(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-16
(45)【発行日】2023-01-24
(54)【発明の名称】グルカゴン類似体アゴニストおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/605 20060101AFI20230117BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20230117BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230117BHJP
A61K 38/28 20060101ALN20230117BHJP
A61K 9/08 20060101ALN20230117BHJP
A61K 47/02 20060101ALN20230117BHJP
A61K 47/22 20060101ALN20230117BHJP
【ＦＩ】
C07K14/605 ZNA
A61K38/26
A61K45/00
A61P3/10
A61K38/28
A61K9/08
A61K47/02
A61K47/22
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021545481
(86)(22)【出願日】2020-01-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-24
(86)【国際出願番号】 US2020015539
(87)【国際公開番号】W WO2020163125
(87)【国際公開日】2020-08-13
【審査請求日】2021-08-04
(31)【優先権主張番号】62/801,344
(32)【優先日】2019-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】アルシーナ－フェルナンデス，ジョルジ
(72)【発明者】
【氏名】コスクン，タマー
(72)【発明者】
【氏名】ガイザー，アンドレア レニー
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２７９７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２３６１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１０７３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／２１０２４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１６３４７３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＳＸ１ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ２ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴのアミノ酸配列を含む化合物であって、式中、Ｘ１はＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２はＱまたはＡである（配列番号２）、化合物。
【請求項2】
Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＱである（配列番号３）、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＡである（配列番号４）、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
Ｘ１がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２がＡである（配列番号５）、請求項１に記載の化合物。
【請求項5】
Ｘ１がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２がＱである（配列番号６）、請求項１に記載の化合物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される緩衝液を含む、医薬組成物。
【請求項7】
薬学的に許容される緩衝液がヒスチジン緩衝生理食塩水である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
追加の治療薬をさらに含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記追加の治療薬がインスリンである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
個体の低血糖症を治療するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項11】
追加の治療薬と組み合わせて使用される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記追加の治療薬がインスリンである、請求項１１に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に生物学および医学に関連し、より具体的には、天然のヒトグルカゴンと比較した場合に、改善された溶解性、改善された化学的安定性、改善された物理的安定性および／またはポンプ使用のための改善された保存適合性を有するグルカゴン類似体アゴニスト（ＧＡＡ）化合物に関し、かつそれを含む医薬組成物、および低血糖症の治療におけるそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
過去数十年間、糖尿病の有病率は上昇し続けている。糖尿病の現在の標準治療としては、食事制限および運動、ならびに経口薬および注射可能な血糖降下薬での治療が挙げられる。
【0003】
グルカゴンは、膵臓のランゲルハンス島のα細胞で分泌される２９アミノ酸のペプチドホルモン（配列番号１）であり、グルコース恒常性に関与する。通常の生理学的条件下では、血糖が下がるとグルカゴンが増加し、肝臓のグリコーゲンがグルコースに分解されて血流中に放出される。糖尿病を患っている個体では、糖尿病治療の副作用として低血糖症が発生する可能性がある。さらに、そのような個体の低血糖症に対する生理学的グルカゴン応答が損なわれ、グルコースレベルが正常範囲に戻るのがより困難になる可能性がある。治療せずに放置すると、重度または急性の低血糖症は、発作、意識喪失、脳損傷、さらには死などの深刻な問題を引き起こす可能性がある。
【0004】
グルカゴンは、急性低血糖症を治療するための確立された治療法である。実際、緊急のグルカゴン投与により、その投与後数分以内に正常な血糖値を回復することができる。しかしながら、投与のために調製されたグルカゴンにはいくつかの不利点がある。例えば、生理的ｐＨまたはほぼ生理的ｐＨの水性緩衝液において、グルカゴンの溶解度は低くなる。同様に、低いｐＨまたは高いｐＨで調合された場合、グルカゴンは、化学的安定性が低く、ゲル化や可溶性凝集体の形成などの物理的安定性も低くなる。これらの不利点を最小限に抑えるために、現在商用のグルカゴンベースの治療法は、投与時に再構成するように指示された凍結乾燥粉末として提供される。緊急事態では、凍結乾燥粉末を再構成することは面倒で不便である。したがって、生理学的条件下でグルカゴンの生物学的性能を維持しながら、非生理学的条件下で十分な水溶性、化学的安定性および物理的安定性を示す治療用途の化合物を提供することが望ましい。
【0005】
酸性緩衝液および生理学的ｐＨ緩衝液への溶解性および安定性を改善するためのアミノ酸置換を有するグルカゴン類似体が知られている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０８６０８６号、ＷＯ２０１１／０２９３５８６、ＷＯ２０１５／０９４８７５、ＷＯ２０１５／０９４８７６およびＷＯ２０１５／０９４８７８を参照されたい。
【0006】
それにもかかわらず、有効なグルコースコントロールを提供することができ、生理学的条件下でグルカゴンの生物学的性能を維持しながら、非生理学的条件下で十分な溶解性ならびに化学的および物理的安定性も示す、低血糖症を治療するための代替治療薬の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0007】
この必要性に対処するために、本開示は、第一に、以下のアミノ酸配列を含む化合物を記載する。
ＨＳＸ１ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ２ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（式Ｉ）、式中、Ｘ１はＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２はＱまたはＡ（配列番号２）であり、Ｃ－末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
ＨＳＸ１ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ２ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（式Ｉ）、式中、Ｘ１はＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２はＱまたはＡ（配列番号２）であり、Ｃ－末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
【0008】
いくつかの例において、化合物が以下のアミノ酸配列を含むかまたは有するように、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＱである。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号３）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号３）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
【0009】
他の例では、化合物が以下のアミノ酸配列を含むかまたは有するように、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＡである。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号４）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号４）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
【0010】
他の例では、化合物が以下のアミノ酸配列を含むかまたは有するように、Ｘ１はＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２はＡである。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号５）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号５）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
【0011】
他の例では、化合物が以下のアミノ酸配列を含むかまたは有するように、Ｘ１はＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ２はＱである。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号６）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号６）、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端にカルボン酸を含む。
【0012】
さらに他の例では、化合物は
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号３）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号４）、ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号５）、またはＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号６）であり、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端のカルボン酸を含む。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号３）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号４）、ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号５）、またはＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ（配列番号６）であり、式中、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端のカルボン酸を含む。
【0013】
第二に、本明細書の化合物の少なくとも１つおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が記載されている。いくつかの例において、薬学的に許容される担体は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水またはヒスチジン緩衝生理食塩水などの緩衝液である。特定の例において、緩衝液は、ヒスチジン、ヒスチジン緩衝液、またはヒスチジン緩衝生理食塩水である。他の例では、医薬組成物は、担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含むことができる。
【0014】
第三に、本明細書の少なくとも１つの化合物を個体に投与するためのキットが記載されている。いくつかの例において、キットは、少なくとも１つの化合物を投与するための注射器および針を含む。特定の例において、化合物は、注射器内の水溶液中に事前に調合されている。他の例では、化合物は、ポンプ設定で使用するために、カートリッジ内の水溶液中に事前に調合されている。さらに他の例では、キットは、例えば、ポンプ設定に使用するために別個のカートリッジ内の水溶液中に事前に調合された、インスリンなどの他の抗糖尿病薬、特に速効型インスリン類似体などの少なくとも１つの追加の治療薬を含む。
【0015】
第四に、本明細書の化合物を使用するための方法、特に低血糖症を治療するために化合物を使用するための方法が記載されている。この方法は、少なくとも、それを必要とする個体に、本明細書における有効量の少なくとも１つの化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む。いくつかの例において、少なくとも１つの化合物は、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、または経皮などの任意の標準的な投与経路を介して投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物は、皮下（ＳＱ）または筋肉内（ＩＭ）投与される。
【0016】
特定の例において、少なくとも１つの化合物は、必要に応じて（すなわち、低血糖症の急性例に応答して）、個体に対してＳＱ投与される。同様に、他の例において、少なくとも１つの化合物は、毎日（ＱＤ）、隔日、週３回、週２回、週１回（すなわち、毎週（ＱＷ））、隔週（すなわち、１週おきに）、または毎月、ＳＱに投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物は、隔日ＳＱに、週３回ＳＱに、週２回ＳＱに、週１回ＳＱに、隔週ＳＱに、または毎月ＳＱに投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物がＱＷ投与される。あるいは、ポンプシステムに関連して使用される場合、少なくとも１つの化合物は、長期的な設定で（すなわち、連続的に多くの日に）、１日当たり複数回のマイクロデリバリーで投与することができる。あるいはなおも、少なくとも１つの化合物は、注射器システムを使用して長期的な設定でマイクロドーズで投与する（すなわち、毎日のマイクロインジェクション）ことができる。
【0017】
この方法はまた、少なくとも１つの化合物を有効量の少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与するステップを含むことができる。いくつかの例において、少なくとも１つの追加の治療薬を、少なくとも１つの化合物と同時に、別々に、または連続して投与することができる。
【0018】
いくつかの例において、少なくとも１つの追加の治療薬を、少なくとも１つの化合物と同じ頻度で（すなわち、毎日、隔日、週に２回、毎週または毎月）投与することができる。他の例において、少なくとも追加の治療薬は、少なくとも１つの化合物とは異なる頻度で投与される。少なくとも１つの追加の治療薬は、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、または経皮などの任意の標準的な投与経路を介して投与することができる。いくつかの例において、少なくとも１つの追加の治療薬の投与経路は、少なくとも１つの化合物と同じであってもよいか、または少なくとも１つの化合物とは異なっていてもよい。
【0019】
いくつかの例において、個体は糖尿病（ＰｗＤ）、特に１型糖尿病の人である。他の例において、個体は、糖尿病を患っているかもしれないし、患っていないかもしれない、低血糖症の急性例（すなわち、緊急投与）を経験している人である。
【0020】
方法はまた、血糖を測定または取得すること、およびそのような得られた値を１つ以上のベースライン値または以前に得られた値と比較して治療の有効性を評価することなどのステップを含み得る。
【0021】
これらの方法はまた、食餌療法および運動と組み合わせることができ、および／または上記で論じたもの以外の追加の治療薬と組み合わせることができる。
【0022】
さらに、インスリンポンプまたはバイホルモン（例えば、インスリン－グルカゴン）ポンプシステムなどのポンプシステムで本明細書の化合物を使用するための方法が提供される。
【0023】
上記を考慮して、本明細書の化合物の少なくとも１つを含むいくつかの使用が提供される。例えば、本明細書の化合物は、治療、特に低血糖症の治療に使用するために提供することができ、任意選択で、少なくとも１つの化合物との別個の、連続的または同時の組み合わせのための少なくとも１つの追加の治療薬を提供することができる。同様に、本明細書の化合物は、低血糖症を治療するための薬剤を製造する際に使用するために提供することができ、薬剤は、任意選択で、少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含み得る。
【0024】
本明細書の化合物の利点は、それらが野生型グルカゴン活性を維持するだけでなく、水溶液中の天然のヒトグルカゴンと比較した場合、高い水溶性、高い化学的安定性、高い物理的安定性、または低いフィブリル化を示すことである。さらに、本明細書の化合物は、天然のヒトグルカゴンと同様の活性（例えば、ヒトグルカゴンと比較した場合の、グルカゴン受容体における効力、作用時間および選択性）を示す。さらに、本明細書の化合物は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体で組換えヒトグルカゴンよりも最大約１０倍高い選択性を示し、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体およびグルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）受容体で活性を示さず、ならびに約５～７の範囲のｐＨで向上した溶解性を示す。このように、本明細書の化合物は、急性低血糖症の事例（すなわち、緊急投与）を含む低血糖症を治療するのに適している。本明細書の化合物の改善された特性はまた、ポンプ投与のための水溶液中のグルカゴンの調製を可能にする。同様に、化合物は、閉ループ血糖コントロールを提供するために、デュアルチャンバーポンプで速効型インスリン類似体と組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書の化合物は、皮下投与時の非常に類似した薬物動態プロファイルに加えて、天然のヒトグルカゴンに非常に類似した会合状態および親水性プロファイルを有する。
【発明を実施するための形態】
【0025】
定義と略語
不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が１つおよび１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が１つおよび１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【0026】
本明細書で使用されるとき、「約」とは、例えば、記載された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、または体積などの値（複数可）の統計的に有意な範囲内を意味する。そのような値または範囲は、所与の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の規模以内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。したがって、「約」は、値にデバイスの固有のエラーの変動、値を決定するために使用される方法／プロトコル／手法の変動、またはさらに調査個体間に存在する変動が含まれることを示すために使用される。
【0027】
本明細書で使用される場合、「活性」、「活性化する」、「活性化すること」などは、以下に記載されるインビトロアッセイなどの当該技術分野で知られているアッセイを使用して測定されるように、受容体に結合する、および受容体での応答を誘導するための本明細書の化合物の能力を意味する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、化学的観点から、１つ以上のアミン基および１つ以上のカルボン酸基の存在によって特徴付けられ、他の官能基を含み得る分子を意味する。当該技術分野で知られているように、標準アミノ酸として指定され、あらゆる生物によって産生されるほとんどのペプチド／タンパク質の構成要素として使用される２０個のアミノ酸のセットが存在する。本開示のアミノ酸配列は、２０個の天然に存在するアミノ酸の標準的な１文字または３文字のコードを含有する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「類似体」は、標的受容体を活性化し、その受容体の天然アゴニストによって誘発される少なくとも１つのインビボまたはインビトロ効果を誘発する、合成ペプチドなどの化合物を意味する。
【0030】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、それを必要とする個体への単回または複数回投与時に、診断または治療中のそのような個体において所望の効果（すなわち、例えば、血糖の増加、および／または体重もしくは体脂肪の減少などの個体の状態における臨床的に測定可能な差異を生じさせ得る）を提供する、本明細書の１つ以上の化合物、またはその薬学的に許容される塩の量、濃度または用量を意味する。有効量は、既知の手法の使用によって、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定されることができる。個体についての有効量を決定する際には、哺乳動物の種、その大きさ、年齢、および全体的な健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の程度または関与度または重症度、個体の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される調製物の生物学的利用能の特徴、選択される用法、併用薬の使用、ならびに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の因子が考慮される。
【0031】
本明細書で使用される場合、「フィブリル化」は、グルカゴンが低いまたは高いｐＨで調合されたときに観察されるゲル化および可溶性会合体形成を意味する。
【0032】
本明細書で使用される場合、「５０％効果濃度」または「ＥＣ５０」は、用量反応曲線（例えば、ｃＡＭＰ）などのアッセイエンドポイントの５０％の活性化／刺激をもたらす化合物の濃度を意味する。
【0033】
本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」は、本明細書の化合物のうちの少なくとも１つを、１つ以上の追加の治療薬と同時に、順次に、または１つ以上の追加の治療薬と組み合わせた単一の調合で投与することを意味する。
【0034】
本明細書で使用される場合、「グルカゴン類似体アゴニスト」または「ＧＡＡ」は、グルカゴン、特に天然のヒトグルカゴン（配列番号１）または組換えのヒトグルカゴンと構造的類似性を有するが、それらとは複数の違いを有する化合物を意味する。本明細書の化合物は、グルカゴン受容体に対して親和性およびグルカゴン受容体において活性を有する化合物をもたらすアミノ酸配列を含む。
【0035】
本明細書で使用される場合、「低血糖症」は、約７２ｍｇ／ｄＬ（約４ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の血糖を意味する。
【0036】
本明細書で使用する場合、「それを必要とする個体」とは、例えば、本明細書に列挙されるものを含む、治療または治療法を必要とする状態、疾患、障害、または症状を有する、ヒトなどの哺乳動物を意味する。
【0037】
本明細書で使用される場合、「非標準アミノ酸」は、細胞内で自然に発生し得るが、ペプチド合成には関与しないアミノ酸を意味する。非標準アミノ酸はペプチドの構成要素である可能性があり、多くの場合、ペプチド内の標準アミノ酸の修飾によって（すなわち、翻訳後修飾を介して）生成される。非標準アミノ酸には、上記の標準アミノ酸とは反対の絶対キラリティーを有するＤ－アミノ酸が含まれる場合がある。本明細書において、「Ａｉｂ」はアルファアミノイソ酪酸であり、「Ｄａｂ（Ａｃ）」はアセチル基（Ａｃ）が４位でアミノ基とアミド結合を形成する２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であり、「４－パル」は３－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニン／４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。
【0038】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される緩衝液」は、当業者に知られている標準的な医薬緩衝液のいずれかを意味する。
【0039】
本明細書で使用される場合、「治療する、治療すること」または「治療すること、治療するため」とは、既存の状態、疾患、障害または症状の進行または重症度を軽減、抑制、逆転、減速または停止することを意味する。
【0040】
特定の略語は次のように定義される。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指す。「ＡＣＲ」は尿中アルブミン／尿中クレアチニン比を指す。「ａｍｕ」は原子質量単位を指す。「ｃＡＭＰ」はサイクリックアデノシン一リン酸を指す。「ＣＲＣ」は完全奏効曲線を指す。「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを指す。「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指す。「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す。「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指す。「ＥＩＡ／ＲＩＡ」は酵素イムノアッセイ／ラジオイムノアッセイを指す。「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメトキシカルボニルを指す。「ｈｒ」は時間を指す。「ＨＥＰＥＳ」は４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指す。「ＨＯＢｔ」はヒドロキシベンゾトリアゾールを指す。「ＨＴＲＦ」は、ホモジナス時間分解蛍光を指す。「ＩＶ」は静脈内を指す。「ｋＤａ」はキロダルトンを指す。「ＬＣ－ＭＳ」は液体クロマトグラフィー質量分析法を指す。「ｍｉｎ」は分を指す。「ＭＳ」は質量分析を指す。「ＯｔＢｕ」はＯ－ｔｅｒｔ－ブチルを指す。「Ｐｂｆ」は、ＮＧ－２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルを指す。「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は逆相高速液体クロマトグラフィーを指す。「ＳＱ」は皮下を指す。「ＳＥＭ」は平均値の標準誤差を指す。「ｔＢｏｃ」はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルを指す。「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指す。「Ｔｒｔ」はトリチルを指す。「ＷＧＡ」はコムギ胚芽凝集素を指す。
【0041】
グルカゴン類似体アゴニスト
本明細書の化合物は、天然のヒトグルカゴン（配列番号１）とは構造上の違いがある。例えば、本明細書の化合物は、天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の番号付けに関して、３、１６、２１、２４、２５、２７および２８位のうちの１つ以上で修飾を含む。本明細書の化合物の例示的なアミノ酸配列としては、以下が挙げられる（天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の対応する残基に対する特定の変化は太字で示されている）。
ここで、各々のＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端にカルボン酸を含み得る。
本明細書の化合物は、天然のヒトグルカゴン（配列番号１）とは構造上の違いがある。例えば、本明細書の化合物は、天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の番号付けに関して、３、１６、２１、２４、２５、２７および２８位のうちの１つ以上で修飾を含む。本明細書の化合物の例示的なアミノ酸配列としては、以下が挙げられる（天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の対応する残基に対する特定の変化は太字で示されている）。
ここで、各々のＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端にカルボン酸を含み得る。
【0042】
さらに、インビボ適合性および有効性を改善するため、本明細書の化合物は、複数の無機および有機酸／塩基のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸／塩基付加塩を形成し得る。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な手法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，」２ｎｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１１）を参照されたい）。本明細書での使用のための薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、および／または酢酸塩が挙げられる。
【0043】
本明細書の化合物の半減期は、例えば、以下の実施例に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている手法を使用して測定することができる。同様に、グルカゴン受容体に対する本明細書の化合物の親和性は、例えば、以下の実施例に記載されるものを含む、受容体結合レベルを測定するための当該技術分野で知られている手法を使用して測定され得、一般に阻害定数（Ｋｉ）値として表される。さらに、グルカゴン受容体における本明細書の化合物の活性は、例えば、以下の実施例に記載されるものを含む当該技術分野で知られている手法を使用して測定することができ、一般にＥＣ５０値として表される。
【0044】
本明細書の化合物を、非経口経路によって（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または経皮的に）投与することができる医薬組成物として調合することができる。そのような医薬組成物およびそれを調製するための手法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，「Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ ｅｄ．，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい。特定の例において、本明細書の化合物は、ＳＱまたはＩＭに投与される。しかしながら、代替的には、化合物は、例えば、錠剤または経口投与のための他の固体、徐放性カプセル、およびクリーム、ローション、吸入剤などを含む現在使用されている任意の他の形態などの他の薬学的に許容される経路のための形態で調合され得る。
【0045】
本明細書の化合物は、医師によって投与され得るか、または注射を使用して自己投与され得る。ゲージサイズおよび注入容量は、当業者によって容易に決定され得ることが理解される。ただし、注入容量は、約２ｍＬ以下、さらには約１ｍＬ以下であり、ニードルゲージは、約２７Ｇ以上、さらには約２９Ｇ以上であり得る。
【0046】
本開示はまた、本明細書の化合物、またはその薬学的に許容される塩を合成するために有用な新規な中間体および方法を提供し、したがってこれらを包含する。本明細書の中間体および化合物は、当該技術分野で周知のさまざまな手法によって調製することができる。例えば、化学合成を使用する方法は、以下の実施例に例示される。記載される経路の各々についての具体的な合成ステップを、本明細書の化合物を調製する種々の方法において組み合わせることができる。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
【0047】
このように、医薬組成物としては、配列番号２および薬学的に許容される担体を有する有効量の化合物、配列番号３および薬学的に許容される担体を有する有効量の化合物、配列番号４および薬学的に許容される担体を有する有効量の化合物、配列番号５および薬学的に許容される担体を有する有効量の化合物、または配列番号６および薬学的に許容される担体を有する有効量の化合物、またはさらにそれらと薬学的に許容される担体との組み合わせが挙げられ得る。
【0048】
本明細書の化合物は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。本明細書の化合物またはそれを含む医薬組成物の例示的な用量は、個体の１キログラム（ｋｇ）あたりのミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（μｇ）、またはピコグラム（ｐｇ）量であり得る。このようにして、１日用量は約１μｇ～約１００ｍｇとなり得る。
【0049】
ここで、医薬組成物中の本明細書の化合物の有効量は、約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約３ｍｇ、または約０．０１ｍｇ～約０．０３ｍｇの用量であり得る。ただし、当業者は、いくつかの例において、有効量（すなわち、用量／投薬量）が前述の範囲の下限を下回りかつ十分に適切である可能性があり、一方、他の場合には、有効量は、より多い用量であり得、許容できる副作用を伴って使用され得ることが理解される。
【0050】
さらに、医薬組成物は、生理学的に許容可能なｐＨを有し得る。いくつかの例において、ｐＨは、約４～約８、または約５～約６の範囲であり得る。
【0051】
本明細書の化合物の少なくとも１つに加えて、医薬組成物には、１つ以上の追加の治療薬、特に他の抗糖尿病薬または減量薬が含まれ得る。いくつかの例において、追加の治療薬は、インスリン、特にＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；インディアナ州インディアナポリス）などの速効型インスリンであり得る。
【0052】
本明細書の化合物は、キットの一部として提供され得る。いくつかの例において、キットは、本明細書の少なくとも１つの化合物（および任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬）を個体に投与するためのデバイスを含む。特定の例において、キットは、本明細書の少なくとも１つの化合物（および任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬）を投与するための注射器および針を含む。特定の例において、本明細書の少なくとも１つの化合物（および任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬）は、注射器内の水溶液中に予め調合される。
【0053】
代替的に、本明細書の化合物は、インスリンポンプまたは二ホルモン（例えば、インスリン－グルカゴン）ポンプシステムなどのポンプシステムで使用され得る。
【0054】
本明細書の化合物は、標準的な手動または自動化された固相合成手順を使用して、当該技術分野で知られている任意の数のペプチド合成手法により合成され得る。自動ペプチド合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（アリゾナ州ツーソン）製である。固相合成用の試薬は、商業的供給源から容易に入手できる。固相合成装置を、干渉基のブロック、反応中のアミノ酸の保護、カップリング、脱保護、および未反応のアミノ酸のキャッピングに関する製造業者の指示に従って使用することができる。
【0055】
通常、Ｎ－α－カルバモイルで保護されたアミノ酸と、樹脂に結合した成長中のペプチド鎖のＮ末端アミノ酸は、ＤＭＦ、Ｎ－メチルピロリドン、塩化メチレンなどの不活性溶媒中において、ジイソプロピル１－カルボジイミドおよび１－ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのカップリング剤の合成存在下で、室温でカップリングされる。ＴＦＡまたはピペリジンなどの試薬を使用して、Ｎα－カルバモイル保護基を得られたペプチド樹脂から除去し、ペプチド鎖に付加するために次に望ましいＮα－保護アミノ酸を用いてカップリング反応を繰り返す。適切なアミン保護基は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。最も一般的に使用される例としては、ｔＢｏｃおよびＦｍｏｃが挙げられる。合成の完了後、ペプチドは、酸性条件下で標準的な処理方法を使用して、同時の側鎖の脱保護により固相支持体から切断される。
【0056】
当業者は、本明細書に記載のペプチド鎖をＣ末端カルボン酸を用いて合成できることを理解するであろう。Ｃ末端カルボン酸ペプチドの合成には、Ｗａｎｇ樹脂とクロロトリチル樹脂をＦｍｏｃ合成で使用できる。
【0057】
通常、Ｃ８またはＣ１８カラムでＲＰ－ＨＰＬＣを使用し、０．０５％～０．１％ＴＦＡの水－ＡＣＮ勾配を使用して、粗ペプチドを精製する。純度は分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで確認できる。ペプチドの同一性はＭＳによって確認できる。ペプチドは、広いｐＨ範囲で水性緩衝液に可溶化できる。
【0058】
グルカゴン類似体アゴニストの使用方法
本明細書の化合物の一使用は、個体、特に糖尿病を患っている個体の血糖コントロールを改善するためのインスリンの補助としてのものである。これに関して、本明細書の化合物を投与することは、過剰なインスリンの投与または遊離によって引き起こされた可能性のある低血糖症の急性例を急速に弱めることによって、血糖コントロールをもたらすことができる。あるいは、糖尿病を患っていない個体において、低血糖症は、特定の薬物療法（例、キニン）、過剰なアルコール摂取、妊娠、肝臓、心臓または腎臓に影響を与える障害（例えば、肝炎）、食欲不振などの摂食障害、過剰なインスリンが原因となる膵臓の腫瘍（例えば、インスリノーマまたはネシジオブラストーシス）、さらには副腎または下垂体の障害に起因する特定のホルモン欠乏症によって引き起こされる可能性がある。したがって、本明細書の化合物を、これらの例においても低血糖症を治療するために使用できると考えられる。
本明細書の化合物の一使用は、個体、特に糖尿病を患っている個体の血糖コントロールを改善するためのインスリンの補助としてのものである。これに関して、本明細書の化合物を投与することは、過剰なインスリンの投与または遊離によって引き起こされた可能性のある低血糖症の急性例を急速に弱めることによって、血糖コントロールをもたらすことができる。あるいは、糖尿病を患っていない個体において、低血糖症は、特定の薬物療法（例、キニン）、過剰なアルコール摂取、妊娠、肝臓、心臓または腎臓に影響を与える障害（例えば、肝炎）、食欲不振などの摂食障害、過剰なインスリンが原因となる膵臓の腫瘍（例えば、インスリノーマまたはネシジオブラストーシス）、さらには副腎または下垂体の障害に起因する特定のホルモン欠乏症によって引き起こされる可能性がある。したがって、本明細書の化合物を、これらの例においても低血糖症を治療するために使用できると考えられる。
【0059】
この方法は、本明細書に記載のステップを含むことができ、必ずしもそうとは限らないが、記載の順序で実施され得る。しかしながら、他の順序も考えられる。さらに、個々のまたは複数のステップは、時間的に並行しておよび／または重複して、および／または個別に、または複数回繰り返されるステップで実施され得る。さらに、これらの方法は、追加の不特定の工程を含み得る。
【0060】
したがって、そのような方法には、糖尿病を患っているまたはそれに罹患している個体を選択することが含まれ得る。あるいは、方法には、糖尿病を患っている、または糖尿病にかかりやすく、低血糖症の急性例を経験している個体を選択することが含まれ得る。あるいは、方法には、糖尿病を患っていないが、低血糖症の急性例を経験している個体を選択することが含まれ得る。
【0061】
方法にはまた、本明細書に記載されるような医薬組成物の形態であり得る、本明細書の少なくとも１つの化合物の有効量を個体に投与することが含まれ得る。いくつかの例において、少なくとも１つの化合物／医薬組成物は、インスリン、特に速効型インスリン類似体などの１つ以上の追加の治療薬を含むことができる。
【0062】
少なくとも１つの化合物および任意選択の追加の治療薬の濃度／用量／投与量は、本明細書の他の場所で論じられている。
【0063】
投与経路に関して、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、例えば、経口、注射（すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、脳内、脳室内、筋肉内、眼内、門脈内または病変内）、徐放システム、または埋め込みデバイスなどによる既知の方法に従って投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、ボーラス注射によって（ＱＤまたはＱＷ）または連続的に（マイクロドージングまたはマイクロインフュージョンを含む）ＳＱ投与することができる。他の例において、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、ボーラス注射によってＩＭ内投与することができる。
【0064】
投与頻度に関して、低血糖症の急性例について、必要に応じて、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を投与することができる。あるいは、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、毎日、隔日、週３回、週２回、週１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週おきに）、または毎月、に投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、毎日（ＱＤ）ＳＱに、隔日ＳＱに、週３回ＳＱに、週２回ＳＱに、週１回（ＱＷ）ＳＱに、隔週ＳＱに、または毎月（ＱＭ）ＳＱに投与することができる。特定の例において、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、ＱＤまたはＱＷ投与する。他の例において、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物を、毎日ＩＭに、隔日ＩＭに、週３回ＩＭに、週２回ＩＭに、週１回ＩＭに、隔週ＩＭに、または毎月ＩＭに投与される。
【0065】
少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物が有効量のインスリンと組み合わせて使用される例に関して、インスリンを、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物と同時に、別々に、または連続して投与することができる速効型インスリンであり得る。この例において、少なくとも１つの化合物および速効型インスリンは、ポンプ設定で使用するために、別個のカートリッジ内の水溶液中に予め調合される。
【0066】
このようにして、インスリンを、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物と同じ頻度で（すなわち、隔日、週に２回、または特に毎週）投与することができる。あるいは、インスリンを、少なくとも１つの化合物またはそれを含む医薬組成物とは異なる頻度で投与することができる。さらに、インスリンは、少なくとも１つの化合物と同じまたは異なる経路で投与することができる（例えば、両方がＳＱ、一方がＳＱ、他方が経口、一方がＳＱ、他方がＩＭなど）。
【0067】
この方法は、食事療法および運動と組み合わせることができ、および／または上記で論じたもの以外の追加の治療薬と組み合わせることができることがさらに企図される。
【実施例】
【0068】
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
【0069】
ペプチド合成
実施例１：
実施例１は、以下のアミノ酸配列を有する化合物である。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号３）。
実施例１：
実施例１は、以下のアミノ酸配列を有する化合物である。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号３）。
【0070】
構造的に、配列番号３の化合物は以下の通りである。
式中、上記の構造は、展開されている１６位のＡｉｂおよび２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準的な１文字アミノ酸コードを示す。
【化1】
式中、上記の構造は、展開されている１６位のＡｉｂおよび２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準的な１文字アミノ酸コードを示す。
【0071】
ここで、配列番号３の化合物は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔでの固相ペプチド合成によって生成される。合成（０．１２５ｍｍｏｌスケール）は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－（ｔＢｕ）－Ｗａｎｇレジン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ）から始まり、約０．３２ｍｍｏｌ／ｇで置換される。合成では、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ保護基戦略を使用する。アミノ酸側鎖誘導体は、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）およびＴｙｒ（ＯｔＢｕ）である。カップリングを、ＤＩＣで活性化された約１０当量のアミノ酸およびＤＭＦ中のシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）（１：１：１のモル比）で実施する。カップリングを室温で３時間実施する。
【0072】
同時の樹脂からの開裂および側鎖保護基の除去を、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール：水：チオアニソール９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）を含む溶液中、室温で２時間実施する。溶液をろ過し、ペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させ、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離する（冷エーテル洗浄を３回繰り返す）。
【0073】
粗ペプチドを１０％酢酸を含む４０ｍＬの水に溶解し、Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ７μｍ、１９ｘ３００ｍｍ）において１８ｍＬ／ｍｉｎの流量で精製する。試料は、９０分間にわたって１６％～３６％Ｂの線形ＡＢ勾配で溶出され、ここで、Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約２５％Ｂで溶出する。ＴＦＡ塩は、結合したＴＦＡ画分を０．１％ＴＦＡ水溶液で２倍の容積に希釈することにより、酢酸塩に変換される。材料をカラムにロードし、続いて５０ｍＬの水をカラムにロードし、次いで２５０ｍＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液とさらに５０ｍＬの水をロードする。試料は、７５分間にわたって５％～２０％Ｂの線形ＡＢ勾配で溶出され、ここで、Ａ＝２％酢酸水溶液、Ｂ＝ＡＣＮである。生成物は約１８％Ｂで溶出する。純画分を合わせて凍結乾燥する。
【0074】
ペプチドの純度および分子量（ＭＷ）を、単一の四重極ＭＳ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２４０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣ－ＭＳシステムで確認する。分析用ＨＰＬＣ分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＲＰ１８、１．７μｍ、２．１ｍｍｘ１００ｍｍカラムで、２０分間にわたって１０％～４０％Ｂの直線ＡＢ勾配で行い、ここで、Ａ＝水中の０．０５％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡであり、流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎ（波長２２０ｎｍ）である。化合物を＞９８％の純度に精製し、１原子質量単位（ａｍｕ）以内の計算値に対応するＭＷを有することを確認する。ＭＷ＝３４１０．８；計算値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１７０６．３、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１３７．９、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８５３．７；実測値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１７０６．４、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１３７．８、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８５３．７。
【0075】
実施例２：
実施例２は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号４）。
実施例２は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号４）。
【0076】
構造的には、配列番号４の化合物は以下の通りである。
式中、上記の構造は、展開されている１６位のＡｉｂおよび２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準的な１文字アミノ酸コードを示す。
【化2】
式中、上記の構造は、展開されている１６位のＡｉｂおよび２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準的な１文字アミノ酸コードを示す。
【0077】
ここで、配列番号４の化合物は、本質的には、実施例１について記載されるように生成される。樹脂からの開裂および同時の側鎖保護基除去後に、粗ペプチドを、実施例１に記載のように、９０分間にわたって１６％～３６％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して精製し、ここで、Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約２４％Ｂで溶出する。ＴＦＡ塩は、実施例１に記載されるように、７５分間にわたって５％～２０％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して酢酸塩に変換され、ここで、Ａ＝２％酢酸水溶液およびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約１７％Ｂで溶出する。純画分を合わせて凍結乾燥する。
【0078】
精製されたペプチドの特徴付けを、実施例１に記載されるように実施し、１原子質量単位（ａｍｕ）内の計算値に対応するＭＷを有することが確認される。ＭＷ＝３３５３．８；計算値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１６７７．８、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１１８．９、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８３９．４；実測値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１６７７．８、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１１８．８、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８３９．３。
【0079】
実施例３：
実施例３は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号５）。
実施例３は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号５）。
【0080】
構造的には、配列番号５の化合物は以下の通りである。
式中、構造は、展開されている３位のＤａｂ（Ａｃ）、１６位のＡｉｂ、および２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準の１文字アミノ酸コードを示す。
【化3】
式中、構造は、展開されている３位のＤａｂ（Ａｃ）、１６位のＡｉｂ、および２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準の１文字アミノ酸コードを示す。
【0081】
ここで、配列番号５の化合物は、本質的には、実施例１に記載されるように生成される。Ｆｍｏｃ－Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨ構成単位は、Ｄａｂ３カップリング（直交保護基）に使用されて、合成プロセスの後半で部位特異的なアセチル化を可能にする。Ｎ末端残基は、実施例１に記載されるのと同じプロトコルを使用して、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとして組み込まれる。ペプチド樹脂の伸長が終了した後、スカベンジャーとしてのＰｈＳｉＨ３の存在下で触媒量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を使用して、Ｄａｂ３に存在するＡｌｌｏｃ保護基を除去する。Ｄａｂ３位置でのアセチル化は、実施例１に記載されているように、ＤＩＣおよびＯｘｙｍａで活性化された酢酸を使用して達成される。樹脂からの開裂および同時の側鎖保護基除去後に、粗ペプチドを、実施例１に記載のように、９０分間にわたって１６％～３６％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して精製し、ここで、Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約２５％Ｂで溶出する。ＴＦＡ塩は、実施例１に記載されるように、７５分間にわたって５％～２０％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して酢酸塩に変換され、ここで、Ａ＝２％酢酸水溶液およびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約２０％Ｂで溶出する。純画分を合わせて凍結乾燥する。
【0082】
精製されたペプチドの特徴付けを、実施例１に記載されるように実施し、１原子質量単位（ａｍｕ）内の計算値に対応するＭＷを有することが確認される。ＭＷ＝３３６７．８；計算値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１６８４．８、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１２３．５、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８４２．９；実測値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１６８４．８、Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１２３．４、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８４２．９。
【0083】
実施例４：
実施例４は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号６）。
実施例４は、以下の構造を有する化合物である。
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号６）。
【0084】
構造的には、配列番号６の化合物は以下の通りである。
式中、構造は、展開している３位のＤａｂ（Ａｃ）、１６位のＡｉｂ、および２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準の１文字アミノ酸コードを示している。
【化4】
式中、構造は、展開している３位のＤａｂ（Ａｃ）、１６位のＡｉｂ、および２５位の４－Ｐａｌを除いて、標準の１文字アミノ酸コードを示している。
【0085】
ここで、配列番号６の化合物は、本質的には、実施例３に記載されるように生成される。樹脂からの開裂および同時の側鎖保護基除去後に、粗ペプチドを、実施例１に記載のように、９０分間にわたって１６％～３６％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して精製し、ここで、Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約２６％Ｂで溶出する。ＴＦＡ塩は、実施例１に記載されるように、７５分間にわたって５％～２０％Ｂの線形ＡＢ勾配を使用して酢酸塩に変換され、ここで、Ａ＝２％酢酸水溶液およびＢ＝ＡＣＮである。生成物は約１９％Ｂで溶出する。純画分を合わせて凍結乾燥する。
【0086】
精製されたペプチドの特徴付けを、実施例１に記載されるように実施し、１原子質量単位（ａｍｕ）内の計算値に対応するＭＷを有することが確認される。ＭＷ＝３４２４．８；計算値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１７１３．４；Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１４２．６、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８５７．２；実測値：Ｍ＋２Ｈ＋／２＝１７１３．４；Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１１４２．４、Ｍ＋４Ｈ＋／４＝８５７．２。
【0087】
インビトロ機能
実施例５：実施例１～４の化合物の溶解性および化学的安定性
方法
実施例１～４の化合物を、Ｈ５．５ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）、Ｈ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍＣｒｅｓｏｌ）およびＨ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）中で調製する。実施例２の化合物の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、実施例１、３および４の化合物においては２ｍｇ／ｍＬである。すべての溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、ＳＬＧＶ００４ＳＬ）でろ過し、いくつかのＨＰＬＣバイアル（ＤＷＫ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ、Ｗｈｅａｔｏｎ ０．３ｍＬバイアル、カタログ番号２２５３２６、キャップカタログ番号Ｗ２２５３３００１）に移す。次いで、試料を４℃および３７℃に維持する。試料を、濁度および相分離についてさまざまな時点で視覚的に評価する。
実施例５：実施例１～４の化合物の溶解性および化学的安定性
方法
実施例１～４の化合物を、Ｈ５．５ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）、Ｈ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍＣｒｅｓｏｌ）およびＨ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）中で調製する。実施例２の化合物の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、実施例１、３および４の化合物においては２ｍｇ／ｍＬである。すべての溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、ＳＬＧＶ００４ＳＬ）でろ過し、いくつかのＨＰＬＣバイアル（ＤＷＫ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ、Ｗｈｅａｔｏｎ ０．３ｍＬバイアル、カタログ番号２２５３２６、キャップカタログ番号Ｗ２２５３３００１）に移す。次いで、試料を４℃および３７℃に維持する。試料を、濁度および相分離についてさまざまな時点で視覚的に評価する。
【0088】
化合物の安定性を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって６０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、３．６μｍ、ＸＢ－Ｃ１８ ４．６ｘ１００ｍｍカラム（Ｐ／ＮＯ ００Ｄ－４４８２－Ｅ０）において、１．２ｍＬ／ｍｉｎ（波長２２０ｎｍ）の流量で、５％Ｂイソクラティック（５分）、５％～２５％Ｂ（２０分）、２５％～３０％Ｂ（３０分）、３０％～４５％Ｂ（１０分）のＡＢ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．０４％ＴＦＡ／ＡＣＮ）勾配で評価する。
【0089】
結果
化合物は、視覚的評価およびＲＰ－ＨＰＬＣの両方により４週間にわたってｐＨ５．５（緩衝液Ｈ５．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）、ｐＨ６（緩衝液Ｈ６ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）およびｐＨ６．５（緩衝液Ｈ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）において４℃および３７℃での溶解度を維持した。物理的外観は透明乃至無色で、乳白色ではなく、粒子もない。ＲＰ－ＨＰＬＣによる回収率を以下の表１に示す。
化合物は、視覚的評価およびＲＰ－ＨＰＬＣの両方により４週間にわたってｐＨ５．５（緩衝液Ｈ５．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）、ｐＨ６（緩衝液Ｈ６ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）およびｐＨ６．５（緩衝液Ｈ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ）において４℃および３７℃での溶解度を維持した。物理的外観は透明乃至無色で、乳白色ではなく、粒子もない。ＲＰ－ＨＰＬＣによる回収率を以下の表１に示す。
【表1】
【0090】
以下の表２に示すように、ＲＰ－ＨＰＬＣによる化合物の評価では、緩衝液Ｈ５．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ（４週間３７℃でｐＨ ５．５対Ｔ０）および緩衝液Ｈ６ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ（４週間３７℃でのｐＨ６対Ｔ０）で４．５％未満、緩衝液Ｈ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ（４週間３７℃でｐＨ ６．５対Ｔ０）で５．３２％≦のメインピーク変化が示されている。
【表2】
【0091】
実施例６：実施例１～４の化合物の物理的安定性
方法
化合物のフィブリル化のレベルを評価するために、チオフラビンＴ結合アッセイを実行する。実施例１～４の化合物をＨ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（実施例２を５ｍｇ／ｍＬで、実施例１、３および４を２ｍｇ／ｍＬで）に溶解し、蒸発を防ぐためにＣＯＰ－Ｃｏｅｘ（Ｚａｃｒｏｓ Ｑ４ ２０１７）材料からなるポンプバッグに充填する。バッグ内の試料は、攪拌（１５０ｒｐｍ、直線方向）の有無にかかわらず４℃および３７℃で２週間保管される。
方法
化合物のフィブリル化のレベルを評価するために、チオフラビンＴ結合アッセイを実行する。実施例１～４の化合物をＨ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（実施例２を５ｍｇ／ｍＬで、実施例１、３および４を２ｍｇ／ｍＬで）に溶解し、蒸発を防ぐためにＣＯＰ－Ｃｏｅｘ（Ｚａｃｒｏｓ Ｑ４ ２０１７）材料からなるポンプバッグに充填する。バッグ内の試料は、攪拌（１５０ｒｐｍ、直線方向）の有無にかかわらず４℃および３７℃で２週間保管される。
【0092】
異なるサンプルのアリコート（各アリコート１００μＬおよび３回ずつ）を０および２週間の時点で採取し、次いでプレートに加えた後、１０μＬの１ｍＭチオフラビンＴ（Ｈ２Ｏのストック溶液、ｐＨ２．８）（Ｔ３５５１６－２５Ｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。試料を３０分間インキュベートする。蛍光を、励起波長として４４０ηｍを使用するＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、発光波長を、４７５ηｍのカットオフと自動感度調整で４８０ηｍに設定する。生データをＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ５．４．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で収集し、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）にインポートする。各時点での３つのウェルの平均は、以下の表３に示す報告された蛍光単位になる。
【0093】
結果
【表3】
【0094】
表３に示されるように、実施例１～４の化合物は、視覚的評価およびチオフラビンＴ結合アッセイの両方によって評価されるように、攪拌ストレスの存在下で２週間、３７℃およびｐＨ６で物理的安定性を維持する。さらに、実施例１～４の化合物は、チオフラビンＴ結合アッセイによって測定されるように、フィブリル化を示さなかった。
【0095】
実施例７：実施例１～４の化合物の会合状態
方法
実施例１～４の化合物を、Ｈ５．５ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）、Ｈ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍＣｒｅｓｏｌ）およびＨ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）中で調製する。実施例２の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、実施例１、３および４の最終濃度は２ｍｇ／ｍＬである。すべての溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、ＳＬＧＶ００４ＳＬ）でろ過する。分析用超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ、モデル－ＸｌｉおよびモデルＯｐｔｉｍａ）を使用して、干渉検出により、２０℃で６０，０００ｒｐｍで約５００回（間隔＝２分）沈降速度データを収集する。
方法
実施例１～４の化合物を、Ｈ５．５ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）、Ｈ６ＰＧ／ｍクレゾール緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍＣｒｅｓｏｌ）およびＨ６．５ＰＧ／ｍＣｒｅｓｏｌ緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５、１９ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、３．１５ｍｇ／ｍＬ ｍクレゾール）中で調製する。実施例２の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、実施例１、３および４の最終濃度は２ｍｇ／ｍＬである。すべての溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、ＳＬＧＶ００４ＳＬ）でろ過する。分析用超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ、モデル－ＸｌｉおよびモデルＯｐｔｉｍａ）を使用して、干渉検出により、２０℃で６０，０００ｒｐｍで約５００回（間隔＝２分）沈降速度データを収集する。
【0096】
結果
以下の表４に示すように、化合物には、モノマー、トリマー、および高分子量種（ＨＭＷＳ）の混合物が含まれる。
以下の表４に示すように、化合物には、モノマー、トリマー、および高分子量種（ＨＭＷＳ）の混合物が含まれる。
【表4】
【0097】
化合物は、分析用遠心分離により、ｐＨ６およびｐＨ６．５よりもｐＨ５．５でわずかに高いモノマーの割合（％）を示している。２ｍｇ／ｍＬでは、実施例１、３および４の化合物においては単量体性が高い。試験品の濃度が高い（５ｍｇ／ｍＬ）ため、実施例２の化合物では、モノマーの割合（％）が減少している。全体として、データは、実施例１～４の化合物の高いモノマー含有量を示しており、これは、動物モデルおよびヒトにおけるＳＱ投与後のより速い吸収速度をもたらし得る。
【0098】
実施例８：実施例１～４の化合物の親水性データ
方法
実施例１～４の化合物の親水性を、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣによって６０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、３．６μｍ、ＸＢ－Ｃ１８ ４．６ｘ１００ｍｍカラム（Ｐ／ＮＯ ００Ｄ－４４８２－Ｅ０）において、１．２ｍＬ／ｍｉｎ（波長２２０ｎｍ）の流量で、５％Ｂイソクラティック（５分）、５％～２５％Ｂ（２０分）、２５％～３０％Ｂ（３０分）、３０％～４５％Ｂ（１０分）のＡＢ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／水；Ｂ＝０．０４％ＴＦＡ／ＡＣＮ）勾配で評価する。
方法
実施例１～４の化合物の親水性を、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣによって６０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、３．６μｍ、ＸＢ－Ｃ１８ ４．６ｘ１００ｍｍカラム（Ｐ／ＮＯ ００Ｄ－４４８２－Ｅ０）において、１．２ｍＬ／ｍｉｎ（波長２２０ｎｍ）の流量で、５％Ｂイソクラティック（５分）、５％～２５％Ｂ（２０分）、２５％～３０％Ｂ（３０分）、３０％～４５％Ｂ（１０分）のＡＢ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／水；Ｂ＝０．０４％ＴＦＡ／ＡＣＮ）勾配で評価する。
【0099】
結果
以下の表５に示すように、化合物は、ＲＰ－ＨＰＬＣによる保持時間がヒトグルカゴンと同等またはわずかに速いことを示しており、これは、ヒトグルカゴンと同等またはわずかに優れた親水性プロファイルを示す（すなわち、保持時間が速いほど親水性が高いことを示す）。
以下の表５に示すように、化合物は、ＲＰ－ＨＰＬＣによる保持時間がヒトグルカゴンと同等またはわずかに速いことを示しており、これは、ヒトグルカゴンと同等またはわずかに優れた親水性プロファイルを示す（すなわち、保持時間が速いほど親水性が高いことを示す）。
【表5】
【0100】
実施例９：実施例１～４の化合物の結合親和性
方法
１．ヒトグルカゴン受容体結合アッセイ：実施例１～４の化合物の結合は、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ、例えば、Ｌｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ １４０：２０３－２０９（１９９４）を参照されたい、ヌクレオチド配列については、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ２０３１６を参照されたい）を過剰発現する２９３－ＨＥＫ細胞株を使用することによって決定される。
方法
１．ヒトグルカゴン受容体結合アッセイ：実施例１～４の化合物の結合は、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ、例えば、Ｌｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ １４０：２０３－２０９（１９９４）を参照されたい、ヌクレオチド配列については、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ２０３１６を参照されたい）を過剰発現する２９３－ＨＥＫ細胞株を使用することによって決定される。
【0101】
接着培養物に由来する細胞を使用して、粗血漿膜を調製する。５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、およびＥＤＴＡを含むｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）を含有する低張緩衝液中で、凍結細胞ペレットを氷上で溶解させる。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）乳棒を備えたガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、２５ストロークで細胞懸濁液を均質化する。均質化物を４℃、１１００ｘｇで１０分間遠心分離する。上清を集めて氷上に保存し、ペレットを均質化懸濁液に再懸濁させて再均質化する。均質化物を１１００ｘｇで１０分間遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、４℃、３５０００ｘｇで１時間遠心分離する。得られた膜ペレットを、約１～３ｍｇ／ｍＬでプロテアーゼ阻害剤を含有する均質化緩衝液に再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまでアリコートとして－８０℃の冷凍庫で保存する。
【0102】
ヒトグルカゴン（配列番号１）を、１２５Ｉ－ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素化し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＮＥＸ２０７））によって精製する。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。１２５Ｉ標識グルカゴン材料中の高プロパノール含有量のために、飽和結合の代わりに相同競合によって、ＫＤの決定を実行する。ｈＧＣＧＲ結合についてのＫＤを３．６５ｎＭであると推定し、試験した全ての化合物のＫｉ値の計算に使用する。
【0103】
受容体結合アッセイを、ＷＧＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；マサチューセッツ州ウォルサム）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法を使用して実施する（例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＭｅｔａｂＥｎｇ．７：３８－４４を参照されたい）。ヒトグルカゴンおよび実施例１～４の化合物を２ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、－２０℃で凍結保存する。
【0104】
実施例１～４の化合物およびヒトグルカゴンを、ＤＭＳＯで段階的に希釈する。最終的に１μＭの１０μＬの希釈試験化合物または冷グルカゴン（非特異的結合（ＮＳＢ））を、４５μＬのアッセイ結合緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン、０．００３％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、およびＥＤＴＡを含まないｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤）を含有するＣｏｒｎｉｎｇ（商標）３６０４（非結合面）クリアボトムアッセイプレート中に移す。９０μＬのメンブレン（１．５μｇ／ウェル）、５０μＬの１２５Ｉ標識グルカゴン（反応中の最終濃度０．１５ｎＭ）、および５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加する。ＤＭＳＯ濃度は４．２％を超えない。プレートを、密封し、プレートシェーカーで混合し、室温で１２時間静置した後、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取る。
【0105】
結果は、実施例１～４の化合物の存在下での特定の１２５Ｉ標識グルカゴン結合の割合（％）として計算される。試験化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、１２５Ｉ標識グルカゴンの特異的結合割合（％）と添加した試料の濃度（５．１ｘ－１１～１．０ｘ１０－６ｍｏｌ／Ｌ）の非線形回帰分析によって導出される。ＩＣ５０濃度を、チェン－プルソフ等式（Ｃｈｅｎｇ＆Ｐｒｕｓｏｆｆ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９－３１０８）を使用して、Ｋｉに変換する。
【0106】
２．ラットグルカゴン受容体結合アッセイ：化合物がラットグルカゴン受容体（ｒＧＣＧＲ）に結合するかどうかを判定するために、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに本質的に記載されている結合アッセイを実施する。粗原形質膜を、クローン化されたｒＧＣＧＲで過渡的にトランスフェクトされた懸濁培養中の２９３－ＨＥＫ細胞から調製する（Ｓｖｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９１：４７９－４８６；ヌクレオチド配列については、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ０４７９６．１も参照されたい）。２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５単位／ｍｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）およびＥＤＴＡ不含Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する低張緩衝液中で、凍結細胞ペレットを氷上で溶解させる。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）乳棒を備えた、ガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、２０ストロークで細胞懸濁液を均質化する。ホモジネートを４℃で、１８００×ｇで１５分間、遠心分離する。上清を退避させて、氷上に保存し、ペレットを均質化バッファーに再懸濁して再均質化する。均質物を１８００ｘｇで１５分間遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、４℃、２５０００ｘｇで３０分間遠心分離する。得られた膜ペレットを、約１～３ｍｇ／ｍＬでプロテアーゼ阻害剤を含有する均質化緩衝液（ＤＮＡｓｅ Ｉなし）に再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまでアリコートとして－８０℃の冷凍庫で保存する。
【0107】
ヒトグルカゴン（配列番号１）は、１２５Ｉ－ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素化され、逆相ＨＰＬＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＮＥＸ２０７））によって精製される。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。１２５Ｉ標識グルカゴン中の高プロパノール含有量のために、飽和結合の代わりに相同競合によって、ＫＤの決定を実行する。ｒＭＲ結合についてのＫＤを２０．４ｎＭであると推定し、試験した全ての化合物のＫｉ値の計算に使用する。
【0108】
ＳＰＡ受容体結合アッセイおよび結果の計算は、ｈＧＣＧＲ結合アッセイに記載されているように実施される。
【0109】
結果
【表6】
【0110】
これらのデータは、実施例１～４の化合物が、ヒトグルカゴンと比較した場合、同様または増加した親和性でｒＧＣＧＲまたはｈＧＣＧＲに結合し、その受容体を活性化し、次にグルカゴン依存性生理学的応答を誘発し得ることを示す。
【0111】
実施例１０：実施例１～４の化合物の機能的活性
方法
機能的活性アッセイ：放射性リガンド競合結合アッセイは、実施例１～４の化合物および比較化合物［ヒトグルカゴン（配列番号１）、ヒトＧＩＰアミド（配列番号７）およびヒトＧＬＰ－１アミド（配列番号８）］についての平衡解離定数（ＫＤ）を決定するために実行される。このようなアッセイは、ＨＥＫ－２９３クローン細胞株を発現する、ヒトＧＬＰ－１受容体（ｈＧＬＰ－１Ｒ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０６２を参照されたい）、ｈＧＣＧＲ、およびヒトＧＩＰ受容体（ｈＧＩＰ－Ｒ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ８４４１８．１を参照されたい）を過剰発現するトランスフェクトＨＥＫ－２９３細胞から調製したＳＰＡ法および膜を使用する。２０μｌアッセイ容量中、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３５０５０）、０．２５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏカタログ番号２６４００）、０．０５％画分Ｖ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２６０）、２５０μＭのＩＢＭＸ、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５６３０）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１０５３）中の試験化合物（２０ポイントＣＲＣ、２．７５倍Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ直接希釈）で、各受容体過剰発現細胞株を処理する。室温での６０分間インキュベーション後に、得られる細胞内ｃＡＭＰの増加を、ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＪ；ＣｉｓＢｉｏ；フランス、コドレ）を使用して定量的に決定する。簡潔には、細胞溶解緩衝液（１０μＬ）中のｃＡＭＰ－ｄ２コンジュゲートを添加し、続いて同様に細胞溶解緩衝液（１０μＬ）中の、抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ３＋－クリプテート抗体を添加することによって、細胞内のｃＡＭＰレベルを検出する。結果として得られる競合アッセイを、室温で少なくとも６０分間インキュベートし、その後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）機器（３２０ｎｍでの励起ならびに６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの発光）を使用して検出する。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ単位（６６５ｎｍ／６２０ｎｍでの発光＊１０，０００）は存在するｃＡＭＰの量に反比例し、ｃＡＭＰ標準曲線を使用して、これを１ウェル当たりのｎＭ ｃＡＭＰに変換する。各ウェルで生成されたｃＡＭＰの量（ｎＭ）を、ヒトＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ２、ヒトグルカゴン、またはヒトＧＩＰ（１－４２）ＮＨ２のいずれかで観察された最大反応の割合（％）変換する。４パラメータロジスティック方程式にフィットさせた、最大反応割合（％）対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値および最大割合（％）（Ｅ最大）を導出する。
方法
機能的活性アッセイ：放射性リガンド競合結合アッセイは、実施例１～４の化合物および比較化合物［ヒトグルカゴン（配列番号１）、ヒトＧＩＰアミド（配列番号７）およびヒトＧＬＰ－１アミド（配列番号８）］についての平衡解離定数（ＫＤ）を決定するために実行される。このようなアッセイは、ＨＥＫ－２９３クローン細胞株を発現する、ヒトＧＬＰ－１受容体（ｈＧＬＰ－１Ｒ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０６２を参照されたい）、ｈＧＣＧＲ、およびヒトＧＩＰ受容体（ｈＧＩＰ－Ｒ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ８４４１８．１を参照されたい）を過剰発現するトランスフェクトＨＥＫ－２９３細胞から調製したＳＰＡ法および膜を使用する。２０μｌアッセイ容量中、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３５０５０）、０．２５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏカタログ番号２６４００）、０．０５％画分Ｖ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２６０）、２５０μＭのＩＢＭＸ、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５６３０）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１０５３）中の試験化合物（２０ポイントＣＲＣ、２．７５倍Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ直接希釈）で、各受容体過剰発現細胞株を処理する。室温での６０分間インキュベーション後に、得られる細胞内ｃＡＭＰの増加を、ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＪ；ＣｉｓＢｉｏ；フランス、コドレ）を使用して定量的に決定する。簡潔には、細胞溶解緩衝液（１０μＬ）中のｃＡＭＰ－ｄ２コンジュゲートを添加し、続いて同様に細胞溶解緩衝液（１０μＬ）中の、抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ３＋－クリプテート抗体を添加することによって、細胞内のｃＡＭＰレベルを検出する。結果として得られる競合アッセイを、室温で少なくとも６０分間インキュベートし、その後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）機器（３２０ｎｍでの励起ならびに６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの発光）を使用して検出する。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ単位（６６５ｎｍ／６２０ｎｍでの発光＊１０，０００）は存在するｃＡＭＰの量に反比例し、ｃＡＭＰ標準曲線を使用して、これを１ウェル当たりのｎＭ ｃＡＭＰに変換する。各ウェルで生成されたｃＡＭＰの量（ｎＭ）を、ヒトＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ２、ヒトグルカゴン、またはヒトＧＩＰ（１－４２）ＮＨ２のいずれかで観察された最大反応の割合（％）変換する。４パラメータロジスティック方程式にフィットさせた、最大反応割合（％）対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値および最大割合（％）（Ｅ最大）を導出する。
【0112】
ヒトＧＬＰ－２受容体（ｈＧＬＰ－２Ｒ）の場合、クローン化されたヒトＧＬＰ－２発現細胞株（２０１６０６２４－ＢＥ０３８５９－０３７）を使用して、ｈＧＬＰ－２Ｒで刺激されたｃＡＭＰ機能的反応を評価する。細胞を、ＧＬＰ－２（配列番号９）または実施例１～４の化合物で刺激し、細胞内で生成されたｃＡＭＰを、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＣ）を使用して定量する。簡潔には、細胞内のｃＡＭＰレベルは、細胞溶解緩衝液の存在下でｃＡＭＰ－ｄ２捕捉抗体に結合することによって検出される。キットに提供される第２の検出抗体である抗ｃＡＭＰクリプテートを追加して、競合サンドイッチアッセイを作成する。検出抗体複合体が形成されると、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）機器で測定されるシグナルが増加する。
【0113】
凍結保存されたｈＧＬＰ－２Ｒ－ＨＥＫ－２９３細胞は、３７℃のウォーターバスで迅速に解凍され、０．５％定義ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０）を添加した予熱されたＤＭＥＭ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ ３１０５３）、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２３７．０１）に再懸濁される。次に、細胞を室温で５分間１００×ｇでペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットを５×１０４細胞／ｍｌでＤＭＥＭに再懸濁する。次に、５０μＬの細胞（２５００細胞／ウェル）を９６ウェルハーフエリアブラックプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３８７５）に播種し、３７℃のインキュベータで一晩インキュベートする。試験試料は、ＤＭＳＯ中で２ｍＭのストックとして調製し、必要になるまで－２０℃で凍結する。処理の日に、ＧＬＰ－２、緩衝液対象、および実施例１～４の化合物をＤＭＳＯで段階的に希釈し、続いて化合物希釈培地（５００μｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸを含むアッセイ培地（ＤＭＥＭ、０．１％脂肪酸不含ウシ血清アルブミンを含むＧｉｂｃｏ ３１０５３Ｐ、ＢＳＡ、７．５％（Ｇｉｂｃｏ １５６２０）；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ）に段階希釈する。反応の前に、細胞を１００μＬ／ウェルのアッセイ培地で洗浄し、２０μＬ／アッセイ培地と置き換え、次いで反応に続いて、２０μＬの２倍濃縮ＧＬＰ－２、緩衝液対照、または実施例１～４の化合物のいずれかを化合物希釈培地に添加する。最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えず、最終ＩＢＭＸ濃度は２５０μＭである。室温で１時間インキュベートした後、ＣｉｓＢｉｏ溶解緩衝液で希釈した２０μＬのｃＡＭＰ－ｄ２－ｃａｐｔｕｒｅ抗体（ＣｉｓＢｉｏ）を添加することによって反応を停止し、ＴｉｔｒａＭａｘ（商標）シェーカー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ ＫＧ；ドイツ、シュヴァーバッハ）を１分間、次いで２０μＬの検出抗体、抗ｃＡＭＰ Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＣｉｓＢｉｏ）を添加し、６００ｒｐｍで１分間混合した後、室温で３００ｒｐｍで穏やかに振とうした。溶解した細胞と抗体の混合物は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）装置を使用して１時間後に読み取られる。Ｅｎｖｉｓｉｏｎの単位は、ｃＡＭＰ標準曲線を使用してｃＡＭＰ／ウェルをｐｍｏｌ／Ｌに変換された。各ウェルで生成されたｃＡＭＰのピコモルは、ＧＬＰ－２コントロールで観察された最大反応割合（％）に変換される。４パラメータロジスティック方程式（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）にフィットさせた、最大反応割合（％）対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値を誘導する。
【0114】
クローン化されたラットグルカゴン発現細胞株（ｒＧＲ Ｃ＃１８、ＢＥ０３５８１－０２９－ＢＥ０３７５４－０６５）は、ラットグルカゴン受容体刺激ｃＡＭＰ機能アッセイに使用される。細胞はグルカゴンまたは試験試料で刺激され、細胞内で生成されたｃＡＭＰは、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＣ）を使用して定量化される。簡潔には、細胞内のｃＡＭＰレベルは、細胞溶解緩衝液の存在下でｃＡＭＰ－ｄ２捕捉抗体に結合することによって検出される。キットに提供される第２の検出抗体である抗ｃＡＭＰクリプテートを追加して、競合サンドイッチアッセイを作成する。検出抗体複合体が形成されると、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）装置で測定されるシグナルが増加する。
【0115】
実験の日に、凍結保存したｒａｔＧｌｕｃａｇｏｎＲｅｃｅｐｔｏｒ－ＨＥＫ２９３細胞を３７℃の水浴で迅速に解凍し、０．５％定義ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０）および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２３７．０１）を添加した予熱したＣｅｌｌ Ｍｅｄｉａ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ３１０５３）に再懸濁する。次に、細胞を室温で５分間１００×ｇでペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをＣｅｌｌ Ｍｅｄｉａに再懸濁する。試験試料は、ＤＭＳＯ中で２ｍＭのストックとして調製し、必要になるまで－２０℃で凍結する。グルカゴン、緩衝液対象、および試験化合物をＤＭＳＯで段階的に希釈した後、化合物希釈培地（５００μｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸを含むアッセイ培地（ＤＭＥＭ、０．１％脂肪酸不含ウシ血清アルブミンを含むＧｉｂｃｏ ３１０５３Ｐ、ＢＳＡ、７．５％（Ｇｉｂｃｏ １５６２０）；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ）に段階希釈する。反応は、２０μＬの細胞（２５００細胞／ウェル）またはｃＡＭＰ標準曲線試料を９６ウェルプレートハーフエリアブラックプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９４）に添加し、続いて２０μＬの２Ｘ濃縮グルカゴン、化合物希釈培地中の緩衝液対象または試験化合物のいずれかを添加することにより、４０μＬで実行される。最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えず、最終ＩＢＭＸ濃度は２５０μＭである。室温で１時間インキュベートした後、ＣｉｓＢｉｏ溶解緩衝液で希釈した２０μＬのｃＡＭＰ－ｄ２－ｃａｐｔｕｒｅ抗体（ＣｉｓＢｉｏ）を添加し、ＴＩＴＲＡＭＡＸシェーカーで１分間穏やかに混合することによって反応を停止し、次いで２０μＬの検出抗体［抗ｃＡＭＰクリプテート（ＣｉｓＢｉｏ）］を添加し、プレートシェーカー上で６００ｒｐｍで１分間混合した後、室温で３００ｒｐｍで穏やかに振とうする。細胞溶解物と抗体の混合物は、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）を使用して１時間後に読み取られる。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）の単位は、ｃＡＭＰ標準曲線を使用してｃＡＭＰ／ウェルをｐｍｏｌ／Ｌに変換された。各ウェルで生成されたｃＡＭＰのピコモルは、グルカゴンコントロールで観察された最大反応の割合（％）に変換される。４パラメータロジスティック方程式（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）にフィットされた、最大反応割合（％）対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値を導出する。
【0116】
結果
【表7】
【0117】
これらのデータは、ＦＢＳおよびＢＳＡの存在下で、実施例１～４の化合物が、ヒトグルカゴンよりも高いｈＧＣＧＲでのアゴニスト活性を有することを示している。加えて、これらのデータは、実施例１～４がヒトグルカゴンよりもｈＧＬＰ－１Ｒで弱いアゴニスト活性を有することを示し、これは、実施例１～４がヒトグルカゴンよりも高い程度の選択性を有することを示す。加えて、実施例１～４の化合物は、ｈＧＩＰＲに評価可能に結合せず、およびそれを活性化しない。したがって、実施例１～４は、グルカゴン受容体媒介生理学的反応を開始すると予測されるが、ＧＬＰ－１ＲおよびＧＩＰＲ媒介生理学的反応を開始しないと予測される。
【表8】
【0118】
これらのデータは、有効性に関して、本発明の実施例１～４が、ＧｃｇＲおよびＧＬＰ－１Ｒ ｃＡＭＰアゴニストアッセイにおいて完全に有効であるとして、ヒトグルカゴンと非常に類似して振る舞うことを示している。
【表9】
【0119】
これらのデータ（左の列）は、実施例１～４および天然グルカゴンが同様の効力でラットＧＣＧＲを機能的に活性化し、それによりラットにおいてグルカゴン受容体媒介生理学的反応を開始できることを示している。これらのデータ（右の列）は、実施例１～４の化合物が２５００ｎＭの最高濃度でｈＧＬＰ－２ＲでｃＡＭＰを刺激せず、したがってｈＧＬＰ－２Ｒを機能的に活性化できないことを示している。このように、それらはＧＬＰ－２Ｒ媒介生理学的反応を開始しないと予測される。
【0120】
実施例１１：実施例１～４の化合物の免疫原性
方法
１．ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ：実施例１～４のＧ化合物に対する臨床免疫原性応答の傾向を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し、多様なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩハプロタイプを持つ１０人の健康なドナーのコホート由来のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。各ドナーは、２．０ｍＬの培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；０．３３μＭ）、および実施例１～４の化合物（１０μＭ）を用いて３回試験される。培養液を５％のＣＯ２を用いて、３７℃で７日間インキュベートする。７日目に、試料を、ハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用したフローサイトメトリーによって分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ／ＴｒｅｅＳｔａｒ；オレゴン州アッシュランド）を使用してデータを解析する。
方法
１．ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ：実施例１～４のＧ化合物に対する臨床免疫原性応答の傾向を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し、多様なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩハプロタイプを持つ１０人の健康なドナーのコホート由来のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。各ドナーは、２．０ｍＬの培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；０．３３μＭ）、および実施例１～４の化合物（１０μＭ）を用いて３回試験される。培養液を５％のＣＯ２を用いて、３７℃で７日間インキュベートする。７日目に、試料を、ハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用したフローサイトメトリーによって分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ／ＴｒｅｅＳｔａｒ；オレゴン州アッシュランド）を使用してデータを解析する。
【0121】
したがって、ＣＤ４＋ｔ細胞アッセイを使用して、当該技術分野で知られている方法に従ってインビボで免疫応答を誘導する可能性について実施例１～４の化合物を比較し（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２４：５６０－５７２；およびＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：９９１－１０００を参照されたい）、臨床的に試験されたモノクローナル抗体およびペプチドの評価は、インビトロで観察されたＴ細胞増殖と診療所での免疫原性との間にある程度の相関関係を示している。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイで３０％未満の陽性反応を誘発するタンパク質治療薬は、免疫原性のリスクが低いことに関連している。
【0122】
結果
【表10】
【0123】
これらのデータは、実施例１～４の化合物では、陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（ＣＤＩ＞２．５）の頻度が低く、少数の陽性ドナーにおける応答強度が低い（ＣＤＩ＜７）ことを示しており、これは免疫原性のリスクが低いことを示している。
【0124】
インビボ研究
実施例１２：実施例１～４の化合物の薬物動態。
方法
１．バイオアナリティクス：実施例１～４の化合物の血漿濃度は、Ｑ Ｓｑｕａｒｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ（Ｉｔｈａｃａ、ニューヨーク）またはＡｌｇｏｒｉｔｈｍｅ Ｐｈａｒｍａ（カナダケベック州ラヴァル）で認定された液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法によって決定される。内部標準としての化合物および類似体は、抗体またはタンパク質の沈殿によって１００％種特異的に抽出される。無傷の化合物の集団は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；マサチューセッツ州ウォルサム）によって検出される。
実施例１２：実施例１～４の化合物の薬物動態。
方法
１．バイオアナリティクス：実施例１～４の化合物の血漿濃度は、Ｑ Ｓｑｕａｒｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ（Ｉｔｈａｃａ、ニューヨーク）またはＡｌｇｏｒｉｔｈｍｅ Ｐｈａｒｍａ（カナダケベック州ラヴァル）で認定された液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法によって決定される。内部標準としての化合物および類似体は、抗体またはタンパク質の沈殿によって１００％種特異的に抽出される。無傷の化合物の集団は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；マサチューセッツ州ウォルサム）によって検出される。
【0125】
２．ブタＰＫ研究：１つの研究（表１１）では、オスのユカタンミニチュアブタ（ＭＳ）に、プロピレングリコール緩衝液（ｐＨ６）（Ｈ６ＰＧ）を含むヒスチジン中の実施例２の化合物の単回皮下用量（３０μｇ／ｋｇ）を投与するか、組換えヒトグルカゴン（ｒＧｌｕｃａｇｏｎ、Ｅ－ｋｉｔ）を０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量で投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、および２４０分に採取し、次いで、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0126】
別の研究（表１２）では、オスのユカタンＭＳに、Ｈ６ＰＧ中の実施例２の化合物の単回皮下用量（３０μｇ／ｋｇ）を投与するか、または０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量でｒグルカゴンを投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、および２４０分に採取し、次いで、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0127】
別の研究（表１３）では、オスのユカタンＭＳに、Ｈ６ＰＧ中の実施例２の化合物の単回皮下用量（１０または３０μｇ／ｋｇ）を投与するか、または０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量でｒグルカゴンを投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、および２４０分に採取し、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0128】
別の研究（表１４）において、オスのユカタンＭＳに、０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量で、Ｈ６ＰＧ中の実施例３の化合物の単回皮下用量（１０または３０μｇ／ｋｇ）を投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、および２４０分に採取し、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0129】
別の研究（表１５）では、オスのユカタンＭＳに、Ｈ６ＰＧ中の実施例１、実施例３および実施例４の化合物を０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量で単回皮下用量（１０または３０μｇ／ｋｇ）を投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、および１５０分に採取し、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0130】
別の研究（表１６）では、オスのユカタンＭＳに、Ｈ６ＰＧ中の実施例１、実施例３および実施例４の化合物を０．０１０ｍＬ／ｋｇの容量で単回皮下用量（１０または３０μｇ／ｋｇ）を投与する。血液を、投与前、投与後２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、および１５０分に採取し、血漿を、薬物動態学的特性評価のために取得する。
【0131】
結果
【表11】
【0132】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【0133】
これらのデータは、実施例１～４およびヒト組換えグルカゴンの薬物動態パラメータが、臨床的に適切な用量レベルでの単回投与後のブタモデルにおいて非常に類似していることを示している。このデータにより、実施例１～４およびヒト組換えグルカゴンの薬物動態プロファイルがヒトでも同様であり得ることが予測される。
【0134】
実施例１３：ラットモデルにおける血糖値に対する実施例１～４の化合物の効果
方法
１．動物プロトコル：４ヶ月齢のオスのスプラーグドーリーラット（Ｅｎｖｉｇｏ；インディアナ州インディアナポリス）を使用する。動物を、１２時間の明／暗サイクルで温度制御（２４℃）した施設内に個別に収容し、動物に食餌および水を自由に摂取させる。施設への１週間の順応後、ラットは治療群にランダム化される（ｎ＝４／群）。試験化合物は、緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、１９ｍｇ／ｍＬ ＰＧ、ｐＨ６）中に調合される。試験の朝、午前６時に食餌を下げる。食餌を下げてから２時間後、試験化合物を０、３、１０、３０、または１００μｇ／ｋｇの用量で皮下投与する。血糖値は、投与後０、３、６、９、１５、２０、３０、４５、６０分にＡｃｃｕ－Ｃｈｅｃｋ（登録商標）血糖計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．；インディアナ州インディアナポリス）により測定される。
方法
１．動物プロトコル：４ヶ月齢のオスのスプラーグドーリーラット（Ｅｎｖｉｇｏ；インディアナ州インディアナポリス）を使用する。動物を、１２時間の明／暗サイクルで温度制御（２４℃）した施設内に個別に収容し、動物に食餌および水を自由に摂取させる。施設への１週間の順応後、ラットは治療群にランダム化される（ｎ＝４／群）。試験化合物は、緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、１９ｍｇ／ｍＬ ＰＧ、ｐＨ６）中に調合される。試験の朝、午前６時に食餌を下げる。食餌を下げてから２時間後、試験化合物を０、３、１０、３０、または１００μｇ／ｋｇの用量で皮下投与する。血糖値は、投与後０、３、６、９、１５、２０、３０、４５、６０分にＡｃｃｕ－Ｃｈｅｃｋ（登録商標）血糖計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．；インディアナ州インディアナポリス）により測定される。
【0135】
インスリンは、ＥＬＩＳＡ（ＭＳＤ；メリーランド州ロックビル）により、投与後３、９、１５、２０、３０、および６０分に測定される。
【0136】
２．統計：結果は、群あたり４匹のラットの平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）として表される。統計的差異は、ダネットの多重比較検定を用いた二元配置分散分析によって、溶媒群の対応する時点と比較して＊ｐ＜０．０５と評価される。
【0137】
結果
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【0138】
これらのデータは、実施例１～４の化合物がラットモデルにおいて用量依存的に血糖を増加させることを示している。グルコースエクスカーションのプロファイルは、緊急キット緩衝液で調合された１０ｕｇ／ｋｇの天然組換えグルカゴンの用量と非常に築地している（データは図示せず）。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ＨＳＸ １ ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ ２ ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴのアミノ酸配列を含む化合物であって、式中、Ｘ １ はＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ はＱまたはＡである（配列番号２）、化合物。
２．Ｘ １ がＱであり、Ｘ ２ がＱである（配列番号３）、上記１に記載の化合物。
３．Ｘ １ がＱであり、Ｘ ２ がＡである（配列番号４）、上記１に記載の化合物。
４．Ｘ １ がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ がＡである（配列番号５）、上記１に記載の化合物。
５．Ｘ １ がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ がＱである（配列番号６）、上記１に記載の化合物。
６．ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号３）の化合物。
７．ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号４）の化合物。
８．ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号５）の化合物。
９．ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号６）の化合物。
１０．上記１～９のいずれかに記載の化合物および薬学的に許容される緩衝液を含む医薬組成物。
１１．前記薬学的に許容される緩衝液がヒスチジン緩衝生理食塩水である、上記１０に記載の医薬組成物。
１２．追加の治療薬をさらに含む、上記１０または１１に記載の医薬組成物。
１３．前記追加の治療薬がインスリンである、上記１２に記載の医薬組成物。
１４．個体の低血糖症を治療する方法であって、
前記個体に有効量の上記１～９のいずれかに記載の化合物を投与するステップを含む、方法。
１５．追加の治療薬を投与することをさらに含む、上記１４に記載の方法。
１６．前記追加の治療薬がインスリンである、上記１５に記載の方法。
１７．治療法で使用するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物。
１８．低血糖症を治療するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物。
１９．低血糖症を治療するための薬剤を製造するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物の使用。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ＨＳＸ １ ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ ２ ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴのアミノ酸配列を含む化合物であって、式中、Ｘ １ はＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ はＱまたはＡである（配列番号２）、化合物。
２．Ｘ １ がＱであり、Ｘ ２ がＱである（配列番号３）、上記１に記載の化合物。
３．Ｘ １ がＱであり、Ｘ ２ がＡである（配列番号４）、上記１に記載の化合物。
４．Ｘ １ がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ がＡである（配列番号５）、上記１に記載の化合物。
５．Ｘ １ がＤａｂ（Ａｃ）であり、Ｘ ２ がＱである（配列番号６）、上記１に記載の化合物。
６．ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号３）の化合物。
７．ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号４）の化合物。
８．ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号５）の化合物。
９．ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ（配列番号６）の化合物。
１０．上記１～９のいずれかに記載の化合物および薬学的に許容される緩衝液を含む医薬組成物。
１１．前記薬学的に許容される緩衝液がヒスチジン緩衝生理食塩水である、上記１０に記載の医薬組成物。
１２．追加の治療薬をさらに含む、上記１０または１１に記載の医薬組成物。
１３．前記追加の治療薬がインスリンである、上記１２に記載の医薬組成物。
１４．個体の低血糖症を治療する方法であって、
前記個体に有効量の上記１～９のいずれかに記載の化合物を投与するステップを含む、方法。
１５．追加の治療薬を投与することをさらに含む、上記１４に記載の方法。
１６．前記追加の治療薬がインスリンである、上記１５に記載の方法。
１７．治療法で使用するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物。
１８．低血糖症を治療するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物。
１９．低血糖症を治療するための薬剤を製造するための、上記１～９のいずれかに記載の化合物の使用。
【0139】
配列
以下の核酸配列および／またはアミノ酸配列が、本開示において言及され、参照のために以下に提供される。
配列番号１－ヒトグルカゴン／組換えヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＸ１ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ２ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ、式中、
Ｘ１ＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、
Ｘ２はＱまたはＡである
配列番号３－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号４－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号５－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号６－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号７－ヒトＧＩＰ（１－４２）アミド
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ－ＮＨ２
配列番号８－ヒトＧＬＰ－１（７－３６）アミド
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ－ＮＨ２
配列番号９－ＧＬＰ－２（１－３４）酸
ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤＲ－ＯＨ
以下の核酸配列および／またはアミノ酸配列が、本開示において言及され、参照のために以下に提供される。
配列番号１－ヒトグルカゴン／組換えヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＸ１ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＸ２ＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ、式中、
Ｘ１ＱまたはＤａｂ（Ａｃ）であり、
Ｘ２はＱまたはＡである
配列番号３－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号４－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号５－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＡＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号６－グルカゴン類似体アゴニスト
ＨＳ［Ｄａｂ（Ａｃ）］ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＱＱＦＶＫ（４－Ｐａｌ）ＬＬＳＴ－ＯＨ
配列番号７－ヒトＧＩＰ（１－４２）アミド
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ－ＮＨ２
配列番号８－ヒトＧＬＰ－１（７－３６）アミド
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ－ＮＨ２
配列番号９－ＧＬＰ－２（１－３４）酸
ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤＲ－ＯＨ
【配列表】