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特許7212371炎症刺激された間葉系幹細胞を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-17
(45)【発行日】2023-01-25
(54)【発明の名称】炎症刺激された間葉系幹細胞を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20230118BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230118BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230118BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20230118BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230118BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230118BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230118BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230118BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230118BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230118BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230118BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230118BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230118BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230118BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230118BHJP
A61K 31/221 20060101ALN20230118BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28 ZNA
A61P1/04
A61P3/10
A61P5/14
A61P7/00
A61P7/06
A61P11/06
A61P15/00
A61P17/00
A61P17/06
A61P19/02
A61P21/00
A61P25/00
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P31/04
A61P37/02
A61P37/06
A61P37/08
A61P43/00 111
C12N5/0775
A61K31/221
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2019513066
(86)(22)【出願日】2017-09-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-10-31
(86)【国際出願番号】 KR2017009824
(87)【国際公開番号】W WO2018048220
(87)【国際公開日】2018-03-15
【審査請求日】2020-05-19
(31)【優先権主張番号】10-2016-0115081
(32)【優先日】2016-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517278646
【氏名又は名称】エスシーエム ライフサイエンス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100091982
【弁理士】
【氏名又は名称】永井 浩之
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100105153
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 悟
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ソン、スン、ウク
(72)【発明者】
【氏名】イ、テク、ギ
【審査官】原口 美和
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１２５５８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０４８１０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００４４９５８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】韓国登録特許第１０－０８０２０１１（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】特表２００７－５３０５４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】STEM CELLS AND DEVELOPMENT，2009年，Vol. 18, No. 1，pp. 103-112
【文献】Veterinary Immunology and Immunopathology，2015年，Vol. 165，pp. 107-118
【文献】Cellular Immunology，2008年，Vol. 251，pp. 116-123
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／２８
Ａ６１Ｐ １／０４
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｐ ５／１４
Ａ６１Ｐ ７／００
Ａ６１Ｐ ７／０６
Ａ６１Ｐ １１／０６
Ａ６１Ｐ １５／００
Ａ６１Ｐ １７／００
Ａ６１Ｐ １７／０６
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３１／０４
Ａ６１Ｐ ３７／０２
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ａ６１Ｐ ３７／０８
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ ５／０７７５
Ａ６１Ｋ ３１／２２１
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アセチルコリンを分泌しコリン性ニューロン－類似表現型を示すヒト間葉系幹細胞を含む、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、前記コリン性ニューロン－類似表現型のヒト間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞を共同培養された複数のドナーのＰＢＭＣと共に培養することによって、またはヒト間葉系幹細胞を植物性凝集素（ＰＨＡ）で処理したドナーのＰＢＭＣと共に培養することによって調製される幹細胞である、前記免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記ヒト間葉系幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４を発現することを特徴とする、請求項１に記載の免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記免疫疾患または炎症疾患は、自己免疫疾患、移植拒否、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症及び炎症からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、慢性疲労症候群、線維筋痛症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性強皮症、喘息及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載の免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
ヒト間葉系幹細胞に炎症刺激を加えて培養するステップ；を含む、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用のコリン性ニューロン－類似表現型ヒト間葉系幹細胞の製造方法であって、前記ヒト間葉系幹細胞に炎症刺激を加えて培養するステップが、前記ヒト間葉系幹細胞を共同培養された複数のドナーのＰＢＭＣと共に培養すること；または前記ヒト間葉系幹細胞を植物性凝集素（ＰＨＡ）で処理したドナーのＰＢＭＣと共に培養することを含み、
前記コリン性ニューロン－類似表現型ヒト間葉系幹細胞がアセチルコリンを分泌する幹細胞である、前記免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項6】
前記ヒト間葉系幹細胞が層分離培養法により分離される、請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
前記コリン性ニューロン－類似表現型ヒト間葉系幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４を発現する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項8】
前記免疫疾患または炎症疾患が、自己免疫疾患、移植拒否、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症及び炎症からなる群から選択された１種以上である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項9】
前記自己免疫疾患が、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、慢性疲労症候群、線維筋痛症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性強皮症、喘息及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される１種以上である、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、炎症刺激された間葉系幹細胞を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用間葉系幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
骨中の軟らかい物質である骨髄は、新たな血液細胞で産生される活性組織であり、少なくとも二つのタイプの幹細胞を含む。造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣｓ）は、自己－更新幹細胞であって、全ての血液継代で産生される。前記造血幹細胞とは異なり、非造血由来の稀な幹細胞は、造血作用（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）のための支持的基質構造を供給及び構成する。これは、中間葉継代の体細胞に分化され得る。造血作用に役立つ非－造血幹細胞は、骨髄基質細胞または間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）と定義される。間葉系幹細胞は、様々な成人組織から分離され、中間葉細胞タイプだけではなく、神経細胞のような非間葉系幹細胞タイプにも分化されると知られている。間葉系幹細胞は、本来多能性を有しているが、分化可能性の観点からは、ｉｎ ｖｉｖｏ上の転換分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のための不確実な能力は臨床的適用に対して制限されて使用する可能性がある。
【0003】
今まで多くの化合物免疫抑制剤または抗炎症剤が開発されており、臨床的に最もよく使用される免疫抑制剤としては、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ、Ｃｉｐｏｌ Ａ）、アザチオプリン（ｉｍｕｒａｎ）、プレドニゾロン（一種のステロイド）がある。前記免疫抑制剤は、抗原刺激から抗体生成に至る過程中、大食細胞による抗原の貪食、リンパ球等による抗原認識、細胞分裂、Ｔ細胞とＢ細胞の分裂、抗体生成等のいくつかの過程を阻害させることで免疫抑制を引き起こす。ほとんど抗腫瘍活性を有しているが、その理由は、ＤＮＡ障害、ＤＮＡ合成阻止等を媒介として細胞分裂を阻止するためである。しかし、それによる代表的な副作用として高血圧と腎毒性（腎機能が低下する）があり、この副作用の発生率が高いため、使用するとき、十分に経過を観察しなければならない等の問題があってきた。その他の副作用として、稀に震え、発作、肝炎、胆液貯留、血中尿酸増加、筋肉気力低下、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、歯肉肥大（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）等がある。よく使用される抑制剤のうちアザチオプリンは、白血球数値の減少、貧血、血小板減少等、骨髄機能を抑制することもあり、膵臓炎、肝炎、胆汁貯留と共に稀に脱毛、発熱等を示す合併症があり得る。ステロイド製剤の一つであるプレドニゾロンは、免疫抑制剤のうち最も早く使用され始めたが、動脈硬化症を促進させるだけではなく、高血圧、胃潰瘍、糖尿、成長阻害、骨粗鬆症、白内障、緑内障等を起こすので注意すべき薬物であるため、安全な免疫抑制剤または抗炎症剤の必要性が浮上している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
骨中の軟らかい物質である骨髄は、新たな血液細胞で産生される活性組織であり、少なくとも二つのタイプの幹細胞を含む。造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣｓ）は、自己－更新幹細胞であって、全ての血液継代で産生される。前記造血幹細胞とは異なり、非造血由来の稀な幹細胞は、造血作用（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）のための支持的基質構造を供給及び構成する。これは、中間葉継代の体細胞に分化され得る。造血作用に役立つ非－造血幹細胞は、骨髄基質細胞または間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）と定義される。間葉系幹細胞は、様々な成人組織から分離され、中間葉細胞タイプだけではなく、神経細胞のような非間葉系幹細胞タイプにも分化されると知られている。間葉系幹細胞は、本来多能性を有しているが、分化可能性の観点からは、ｉｎ ｖｉｖｏ上の転換分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のための不確実な能力は臨床的適用に対して制限されて使用する可能性がある。
【0005】
今まで多くの化合物免疫抑制剤または抗炎症剤が開発されており、臨床的に最もよく使用される免疫抑制剤としては、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ、Ｃｉｐｏｌ Ａ）、アザチオプリン（ｉｍｕｒａｎ）、プレドニゾロン（一種のステロイド）がある。前記免疫抑制剤は、抗原刺激から抗体生成に至る過程中、大食細胞による抗原の貪食、リンパ球等による抗原認識、細胞分裂、Ｔ細胞とＢ細胞の分裂、抗体生成等のいくつかの過程を阻害させることで免疫抑制を引き起こす。ほとんど抗腫瘍活性を有しているが、その理由は、ＤＮＡ障害、ＤＮＡ合成阻止等を媒介として細胞分裂を阻止するためである。しかし、それによる代表的な副作用として高血圧と腎毒性（腎機能が低下する）があり、この副作用の発生率が高いため、使用するとき、十分に経過を観察しなければならない等の問題があってきた。その他の副作用として、稀に震え、発作、肝炎、胆液貯留、血中尿酸増加、筋肉気力低下、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、歯肉肥大（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）等がある。よく使用される抑制剤のうちアザチオプリンは、白血球数値の減少、貧血、血小板減少等、骨髄機能を抑制することもあり、膵臓炎、肝炎、胆汁貯留と共に稀に脱毛、発熱等を示す合併症があり得る。ステロイド製剤の一つであるプレドニゾロンは、免疫抑制剤のうち最も早く使用され始めたが、動脈硬化症を促進させるだけではなく、高血圧、胃潰瘍、糖尿、成長阻害、骨粗鬆症、白内障、緑内障等を起こすので注意すべき薬物であるため、安全な免疫抑制剤または抗炎症剤の必要性が浮上している。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記のような課題を解決するために、本発明は、炎症刺激された間葉系幹細胞を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0007】
また、本発明は、間葉系幹細胞に炎症刺激を加えて培養するステップ；を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用間葉系幹細胞の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0008】
本発明の炎症刺激された間葉系幹細胞は、アセチルコリンを分泌する効果があり、副作用が知られた既存の免疫抑制剤及び炎症抑制剤の代わりとなり得、経済的に使用され得る細胞治療剤として免疫疾患及び炎症疾患の予防または治療に有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ａは、本発明のＭＳＣｓが線維芽細胞－類似形態を有することを確認した結果を示した図である。ｂは、本発明のＭＳＣｓの脂肪細胞化（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）、軟骨分化（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）及び骨分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）への分化潜在力を確認した結果を示した図である。ｃは、本発明のＭＳＣｓの陽性または陰性マーカーのフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図2】ａは、ＰＢＭＣｓ（ＰまたはＰｏ）及び混合リンパ球反応（ＭＬＲ）上でＭＳＣｓの有無による同種抗原性（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ）免疫反応をリンパ球増殖及び活性を通して確認した結果を示した図である。ｂは、ＰＢＭＣｓ（Ｐ）、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）処理されたヒトＰＢＭＣｓ（ＰＰＨＡ）にＭＳＣｓ共同培養の有無によるリンパ球増殖及び活性の結果を示した図である。ｃは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓでＭＳＣｓを共同培養したとき、非正常な形態学的変化を光学顕微鏡で確認した結果を示した図である。ｄは、ＭＬＲ－活性化で、ｅは、ＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓでＭＳＣｓを共同培養後、神経細胞－類似形態的特徴を確認した結果を示した図である。ｆは、ＭＬＲ－活性化で、ｇは、ＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓでＭＳＣｓを共同培養後、神経球－類似細胞クラスター（赤い矢印）を確認した結果を示した図である。
【図3】ａは、炎症性条件に対するＭＳＣｓでスフェロイド個体生成を確認した結果を示した図である。ｂは、炎症性条件を最小化したとき、ＭＳＣｓのスフェロイドの生成有無及びＭＳＣｓ特性変化を確認した結果を示した図である。
【図4】ａは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＮＦ－Ｍ及びＧＦＡＰの発現を確認した図である。ｂは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１及びＧＦＡＰのフローサイトメトリーの結果を示した図である。ｃ及びｄは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、免疫蛍光染色してｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ１、ＧＦＡＰ及びＯ４の発現程度を確認した図である。
【図5】ａは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲ発現を確認した図である。ｂ及びｃは、それぞれＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ｑＲＴ－ＰＣＲを通してＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲ発現を確認した図である。ｄは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ウェスタンブロットを遂行し、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲ発現を確認した図である。ｅ及びｆは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、免疫蛍光染色を遂行してＴｒｋＡ発現程度を確認した結果を確認した図である。
【図6】ａは、ＭＬＲ－活性化されたＰＢＭＣｓをＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現程度を確認した結果を示した図である。ｂは、ＭＬＲ－活性化されたＰＢＭＣｓにｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現程度を確認した結果を示した図である。ｃは、ＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓをＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現程度を確認した結果を示した図である。ｄは、ＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現程度を確認した結果を示した図である。ｅ乃至ｈは、ＥＬＩＳＡを遂行してＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓから分泌されたＮＧＦ及びＢＤＮＦの分泌量を確認した結果を示した図である。
【図7】ａは、炎症性条件によるＭＳＣｓのスフェロイド形成を確認した結果を示した図である。ｂは、ＭＳＣｓのスフェロイドのＴｕｊ１、ＮＦ－Ｍ及びＭＡＰ２の発現程度を確認した結果を示した図である。
【図8】ａは、炎症性条件により活性化されたＰＢＭＣｓのスフェロイド形成を確認した結果を示した図である。ｂは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で、ＭＳＣｓスフェロイドまたはＭＳＣｓ単一分子膜の比率（１：２、１：５及び１：２０）によるリンパ球増殖抑制程度を確認した結果を示した図である。ｃは、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）条件で、ＭＳＣｓスフェロイドまたはＭＳＣｓ単一分子膜の比率（１：２、１：５及び１：２０）によるリンパ球増殖抑制程度を確認した結果を示した図である。ｄは、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）でＭＳＣｓスフェロイドのＴｕｊ１及びｎｅｓｔｉｎの発現のフローサイトメトリーの確認結果を示した図である。
【図9】ａは、何の処理もしていないＭＳＣｓをｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地に培養した後、Ｔｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＮＦ－Ｍの発現を確認した結果を示した図である。ｂは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件のＭＳＣｓをｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地に培養した後、Ｔｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＮＦ－Ｍの発現を確認した結果を示した図である。
【図10】ａは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、免疫蛍光染色してＣｈＡＴ、ＴＨ及びＧＡＢＡの発現程度を確認した結果を示した図である。ｂは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してＣｈＡＴ発現程度を確認した図である。ｃは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ウェスタンブロットを遂行してＣｈＡＴ発現程度を確認した図である。ｄは、ＭＬＲ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、免疫蛍光染色を通してＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、ＭＢＰ、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＴｒｋＡ及びＧＡＢＡの発現程度を示した図である。ｅは、ＭＬＲ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養した後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較してアセチルコリン分泌を確認した結果を示した図である。ｆは、ＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養した後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ）群と比較してアセチルコリン分泌を確認した結果を示した図である。
【図11】ａは、一般培養またはトランスウェルプレート培養と比較して、炎症性条件でＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型への変化を確認した結果を示した図である。ｂは、調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭ）条件でＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型への変化を確認した結果を示した図である。ｃは、ｂ条件でＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、ＮＦ－Ｍ及びＴｕｊ１の発現を確認した結果を示した図である。
【図12】ａは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較してＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎＡＣｈＲα３、ｎＡＣｈＲα５、ｎＡＣｈＲα７、ｎＡＣｈＲα８、ｎＡＣｈＲβ２の発現程度を確認した結果である。ｂは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較してｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎＡＣｈＲα５の発現程度を確認した結果を示した図である。ｃは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較してｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎＡＣｈＲα７の発現程度を確認した結果を示した図である。ｄは、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して、ウェスタンブロットを通してｎＡＣｈＲα７の発現程度を確認した結果を示した図である。
【図13】炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＰＢＭＣｓのフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図14】ａ乃至ｃは、α－ＢＴＸを添加した培地にＭＬＲ－活性化ＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して各リンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの結果を確認した結果を示した図である。ｄ乃至ｆは、α－ＢＴＸを添加した培地にＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して各リンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの結果を確認した結果を示した図である。ｇ乃至ｉは、ＡＣｈ－Ｃｌを添加した培地にＭＬＲ－活性化ＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して各リンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの結果を確認した結果を示した図である。ｊ乃至ｌは、ＡＣｈ－Ｃｌを添加した培地にＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して各リンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの結果を確認した結果を示した図である。
【図15】ａ乃至ｄは、非特異的コリン性アゴニストであるカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）を培地に添加した後、ＭＬＲ－活性化またはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓにＭＳＣｓを共同培養後、ＰＢＭＣｓ単独（Ｐ及びＰｏ）群と比較して各リンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの結果を確認した結果を示した図である。
【図16】ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８－活性化されたマウス脾臓細胞（２×１０５）とＭＳＣｓ（４×１０３～４×１０４）を１：５、１：１０、１：２０、及び１：５０の比率で培養後、リンパ球増殖抑制結果を確認した図である。ｂは、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓのコリン性神経細胞類似表現型変化有無を確認した結果を示した図である。ｃは、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓのＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＴＨの発現を確認した結果を示した図である。
【図17】ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８－活性化されたラットの脾臓細胞（２×１０５）とＭＳＣｓ（４×１０３～４×１０４）を１：５、１：１０及び１：２０の比率で培養後、リンパ球増殖抑制結果を確認した図である。ｂは、ラットの脾臓細胞で処理されたＭＳＣｓのコリン性神経細胞類似表現型変化有無を確認した結果を示した図である。ｃは、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓのＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＴＨ及びＧＡＢＡの発現を確認した結果を示した図である。ｄは、ラットの脾臓細胞で処理されたＭＳＣｓ（ｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅ）で神経成長因子受容体であるＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲのｍＲＮＡ発現の変化を比較した結果を示した図である。
【図18】ａは、一時的な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ヒト化ＧＶＨＤマウスモデルにＰＢＭＣｓ及びＭＳＣｓ接種してＣｈＡＴ＋ ｎｅｓｔｉｎ＋ヒト細胞を確認過程を模式化した図である。ｂは、ＣｈＡＴ＋ ｎｅｓｔｉｎ＋ヒト細胞を確認するために、ＰＢＭＣｓ（Ｐ１またはＰ２）または混合されたＰＢＭＣｓ（Ｐ１＋Ｐ２）注入マウスにヒトＭＳＣｓを処理した各マウスで抗－ＣｈＡＴ及び抗－ｎｅｓｔｉｎ抗体の発現程度を確認した結果である。ｃは、ＭＳＣ細胞質の有無を確認するために、ＰＢＭＣｓ（Ｐ１またはＰ２）または混合されたＰＢＭＣｓ（Ｐ１＋Ｐ２）注入マウスにヒトＭＳＣｓを処理した各マウスに生体に適したシリカ－コーティングされた蛍光ナノ粒子を注入した結果を示した結果である（矢印は、ＭＳＣ細胞質を示す）。
【図19】本発明の炎症性刺激に対するＭＳＣｓのコリン性抗－炎症メカニズムを模式化した図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、炎症刺激された間葉系幹細胞を含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0011】
前記間葉系幹細胞は、層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離され得、前記方法で分離された本発明の間葉系幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４を発現できる。
【0012】
本発明において、「層分離培養法」は、個体から骨髄を採取し、それを培養した後、前記培養上層液だけを新たな容器に移動させて培養し、前記培養で生成される培養上層液だけを分離してコーティング剤が処理された培養容器またはコーティング剤が処理されていない培養容器で繰り返し培養するステップを経て間葉系幹細胞を収得する方法を意味し、ＫＲ１０－０８０２０１１に記載の内容が本発明に全体として参照され得、好ましくは、前記文献に開示されているように層分離培養法を遂行することができる。
【0013】
前記炎症刺激された間葉系幹細胞は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）条件、類似分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）処理条件及びサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理条件からなる群から選択された１種以上の培養条件で培養する方法を通して炎症刺激された間葉系幹細胞であってよく、前記類似分裂促進物質は、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、ＰＷＭ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）、リポ多糖、ストレプトリジンＳ、水銀化合物及び抗リンパ球抗体からなる群から選択された１種以上であり、これに制限されない。
【0014】
本発明において、「混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）」は、細胞性免疫機能を試験管で測定する方法の一つであって、臓器移植時、ドナーとレシピエントとの間の組織適合性（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を調査するために利用される試験法である。ドナーとレシピエントのリンパ球を混ぜて細胞培養をしたとき、万一両者の組織的合成抗原が互いに異なれば、リンパ球は分裂を始める。分裂したか否かは、予め培地に加えておいた３ＨチミジンがＤＮＡに収容されたか否かによって分かる。本発明において、混合リンパ球反応は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することを意味し、ここに間葉系幹細胞を処理して、本発明の炎症刺激された間葉系幹細胞を収得する。
【0015】
本発明において、「類似分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）」は、細胞分裂を誘発する物質を意味し、免疫学的には、抗原非特異的（多重クローン性）にリンパ球を幼若化して分裂を誘発させることを意味する。
【0016】
本発明において、「植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）」は、植物由来の細胞凝集活性（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ）を備えたレクチン［ｌｅｃｔｉｎ（糖結合タンパク質）］を意味し、Ｔ細胞にのみ作用する特徴がある。本発明において、植物性凝集素処理は、ドナーで収得したＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理した後、ここに間葉系幹細胞を処理することを意味し、このような処理を通して本発明の炎症刺激された間葉系幹細胞を収得する。
【0017】
本発明において、「コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）」は、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）の種子から得られた結晶性タンパク質の一つである。Ｃｏｎ Ａは、Ｔ細胞を活性化させるが、Ｂ細胞は活性化させず、不溶化するとＢ細胞も活性化される。また、様々ながん細胞で正常細胞に比べてＣｏｎ Ａに対する高い凝集性を示すため、がん細胞膜構造の特異性を研究する手段として利用されている。
【0018】
本発明において、「炎症刺激された間葉系幹細胞」は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）、類似分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）処理及びサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理条件で炎症刺激されるか、好ましくは、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）または植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）条件で炎症刺激されて間葉系幹細胞が神経細胞と類似した特徴を有することを意味し、本発明の一実施例において、本発明の炎症刺激された間葉系幹細胞は、神経細胞と類似した形態に変化し、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ及びＭＡＰ２を発現し、星状膠細胞（アストロサイト）マーカーであるＧＦＡＰ及び希突起神経膠マーカーであるＯ４のような神経膠マーカーは発現しないことを確認した。
【0019】
前記炎症刺激された間葉系幹細胞は、コリン性ニューロン－類似表現型（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に変化し、アセチルコリンを分泌できる。
【0020】
本発明において、「コリン性ニューロン（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）」は、神経繊維末端から化学伝達物質としてアセチルコリンを分泌するニューロンを意味する。
【0021】
本発明において、「アセチルコリン」は、コリンと酢酸のエステルである神経伝達物質であり、神経の末端で分泌され、神経の刺激を筋肉に伝達する化学物質である。
【0022】
前記組成物には、アセチルコリンのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）をさらに含むことができ、例えば、ＡＣｈ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＣｈ－Ｃｌ）、カルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）、エピバチジン（ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎｅ）、ＤＭＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｉｕｍ）、スキサメトニウム（ｓｕｘａｍｅｔｈｏｎｉｕｍ）、シチシン（ｃｙｔｉｓｉｎｅ）、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）、ニフェン（ｎｉｆｅｎｅ）、バレニクリン（ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ）、ＭＤＭＡ（３，４－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）及びメタンフェタミン（ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）からなる群から選択された１種以上を選択してさらに含むことができ、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療のためのものであれば、これに制限されない。
【0023】
前記免疫疾患または炎症疾患は、自己免疫疾患、移植拒否、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症及び炎症からなる群から選択された１種以上であってよく、前記自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、慢性疲労症候群、線維筋痛症、甲状腺機能低下症、亢進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性強皮症、喘息及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択された１種以上であってよいが、これに制限されない。
【0024】
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。また、薬学組成物の製造には、固体または液体の製剤用添加物を使用することができる。製剤用添加物は、有機または無機のいずれであってもよい。
【0025】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）、デンプン、タルク、ソルビトール、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。着色剤としては、通常医薬品に添加することが許可されているものであれば、いずれも使用することができる。これらの錠剤、粒剤には、糖衣、ゼラチンコーティング、その他、必要に応じて適宜コーティングすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤等を添加することができる。
【0026】
本発明の薬学的組成物は、当業界において通常製造されるいかなる剤形にも製造され得、製剤の形態は、特に限定されるものではないが、好ましくは、外用剤であってよい。本発明の外用剤には、シート剤、液状塗布剤、噴霧剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、粉剤、浸透パッド剤、噴霧剤、ゲル剤、パスタ剤、リニメント剤、軟膏剤、エアゾール、粉末剤、懸濁液剤、経皮吸収剤等の通常の外用剤の形態が含まれ得る。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知になった処方書である文献に記述されている。
【0027】
本発明の薬学的有効量は、患者の傷の種類、適用部位、処理回収、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類等によって変わり得る。使用量は、特に限定されないが、通常、本発明の薬学組成物の１日有効量を患者に適用時、０．００００１～１００００μｇであってよい。前記１日量は、１日に１回、または適当な間隔をおいて１日に２～３回に分けて投与してもよく、数日間隔で間欠投与してもよい。
【0028】
しかし、本発明の薬学的組成物の前記使用量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度、傷の種類、適用部位、処理回収、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類等の様々な関連因子に照らして決定されるものであるので、前記有効量は、いかなる側面にも本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
【0029】
また、本発明は、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療に使用するための炎症刺激された間葉系幹細胞の用途を提供する。
【0030】
また、本発明は、免疫疾患または炎症疾患の予防または治療剤の製造に使用するための炎症刺激された間葉系幹細胞の用途を提供する。
【0031】
また、本発明は、前記炎症刺激された間葉系幹細胞を個体に投与するステップを含む、個体の免疫反応または炎症反応を抑制する方法を提供する。
【0032】
また、本発明は、前記炎症刺激された間葉系幹細胞を個体に投与するステップを含む、個体の炎症性疾患の予防または治療方法を提供する。
【0033】
本発明において、「個体」とは、牛、犬、豚、鶏、羊、馬、ヒトを含む哺乳動物を意味するが、これに制限されるものではない。
【0034】
前記方法において、前記間葉系幹細胞は、層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離されたことを特徴とし得、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４を発現することを特徴とし得る。
【0035】
本発明の方法に使用される炎症刺激された間葉系幹細胞は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）条件、類似分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）処理条件及びサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理条件からなる群から選択された１種以上の培養条件で培養されたことを特徴とし得、前記類似分裂促進物質は、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、ＰＷＭ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）、リポ多糖、ストレプトリジンＳ、水銀化合物及び抗－リンパ球抗体からなる群から選択された１種以上であってよく、炎症刺激された間葉系幹細胞は、コリン性ニューロン－類似表現型（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に変わったことを特徴とし得る。
【0036】
前記炎症刺激された間葉系幹細胞は、アセチルコリンを分泌することを特徴とし得、免疫疾患または炎症疾患は、自己免疫疾患、移植拒否、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症及び炎症からなる群から選択された１種以上であってよい。
【0037】
また、本発明は、間葉系幹細胞に炎症刺激を加えて培養するステップを含む免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用間葉系幹細胞の製造方法を提供する。
【0038】
前記炎症刺激は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）条件、類似分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）処理及びサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理からなる群から選択された１種以上であり、前記類似分裂促進物質は、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、ＰＷＭ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）、リポ多糖、ストレプトリジンＳ、水銀化合物及び抗リンパ球抗体からなる群から選択された１種以上であり、好ましくは、混合リンパ球反応条件または植物性凝集素処理であるが、これに制限されない。
【0039】
前記製造方法により製造された間葉系幹細胞は、アセチルコリンを分泌し、免疫抑制剤または抗炎症剤として使用され得る。
【0040】
本発明において、「免疫抑制剤」とは、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）条件、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）処理またはサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理条件で培養した間葉系幹細胞またはその培養物を含む製剤であり、免疫反応を抑制して免疫疾患を治療できる製剤を意味する。
【0041】
本発明において、「抗炎症剤」とは、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）条件、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）処理またはサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理条件で培養した間葉系幹細胞またはその培養物を含む製剤であり、炎症反応を抑制して炎症疾患を治療できる製剤を意味する。
【0042】
本発明において、用語「培養」は、本発明の間葉系幹細胞を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。
【0043】
前記本発明の間葉系幹細胞は、通常の培地で生育可能であり、本発明の間葉系幹細胞を培養するために、培養対象、即ち、培養体となる細胞が必要とする栄養物質を含むものであり、特殊な目的のための物質がさらに添加されて混合されたものであってよい。前記培地は、培養器または培養液ともいい、天然培地、合成培地または選択培地を全て含む概念である。
【0044】
培養に使用される培地は、適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン等を含有した通常の培地内で温度、ｐＨ等を調節しながら適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。使用され得る炭素源としては、グルコース及びキシロースの混合糖を主炭素源として使用し、それ以外に、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ヤシ油等のような油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用され得る。使用され得る窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンのようなアミノ酸及びペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物等の有機窒素源が使用され得る。これらの窒素源は、単独または組み合わされて使用され得る。前記培地には、リン源としてリン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム及び対応するナトリウム－含有塩が含まれ得る。使用され得るリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれる。また、無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及び炭酸カルシウム等が使用され得る。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用され得る。
【0045】
また、培養培地に適切な前駆体が使用され得る。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式、流加式または連続式で添加され得るが、特にこれに制限されることはない。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節できる。
【0046】
以下、実施例は、専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって自明であるだろう。
【0047】
実験例１．材料及び方法
１－１．間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）の分離、特徴及び培養
ＭＳＣｓは、ＫＲ１０－０８０２０１１に開示された層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離された間葉系幹細胞である。前記ＭＳＣｓの分離及び特徴は、細胞形状、マーカー発現及び中間葉分化で確認し、その結果を図１に示した。フローサイトメトリーのための抗体は、ａｎｔｉ－ＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＣＤ２９（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、ａｎｔｉ－ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４４（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４９ｆ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ７３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１４６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びａｎｔｉ－Ｏｃｔ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を利用した。アイソタイプ－マッチされた対照抗体は、対照群として使用した。脂肪細胞、骨形成及び軟骨分化を含む中間葉幹分化可能性は、従来の文献（Ｊｕｎｇ，Ｋ．Ｈ．等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４０、９９８－１００８（２０１１））を参考にして評価した。ＭＳＣｓは、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）及び１％のマイコゴン（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補充された低グルコース（ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に３７度に加湿されたＣＯ２培養器で培養した。細胞が７０－８０％程度に達すると、トリプシン／ＥＤＴＡを含めて分離した後、追加培養のために、サブ－培養した。
１－１．間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）の分離、特徴及び培養
ＭＳＣｓは、ＫＲ１０－０８０２０１１に開示された層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離された間葉系幹細胞である。前記ＭＳＣｓの分離及び特徴は、細胞形状、マーカー発現及び中間葉分化で確認し、その結果を図１に示した。フローサイトメトリーのための抗体は、ａｎｔｉ－ＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＣＤ２９（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、ａｎｔｉ－ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４４（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４９ｆ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ７３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１４６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びａｎｔｉ－Ｏｃｔ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を利用した。アイソタイプ－マッチされた対照抗体は、対照群として使用した。脂肪細胞、骨形成及び軟骨分化を含む中間葉幹分化可能性は、従来の文献（Ｊｕｎｇ，Ｋ．Ｈ．等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４０、９９８－１００８（２０１１））を参考にして評価した。ＭＳＣｓは、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）及び１％のマイコゴン（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補充された低グルコース（ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に３７度に加湿されたＣＯ２培養器で培養した。細胞が７０－８０％程度に達すると、トリプシン／ＥＤＴＡを含めて分離した後、追加培養のために、サブ－培養した。
【0048】
１－２．免疫抑制分析及び炎症条件
ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、二人の患者から分離し、各患者の１×１０５ＰＢＭＣｓを混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）のために９６－ウェルプレートに共同－培養した。リンパ球増殖でＭＳＣｓの効果を評価するために、４×１０４ＭＳＣｓを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）上で５日間共同－培養した。マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）活性のために、２×１０５ＰＢＭＣｓを１μｇ／ｍＬ植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で刺激した。また、４×１０４ＭＳＣｓをＰＢＭＣｓと共に３日間培養した。リンパ球増殖は［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｗｅｌｌ）の取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により放出された放射線はβ－カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を利用して分析した。ＭＬＲまたはＰＨＡ処理によるリンパ球活性で炎症反応を確認した。
ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、二人の患者から分離し、各患者の１×１０５ＰＢＭＣｓを混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）のために９６－ウェルプレートに共同－培養した。リンパ球増殖でＭＳＣｓの効果を評価するために、４×１０４ＭＳＣｓを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）上で５日間共同－培養した。マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）活性のために、２×１０５ＰＢＭＣｓを１μｇ／ｍＬ植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で刺激した。また、４×１０４ＭＳＣｓをＰＢＭＣｓと共に３日間培養した。リンパ球増殖は［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｗｅｌｌ）の取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により放出された放射線はβ－カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を利用して分析した。ＭＬＲまたはＰＨＡ処理によるリンパ球活性で炎症反応を確認した。
【0049】
１－３．ＥＬＩＳＡ
ｎＡＣｈＲアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）またはアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）を含めて共同－培養した培地を得た。ＴＮＦ－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｃａｔ．＃ ５５５２１２）及びＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｃａｔ．＃ ５５５１４１）に対するＥＬＩＳＡキットを利用して分泌された前炎症性サイトカインを定量した。ＭＬＲまたはＰＨＡが活性されたＰＢＭＣｓを培養した培地を利用してＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ＤＹ２５６－０５）及びＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃ ＤＢＤ００）に対する分析を遂行した。
ｎＡＣｈＲアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）またはアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）を含めて共同－培養した培地を得た。ＴＮＦ－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｃａｔ．＃ ５５５２１２）及びＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｃａｔ．＃ ５５５１４１）に対するＥＬＩＳＡキットを利用して分泌された前炎症性サイトカインを定量した。ＭＬＲまたはＰＨＡが活性されたＰＢＭＣｓを培養した培地を利用してＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ＤＹ２５６－０５）及びＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃ ＤＢＤ００）に対する分析を遂行した。
【0050】
１－４．ＲＮＡ分離、ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ及びｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の遂行
総ＲＮＡは、ｅａｓｙＢｌｕｅ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）を利用して分離した。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を利用して１ｇの総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成した。Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲは、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して遂行した。アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）は、ＳｙｂｅｒＳａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む１％のアガロースゲルで電気泳動を遂行し、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉ ＰｈｏｔｏＦｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して分析した。ＰＣＲプライマー配列は、下記表１に示した。前記プライマーは、ＴｒｋＡ（Ｈｓ０１０２１０１１）、ＴｒｋＢ（Ｈｓ００１７８８１１）、ＴｒｋＣ（Ｈｓ００１７６７９７）、ｐ７５ＮＴＲ（Ｈｓ００６０９９７７）、ｎＡＣｈＲα７（Ｈｓ０４１８９９０９）、ｎＡＣｈＲα５（Ｈｓ００１８１２４８）、ＣｈＡＴ（Ｈｓ００２５２８４８）及び１８ｓ ｒＲＮＡ（Ｈｓ０３９２８９８５）を増幅するために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で購入してｑＲＴ－ＰＣＲを遂行した。前記ｑＲＴ－ＰＣＲは、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遂行した。
総ＲＮＡは、ｅａｓｙＢｌｕｅ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）を利用して分離した。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を利用して１ｇの総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成した。Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲは、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して遂行した。アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）は、ＳｙｂｅｒＳａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む１％のアガロースゲルで電気泳動を遂行し、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉ ＰｈｏｔｏＦｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して分析した。ＰＣＲプライマー配列は、下記表１に示した。前記プライマーは、ＴｒｋＡ（Ｈｓ０１０２１０１１）、ＴｒｋＢ（Ｈｓ００１７８８１１）、ＴｒｋＣ（Ｈｓ００１７６７９７）、ｐ７５ＮＴＲ（Ｈｓ００６０９９７７）、ｎＡＣｈＲα７（Ｈｓ０４１８９９０９）、ｎＡＣｈＲα５（Ｈｓ００１８１２４８）、ＣｈＡＴ（Ｈｓ００２５２８４８）及び１８ｓ ｒＲＮＡ（Ｈｓ０３９２８９８５）を増幅するために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で購入してｑＲＴ－ＰＣＲを遂行した。前記ｑＲＴ－ＰＣＲは、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遂行した。
【表1】
【0051】
１－５．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、Ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５１４４９）、ａｎｔｉ－Ｔｕｊ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６０３８１）及びａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６１３０）抗体を利用した。アイソタイプ－マッチされた対照抗体は対照群として利用し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して分析した。
フローサイトメトリーのために、Ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５１４４９）、ａｎｔｉ－Ｔｕｊ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６０３８１）及びａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６１３０）抗体を利用した。アイソタイプ－マッチされた対照抗体は対照群として利用し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して分析した。
【0052】
１－６．ウェスタンブロット分析
各実験群の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭの塩化フッ素（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ）、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、プロテアーゼ阻害カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びホスファターゼ阻害カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を３０分間アイスに置いて処理した。細胞破片は、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して除去した後、上層液を新たなマイクロチューブに移した。細胞溶解物でタンパク質の濃度は、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を利用して測定した。同等なタンパク質は、還元条件下で１０％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離し、イモビロンＰメンブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動を遂行した。免疫検出のために、ａｎｔｉ－ＴｒｋＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ０６－５７４）、ａｎｔｉ－ＴｒｋＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ３３７６）、ａｎｔｉ－ｐ７５ＮＴＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃ ８２３８）、ａｎｔｉ－ＣｈＡＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１４４Ｐ）、ａｎｔｉ－ｎＡＣｈＲ ７（Ａｌｏｍｏｎｅ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ；ｃａｔ．＃ ＡＮＣ－００７）、またはａｎｔｉ－Ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ＳＣ－４７７７８）抗体を一次抗体として利用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）に供与して二次抗体を処理して培養した後、バンドの強化された化学発光は、Ｗｅｓｔ－Ｚｏｌ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用して検出した。
各実験群の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭの塩化フッ素（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ）、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、プロテアーゼ阻害カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びホスファターゼ阻害カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を３０分間アイスに置いて処理した。細胞破片は、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して除去した後、上層液を新たなマイクロチューブに移した。細胞溶解物でタンパク質の濃度は、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を利用して測定した。同等なタンパク質は、還元条件下で１０％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離し、イモビロンＰメンブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動を遂行した。免疫検出のために、ａｎｔｉ－ＴｒｋＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ０６－５７４）、ａｎｔｉ－ＴｒｋＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ３３７６）、ａｎｔｉ－ｐ７５ＮＴＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃ ８２３８）、ａｎｔｉ－ＣｈＡＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１４４Ｐ）、ａｎｔｉ－ｎＡＣｈＲ ７（Ａｌｏｍｏｎｅ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ；ｃａｔ．＃ ＡＮＣ－００７）、またはａｎｔｉ－Ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ＳＣ－４７７７８）抗体を一次抗体として利用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）に供与して二次抗体を処理して培養した後、バンドの強化された化学発光は、Ｗｅｓｔ－Ｚｏｌ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用して検出した。
【0053】
１－８．ＡＣｈ分析
２４時間の間ＭＬＲまたはＰＨＡで刺激されたＭＳＣｓを培養し、各ＭＳＣｓを収得した。ＡＣｈ／コリンは、製造会社のマニュアルに従ってＥｎｚｙｃｈｒｏｍ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ；ＥＡＣＬ－１００）を利用して定量した。
２４時間の間ＭＬＲまたはＰＨＡで刺激されたＭＳＣｓを培養し、各ＭＳＣｓを収得した。ＡＣｈ／コリンは、製造会社のマニュアルに従ってＥｎｚｙｃｈｒｏｍ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ；ＥＡＣＬ－１００）を利用して定量した。
【0054】
１－９．スフェロイド形成確認
細胞接種の前に、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ、蒸留水に溶解する）をペトリ皿（ｄｉａｍｅｔｅｒ、１００ｍｍ）に室温条件で３０分間コーティングした後、ＰＢＳで十分に洗浄した。総１×１０６ＭＳＣｓを１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のＮ２補充剤（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む皿に接種した後、２４－７２時間の間培養した。
細胞接種の前に、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ、蒸留水に溶解する）をペトリ皿（ｄｉａｍｅｔｅｒ、１００ｍｍ）に室温条件で３０分間コーティングした後、ＰＢＳで十分に洗浄した。総１×１０６ＭＳＣｓを１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％のＮ２補充剤（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む皿に接種した後、２４－７２時間の間培養した。
【0055】
１－１０．免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡の使用
各実験群の細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳで溶解された０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ）を利用して透過化した。前記細胞をａｎｔｉ－ＴｒｋＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ０６－５７４）、ａｎｔｉ－ＣｈＡＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１４４Ｐ）、ａｎｔｉ－Ｔｕｊ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＭＡＢ１６３７）、ａｎｔｉ－ＴＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃ ２７９２）、ａｎｔｉ－ＮＣＡＭ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＣＢＬ２７５）、ａｎｔｉ－ＭＢＰ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ９８０）、ａｎｔｉ－Ｏ４（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃ Ｏ７１３９）、ａｎｔｉ－ＮＦ－Ｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１９８７）、ａｎｔｉ－Ｎｅｓｔｉｎ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＭＡＢ５３２６）、またはａｎｔｉ－ＧＡＢＡ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ Ａｂ８６１８６）である一次抗体（１：２００－１：１０００希釈）で４度の条件で一晩標識した。一次抗体と培養した後、前記細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－供与された二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）（１：３００希釈）で１時間の間培養した。前記細胞を４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１分間染色し、それを共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を利用して観察した。
各実験群の細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳで溶解された０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ）を利用して透過化した。前記細胞をａｎｔｉ－ＴｒｋＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ ０６－５７４）、ａｎｔｉ－ＣｈＡＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１４４Ｐ）、ａｎｔｉ－Ｔｕｊ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＭＡＢ１６３７）、ａｎｔｉ－ＴＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃ ２７９２）、ａｎｔｉ－ＮＣＡＭ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＣＢＬ２７５）、ａｎｔｉ－ＭＢＰ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ９８０）、ａｎｔｉ－Ｏ４（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃ Ｏ７１３９）、ａｎｔｉ－ＮＦ－Ｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＡＢ１９８７）、ａｎｔｉ－Ｎｅｓｔｉｎ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ＭＡＢ５３２６）、またはａｎｔｉ－ＧＡＢＡ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ；ｃａｔ．＃ Ａｂ８６１８６）である一次抗体（１：２００－１：１０００希釈）で４度の条件で一晩標識した。一次抗体と培養した後、前記細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－供与された二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）（１：３００希釈）で１時間の間培養した。前記細胞を４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１分間染色し、それを共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を利用して観察した。
【0056】
１－１１．コリン性アンタゴニスト（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）またはアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）処理
α－ブンガロトキシン（α－Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ２０３９８０）は、ｎＡＣｈＲα７のアンタゴニストであり、１Ｍの濃度で培地に添加した。コリン性アゴニストとして、ＡＣｈクロリド（ＡＣｈ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃ Ａ６６２５）及びカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ２１２３８５）を各１ｎＭ及び１０ｐＭの濃度で添加して実験を遂行した。
α－ブンガロトキシン（α－Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ２０３９８０）は、ｎＡＣｈＲα７のアンタゴニストであり、１Ｍの濃度で培地に添加した。コリン性アゴニストとして、ＡＣｈクロリド（ＡＣｈ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃ Ａ６６２５）及びカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃ ２１２３８５）を各１ｎＭ及び１０ｐＭの濃度で添加して実験を遂行した。
【0057】
実施例１．本発明のＭＳＣｓの特性確認
本発明のＭＳＣｓは、層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離した。本発明のＭＳＣｓは、従来の濃度勾配遠心分離法（Ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で分離されたＭＳＣｓと比較したとき、幹細胞でない他の種類の細胞が混ざっておらず、幹細胞だけが分離されて幹細胞の純度が高い長所がある。前記ＭＳＣｓを利用して下記一連の実験に使用するＭＳＣｓの特性を確認した。
本発明のＭＳＣｓは、層分離培養法（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）で分離した。本発明のＭＳＣｓは、従来の濃度勾配遠心分離法（Ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で分離されたＭＳＣｓと比較したとき、幹細胞でない他の種類の細胞が混ざっておらず、幹細胞だけが分離されて幹細胞の純度が高い長所がある。前記ＭＳＣｓを利用して下記一連の実験に使用するＭＳＣｓの特性を確認した。
【0058】
具体的には、本発明のＭＳＣｓを培養した後、その形態的特性を確認した。また、ＭＳＣｓの分化潜在力を確認するために、脂肪細胞－特異的脂質液体（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔｓ）であるＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏを利用して視覚化し、軟骨－特異的プロテオグリカン（ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）であるＳａｆｒａｎｉｎ Ｏを利用して視覚化し、骨－特異的無機化作用（ｂｏｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓを利用して視覚化した。また、フローサイトメトリーを遂行して本発明のＭＳＣｓの特性を確認するために、陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４を利用した。陰性マーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０６及びＨＬＡ－ＤＲを含む造血性／内皮マーカーを利用した。その結果を図１に示した。
【0059】
図１のａに示したように、本発明のＭＳＣｓは、線維芽細胞－類似形態を示すことを確認した。
【0060】
図１のｂに示したように、本発明のＭＳＣｓは、脂肪細胞化（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）、軟骨分化（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）及び骨分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）への分化潜在力が存在することを確認した。
【0061】
図１のｃに示したように、本発明のＭＳＣｓは、陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）及びＯｃｔ４が正常に発現することを確認した。
【0062】
実施例２．炎症性条件によるＭＳＣｓのリンパ球増殖抑制効果、形態学的変化、スフェロイド個体生成有無及び免疫抑制との関係確認
２－１．炎症性条件によるＭＳＣｓのリンパ球増殖抑制効果及び形態学的変化の確認
炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によるヒトＭＳＣｓのリンパ球増殖抑制効果及び形態学的変化を確認した。
２－１．炎症性条件によるＭＳＣｓのリンパ球増殖抑制効果及び形態学的変化の確認
炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によるヒトＭＳＣｓのリンパ球増殖抑制効果及び形態学的変化を確認した。
【0063】
具体的には、前記実験例１－２の方法によって、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）に対して、同種抗原性（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ）免疫反応によるリンパ球増殖抑制効果及び形態学的変化を確認した。その結果を図２に示した。
【0064】
図２のａに示したように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群で同種抗原性（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ）免疫反応により誘導されたリンパ球増殖を効果的に抑制することを確認した。
【0065】
図２のｂに示したように、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）条件で共同培養したＭＳＣｓはリンパ球増殖を抑制することを確認した。
【0066】
図２のｃに示したように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）条件で共同培養したＭＳＣｓの特異的な伸長、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及び分岐（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を含む非正常な形態学的変化が現れることを確認した。
【0067】
図２のｄ及びｅに示したように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）条件で共同培養したＭＳＣｓの樹状突起－類似細胞のような神経細胞と類似した形態的特徴が現れることを確認した。また、樹状突起－類似経路を通して隣接細胞と連結されることを確認した。
【0068】
図２のｆ及びｇに示したように、炎症性条件でＭＳＣｓは神経細胞と類似した形態が現れることを確認した。
【0069】
従って、ＭＳＣｓは、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で非正常に形態が変わることを確認した。
【0070】
２－２．炎症性条件によるＭＳＣｓのスフェロイド個体生成有無及び免疫抑制との関係
炎症性条件に対するＭＳＣｓでスフェロイド個体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）生成有無及び前記個体がアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）作用機序による死滅より免疫抑制と関連があるかを確認した。
炎症性条件に対するＭＳＣｓでスフェロイド個体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）生成有無及び前記個体がアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）作用機序による死滅より免疫抑制と関連があるかを確認した。
【0071】
具体的には、前記実験例１－２の方法によって、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件で、スフェロイド個体生成有無を確認した。また、前記混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件効果に対する中和及び効果を最小化するために、ＭＳＣｓの付着されていないスフェロイド個体の構造を含む上層液を新たな培地に移して２４時間培養した。その結果を図３に示した。
【0072】
図３のａに示したように、ＭＬＲの炎症性条件によってＭＳＣｓでスフェロイド個体が生成されることを確認した。
【0073】
図３のｂに示したように、ＭＬＲの炎症性条件を最小化したとき、ＭＳＣｓでスフェロイド個体でない培地に付着された線維芽細胞－類似ＭＳＣｓ形態が現れることを確認した。
【0074】
従って、炎症性条件を最小化した時は、スフェロイド個体の生成が阻害され、線維芽細胞－類似ＭＳＣｓで発現されることを確認して、炎症性条件はＭＳＣｓでスフェロイド個体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）生成を誘導し、ＭＳＣｓの特性を変化させることを確認した。
【0075】
実施例３．炎症性条件によるＭＳＣｓの神経細胞－類似特性の確認
炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によってヒトＭＳＣｓが神経細胞－類似特性に変わるかを確認した。
炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によってヒトＭＳＣｓが神経細胞－類似特性に変わるかを確認した。
【0076】
具体的には、前記実験例１－２の方法によって、神経成長因子受容体発現を確認した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）に対して、前記実験例１－４の方法によってＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＮＦ－Ｍ及びＧＦＡＰの発現を確認した。また、実験例１－５の方法によってｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１及びＧＦＡＰのフローサイトメトリーを遂行した。また、実験例１－９の方法によって免疫蛍光染色してｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ１、ＧＦＡＰ及びＯ４の発現程度を確認した。その結果を図４に示した。
【0077】
図４のａに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓで神経細胞マーカーであるＴｕｊ１及びＭＡＰ２は発現されることを確認したが、星状膠細胞（アストロサイト）であるＧＦＡＰは発現されないことを確認した。
【0078】
図４のｂに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓでｎｅｓｔｉｎ及びＴｕｊ１は発現するが、ＧＦＡＰは発現されないことを確認した。
【0079】
図４のｃ及びｄに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓでｎｅｓｔｉｎ及びＴｕｊ１のような神経細胞マーカーは発現することを確認した。しかし、星状膠細胞（アストロサイト）マーカーであるＧＦＡＰ及び希突起神経膠マーカーであるＯ４のような神経膠マーカーは発現しないことを確認した。
【0080】
従って、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓは不完全及び未成熟神経細胞特徴が抑制され、神経細胞と類似した特徴が現れることを確認した。
【0081】
実施例４．炎症性条件によるＭＳＣｓの神経成長因子受容体（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び神経成長因子の発現の確認
４－１．炎症性条件によるＭＳＣｓの神経成長因子受容体の発現の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓの神経成長因子受容体の発現を確認するために、前記実験例１－２の方法によって、成長因子受容体の発現を確認した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）；または一般ＭＳＣにＰＨＡ処理群（ＭＳＣ＋ＰＨＡ）に対して、Ｔｒｋファミリー（Ａ、Ｂ及びＣ）及びｐ７５ＮＴＲを含む神経成長因子受容体の発現を確認した。
４－１．炎症性条件によるＭＳＣｓの神経成長因子受容体の発現の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓの神経成長因子受容体の発現を確認するために、前記実験例１－２の方法によって、成長因子受容体の発現を確認した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）；または一般ＭＳＣにＰＨＡ処理群（ＭＳＣ＋ＰＨＡ）に対して、Ｔｒｋファミリー（Ａ、Ｂ及びＣ）及びｐ７５ＮＴＲを含む神経成長因子受容体の発現を確認した。
【0082】
前記実験例１－４の方法によってＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲの発現を確認した。また、実験例１－６の方法によってウェスタンブロットを遂行してＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲの発現を確認した。また、実験例１－９の方法によって免疫蛍光染色してＴｒｋＡの発現程度を確認した。その結果を図５に示した。
【0083】
図５のａ、ｂ及びｃに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓでＴｒｋＡ及びｐ７５ＮＴＲの発現は有意的に発現されたことを確認したが、ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣの発現は低いことを確認した。
【0084】
図５のｅ及びｆに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓでＴｒｋＡタンパク質が発現されることを確認した。
【0085】
４－２．炎症性条件によるＰＢＭＣｓの神経成長因子の発現の確認
神経成長因子と知られたＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現をＰＢＭＣｓで確認した。
神経成長因子と知られたＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現をＰＢＭＣｓで確認した。
【0086】
具体的には、前記３－１のような条件で、前記実験例１－４の方法によってＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現を確認した。また、実験例１－３の方法によって、ＥＬＩＳＡを遂行してＮＧＦ及びＢＤＮＦの発現を確認した。その結果を図６に示した。
【0087】
図６のａ乃至ｈに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＰＢＭＣｓでＮＧＦ及びＢＤＮＦがいずれも発現が顕著に増加することを確認した。
【0088】
従って、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＰＢＭＣｓで神経成長因子－受容体及び神経成長因子をいずれも発現し、前記ＭＳＣｓを刺激してＭＳＣｓが神経細胞類似特徴が現れることを確認した。
【0089】
実施例５．炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経細胞マーカーの発現及びリンパ球増殖抑制効果の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経細胞マーカーの発現及びリンパ球増殖抑制効果を確認した。
炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経細胞マーカーの発現及びリンパ球増殖抑制効果を確認した。
【0090】
５－１．炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経細胞マーカーの発現の確認
具体的には、前記実施例１に示したように、炎症性条件によるＭＳＣｓで楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ）構造は神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）と似ており、本発明の炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の特性を確認するために、炎症性条件によるＭＳＣｓのスフェロイドを前記実験例１－８の方法によって収得してマトリゲル－コーティングされた培地に置いて培養した後、培地に付着されたスフェロイドを確認した。また、前記スフェロイドの神経細胞マーカーの発現を確認するために、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、２％のＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％の非－必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子及び１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）を含む神経性分化培地に培養した。その後、免疫蛍光染色して神経細胞マーカーであるＴｕｊ１、ＮＦ－Ｍ及びＭＡＰ２の発現と神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＮＰＣｓ）のマーカーであるｎｅｓｔｉｎの発現を確認した。その結果を図７に示した。
【0091】
図７のａに示したように、炎症性条件によるＭＳＣｓは、スフェロイドを成功的に生成させることを確認した。また、図７のｂに示したように、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１、ＮＦ－Ｍ及びＭＡＰ２の発現及び神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＮＰＣｓ）のマーカーであるｎｅｓｔｉｎが発現されることを確認し、本発明の炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）特性が現れることを確認した。
【0092】
５－２．炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）のリンパ球増殖抑制効果の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）とＰＢＭＣｓとの間の関係を確認するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養する実験を遂行し、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件でＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して３または５日間培養する実験を遂行し、それによるスフェロイド形成を確認した。
炎症性条件によるＭＳＣｓを構成する神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）とＰＢＭＣｓとの間の関係を確認するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養する実験を遂行し、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件でＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して３または５日間培養する実験を遂行し、それによるスフェロイド形成を確認した。
【0093】
また、ＭＬＲ炎症性条件によるＭＳＣスフェロイドがリンパ球増殖を抑制するかを確認するために、細胞数に依存的な単一分子膜で培養されたＭＳＣｓと比較した。具体的には、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（ＰまたはＰｏ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのないＰＨＡ条件群（ＰＰＨＡ）；ＭＳＣｓスフェロイドとＭＬＲまたはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓとの間の１：２、１：５及び１：２０の比率で培養された群（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）；ＭＳＣｓ単一分子膜とＭＬＲまたはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓとの間の１：２、１：５及び１：２０の比率で培養された群（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）に対するリンパ球増殖抑制程度を確認した。
【0094】
また、前記実験例１－５に示したように、フローサイトメトリーを遂行し、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）でＭＳＣｓスフェロイドのＴｕｊ１及びｎｅｓｔｉｎの発現程度を確認した。その結果を図８に示した。
【0095】
図８のａに示したように、前記炎症性条件により活性化されたＰＢＭＣｓ（ＭＬＲ）で丸い形状のスフェロイドが形成されることを確認し、ＰＢＭＣｓ及びＭＳＣスフェロイドの間の相互関係が形成されることを確認した。
【0096】
図８のｂ及びｃに示したように、ＭＬＲまたはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓとＭＳＣｓスフェロイドの混合培養群（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）で、ＭＳＣｓスフェロイドの比率が高いほどリンパ球増殖抑制が効果的であることを確認した。また、ＭＬＲまたはＰＨＡ－活性化されたＰＢＭＣｓとＭＳＣｓ単一分子膜の混合培養群（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）でリンパ球増殖抑制がさらに活性化されることを確認した。
【0097】
図８のｄに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）でＭＳＣｓスフェロイドのＴｕｊ１及びｎｅｓｔｉｎの発現が増加することを確認した。
【0098】
５－３．神経性ポテンシャル（ｈｉｇｈ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）による炎症性条件によるＭＳＣｓの神経球－類似スフェロイド（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｌｉｋｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）の神経細胞マーカーの発現の確認
神経性ポテンシャルによる炎症性条件によるＭＳＣｓのスフェロイドの神経細胞マーカーの発現を確認するために、対照群として、何の処理もしていないＭＳＣｓを２％のＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％の非－必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子及び１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子８を含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地に培養して、ＭＳＣ１及びＭＳＣ２で示した。その後、神経細胞マーカーまたは神経前駆細胞マーカーであるＴｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＮＦ－Ｍの発現を確認した。
神経性ポテンシャルによる炎症性条件によるＭＳＣｓのスフェロイドの神経細胞マーカーの発現を確認するために、対照群として、何の処理もしていないＭＳＣｓを２％のＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％の非－必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子及び１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子８を含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地に培養して、ＭＳＣ１及びＭＳＣ２で示した。その後、神経細胞マーカーまたは神経前駆細胞マーカーであるＴｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＮＦ－Ｍの発現を確認した。
【0099】
また、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓをＭＳＣと共同培養して遂行し、２％のＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ）、１％の非－必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子及び１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子８を含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ培地に培養して、それぞれＭＳＣ１及びＭＳＣ２で示した。その後、神経細胞マーカーまたは神経前駆細胞マーカーであるＴｕｊ１、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＮＦ－Ｍの発現を確認した。その結果を図９に示した。
【0100】
図９のａ及びｂに示したように、神経球－類似スフェロイドで神経細胞マーカーが発現されるという事実を確認し、前記神経球－類似スフェロイドは、神経類似細胞のように類似した機能を発揮できることを確認した。
【0101】
実施例６．炎症性条件によるＭＳＣｓのアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌の確認
６－１．炎症性条件によるＭＳＣｓのアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓは、神経細胞類似特徴を有するものと確認され、神経伝達物質であるアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌を確認した。
６－１．炎症性条件によるＭＳＣｓのアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌の確認
炎症性条件によるＭＳＣｓは、神経細胞類似特徴を有するものと確認され、神経伝達物質であるアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌を確認した。
【0102】
具体的には、前記実験例１－２の方法及び１－７の方法のように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することを意味し、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件を意味し、二つの条件を含んで炎症性条件と言及する。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）に対して、実験例１－５の方法によって、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してＣｈＡＴ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現程度を確認した。また、前記実験例１－６の方法によってウェスタンブロットを遂行してＣｈＡＴの発現程度を確認した。また、実験例１－９の方法によって免疫蛍光染色してＣｈＡＴ、ＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）及びＧＡＢＡ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）；またはＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、ＭＢＰ、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＴｒｋＡ及びＧＡＢＡ；に対する発現程度を確認した。その結果を図１０に示した。
【0103】
図１０のａに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓでコリン性（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）であるＣｈＡＴが発現することを確認した。これに対して、ＧＡＢＡ性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ）であるＧＡＢＡ及びドーパミン性（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ）ＴＨは発現しないことを確認した。
【0104】
図１０のｂ及びｃに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓは、他の条件の細胞よりＣｈＡＴが高く発現されることを確認した。
【0105】
図１０のｄに示したように、ＭＳＣｓのスフェロイドは、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によりＭＳＣｓはコリン性に誘導されることを確認した。
【0106】
図１０のｅ及びｆに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓは、アセチルコリンを分泌することを確認した。
【0107】
６－２．炎症性条件で分泌された水溶性因子（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ）によりＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型への変化確認
炎症性条件で細胞と細胞との間のｃｏｎｔａｃｔで惹き起こされたコリン性ニューロン－類似表現型への変化ではなく、ある分泌された水溶性因子（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ）によりＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型への変化をトランスウェルプレートを用いた実験を通して確認した。
炎症性条件で細胞と細胞との間のｃｏｎｔａｃｔで惹き起こされたコリン性ニューロン－類似表現型への変化ではなく、ある分泌された水溶性因子（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ）によりＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型への変化をトランスウェルプレートを用いた実験を通して確認した。
【0108】
具体的には、０．４ｍ－ｐｏｒｅのトランスウェルプレートに（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）十万個のＭＳＣｓを下段ウェルに接種し、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）－活性化されたＰＢＭＣｓ（１×１０６）（ｂｏｔｔｏｍ：ＭＳＣ、ｉｎｓｅｒｔ：Ｐ＋Ｐｏ）または培地（ｂｏｔｔｏｍ：ＭＳＣ、ｉｎｓｅｒｔ：ｍｅｄｉｕｍ）を挿入して３日間培養した。また、トランスウェルでない一般の培養方法で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件でＭＳＣｓを培養して（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ））コリン作動性ニューロン－類似表現型への変化を確認した。
【0109】
また、調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭ）に培養していないＭＳＣｓ（ｎｏ ＣＭ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で活性化されたＰＢＭＣｓの調整培地（ＣＭ）にＭＳＣｓ培養（ＣＭ ｆｒｏｍ ＭＬＲ）；及び混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で活性化されたＰＢＭＣｓの調整培地（ＣＭ）にＭＳＣｓ培養（ＣＭ ｆｒｏｍ ＰＰＨＡ）して、前記ＭＳＣｓのコリン作動性ニューロン－類似表現型への変化を確認した。また、ＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、ＮＦ－Ｍ及びＴｕｊ１の発現を確認した。その結果を図１１に示した。
【0110】
図１１のａに示したように、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）で培養されたＭＳＣｓの神経－類似形態学的変化は、トランスウェル分析上にも確認された。
【0111】
図１１のｂ及びｃに示したように、調整培地（ＣＭ）条件でも前記ＭＳＣｓはコリン作動性ニューロン－類似表現型を示すことを確認し、ＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、ＮＦ－Ｍ及びＴｕｊ１の発現もまた示されることを確認した。
【0112】
実施例７．炎症性条件によるＰＢＭＣｓのニコチンコリン性受容体の発現及びコリン性抑制メカニズムを確認
７－１．炎症性条件によるＰＢＭＣｓのニコチンコリン性受容体の発現の確認
炎症性条件によるＰＢＭＣｓがニコチンコリン性受容体を発現するかを確認するために、前記実験例１－２の方法によって実験を遂行した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。
７－１．炎症性条件によるＰＢＭＣｓのニコチンコリン性受容体の発現の確認
炎症性条件によるＰＢＭＣｓがニコチンコリン性受容体を発現するかを確認するために、前記実験例１－２の方法によって実験を遂行した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。
【0113】
実験例１－５の方法によって、Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎＡＣｈＲα３、ｎＡＣｈＲα５、ｎＡＣｈＲα７、ｎＡＣｈＲα８、ｎＡＣｈＲβ２の発現程度を確認し、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行してｎＡＣｈＲα５またはｎＡＣｈＲα７の発現程度を確認した。また、前記実験例１－６の方法によってウェスタンブロットを遂行してｎＡＣｈＲα７の発現程度を確認した。その結果を図１２に示した。
【0114】
図１２のａ乃至ｃに示したように、ＰＢＭＣｓのスフェロイドは、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によりｎＡＣｈＲα５及びｎＡＣｈＲα７を発現することを確認した。
【0115】
図１２のｄに示したように、ＰＢＭＣｓのスフェロイドは、炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）によりｎＡＣｈＲα７を発現することを確認した。
【0116】
７－２．ＭＳＣｓのニコチンコリン性受容体の発現の確認
ＭＳＣｓがニコチンコリン性受容体を発現するかを確認するために、前記実験例１－２の方法によって実験を遂行した。ＭＳＣｓ単独群（ＭＳＣ ｃｏｎｔｒｏｌ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。その結果を図１３に示した。
ＭＳＣｓがニコチンコリン性受容体を発現するかを確認するために、前記実験例１－２の方法によって実験を遂行した。ＭＳＣｓ単独群（ＭＳＣ ｃｏｎｔｒｏｌ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。その結果を図１３に示した。
【0117】
図１３に示したように、ＭＳＣｓ単独群は、ｎＡＣｈＲα７の発現が少ないか、または示されないことを確認した。
【0118】
従って、前記７－１及び７－２の実施例によって、ニコチンコリン性受容体であるｎＡＣｈＲα７は、免疫細胞であるＰＢＭＣ細胞でのみ発現されることを確認した。これによって、幹細胞であるＭＳＣで分泌されたアセチルコリンが前記ニコチンコリン性受容体が発現された免疫細胞にのみ結合することを確認した。
【0119】
７－３．炎症性条件によるＭＳＣｓのＡＣｈ－ｎＡＣｈＲ経路メカニズムの確認
炎症性条件によるＭＳＣｓでＡＣｈ－ｎＡＣｈＲ経路メカニズムを確認するために、前記実験例１－２及び１－１０の方法によって実験を遂行した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。コリン性アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるα－ＢＴＸ（α－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ、ｎＡＣｈＲα７のアンタゴニスト）；コリン性アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）であるＡＣｈ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＣｈ－Ｃｌ、ＡＣｈＲのアゴニスト）；または非特異的コリン性アゴニストであるカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）を培地に添加した後、各炎症性条件によるＭＳＣｓのＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの活性を確認した。その結果を図１４に示した。
炎症性条件によるＭＳＣｓでＡＣｈ－ｎＡＣｈＲ経路メカニズムを確認するために、前記実験例１－２及び１－１０の方法によって実験を遂行した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件は、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓを共に培養することであり、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件は、ＰＢＭＣｓにＰＨＡを処理して生成した条件である。前記炎症性条件によって、互いに異なるドナーで収得した各ＰＢＭＣｓ単独群（Ｐ及びＰｏ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＭＬＲ）；ＭＳＣｓのない混合リンパ球反応条件群（ＭＬＲ）；または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件に共同培養したＭＳＣｓ群（ＭＳＣ ｉｎ ＰＰＨＡ）を置いた。コリン性アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるα－ＢＴＸ（α－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ、ｎＡＣｈＲα７のアンタゴニスト）；コリン性アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）であるＡＣｈ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＣｈ－Ｃｌ、ＡＣｈＲのアゴニスト）；または非特異的コリン性アゴニストであるカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）を培地に添加した後、各炎症性条件によるＭＳＣｓのＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの活性を確認した。その結果を図１４に示した。
【0120】
図１４のａ乃至ｃに示したように、炎症性条件である混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で培養されたＭＳＣｓにより抑制されたリンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γがα－ＢＴＸと共に培養することでまた活性化されることを確認した。
【0121】
図１４のｄ乃至ｆに示したように、炎症性条件である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件で培養されたＭＳＣｓにより抑制されたリンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γがα－ＢＴＸと共に培養することでまた活性化されることを確認した。
【0122】
図１４のｇ乃至ｉに示したように、炎症性条件である混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件で培養されたＭＳＣｓにより抑制されたリンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γがＡＣｈ－Ｃｌと共に培養することで有意的にさらに抑制されることを確認した。
【0123】
図１４のｊ乃至ｌに示したように、炎症性条件である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件で培養されたＭＳＣｓにより抑制されたリンパ球増殖、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γがＡＣｈ－Ｃｌと共に培養することで有意的にさらに抑制されることを確認した。
【0124】
図１５のａ乃至ｄに示したように、非特異的コリン性アゴニストであるカルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）を本発明の炎症性条件のＭＳＣｓ培養培地に添加して培養時、前記ＭＳＣｓのリンパ球増殖及び炎症性サイトカインの放出を抑制することを確認し、特異的または非特異的コリン性アゴニストのいずれにおいてもＡＣｈ－ｎＡＣｈＲ経路メカニズムを確認した。
【0125】
実施例８．マウスまたはラットの炎症細胞処理を通したＭＳＣｓの炎症性刺激の有無、形態的変化及び神経細胞類似特性の確認
実施例８－１．マウスまたはラットの炎症細胞処理を通したＭＳＣｓの炎症性刺激の有無、形態的変化及び神経細胞類似特性の確認
マウスの炎症関連細胞の一つである脾臓細胞処理を通してＭＳＣｓに炎症性刺激の有無を確認し、それによるＭＳＣｓの形態的変化及びコリン性神経細胞類似表現型への変化程度を確認した。
実施例８－１．マウスまたはラットの炎症細胞処理を通したＭＳＣｓの炎症性刺激の有無、形態的変化及び神経細胞類似特性の確認
マウスの炎症関連細胞の一つである脾臓細胞処理を通してＭＳＣｓに炎症性刺激の有無を確認し、それによるＭＳＣｓの形態的変化及びコリン性神経細胞類似表現型への変化程度を確認した。
【0126】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）の脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ、ＳＰ）を１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びａｎｔｉ－ＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体（αＣＤ３／ＣＤ２８）と共に培養して活性した。この後、ＣＤ３／ＣＤ２８－活性化されたマウスの脾臓細胞（２×１０５）とＭＳＣｓ（４×１０３～４×１０４）を１：５、１：１０、１：２０、及び１：５０の比率で培養し、その形態学的変化を確認した。
【0127】
また、コリン性ニューロンまたは神経前駆細胞関連マーカーであるＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＴＨを利用してその発現を確認した。その結果を図１６に示した。
【0128】
図１６のａに示したように、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、リンパ球増殖抑制がまともになされないことを確認した。
【0129】
図１６のｂに示したように、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、コリン性神経細胞類似表現型に変化しないことを確認した。
【0130】
図１６のｃに示したように、マウスの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、コリン性ニューロンまたは神経前駆細胞関連マーカーであるＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ及びＴＨが発現されないことを確認した。
【0131】
実施例８－２．ラットの炎症細胞処理を通したＭＳＣｓの炎症性刺激の有無、形態的変化及び神経細胞類似特性の確認
ラットの炎症関連細胞の一つである脾臓細胞処理を通してＭＳＣｓに炎症性刺激の有無を確認し、それによるＭＳＣｓの形態的変化及びコリン性神経細胞類似表現型への変化程度を確認した。
ラットの炎症関連細胞の一つである脾臓細胞処理を通してＭＳＣｓに炎症性刺激の有無を確認し、それによるＭＳＣｓの形態的変化及びコリン性神経細胞類似表現型への変化程度を確認した。
【0132】
具体的には、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｏｒｉｅｎｔ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）の脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ、ＳＰ）を１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びａｎｔｉ－ＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体（αＣＤ３／ＣＤ２８）と共に培養して活性した。この後、ＣＤ３／ＣＤ２８－活性化されたマウスの脾臓細胞（２×１０５）とＭＳＣｓ（４×１０３～４×１０４）を１：５、１：１０及び１：２０の比率で培養し、その形態学的変化を確認した。
【0133】
また、コリン性ニューロンまたは神経前駆細胞関連マーカーであるＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ、ＴＨ及びＧＡＢＡを利用してその発現を確認した。また、ラットの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓの神経成長因子受容体であるＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲのｍＲＮＡ発現程度を確認した。その結果を図１７に示した。
【0134】
図１７のａに示したように、ラットの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、リンパ球増殖抑制がまともになされないことを確認した。
【0135】
図１７のｂに示したように、ラットの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、コリン性神経細胞類似表現型に変化しないことを確認した。
【0136】
図１７のｃに示したように、ラットの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、コリン性ニューロンまたは神経前駆細胞関連マーカーであるＣｈＡＴ、ＮＣＡＭ１、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｍ、ｎｅｓｔｉｎ、ＭＢＰ、ＴＨ及びＧＡＢＡが発現されないことを確認した。
【0137】
図１７のｄに示したように、ラットの脾臓細胞処理されたＭＳＣｓは炎症性刺激されず、神経成長因子受容体であるＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ及びｐ７５ＮＴＲのｍＲＮＡ発現が一般のＭＳＣｓよりさらに低いことを確認した。
【0138】
従って、ＭＳＣｓのコリン性ニューロン－類似表現型（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）への変化及び神経細胞類似特性は、マウスまたはラットでは現れないヒト特異的現象であることを確認した。
【0139】
実施例９．マウス内ヒト細胞のＣｈＡＴまたはｎｅｓｔｉｎの発現有無及びＭＳＣ細胞質の発生有無の確認
ＰＢＭＣｓ及びＭＳＣｓ処理によるマウス内ヒト細胞のＣｈＡＴまたはｎｅｓｔｉｎの発現有無及びＭＳＣ細胞質の発生有無を確認した。
ＰＢＭＣｓ及びＭＳＣｓ処理によるマウス内ヒト細胞のＣｈＡＴまたはｎｅｓｔｉｎの発現有無及びＭＳＣ細胞質の発生有無を確認した。
【0140】
具体的には、図１８のａに示したように、一時的な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ヒト化ＧＶＨＤマウスモデルを作製するために、１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）（ｎ＝３）に８．５Ｇｙ（４ＭＶ Ｌｉｎａｃ；Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を放射線照射した。照射２４時間後、前記マウスにそれぞれＰＢＭＣｓ（Ｐ１またはＰ２；５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｅａｃｈ／ｈｅａｄ）または混合されたＰＢＭＣｓ（Ｐ１＋Ｐ２；１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ、混合比は１：１）を注入した。その後、ヒトＭＳＣｓ（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）を前記マウスにそれぞれ注入して４８時間後、前記各マウスを犠牲にさせて二次リンパ器官（脾臓及び表面子宮頸部（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｖｉｃａｌ）、脇、腸間膜及び鼠蹊部のリンパ節（ｉｎｇｕｉｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ））を摘出した後、凍結して各切片を準備した。ＣｈＡＴ＋ ｎｅｓｔｉｎ＋ヒト細胞を確認するために、前記各マウスにヒト－特異的抗－ＣｈＡＴ及び抗－ｎｅｓｔｉｎ抗体で免疫蛍光染色してこれを確認した。ＤＡＰＩは、核の染色を確認するために使用した。また、ＭＳＣ追跡実験のために、前記各マウスに製造会社のプロトコルによって、ＭＳＣの細胞質の有無を確認するために、生体に適したシリカ－コーティングされた蛍光ナノ粒子（Ｎｅｏｓｔｅｍ；Ｂｉｔｅｒｉａｌｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で標識した。その結果を図１８に示した。
【0141】
図１８のｂに示したように、混合されたＰＢＭＣｓ（Ｐ１＋Ｐ２）を注入後、ヒトＭＳＣｓを注入したマウスの腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）でａｎｔｉ－ＣｈＡＴ及びａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎの抗体が発現されることを確認した。
【0142】
図１８のｃに示したように、混合されたＰＢＭＣｓ（Ｐ１＋Ｐ２）を注入後、ヒトＭＳＣｓを注入したマウスでＭＳＣの細胞質が発見されることを確認した。
【0143】
前記一連の実験を通して、図１９に示したように、本発明の炎症性条件（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）条件または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）処理条件）処理は、ＭＳＣｓを実際のニューロン細胞への転換分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）させるのではなく、コリン性ニューロン－類似表現型に変化させるということを確認した。炎症性条件で処理されたＭＳＣｓは、神経成長因子受容体（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ニコチンコリン性受容体の発現が増加し、具体的には、前記神経成長因子受容体のうちＴｒｋＡ及びｐ７５ＮＴＲの発現が有意的に増加し、炎症環境にある免疫細胞で発現された神経成長因子ＮＧＦ及びＢＤＮＦにより刺激を受けてコリン性ニューロン－類似細胞形状に変化することを確認した。また、本発明の炎症性条件で処理されたＭＳＣｓは、アセチルコリンを分泌して免疫細胞表面に増加したニコチンコリン性受容体（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）であるｎＡＣｈＲα７を通して活性化された免疫細胞を抑制できることを確認し、このような特性を活用すれば免疫疾患または炎症疾患の予防または治療に利用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図14f】
【図14g】
【図14h】
【図14i】
【図14j】
【図14k】
【図14l】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】