(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-20
(45)【発行日】2023-01-30
(54)【発明の名称】新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚感作性試験法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/49 20060101AFI20230123BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230123BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20230123BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20230123BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20230123BHJP
【ＦＩ】
C12N15/49 ZNA
C12Q1/06
C12Q1/6897
C12Q1/70
C12N15/53
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020166922
(22)【出願日】2020-10-01
(65)【公開番号】P2022059283
(43)【公開日】2022-04-13
【審査請求日】2021-02-05
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和元年１０月３１日、日本動物実験代替法学会第３２回大会 プログラム・講演要旨集、表紙、第１４、３１、１３１頁及び奥付
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和元年１１月２１日、日本動物実験代替法学会第３２回大会で発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和２年４月２３日、Ｔｏｘｙｃｏｌｏｇｙ、第４３９巻、第１５２４７６－１５２４８２頁（２０２０年）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和２年６月１日、一般財団法人化学物質評価研究機構のホームページ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｒｉｊ．ｏｒ．ｊｐ／ 第２５回化学物質評価研究機構研究発表会、研究発表１
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和２年７月２１日、国立大学法人山口大学大学院連合獣医学研究科学位論文発表会で発表
(73)【特許権者】
【識別番号】000173566
【氏名又は名称】一般財団法人 化学物質評価研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100156889
【弁理士】
【氏名又は名称】小山 京子
(72)【発明者】
【氏名】武吉 正博
(72)【発明者】
【氏名】前田 洋祐
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２４３１９０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００３－０７９３６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０３９７５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２９２２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５３２８２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３６１０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／１３３８２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－１０２７２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Yosuke Maeda et al.，AATEX，2019年，Vol. 24(Supplement)，p. 146, P-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮膚感作性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、下記工程（１）～（４）：
（１）抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス、及び
前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス
で二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程、
（２）前記細胞株に被験物質を曝露させる工程、
（３）ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（４）ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（５）下記式：
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
によりｎＲＬＵを算出し、そして、下記式：
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
により、皮膚感作性評価指標をｎＡＡ値として算出する工程、
（６）前記工程（５）におけるｎＡＡ値を、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果及び非感作性物質（陰性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果と比較し、陽性もしくは陰性と判定するための最適カットオフ値を求めて、そのカットオフ値を判定基準として被験物質の皮膚感作性の判定を行う工程、
からなる、皮膚感作性試験方法。
【請求項2】
前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、その上流に、配列番号１で表される配列から調製される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記（１）工程のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子が、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有し、そして、その上流にチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有するものであり、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子配列を挿入したレンチウイルスを用いて感染させ、かつ、前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルスで感染させた、ヒトケラチノサイト細胞株を提供することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記工程（１）で提供される細胞株が、ヒトケラチノサイト細胞株が生存できない濃度の抗生物質である、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下においても増殖可能な安定細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記工程（６）における、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群及び非感作性物質（陰性対照物質）群が、少なくとも下記：皮膚感作性物質がオキサゾロン、２，４－ジニトロクロロベンゼン、４－フェニレンジアミン、グリオキサール、４－ニトロベンジルブロミド、４－メチルアミノフェノールサルフェート、５－クロロ－２－メチルイソチアゾリノン、桂皮アルデヒド、イソオイゲノール、テトラメチルチウラムジスルフィド、２－メルカプトベンゾチアゾール、メチルジブロモグルタロニトリル、オイゲノール、シンナミルアルコール、ヘキシルシンナムアルデヒド、シトラール、安息香酸フェニル、イミダゾジニル尿酸、エチレングリコール ジメタクリレート、及び
非感作性物質がサリチル酸メチル、サリチル酸、イソプロパノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、フタル酸ジメチル、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、グリセロール、
の群であって、それぞれについて前記工程（１）から工程（５）を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高精度かつ簡便なｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚感作性試験法に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚感作の結果生じるアレルギー性接触皮膚炎は、労働衛生上に、及び環境衛生上に共通する問題である。ゆえに、皮膚感作性を評価することは化学物質の安全性評価において重要である。化学物質の皮膚での接触感作性のリスクを動物で予測する試験法としては、モルモットを用いる皮膚感作性試験（ＯＥＣＤ ＴＧ４０６）やマウスを用いる局所リンパ節試験（ＬＬＮＡ：Ｌｏｃａｌ Ｌｙｍｐｈｏ Ｎｏｄｅ Ａｓｓａｙ、ＯＥＣＤ ＴＧ４２９）がある。この［３Ｈ－メチル］－チミジン取込量を測定するＬＬＮＡ以外にも、放射性同位元素（ＲＩ）を用いずＡＴＰ量を測定するＬＬＮＡ：ＤＡ（ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ａ）やブロモデオキシウリジン量を測定するＬＬＮＡ：ＢｒｄＵ－ＥＬＩＳＡ（ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｂ）がある。このように、現在、ＯＥＣＤからガイドラインとして公表されている試験法は、動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏの試験法が用いられてきた。
近年は、ＥＵにおける欧州化学品規制では、安全性評価は、コンピューターを用いた定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）モデルやｉｎ ｖｉｔｒｏ試験等による代替法が推奨されており、さらに、動物実験により安全性が評価された成分を含んだ化粧品の輸入及び販売も禁止された（２０１３年３月全面施行）。そのため、動物を用いない化学物質の皮膚感作性を評価する代替法の開発が強く求められている。そして、化学物質の安全性評価のための動物試験の使用を縮小し減少させるために尽力が行われてきた。
近年は、ＥＵにおける欧州化学品規制では、安全性評価は、コンピューターを用いた定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）モデルやｉｎ ｖｉｔｒｏ試験等による代替法が推奨されており、さらに、動物実験により安全性が評価された成分を含んだ化粧品の輸入及び販売も禁止された（２０１３年３月全面施行）。そのため、動物を用いない化学物質の皮膚感作性を評価する代替法の開発が強く求められている。そして、化学物質の安全性評価のための動物試験の使用を縮小し減少させるために尽力が行われてきた。
【0003】
現在のところ、化学物質の感作性を評価するために開発された非動物性試験法の殆どは、ＯＥＣＤにより推奨されている皮膚感作性のＡＯＰにおける４つのキーイベントのいずれかをカバーするものである。即ち、皮膚感作性のＡｄｖｅｒｓｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ（ＡＯＰ）には、以下の４つのキーイベント（ＫＥ）、ＫＥ－１：内因性皮膚タンパク質へのハプテンの結合、ＫＥ－２：ケラチノサイトの活性化、ＫＥ－３：樹状細胞の活性化、そしてＫＥ－４：Ｔ細胞活性化が存在し、それらの評価方法が、近年確立された。現在、多くの非動物試験法は、これらの４つのキーイベントの一つをカバーする化学物質の感作性評価の方法として開発されている。
【0004】
ＡＲＥ－Ｎｒｆ２ルシフェラーゼ試験法は、感作性発現機序における第二のイベント（ＫＥ－２）であるケラチノサイトおける炎症反応及びＮｒｆ２－Ｋｅａｐｌ－ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙ（Ｋｅａｐ１：Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）を利用した試験法であり、化学物質の感作性を判断する上で重要な情報を与えるものであり、ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄとして国際的に標準化されている。
しかし、この方法は、予測精度が十分でない点と、試験において細胞生存率を個別に測定する必要があり、操作が煩雑である。
しかし、この方法は、予測精度が十分でない点と、試験において細胞生存率を個別に測定する必要があり、操作が煩雑である。
【0005】
非特許文献１により、Ｎｒｆ２－Ｋｅａｐ１－ＡＲＥ経路を応用した一過性発現系によるｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚感作性試験代替法が報告された。
しかし、非特許文献１の試験方法は、実験のたびに化学薬品による遺伝子導入が必要となることに加え、遺伝子導入に１週間程度の期間を要する。また用いる細胞数や遺伝子導入効率の変動がある。さらに、２種類のプラスミドにそれぞれ導入効率の影響を受けるため、改良の余地があるといえる。
しかし、非特許文献１の試験方法は、実験のたびに化学薬品による遺伝子導入が必要となることに加え、遺伝子導入に１週間程度の期間を要する。また用いる細胞数や遺伝子導入効率の変動がある。さらに、２種類のプラスミドにそれぞれ導入効率の影響を受けるため、改良の余地があるといえる。
【0006】
非特許文献２は、医療機器における感作性物質を検出するためのＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介したレポーター遺伝子アッセイ、即ち、ＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介した転写活性のためのＮａｎｏＬｕｃ及び細胞毒性のためのホタルルシフェラーゼ系を報告した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】前田洋祐ら、日本動物実験代替法学会第３０回大会プログラム・講演要旨集、第１５０頁（２０１７年１１月２３－２５日）
【文献】Ｅ．Ｍｅｒｔｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第４６巻、第５０８９－５１０２頁（２０１９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記の通り、ＫＥ－２に対応する試験法、ケラチノセンス（登録商標）アッセイ及びＬｕＳｅｎｓは、ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄとして承認されており（ＯＥＣＤ、２０１８年）、そして、この目的のために広く使用されている。
しかしながら、これらのアッセイは、予備試験のための用量を決定するための別個の細胞毒性試験を必要とし、本試験は、これにより計算された細胞生存率が５０％となる濃度（ＩＣ５０）に基づいて行われるか、又は細胞生存率が７５％の濃度（ＣＶ７５）の用量において行う手順が必要となる。
また、既存の標準化試験ではいくつかの物質において偽陰性もしくは偽陽性を示す精度上の問題があった。
そして、さらなる信頼性のある効果的な体系的試験法の開発が望まれる。
しかしながら、これらのアッセイは、予備試験のための用量を決定するための別個の細胞毒性試験を必要とし、本試験は、これにより計算された細胞生存率が５０％となる濃度（ＩＣ５０）に基づいて行われるか、又は細胞生存率が７５％の濃度（ＣＶ７５）の用量において行う手順が必要となる。
また、既存の標準化試験ではいくつかの物質において偽陰性もしくは偽陽性を示す精度上の問題があった。
そして、さらなる信頼性のある効果的な体系的試験法の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
簡便で正確度の良い試験方法にするために、発明者らは鋭意研究の結果、二重のルシフェラーゼ系を採用する手法を試み本発明に至った。即ち、第１のルシフェラーゼを用いることにより抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）－Ｎｒｆ２を介した転写活性を評価し、そして第２のルシフェラーゼを細胞毒性の同時評価に使用し、そしてＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介した転写活性をルシフェラーゼ系の細胞毒性試験から得られる生細胞数を用いて標準化し、これを化学物質の皮膚感作性を評価に適用することを試み本発明に至った。
【0010】
即ち、本発明は、
＜１＞ 皮膚感作性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
下記工程（１）～（４）：
（１）抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス、及び
前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス
で二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程、
（２）前記細胞株に被験物質を曝露させる工程、
（３）ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（４）ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（５）下記式：
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
によりｎＲＬＵを算出し、そして、下記式：
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
により、皮膚感作性評価指標をｎＡＡ値として算出する工程、
（６）前記工程（５）におけるｎＡＡ値を、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果及び非感作性物質（陰性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果と比較し、陽性もしくは陰性対象物質と判定するための最適カットオフ値を求めて、そのカットオフ値を判定基準として被験物質の皮膚感作性の判定を行う工程、
からなる、皮膚感作性試験方法。
＜２＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号１で表される配列から調製される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜４＞ 前記（１）工程のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子が、
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有し、そして、その上流にチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜５＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有するものであり、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子配列を挿入したレンチウイルスを用いて感染させ、かつ、前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルスで感染させた、ヒトケラチノサイト細胞株を提供することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜６＞ 前記工程（１）で提供される細胞株が、ヒトケラチノサイト細胞株が生存できない濃度の抗生物質である、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下においても増殖可能な安定細胞株である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞ 前記工程（６）における、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群及び非感作性物質（陰性対照物質）群が、少なくとも下記：
皮膚感作性物質がオキサゾロン、２，４－ジニトロクロロベンゼン、４－フェニレンジアミン、グリオキサール、４－ニトロベンジルブロミド、４－メチルアミノフェノールサルフェート、５－クロロ－２－メチルイソチアゾリノン、桂皮アルデヒド、イソオイゲノール、テトラメチルチウラムジスルフィド、２－メルカプトベンゾチアゾール、メチルジブロモグルタロニトリル、オイゲノール、シンナミルアルコール、ヘキシルシンナムアルデヒド、シトラール、安息香酸フェニル、イミダゾジニル尿酸、エチレングリコール ジメタクリレート、及び
非感作性物質がサリチル酸メチル、サリチル酸、イソプロパノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、フタル酸ジメチル、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、グリセロール、
の群であって、それぞれについて前記工程（１）から工程（５）を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法、
である。
＜１＞ 皮膚感作性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
下記工程（１）～（４）：
（１）抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス、及び
前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス
で二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程、
（２）前記細胞株に被験物質を曝露させる工程、
（３）ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（４）ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（５）下記式：
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
によりｎＲＬＵを算出し、そして、下記式：
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
により、皮膚感作性評価指標をｎＡＡ値として算出する工程、
（６）前記工程（５）におけるｎＡＡ値を、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果及び非感作性物質（陰性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果と比較し、陽性もしくは陰性対象物質と判定するための最適カットオフ値を求めて、そのカットオフ値を判定基準として被験物質の皮膚感作性の判定を行う工程、
からなる、皮膚感作性試験方法。
＜２＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号１で表される配列から調製される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜４＞ 前記（１）工程のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子が、
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有し、そして、その上流にチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを有することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜５＞ 前記（１）工程のホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子が、
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有し、
その上流に、配列番号２で表される配列を有するプロモーターを有し、そして、
その上流にエンハンサーとして配列番号３で表される抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）を有するものであり、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子配列を挿入したレンチウイルスを用いて感染させ、かつ、前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルスで感染させた、ヒトケラチノサイト細胞株を提供することを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜６＞ 前記工程（１）で提供される細胞株が、ヒトケラチノサイト細胞株が生存できない濃度の抗生物質である、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下においても増殖可能な安定細胞株である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞ 前記工程（６）における、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群及び非感作性物質（陰性対照物質）群が、少なくとも下記：
皮膚感作性物質がオキサゾロン、２，４－ジニトロクロロベンゼン、４－フェニレンジアミン、グリオキサール、４－ニトロベンジルブロミド、４－メチルアミノフェノールサルフェート、５－クロロ－２－メチルイソチアゾリノン、桂皮アルデヒド、イソオイゲノール、テトラメチルチウラムジスルフィド、２－メルカプトベンゾチアゾール、メチルジブロモグルタロニトリル、オイゲノール、シンナミルアルコール、ヘキシルシンナムアルデヒド、シトラール、安息香酸フェニル、イミダゾジニル尿酸、エチレングリコール ジメタクリレート、及び
非感作性物質がサリチル酸メチル、サリチル酸、イソプロパノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、フタル酸ジメチル、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、グリセロール、
の群であって、それぞれについて前記工程（１）から工程（５）を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法、
である。
【0011】
用語の説明
本発明における「被験物質」とは、特に限定されるものではなく、化粧品、医薬、医療用具、生活用品等としての、ヒトその他生物に用いられ、皮膚と接触する可能性のある全ての化学物質が対象である。
本発明における「ＬＬＮＡ」とは、「ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ Ｌｙｍｐｈｏ Ｎｏｄｅ Ａｓｓａｙ）」を指し、ＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４２９に記載の皮膚感作・局所リンパ節試験をいう。
「ケラチノセンス（登録商標）」とは、Ｇｉｖａｕｄａｎ社（ジボダン社、ヴェルニエ、スイス国）の開発したＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４４２Ｄに記載の皮膚感作性予測に用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であるＡＲＥ－Ｎｒｆ２ ルシフェラーゼ試験法をいう。
「ＬｕＳｅｎｓ」とは、ＢＡＳＦ社（ルートヴィヒスハーフェン・アム・ライン、ドイツ国）の開発したＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４４２Ｄに記載の皮膚感作性予測に用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であるＡＲＥ－Ｎｒｆ２ ルシフェラーゼ試験法をいう。
本明細書における「ヒトデータ」とは、Ｔｚｕｔｚｕｙら，「ＬｕＳｅｎｓ：Ａ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｂａｓｅｄ ＡＲＥ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｈａｚａｒｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，第２８巻，１４８２－１４９７頁（２０１４年）に記載されたヒトでの結果を指す。
本発明における「被験物質」とは、特に限定されるものではなく、化粧品、医薬、医療用具、生活用品等としての、ヒトその他生物に用いられ、皮膚と接触する可能性のある全ての化学物質が対象である。
本発明における「ＬＬＮＡ」とは、「ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ Ｌｙｍｐｈｏ Ｎｏｄｅ Ａｓｓａｙ）」を指し、ＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４２９に記載の皮膚感作・局所リンパ節試験をいう。
「ケラチノセンス（登録商標）」とは、Ｇｉｖａｕｄａｎ社（ジボダン社、ヴェルニエ、スイス国）の開発したＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４４２Ｄに記載の皮膚感作性予測に用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であるＡＲＥ－Ｎｒｆ２ ルシフェラーゼ試験法をいう。
「ＬｕＳｅｎｓ」とは、ＢＡＳＦ社（ルートヴィヒスハーフェン・アム・ライン、ドイツ国）の開発したＯＥＣＤ ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４４２Ｄに記載の皮膚感作性予測に用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であるＡＲＥ－Ｎｒｆ２ ルシフェラーゼ試験法をいう。
本明細書における「ヒトデータ」とは、Ｔｚｕｔｚｕｙら，「ＬｕＳｅｎｓ：Ａ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｂａｓｅｄ ＡＲＥ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｈａｚａｒｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，第２８巻，１４８２－１４９７頁（２０１４年）に記載されたヒトでの結果を指す。
【0012】
本発明の皮膚感作試験法は、下記（１）～（４）の工程を有することを特徴とする。
即ち、
皮膚感作性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
下記工程（１）～（４）：
（１）抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス、及び
前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス
で二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程、
（２）前記細胞株に被験物質を曝露させる工程、
（３）ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（４）ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程
からなり、さらに、工程（５）及び（６）を有する。
工程（５）下記式：
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
によりｎＲＬＵを算出し、そして、下記式：
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
により、皮膚感作性評価指標をｎＡＡ値として算出する。
工程（６）前記工程（５）におけるｎＡＡ値を、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果及び非感作性物質（陰性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果と比較し、陽性もしくは陰性対象物質と判定するための最適カットオフ値を求めて、そのカットオフ値を判定基準として被験物質の皮膚感作性の判定を行う。
即ち、
皮膚感作性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
下記工程（１）～（４）：
（１）抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス、及び
前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス
で二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程、
（２）前記細胞株に被験物質を曝露させる工程、
（３）ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程、
（４）ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程
からなり、さらに、工程（５）及び（６）を有する。
工程（５）下記式：
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
によりｎＲＬＵを算出し、そして、下記式：
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
により、皮膚感作性評価指標をｎＡＡ値として算出する。
工程（６）前記工程（５）におけるｎＡＡ値を、皮膚感作性物質（陽性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果及び非感作性物質（陰性対照物質）群について前記工程（１）から前記工程（５）をそれぞれ行った結果と比較し、陽性もしくは陰性対象物質と判定するための最適カットオフ値を求めて、そのカットオフ値を判定基準として被験物質の皮膚感作性の判定を行う。
【0013】
次に、本発明の方法の各工程について述べる。
【0014】
工程（１）：抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を用い、
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス及び前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルスで二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程は、本発明のアッセイのための細胞株の確立の工程である。
前記ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルス及び前記ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞生存率測定用レポーター遺伝子を挿入したレンチウイルスで二重に感染させたヒトケラチノサイト細胞株を提供する工程は、本発明のアッセイのための細胞株の確立の工程である。
【0015】
本発明に用いる二重ルシフェラーゼ系のヒトケラチノサイト細胞株は、ＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子（ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ））と細胞生存率測定用レポーター遺伝子（ＴＫ－Ｌｕｃ（ウミシイタケルシフェラーゼ））をそれぞれの配列を保有するレンチウイルスを作成し、ヒトケラチノサイトに二重に感染させた細胞株をスクリーニングすることにより安定発現株としたものを用いる。
【0016】
宿主細胞は、不死化正常ヒトケラチノサイトを使用する。本発明の好ましい態様において、例えば、ＰＨＫ １６－０ｂ（ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）細胞株を使用するが、これに限定されるものではない。
当該不死化正常ヒトケラチノサイト、ＰＨＫ １６－０ｂをＨＫＧＳ（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）サプリメントを添加したＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）中に５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下にて培養を行う。
当該不死化正常ヒトケラチノサイト、ＰＨＫ １６－０ｂをＨＫＧＳ（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）サプリメントを添加したＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）中に５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下にて培養を行う。
【0017】
本発明によるＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子を有するレンチウィルスベクター作製用プラスミドにおいて、下記の操作を行なう。
α２Ｕ－グロブリンプロモーター（ＡＵＧ）及び抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ：５’－ＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴ―３’）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子配列を、ｐＬＶＳＩＮに挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃを作製する。
α２Ｕ－グロブリンプロモーター（ＡＵＧ）及び抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ：５’－ＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴ―３’）によって発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子配列を、ｐＬＶＳＩＮに挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃを作製する。
【0018】
上記ＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子（ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ）は、ＡＵＧ－Ｌｕｃ配列を有するプラスミドを用いた公知の方法に基づき調製される。Ｔａｋｅｈｏｓｈｉ Ｍら、Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、第７７巻、第５号、第２７４－９頁（２００３年）が参照され、例えば、下記配列番号１に記載の配列：
及び配列番号２に記載の配列：
が挙げられ参照されるが、これに限定されるものではない。
【表1】
【表2】
【0019】
他方で、上記と同様の方法で、細胞生存率測定用レポーター遺伝子を有するレンチウィルスベクター作製用プラスミドの作製について、下記の操作を行なう。
ＴＫプロモーター及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ＴＫ－ｒＬｕｃ）をｐＬＶＳＩＮに挿入しｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃを作製する。
ＴＫプロモーター及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ＴＫ－ｒＬｕｃ）をｐＬＶＳＩＮに挿入しｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃを作製する。
【0020】
本発明の好ましい態様において使用される上記細胞生存率測定用レポーター遺伝子（ＴＫ－Ｌｕｃ）は、プロメガ社のｐＲＬ－ＴＫ Ｖｅｃｔｏｒ（製品番号：Ｅ２２４１）のＴＫプロモーター及びウミシイタケルシフェラーゼの配列を使用するが、これに限定されるものではない。
【0021】
本発明の好ましい態様において、レンチウイルスベクターは、例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ及びｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて作製するが、これに限定されるものではない。
【0022】
ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ又はピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃは、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション導入試薬（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて、接着性の細胞であるＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標）２９３Ｔ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）にｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃａｇｉｎｇ Ｍｉｘと同時遺伝子導入する。その後、５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において４８時間培養し、この培養液を収集する。そしてＤＩＳＭＩＣ－２５ＡＳフィルター（０．４４μｍ、東洋ろ紙株式会社、東京、日本）を用いて培養液をろ過し細胞残屑を除去し、このろ液をレンチウィルスベクターとして感染に使用するものとする。
【0023】
上記のＰＨＫ １６－０ｂは、ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ又はＴＫ－ｒＬｕｃを有するレンチウイルスベクターそれぞれに感染させた細胞は、不死化正常ヒトケラチノサイトＰＨＫ １６－０ｂが生存できない濃度の抗生物質、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド（インビボゲン社、カリフォルニア州、米国）及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）の存在下７日間培養し、安定発現株の特定を行う。
【0024】
作成したＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ及びＴＫ－ｒＬｕｃの安定発現株は、ＰＨＫ １６－０ｂが生存できない濃度の抗生物質、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド（インビボゲン社、カリフォルニア州、米国）及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）の存在下においても増殖可能な細胞と特定される。
【0025】
本発明の方法によるアッセイを行うために、本発明の細胞株は、取り扱い説明書及びその他の試薬とともにキットを構成し得る。よって本発明は、ＡＲＥ活性測定用レポーター遺伝子（ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ））及び細胞生存率測定用レポーター遺伝子（ＴＫ－ｒＬｕｃ（ウミシイタケルシフェラーゼ））を含む細胞株を含むキットもまた提供し得る。
【0026】
工程（２）：前記細胞株に被験物質を曝露させる工程は、例えば、以下の手技が挙げられるがこれに限定されるものではない。
被験物質は、溶媒に溶解し、細胞培養液を用いて適切な濃度に希釈する必要がある。例えば、被験物質を、２００ｍＭを最大濃度とし公比２において段階希釈し、そして細胞培養液を用いて５０倍に希釈する。
細胞は、９６穴マイクロプレート（＃１３６１０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）のウェルに、培地１００μＬ中にウェル当たり２００００個の細胞となるよう播種し、そして２４時間の前培養を行った。
上記の前培養の後、被験物質１００μＬを添加しそして２４時間培養する。
被験物質は、溶媒に溶解し、細胞培養液を用いて適切な濃度に希釈する必要がある。例えば、被験物質を、２００ｍＭを最大濃度とし公比２において段階希釈し、そして細胞培養液を用いて５０倍に希釈する。
細胞は、９６穴マイクロプレート（＃１３６１０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）のウェルに、培地１００μＬ中にウェル当たり２００００個の細胞となるよう播種し、そして２４時間の前培養を行った。
上記の前培養の後、被験物質１００μＬを添加しそして２４時間培養する。
【0027】
工程（３）：ホタルルシフェラーゼ活性を測定する工程は、例えば、以下の手技が挙げられるがこれに限定されるものではない。
培養液をウェルから除去し、そして５０μＬの第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）をウェルに添加し、試薬の添加１０分後の室温下での化学発光をプレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定する。
培養液をウェルから除去し、そして５０μＬの第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）をウェルに添加し、試薬の添加１０分後の室温下での化学発光をプレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定する。
【0028】
工程（４）：ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定する工程は、例えば、以下の手技が挙げられるがこれに限定されるものではない。
第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬添加後、５０μＬの第２のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ストップ及びＧｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）を同一ウェルに添加し、１０分後に室温下での化学発光を、プレートリーダーを用いて測定する。
第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬添加後、５０μＬの第２のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ストップ及びＧｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）を同一ウェルに添加し、１０分後に室温下での化学発光を、プレートリーダーを用いて測定する。
【0029】
工程（５）：ｎＡＡの算出工程
生細胞数により標準化したＲＬＵ値（ｎＲＬＵ）は、各ウェルのＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値を、同一ウェルの生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値で除すことにより算出される。本発明で用いる新規な評価パラメーター：生細胞数で標準化したＡＲＥ活性（ｎＡＡ）は、以下の通り算出される。
生細胞数により標準化したＲＬＵ値（ｎＲＬＵ）は、各ウェルのＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値を、同一ウェルの生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値で除すことにより算出される。本発明で用いる新規な評価パラメーター：生細胞数で標準化したＡＲＥ活性（ｎＡＡ）は、以下の通り算出される。
【0030】
本発明の試験結果を評価するにあたり、例えば、被験物質のｎＲＬＵは、
ｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
として求められるが、評価指標はこれに限定されるものではない。
ｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
として求められるが、評価指標はこれに限定されるものではない。
【0031】
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
【0032】
また、細胞生存率を、下記式を用いてウミシイタケルシフェラーゼ活性値を用いて算出する。
【0033】
細胞生存率（％）＝｛（被験物質中のｒＬｕｃのＲＬＵ）／（溶媒対照中のｒＬｕｃの平均ＲＬＵ）｝×１００
【0034】
工程（６）：陰性対照物物質の最適カットオフ値を求めて皮膚感作性の判定を行う。
感作性物質と非感作性物質との鑑別のための最適カットオフ値
アッセイを、各被験物質について３回行い、各アッセイの最大ｎＡＡ値を測定し、そして各被験物質の平均最大ｎＡＡ及び標準偏差（ＳＤ）を算出する。
例えば、後述の試験結果によれば、最適カットオフ値は、非感作性物質の最高平均ｎＡＡ＋２ＳＤを超え、ＬＬＮＡの結果及びヒトデータとの一致率が最も高い値として決定され得る。
そして、被験物質のｎＡＡがカットオフ値を超えた場合に、陽性と判定する。
感作性物質と非感作性物質との鑑別のための最適カットオフ値
アッセイを、各被験物質について３回行い、各アッセイの最大ｎＡＡ値を測定し、そして各被験物質の平均最大ｎＡＡ及び標準偏差（ＳＤ）を算出する。
例えば、後述の試験結果によれば、最適カットオフ値は、非感作性物質の最高平均ｎＡＡ＋２ＳＤを超え、ＬＬＮＡの結果及びヒトデータとの一致率が最も高い値として決定され得る。
そして、被験物質のｎＡＡがカットオフ値を超えた場合に、陽性と判定する。
【0035】
本発明の方法によるアッセイにより得られたｎＡＡ値の計算結果を後述の表２に纏める。その結果、表中の下から９物質、即ち、非感作性物質９物質のｎＡＡ値の最大値は０．８５乃至１．３２の範囲であり、そして感作性物質１９物質の値は１．７５乃至２６．４２の範囲であった。
【0036】
現在のＯＥＣＤ ＡＲＥ－Ｎｒｆ２ルシフェラーゼアッセイであるケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓは、ＷＳＴ－８アッセイ及びＭＴＴアッセイのようにミトコンドリア還元酵素の活性に基づく細胞毒性試験を使用しており、実際の細胞状態を反映し得なくても第１の用量設定目的のためにこれらを用いる。
【0037】
これに対し、本発明の方法は、本目的のために二重ルシフェラーゼアッセイ、即ち、ホタルルシフェラーゼ系及びウミシイタケルシフェラーゼ系を採用しており、ＡＲＥを介した転写活性の生細胞数による標準化のためにルシフェラーゼ系による細胞毒性試験を適用した。即ち、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の結果は、細胞の転写活性において化学物質の影響を受け、そしてこのアッセイの結果は、ＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介した転写活性における化学物質の実際の効果を反映し得るであろう。
本目的のために、発明者らは、新しいパラメーターｎＡＡを採用した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性系の細胞毒性試験を用いて測定した実際の細胞条件により標準化されたＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介した転写活性は、本アッセイ系における転写活性のある細胞の実際の転写活性を得ることができることが考えられるためである。
本目的のために、発明者らは、新しいパラメーターｎＡＡを採用した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性系の細胞毒性試験を用いて測定した実際の細胞条件により標準化されたＡＲＥ－Ｎｒｆ２を介した転写活性は、本アッセイ系における転写活性のある細胞の実際の転写活性を得ることができることが考えられるためである。
【0038】
本発明の方法によるｎＡＡの算出結果によれば、非感作性物質のｎＡＡ値の最大値は０．８５乃至１．３２の範囲であり、そして感作性物質の範囲は１．７５乃至２６．４２の範囲であった。これを用いて、非感作性物質と感作性物質を鑑別する最適カットオフ値を決定するために、ヒトデータ又はＬＬＮＡからの結果に対する本発明の方法によるアッセイ結果の一致率を算出し、そして、非感作性物質の最大ｎＡＡ＋２ＳＤを超える最小ｎＡＡを最適カットオフ値として決定した。
その結果、最適対象カットオフ値はｎＡＡ≧１．６と決定され、これは非感作性物質から得られた最大ｎＡＡ＋２ＳＤ（＝約１．５７）を超えるものである。一方、ＬＬＮＡ及びヒトデータに対する判定結果の一致率（％）は、それぞれ９６．４及び１００．０であった（表３）。
その結果、最適対象カットオフ値はｎＡＡ≧１．６と決定され、これは非感作性物質から得られた最大ｎＡＡ＋２ＳＤ（＝約１．５７）を超えるものである。一方、ＬＬＮＡ及びヒトデータに対する判定結果の一致率（％）は、それぞれ９６．４及び１００．０であった（表３）。
【0039】
本発明の方法、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓを用いた場合のＬＬＮＡ又はヒトデータに対する正確度（％）、感度（％）及び特異度（％）結果の比較においても、本発明による方法のアッセイ系は、ＬＬＮＡに対する正確度（％）、感度（％）及び特異度（％）はそれぞれ９６．４、９５．０及び１００．０であり、そしてヒトデータに対するものはすべて１００と良好である。
【0040】
本発明の方法によれば、ケラチノセンス（登録商標）又はＬｕＳｅｎｓにおいて偽陰性であった化学物質である安息香酸フェニルにおいても、明白な陽性の結果が得られ、そしてＬｕＳｅｎｓにおいて偽陽性であったサリチル酸メチルにおいて、ＡＲＥを介した転写活性、ｎＡＡを用いることにより陰性の結果が得られた（図２及び３）。さらに、二重ルシフェラーゼ系レポーター遺伝子アッセイ（Ｍｅｒｔｌら、非特許文献２）に報告された偽陰性のメチルブロモグルタロニトリルもまた、本発明の方法において陽性の結果を得られた（図４乃至７）。
【0041】
これらの結果は、化学物質の皮膚感作性の予測精度に関し、本発明の方法が、他の３つの試験法と比較して優れた改善を達成できたことを示している。
【0042】
また、本発明の方法は、二重ルシフェラーゼアッセイ系を用いることにより、ＡＲＥを介した転写活性及び細胞生存率を同時測定可能になったことから予備試験が不要となり、さらに化学物質の曝露時間も半分に短縮されたことから、他の２つのＯＥＣＤ試験方法、ケラチノセンス（登録商標）又はＬｕＳｅｎｓよりも簡便で短時間の操作が可能であることが示された。
さらにまた、本試験方法は、血清フリーのＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地を使用するため、アッセイ系はまた動物福祉上の観点からも利点を有する。このことはまた、比較的反応性の高い化学物質、とりわけ血清タンパク質との反応により偽陰性を示す物質の適正な評価に寄与できる。（Ｏｔａｋｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，第３９３巻、第９－１４頁（２０１８年））。
さらにまた、本試験方法は、血清フリーのＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地を使用するため、アッセイ系はまた動物福祉上の観点からも利点を有する。このことはまた、比較的反応性の高い化学物質、とりわけ血清タンパク質との反応により偽陰性を示す物質の適正な評価に寄与できる。（Ｏｔａｋｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，第３９３巻、第９－１４頁（２０１８年））。
【0043】
非特許文献１の方法は、一過性発現系のために実験の度に化学薬品による遺伝子導入が必要となるのに対し、本発明の方法は、ウイルスをゲノム上に安定的に組み込んでいるためその都度の遺伝子導入が不要となる。
また、非特許文献１の方法では遺伝子導入に用いる化学薬品は細胞毒性があるため、遺伝子導入のために多くの細胞を用意する必要があるが、本発明の方法においては試験に必要な細胞数のみで良い。
さらにまた、非特許文献１においては遺伝子導入効率が変わるためにデータのばらつきが生じる点に対し、本発明の方法は安定したデータの取得が可能である。データの安定性については上述の通りである。
そして、本発明の方法によれば、ｎＡＡによる高精度な皮膚感作性評価が可能となり、従来の方法で偽陰性、偽陽性であった化学物質も正確に判定可能となった。
また、非特許文献１の方法では遺伝子導入に用いる化学薬品は細胞毒性があるため、遺伝子導入のために多くの細胞を用意する必要があるが、本発明の方法においては試験に必要な細胞数のみで良い。
さらにまた、非特許文献１においては遺伝子導入効率が変わるためにデータのばらつきが生じる点に対し、本発明の方法は安定したデータの取得が可能である。データの安定性については上述の通りである。
そして、本発明の方法によれば、ｎＡＡによる高精度な皮膚感作性評価が可能となり、従来の方法で偽陰性、偽陽性であった化学物質も正確に判定可能となった。
【発明の効果】
【0044】
本発明の方法によれば、さらにｎＡＡの分類基準の最適化のために、金属、混合物、医薬品及び植物抽出物を含む広範囲の化学物質への適応及び再現性を確認することで種々の試験に適用可能であり、結論として、本発明による新規のＡＲＥ－Ｎｒｆ２系皮膚感作性スクリーニングアッセイは、皮膚感作性ＡＯＰのＫＥ－２におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚感作性試験法の簡便で高精度な方法を提供可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】本発明の皮膚感作試験法による桂皮アルデヒドの細胞毒性試験の結果を示す図である（図中、白丸はミトコンドリア還元酵素の活性を指標とした細胞生存率を表し、黒丸はｒＬｕｃの活性を指標とした細胞生存率を表す。）。
【図2】本発明の皮膚感作試験法による安息香酸フェニルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸は誘導倍率を表す。）。
【図3】本発明の皮膚感作試験法による安息香酸フェニルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸はｎＡＡを表す。）。
【図4】本発明の皮膚感作試験法によるサリチル酸メチルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸は誘導倍率を表す。）。
【図5】本発明の皮膚感作試験法によるサリチル酸メチルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸はｎＡＡを表す。）。
【図6】本発明の皮膚感作試験法によるメチルジブロモグルタロニトリルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸は誘導倍率を表す。）。
【図7】本発明の皮膚感作試験法によるメチルジブロモグルタロニトリルの試験結果を示す図である（図中、白丸は細胞生存率を表し、黒丸はｎＡＡを表す。）。
【実施例】
【0046】
材料と方法
本発明の試験に使用した化学物質（以下、被験物質とする）を、表１に一覧する。下記の皮膚感作性物質１９物質及び非感作性物質９物質を含む全２８の化学物質を、各試験方法の評価実験に用いた。試験したすべての化学物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）に溶解した。
本発明の試験に使用した化学物質（以下、被験物質とする）を、表１に一覧する。下記の皮膚感作性物質１９物質及び非感作性物質９物質を含む全２８の化学物質を、各試験方法の評価実験に用いた。試験したすべての化学物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）に溶解した。
【0047】
表１．試験に用いた化学物質一覧．
P: 陽性， N: 陰性
1: 東京化成工業株式会社., 2: 富士フイルム和光純薬株式会社, 3:DB-ALM, 2013, 4: ICCVAM, 2009, 5: Tzutzuy et al., 2014
【表3】
1: 東京化成工業株式会社., 2: 富士フイルム和光純薬株式会社, 3:DB-ALM, 2013, 4: ICCVAM, 2009, 5: Tzutzuy et al., 2014
【0048】
（実施例１）
本発明のアッセイのための細胞株の樹立
不死化正常ヒトケラチノサイト、ＰＨＫ １６－０ｂ（ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）細胞株を、宿主細胞として使用した。当該細胞をＨＫＧＳ（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）サプリメントを添加したＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）中に５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下にて培養した。
α２Ｕ－グロブリンプロモーター（配列番号２）（武吉ら、２００３年）及び抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ：５’－ＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴ―３’）により発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子配列をｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃを作製した。
ＴＫプロモーター及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｒＬｕｃ）をｐＬＶＳＩＮに挿入しｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃを作製した。
本発明のアッセイのための細胞株の樹立
不死化正常ヒトケラチノサイト、ＰＨＫ １６－０ｂ（ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）細胞株を、宿主細胞として使用した。当該細胞をＨＫＧＳ（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）サプリメントを添加したＥｐｉ－Ｌｉｆｅ培地（サーモフィッシャーサイエンスＫ．Ｋ．マサチューセッツ州、米国）中に５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下にて培養した。
α２Ｕ－グロブリンプロモーター（配列番号２）（武吉ら、２００３年）及び抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ：５’－ＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴ―３’）により発現が制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子配列をｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃを作製した。
ＴＫプロモーター及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｒＬｕｃ）をｐＬＶＳＩＮに挿入しｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃを作製した。
【0049】
レンチウイルスベクターを次の方法で作製した。
ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ又はｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃのそれぞれについてを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション試薬（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて、接着性の細胞であるＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標）２９３Ｔ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に、ｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）と同時に遺伝子導入し、５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において４８時間培養した。次に、この培養液を収集しそしてＤＩＳＭＩＣ－２５ＡＳフィルター（０．４４μｍ、東洋ろ紙株式会社、東京、日本）を用いてろ過し細胞残屑を除去し、ろ液を感染に使用するレンチウイルスベクターとして得た。
ｐＬＶＳＩＮ－ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ又はｐＬＶＳＩＮ－ＴＫ－ｒＬｕｃのそれぞれについてを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション試薬（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて、接着性の細胞であるＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標）２９３Ｔ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に、ｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）と同時に遺伝子導入し、５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において４８時間培養した。次に、この培養液を収集しそしてＤＩＳＭＩＣ－２５ＡＳフィルター（０．４４μｍ、東洋ろ紙株式会社、東京、日本）を用いてろ過し細胞残屑を除去し、ろ液を感染に使用するレンチウイルスベクターとして得た。
【0050】
上記のＰＨＫ １６－０ｂを、ＡＲＥ－ＡＵＧ－Ｌｕｃ又はＴＫ－ｒＬｕｃを有するレンチウイルスベクターそれぞれに感染させ、そして、感染させた細胞を５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド（インビボゲン社、カリフォルニア州、米国）及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）の存在下７日間培養し、生存し増殖した細胞を次のアッセイに用いた。
【0051】
（実施例２）
本発明のアッセイ
全ての被験物質を、２００ｍＭを最大とし、公比２において段階希釈し、その後細胞培養液を用いて５０倍希釈した。
細胞を、９６穴マイクロプレート（＃１３６１０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）のウェルに、培地１００μＬにウェル当たり２００００個の細胞となるよう播種し、そして５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において２４時間の前培養を行った。
前培養の後、被験物質１００μＬを添加しそして５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において２４時間培養した。
培養液をウェルから除去し、５０μＬの第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）をウェルに添加し、試薬の添加１０分後の室温下における化学発光をプレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定し、ホタルルシフェラーゼの活性を測定した。第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬添加後、５０μＬの第２のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ストップ及びＧｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）を同一ウェルに添加し、１０分後に室温下における化学発光を、プレートリーダーを用いて測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。
本発明のアッセイ
全ての被験物質を、２００ｍＭを最大とし、公比２において段階希釈し、その後細胞培養液を用いて５０倍希釈した。
細胞を、９６穴マイクロプレート（＃１３６１０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）のウェルに、培地１００μＬにウェル当たり２００００個の細胞となるよう播種し、そして５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において２４時間の前培養を行った。
前培養の後、被験物質１００μＬを添加しそして５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下において２４時間培養した。
培養液をウェルから除去し、５０μＬの第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）をウェルに添加し、試薬の添加１０分後の室温下における化学発光をプレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定し、ホタルルシフェラーゼの活性を測定した。第１のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬添加後、５０μＬの第２のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ストップ及びＧｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社、ウィスコンシン州、米国）を同一ウェルに添加し、１０分後に室温下における化学発光を、プレートリーダーを用いて測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。
【0052】
生細胞数により標準化したＲＬＵ値（ｎＲＬＵ）は、各ウェルのＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値を、同一ウェルの生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性のＲＬＵ値で除すことにより算出される。
【0053】
被験物質のｎＲＬＵ＝（ＡＲＥ活性を示すホタルルシフェラーゼ活性）／（生細胞数を示すウミシイタケルシフェラーゼ活性）
として求めた。
として求めた。
【0054】
そして、生細胞数で標準化したＡＲＥ活性（ｎＡＡ）を、下記式を用いて算出した。
【0055】
ｎＡＡ＝（被験物質のｎＲＬＵ）／（溶媒対照の平均ｎＲＬＵ）
【0056】
誘導倍率を、下記式を用いてホタルルシフェラーゼ活性の算出に用いた。
【0057】
誘導倍率＝（被験物質のＬｕｃのＲＬＵ）／（溶媒対照のＬｕｃの平均ＲＬＵ）
【0058】
また、細胞生存率を、下記式を用いてウミシイタケルシフェラーゼ活性値を用いて算出した。
【0059】
細胞生存率（％）＝｛（被験物質中のｒＬｕｃのＲＬＵ）／（溶媒対照中のｒＬｕｃの平均ＲＬＵ）｝×１００
【0060】
アッセイを、各被験物質について３回行い、各アッセイの最大ｎＡＡ値を測定し、そして各被験物質の平均最大ｎＡＡ及び標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【0061】
感作性物質と非感作性物質との鑑別のための最適カットオフ値
最適カットオフ値は、上述の試験方法による結果からは、非感作性物質の最高平均ｎＡＡ＋２ＳＤを超える最も高い補正後の結果（％）の値を以下の通り決定した。
最適カットオフ値は、上述の試験方法による結果からは、非感作性物質の最高平均ｎＡＡ＋２ＳＤを超える最も高い補正後の結果（％）の値を以下の通り決定した。
【0062】
本発明のアッセイの結果
本発明のアッセイにおけるｎＡＡ値の計算結果を表２に纏める。その結果、表中の下から９物質、即ち、非感作性物質９物質のｎＡＡ値の最大値は０．８５乃至１．３２の範囲であり、そして感作性物質１９物質の値は１．７５乃至２６．４２の範囲であった。
本発明のアッセイにおけるｎＡＡ値の計算結果を表２に纏める。その結果、表中の下から９物質、即ち、非感作性物質９物質のｎＡＡ値の最大値は０．８５乃至１．３２の範囲であり、そして感作性物質１９物質の値は１．７５乃至２６．４２の範囲であった。
【0063】
表２． 本発明のアッセイの結果の概要．
【表4】
【0064】
ｎＡＡの暫定カットオフ値を１．２から０．１きざみで２．０まで設定し、各暫定カットオフ値を用いて得た感作性判定結果と、ＬＬＮＡの結果及びヒトデータに対する一致率を表３に示す。
【0065】
表３．本発明のアッセイの最適カットオフ値の決定．
太字：最適カットオフ基準
【表5】
【0066】
表３のとおり、非感作性物質と感作性物質を鑑別するための最適な対象カットオフ値を１．６と決定した。これは、非感作性物質のｎＡＡ（１．３２）＋２ＳＤ（＝１．５７）を超える値である。ヒトデータ及びＬＬＮＡの結果に対して、それぞれ１００．０及び９６．４の一致率（％）を示した。
【0067】
比較例
ミトコンドリア還元酵素活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づく細胞毒性試験の比較
ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄの陽性対照物質である桂皮アルデヒド（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）を、ケラチノセンス（登録商標）アッセイ及びＬｕＳｅｎｓにおいて採用されるミトコンドリア還元酵素活性に基づく細胞毒性試験をＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄに基づき行い、その結果を、同物質のｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験と比較した。
この試験において、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８、同仁堂社、大阪、日本）を用いたＷＳＴ－８アッセイを、従来のＭＴＴアッセイと同様の原理を用いる細胞毒性テストに基づくミトコンドリ還元酵素活性として行った。
桂皮アルデヒドを、２０ｍＭを最大とし、公比２において段階希釈し、そして細胞培養液を用いて５０倍希釈した。細胞を、平板のウェル当たり２００００個の細胞となるよう、培地１００μＬ中に播種し、そして２４時間の前培養を行った。前培養の後、被験被験物質１００μＬを添加しそして２４時間培養した。
培養終了後に、培養液を各ウェルから除去し、そして次に細胞培養液で５倍に希釈したＣＣＫ－８を各ウェル添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下で１時間インキュベーションしたのち、４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定した。細胞生存率は、下記式を用いて算出した。
ミトコンドリア還元酵素活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づく細胞毒性試験の比較
ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄの陽性対照物質である桂皮アルデヒド（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）を、ケラチノセンス（登録商標）アッセイ及びＬｕＳｅｎｓにおいて採用されるミトコンドリア還元酵素活性に基づく細胞毒性試験をＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄに基づき行い、その結果を、同物質のｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験と比較した。
この試験において、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８、同仁堂社、大阪、日本）を用いたＷＳＴ－８アッセイを、従来のＭＴＴアッセイと同様の原理を用いる細胞毒性テストに基づくミトコンドリ還元酵素活性として行った。
桂皮アルデヒドを、２０ｍＭを最大とし、公比２において段階希釈し、そして細胞培養液を用いて５０倍希釈した。細胞を、平板のウェル当たり２００００個の細胞となるよう、培地１００μＬ中に播種し、そして２４時間の前培養を行った。前培養の後、被験被験物質１００μＬを添加しそして２４時間培養した。
培養終了後に、培養液を各ウェルから除去し、そして次に細胞培養液で５倍に希釈したＣＣＫ－８を各ウェル添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃の加湿環境下で１時間インキュベーションしたのち、４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダー（ＡＲＶＯ Ｘ２、パーキンエルマー社、ウォルサム、米国）を用いて測定した。細胞生存率は、下記式を用いて算出した。
【0068】
細胞生存率（％）＝（被験ウェルの吸光度）／（溶媒対照の平均吸光度）×１００
【0069】
その後、ミトコンドリア還元酵素活性に基づく細胞毒性試験の結果を本発明による方法において言及したｒＬｕｃに基づくアッセイの結果と比較した。ＩＣ５０値を、統計ソフトウエア（グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ）バージョン６．０２、グラフパッドソフトウエア社、カルフォルニア州、米国）を用いて計算した。
【0070】
＜結果＞
ミトコンドリア還元酵素活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づく細胞毒性試験の比較
ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄの陽性対照物質桂皮アルデヒドを、ＷＳＴ－８アッセイを用いた細胞毒性試験及び、ｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験に供し、両試験法の結果を比較し、図１に示す。ｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験において、この被験物質のＩＣ５０値を６１．９μＭと算出され、そして２００μＭにおけるこの細胞生存率は０．９％であった。しかし、ＷＳＴ－８アッセイにおけるＩＣ５０値は、２００μＭにおけるこの細胞生存率は＞５０％であったため、２００μＭより高く評価された。
ミトコンドリア還元酵素活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づく細胞毒性試験の比較
ＯＥＣＤ ＴＧ４４２Ｄの陽性対照物質桂皮アルデヒドを、ＷＳＴ－８アッセイを用いた細胞毒性試験及び、ｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験に供し、両試験法の結果を比較し、図１に示す。ｒＬｕｃの転写活性に基づく細胞毒性試験において、この被験物質のＩＣ５０値を６１．９μＭと算出され、そして２００μＭにおけるこの細胞生存率は０．９％であった。しかし、ＷＳＴ－８アッセイにおけるＩＣ５０値は、２００μＭにおけるこの細胞生存率は＞５０％であったため、２００μＭより高く評価された。
【0071】
本発明の方法によるアッセイ、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの予測精度
本発明の方法によるアッセイの感度（ＬＬＮＡ又はヒトデータにおける陽性に対する本発明の方法によるアッセイにおける陽性結果の百分率）、特異度（ＬＬＮＡ又はヒトデータにおける陰性に対する本発明の方法によるアッセイにおける陰性結果の百分率）、及び正確度（補正後の予測値の総合的な百分率）を、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）統計量（Ｃｏｏｐｅｒら、１９７９年）に基づき算出した。ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの性能パラメーターも同様に算出した。
本発明の方法によるアッセイの感度（ＬＬＮＡ又はヒトデータにおける陽性に対する本発明の方法によるアッセイにおける陽性結果の百分率）、特異度（ＬＬＮＡ又はヒトデータにおける陰性に対する本発明の方法によるアッセイにおける陰性結果の百分率）、及び正確度（補正後の予測値の総合的な百分率）を、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）統計量（Ｃｏｏｐｅｒら、１９７９年）に基づき算出した。ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの性能パラメーターも同様に算出した。
【0072】
本発明の方法によるアッセイ、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓにおいて得られた結果を表４に一覧し、そして、本発明の方法によるアッセイ、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓのＬＬＮＡ又はヒトでの試験結果に対する正確度、感度及び特異度の計算結果を表５及び表６に一覧する。
【0073】
表４．本発明による方法、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓによる結果の概要．
P:陽性，N: 陰性
1: DB-ALM, 2013, 2: Tzutzuy et al., 2014
【表6】
1: DB-ALM, 2013, 2: Tzutzuy et al., 2014
【0074】
表５．本発明による方法、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの予測精度の比較．
【表7】
【0075】
表６．本発明による方法、ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの予測精度の比較．
【表8】
【0076】
表５及び表６から、本発明に係る方法のＬＬＮＡに対する正確度、感度及び特異度は、それぞれ９６．４％、９５．０％及び１００．０％と算出され良好な結果を得た。
ケラチノセンス（登録商標）のＬＬＮＡに対するものは、それぞれ８９．３％、８５．０％及び１００．０％と算出され、そしてヒトデータに対するものは、それぞれ９２．２％、８９．５％及び１００．０％と算出された。
ＬｕＳｅｎｓのＬＬＮＡに対するものは、それぞれ８９．３％、９０．０％及び８７．５％と算出され、そして、ヒトデータに対するものは、それぞれ９２．９％、９４．７％及び８８．９％と算出された。
ケラチノセンス（登録商標）のＬＬＮＡに対するものは、それぞれ８９．３％、８５．０％及び１００．０％と算出され、そしてヒトデータに対するものは、それぞれ９２．２％、８９．５％及び１００．０％と算出された。
ＬｕＳｅｎｓのＬＬＮＡに対するものは、それぞれ８９．３％、９０．０％及び８７．５％と算出され、そして、ヒトデータに対するものは、それぞれ９２．９％、９４．７％及び８８．９％と算出された。
【0077】
本発明の試験の結果、本発明の方法は、正確度（％）、感度（％）及び特異度（％）において、上記のとおり優れた方法であることが示された。
また、本発明の方法では安息香酸フェニル及びオイゲノールの結果は明らかに陽性と示された（これらは、ケラチノセンス（登録商標）又はＬｕＳｅｎｓにおいて偽陰性であった。表４参照）。
ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの両試験法において偽陰性となった安息香酸フェニルは、誘導倍率による評価では、細胞生存率が減少するにつれ誘導倍率も減少し偽陰性となったが、生細胞数で補正したｎＡＡでは濃度依存的な増加が認められ正しく陽性と示された。
これらの事実は、予測精度に関し、従来の同様の方法と比較して、ｎＡＡを用いて達成されたより良い改善を示している。
また、本発明の方法では安息香酸フェニル及びオイゲノールの結果は明らかに陽性と示された（これらは、ケラチノセンス（登録商標）又はＬｕＳｅｎｓにおいて偽陰性であった。表４参照）。
ケラチノセンス（登録商標）及びＬｕＳｅｎｓの両試験法において偽陰性となった安息香酸フェニルは、誘導倍率による評価では、細胞生存率が減少するにつれ誘導倍率も減少し偽陰性となったが、生細胞数で補正したｎＡＡでは濃度依存的な増加が認められ正しく陽性と示された。
これらの事実は、予測精度に関し、従来の同様の方法と比較して、ｎＡＡを用いて達成されたより良い改善を示している。
【0078】
結果より、ミトコンドリア還元酵素活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づく細胞毒性試験結果の比較において、桂皮アルデヒドのＩＣ５０値を６１．９μＭと算出し、そして２００μＭにおける細胞生存率を細胞毒性試験に基づくｒＬｕｃ活性において０．９％とした。
しかしながら、ＷＳＴ－８アッセイにおけるＩＣ５０値は２００μＭ以上と評価された（図１）。
以上から、既存のアッセイ法では５０％以上の細胞生存率をクリアしている２００μＭの用量ではｒＬｕｃは殆ど活性が認められない結果となった。
同じエンドポイントであるＡＲＥ依存性のレポーター遺伝子においても同様の影響を及ぼしている可能性が考えられ、ｒＬｕｃを指標とした細胞毒性評価の方が、化学物質がＡＲＥ依存性の遺伝子発現に与える影響を正しく評価可能であると考えられた。
しかしながら、ＷＳＴ－８アッセイにおけるＩＣ５０値は２００μＭ以上と評価された（図１）。
以上から、既存のアッセイ法では５０％以上の細胞生存率をクリアしている２００μＭの用量ではｒＬｕｃは殆ど活性が認められない結果となった。
同じエンドポイントであるＡＲＥ依存性のレポーター遺伝子においても同様の影響を及ぼしている可能性が考えられ、ｒＬｕｃを指標とした細胞毒性評価の方が、化学物質がＡＲＥ依存性の遺伝子発現に与える影響を正しく評価可能であると考えられた。
【0079】
本明細書中の参考文献は以下を参照のこと。
・Cooper,J.A. Saracci,R. and Cole,P.(1979).Describing the validity of carcinogen screening tests, Br. J. Cancer. 39,87.
・DB-ALM(INVITTOX).(2013).Protocol 155.
・Mertl E, Riegel E, Glück N, Ettenberger-Bornberg G, Lin G, Auer S, Haller M, Wlodarczyk A, Steurer C, Kirchnawy C, Czerny T.(2019). A dual luciferase assay for evaluation of skin sensitizing potential of medical devices. Molecular Biology Reports. 46,5089-5102.
・European Union(EU).(2013). Ban on Animal Testing.
・Kinber,I., Basketter,D.A. Gerberick,G.F., Ryan,C.A., and Dearman,R.J., 2011. Chemical allergy: Translating biology into hazard Characterization. Toxicol. Sci. 120,238-268.
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【産業上の利用可能性】
【0080】
本発発明の方法は、種々の化粧品、医薬品、生活用品その他の製品に対する皮膚感作性試験に適用可能であり、より簡便で高精度な方法を提供可能とするものである。
【0081】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】