された６当量のアミノ酸（１：１：１のモル比）を用いたカップリングで、９０分間、２５℃で行われるＦｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ法を用いた固相ペプチド合成により生成される。
【0070】
粗ペプチドの質を改善するために、Ｐｒｏ３１（４時間）、Ｔｒｐ２５（４時間）、Ｇｌｕ２４（４時間）、Ｖａｌ２３（１０時間）、Ｇｌｕ２１（４時間）、Ａｉｂ１６（４時間）、Ａｓｐ１５（４時間）、Ｔｈｒ７（４時間）、Ｔｈｒ５（４時間）、Ｇｌｙ４（４時間）、Ｇｌｎ３（４時間）及びＡｉｂ２（２４時間）に対する伸長カップリングが必要とされる。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨの基礎的要素をＬｙｓ２０カップリング（オルソゴナル保護基）に用いて、合成プロセス中、後で脂肪酸部分の部位特異的な付加を可能とさせる。Ｎ末端残基は、上述のＤＩＣ－ＨＯＢｔプロトコールを用いて、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨとして組み込まれる（２４時間カップリング）。
【0071】
上述のペプチド－樹脂伸長が終了した後、Ｌｙｓ２０中に存在しているＡｌｌｏｃ保護基を、スカベンジャーとしてＰｈＳｉＨ３の存在下、触媒量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて除去する。Ｌｙｓ２０側鎖を伸長するためにＦｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ法を用いた追加のカップリング／脱保護サイクルは、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ２－ＣＨ２ＣＯＯＨ（ＣｈｅｍＰｅｐ カタログ番号 ２８０１０２）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（ＣｈｅｍＰｅｐ カタログ番号 １００７０３）及びＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯｔＢｕを含む。すべてのカップリングにおいて、３当量の基礎的要素が、ＤＭＦ中、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）と共に４時間、２５℃で用いられる。
【0072】
樹脂からの同時開裂及び側鎖保護基の除去は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール：水：チオアニソール９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）を含有する溶液中で２時間、２５℃で行われ、次いで、冷エーテルを用いて沈殿される。Ｃ１８カラム上で水／アセトニトリル（０．０５％ ｖ／ｖ ＴＦＡ含有）勾配を用いた逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより適切な分画をプールし、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩を生じさせることによって、粗ペプチドを９９％超の純度まで精製する（１５～２０％の精製収率）。
【0073】
原則的に上述のように行った合成において、実施例１の純度は、分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７１３．６；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７１４．３；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８５．７；観測地 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８５．９）を用いて確認される。
【0074】
実施例２
実施例２は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号７）。
実施例２は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号７）。
【0075】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例２の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化2】
【0076】
実施例２のペプチドは、上述の実施例１と同様に合成される。ＤＭＦ中、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）と共に３当量の基礎的要素を用いて、４時間、２５℃で、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１８－ＣＯＯｔＢｕが組み込まれる。
【0077】
原則的に上述の実施例１と同様に行われた合成において、実施例２の純度は分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７２３．２；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７２３．６；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２９２．９；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２９３．０）を用いて確認される。
【0078】
実施例３
実施例３は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＬであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号８）。
実施例３は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＬであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号８）。
【0079】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例３の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化3】
【0080】
実施例３のペプチドは、上述の実施例１と同様に合成される。
【0081】
原則的に上述の実施例１のように行われた合成において、実施例３の純度は分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７１７．４；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７１８．３；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８８．３；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８９．０）を用いて確認される。
【0082】
実施例４
実施例４は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号９）。
実施例４は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号９）。
【0083】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例４の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化4】
【0084】
実施例４のペプチドは、上述の実施例１と同様に合成される。
【0085】
原則的に上述の実施例１のように行われた合成において、実施例４の純度は分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５６３．７；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５６４．４；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１７２．９；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４ ＝１１７３．６）を用いて確認される。
【0086】
実施例５
実施例５は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１０）。
実施例５は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＥであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＧＰＳＳＧであり、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１０）。
【0087】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例５の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化5】
【0088】
実施例５のペプチドは、上述の実施例１と同様に合成される。
【0089】
原則的に上述の実施例１及び２のように行われた合成において、実施例５の純度は分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５７２．９；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５７３．８；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１７９．８；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１８０．６）を用いて確認される。
【0090】
実施例６
実施例６は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは１であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７は存在せず、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端酸である（配列番号１１）。
実施例６は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは１であり、ｂは１６であり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７は存在せず、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端酸である（配列番号１１）。
【0091】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例６の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化6】
【0092】
実施例６のペプチドは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ自動化ペプチド合成器（ＰＴＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）上で、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｗａｎｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社 カタログアイテム番号 ８５６００８；開始量 ０．５１ｍｍｏｌ／ｇ）から開始し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で活性化された６当量のアミノ酸（１：１：１のモル比）を用いたカップリングで９０分間、２５℃で行われるＦｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ法を用いた固相ペプチド合成により生成される。
【0093】
粗ペプチドの質を改善するために、Ｔｒｐ２５（４時間）、Ａｌａ２４（４時間）、Ｖａｌ２３（１０時間）、Ｇｌｕ２１（４時間）、Ａｉｂ１６（４時間）、Ａｓｐ１５（４時間）、Ｔｈｒ７（４時間）、Ｔｈｒ５（４時間）、Ｇｌｎ３（４時間）及びＡｉｂ２（２４時間）に対する伸長カップリングが必要とされる。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨの基礎的要素を用いて（オルソゴナル保護基）、合成プロセス中、後でＬｙｓ２０カップリングによる脂肪酸部分の部位特異的な付加を可能とする（４時間のカップリング時間）。Ｎ末端残基は、上述のＤＩＣ－ＨＯＢｔプロトコールを用いて、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨとして組み込まれる（２４時間カップリング）。
【0094】
上述のペプチド－樹脂伸長が終了した後、Ｌｙｓ２０中に存在しているＡｌｌｏｃ保護基を、スカベンジャーとしてＰｈＳｉＨ３の存在下、触媒量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて除去する。Ｌｙｓ２０側鎖を伸長するためのＦｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ法を用いた追加のカップリング／脱保護サイクルは、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ２－ＣＨ２ＣＯＯＨ（ＣｈｅｍＰｅｐ社 カタログ番号 ２８０１０２）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（ＣｈｅｍＰｅｐ社 カタログ番号 １００７０３）及びＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯｔＢｕを含んだ。すべてのカップリングにおいて、ＤＭＦ中、３当量の基礎的要素が、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）と共に４時間、２５℃で用いられる。
【0095】
樹脂からの同時開裂及び側鎖保護基の除去は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール：水：チオアニソール９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）を含有する溶液中で２時間、２５℃で行われ、次いで、冷エーテルを用いて沈殿される。Ｃ１８カラム上で水／アセトニトリル（０．０５％ ｖ／ｖ ＴＦＡ含有）勾配を用いた逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行い、そこで適切な分画をプールし、凍結乾燥することにより、粗ペプチドを９９％超の純度まで精製する（１５～２０％の精製収率）。
【0096】
原則的に上述のように行った合成において、実施例６の純度は、分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１３８２．７；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１３８３．３；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０３６．６；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０３７．７）を用いて確認される。
【0097】
実施例７
実施例７は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは１であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７は存在せず、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端酸である（配列番号１２）。
実施例７は、以下の記載により表されるグルカゴン受容体アゴニストである：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、Ｘ１はＡｉｂであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＡｉｂであり、Ｘ４は（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されたＫであり、ａは１であり、ｂは１８であり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７は存在せず、及びＣ末端アミノ酸はＣ末端酸である（配列番号１２）。
【0098】
以下は、Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０の残基を例外として、標準的な一文字のアミノ酸コードを用いた実施例７の構造の記載であり、これらアミノ酸残基の構造は伸長されている。
【化7】
【0099】
実施例７のペプチドは、上述の実施例６と同様に合成される。ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１８－ＣＯＯｔＢｕが、ＤＭＦ中、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）と共に３当量の基礎的要素を用いて、４時間、２５℃で組み込まれる。
【0100】
原則的に上述の実施例６のように行われる合成において、実施例７の純度は、分析的逆相ＨＰＬＣにより検証され、同一性はＬＣ／ＭＳ（実測値：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１３９１．８；計算値 Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１３９２．６；実測値：Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０４４．３；計算値 Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０４４．７）を用いて確認される。
【0101】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの機能性
結合アフィニティ
実施例１～７のペプチドの結合アフィニティは、組み換えヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ－Ｒ）、マウスグルカゴン受容体（ｍＧｃｇ－Ｒ）及びラットグルカゴン受容体（ｒＧｃｇ－Ｒ）に対して決定される。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ：ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）法、及びｈＧｃｇ－Ｒ、ｍＧｃｇ－ＲまたはｒＧｃｇ－Ｒを過剰発現する２９３ＨＥＫ安定トランスフェクト細胞から調製された膜を用いて、放射性リガンド競合結合アッセイを行い、実施例１～７のペプチドに対する平衡解離定数（Ｋｉ）を決定する。実験プロトコール及び結果を以下に記載する。
結合アフィニティ
実施例１～７のペプチドの結合アフィニティは、組み換えヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ－Ｒ）、マウスグルカゴン受容体（ｍＧｃｇ－Ｒ）及びラットグルカゴン受容体（ｒＧｃｇ－Ｒ）に対して決定される。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ：ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）法、及びｈＧｃｇ－Ｒ、ｍＧｃｇ－ＲまたはｒＧｃｇ－Ｒを過剰発現する２９３ＨＥＫ安定トランスフェクト細胞から調製された膜を用いて、放射性リガンド競合結合アッセイを行い、実施例１～７のペプチドに対する平衡解離定数（Ｋｉ）を決定する。実験プロトコール及び結果を以下に記載する。
【0102】
ヒトＧｃｇ受容体結合アッセイには、組み換えｈＧｃｇ－Ｒを過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞から単離されたクローン化ｈＧｃｇ－Ｒ（Lok, S, et. al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)）を用いる。ｈＧｃｇ－Ｒ ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤ（Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)）へとサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞へとトランスフェクトし、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを用いて選択する。
【0103】
マウスＧｃｇ－Ｒ受容体結合アッセイには、２９３ＨＥＫ膜から単離されたクローン化マウスグルカゴン受容体（ｍＧｃｇＲ）（Burcelin R, Li J, Charron MJ. Gene 164 (2), 305-10 (1995) GenBank: L38613）を用いる。ｍＧｃｇＲ ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）－ＺｅｏＲへとサブクローニングする。このプラスミドを２９３ＨＥＫ細胞へとトランスフェクトし、１００μｇ／ｍＬのゼオシンを用いてクローン株を選択する。
【0104】
ラットＧｃｇ受容体結合アッセイには、ｒＧｃｇ－Ｒを一過性に発現する２９３ＨＥＫ細胞から単離された膜中のクローン化ラットグルカゴン受容体（ｒＧｃｇ－Ｒ）（Svoboda, M, Ciccarelli, E, Tastenoy, M, Robberecht, P, Christophe, J. A cDNA construct allowing the expression of rat hepatic glucagon receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1), 135-142 (1993), GenBank: L04796）を用いる。ｒＧｃｇ－Ｒ ｃＤＮＡを発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）－ＺｅｏＲへとサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞へとトランスフェクトし、４８時間、一過性に発現させる。
【0105】
付着性培養物からの細胞を用いて粗細胞膜を調製する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及びＥＤＴＡ有りのＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する低張緩衝液中、氷上で細胞を溶解させる。細胞懸濁液を、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）乳棒に適合させたガラスＰｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用いて、２５ストローク、破砕する。ホモジネート物を１０分間、４℃、１１００ｘｇで遠心する。上清を集め、低張緩衝液中で沈殿物を再懸濁し、再度ホモジナイズしながら氷上で保存する。混合物を１０分間、１１００ｘｇで遠心する。第二の上清を第一の上清と併せて１つにまとめ、１時間、４℃、３５０００ｘｇで遠心する。膜沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤を含有するホモジナイゼーション緩衝液中で再懸濁し、液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで－８０℃の冷凍庫中で分注して保存する。
【0106】
Ｇｃｇは、Ｉ－１２５－ラクトペルオキシダーゼ法により放射ヨウ素標識され、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ（ＮＥＸ２０７）で逆相ＨＰＬＣにより精製される。特異的活性は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。ＫＤの決定は、同種競合または飽和結合分析により行われる。ヒトＧｃｇ－ＲのＫＤは、３．９２ｎＭであると推定され、これを用いてｈＧｃｇ－Ｒアッセイで検証される化合物すべてに対するＫｉ値が算出される。マウスＧｃｇ－ＲのＫＤは３．５２ｎＭであると推定され、これを用いてｍＧｃｇ－Ｒアッセイで検証される化合物すべてに対するＫｉ値が算出される。ラットＧｃｇ－ＲのＫＤは２１．４ｎＭであると推定され、これを用いてｒＧｃｇ－Ｒアッセイで検証される化合物すべてに対するＫｉ値が算出される。
【0107】
受容体結合アッセイは、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ：ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）フォーマットを用いて行われる。結合緩衝液は、２５ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）バシトラシン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、０．００３％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０）と、ＥＤＴＡ無しのＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。Ｇｃｇ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を、３．４８ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）でＤＭＳＯ中に溶解させ、１００μＬの分注物中、－２０℃で冷凍保存する。Ｇｃｇ分注物を希釈し、１時間以内に結合アッセイに用いる。ペプチドアナログはＤＭＳＯ中に溶解させ、１００％ＤＭＳＯ中で３倍連続希釈を行う。次に、５μＬの連続希釈された化合物またはＤＭＳＯを、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または非標識Ｇｃｇ対照（最終１μＭ、ＮＳＢ社）を含有するＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２クリアボトムアッセイプレートへと移す。次いで、５０μＬ ｈＧｃｇ－Ｒ（１．５μｇ／ウェル）、ｍＧｃｇ－Ｒ（６．４７μｇ／ウェル）またはｒＧｃｇ－Ｒ（１．５μｇ／ウェル）の膜、５０μＬ Ｉ－１２５ Ｇｃｇ（反応時、最終濃度０．１５ｎＭ）、及び５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を加え、プレートを密封し、プレート振とう器上（６に設定）で１分間、混合させる。室温での１２時間の沈降時間後、プレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターを用いて読み取る。結果は、化合物存在下での特異的Ｉ－１２５－Ｇｃｇ結合の割合として算出される。化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、添加された化合物濃度に対する、Ｉ－１２５－Ｇｃｇの特異的結合割合の非線形回帰により導かれる。ＩＣ５０濃度は、チェン－プルソフ（Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ）の式（Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, (1973)）を用いてＫｉに転換される。
【0108】
ｈＧｃｇ－Ｒ、ｍＧｃｇ－Ｒ、及びｒＧｃｇ－Ｒでの実施例１～７のペプチド及びヒトＧｃｇのＫｉを以下の表１に示す。
表１
表１
【表1】
【0109】
これらのデータは、本発明のグルカゴン受容体アゴニストが、３つの異なる種（ヒト、マウス、及びラットの受容体）において、ヒトグルカゴンと同等、またはヒトグルカゴンよりも大きなアフィニティでグルカゴン受容体に結合することを示している。
【0110】
機能活性及び選択性
機能活性及び選択性は、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ－Ｒ）、ヒトグルカゴン様ペプチド－１受容体（ｈＧＬＰ－１Ｒ）、またはヒト胃抑制ペプチド（グルコース依存性インスリン分泌促進性ポリペプチド受容体、ｈＧＩＰ－Ｒとしても知られる）を発現するＨＥＫ２９３細胞における細胞内ｃＡＭＰの定量により決定される。実験プロトコール及び結果を以下に記載する。
機能活性及び選択性は、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ－Ｒ）、ヒトグルカゴン様ペプチド－１受容体（ｈＧＬＰ－１Ｒ）、またはヒト胃抑制ペプチド（グルコース依存性インスリン分泌促進性ポリペプチド受容体、ｈＧＩＰ－Ｒとしても知られる）を発現するＨＥＫ２９３細胞における細胞内ｃＡＭＰの定量により決定される。実験プロトコール及び結果を以下に記載する。
【0111】
ｈＧｃｇ－Ｒ機能性ｃＡＭＰアッセイには、クローン化ｈＧｃｇ－Ｒを発現する２９３ＨＥＫ細胞を用いる（Lok, S, et. al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)）。ｈＧｃｇ－Ｒ ｃＤＮＡは、発現プラスミドｐｈＤ（Trans- activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)）へとサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞へとトランスフェクトし、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを用いて細胞を選択する。
【0112】
ｈＧＬＰ－１－Ｒ機能ｃＡＭＰアッセイには、クローン化ｈＧＬＰ－１－Ｒを発現する２９３ＨＥＫ細胞を用いる（Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993）。ｈＧＬＰ－１Ｒ ｃＤＮＡは、発現プラスミドｐｈＤ（Trans- activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)）へとサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞へとトランスフェクトし、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを用いて細胞を選択する。
【0113】
ｈＧＩＰ－Ｒ機能アッセイには、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）－Ｎｅｏ－ＲプラスミドへとクローニングされたｈＧＩＰ－Ｒ（Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W. and Bonner,T.I., GenBank: AAA84418.1）を用いる。ｈＧＩＰ－Ｒ－ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏプラスミドは、懸濁培養のためにチャイニーズハムスター卵巣細胞のＣＨＯ－Ｓへとトランスフェクトされ、５００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の存在下で選択される。
【0114】
各受容体過剰発現細胞株は、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチドの０．８５％ ＮａＣｌ溶液、Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号 ３５０５０）、０．１％カゼイン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｃ４７６５）、２５０μＭ ＩＢＭＸ（３－イソブチル－１－メチルキサンチン）及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ′－（２－エタンスルホン酸）、ＨｙＣｌｏｎｅ社、カタログ番号ＳＨ３０２３７．０１］を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号３１０５３）中、４０μＬのアッセイ量でペプチドを用いて処理される。６０分の室温でのインキュベーション後、生じた細胞内ｃＡＭＰ（アデノシン３’、５’－環状一リン酸）の増加は、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（ＣｉｓＢｉｏ社 ６２ＡＭ４ＰＥＣ）を用いて定量的に決定される。細胞内のｃＡＭＰ値は、ｃＡＭＰ－ｄ２結合体の細胞溶解緩衝溶液（２０μＬ）を添加し、次いで抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ３＋－クリプテート抗体の細胞溶解緩衝溶液（２０μＬ）を添加することにより検出される。得られた競合アッセイは、室温で少なくとも６０分間インキュベートされ、次いで、３２０ｎｍの励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍの発光で、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）装置を用いて検出される。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ単位（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ＊１０，０００での発光）は、存在するｃＡＭＰの量に対して反比例し、ｃＡＭＰ標準曲線を用いて、ウェル毎のｎＭ ｃＡＭＰに転換される。各ウェルで生成されたｃＡＭＰの量（ｎＭ）は、１０ｎＭ ヒトＧＬＰ－１（７～３６）ＮＨ２（ｈＧＬＰ－１Ｒアッセイに対して）、１０ｎＭ ヒトＧｃｇ（ｈＧｃｇ－Ｒアッセイに対して）、または１０ｎＭ ヒトＧＩＰ（１～４２）ＮＨ２（ｈＧＩＰ－Ｒアッセイに対して）のいずれかで観察された最大反応の割合に転換される。相対ＥＣ５０値及び最も高い割合の（Ｅｍａｘ）は、４パラメータロジスティック方程式に適合させた、添加ペプチドの濃度に対する最大反応割合を用いた非線形回帰分析により導かれる。
【0115】
実施例１～７、ヒトＧＩＰ（１～４２）ＮＨ２、ヒトＧＬＰ－１（７～３６）ＮＨ２、及びヒトＧｃｇに関する機能性データを以下の表２に示す。ＥＣ５０に対する平均は、カッコ内に示されている反復回数（ｎ）の数と共に、幾何平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）としてあらわされている。（＞）という修飾語句は、有効性％が５０％に届かず、算出されたＥＣ５０は検証された最も高い濃度を用いて得られていることを示す。
表２
表２
【表2】
【0116】
これらデータは、本発明のグルカゴン受容体アゴニストが、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体と比較し、高い選択性で、ヒトグルカゴンと同様のグルカゴン受容体での能力を有していることを示している。
【0117】
薬物動態
ラットにおける薬物動態
オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍＬ／ｋｇの量で、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解した実施例化合物を単回皮下投与（１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）した。血液は、投与後、１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、及び２４０時間で各動物から採取する。
ラットにおける薬物動態
オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍＬ／ｋｇの量で、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解した実施例化合物を単回皮下投与（１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）した。血液は、投与後、１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、及び２４０時間で各動物から採取する。
【0118】
化合物の血漿濃度は、ＬＣ／ＭＳ法により測定される。各方法は、損なわれていないペプチドを測定した（ペプチドと結合時間延長）。各アッセイに対し、内部標準（ＩＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ）として用いられた化合物及びアナログは、メタノール及び０．１％ギ酸を用いて、ラットまたはサルの１００％血漿（５０μＬ）から抽出される。上清中に存在する化合物及びＩＳの遠心によって、２つの異なる層が形成される。２７５μｌの上清の分注物を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅへと移し、真空にして、フロースルーを９６ウェルプレートへと集める。
【0119】
上清を除去するために温めた窒素ガスを用いて試料を乾燥させる。３０％アセトニトリルと５％ギ酸の１５０μｌ量をウェルに加え、試料を再構成させる。注入試料（２０μｌ）を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｃ５－３、５ｃｍＸ０．１ｍｍ、３μｍカラムへとロードする。検出及び定量のために、カラム流出物をＴｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器へと移動させる。
【0120】
オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに対する、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後の平均薬物動態パラメーターを以下の表３に提示する（実施例１、２及び５、ならびに実施例３及び４に対するＴｍａｘならびにＣｍａｘに対してはｎ＝３；実施例３及び４のＴ１／２、ＡＵＣ０－ｉｎｆならびにＣＬ／Ｆに対してはｎ＝２）。
表３
表３
【表3】
【0121】
これらデータは、Ｔ１／２がおよそ３０分である天然型ヒトグルカゴンと比較し、実施例１～５が延長された作用時間を有することを示している。
【0122】
カニクイザルにおける薬物動態
オスのカニクイザルに、０．２５ｍＬ／ｋｇの量で、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した被験化合物の単回静脈内投与（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）または単回皮下投与（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）を行う。血液は、投与後、０．５ （ＩＶのみ）、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、１９２、２４０、３３６、４８０、５７６、及び６７２時間で各動物から採取する。化合物の血漿濃度は、Ｓｐｒａｇｕｅ ｄａｗｌｅｙラットの実験でおよそ上述されたようにＬＣ／ＭＳ法により決定される。
オスのカニクイザルに、０．２５ｍＬ／ｋｇの量で、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した被験化合物の単回静脈内投与（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）または単回皮下投与（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）を行う。血液は、投与後、０．５ （ＩＶのみ）、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、１９２、２４０、３３６、４８０、５７６、及び６７２時間で各動物から採取する。化合物の血漿濃度は、Ｓｐｒａｇｕｅ ｄａｗｌｅｙラットの実験でおよそ上述されたようにＬＣ／ＭＳ法により決定される。
【0123】
平均（ｎ＝２）薬物動態パラメーターを以下の表４に示す。
表４
表４
【表4】
【0124】
これらデータは、実施例１及び２が、１時間未満のＴ１／２を有する天然型ヒトグルカゴンと比較し、延長された作用時間を有することを示す。
【0125】
Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
ラットにおける連続的グルコースモニタリング
１２～１４週齢の正常なＳｐｒａｇｕｅ ｄａｗｌｅｙのオスラット（ＨＡＲＬＡＮ（商標）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、自由に餌（ＴＤ２０１４ ＴＥＫＬＡＤ ＧＬＯＢＡＬ ＲＯＤＥＮＴ ＤＩＥＴ（登録商標）、ＨＡＲＬＡＮ（商標）Ｌａｂｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と水を与え、１２時間の明／暗サイクルで温度管理された（２４℃）施設内で、個々に飼育する。当該施設への２週間の順応後、ラットに、ＨＤ－ＸＧトランスミッター（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓｔ Ｐａｕｌ、ＭＮ）を移植する。
ラットにおける連続的グルコースモニタリング
１２～１４週齢の正常なＳｐｒａｇｕｅ ｄａｗｌｅｙのオスラット（ＨＡＲＬＡＮ（商標）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、自由に餌（ＴＤ２０１４ ＴＥＫＬＡＤ ＧＬＯＢＡＬ ＲＯＤＥＮＴ ＤＩＥＴ（登録商標）、ＨＡＲＬＡＮ（商標）Ｌａｂｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と水を与え、１２時間の明／暗サイクルで温度管理された（２４℃）施設内で、個々に飼育する。当該施設への２週間の順応後、ラットに、ＨＤ－ＸＧトランスミッター（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓｔ Ｐａｕｌ、ＭＮ）を移植する。
【0126】
トランスミッター移植手術は、２％～３％のイソフルラン（２－クロロ－２－（ジフルオロメトキシ）－１，１，１－トリフルオロエタン）麻酔下で行われる。トランスミッターのグルコースセンサーを下降大動脈に設置する。トランスミッターの温度センサーをトランスミッター本体と共に腹腔に設置する。トランスミッター移植手術の７日後、すべてのラットをテレメトリー受信機上に置き、ラットをホームケージ内で自由に移動させながら血中グルコースと深部体温の測定値を１分間隔で連続的に記録する。データ取得はＤＡＴＡＱＵＥＳＴ Ａ．Ｒ．Ｔ．（商標）システムソフトウェア（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｓｔ Ｐａｕｌ、ＭＮ）により制御及び分析される。グルコースセンサーの初期キャリブレーションは、術後７日目の腹腔内グルコース負荷試験（ｉｐＧＴＴ：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）によって行われ、その後のキャリブレーションは一日おきに尾血管のグルコース測定によって行われる。術後９～１１日目に開始して、ｐＨ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解した１０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与量、１ｍＬ／Ｋｇ体重での被験化合物を皮下注射で１回投与する。血中グルコース値を７日目まで監視する。
【0127】
血中グルコースのデータから、実施例１～７は各々、用量依存性に血中グルコース値を持続的に増加させたことが示される。
【0128】
物理的特性及び化学的特性
溶解性及び安定性
実施例１～６の試料は、Ｈ２Ｏ中、５ｍｇ／ｍＬで調製され、緩衝液Ｃ６Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６）、Ｃ７Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）、Ｈ６．５Ｎ（１０ｍＭ ヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）及びＨ７．５Ｎ（１０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）へと記載されるように透析される。試料は記載されるように１０ｍｇ／ｍＬペプチドへと濃縮され、１週間、４℃に維持される。試料は記載されるように視覚的に、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。
溶解性及び安定性
実施例１～６の試料は、Ｈ２Ｏ中、５ｍｇ／ｍＬで調製され、緩衝液Ｃ６Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６）、Ｃ７Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）、Ｈ６．５Ｎ（１０ｍＭ ヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）及びＨ７．５Ｎ（１０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）へと記載されるように透析される。試料は記載されるように１０ｍｇ／ｍＬペプチドへと濃縮され、１週間、４℃に維持される。試料は記載されるように視覚的に、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。
【0129】
４℃で１週間後、すべての製剤中の実施例１～６は透明で無色である。ＳＥＣ－ＨＰＬＣデータを表５に示す。高分子量（ＨＭＷ：ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）ポリマーの有意な増加、または主要ピークの消失は生じていない。実施例１～６に関し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる回収率は５％以内である。
表５
表５
【表5】
【0130】
また３つの追加製剤において、実施例１～２の溶解性を評価する：Ｔ７（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７）、Ｔ７Ｔｍ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０２％ポリソルベート－２０、２９ｍＭ ｍ－クレゾール、ｐＨ７）、及びＴ７Ｎｍ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２９ｍＭ ｍ－クレゾール、ｐＨ７）。化合物は、記載されるように透析によってＴ７中に調製される。試料はＴ７、Ｔ７Ｔｍ、またはＴ７Ｎｍ中、２ｍｇ／ｍＬで調製され、次いで記載されるように１０ｍｇ／ｍＬペプチドに濃縮される。製剤は４℃で１週間維持され、記載されるように視覚的に、ならびにＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣにより評価される。
【0131】
すべての製剤は透明及び無色を維持している。表６にＳＥＣ－ＨＰＬＣデータ及びＲＰ－ＨＰＬＣデータがある。ＨＭＷポリマーの増加は、いずれの製剤でも０．２％を超えていない。ＲＰ－ＨＰＬＣによるピーク回収率はすべての製剤に対し５％以内である。
表６
表６
【表6】
【0132】
これらデータは、実施例１～６が、異なる緩衝液条件下でも許容可能な溶解特性を有していることを示す。
【0133】
化学的安定性
実施例１の化学的安定性は、様々なｐＨ値の異なる緩衝液中で測定される。試料はＨ２Ｏ中、５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製され、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット、２０００ＭＷＣＯ（パート番号６６２０３）を用いて一晩、４℃で対象の緩衝液へと透析され、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ社、ＳＬＧＶ０１３ＳＬ）を介してろ過され、次いで各緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬに希釈される。緩衝液の組成は、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８（Ｔ８）、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７（Ｔ７）、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭヒスチジン ｐＨ７（Ｈ７）、またはＨ２Ｏ中、１０ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６（Ｃ６）である。１ｍｇ／ｍＬの各試料を３つのバイアルへと移す。試料は４℃、２５℃、及び４０℃に維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。化合物の安定性は、６０℃に加熱されたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８、３．５μｍ、４．６Ｘ１００ｍｍカラム（パート番号１８６００１７９）上で、３分にわたり１０％Ｂの定組成、３分にわたり３０％Ｂ、３０分にわたり３０～６０％Ｂ、及び２分にわたり９５％ＢのＡＢ（Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ＝０．０８５％ ＴＦＡ／アセトニトリル）勾配を用いて、０．９ｍＬ／分の流速で、分析的逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により評価される（波長は２１４ｎｍ）。また安定性は、インスリンＨＭＷＰ、７．８Ｘ３００ｍｍカラム（パート番号ＷＡＴ２０１５５４９）上で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％アセトニトリル、ｐＨ７．２の泳動緩衝液を用いて、４０分間、０．５ｍＬ／分の流速で泳動を行うサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により評価される。
実施例１の化学的安定性は、様々なｐＨ値の異なる緩衝液中で測定される。試料はＨ２Ｏ中、５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製され、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット、２０００ＭＷＣＯ（パート番号６６２０３）を用いて一晩、４℃で対象の緩衝液へと透析され、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ社、ＳＬＧＶ０１３ＳＬ）を介してろ過され、次いで各緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬに希釈される。緩衝液の組成は、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８（Ｔ８）、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７（Ｔ７）、Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭヒスチジン ｐＨ７（Ｈ７）、またはＨ２Ｏ中、１０ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６（Ｃ６）である。１ｍｇ／ｍＬの各試料を３つのバイアルへと移す。試料は４℃、２５℃、及び４０℃に維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。化合物の安定性は、６０℃に加熱されたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８、３．５μｍ、４．６Ｘ１００ｍｍカラム（パート番号１８６００１７９）上で、３分にわたり１０％Ｂの定組成、３分にわたり３０％Ｂ、３０分にわたり３０～６０％Ｂ、及び２分にわたり９５％ＢのＡＢ（Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ＝０．０８５％ ＴＦＡ／アセトニトリル）勾配を用いて、０．９ｍＬ／分の流速で、分析的逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により評価される（波長は２１４ｎｍ）。また安定性は、インスリンＨＭＷＰ、７．８Ｘ３００ｍｍカラム（パート番号ＷＡＴ２０１５５４９）上で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％アセトニトリル、ｐＨ７．２の泳動緩衝液を用いて、４０分間、０．５ｍＬ／分の流速で泳動を行うサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により評価される。
【0134】
実施例１に関し、ｐＨ７及びｐＨ８で外見上は透明から無色であり、乳白光または粒子は無い。ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を以下の表７にまとめる。回収率はＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより５％以内であり、許容可能である。
表７
表７
【表7】
【0135】
４℃及び４０℃に４週間維持されたＴ８緩衝液中の試料もまた液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析される。実施例１に関し、ｐＨ８で主要部分の劣化は特定されない。全体として、実施例１の化学的安定性は、検証された緩衝液条件下で、優れた安定性を示している。
【0136】
物理的安定性
実施例１の被験試料は、Ｔ７緩衝液中での透析によって調製され、次いで記載されるようにＴ７ｍ、Ｔ７Ｎｍ、及びＴ７Ｔｍ中で２ｍｇ／ｍＬペプチドで製剤化される。各製剤は清浄なガラスバイアルに移され、テフロン（登録商標）コートされた磁性フリー（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｌｅｅ）により、室温で６時間、４００ｒｐｍで攪拌される。評価のために０時、１時間、３時間、及び６時間で１００μＬの分注物を採取する。試料は従前のように視覚的に、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。
実施例１の被験試料は、Ｔ７緩衝液中での透析によって調製され、次いで記載されるようにＴ７ｍ、Ｔ７Ｎｍ、及びＴ７Ｔｍ中で２ｍｇ／ｍＬペプチドで製剤化される。各製剤は清浄なガラスバイアルに移され、テフロン（登録商標）コートされた磁性フリー（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｌｅｅ）により、室温で６時間、４００ｒｐｍで攪拌される。評価のために０時、１時間、３時間、及び６時間で１００μＬの分注物を採取する。試料は従前のように視覚的に、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。
【0137】
すべての製剤は透明かつ無色を維持しており、乳白光または沈殿物は生じていない。表８に示されるように、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの主要ピーク中のペプチドの割合はすべての製剤に関し５％以内に維持されている。データは、検証された条件下で実施例１が優れた物理的安定性を有していることを示す。
表８
表８
【表8】
【0138】
併用実験
ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストまたはＧＬＰ－１Ｒアゴニストとの合剤における活性
安定性試験において、実施例１及び３と、配列番号１５のＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストまたはデュラグルチドとの合剤を以下に記載されるように調製し、個々の化合物及び合剤の活性を上述の方法を用いて測定する。データは表９及び表１０に示す。（＞）という修飾語句は、有効性％が５０％に届かず、算出されたＥＣ５０は検証された最も高い濃度を用いて得られていることを示す。
表９
表１０
ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストまたはＧＬＰ－１Ｒアゴニストとの合剤における活性
安定性試験において、実施例１及び３と、配列番号１５のＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストまたはデュラグルチドとの合剤を以下に記載されるように調製し、個々の化合物及び合剤の活性を上述の方法を用いて測定する。データは表９及び表１０に示す。（＞）という修飾語句は、有効性％が５０％に届かず、算出されたＥＣ５０は検証された最も高い濃度を用いて得られていることを示す。
表９
【表9】
表１０
【表10】
【0139】
これらのデータは、実施例１及び３の生物活性がストレス条件下及び非ストレス条件下、ならびに／またはＧＬＰ－１ＲアゴニストもしくはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの併用で維持されていることを示す。
【0140】
ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの併用に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験
本発明のグルカゴン受容体アゴニストと、長期作用型ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの併用の効果を、Ｃ５７／ＢＬ６食事誘導型肥満（ＤＩＯ：ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｅ）マウスにおいて検証する。ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは上述の配列番号１４の構造を有している。ＧＬＰ－１ＲアゴニストはＷＯ２００５０００８９２に記載されるＧＬＰ－１－Ｆｃ融合体である。合剤安定性試験において、合剤は以下に概要されるように調製される。
本発明のグルカゴン受容体アゴニストと、長期作用型ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの併用の効果を、Ｃ５７／ＢＬ６食事誘導型肥満（ＤＩＯ：ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｅ）マウスにおいて検証する。ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは上述の配列番号１４の構造を有している。ＧＬＰ－１ＲアゴニストはＷＯ２００５０００８９２に記載されるＧＬＰ－１－Ｆｃ融合体である。合剤安定性試験において、合剤は以下に概要されるように調製される。
【0141】
１２週間、高脂肪食（６０％Ｋｃａｌが脂肪由来）を与えられた後、Ｃ５７／ＢＬ６ ＤＩＯ動物は、糖尿病ではないが、インスリン抵抗性、脂質代謝異常、及び肝脂肪変性を示し、それらはすべてメタボリック症候群の特徴である。従って、これら動物での試験を用いて、たとえば体重の減少、体組成、及び肝脂肪変性などのパラメーターに対する候補治療剤（複数含む）の効果を調査し得る。
【0142】
２０～２１週齢、体重が４２～４７ｇであり、当初脂肪量が１１．９ｇ～１７．２ｇの範囲にあるオスのＤＩＯ Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを用いる。動物は自由に餌と水を与えられ、１２時間の明／暗サイクル（２２：００に点灯）で温度管理された（２４℃）施設内で、個々に飼育される。施設への２週間の順応後、マウスは、各群が類似した平均開始体重を有するよう、体重に基づき治療群（ｎ＝５匹／群）へと無作為化される。
【0143】
ビヒクル（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）、ビヒクルに溶解させた被験化合物（３～１０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量範囲）、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはそれらの組み合わせ（３～１０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量範囲）を、不断給餌されているマウスに対し、１５日間、３日毎に、暗サイクルが始まる３０～９０分前にＳＣ注射により投与する。ＳＣ注射は１日目、４日目、７日目、１０日目、及び１３日目に行われる。毎日の体重、食物摂取量及びグルコースを、試験期間を通じて計測する。体重の絶対変化は、最初の分子注射が行われる前の同動物の体重を差し引くことにより算出する。０日目及び１４日目に、総脂肪量を、Ｅｃｈｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ社、ＴＸ）装置を用いた核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により測定する。
【0144】
毎日の血中グルコースは、尾静脈血液からＡｃｃｕ－Ｃｈｅｋグルコメーター（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて測定する。試験の最後に動物を殺処分し、肝臓を取り出して凍結する。殺処分時に採取された肝臓のホモジネートから測定された肝臓トリグリセリド、及び血漿コレステロールをＨｉｔａｃｈｉ ＭｏｄｕｌａｒＰ臨床分析機器で測定する。群間の統計比較は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、次いでダネットの多重比較検定を用いて行う。体重減少に対するＥＤ５０値の低下は、非線形フィットツールを用いたＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにて測定される。
【0145】
上述の通りに行われた試験の体重減少及び脂肪量割合の変化のデータは、以下の表１１（実施例１）及び１２（実施例１及び２）に提示される。表１１の結果は、５匹のマウス／群の平均±ＳＥＭとして表されており、表１２の結果は、６匹のマウス／群の平均±ＳＥＭとして表されている。
【0146】
実施例１及び２と、ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの併用は、実施例１または２、ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの単独の効果と比較し、体重と脂肪量に対し相乗的な効果を有している（表１１及び１２）。
表１１
表１２
表１１
【表11】
表１２
【表12】
【0147】
血中グルコース、血漿コレステロール、及び肝トリグリセリドに対する効果に関するデータは、以下の表１３（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）及び１４（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）に提示する。個々に投与された実施例１及び２が用量依存性に血中グルコースを増加させた一方で、かかる実施例グルカゴン受容体アゴニストと、ＧＬＰ－１ＲアゴニストまたはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとのいずれかの併用は、血中グルコース、血漿コレステロール、及び肝グリセリドを低下させる。
表１３
表１４
表１３
【表13】
表１４
【表14】
【0148】
ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの合剤における安定性
実施例１及び３の試料を調製し、記載されるようにＴ７へと透析する。両試料を、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎｍ中、１ｍｇ／ｍＬペプチドで別々に製剤化する。配列番号１５のＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストもまた調製し、実施例グルカゴン受容体アゴニストに対して記載されるようにＴ７へと透析する。ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、Ｔ７、Ｔ７ｍ、及びＴ７Ｎｍ中、１ｍｇ／ｍＬペプチドで製剤化される。１ｍｇ／ｍＬの実施例１と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストを含む合剤試料、または１ｍｇ／ｍＬの実施例３と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストを含む合剤試料もまた調製され、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎｍ中で製剤化される。各製剤試料を３つのバイアルに移す。試料は４℃、２５℃、及び４０℃に維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。安定性は、単剤製剤で上述されたようにＲＰ－ＨＰＬＣにより評価される。記載されたＲＰ－ＨＰＬＣ法は、実施例化合物及びＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの主要ピーク、ならびに３日間、ｐＨ９及び４０℃で試料にストレスを与えることにより生成されたすべての分解ピークを良く分離させる。
実施例１及び３の試料を調製し、記載されるようにＴ７へと透析する。両試料を、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎｍ中、１ｍｇ／ｍＬペプチドで別々に製剤化する。配列番号１５のＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストもまた調製し、実施例グルカゴン受容体アゴニストに対して記載されるようにＴ７へと透析する。ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、Ｔ７、Ｔ７ｍ、及びＴ７Ｎｍ中、１ｍｇ／ｍＬペプチドで製剤化される。１ｍｇ／ｍＬの実施例１と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストを含む合剤試料、または１ｍｇ／ｍＬの実施例３と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストを含む合剤試料もまた調製され、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎｍ中で製剤化される。各製剤試料を３つのバイアルに移す。試料は４℃、２５℃、及び４０℃に維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。安定性は、単剤製剤で上述されたようにＲＰ－ＨＰＬＣにより評価される。記載されたＲＰ－ＨＰＬＣ法は、実施例化合物及びＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの主要ピーク、ならびに３日間、ｐＨ９及び４０℃で試料にストレスを与えることにより生成されたすべての分解ピークを良く分離させる。
【0149】
ＲＰ－ＨＰＬＣによるすべての試料に対する総ピーク回収率は５％以内である。すべての製剤は透明及び無色を維持しており、乳白光または沈殿は無い。４週後のＲＰ－ＨＰＬＣにより観察された各主要ピークのペプチド割合の変化を表１５に要約する。主要ピーク割合の減少は、すべての検証製剤において、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの合剤と比較し、単剤として製剤化された場合の実施例１に対して有意な変化は無い。ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストは、実施例１または実施例３のいずれかとの合剤に対し、単剤として製剤化された場合の主要ピーク割合において、一定の減少を示している。データは、実施例１及び３が、単剤またはＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストとの合剤として製剤化されたときに許容可能な安定性を有していること、及び実施例１及び３が合剤中でＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの安定性に有害な影響を与えていないことを示している。
表１５
表１５
【表15】
【0150】
実施例１、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、及びそれらの組み合わせのＴ７Ｎｍ中で製剤化された試料、ならびに実施例１及びＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの組み合わせのＴ７中で製剤化された試料もまた、４週間、４℃及び４０℃でインキュベートされ、ＬＣ－ＭＳにより評価される。主要部分の分解は特定されていない。実施例１及びＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストの両方に関し、化学的修飾は、合剤と単剤の間に有意差は無い。
【0151】
ＧＬＰ－１Ｒアゴニストとの合剤における安定性
Ｔ７緩衝液への調製に関し上述されたものと同じ方法を用いて、実施例１及び３が調製され、Ｃ６．５（１０ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６．５）へと透析される。化合物は、緩衝液のＣ６．５、Ｃ６．５Ｍ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ Ｄ－マンニトール、ｐＨ ６．５）、Ｃ６．５Ｔ（１０ｍＭクエン酸塩、０．０２％ポリソルベート－８０、ｐＨ６．５）、及びＣ６．５ＭＴ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ Ｄ－マンニトール、０．０２％ポリソルベート－８０、ｐＨ６．５）中にて、１ｍｇ／ｍＬペプチドで別々に製剤化される。Ｃ６．５に溶解させたデュラグルチドの４６．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液を用いて、Ｃ６．５及びＣ６．５ＭＴ中、３ｍｇ／ｍＬでデュラグルチドを製剤化する。Ｃ６．５ＭＴの合剤は３ｍｇ／ｍＬのデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬの実施例１を有して調製され、または３ｍｇ／ｍＬのデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬの実施例３を有して調製される。各製剤試料を３つのバイアルに移し、４℃、２５℃、及び４０℃で維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。安定性は、上述されたようにＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。記載された両ＨＰＬＣ法は、実施例化合物及びデュラグルチドの主要ピーク、ならびに３日間、ｐＨ９及び４０℃で試料にストレスを与えることにより生成されたすべての分解ピークを良く分離させる。
Ｔ７緩衝液への調製に関し上述されたものと同じ方法を用いて、実施例１及び３が調製され、Ｃ６．５（１０ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６．５）へと透析される。化合物は、緩衝液のＣ６．５、Ｃ６．５Ｍ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ Ｄ－マンニトール、ｐＨ ６．５）、Ｃ６．５Ｔ（１０ｍＭクエン酸塩、０．０２％ポリソルベート－８０、ｐＨ６．５）、及びＣ６．５ＭＴ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ Ｄ－マンニトール、０．０２％ポリソルベート－８０、ｐＨ６．５）中にて、１ｍｇ／ｍＬペプチドで別々に製剤化される。Ｃ６．５に溶解させたデュラグルチドの４６．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液を用いて、Ｃ６．５及びＣ６．５ＭＴ中、３ｍｇ／ｍＬでデュラグルチドを製剤化する。Ｃ６．５ＭＴの合剤は３ｍｇ／ｍＬのデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬの実施例１を有して調製され、または３ｍｇ／ｍＬのデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬの実施例３を有して調製される。各製剤試料を３つのバイアルに移し、４℃、２５℃、及び４０℃で維持される。２週間ごと、トータルで４週間、試料を評価する。試料は濁度及び相分離に関して視覚的に評価される。安定性は、上述されたようにＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価される。記載された両ＨＰＬＣ法は、実施例化合物及びデュラグルチドの主要ピーク、ならびに３日間、ｐＨ９及び４０℃で試料にストレスを与えることにより生成されたすべての分解ピークを良く分離させる。
【0152】
ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの両方によるすべての安定性試料に対する総ピーク回収率は５％以内である。すべての製剤は透明及び無色を維持しており、乳白光または沈殿は無い。４週後にＳＥＣ－ＨＰＬＣにより観察された各主要ピークにおける化合物の割合の変化を表１６に要約する。実施例１及び３は多くの場合において安定であり、主要ピークの有意な低下は示していない。実施例１は、単剤と比較し、デュラグルチドとの合剤の場合でも安定性の低下を示していない。実施例３は単剤と比較し、デュラグルチドとの合剤で、若干の安定性の低下を示している。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、単剤と比較し、実施例１または３のいずれかとの合剤の場合において、安定性の低下を示していない。
表１６
表１６
【表16】
【0153】
ＲＰ－ＨＰＬＣにより観察されるように、安定性の傾向は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより観察された傾向と類似している。４週後にＲＰ－ＨＰＬＣにより観察された各主要ピークにおける化合物の割合の変化を表１７に要約する。実施例１及び３は多くの場合において安定であり、主要ピークの有意な低下は示していない。実施例１は、単剤と比較し、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストとの合剤の場合でも安定性の低下を示していない。実施例３は単剤と比較し、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストとの合剤で、若干の安定性の低下を示している。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、単剤と比較し、いずれか実施例との合剤の場合においても、安定性の低下を示していない。
表１７
また、本発明は以下を提供する。
［１］ 式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）、
を含む、グルカゴン受容体アゴニスト化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［２］ 式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）
からなるグルカゴン受容体アゴニスト化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［３］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療する方法。
［４］ １つ以上の追加の治療剤の有効量を投与することをさらに含む、［３］に記載の方法。
［５］ 前記追加の治療剤がＧＬＰ－１Ｒアゴニストである、［４］に記載の方法。
［６］ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［５］に記載の方法。
［７］ 前記追加の治療剤がＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである、［４］に記載の方法。
［８］ 前記ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストが配列番号１５の構造を有している、［７］に記載の方法。
［９］ 治療のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１０］ Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１１］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、及びインスリン受容体アゴニストからなる群から選択される１つ以上に追加の治療剤と組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１２］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、デュラグルチド組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１３］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、配列番号１５の構造を有するＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストと組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１４］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストと、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
［１５］ 追加の治療剤をさらに含む、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］ 前記追加の治療剤がＧＬＰ－１Ｒアゴニストである、［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ 前記追加の治療剤がＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである、［１５］に記載の医薬組成物。
［１９］ 前記ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストが配列番号１５の構造を有している、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］ グルカゴン受容体でのグルカゴン受容体アゴニストの活性が、ＧＬＰ－１受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの能力よりも少なくとも１００倍高い、［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［２１］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストの有効量の投与を含む、非治療的体重減少を誘導する方法。
表１７
【表17】
また、本発明は以下を提供する。
［１］ 式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）、
を含む、グルカゴン受容体アゴニスト化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［２］ 式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈの結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６）
からなるグルカゴン受容体アゴニスト化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［３］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を治療する方法。
［４］ １つ以上の追加の治療剤の有効量を投与することをさらに含む、［３］に記載の方法。
［５］ 前記追加の治療剤がＧＬＰ－１Ｒアゴニストである、［４］に記載の方法。
［６］ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［５］に記載の方法。
［７］ 前記追加の治療剤がＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである、［４］に記載の方法。
［８］ 前記ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストが配列番号１５の構造を有している、［７］に記載の方法。
［９］ 治療のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１０］ Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１１］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニスト、及びインスリン受容体アゴニストからなる群から選択される１つ以上に追加の治療剤と組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１２］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、デュラグルチド組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１３］ Ｔ２ＤＭ、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質代謝異常症、メタボリック症候群、高インスリン血症、または夜間低血糖の治療のための、配列番号１５の構造を有するＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストと組み合わせた、同時の、別々の、または連続の使用のための［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［１４］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストと、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
［１５］ 追加の治療剤をさらに含む、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］ 前記追加の治療剤がＧＬＰ－１Ｒアゴニストである、［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ 前記追加の治療剤がＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストである、［１５］に記載の医薬組成物。
［１９］ 前記ＧＩＰ－ＧＬＰ－１共アゴニストが配列番号１５の構造を有している、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］ グルカゴン受容体でのグルカゴン受容体アゴニストの活性が、ＧＬＰ－１受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの能力よりも少なくとも１００倍高い、［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［２１］ ［１］～［２］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストの有効量の投与を含む、非治療的体重減少を誘導する方法。
【0154】
配列
配列番号１－ヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２－ヒトＧＬＰ－１
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ
配列番号３－ヒトＯＸＭ
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
配列番号４－ヒトＧＩＰ
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ
配列番号５－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている。
配列番号６－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号７－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及び式中、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号８－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｌであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
ならびに式中、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号９－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり、
ならびにＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１０－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり、
ならびにＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１１－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、
Ｘ７は、存在せず、及び
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端酸である。
配列番号１２－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、
Ｘ７は、存在せず、及び
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端酸である。
配列番号１３－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１０～２０であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅまたは１－ナフチルアラニン（１－Ｎａｌ）であり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている。
配列番号１４－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ４は、１－Ｎａｌであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１５－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１８であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１６－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり、
及びＣ末端アミノ酸は、アミド化されている。
配列番号１７－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、及び
Ｘ７は、存在しない。
配列番号１－ヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２－ヒトＧＬＰ－１
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ
配列番号３－ヒトＯＸＭ
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
配列番号４－ヒトＧＩＰ
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ
配列番号５－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ６は、ＴまたはＥであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであるかのいずれかであり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている。
配列番号６－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号７－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
及び式中、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号８－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｌであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、
ならびに式中、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号９－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり、
ならびにＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１０－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、及び
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり、
ならびにＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１１－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１６であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、
Ｘ７は、存在せず、及び
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端酸である。
配列番号１２－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１８であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、
Ｘ７は、存在せず、及び
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端酸である。
配列番号１３－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１または２であり、ｂは１０～２０であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅまたは１－ナフチルアラニン（１－Ｎａｌ）であり、
及びＣ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている。
配列番号１４－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１８であり、
Ｘ４は、１－Ｎａｌであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１５－ＧＩＰ－ＧＬＰ共アゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
Ｘ３は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１８であり、
Ｘ４は、Ｐｈｅであり、
及びＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端一級アミドとしてアミド化されている。
配列番号１６－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、ＴまたはＬであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは２であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、Ｅであり、
Ｘ６は、Ｔであり、
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり、
及びＣ末端アミノ酸は、アミド化されている。
配列番号１７－グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ｔであり、
Ｘ３は、Ａｉｂであり、
Ｘ４は、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈを用いたＫ側鎖のイプシロンアミノ基への結合によって化学的に修飾されているＫであり、式中、ａは１であり、ｂは１４～２４であり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｅであり、及び
Ｘ７は、存在しない。
【配列表】