特許 7213507 組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-19

(45)【発行日】2023-01-27

(54)【発明の名称】組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20230120BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230120BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20230120BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230120BHJP

   A61K 39/23 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20230120BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20230120BHJP

   C12N 15/35 20060101ALN20230120BHJP

   C07K 14/015 20060101ALN20230120BHJP

【ＦＩ】

C12N15/82 Z ZNA

C12N15/85 Z

A01H5/00 A

C12N5/10

A61K39/23

A61P31/20

G01N33/569 L

C12N15/35

C07K14/015

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2021532309

(86)(22)【出願日】2019-11-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-01

(86)【国際出願番号】 KR2019015705

(87)【国際公開番号】W WO2020116815

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2021-06-07

(31)【優先権主張番号】10-2018-0155084

(32)【優先日】2018-12-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520130373

【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（アニマル アンド プラント クオレンティン エージェンシー）

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（ＡＮＩＭＡＬ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＡＧＥＮＣＹ）

(73)【特許権者】

【識別番号】519142114

【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ジェ－ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ウ，イン－オク

(72)【発明者】

【氏名】チョ，スドン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ヨンジク

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジュ－ヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョ，イン－ス

【審査官】幸田 俊希

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０８３１５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００４／００９３６４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０２３８２８４５（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０８０９６５７３（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２の６個の連続したヒスチジン（６ｘＨｉｓ）をコードするポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列又は配列番号４の塩基配列で表示される豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子の配列を順に連結してなる、組換え発現ベクター。

【請求項2】

請求項１の組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質を発現させる組換え植物体。

【請求項3】

請求項１の組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質を発現させる組換え昆虫細胞。

【請求項4】

請求項１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質を含む、豚パルボウイルスワクチン用組成物。

【請求項5】

請求項１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質を含む、豚パルボウイルス診断用組成物。

【請求項6】

請求項１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質を含む、豚パルボウイルス診断用キット。

【請求項7】

請求項１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を抗原として用いて、試料内で抗原－抗体反応によって豚パルボウイルスのＶＰ２抗体を検出する豚パルボウイルス診断方法。

【請求項8】

前記抗原－抗体反応は、組織免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）及びタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）分析法からなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて行う、請求項７に記載の豚パルボウイルス診断方法。

【請求項9】

前記試料は、細胞、血液、小便、唾液及び組織からなる群から選ばれる１種以上である、請求項７に記載の豚パルボウイルス診断方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、大韓民国農林畜産食品部の支援下で課題番号１５４５０１６３１６によってなされたものであり、該課題の研究管理専門機関は農林畜産検疫本部、研究事業名は“農林畜産検疫検査技術開発（Ｒ＆Ｄ）”、研究課題名は“植物遺伝子臨時発現システムを用いた新種豚パルボウイルスワクチン開発”、主管機関は農林畜産検疫本部、研究期間は２０１８．０１．０１～２０１８．１２．３１である。

【0002】

本特許出願は、２０１８年１２月５日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１８－０１５５０８４号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。

【0003】

本発明は、組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途に関する。

【背景技術】

【0004】

豚パルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）は外皮（ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）がなく、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）であり、約５ｋｂサイズの小さいＤＮＡを持つウイルスで、ブタにおいて繁殖障害を起こす原因体の一つである。１９６５年にドイツで初めて分離されて以来、現在も、ヨーロッパとアジアをはじめとして全世界で流行している。ＰＰＶ血清型１型が主に繁殖障害と関連しており、臨床症状の代表には、ＳＭＥＤＩ症候群と呼ばれる死産（ｓｔｉｌｌｂｉｒｔｈ）、胎児ミイラ化（ｍｕｍｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、胚死（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅａｔｈ）そして不妊（ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）がある。また、繁殖障害の他にも、皮膚疾患、下痢、及び呼吸器障害を起こすため、養豚産業において多くの経済的損失を与えている。

【0005】

豚パルボウイルス感染症は、母豚で繁殖障害を起こし、全世界的に大きく問題となっているにもかかわらず、今も根絶されずにいる。このため、養豚農家の生産性損失を最小化し、妊娠母豚の分娩率を高めるためには、優れた効能を有し且つ有効性が改善された新しいワクチンが望まれている。

【0006】

現在用いられている豚パルボウイルス感染症診断法には、中和試験（Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ，ＶＮＴ）、酵素免疫法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）、血球凝集抑制反応法（ＨＩ）などがある。現在、市都家畜防疫事業の家畜血清検査及び病性鑑定のために供給される診断液としてＨＩＡ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）診断液がある。ＨＩＡ診断法は、動物（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）の血球を用いなければならないため、使用が面倒であり、血球採取のために動物を常時飼育しなければならないという不具合がある。中和試験法は、クリーンベンチで豚パルボウイルスを培養しなければならなく、結果を得るまで３～４日がかかるという問題点がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、抗原タンパク質として、優れた抗原性及び免疫原性を有する組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質を開発するために鋭意研究努力した。その結果、豚パルボウイルスＶＰ２遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）を最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）して合成し、これを含む組換え発現ベクターによって形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞から得た豚パルボウイルスＶＰ２抗原タンパク質が高い安定性及び免疫原性を有するということを糾明し、本発明を完成するに至った。

【0008】

したがって、本発明の目的は、組換え豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質発現ベクターを提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は、組換え豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を発現させる組換え植物体又は組換え昆虫細胞を提供することである。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、豚パルボウイルスワクチン用組成物を提供することである。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、豚パルボウイルス診断用組成物を提供することである。

【0012】

本発明のさらに他の目的は、豚パルボウイルス診断用キットを提供することである。

【0013】

本発明のさらに他の目的は、豚パルボウイルス診断方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の一様態によれば、本発明は、豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0015】

本発明者らは、抗原タンパク質として、優れた抗原性及び免疫原性を有する組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、豚パルボウイルスＶＰ２遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）を最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）して合成し、これを含む組換え発現ベクターによって形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞から得た豚パルボウイルスＶＰ２抗原タンパク質が高い安定性及び免疫原性を有するということを糾明した。

【0016】

前記豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３又は配列番号４の塩基配列で表示されるもの又はこれと機能的に同等な塩基配列を有することができる。

【0017】

前記配列番号３の塩基配列は、豚パルボウイルス８２ ＶＰ２遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）を植物体発現のために最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）した配列である。

【0018】

前記配列番号４の塩基配列は、豚パルボウイルス０７ ＶＰ２遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）を植物体発現のために最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）した配列である。

【0019】

前記“機能的に同等な”ものとは、塩基の付加、置換又は欠失の結果、配列番号３又は配列番号４の塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであり、配列番号３又は配列番号４で表示される塩基配列によってコードされたタンパク質と実質的に同質の生理活性を示すタンパク質をコードできる塩基配列のことを意味する。例えば、一部の塩基配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）又は挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）によって修飾されたが、豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードする核酸分子と機能的に同じ作用ができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含むことができる。

【0020】

本発明の他の様態によれば、本発明は、本発明の前記組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を発現させる組換え植物体を提供する。

【0021】

前記植物体は、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属植物であってよい。

【0022】

前記ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属植物は、ニコチアナアクミナタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ニコチアナアフリカナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ニコチアナアラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、ニコチアナアテナータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナクレベランディイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナエクシグア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｉｇｕａ）、ニコチアナグラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）、ニコチアナグルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ Ｌ．）、ニコチアナラングスドルフィ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ）、ニコチアナロンギフロラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ）、ニコチアナオクシデンタリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ニコチアナオブツシフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナオトフォラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｔｏｐｈｏｒａ）、ニコチアナプランバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナクアドリヴァルヴィス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ）、ニコチアナルスチカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ Ｌ．）、ニコチアナスアヴェオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ Ｌｅｈｍ．）、ニコチアナシルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）又はニコチアナトメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ Ｇｏｏｄｓｐ．）でよく、例えば、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）でよい。

【0023】

本発明に係る豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターによって形質転換された植物体は、豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を発現させることができる。前記形質転換された植物体を用いる場合、植物体の裁培が可能な一般実験室で容易に大量のタンパク質が製造でき、得られた豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質は、モルモット赤血球に対する血球凝集能のような豚パルボウイルス抗原タンパク質固有の生物学的機能を有しており、感染性を持つ生きているウイルスの取扱による汚染可能性がないため安全であり、従来の抗原製造過程に比べて非常に迅速で正確に抗原を大量生産することができる。

【0024】

本発明の一具現例によれば、前記組換え植物体から得た豚パルボウイルスＶＰ２抗原タンパク質は、豚パルボウイルスを診断するのに有用に用いることができる。

【0025】

本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明の前記組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を発現させる組換え昆虫細胞を提供する。

【0026】

前記昆虫細胞は、ハスモンヨトウ種のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来したＳｆ-９細胞でよいが、これに制限されない。

【0027】

本発明の一具現例によれば、前記組換え発現ベクターに含まれる豚パルボウイルスＶＰ２遺伝子は、植物体発現に最適化された配列で構成されるが、前記組換え発現ベクターで形質転換された組換え昆虫細胞においても豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質が効果的に発現する。

【0028】

本発明の一具現例によれば、前記組換え昆虫細胞から得た豚パルボウイルスＶＰ２抗原タンパク質は、豚パルボウイルスを診断するのに有用に用いることができる。

【0029】

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を含む豚パルボウイルス診断用組成物及び診断キットを提供する。

【0030】

本発明において、“診断”は、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、豚パルボウイルス発病の有無又は発病可能性の有無を確認することである。

【0031】

前記診断キットは、当業界おける通常の方法を用いて製造できる。このような診断キットは、豚パルボウイルスＶＰ２抗原タンパク質の他、免疫学的分析に用いられる当分野における一般の道具、試薬なども含まれる。このような道具／試薬としては、適切な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これに制限されない。標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含むことができる。適切な担体としては、これに限定されないが、可溶性担体、例えば当分野に公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他に紙、ガラス、金属、アガロース及びそれらの組合せが挙げられる。

【0032】

また、本発明は、前記組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を抗原として用いて、試料内で抗原－抗体反応によって豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質に対する抗体を検出する豚パルボウイルスの診断方法を提供する。

【0033】

前記抗原－抗体反応は、当業界における通常のいかなる方法も用いることができ、例えば、組織免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）及びタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）分析法からなる群から選ばれる１種以上の方法を用いることができる。

【0034】

前記試料は、豚パルボウイルスに感染されていると予想されたり或いは感染されている細胞、血液、小便、唾液、組織などを含むが、それらに限定されない。

【0035】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は配列番号３又は配列番号４の塩基配列で表示される豚パルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を含む、豚パルボウイルスに対するワクチン組成物を提供する。

【0036】

本明細書において用語‘ワクチン組成物’は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の免疫反応に肯定的に影響を与える組成物を意味する。前記ワクチン組成物は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に細胞性免疫反応、例えば、ＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）又は体液性免疫反応、例えば、抗体によって誘発される向上した全身的又は局所的免疫反応を提供する。

【0037】

前記ワクチン組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。本発明の組成物に含み得る薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに制限されるものではない。

【0038】

本発明の組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

【0039】

本発明のワクチン組成物は、その他の構成成分、例えば、安定化剤、賦形剤、その他薬学的許容化合物又は任意のその他抗原又はその一部を含むことができる。ワクチンは、冷凍乾燥した製剤又は懸濁液の形態で存在してよく、それらはいずれもワクチン生成分野における通常のものである。

【0040】

本発明であるワクチン組成物の投与形態は、腸溶皮使用単位体の形態、腹腔内、筋肉内又は皮下投与用接種、エアゾール噴霧、経口又は鼻腔内の用途であってよい。飲用水又は食用ペレットとして投与することも可能である。

【0041】

本発明のワクチン組成物は、異種抗原及びサイトカインのような免疫調節分子を同一の組換え体内で発現させて単一ワクチンとして伝達することもでき、免疫増強剤と共に投与することもできる。本明細書の用語、“免疫増強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）”は、一般に、抗原に対する体液又は細胞免疫反応を増加させる任意の物質（例えば、ミョウバン（ａｌｕｍ）、プロイント完全アジュバント、プロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ、ｐｏｌｙ ＩＣ、ｐｏｌｙ ＡＵなど）を意味する。

【発明の効果】

【0042】

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクター、該ベクターによって形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞、該組換え植物体又は組換え昆虫細胞から得た豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質を含む豚パルボウイルスに対するワクチン組成物及び豚パルボウイルス診断用組成物を提供する。

【0043】

（ｂ）本発明の組換え植物体又は組換え昆虫細胞を用いる場合、豚パルボウイルス抗原タンパク質を高効率で生産することができ、前記組換え植物体又は組換え昆虫細胞を用いた豚パルボウイルス抗原タンパク質生産方法は、他の抗原生産方法に比べて優れた安全性及び安定性を呈する。

【0044】

（ｃ）本発明の豚パルボウイルス診断用組成物は、組換え抗原タンパク質を用いるものであり、生きているウイルスの取扱による汚染可能性がないため安全であり、大量の試料から速かに豚パルボウイルス感染の有無が診断できる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】豚パルボウイルス系統（ｓｔｒａｉｎ）別ＶＰ２タンパク質の配列を示す図である。

【図2A】ＰＰＶ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクター構造を示す模式図である。

【図2B】ＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクター構造を示す模式図である。

【図3A】植物体で発現した組換えＰＰＶ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の発現をウェスタンブロットを用いて確認した結果を示す図である。

【0046】

Ｒｂｃ：６Ｈｉｓ：ＶＰ２は、ルビスコトランジットペプチド、６ＸＨｉｓ及びコドン最適化したＰＰＶ ＶＰ２を一連の順序で含む発現ベクターで形質転換した植物体におけるＰＰＶ ＶＰ２発現を確認したものであり、Ｒｂｃ：ＶＰ２：６Ｈｉｓは、ルビスコトランジットペプチド、コドン最適化したＰＰＶ ＶＰ２及び６ＸＨｉｓを一連の順序で含む発現ベクターで形質転換した植物体におけるＰＰＶ ＶＰ２発現を確認したものである。

【図3B】植物体で発現した組換えＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の発現をウェスタンブロットを用いて確認した結果を示す図である。

【図3C】コドン最適化されていないＰＰＶ ＶＰ２を含む発現ベクターで形質転換した植物体におけるＰＰＶ ＶＰ２発現をウェスタンブロットを用いて確認した結果を示す図である。

【0047】

６Ｈｉｓ：ＶＰ２は、６ＸＨｉｓ及びコドン最適化されていないＰＰＶ ＶＰ２を含む発現ベクターで形質転換した植物体におけるＰＰＶ ＶＰ２発現を確認したものであり、ＶＰ２：６Ｈｉｓは、コドン最適化されていないＰＰＶ ＶＰ２及び６ＸＨｉｓを含む発現ベクターで形質転換した植物体におけるＰＰＶ ＶＰ２発現を確認した結果である。

【図4】昆虫細胞で発現した組換えＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の発現をウェスタンブロットを用いて確認した結果を示す図である。

【図5A】植物体で発現した組換えＰＰＶ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の免疫原性をブタで評価した結果を示す図である。

【図5B】植物体で発現した組換えＰＰＶ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の免疫原性評価に用いられた９６プレートを示す図である。

【図6A】植物体及び昆虫細胞で発現した組換えＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質に対してモルモットで免疫原性を評価した結果を示す図である。

【図6B】植物体及び昆虫細胞で発現した組換えＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の免疫原性評価に用いられた９６プレートを示す図である。

【図7A】植物体で発現した組換えＰＰＶ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質のモルモット赤血球凝集能を確認した結果を示す図である。

【図7B】植物体で発現した組換えＰＰＶ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質のモルモット赤血球凝集能を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0048】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0049】

実施例
実施例１．組換え豚パルボウイルス（ＰＰＶ）ＶＰ２（ＰＰＶ ８２－ｏｐｔ、ＰＰＶ ０７－ｏｐｔ）抗原植物発現ベクター作製
抗原性の最も高いＶＰ２をターゲッティングするために、ブタ流死産胎児の試料から得たＰＰＶ ＶＰ２ ＤＮＡ配列を使用し、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔコドン最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）プログラムを用いてニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に合わせて最適化し、バイオニア社に依頼して合成した。最適化されたＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２のヌクレオチド配列は１７４０ｂｐであり、ＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２は１７３７ｂｐで構成される。

【0050】

１－１．組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２発現ベクター
ＰＰＶ ＶＰ２抗原の植物発現のためにｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にルビスコ（ＲｕＢｉｓＣＯ）トランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）及びＰＰＶ ８２ ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を順に連結して組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２植物発現ベクターを作製した（図２Ａ）。

【0051】

１－２．組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２発現ベクター
ＰＰＶ ＶＰ２抗原の植物発現のために、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にルビスコ（ＲｕＢｉｓＣＯ）トランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、及びＰＰＶ ０７ ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を順に連結し、組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２植物発現ベクターを作製した（図２Ｂ）。

【0052】

実施例２．植物体において組換えＰＰＶ ＶＰ２（ＰＰＶ ８２－ｏｐｔ、ＰＰＶ ０７－ｏｐｔ）タンパク質の発現
植物で組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質又はＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２を発現させるために、前記の実施例１で準備した組換え発現ベクターは、メーカーの指示に従って、Ｇｅｎｅ ｐｕlｓeｒ ＸＣｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて電気穿孔によってアグロバクテリア菌株ＧＶ３１０１に形質転換された。形質転換されたＧＶ３１０１を安定期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に到達するまで、適切な抗生剤を含有するＹＥＰ培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で成長させた。培養物を遠心分離し、沈殿物を浸潤培地（１０ｍＭ Ｍｅｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭアセトシリンゴン）に０．５のＯＤ ６００で再懸濁させた後、１時間室温で培養した。２５℃条件下で４～６週齢に育ったニコチアナベンサミアナ葉にアグロバクテリア懸濁液を注射器又は真空浸透させる方法でアグロ－インフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。

【0053】

実施例３．植物体において組換えＰＰＶ ＶＰ２（ＰＰＶ ８２－ｏｐｔ、ＰＰＶ ０７－ｏｐｔ）タンパク質発現確認
約３ｃｍ^２の葉組織を１００μｌの粉砕緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ ＳＤＳ、５ｍＭ ＤＴＴ及び植物プロテアーゼ抑制剤カクテル［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）を用いて粉砕し、不溶性残骸を４℃で１０分間２０，０００ｘ ｇで遠心分離した。サンプルを１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから分離し、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ ｏｆ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。その後、単クローンＨｉｓ抗体（１：１，０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させ、化学発光基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で検出した。

【0054】

ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド－６個の連続したヒスチジンをコードするポリヌクレオチドと、豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質（ＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質又はＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを順に連結して作製した植物発現ベクターを用いた場合、図３Ａ（左パネル）及び図３Ｂから確認されるように、良好な発現を示したが、ヒスチジンを豚パルボウイルスＶＰ２タンパク質の後側に付けて作製した植物発現ベクターを用いた場合には、タンパク質発現が見られなかった（図３Ａの右パネル）。

【0055】

また、コドン最適化されていない豚パルボウイルスＶＰ２を含む発現ベクターで形質転換した植物体では豚パルボウイルスＶＰ２が発現しなかった（図３Ｃ）。

【0056】

実施例４．組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２抗原昆虫細胞発現ベクター作製
ＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２配列を増幅して、ｐＤｒｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、塩基配列を分析した。バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）組換え発現のためにｐＦａｓｔＢａｃ^TM ＨＴ Ｂベクトル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングを行った。

【0057】

実施例５．昆虫細胞において組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の発現及び確認
昆虫で組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質を発現させるために、メーカーの指示に従って、組換え発現ベクターを４２℃熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）を用いてＤＨ１０Ｂａｃに形質転換した。形質転換されたＤＨ１０Ｂａｃを、Ｓ．Ｏ．Ｃ培地で３７℃、４時間培養させた。１／１０希釈してＬＢ培地にゲンタマイシン（７ｕｇ／ｍｌ）抗生剤を添加し、４８時間、３７℃で培養した。１０個のコロニーを１０枚のプレートに移した後、ｐＵＣ／Ｍ１３プライマーでＰＣＲを用いて組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２配列を確認した。Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）用いてＳｆ－９細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。

【0058】

２７℃でトランスフェクションし、５日後に細胞を収穫して４℃で３０分間タンパク質を抽出した。組換えＰＰＶ ＶＰ２タンパク質のＮ－末端にヒスチジンが結合しており、ＶＰ２タンパク質精製のためにＮＩ－ＮＴＡレジンを用いてタンパク質を分離した。

【0059】

ＰＶＤＦメンブレインに精製したタンパク質を移した後、５％ ＢＳＡでメンブレインをブロッキングした。１次抗体マウス－Ｈｉｓ（１：１，０００）で常温で１時間反応させ、ＴＢＳＴで５回洗浄した後、２次抗体マウス－ＨＲＰ（１：５，０００）で常温で１時間反応させ、ＴＢＳＴで５回洗浄した後、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）と反応させてタンパク質発現を確認した（図４）。

【0060】

実施例６．組換えＰＰＶ ＶＰ２タンパク質の免疫原性評価
６－１．組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質免疫原性評価
植物体で発現させた組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質を、水酸化アルミニウムゲルアジュバント（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｇｅｌ ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：１に混合し、２５，０００ＨＡユニットで１００～１１０日齢ブタに１次接種し、２週後に２次接種した後、２週後に採血してＨＩ力価（ＨＩ ｔｉｔｅｒ）を測定した。その結果、平均２^７の抗体価を確認した（図５Ａ及び図５Ｂ）。

【0061】

６－２．組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質免疫原性評価
昆虫細胞で発現させた組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質と植物発現システムを用いて発現させた組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質をそれぞれ、５００ＨＡユニットでモルモットに１次接種し、２週後に２次接種した後、２週後に採血してＨＩ力価を測定した。その結果、植物体で発現した組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質は、２^１０の平均抗体価を示し、昆虫細胞で発現した組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質は、２^１１の平均抗体価を示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。

【0062】

実施例７．血球凝集反応（ＨＡ）
７－１．組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の血球凝集能
ＰＰＶは、モルモット赤血球に凝集する特徴を示し、Ｓｅｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）論文を参考して血球凝集反応を実施した。９６ウェルＵプレートにニコチアナベンサミアナで発現したＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質を２倍希釈した後、０．６％モルモット赤血球と混合し、３７℃で１時間反応させた後、結果を解析した。

【0063】

組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質は、モルモット血球凝集能２^１１ＨＡユニット（８ｇ／植物）を示しており、これによって、植物で発現した組換えＰＰＶ ８２－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の抗原性を確認した（表１、図７Ａ）。

【0064】

【表1】

【0065】

７－２．組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の血球凝集能
ＰＰＶは、モルモット赤血球に凝集する特徴を示し、Ｓｅｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）論文を参考して血球凝集反応を実施した。９６ウェルＵプレートにニコチアナベンサミアナで発現したＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質を２倍希釈した後、０．６％モルモット赤血球と混合し、３７℃で１時間反応させた後、結果を解析した。

【0066】

組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質は、モルモット血球凝集能２^５ＨＡユニット（８ｇ／植物）を示し、これによって、植物で発現した組換えＰＰＶ ０７－ｏｐｔ ＶＰ２タンパク質の抗原性を確認した（表２、図７Ｂ）。

【0067】

【表2】

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7a】

【図7b】

【配列表】

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