▶ アソシアシオン セントロ デ インベスティガシオン コオペラティバ エン ビオマテリアレス−セイセ ビオマグネの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-23
(45)【発行日】2023-01-31
(54)【発明の名称】金属ナノクラスター足場
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230124BHJP
B82Y 5/00 20110101ALI20230124BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230124BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230124BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20230124BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
B82Y5/00
C07K19/00
C12N15/63 Z
C07K14/00
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019572775
(86)(22)【出願日】2018-07-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-10-22
(86)【国際出願番号】 EP2018068710
(87)【国際公開番号】W WO2019011938
(87)【国際公開日】2019-01-17
【審査請求日】2021-05-17
(31)【優先権主張番号】17382451.7
(32)【優先日】2017-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】519463879
【氏名又は名称】アソシアシオン セントロ デ インベスティガシオン コオペラティバ エン ビオマテリアレス－セイセ ビオマグネ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ロペス コルタハレナ，アイツィベル
(72)【発明者】
【氏名】アイレス トラポート，アントニオ
【審査官】木原 啓一郎
(56)【参考文献】
【文献】PNAS，2005年03月22日，Vol. 102，pp. 5014-5019, supporting information
【文献】Protein Engineering, Design & Selection，2004年05月27日，Vol. 17，pp. 399-409
【文献】Structure，2003年05月06日，Vol. 11，pp. 497-508
【文献】BIOMACROMOLECULES，2015年11月04日，Vol. 16，pp. 3836-3844
【文献】RSC ADVANCES，2014年12月05日，Vol. 5，pp. 2062-2069
【文献】COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES，2016年01月22日，Vol. 141，pp. 93-101
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）のタンパク質又はその塩を含む金属ナノクラスター足場であって、ＷnＺpＷq （Ｉ）
ｎ及びｑは、１から１０の値を有する整数を表し、且つｐは、１から１０の値を有する整数を表し、ただし、ｎ＋ｐ＋ｑは、３以上であり、
Ｗは、配列番号３７の配列ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳを含むペプチド又はその塩であり、
Ｚは、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、９７、９９、１１９、１２１、又は１４７の配列からなるペプチド又はその塩である、
金属ナノクラスター足場。
【請求項2】
一般式（Ｉ）のｎ及びｑが１である、請求項１に記載の金属ナノクラスター足場。
【請求項3】
一般式（Ｉ）のタンパク質が、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１５５、配列番号１５７、及び配列番号１５９からなる群から選択される、請求項１に記載の金属ナノクラスター足場。
【請求項4】
ペプチド、ナノ粒子、核酸、無機分子、有機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体、抗原、タグペプチド、ＭＲＩコントラスト剤、ＰＥＴコントラスト剤、配位金属コントラスト剤、及びそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるエレメントに結合される、請求項１から３のいずれか１項に記載の金属ナノクラスター足場。
【請求項5】
金属が、銅、金、銀、ニッケル、亜鉛、チタン、クロム、鉄、コバルト、パラジウム、カドミウム、ルテニウム、ロジウム、イリジウム、白金、又はそれらの組合せを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の金属ナノクラスター足場。
【請求項6】
請求項１から５のいずれか１項に記載の金属ナノクラスター足場をコードする核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本出願に至ったプロジェクトは、欧州連合（European Union）のホライゾン（Horizon）２０２０研究・革新プログラムの下で欧州研究会議（European Research Council）（ERC）から資金援助を受けた（助成金契約第６４８０７１号）。
本出願に至ったプロジェクトは、欧州連合（European Union）のホライゾン（Horizon）２０２０研究・革新プログラムの下で欧州研究会議（European Research Council）（ERC）から資金援助を受けた（助成金契約第６４８０７１号）。
【0002】
本出願は、２０１７年７月１１日出願の欧州特許出願第１７３８２４５１．７号に基づく利益を主張する。本発明は、一般的には、短鎖ペプチド配列により安定化された金属原子ナノクラスターの分野に関する。特定的には、本発明は、とりわけ、こうした短鎖ペプチド配列、さらにはそれを含むナノクラスター、こうしたナノクラスターの調製プロセス、及びその使用を提供する。
【背景技術】
【0003】
背景技術
金属ナノクラスター（ＮＣ）は、バルク金属や古典的金属ナノ粒子とは実質的に異なるユニークな性質があるため、近年とくに注目されてきた。
金属ナノクラスター（ＮＣ）は、バルク金属や古典的金属ナノ粒子とは実質的に異なるユニークな性質があるため、近年とくに注目されてきた。
【0004】
金属ＮＣは、数個から何百個もの金属原子からなる２ｎｍ未満のサイズを有する小さな金属原子アセンブリーである。貴金属ＮＣは、強い量子閉じ込め効果に起因して離散したサイズチューナブル電子遷移及び強い蛍光発光を示す。とりわけ、金属原子の電子がかかる小さな分子寸法及び特別な離散エネルギーレベルに閉じ込められるという事実に起因して、金属ＮＣは、強いフォトルミネセンス、優れた光安定性、良好な生体適合性、及びサブナノメートルサイズをはじめとする特別な光学的、電子的、及び化学的性質を呈する。それらは、紫外から近赤外の領域にわたり蛍光を示す。金属ＮＣは、センサーとして（例えば、温度及びｐＨに対して）、バイオ分子、タンパク質、核酸、及び金属イオンの検出においてバイオイメージングツールとして、とりわけ薬剤送達システムとして使用されてきた（Qu X et al. 2015, Li J et al. 2014 and Shang L et al. 2011を参照されたい）。
【0005】
これまで、金（Ａｕ）及び銀（Ａｇ）のＮＣを開発するためにかなりの努力がなされてきた。それとは対照的に、銅（Ｃｕ）ＮＣの合成に関する報告が依然として乏しいのは、ごく小さな粒子の調製が困難であるうえに（例えば、Huang H et al. 2014では、銅ＮＣの直径は１．７ｎｍである）酸化しやすいからである。生物学的用途ではナノクラスターは水性媒体中で安定でなければならないので、後者が関連する。
【0006】
特定のデンドリマー、低分子、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質などの分子を組み込むことにより金属ＮＣの安定化が可能であると報告されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、パパイン、ヒトトランスフェリン、リゾチーム、トリプシン、ペプシン、インスリン、ペルオキシダーゼなどのタンパク質は、金属ＮＣの調製に利用されてきた（例えば、Xie J et al. 2009, Huang H et al. 2014 and Li J et al. 2014を参照されたい）。それにもかかわらず、通常使用される方法は、タンパク質の二次又は三次構造の変性を引き起こして前記タンパク質の機能に影響を及ぼす。代替的に、金属ＮＣの合成及び安定化のために鋳型として特定の配列モチーフ繰返しを有するタンパク質の使用が提案されており、例えば、コンセンサステトラトリコペプチドリピート（ＣＴＰＲ）モジュールの３４アミノ酸ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフ（D’Andrea L et al. 2003）は、ある特定の安定性を付与すると思われることから金ＮＣ形成に有用であるとして当該技術の現状でも開示されている（Couleaud P et al. 2015）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
努力がなされたにもかかわらず、タンパク質鋳型がその生物学的機能性を維持した状態で生物学的用途に使用される多種多様な金属と併用可能な小さな安定した金属ナノクラスターを調製するための足場として有用なタンパク質鋳型の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明の概要
本発明者らは、効率的な足場として有用なタンパク質鋳型を提供するＣＴＰＲ変異モチーフを作製した。これは、タンパク質鋳型の生物学的性質を保持しつつ、より高い蛍光強度、安定性（とくに光安定性）、及び細胞への内在化能を有するＮＣを提供する。
本発明者らは、効率的な足場として有用なタンパク質鋳型を提供するＣＴＰＲ変異モチーフを作製した。これは、タンパク質鋳型の生物学的性質を保持しつつ、より高い蛍光強度、安定性（とくに光安定性）、及び細胞への内在化能を有するＮＣを提供する。
【0009】
特定的には、驚くべきことに、ＣＴＰＲの領域の配列番号１９の配列の特定のアミノ酸残基をヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）又はシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）で置き換えた場合、顕著に安定したＣｕＮＣ、ＡｕＮＣ、及びＡｇＮＣの合成が達成されることを、本発明者らは見いだした（以下の実施例）。
【0010】
ＣＴＰＲの領域の配列番号１９の配列の特定の位置をグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）で置き換えることによっても、Ｈｉｓ又はＣｙｓを用いて得られた結果を得ることが可能であることを、本発明者らは見いだした。これは、これらの４種のアミノ酸（すなわち、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）が金属イオンに配位するからである。
【0011】
こうした変異モチーフをタンパク質に組み込んだ場合、組込みがタンパク質の活性に悪影響を及ぼさないことも、本発明者らは見いだした。タンパク質がＮＣを安定化させる場合、同一のリガンド親和性値が維持されるので（解離定数（Ｋｄ）により示唆される）、タンパク質の特異的なリガンド結合活性又は認識活性は保存された。したがって、得られたタンパク質さらにはナノクラスターはいずれも、それらのそれぞれの活性を示した。
【0012】
そのため、第１の態様では、本発明は、以下の配列番号１：
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表す）
の配列又はその塩からなるアミノ酸配列を提供する。
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表す）
の配列又はその塩からなるアミノ酸配列を提供する。
【0013】
さらなる態様では、本発明は、以下の配列番号１：
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、
－Ｘ１からＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表し、
－Ｘ２がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ３はＮであり、且つ
－Ｘ３がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ２はＹである）
の配列からなるアミノ酸配列又はその塩を提供する。
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、
－Ｘ１からＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表し、
－Ｘ２がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ３はＮであり、且つ
－Ｘ３がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ２はＹである）
の配列からなるアミノ酸配列又はその塩を提供する。
【0014】
理論に拘束されるものではないが、金属と本発明のペプチド又はタンパク質との結合（カップリング）は、以上に定義された残基Ｘ１～６を介して行われ、これにより、得られる金属ナノクラスターに驚くべき安定化効果が付与されると、本発明者らは考えている。
【0015】
第２の態様では、本発明は、以下の式（Ｉ）：
Ｚ－（Ｂ）ｎ－Ｆ－（Ｇ）ｍ （Ｉ）
（式中、
ｎ及びｍは、０又は１であり、
Ｚは、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列を表し、ただし、Ｘ１がＣであるとき、Ｘ４は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、又はＮであり、
Ｂは、リンカーを表し、
Ｆは、αヘリックス二次モチーフを有するアミノ酸配列であり、且つ
Ｇは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列である）
のペプチド又はその塩を提供する。
Ｚ－（Ｂ）ｎ－Ｆ－（Ｇ）ｍ （Ｉ）
（式中、
ｎ及びｍは、０又は１であり、
Ｚは、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列を表し、ただし、Ｘ１がＣであるとき、Ｘ４は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、又はＮであり、
Ｂは、リンカーを表し、
Ｆは、αヘリックス二次モチーフを有するアミノ酸配列であり、且つ
Ｇは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列である）
のペプチド又はその塩を提供する。
【0016】
第３の態様では、本発明は、以下の一般式（ＩＩ）：
ＷｎＺｐＷｑ （ＩＩ）
（式中、
ｎ及びｑは、０から１０の値を有する整数を表し、且つｐは、１から１０の値を有する整数を表し、ただし、ｎ＋ｐ＋ｑは、２以上であり、
Ｗは、配列番号３７の配列ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳを含むペプチドであり、且つ
Ｚは、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチドを含むアミノ酸配列である）
のタンパク質又はその塩を提供する。
ＷｎＺｐＷｑ （ＩＩ）
（式中、
ｎ及びｑは、０から１０の値を有する整数を表し、且つｐは、１から１０の値を有する整数を表し、ただし、ｎ＋ｐ＋ｑは、２以上であり、
Ｗは、配列番号３７の配列ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳを含むペプチドであり、且つ
Ｚは、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチドを含むアミノ酸配列である）
のタンパク質又はその塩を提供する。
【0017】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様に係るペプチド、又は本発明の第３の態様に係るタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【0018】
第５の態様では、本発明は、本発明の第４の態様に係る核酸配列を含む発現カセットを提供する。
【0019】
第６の態様では、本発明は、本発明の第４の態様に係る核酸配列又は本発明の第５の態様に係る発現カセットを含む核酸ベクターを提供する。
【0020】
第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様に係るペプチド、本発明の第３の態様に係るタンパク質、本発明の第４の態様に係る核酸配列、本発明の第５の態様に係る発現カセット、又は本発明の第６の態様に係る核酸ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0021】
第８の態様では、本発明は、金属ナノクラスター足場としての、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様に係るペプチド、又は本発明の第３の態様に係るタンパク質の使用を提供する。
【0022】
第９の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様に係るペプチド、又は本発明の第３の態様に係るタンパク質を含む金属ナノクラスターを提供する。
【0023】
第１０の態様では、本発明は、本発明の第９の態様に係る少なくとも２種の金属ナノクラスターの組合せを提供する。
【0024】
第１１の態様では、本発明は、（ａ）本発明の第３の態様で定義されたタンパク質と金属含有化合物とを混合する工程と、（ｂ）混合物を還元反応に付す工程と、を含む、本発明の第９の態様に係る金属ナノクラスターの作製プロセスを提供する。有利には、本発明のペプチドモチーフの特定の性質に起因して、本発明のプロセスは、ＮＣを形成する足場として作用するタンパク質の変性を必要としないので、ＮＣの調製を単純化する。
【0025】
本発明の第１２の態様は、本発明の第１１の態様のプロセスにより得られる金属ナノクラスターに関する。
【0026】
以上で述べたように、本発明のアミノ酸配列及びペプチドは、タンパク質の設計を可能にするので、足場として使用したとき、その安定化効果に起因して金属ＮＣの固有の性質を向上させる。
【0027】
第１３の態様では、本発明は、イメージング剤としての、薬剤送達担体としての、代謝干渉剤としての、触媒としての、検体としての、結晶学的データセットの位相調整用としての、細胞標識剤としての、特異的タンパク質標識剤としての、バイオセンサーとしての、温度センサーとしての、光増感剤としての、又は光電子デバイスの製造用としての、本発明の第９の態様に係る金属ナノクラスター又は本発明の第１０の態様に係る金属ナノクラスターの組合せ又は本発明の第１２の態様に係る金属ナノクラスターの使用を提供する。
【0028】
第１４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチド又は本発明の第３の態様に係るタンパク質又は本発明の第４の態様に係る核酸配列又は本発明の第５の態様に係る発現カセット又は本発明の第６の態様の核酸ベクター又は本発明の第７の態様に係る宿主細胞又は本発明の第９の態様の金属ナノクラスター又は本発明の第１０の態様に係る金属ナノクラスターの組合せ又は本発明の第１２の態様に係る金属ナノクラスターを含むキットを提供する。
【0029】
第１５の態様では、本発明は、本発明の第９の態様に係る金属ナノクラスター又は本発明の第１２の態様に係る金属ナノクラスターを調製するための、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチド又は本発明の第３の態様に係るタンパク質又は本発明の第４の態様に係る核酸配列又は本発明の第５の態様に係る発現カセット又は本発明の第６の態様に係る核酸ベクター又は本発明の第７の態様に係る宿主細胞を含むキットの使用を提供する。
【0030】
第１６の態様では、本発明は、本発明の第９の態様に係る金属ナノクラスター又は第１０の態様に係る金属ナノクラスターの組合せ又は第１２の態様に係る金属ナノクラスターを含むデバイスを提供する。
【0031】
最後に、最後の態様では、本発明は、診断又は予後予測に使用するための、本発明の第９若しくは第１２の態様の金属ＮＣ又は本発明の第１０の態様の組合せを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
図面の簡単な説明
【図1】ＣｕＮＣにおけるＨｉｓクランプの存在及び位置の効果を示す蛍光スペクトル（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図2】リン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中及びヒト血漿（ＨＰ）中におけるＷＨＷ－ＣｕＮＣの安定性。（Ｆ：蛍光強度（％）、Ｔ：時間（日数））。
【図3】ＷＨＷ安定化ＮＣの蛍光スペクトルにおける特定の金属（Ｃｕ、Ａｕ、及びＡｇ）の存在の効果を示す。
【図4】銅ＮＣ中のＨモジュールの数が蛍光スペクトルに及ぼす効果を示す（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図5】異なるタンパク質安定化ＡｕＮＣの蛍光スペクトルの比較を表すとともにシステインクランプの効果を示す。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図6】タンパク質安定化ＡｕＮＣの蛍光におけるシステイン残基の量の効果を示す。６Ａは、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ１Ｃ１Ｃ１Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示し、一方、６Ｂは、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示する。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図7】異なるタンパク質安定化ＡｕＮＣの蛍光発光スペクトルを表し、７Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＸ１Ｗ、ＷＸＷ、及びＷＣ１Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示し、且つ７Ｂは、ＷＨＷ、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示する（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図8】異なるタンパク質安定化ＡｇＮＣの蛍光発光スペクトルを示す。８Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＸ１Ｗ、ＷＸＷ、ＷＣ１Ｗ、及びＷＨＷタンパク質により形成されたＡｇＮＣを開示する。８Ｂは、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗタンパク質により形成されたＡｇＮＣを開示する。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図9】異なるタンパク質安定化ＣｕＮＣの蛍光発光スペクトルを記述する。９Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＸ１Ｗ、ＷＸＷ、ＷＣ１Ｗ、及びＷＨＷタンパク質により形成されたＣｕＮＣを開示する。９Ｂは、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗタンパク質により形成されたＣｕＮＣを開示する（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図10】異なるタンパク質安定化ＡｕＮＣの蛍光発光スペクトルの比較を表すとともに、システイン（ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ）又はヒスチジンクランプ（ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）の効果を示す。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図11】異なるタンパク質安定化ＡｕＮＣの蛍光発光スペクトルを表し、１１Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、及びＷＨ３Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示し、且つ１１Ｂは、ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、ＷＣ３Ｗ、ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗタンパク質により形成されたＡｕＮＣを開示する。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図12】異なるタンパク質安定化ＡｇＮＣの蛍光発光スペクトルを示す。１２Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、及びＷＨ３Ｗタンパク質により形成されたＡｇＮＣを開示し、且つ１２Ｂは、ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、ＷＣ３Ｗ、ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗタンパク質により形成されたＡｇＮＣを開示する。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図13】異なるタンパク質安定化ＣｕＮＣの蛍光発光スペクトルを記述する。１３Ａは、ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、及びＷＨ３Ｗタンパク質により形成されたＣｕＮＣを開示し、且つ１３Ｂは、ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、ＷＣ３Ｗ、ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗタンパク質により形成されたＣｕＮＣを開示する（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ））。
【図14】タンパク質安定化ＣｄＳＮＣ（ＷＷＷＷＷＷ、ＷＨ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）の蛍光発光におけるヒスチジン残基の数及び位置の効果を示す（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ）、対照、「タンパク質を含まない対照」）。
【図15】異なるタンパク質安定化ＣｄＳＮＣ（ＷＷＷＷＷＷ、ＷＨ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）の蛍光励起スペクトルを示す。（Ｆ：蛍光強度（任意単位）、λ：波長（ｎｍ）、対照、「タンパク質を含まない対照」）。
【図16】ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０、ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ、及びＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋの円二色性スペクトル（Ａ）、熱アンフォールディング（Ｂ）、及びＨｓｐ９０へのリガンド結合活性（Ｃ）を示す。（［θ］：ＣＤシグナル（ｍｄｅｇ）、λ：波長（ｎｍ）、Ｔ：温度（℃）、％Ｌ．Ｂ．：結合リガンドのパーセント、［Ｐ］：タンパク質濃度）。
【図17】ＷＨＷタンパク質により安定されたＣｕナノクラスターの蛍光強度（Ｆ）を温度Ｔ（℃）の関数として示す。
【図18】ＧＦＰ（黒四角）及びＤＡＰＩ（黒三角）と比較してＡｇＮＣ（黒丸）の蛍光強度の経時的光漂白曲線を表す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、配列番号１の配列のペプチド又はその塩を提供する。
第１の態様では、本発明は、配列番号１の配列のペプチド又はその塩を提供する。
【0034】
本発明のアミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質のいずれかを形成するアミノ酸は、とくに明記されていない限り、Ｄ配置又はＬ配置を有することが可能である。
【0035】
治療目的で使用する場合に薬学的に許容可能でなければならない点を除けば、塩に関する制限は存在しない。一実施形態では、塩は薬学的に許容可能な塩である。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴うことなく健全な医学的判断の範囲内でヒト及び下等動物の組織に接触させて使用するのに好適であるとともに合理的な便益／リスク比に見合う塩を意味する。薬学的に許容可能な塩は当技術分野で周知である。薬学的に許容可能な非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸を用いて、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸などの有機酸を用いて、又はイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を用いて形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、及びアンモニウムを含む。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、非毒性アンモニウムカチオン、第４級アンモニウムカチオン、及びアミンカチオンを含み、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオンなどのカウンターイオンを用いて形成される。
【0036】
本発明の目的では、所与の範囲はいずれも、範囲の下側端点及び上側端点の両方を含む。温度、時間などの所与の範囲は、とくに明記されていない限り、近似とみなすべきである。
【0037】
本発明の第１の態様の一実施形態では、以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ１からＸ６の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表す。
【0038】
本発明の第１の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、且つＸ６は、Ｋ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、ただし、Ｘ１からＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ又はＣを表し、他の一実施形態では、Ｘ１からＸ６の少なくとも３つ、４つ、５つ、又は６つは、同一であるか又は異なり、且つＨ又はＣを表す。
【0039】
本発明の第１の態様の一実施形態では、以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、且つＸ６は、Ｋ、Ｈ、及びＣから選択されるアミノ酸であり、ただし、
－Ｘ１からＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ又はＣを表し、
－Ｘ２がＨ又はＣであるとき、Ｘ３はＮであり、
－Ｘ３がＨ又はＣであるとき、Ｘ２はＹであり、且つ
－Ｘ６がＨ又はＣであるとき、Ｘ５はＬ、Ａ、又はＶである。
－Ｘ１からＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ又はＣを表し、
－Ｘ２がＨ又はＣであるとき、Ｘ３はＮであり、
－Ｘ３がＨ又はＣであるとき、Ｘ２はＹであり、且つ
－Ｘ６がＨ又はＣであるとき、Ｘ５はＬ、Ａ、又はＶである。
【0040】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ６はＫである。
【0041】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ１がＥであるとき、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表す。他の一実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも３つ、４つ、又は５つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表し、他の一実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つは、同一であるか又は異なり、且つＨ又はＣを表す。
【0042】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号２）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号３）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号４）、ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号５）、ＡＥＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号６）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号７）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号８）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号９）、ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１０）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１１）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１２）、及びＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１３）からなる群から選択される。とくに、アミノ酸配列は、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号３）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号４）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号８）、及びＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１３）からなる群から選択される。
【0043】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号２）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号３）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号４）、ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号５）、ＡＥＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号６）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号７）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号８）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号９）、ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１０）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１１）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１２）、ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１３）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＸ６（配列番号１１０）、ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＸ６（配列番号１１１）、ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＸ６（配列番号１１２）、ＡＥＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＹＸ６（配列番号１１３）、ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号１１４）、ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１６７）、及びＡＸ１ＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号１６８）からなる群から選択される。
【0044】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｘ１からＸ６は同一であり且つＣ又はＨを表す。
【0045】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号１４）、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１５）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１６）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１７）、及びＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣ（配列番号１８）からなる群から選択される。
【0046】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号１４）、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１５）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１６）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１７）、及びＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣ（配列番号１８）、ＡＨＡＷＨＨＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１１５）、ＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＬＨ（配列番号１１７）、及びＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１４５）からなる群から選択される。
【0047】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号１４）、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１５）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１６）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫ（配列番号１７）、及びＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣ（配列番号１８）、ＡＨＡＷＨＨＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１１５）、ＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＬＨ（配列番号１１７）、ＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１４５）、ＡＣＡＷＹＨＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号１６９）、及びＡＣＡＷＹＮＬＧＨＡＹＹＫ（配列番号１７０）からなる群から選択される。
【0048】
第２の態様では、本発明は、式（Ｉ）のペプチド又はその塩を提供する。
【0049】
本発明の第２の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、アミノ酸配列は、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２の配列であるαヘリックス二次モチーフ（「Ｆ」）を有する。
【0050】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ｍは１である。本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ｎ及びｍは１である。
【0051】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、リンカー「Ｂ」はアミノ酸配列ＱＧＤである。
【0052】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、配列「Ｇ」は、その第２のアミノ酸がプロリンである限り、４アミノ酸のいずれかの配列でありうる。好ましい実施形態では、「Ｇ」は、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５である。より好ましい実施形態では、配列番号２３である。
【0053】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ＺのＣ末端に結合された配列（式（Ｉ）中の「ＢＦＧ」）は、配列番号２６：ＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳである。
【0054】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ペプチドは、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２７）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２９）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３１）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３３）、及びＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲ（配列番号３５）からなる群から選択される。
【0055】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ペプチドは、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２７）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２９）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３１）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３３）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３５）、ＡＨＡＷＨＨＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号１１９）、ＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＬＨＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号１２１）、及びＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲ（配列番号１４７）からなる群から選択される。
【0056】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ペプチドは、ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２７）、ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２９）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３１）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３３）、ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３５）、ＡＣＡＷＹＨＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号９７）、ＡＣＡＷＹＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号９９）、ＡＨＡＷＨＨＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号１１９）、ＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＬＨＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号１２１）、及びＡＨＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲ（配列番号１４７）から選択される。
【0057】
第３の態様では、本発明は、式（ＩＩ）のタンパク質を提供する。
【0058】
本発明の第３の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｗは配列番号３７の配列である。
【0059】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｚは、本発明の第２の態様で定義されたペプチドである。
【0060】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ｎ及びｑは、同一であるか又は異なり、且つ０とは異なる。
【0061】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ｐは、１、２、３、４、５、又は６である。
【0062】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、以下の一般式（ＩＩ）である。
ＷＺｐＷ （ＩＩ）
式中、Ｗ、Ｚ、及びｐは、以上に定義した通りである。
ＷＺｐＷ （ＩＩ）
式中、Ｗ、Ｚ、及びｐは、以上に定義した通りである。
【0063】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、タンパク質は、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１配列番号１５５、配列番号１５７、及び配列番号１５９からなる群から選択される。
【0064】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、ペプチド、ナノ粒子、核酸、無機分子、有機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体、抗原、タグペプチド、イメージング剤、例えば、ＭＲＩコントラスト剤、ＰＥＴコントラスト剤、配位金属コントラスト剤、及びそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるエレメントに結合される。
【0065】
本発明の第３の態様のタンパク質に結合可能なペプチドは、細胞核、細胞膜などへの前記タンパク質の方向付けを可能にするか、又は移行ペプチドである。
【0066】
本発明の第３の態様のタンパク質に結合可能なタグペプチドは、例えば、ペプチドＭＥＥＶＦ（配列番号１０９）、Ｈｉｓタグペプチド、又は専門家に知られるいずれかのタグペプチドでありうる。それはまた、細胞内の対象オルガネラへのＮＣの結合を可能にするタグペプチドでありうる。
【0067】
例示として、本発明のＮＣは、その蛍光性に起因して核酸の標識剤として使用可能であるので、特異的エピジェネティクス修飾又は代替的に遺伝子突然変異、例えば、点突然変異（ＳＮＰ、多型）、欠失、若しくは挿入の存在又は不在の検出を可能にする。
【0068】
「抗体」という用語は、本明細書では抗原に特異的に結合するその能力という意味で用いられ、ひいてはかかる能力を有する分子を意味する。前記用語に含まれるのは、標的抗原に特異的に結合するインタクト抗体及び標的抗原に特異的に結合する抗体フラグメントである。
【0069】
本明細書で用いられる場合、「インタクト抗体」という用語は、イムノグロブリン分子の可変領域に位置する部位をはじめとする少なくとも１つの結合認識部位（例えば抗原結合部位）を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的をはじめとするそのコグネイト標的に特異的に結合可能なイムノグロブリン分子を意味する。抗体は、いずれかのクラスの抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（又はそのサブクラス）、ＩｇＭを含む。好ましい実施形態では、抗体はＩｇＧである。
【0070】
本明細書で用いられる場合、「抗体フラグメント」という用語は、抗体の機能性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、重鎖又はそのフラグメント、軽鎖又はそのフラグメント、ドメイン抗体（ＤＡｂ）（すなわち、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨドメイン）若しくは抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬドメイン））又はそのダイマー、ＶＨ又はそのダイマー、ＶＬ又はそのダイマー、ナノボディー（ラクダ科動物ＶＨ）、及びそれらの機能性変異体、抗体を含む融合タンパク質、又は所望の特異性の抗原認識部位を含むイムノグロブリン分子のいずれかの他の修飾構成体を意味する。抗体フラグメントは、抗原結合フラグメントを意味しうる。好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、ＶＨ又はドメイン抗体又はＤＡｂである。他の好ましい一実施形態では、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。他の好ましい一実施形態では、抗体フラグメントはナノボディーである。
【0071】
各種抗体を調製及び使用する技術は、当技術分野で周知である。例えば、ヒトイムノグロブリントランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリーからいずれの非ヒト配列も欠如した完全ヒトモノクローナル抗体を調製することが可能である。
【0072】
本発明の特定の態様では、抗体は、細胞表面上に露出した抗原に特異的に結合する抗体である。
【0073】
「イメージング剤」という用語は、標的細胞の位置特定を可能にするように設計された化学化合物を意味する。本発明の目的に好適なイメージング剤の例としては、限定されるものではないが、放射性核種、フルオロフォア、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）コントラスト剤、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）コントラスト剤、コントラスト剤としてシグナルを与える配位金属、又はそれらのいずれかの組合せが挙げられる。
【0074】
本明細書で用いられる「磁気コントラスト剤」又は「ＭＲＩ剤」という用語は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）において体内構造の可視性を向上させるために使用される一群のコントラスト媒体を意味する。ＭＲＩ剤の例としては、限定されるものではないが、ガドリニウム系及び他のランタニド系の化合物、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）及び微小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、鉄白金系化合物及びマンガン系化合物が挙げられる。
【0075】
ガドリニウムコントラスト剤の例示的な例は、限定されるものではないが、細胞外液剤、例えば、ガドテレート（Dotarem（登録商標）、Clariscan（商標））、ガドジアミド（Omniscan）、ガドベネート（MultiHance（登録商標））、ガドペンテテート（Magnevist（登録商標））、ガドテリドール（ProHance（登録商標））、ガドベルセタミド（OptiMARK（商標））、ガドブトロール（Gadovist（登録商標）若しくはGadavist（登録商標））、ガドペンテト酸ジメグルミン（Magnetol（商標））、血液プール剤、例えば、アルブミン結合ガドリニウム錯体、例えば、ガドホスベセット（Ablavar（登録商標）、以前はVasovist（登録商標））、及びガドコレチン酸、又は高分子ガドリニウム錯体、例えば、ガドメリトール（Vistarem（登録商標））、ガドマー１７（GadoSpin（商標）D）、及び肝胆道（肝臓）剤、例えば、ガドキセト酸である。
【0076】
放射性核種の例示的な例としては、限定されるものではないが、γ放射同位体、例えば、ガンマカメラを用いたラジオシンチグラフィー又はシングルフォトンエミッションコンピュータートモグラフィーで使用可能な＜９９ｍ＞Ｔｃ、＜１２３＞Ｉ、及び＜ｍ＞Ｉｎ、さらには陽電子放射体、例えば、ＰＥＴで使用可能な＜１８＞Ｆ、＜６４＞Ｃｕ、＜６８＞Ｇａ、＜８６＞Ｙ、＜１２４＞Ｉ、＜２１３＞Ｂｉ、及び＜２１１＞Ａｔ、又はβ放射体、例えば、＜１３１＞Ｉ、＜９０＞Ｙ、＜９９ｍ＞Ｔｃ、＜１７７＞Ｌｕ、及び＜６７＞Ｃｕ”が挙げられる。
【0077】
ＰＥＴコントラスト剤の例示的な例は、限定されるものではないが、放射性のフッ素（Ｆ－１８、例えば、フッ素－１８フルオロデオキシグルコースＦＤＧ）、酸素（酸素－１５）、炭素（例えばＣ－１１）、窒素（窒素－１３）、又はガリウム（ガリウム－６８）、ジルコニウム（ジルコニウム－８９）、若しくはルビジウム（ルビジウム－８２）に基づく短い半減期を有する同位体の放射性核種である。
【0078】
本明細書で用いられる「フルオロフォア」という用語は、光励起時に再発光可能な蛍光化学化合物を意味する。蛍光色素としては、限定されるものではないが、Ｃｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ５、及びＦＩＴＣが挙げられる。
【0079】
以上に列挙された分子のいずれかへの本発明のタンパク質の結合性は、共有結合によるか、静電相互作用若しくは疎水力によるか、又は吸着によるものでありうる。当業者であれば、ルーチンプロトコルを用いて本発明のタンパク質を特定のリガンドに結合させることが可能であり、より適切なプロトコルの選択は、本発明のタンパク質の特定の性質だけでなく結合されるリガンドの性質にも依拠するであろう。さらに、Ｘ１からＸ６の少なくとも２つがフリーであり且つ以上に定義される通りである限り、タンパク質を形成するアミノ酸のいずれかとリガンドとの間の結合を行うことが可能である。
【0080】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、タンパク質は、以上に列挙されたエレメントのいずれかに共有結合する。その場合、タンパク質は、そのＮ末端及び／又はそのＣ末端を介してエレメントに共有結合する。
【0081】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、細胞局在化シグナル又は認識ドメインに結合される。
【0082】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、細胞局在化シグナルは、核局在化シグナル、小胞体局在化シグナル、又はミトコンドリア局在化シグナルである。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、細胞局在化シグナルは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、又は配列番号７８である。
【0083】
代替的に、本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、認識ドメインは、Ｈｓｐ９０結合ドメイン、Ｈｓｐ７０結合ドメイン、ｄｓｓ１タンパク質結合ドメイン、タグ配列、ＴＰＲドメイン、アンキリンドメイン、Ｓｒｃ相同性３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ホメオドメイン、ロイシンジッパータンパク質、αリプレッサー様タンパク質）、又はペプチドグリカン認識タンパク質である。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、認識ドメインは、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号９０からなる群から選択される。
【0084】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、タンパク質は、配列番号７９、配列番号９１、配列番号９３、及び配列番号９５からなる群から選択される。
【0085】
本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、Ｎ末端に配列ＧＡＭＧＳ（配列番号６９）を含む。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、Ｎ末端のペプチドは、配列ＧＡＭＧＳ（配列番号６９）である。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、Ｃ末端にαヘリックス二次モチーフを有する配列を含む。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、Ｃ末端のペプチドは、配列ＡＥＡＫＱＮＬＧＮＡＫＱＫＱＧ（配列番号７０）を含む。本発明の第３の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、タンパク質は、そのＮ末端に配列ＧＡＭＧＳ（配列番号６９）及びそのＣ末端に配列ＡＥＡＫＱＮＬＧＮＡＫＱＫＱＧ（配列番号７０）を含む。
【0086】
本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様のペプチド、及び本発明の第３の態様のタンパク質は、（ａ）結合されるアミノ酸の脱保護及び（ｂ）保護されたアミノ酸のカップリングの逐次工程のサイクルが実施される固相合成などのルーチンの方法により調製可能である。保護基は、Ｎ－保護基、Ｃ－保護基、又は側鎖保護基でありうる。３つのカテゴリーすべてに属する市販の保護基が存在する。
【0087】
代替的に、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様のペプチド、及び本発明の第３の態様のタンパク質は、適切な宿主生物において分子クローニング及び発現により調製可能である。
【0088】
以上のほかに、本発明の第１の態様のアミノ酸配列、本発明の第２の態様のペプチド、又は本発明の第３の態様のタンパク質のＮ（ｔ）及び／又はＣ（ｔ）の末端アミノ基及び／又は末端カルボキシ基は、誘導体化可能である。末端アミノ基は、アシル化により誘導体化可能であり、一方、カルボキシ基は、アミド化により誘導体化可能である。当業者であれば、一般的知識を用いて、かかる誘導体化を達成するのに適した試薬及び条件を選択することが可能である。
【0089】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチド又は本発明の第３の態様に係るタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【0090】
本発明によれば、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に用いられ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は１つ以上のヌクレオチドアナログを含有する種を意味する。本発明に係る好ましい核酸又はポリヌクレオチドはＤＮＡであり、最も好ましいのは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡである。
【0091】
本発明の第４の態様の一実施形態では、核酸配列は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、及び配列番号６８からなる群から選択される配列を含む。本発明の第４の態様の他の一実施形態では、核酸配列は、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５６、配列番号１５８、及び配列番号１６０からなる群から選択される配列を含む。遺伝暗号は縮重しているため、核酸配列が本明細書に列挙されたものと異なりうることは、当業者に公知である。したがって、本発明はまた、そうした縮重ＤＮＡ配列に関する。
【0092】
第５の態様では、本発明は発現カセットを提供する。
【0093】
「発現カセット」という用語は、所望のアミノ酸ペプチド又はタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子と、プロモーター、オープンリーディングフレーム、ターミネーターなどのそれらの発現を制御する配列と、で構成された核酸配列として定義される。分泌シグナル、マーカー遺伝子、精製タグなどの追加の配列エレメントも、発現カセット内に含まれうる。
【0094】
第６の態様では、本発明は核酸ベクターを提供する。
【0095】
本発明の本態様に係る「ベクター」という用語は、宿主細胞への外来遺伝エレメント（とくに１つ以上の遺伝子）のインテグレーションに好適であるとともに対象遺伝子の複製及び／又は発現に適した核酸である。本発明の適切なベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体である。これらのうち、最もよく使用されるベクターはプラスミドである。好ましい実施形態では、ベクターはpProEx-HTAベクター（Invitrogen）である。
【0096】
第７の態様では、本発明は宿主細胞を提供する。
【0097】
宿主細胞は原核細胞又は真核細胞でありうる。本発明に係る原核宿主としては、細菌とくにＥ．コリ（E. coli）、例えば、以上のベクターの増殖に好適なＣ４１、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＢＬ２１のような市販の株が挙げられる。真核宿主細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces）やピキア属（Pichia）の株などの酵母細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、若しくはＳｆ９などの昆虫細胞、又は植物細胞でありうる。
【0098】
当業者であれば、本発明のペプチド又はタンパク質をコードする核酸の適切な増殖及び／又は好適な宿主への移入に適したベクター構築物／宿主細胞ペアを容易に選択可能である。適切なベクターエレメント及びベクターを適切な宿主細胞に導入する具体的方法は、当該技術の現状で同様に公知である。
【0099】
第８の態様では、本発明は、金属ナノクラスター足場としての、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列、本発明の第２の態様に係るペプチド、又は本発明の第３の態様に係るタンパク質の使用を提供する。より特定の実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属の原子又はイオンは、銅、金、銀、ニッケル、亜鉛、チタン、クロム、鉄、コバルト、パラジウム、カドミウム、ルテニウム、ロジウム、イリジウム、白金、及びそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。さらにより特定の実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属は、銅、金、銀、又はそれらのいずれかの組合せである。
【0100】
αヘリックスを形成可能なペプチド又はタンパク質は、足場形成ナノクラスターとしてとくに好ましい。第９の態様では、本発明はナノクラスターを提供する。
【0101】
金属ナノクラスターは、２ナノメートル（ｎｍ）以下のサイズを有する金属粒子として定義される。特定の実施形態では、本発明の金属ナノクラスターは約０．５から１．５ｎｍの直径を有し、より特定的には直径は約０．７から１．１ｎｍである。
【0102】
金属ナノクラスターのサイズは、専門家に公知のいずれかの方法により、例えば、質量分析法、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、高分解能透過電子顕微鏡法（ＨＲ－ＴＥＭ）により直接的に又はその蛍光発光性により間接的に測定可能である。
【0103】
第９の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属の原子又はイオンは、遷移金属の原子又はイオンである。より特定の実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属の原子又はイオンは、銅、金、銀、ニッケル、亜鉛、チタン、クロム、鉄、コバルト、パラジウム、カドミウム、ルテニウム、ロジウム、イリジウム、白金、及びそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。さらにより特定の実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属は、銅、金、銀、又はそれらのいずれかの組合せである。さらに他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ナノクラスターは金と銀との混合物を含む。さらに他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金：銀のモル比は５：１から１５：１に含まれる。他の一実施形態では、金：銀のモル比は９：１である。
【0104】
本発明の第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ナノクラスターは、（ａ）金属が金であるものであり且つ配列番号６１のペプチドを含むか、又は代替的に（ｂ）金属が銀であるものであり且つ配列番号６３のタンパク質を含むか、又は代替的に（ｃ）金属が銅であるものであり且つ配列番号５９のタンパク質を含むか、又は代替的に（ｄ）金属が銀であるものであり且つ配列番号５９のタンパク質を含むか、又は代替的に（ｅ）金と銀との混合物を含むものであり且つ配列番号５９のタンパク質を含むか、又は代替的に（ｆ）９：１のモル比の金と銀との混合物と配列番号５９のタンパク質とを含むものである。
【0105】
本発明の第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属ナノクラスターは蛍光を発する。
【0106】
「蛍光金属ナノクラスター」とは、所与の波長で励起した後に励起波長とは異なる波長の光を発する本発明の金属ナノクラスターを意味する。いくつかの実施形態では、蛍光金属ナノクラスターは、励起により可視色の蛍光を発する。ある特定の実施形態では、励起光は、紫外光、可視光、又は近赤外光である。例えば、励起光（例えばレーザーにより提供される）は、２００ｎｍから２０００ｎｍの波長を含む。本発明の第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属ナノクラスターは、３６０から３８０ｎｍで励起したとき４４０から４６０ｎｍに最大発光波長を有する蛍光を発する。本発明の第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ナノクラスターは、３６０から３８０ｎｍで励起したとき４４０から４６０ｎｍに最大発光波長を有する蛍光及び４３０から４６０ｎｍで励起したとき５８０から６４０ｎｍに最大発光波長を有する蛍光を発する。当業者であれば、一般的知識を用いて、例えば特定の金属還元条件を用いることにより異なる蛍光色を達成可能である。
【0107】
本明細書に提供される実施例は、本発明の金属ＮＣの蛍光を実証する。各グラフは独立した実験を表し、各グラフに示される実験データは同時に得られたものであるため、それらの比較が可能であった。
【0108】
本発明の第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本発明の第３の態様のタンパク質のＣｙｓ残基数は１６、１７、１８、１９、又は２０である。より特定の実施形態では、本発明の第３の態様のタンパク質のＣｙｓ残基数は１６、１７、１８、１９、又は２０であり、且つ金属は金である。
【0109】
第９の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、ＮＣ中の金属原子数は１から２０であり、特定の実施形態では３から８個の原子である。
【0110】
第９の態様の金属ＮＣの他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属は金である。より特定の実施形態では、金属は金であり、且つＮＣ中の金属原子数は３、４、５、６、７、又は８である。
【0111】
第１０の態様では、本発明は、本発明の第９の態様の少なくとも２種の金属ナノクラスターの組合せに関する。好ましい実施形態では、組合せはＡｕＮＣとＡｇＮＣであるか、代替的にＡｕＮＣとＣｕＮＣであるか、代替的にＣｕＮＣとＡｇＮＣであるか、又は代替的にＡｕＮＣとＡｇＮＣとＣｕＮＣである。
【0112】
第１１の態様では、本発明は、ａ）タンパク質中に存在する金属配位残基に金属を吸着させるために本発明の第３の態様のタンパク質と金属含有化合物とを混合する工程を含む、本発明の第９の態様の金属ナノクラスターの作製プロセスに関する。
【0113】
第１１の態様のある実施形態では、金属含有化合物は金属塩である。好ましい実施形態では、金属塩は、ＨＡｕＣｌ４、ＡｕＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＫＡｕＣｌ４、ＡｕＩ、ＡｕＢｒ３、Ａｕ（ＯＨ）３、ＨＡｕＢｒ４、ＡｇＮＯ３、ＡｇＣｌ、Ａｇ２ＣＯ３、Ａｇ２ＳＯ４、ＡｇＣｌＯ４、ＡｇＩ、ＡｇＣＮ、ＡｇＮＯ２、ＡｇＮＯ３、ＡｇＦ、ＡｇＰＦ６、ＡｇＯＣＮ、Ａｇ３ＰＯ４、ＡｇＦ２、ＣｕＳＯ４、ＣｕＩ、ＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ、ＣｕＢｒ２、ＣｕＣＮ、ＣｕＦ、ＣｕＦ２、Ｃｕ（ＣｌＯ４）２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｃｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２、Ｎｉ（ＯＣＯＣＨ３）２、ＮｉＣｌ２、ＮｉＳＯ４、Ｎｉ（ＮＯ３）２、Ｋ２Ｎｉ（ＣＮ）４、Ｎｉ（ＣｌＯ４）２、ＮｉＢｒ２、ＮｉＩ２、Ｎｉ（ＯＨ）２、ＮｉＣＯ３、ＮｉＦ２、ＮｉＣ２Ｏ４、ＺｎＳＯ４、ＺｎＩ、ＺｎＣｌ、ＺｎＣｌ２、ＺｎＢｒ、ＺｎＢｒ２、ＺｎＣＮ、ＺｎＦ、ＺｎＦ２、Ｚｎ（ＣｌＯ４）２、Ｚｎ（ＮＯ３）２、Ｚｎ（ＣＯ２ＣＨ３）２、ＺｎＳＯ４、（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）２Ｚｎ３、（ＣＨ３ＣＯ２）２Ｚｎ、Ｔｉ［ＯＣＨ（ＣＨ３）２］４、Ｔｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、Ｔｉ［ＯＣＨ２ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）（ＣＨ２）３ＣＨ３］４、ＣｒＣｌ２、ＣｒＣｌ３、ＣｒＦ２、ＣｒＦ３、ＣｒＢｒ２、ＣｒＢｒ３、ＣｒＩ２、ＣｒＩ３、Ｃｒ（ＣｌＯ４）３、Ｋ３Ｃｒ（Ｃ２Ｏ４）３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｒＰＯ４、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、Ｆｅ（ＮＯ３）２、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３、Ｃ１２Ｈ１４ＦｅＯ１２、ＦｅＳＯ４、Ｃ６Ｈ５ＦｅＯ７、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｃｏ（ＳＣＮ）２、ＣｏＣｌ２、ＣｏＦ２、ＣｏＦ３、ＣｏＩ２、ＣｏＢｒ２、ＣｏＣＯ３、Ｃｏ３（ＰＯ４）２、ＣｏＳＯ４、Ｃｏ（ＣｌＯ４）２、Ｃｏ（ＯＨ）２、（ＣＨ３ＣＯ２）２Ｃｏ、（ＣＦ３ＣＯＯ）２Ｐｄ、Ｃ１０Ｈ１８Ｏ４Ｐｄ、［（Ｃ６Ｈ５）３Ｐ］２ＰｄＣｌ２、Ｃｄ（ＮＯ３）２、Ｃｄ（ＯＣＯＣＨ３）２、Ｃ１２Ｈ２０ＣｄＮ２Ｓ４、Ｃ１２Ｈ２２ＣｄＯ１４、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｄＩ２、ＣｄＣＯ３、Ｃｄ（ＣｌＯ４）２、ＣｄＢｒ２、Ｃｄ（ＯＨ）２、ＲｕＣｌ３、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ２、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３、ＲｕＩ３、Ｒｕ（ＮＯ）Ｃｌ３、［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｃｌ］Ｃｌ２、Ｈ１５Ｃｌ２Ｎ５Ｒｕ、［（ＣＦ３ＣＯＯ）２Ｒｈ］２、ＣｌＲｈ（Ｐ（Ｃ６Ｈ４ＳＯ３・Ｎａ）３）３、Ｒｈ（ＮＯ３）３、ＩｒＣｌ３、Ｈ２Ｃｌ６Ｉｒ、ｌｒＣｌ４、Ｉｒ４（ＣＯ）１２、ＩｒＢｒ３、［Ｉｒ（ＮＨ３）５Ｃｌ］Ｃｌ２、ＰｔＣｌ２、ＰｔＣｌ４、Ｈ２ＰｔＣｌ６、Ｋ２ＰｔＣｌ６、（ＮＨ４）２ＰｔＣｌ６、Ｐｄ（ＮＯ３）２、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｅｒ、Ｃｙ、Ｎｄのハロゲン化物、他のランタニド塩、及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、金属塩は、ＨＡｕＣｌ４、ＡｇＮＯ３、若しくはＣｕＳＯ４、又はそれらのいずれかの組合せである。
【0114】
第１１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、金属含有化合物は金属塩Ｃｄ（ＣＨ３ＣＯ２）２である。
【0115】
第１１の態様の他の一実施形態では、工程ａ）は、少なくとも２０分間、特定的には少なくとも３０分間、より特定的には約３０から６０分間実施される。
【0116】
本発明の第１１の態様のある実施形態では、工程ａ）の金属とタンパク質とのモル比は２：１から１２０：１である。他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、モル比は５：１から７０：１である。他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、モル比は５：１、２０：１、又は５０：１である。他の一実施形態では、モル比は５０：１である。
【0117】
第１１の態様の他の一実施形態では、プロセスは、還元剤の添加を含む還元工程ｂ）を実施することをさらに含む。
【0118】
本発明者らは、本発明のタンパク質が多用途であることから、プロセスのさまざまなパラメーターを調整することにより蛍光ＮＣの性質のモジュレーションを達成可能であることを見いだした。以上との関連では、還元剤と金属との特定のモル比の下でプロセスを実施すると、蛍光の増加したＮＣが達成されることが判明した。このことを考慮して、本発明の第１２の態様は、本発明の第１１の態様の生成物により得られる金属ナノクラスターに関する。
【0119】
本発明の第１１の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、工程（ｂ）は過剰量の還元剤で実施される。一実施形態では、還元剤：金属のモル比は３：１から６００：１の範囲内である。特定の実施形態では、５：１から５００：１の範囲内である。他の一実施形態では、還元剤：金属のモル比は１０：１から２００：１である。より特定の実施形態では、モル比は１００：１である。
【0120】
本発明の金属ＮＣを達成するために本発明の方法で使用される還元剤は、当該分野の専門家に公知のいずれかの還元剤でありうる。特定の実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、タンニン酸、ヒドラジン、ホウ水素化ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、デキストロース、ジメチルアミンボラン、２，５ジアミノベンゼンスルホン酸、１，２－ヘキサデカンジオール、又はそれらの混合物でありうる。他の一実施形態では、還元剤は硫化ナトリウムである。
【0121】
他の一実施形態では、工程（ｂ）は、プロトン性又は非プロトン性のどちらかの極性溶媒で実施される。一実施形態では、溶媒は水である。
【0122】
本発明の第１１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、工程（ｂ）は５．５から１２．０のｐＨ範囲で実施される。特定の実施形態では、ｐＨは７．０である。
【0123】
本発明の第１１の態様の他の一実施形態では、工程（ｂ）は約３０から５５℃の温度で実施される。特定の実施形態では、工程（ｂ）は、約３７から５５℃、より特定的には約５０℃の温度で実施される。
【0124】
本発明の第１１の態様の他の一実施形態では、工程ｂ）は、約２０から９０時間、特定的には約２４から３０、４８から５０、又は７０から７５時間、より特定的には約７２時間にわたり実施される。
【0125】
本発明の第１１の態様の他の一実施形態では、工程ｂ）は、約２０から１４４時間、特定的には約９６から１２０時間、より特定的には約１２０時間にわたり実施される。
【0126】
本発明の第１１の態様の好ましい実施形態では、工程ａ）は、約５：１、２０：１、又は５０：１のモル比で金属とタンパク質とを混合することにより実施され、且つ工程ｂは、約２０から９０時間にわたり約３０から５５℃の温度で実施される。より特定の実施形態では、工程ａ）の金属とタンパク質とのモル比は５０：１であり、且つ工程ｂ）は、約７２時間にわたり約５０℃の温度で実施される。
【0127】
工程（ｂ）から得られたタンパク質安定化金属ナノクラスターは、溶液の他の成分（例えば、未反応のフリーの金属カチオン、アニオン、塩、又は本発明のタンパク質）からナノクラスターを分離するために分離技術に付すことが可能である。こうした技術の例示的な例として、限定されるものではないが、濾過（例えば、選択された分子カットオフを有するメンブレンを用いて）、沈殿（例えば、エタノールなどの水溶性有機溶媒を用いて）、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を適用することが可能である。その後、続いて、単離されたナノクラスターの乾燥又は凍結乾燥を行うことが可能である。
【0128】
本発明の第１３の態様は、イメージング剤としての、薬剤送達担体としての、代謝干渉剤としての、触媒としての、検体としての、結晶学的データセットの位相調整用としての、細胞標識剤としての、特異的タンパク質標識剤としての、バイオセンサーとしての、温度センサーとしての、光増感剤としての、又は光電子デバイスの製造用としての、本発明の第９の態様若しくは第１２の態様の金属ナノクラスター又は第１０の態様の金属ナノクラスターの組合せの使用に関する。
【0129】
第１３の態様の特定の実施形態では、いずれかの起源の細胞内での使用が実施可能である。特定の実施形態では、細胞は植物細胞又は動物細胞である。さらにより特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【0130】
本発明のある実施形態では、第９の態様又は第１２の態様の金属ＮＣを使用する場合、蛍光金属ナノクラスターからの蛍光シグナルの検出は、対照サンプルと比較してサンプルで検出された蛍光シグナルの変化を検出することを含む。例えば、蛍光シグナルの変化は蛍光シグナルの波長の変化である。ある特定の態様では、蛍光シグナルの変化は、蛍光シグナルの波長の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｍの変化である。
【0131】
第１３の態様の他の好ましい一実施形態では、使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの使用である。
【0132】
タンパク質安定化金属ナノクラスターの特定の使用は、薬剤、好ましくは治療有効量の薬剤を送達するための使用である。
【0133】
本明細書で用いられる「治療有効量」又は「有効量」という用語は、病気の治療又は予防のどちらかで所望の利益を提供するのに十分な程度に多い、ただし、医学的判断の範囲内で重篤な副作用を回避するのに十分な程度に少ない活性剤（薬剤）の量を意味する。本発明に係る前記薬剤の特定の用量は、投与化合物、投与経路、及び治療される特定の病態を含めて患者を取り巻く特定の状況により決定されるであろう。
【0134】
「薬剤」という用語は、疾患又は病態例えば癌などの治療、治癒、又は予防に使用される化学物質を意味する。薬剤の化学的性質は大幅に異なりうる。例えば、それは低分子、ペプチドなどでありうる。特定の実施形態では、薬剤は、荷電状態又は中性状態、蛍光性又は非蛍光性でありうる。
【0135】
センサーとしては、タンパク質安定化金属ナノクラスターは、例えば、温度センサー、ｐＨセンサーとして、及び診断において又は治療に対する反応を評価するために比色バイオセンシングに使用可能である。
【0136】
化学反応を触媒するためにタンパク質安定化金属ナノクラスターを使用する場合、ナノクラスターは担体上に位置しうる。触媒金属の組合せを使用しうる。いずれかの好適な担体粒子を使用しうる。粒子に好適な典型的な担体は炭素担体であるが、シリカ又はいずれかの他の多孔性材料からも作製しうる。好適な炭素担体材料としては、Shaw C-55（商標）（Chevron Texaco Corp., Houston, Tex.）、Vulcan（登録商標）XC-72カーボンブラック（Cabot Corp., Waltham, Mass.）、Black Pearls（登録商標）2000 Carbon（Cabot Corp., Waltham, Mass.）などが挙げられる。
【0137】
タンパク質安定化金属ナノクラスターは、重原子を用いた多波長異常回折（ＭＡＤ）又は単波長異常分散（ＳＡＤ）の位相調整と同様に結晶学的データセットの位相調整用として使用可能である。
【0138】
タンパク質安定化金属ナノクラスターは、フォトダイナミック療法用光増感剤として使用可能である。
【0139】
光増感剤は、光化学プロセスにおいて他の分子に化学変化を引き起こす分子である。フォトダイナミック療法（ＰＤＴ）は、光と光増感物質とが関与する光線療法の形態であり、細胞死を誘発するために分子酸素が併用される。ＰＤＴは、ヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞例えば癌細胞の死を誘発するために使用可能であり（例えば、前立腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肺癌、及び膀胱癌で使用可能である）、ウェット加齢黄斑変性、乾癬、及びアテローム硬化症の治療に使用されてきた。ＰＤＴは、細菌、真菌、及びウイルスにより引き起こされる病態を治療するために使用可能である。ＰＤＴは、座瘡の治療及びヘルペスを含めて抗ウイルス治療に役立つ。したがって、タンパク質安定化金属ナノクラスターは、上述した治療のいずれかでフォトダイナミック療法用光増感剤として使用可能である。
【0140】
タンパク質安定化金属ナノクラスターは、光電子デバイスとして使用可能である。光電子デバイスは、光及び電流の両方で動作する電子デバイスである。これは、レーザーダイオードや発光ダイオードなどの電動光源、ソーラーセルや光起電力セルなどの光を電流に変換するためのコンポーネント、光の伝播を電子的に制御可能なデバイスを含みうる。
【0141】
本発明の第１４の態様の特定の実施形態では、キットは１つ以上のバイアルを含む。
【0142】
本発明の第１４の態様の他の一実施形態では、キットは上述した金属含有化合物を含む。より好ましい実施形態では、キットは上述した還元剤を含む。
【0143】
第１４の態様の他の一実施形態では、キットは、本発明の第９又は第１２の態様の金属ナノクラスター又は本発明の第１０の態様に係る金属ナノクラスターの組合せを作製するための、本発明の第１の態様に係るアミノ酸配列又は本発明の第２の態様に係るペプチド又は本発明の第３の態様に係るタンパク質又は本発明の第４の態様に係る核酸配列又は本発明の第５の態様に係る発現カセット又は本発明の第６の態様の核酸ベクター又は本発明の第７の態様に係る宿主細胞の使用の適応が記された説明書（例えばリーフレット）を含む。
【0144】
本発明の第１４の態様の他の一実施形態では、キットは、本発明の第１３の態様の使用における、本発明の第９又は第１２の態様の金属ナノクラスター又は本発明の第１０の態様に係る金属ナノクラスターの組合せの使用の適応が記された説明書（例えばリーフレット）を含む。
【0145】
本発明の第１４の態様の他の一実施形態では、キットは、上述した使用において本発明のタンパク質安定化金属ナノクラスターの使用を可能にするエレメントを含む。
【0146】
第１６の態様では、本発明はデバイスを提供する。
【0147】
タンパク質足場は基材上に配置可能である。基材中への足場の組織化により、作製される特定のデバイスを決定可能である。それはアレイなどの所定のパターンで配置可能である。アレイは、複数の単分散タンパク質安定化金属ナノクラスター（実質的に同一のサイズのクラスター）により形成可能である。基材は、タンパク質安定化ナノクラスターを足場に装着するように又は足場として作用するタンパク質を装着するように処理可能である。
【0148】
基材上に所定のパターンで足場を配置するいくつかの方法が存在する。例えば、第１の方法は、基材上の電極間に形成された電界で足場分子をアライメントすることを含む。したがって、電極間にアライメントできるように使用される足場分子が十分な双極子を有していなければならないことは、分かるであろう。これはαヘリックスを形成するポリペプチドが好ましい１つの理由である。αヘリックスは、電界の形成時に電極間に分子をアライメントできるようにする十分な双極子をポリペプチド分子に付与する。第２の方法は、モノマー、オリゴマー（１０アミノ酸若しくはヌクレオチド以下）、又は小さなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを基材の表面上のより長い分子中に重合させることを含む。例えば、足場分子は、基材上で電極間のブリッジとして重合させることが可能である。
【0149】
足場は、静電結合や共有結合などによりタンパク質をより強固に基材に接着させることとは対照的に、基材の表面に単純に配置しうる。本明細書で用いられる場合、「基材」という用語は、デバイス例えば電子デバイスを形成するために使用しうるいずれかの材料又は材料の組合せを意味する。例えば、基材は、ケイ素、窒化ケイ素、超フラットガラス、金属、及びそれらの組合せからなる群から選択しうる。
【0150】
単純に表面上に足場を配置するので、作業デバイスの作製プロセスは単純化される。基材の表面上への足場の配置は、（１）分子足場を含有する溶液を形成することと、（２）基材上への溶液のスピンコーティングなどにより足場を含有する溶液を基材上に配置することと、（３）溶媒を蒸発させることにより基材表面上に固形分子足場を堆積させることと、により達成可能である。基材上への足場の単純な堆積が十分にロバストなデバイスを生成しない場合、より強固に足場を基材に結合させうる。これを達成する一方法は、基材と分子足場との間で接着剤又はテザーとして作用する化合物を使用することである。どの化合物を接着剤又はテザーとして使用するかは、基材及び金属ナノクラスターの性質に依存する。例えば、アミノシラン試薬を用いて基材に分子足場を装着しうる。シラン官能基は、ケイ素、ガラス、又は金の基材へのテザーの結合を可能にする。これにより、基材に足場をテザー連結するために足場との反応に使用可能な末端アミノ基を有するテザーが提供される。末端アミノ基はまた、活性化アミノ酸を用いたタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ重合の開始部位として使用可能である。
【0151】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（～を含む）」という語及びその語の変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を除外することを意図するものではない。さらに、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（～を含む）」という語は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（～からなる）」の場合を包含する。本発明のそのほかの目的、利点、及び特徴は、本明細書を吟味することにより当業者に明らかになるだろう。又は本発明を実施すれば分かるであろう。以下の実施例及び図面は、例示を目的として提供されたものであり、本発明を限定することを意図したものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の及び好ましい実施形態のすべての可能な組合せをカバーする。
【実施例】
【0152】
実施例
材料及び方法：
１．ペプチドブロックの調製：
本セクションに提供される式（ＩＩ）のタンパク質の設計のために、配列番号３７の配列の「ＣＴＲＰ１＿Ｗ」、「ユニットＷ」、「Ｗ」、「モジュールＷ」、又は「Ｗモジュール」と称される且つ配列番号３８のＤＮＡ配列によりコードされるペプチドブロックをスターターブロックとして使用した。これから、製造業者の説明書に従ってQuickChange部位指向突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて配列番号３８でパンクチュアル（punctual）突然変異を行った。作製した変異体の各々を表１にまとめる。
材料及び方法：
１．ペプチドブロックの調製：
本セクションに提供される式（ＩＩ）のタンパク質の設計のために、配列番号３７の配列の「ＣＴＲＰ１＿Ｗ」、「ユニットＷ」、「Ｗ」、「モジュールＷ」、又は「Ｗモジュール」と称される且つ配列番号３８のＤＮＡ配列によりコードされるペプチドブロックをスターターブロックとして使用した。これから、製造業者の説明書に従ってQuickChange部位指向突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて配列番号３８でパンクチュアル（punctual）突然変異を行った。作製した変異体の各々を表１にまとめる。
【0153】
【表1】
【0154】
これらのモジュールを調製するために、式（Ｉ）に記載の「Ｇ」エレメントとして配列番号２３を使用した。配列番号２５を代わりに用いてモジュールの作製を行い、類似の結果を得た（データは示されていない）。同様に、配列番号２４も使用する。
【0155】
２．式（ＩＩ）のタンパク質の調製：
以下の表２に列挙されたタンパク質を得るために、先のセクションに記載のモジュールをコードする核酸をライゲートし一体化させた（pProEx-HTAベクター（Invitrogen）でＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩを用いて）。ＤＮＡシーケンシング（Stab vida）により構築物アイデンティティーを検証した。Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ及びアンピシリン耐性をコードする前記ベクター中の所望のタンパク質に対する合成遺伝子をＥ．コリ（E. coli）Ｃ４１細胞にトランスフォームし、３７℃の寒天プレート上で一晩培養した。１つの単一コロニーを選択し、１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリンを含有する５０ｍＬのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で一晩インキュベートした。次いで、１０ｍＬの一晩培養物を１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリンが補足された１ＬのＬＢ培地中に分注した。光学濃度（ＯＤ６００）が０．６から０．８に達するまで、３７℃のインキュベーターシェーカー（２５０ｒｐｍ）中で細胞を成長させた。１ｍＭイソプロピルβ－ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）でＣＴＰＲの発現を誘発し、続いて３７℃で５時間の発現を行った。５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより細胞を採取した。５０ｍＭトリス、３００ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶解緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁させた。マイクロチップソニケーターを用いて３０％のパワーで２分間超音波処理した後、溶解細胞を１６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして標準的Ｃｏ－ＮＴＡアフィニティー精製プロトコルを用いてタンパク質上清を精製した。次いで、ＴＥＶプロテアーゼを用いてＣＴＰＲタンパク質からＮ末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。最終工程として、６から８ｋＤａの分子量カットオフを有する透析膜を用いて４℃で１０ｍＭリン酸緩衝液に対してＣＴＰＲの水性溶液を３回透析した。アミノ酸組成から計算された２８０ｎｍの吸光係数を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸収によりタンパク質濃度を測定した。
以下の表２に列挙されたタンパク質を得るために、先のセクションに記載のモジュールをコードする核酸をライゲートし一体化させた（pProEx-HTAベクター（Invitrogen）でＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩを用いて）。ＤＮＡシーケンシング（Stab vida）により構築物アイデンティティーを検証した。Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ及びアンピシリン耐性をコードする前記ベクター中の所望のタンパク質に対する合成遺伝子をＥ．コリ（E. coli）Ｃ４１細胞にトランスフォームし、３７℃の寒天プレート上で一晩培養した。１つの単一コロニーを選択し、１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリンを含有する５０ｍＬのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で一晩インキュベートした。次いで、１０ｍＬの一晩培養物を１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリンが補足された１ＬのＬＢ培地中に分注した。光学濃度（ＯＤ６００）が０．６から０．８に達するまで、３７℃のインキュベーターシェーカー（２５０ｒｐｍ）中で細胞を成長させた。１ｍＭイソプロピルβ－ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）でＣＴＰＲの発現を誘発し、続いて３７℃で５時間の発現を行った。５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより細胞を採取した。５０ｍＭトリス、３００ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶解緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁させた。マイクロチップソニケーターを用いて３０％のパワーで２分間超音波処理した後、溶解細胞を１６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして標準的Ｃｏ－ＮＴＡアフィニティー精製プロトコルを用いてタンパク質上清を精製した。次いで、ＴＥＶプロテアーゼを用いてＣＴＰＲタンパク質からＮ末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。最終工程として、６から８ｋＤａの分子量カットオフを有する透析膜を用いて４℃で１０ｍＭリン酸緩衝液に対してＣＴＰＲの水性溶液を３回透析した。アミノ酸組成から計算された２８０ｎｍの吸光係数を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸収によりタンパク質濃度を測定した。
【0156】
こうして、表２に列挙された式（ＩＩ）のタンパク質を調製した。
【0157】
【表2】
【0158】
合成されたＣＴＰＲタンパク質は、Ｎ末端にクローニング技術に起因する余分な配列ＧＡＭＧＳ（配列番号６９）と、Ｃ末端にタンパク質の溶解性を増加させるのに役立つαヘリックス二次構造を有する余分な配列（ＡＥＡＫＱＮＬＧＮＡＫＱＫＱＧ、配列番号７０）と、をさらに含んでいた。
【0159】
それらの使用前、以下のように、アフィニティークロマトグラフィーにより２回及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によりさらに１回の、合わせて３回にわたりタンパク質を精製した。
１．コバルト又はニッケルニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アフィニティー精製のプロトコル：超音波処理による細胞溶解後に得られたタンパク質上清を５ｍｌ／ｍｉｎの流量のポンプによりアフィニティーカラム（Ｃｏ－ＮＴＡ、Ｎｉ－ＮＴＡ）にロードした。次いで、５０から１００ｍＬの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０でカラムを洗浄した。最後に、２５ｍＬの３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０を用いてタンパク質を溶出させた。
２．次いで、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断を用いてタンパク質からＮ末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。４℃の消化緩衝液（０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、５０ｍＭトリスｐＨ８．０）中で１単位／ｍｌのＴＥＶプロテアーゼと共にタンパク質を一晩インキュベートした。
３．Ｃｏ－ＮＴＡ又はＮｉ－ＮＴＡアフィニティー精製のプロトコル：Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグの切断後に得られたタンパク質溶液を５ｍｌ／ｍｉｎの流量のポンプによりアフィニティー（Ｃｏ－ＮＴＡ、Ｎｉ－ＮＴＡ）にロードした。精製されたタンパク質をフロースルー画分で捕集した。
４．高分解能分取サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＦＰＬＣ：２回のアフィニティークロマトグラフ後に得られた精製タンパク質をシリンジによりゲル濾過カラム（タンパク質のサイズに依存してSuperdex 75又は200）を備えたＦＰＬＣシステムにロードした。１ｍｌ／ｍｉｎの流量で３００ｍＭ ＮａＣｌ、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７．４の溶液を用いてタンパク質を溶出させた。タンパク質を２ｍＬの画分で捕集した。
５．アミノ酸組成から計算された２８０ｎｍの吸光係数を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸収によりタンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプルは－２０℃で凍結貯蔵した。
１．コバルト又はニッケルニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アフィニティー精製のプロトコル：超音波処理による細胞溶解後に得られたタンパク質上清を５ｍｌ／ｍｉｎの流量のポンプによりアフィニティーカラム（Ｃｏ－ＮＴＡ、Ｎｉ－ＮＴＡ）にロードした。次いで、５０から１００ｍＬの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０でカラムを洗浄した。最後に、２５ｍＬの３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０を用いてタンパク質を溶出させた。
２．次いで、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断を用いてタンパク質からＮ末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。４℃の消化緩衝液（０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、５０ｍＭトリスｐＨ８．０）中で１単位／ｍｌのＴＥＶプロテアーゼと共にタンパク質を一晩インキュベートした。
３．Ｃｏ－ＮＴＡ又はＮｉ－ＮＴＡアフィニティー精製のプロトコル：Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグの切断後に得られたタンパク質溶液を５ｍｌ／ｍｉｎの流量のポンプによりアフィニティー（Ｃｏ－ＮＴＡ、Ｎｉ－ＮＴＡ）にロードした。精製されたタンパク質をフロースルー画分で捕集した。
４．高分解能分取サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＦＰＬＣ：２回のアフィニティークロマトグラフ後に得られた精製タンパク質をシリンジによりゲル濾過カラム（タンパク質のサイズに依存してSuperdex 75又は200）を備えたＦＰＬＣシステムにロードした。１ｍｌ／ｍｉｎの流量で３００ｍＭ ＮａＣｌ、トリス／ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７．４の溶液を用いてタンパク質を溶出させた。タンパク質を２ｍＬの画分で捕集した。
５．アミノ酸組成から計算された２８０ｎｍの吸光係数を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸収によりタンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプルは－２０℃で凍結貯蔵した。
【0160】
３．タンパク質安定化ナノクラスターの合成：
ａ）タンパク質安定化銅ナノクラスター（タンパク質－ＣｕＮＣ）の合成
最初に、３０秒間ボルテックスして２０００μＬの１０μＭ試験タンパク質とＣｕＳＯ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、少なくとも３０分間放置して銅イオンをタンパク質に吸着させた。次いで、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（ＣｕＳＯ４を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより銅イオンから金属銅への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化銅ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
ａ）タンパク質安定化銅ナノクラスター（タンパク質－ＣｕＮＣ）の合成
最初に、３０秒間ボルテックスして２０００μＬの１０μＭ試験タンパク質とＣｕＳＯ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、少なくとも３０分間放置して銅イオンをタンパク質に吸着させた。次いで、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（ＣｕＳＯ４を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより銅イオンから金属銅への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化銅ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
【0161】
ｂ）タンパク質安定化金ナノクラスター（タンパク質－ＡｕＮＣ）の合成
最初に、３０秒間ボルテックスして１０００μＬの２０μＭタンパク質とＨＡｕＣｌ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して金イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＨＡｕＣｌ４を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより金イオンから金属金への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化金ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
最初に、３０秒間ボルテックスして１０００μＬの２０μＭタンパク質とＨＡｕＣｌ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して金イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＨＡｕＣｌ４を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより金イオンから金属金への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化金ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
【0162】
ｃ）タンパク質安定化銀ナノクラスター（タンパク質－ＡｇＮＣ）の合成
最初に、３０秒間ボルテックスして５００μＬの２０μＭタンパク質とＡｇＮＯ３（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して銀イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＡｇＮＯ３を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより銀イオンから金属銀への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化銀ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
最初に、３０秒間ボルテックスして５００μＬの２０μＭタンパク質とＡｇＮＯ３（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．又はシステイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して銀イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＡｇＮＯ３を基準にして１０又は１００ｅｑ．）を添加することにより銀イオンから金属銀への還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスし、次いでは３７℃又は５０℃で７２時間インキュベーした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化銀ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
【0163】
４．金属混合物を用いた蛍光金属ＮＣの合成：
以上の実施例３のときと同一の実験条件（還元剤、システイン：金属：還元剤比、及び反応時間）で、金属（Ａｕ及びＡｇ）ＮＣの合成及び安定化における金属混合物の効果を評価した。ただし、この場合には、５００μＬの２０μＭ試験タンパク質（ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ）とＨＡｕＣｌ４及び／又はＡｇＮＯ３（システイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合した。
以上の実施例３のときと同一の実験条件（還元剤、システイン：金属：還元剤比、及び反応時間）で、金属（Ａｕ及びＡｇ）ＮＣの合成及び安定化における金属混合物の効果を評価した。ただし、この場合には、５００μＬの２０μＭ試験タンパク質（ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ）とＨＡｕＣｌ４及び／又はＡｇＮＯ３（システイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合した。
【0164】
５．異なる発光色を有するタンパク質安定化銅ナノクラスターの合成：
そのほか、異なる発光色を有するＣｕＮＣの形成の可能性を試験した。この目標に向かって、ＣｕＮＣの合成及び安定化に関して以上に記載したものに類似したプロトコルに従ってタンパク質ＷＨＷを鋳型として用いたＣｕＮＣの合成及び安定化を行った。ただし、温度（３７及び５０℃）並びに還元剤（アスコルビン酸ナトリウム、タンニン酸、及びヒドラジン）のパラメーターに変更を加えた。
そのほか、異なる発光色を有するＣｕＮＣの形成の可能性を試験した。この目標に向かって、ＣｕＮＣの合成及び安定化に関して以上に記載したものに類似したプロトコルに従ってタンパク質ＷＨＷを鋳型として用いたＣｕＮＣの合成及び安定化を行った。ただし、温度（３７及び５０℃）並びに還元剤（アスコルビン酸ナトリウム、タンニン酸、及びヒドラジン）のパラメーターに変更を加えた。
【0165】
すべての場合に、２０００μＬの１０μＭタンパク質とＣｕＳＯ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．）とを少なくとも３０分間混合して銅イオンをタンパク質の安定化部位に吸着させた。次いで、以下の条件を適用することにより銅イオンから金属銅への還元を達成した（表３）。
【0166】
【表3】
【0167】
最後に、すべての場合に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、さらなる実験のために４℃に維持した。
【0168】
６．核局在化シグナルに融合させた本発明のタンパク質ＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣ：
細胞マーカーとしてとくに核マーカーとして本発明のタンパク質安定化金属ＮＣの能力を試験した。
細胞マーカーとしてとくに核マーカーとして本発明のタンパク質安定化金属ＮＣの能力を試験した。
【0169】
ＮＬＳ－ＷＨＷの合成：ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用した（配列番号７１）。ＷＨＷタンパク質をコードする遺伝子を含むpProEx-HTAベクターと、ＮＬＳペプチドの配列を含むプライマー（フォワードプライマー配列番号８８、リバースプライマー配列番号８９）と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＮＬＳ－ＷＨＷタンパク質をコードする遺伝子を構築した。ＤＮＡシーケンシング（Stab vida）により構築物アイデンティティーを検証した。配列番号７９はＮＬＳ－ＷＨＷタンパク質を表し、配列番号８０は前記タンパク質をコードするＤＮＡを表す。
【0170】
ＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣの合成：ＣｕＮＣの合成及び安定化に関して以上に記載したのと同一のプロトコルに従って、ＮＬＳ－ＷＨＷタンパク質を鋳型として用いたＣｕＮＣの合成及び安定化を行った。
【0171】
最後に、ＣＴＰＲタンパク質安定化ＣｕＮＣの蛍光性に及ぼすＮＬＳの存在の影響を調べるために、マイクロプレートリーダーを用いてタンパク質安定化ＣｕＮＣの蛍光スペクトルを収集した。
【0172】
細胞イメージング：細胞イメージングを評価するために、ＭＣＦ７細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（Manassas, VA, USA）から購入した）を２４ウェルプレート上の５００μｌの完全培地中で２．５×１０４細胞／ウェルの密度で培養した。２４時間後、成長培地を除去してからＷＨＷ－ＣｕＮＣ及びＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣ（５μＭ）の存在下、３７℃で細胞を２４時間インキュベートし、インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄してフリーの非結合タンパク質安定化ＣｕＮＣを除去し、最後に、蛍光顕微鏡下で観察した。
【0173】
７．認識ドメインに融合させた本発明のタンパク質（ＣＣ１ＣＴＰＲ３９０、ＣＣ１ＴＰＲ２Ａ及びＣＣ１ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋ）：
蛍光ＡｕＮＣを生成するＣｙｓクランプモジュールと、異なる結合活性を有するＣＴＰＲモジュールと、を組み合わせた新たなＣＴＰＲタンパク質を形成した。ただし、ＣＴＰＲタンパク質の構造及び機能の健全性は保存された。ＣＣ１モジュール（表１に示されるようにモジュールＣ及びＣ１を融合させることにより得られた）を３つの異なるＨｓｐ９０認識ドメイン：ＣＴＰＲ３９０、ＴＰＲ２Ａ、及びＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋに融合させて（ベクターpProEx-HTAを用いてＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより）、タンパク質ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０（配列番号９２によりコードされる）を表す配列番号９１、タンパク質ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ（配列番号９４によりコードされる）を表す配列番号９３、及びタンパク質ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋ（配列番号９６によりコードされる）を表す配列番号９５を形成した。以上に示されるようにタンパク質の発現及び精製を実施した。以上の実施例６に開示されるようにタンパク質の構造を特徴付けた。
蛍光ＡｕＮＣを生成するＣｙｓクランプモジュールと、異なる結合活性を有するＣＴＰＲモジュールと、を組み合わせた新たなＣＴＰＲタンパク質を形成した。ただし、ＣＴＰＲタンパク質の構造及び機能の健全性は保存された。ＣＣ１モジュール（表１に示されるようにモジュールＣ及びＣ１を融合させることにより得られた）を３つの異なるＨｓｐ９０認識ドメイン：ＣＴＰＲ３９０、ＴＰＲ２Ａ、及びＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋに融合させて（ベクターpProEx-HTAを用いてＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより）、タンパク質ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０（配列番号９２によりコードされる）を表す配列番号９１、タンパク質ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ（配列番号９４によりコードされる）を表す配列番号９３、及びタンパク質ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋ（配列番号９６によりコードされる）を表す配列番号９５を形成した。以上に示されるようにタンパク質の発現及び精製を実施した。以上の実施例６に開示されるようにタンパク質の構造を特徴付けた。
【0174】
そのほか、ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０、ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ、ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋタンパク質及びその標的ペプチドを用いることにより、試験タンパク質のリガンド結合活性を調べた。５０ｎＭフルオレセイン標識Ｈｓｐ９０ペプチド溶液中に漸増量のタンパク質を加えて蛍光異方性によりＨｓｐ９０ペプチド（配列番号９０）へのタンパク質結合親和性を決定した。励起偏光子及び発光偏光子を備えたPerkin Elmer Fluorimeterで蛍光強度を記録した。５ｎｍのスリット幅で４９２ｎｍの励起を達成し、且つ５ｎｍのスリット幅で５１６ｎｍの発光を記録した。タンパク質の二次構造エレメント、とくに、ＴＰＲタンパク質のα－ヘリックス構造を報告する領域でスペクトルを取得した。
【0175】
以上に記載のものと同一のプロトコルを用いてＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣを形成した（実施例３ｂ）。ＡｕＮＣ蛍光をモニターしてＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣのセンシング性を調べた。ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣ溶液のＰＢＳ中２０μＭタンパク質濃度の蛍光発光スペクトルを記録した。Ｈｓｐ９０リガンドペプチドの漸増時（５から６００μＭ）に蛍光発光スペクトルの変化を決定した。分光蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で蛍光スペクトルを記録した。５ｎｍのスリット幅で３７０ｎｍの励起を達成し、且つ５ｎｍのスリット幅で３９０から５５０ｎｍの発光を記録した。最大発光（４５０ｎｍ）で蛍光強度を記録し、各点で３回の測定の平均を報告した。
【0176】
８．蛍光量子収率の決定：
エタノール中のアントラセンを参照として用いて蛍光量子収率（Φ）を計算した（ΦＲｅｆ＝０．２７、λｅｘｃ＝３７０ｎｍ、及びλｅｍ＝４２３ｎｍ）。
エタノール中のアントラセンを参照として用いて蛍光量子収率（Φ）を計算した（ΦＲｅｆ＝０．２７、λｅｘｃ＝３７０ｎｍ、及びλｅｍ＝４２３ｎｍ）。
【0177】
Fluoromax 4（Horiba Jobin-Yvon）を用いて蛍光測定を行い、且つCary 50 Conc（Varian）を用いて石英キュベット中で吸光度を記録した。
【0178】
９．タンパク質－ＮＣ構造の決定：
Jasco J-815分光計を用いて円二色性（ＣＤ）によりナノクラスター形成時のタンパク質二次構造を調べた。１ｎｍの増分で１ｎｍのバンド幅及び１０秒間の平均時間を用いて０．１ｃｍの経路長のキュベット中で１０μＭのタンパク質濃度におけるＣＤスペクトルを取得した。
Jasco J-815分光計を用いて円二色性（ＣＤ）によりナノクラスター形成時のタンパク質二次構造を調べた。１ｎｍの増分で１ｎｍのバンド幅及び１０秒間の平均時間を用いて０．１ｃｍの経路長のキュベット中で１０μＭのタンパク質濃度におけるＣＤスペクトルを取得した。
【0179】
１０．透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：
炭素で被覆されたすべてのＣｕ／Ｒｈグリッドをサンプル堆積前にグロー放電に暴露した。１０μＬの試験サンプル溶液をグリッド上に堆積させることによりＴＥＭ用サンプルを作製した。３分後、濾紙を用いて過剰の溶液をグリッドから除去した。堆積した塩を除去するために、グリッドを１滴の水で洗浄し、濾紙を用いて過剰の水を乾燥させた。次いで、２％酢酸ウラニル溶液のドロップレットを用いてグリッドを１分間染色し、濾紙を用いて過剰の溶液を除去した。１００ｋＶで操作されるタングステンフィラメントを備えたJEOL JEM1200EXII電子顕微鏡でKodak SO-163フィルムを用いて６０Ｋの倍率で顕微鏡写真を記録した。
炭素で被覆されたすべてのＣｕ／Ｒｈグリッドをサンプル堆積前にグロー放電に暴露した。１０μＬの試験サンプル溶液をグリッド上に堆積させることによりＴＥＭ用サンプルを作製した。３分後、濾紙を用いて過剰の溶液をグリッドから除去した。堆積した塩を除去するために、グリッドを１滴の水で洗浄し、濾紙を用いて過剰の水を乾燥させた。次いで、２％酢酸ウラニル溶液のドロップレットを用いてグリッドを１分間染色し、濾紙を用いて過剰の溶液を除去した。１００ｋＶで操作されるタングステンフィラメントを備えたJEOL JEM1200EXII電子顕微鏡でKodak SO-163フィルムを用いて６０Ｋの倍率で顕微鏡写真を記録した。
【0180】
１１．本発明のＮＣの安定化に利用可能なクリティカルパラメーターを決定する試験
タンパク質：金属比、金属：還元剤比、及び反応時間の影響を調べた。
タンパク質：金属比、金属：還元剤比、及び反応時間の影響を調べた。
【0181】
タンパク質ＷＨＷを鋳型として用いて以上に提供されたもの（実施例３ａ）に類似したプロトコルを開発し、ＣｕＮＣの合成及び安定化におけるタンパク質：金属、金属：還元剤比、及び反応時間の影響を調べた。３つの異なる金属：タンパク質比（５：１、２０：１、及び５０：１）、２つの異なる金属：還元剤比（１：１０及び１：１００）、並びに３つの異なる反応時間（２４、４８、及び７２時間）を試験した。比とはモル当量を意味する。結果は、結果セクション番号１（「ヒスチジンクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光金属ナノクラスター」と称される）に提供される。
【0182】
実施例２に記載のタンパク質（ＷＷＷ、ＷＸ１Ｗ、ＷＸＷ、ＷＣ１Ｗ、ＷＨＷ、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ）（図７、８、及び９）を用いて、次のプロトコルに従った。最初に、３０秒間ボルテックスして５００μＬの２０μＭタンパク質とＣｕＳＯ４、ＨＡｕＣｌ４、又はＡｇＮＯ３（システイン数を基準にして５ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して金属イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＨＡｕＣｌ４、ＡｇＮＯ３、又はＣｕＳＯ４を基準にして１０ｅｑ．）を添加することにより、銅／金／銀イオンから金属の銅／金／銀への還元を達成した。反応混合物を３７℃又は５０℃で７２時間インキュベートした。結果は、結果セクション番号２（「システインクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光金属ナノクラスター」と称される）に提供される。
【0183】
実施例２に記載のタンパク質（ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１、及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）（図１０）を用いて、次のプロトコルを使用した。５００μＬの２０μＭタンパク質溶液とＨＡｕＣｌ４（システイン数又はヒスチジン数を基準にして１５ｅｑ．）とを混合して３０秒間ボルテックスした。次いで、反応系を３０分間インキュベートして金属イオンをタンパク質のシステイン又はヒスチジンに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（ＨＡｕＣｌ４を基準にして１０ｅｑ．）を添加することにより金イオンから金属金への還元を達成した。反応混合物を３７℃で７２時間インキュベートした。結果は、結果セクション番号４（「システインクランプと比較されるヒスチジンクランプに基づく配位残基を有するいくつかのモジュールを含有するＣＴＰＲ変異体を含む蛍光金ナノクラスター」と称される）に提供される。
【0184】
１２．本発明の設計タンパク質とシステイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体との間の金属ナノクラスターの合成及び安定化の効率の比較
同一の実験条件（還元剤、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、金属ナノクラスターの合成及び安定化に関して、システイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体と比較して、本発明の設計タンパク質の効率を評価した。結果は、結果セクション５（「本発明の設計タンパク質とシステイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体との間の金属ナノクラスターの合成及び安定化の効率の比較」）（図１１、１２、及び１３）に提供される。
同一の実験条件（還元剤、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、金属ナノクラスターの合成及び安定化に関して、システイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体と比較して、本発明の設計タンパク質の効率を評価した。結果は、結果セクション５（「本発明の設計タンパク質とシステイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体との間の金属ナノクラスターの合成及び安定化の効率の比較」）（図１１、１２、及び１３）に提供される。
【0185】
実施例２に記載のタンパク質（ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、ＷＣ３Ｗ、ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、ＷＨ３Ｗ、ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗ）を用いて、次のプロトコルに従った。
【0186】
最初に、３０秒間ボルテックスして１０００μＬの２０μＭタンパク質とＣｕＳＯ４、ＡｇＮＯ３、又はＨＡｕＣｌ４（タンパク質を基準にして５０ｅｑ．）とを混合し、次いで、３０分間放置して金イオンをタンパク質のシステインに吸着させた。次いで、アスコルビン酸ナトリウム（金属を基準にして１０ｅｑ．）を添加することにより金属イオンから金属メタルへの還元を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスしてから３７℃で７２時間インキュベートした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化金ナノクラスターの蛍光スペクトルを収集した。
【0187】
１３．タンパク質安定化ＣｄＳナノクラスターの合成：
２５００μＬの５μＭタンパク質とＣｄ（ＣＨ３ＣＯ２）２（０．４ｍＭ）とを混合して３０秒間ボルテックスした。次いで、反応系を６０分間インキュベートしてＣｄイオンをタンパク質のヒスチジンに吸着させた。次いで、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）（０．２８ｍＭ）を添加することによりＣｄＳナノクラスターの形成を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスしてから３７℃で５日間インキュベートした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化ＣｄＳＮＣの蛍光スペクトルを収集した。結果は、結果セクション番号６（「ヒスチジンクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光ＣｄＳナノクラスター」）（図１４及び１５）に提供される。
２５００μＬの５μＭタンパク質とＣｄ（ＣＨ３ＣＯ２）２（０．４ｍＭ）とを混合して３０秒間ボルテックスした。次いで、反応系を６０分間インキュベートしてＣｄイオンをタンパク質のヒスチジンに吸着させた。次いで、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）（０．２８ｍＭ）を添加することによりＣｄＳナノクラスターの形成を達成した。反応混合物を３０秒間ボルテックスしてから３７℃で５日間インキュベートした。最後に、１０ｋＤａメンブレンを備えたAmicon限外濾過チューブを用いてサンプルをＰＢＳで数回洗浄して未反応塩を排除し、次いで、ＦＰＬＣにより精製した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてタンパク質安定化ＣｄＳＮＣの蛍光スペクトルを収集した。結果は、結果セクション番号６（「ヒスチジンクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光ＣｄＳナノクラスター」）（図１４及び１５）に提供される。
【0188】
１４．タンパク質－ＮＣ安定性の決定：
マイクロプレートリーダーを用いて蛍光分光測光によりＰＢＳ中及びヒト血漿中における１０μＭ ＷＨＷ－ＣｕＮＣの安定性を室温で１週間調べた。
マイクロプレートリーダーを用いて蛍光分光測光によりＰＢＳ中及びヒト血漿中における１０μＭ ＷＨＷ－ＣｕＮＣの安定性を室温で１週間調べた。
【0189】
１５．生存能及び内在化の研究用の細胞培養物の調製：
１０％の最終濃度でウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．２５μｇ／ｍＬフンギゾン及び１００単位のペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で単層としてＭＣＦ７細胞株を成長させた。培地、血清、Ｌ－グルタミン、フンギゾン、及び抗生物質はすべて、ＧＩＢＣＯから購入した。インキュベーター内において７５％空気及び５％ＣＯ２からなる加湿雰囲気で細胞系を３７℃に維持した。ＰＢＳに分散された５００μＬのタンパク質安定化ＣｕＮＣを再分散の目的で５分間超音波処理した。次いで、１０％ＦＢＳを含有する培地中に所望の濃度でタンパク質安定化ＣｕＮＣを希釈した。得られたサンプルを０．２２μｍ Millex-GPフィルター（Merck-Millipore Darmstadt, Germany）に通して濾過し、そして再び１分間超音波処理した。タンパク質安定化ＣｕＮＣと共に細胞を２４時間インキュベートした。次いで、分散されたタンパク質安定化ＣｕＮＣを有する細胞培地を除去し、そして細胞培地からタンパク質安定化ＣｕＮＣを完全に除去するために細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、新鮮な細胞培地を添加して、さらなる生存能及び内在化の研究を継続した。
１０％の最終濃度でウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．２５μｇ／ｍＬフンギゾン及び１００単位のペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で単層としてＭＣＦ７細胞株を成長させた。培地、血清、Ｌ－グルタミン、フンギゾン、及び抗生物質はすべて、ＧＩＢＣＯから購入した。インキュベーター内において７５％空気及び５％ＣＯ２からなる加湿雰囲気で細胞系を３７℃に維持した。ＰＢＳに分散された５００μＬのタンパク質安定化ＣｕＮＣを再分散の目的で５分間超音波処理した。次いで、１０％ＦＢＳを含有する培地中に所望の濃度でタンパク質安定化ＣｕＮＣを希釈した。得られたサンプルを０．２２μｍ Millex-GPフィルター（Merck-Millipore Darmstadt, Germany）に通して濾過し、そして再び１分間超音波処理した。タンパク質安定化ＣｕＮＣと共に細胞を２４時間インキュベートした。次いで、分散されたタンパク質安定化ＣｕＮＣを有する細胞培地を除去し、そして細胞培地からタンパク質安定化ＣｕＮＣを完全に除去するために細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、新鮮な細胞培地を添加して、さらなる生存能及び内在化の研究を継続した。
【0190】
１６．ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ：
レサズリン色素（Sigma-Aldrich）は、増殖及び細胞傷害性アッセイで細胞生存能の信頼できるインジケーターとして広く使用されてきた。細胞生存能を評価するために、２４ウェルプレート上の５００μｌの完全培地中でＭＣＦ７細胞を２．５×１０４細胞／ウェルの密度で培養した。２４時間後、成長培地を除去し、次いで、異なる濃度のタンパク質安定化ＣｕＮＣ（２、５、１０、及び２０μＭ）の存在下３７℃で細胞を２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％ＦＢＳが補足されたＤＭＥＭを細胞培養物に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターで維持した。７２時間後、培地を１０％ＦＢＳ及び１０％レサズリン色素（１ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）が補足されたＤＭＥＭで置き換えた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２インキュベーターで３時間維持し、次いで、Synergy H4マイクロプレートリーダーを用いて反応混合物の吸光度を測定することにより低減されたレサズリンの量を決定した（λｅｘｃ＝５７０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。６００μｌの１０％レサズリン色素を陰性対照として空のウェルに添加した。対照細胞（ナノ粒子を含まない）と比較した処理細胞の吸収のパーセントとして細胞の生存能を表した。実験はすべてトリプリケートで行った。
レサズリン色素（Sigma-Aldrich）は、増殖及び細胞傷害性アッセイで細胞生存能の信頼できるインジケーターとして広く使用されてきた。細胞生存能を評価するために、２４ウェルプレート上の５００μｌの完全培地中でＭＣＦ７細胞を２．５×１０４細胞／ウェルの密度で培養した。２４時間後、成長培地を除去し、次いで、異なる濃度のタンパク質安定化ＣｕＮＣ（２、５、１０、及び２０μＭ）の存在下３７℃で細胞を２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％ＦＢＳが補足されたＤＭＥＭを細胞培養物に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターで維持した。７２時間後、培地を１０％ＦＢＳ及び１０％レサズリン色素（１ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）が補足されたＤＭＥＭで置き換えた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２インキュベーターで３時間維持し、次いで、Synergy H4マイクロプレートリーダーを用いて反応混合物の吸光度を測定することにより低減されたレサズリンの量を決定した（λｅｘｃ＝５７０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。６００μｌの１０％レサズリン色素を陰性対照として空のウェルに添加した。対照細胞（ナノ粒子を含まない）と比較した処理細胞の吸収のパーセントとして細胞の生存能を表した。実験はすべてトリプリケートで行った。
【0191】
１７．温度センサーとしてのタンパク質安定化金属ＮＣの使用：
以上のポイント５（異なる発光色を有するタンパク質安定化銅ナノクラスターの合成）に記載されるように合成された青色発光ＷＨＷ安定化ＣｕＮＣを次のように温度センサーとして使用した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてサンプルを３７０ｎｍで励起したときの異なる温度におけるタンパク質安定化銅ナノクラスターの蛍光発光強度を４３０ｎｍで記録した。
以上のポイント５（異なる発光色を有するタンパク質安定化銅ナノクラスターの合成）に記載されるように合成された青色発光ＷＨＷ安定化ＣｕＮＣを次のように温度センサーとして使用した。Fluorimeter Perkin Elmerを用いてサンプルを３７０ｎｍで励起したときの異なる温度におけるタンパク質安定化銅ナノクラスターの蛍光発光強度を４３０ｎｍで記録した。
【0192】
１８．ライブイメージングツールとしてのタンパク質安定化金属ＮＣの使用：
以上の材料及び方法のポイント３に記載されるように合成されたＷＨＷ安定化ＡｇＮＣの２０μＭ溶液、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の２０μＭ溶液、及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の２０μＭ溶液の蛍光強度を連続水銀アークランプ照明下でさまざまな時間でLeica DM3蛍光顕微鏡を用いて記録した。Image Jソフトウェアを用いて蛍光強度を定量した。
以上の材料及び方法のポイント３に記載されるように合成されたＷＨＷ安定化ＡｇＮＣの２０μＭ溶液、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の２０μＭ溶液、及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の２０μＭ溶液の蛍光強度を連続水銀アークランプ照明下でさまざまな時間でLeica DM3蛍光顕微鏡を用いて記録した。Image Jソフトウェアを用いて蛍光強度を定量した。
【0193】
【0194】
ＣｕＮＣの合成及び安定化のための鋳型として作用するように３つのモジュールにより形成されたＣＴＰＲタンパク質（いわゆるＣＴＰＲ３）の能力並びに金属ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の特異的金属結合部位（ヒスチジン（Ｈｉｓ）クランプ）の存在及び位置の影響を分析した。そのほか、異なる貴金属ＮＣ（Ａｕ及びＡｇ）のＮＣを安定化させるＣＴＰＲタンパク質の多用途性及び異なる発光色を有するＣｕＮＣを形成する可能性を試験した。最後に、構造中に局在化ペプチド（この場合にはＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ））を含むＣＴＰＲタンパク質を用いて、非特異的細胞マーカー又は特異的細胞マーカーとして、細胞イメージング分野におけるこうした金属ＮＣの潜在的用途を評価した。
【0195】
ＣｕＮＣの合成及び安定化のために、３つの異なるＣＴＰＲ３タンパク質の設計、発現、及び作製を行った。最初に、ＣＴＰＲリピート内の位置５及び９に２つのＨｉｓ残基を導入して修飾ＣＴＰＲユニット（Ｈ）を形成することにより、Ｈｉｓクランプをモジュールレベルで設計した（表１）。Ｈモジュールと野生型ＣＴＰＲモジュール（Ｗ）とを組み合わせることにより、３つの同一の野生型ＣＴＰＲモジュールにより構成されたＣＴＰＲ３－ＷＷＷと、２つの野生型ＣＴＰＲモジュール（Ｗ）と中心リピートに局在化された金属結合Ｈｉｓクランプ（Ｈ）を含有する１つのモジュールとにより構成されたＣＴＰＲ３－ＷＨＷと、ＨモジュールがＮ末端リピートに局在化されたＣＴＰＲ３－ＨＷＷと、の３つのＣＴＰＲ３タンパク質を形成した。３つの設計されたＣＴＰＲをタンパク質安定化ＣｕＮＣの形成に関して試験した。タンパク質配列、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間の影響を調べるために、類似のプロトコルを開発してすべての合成に適用した。サンプルの吸収及び蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化ＣｕＮＣに対応する特性蛍光を示した（図１）。最初に、我々は、材料及び方法のセクションに記載したのと同一の実験条件（還元剤、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、ＣｕＮＣの合成及び安定化におけるタンパク質配列の影響を評価した。図１に示されるように、ＣＴＰＲ３－ＷＨＷタンパク質を用いてより大きな蛍光発光強度を有するＣｕＮＣを得た。Ｈｉｓクランプの存在及び位置の重要性を評価した後、ＣｕＮＣの合成及び安定化の理想的足場としてＣＴＰＲ３－ＷＨＷタンパク質を選択した。次いで、最終ＣｕＮＣの性質を最適化するためにＣＴＰＲ３－ＷＨＷタンパク質を用いてＣｕＮＣの合成及び安定化におけるタンパク質：金属：還元剤比及び反応時間の役割を評価した。安定化ＣｕＮＣの蛍光性は、２４ｈから７２ｈの時間にわたり増加した。安定化ＣｕＮＣの蛍光性は、５：１から５０：１の金属：タンパク質比の増加によっても、さらには１０：１から１００：１の還元剤：金属比の増加によっても、向上することが観測された。最後に、より大きな蛍光発光強度をもたらすことから、金属：タンパク質比として５０：１、還元剤：金属比として１００：１、及び反応時間として７２ｈを用いて合成されたＣｕＮＣを選択して十分に特徴付けた。
【0196】
同一濃度のタンパク質単独で（ＷＨＷ）のＵＶ可視のスペクトルと比較してタンパク質安定化ＣｕＮＣ（ＷＨＷ－ＣｕＮＣ）のＵＶ可視のスペクトルは、２８０ｎｍの特性タンパク質吸収に加えて、３７０ｎｍ近傍に明瞭なピークの存在を示した。励起スペクトルは、３７０ｎｍに最大を有する単一ピークを示した。生成物の蛍光発光スペクトルは、３７０ｎｍで励起したとき、４５０ｎｍに最大を有する単一ピークからなっていた。標準としてアントラセンを用いて蛍光量子収率（Φ）を測定したところ１０％（λｅｘ：３７０ｎｍ）であった。光物理的及び構造的特徴付けに加えて、ＣＴＰＲタンパク質鋳型の構造健全性は、タンパク質－ＮＣハイブリッド構造の将来的適用に非常に重要である。円二色性（ＣＤ）測定は、ＮＣ形成後のＷＨＷ－ＣｕＮＣ錯体中のタンパク質のαヘリックス二次構造含有率の減少をなんら示さなかったので、ＷＨＷは、ＮＣ合成条件下で安定であるとともに、安定化ＮＣは、タンパク質足場の構造を撹乱しないことを確認しうる。ＴＥＭ測定は、小さなＣｕＮＣの存在を示唆した（個別ＣｕＮＣの平均サイズは、０．９±０．２ｎｍとして計算された）。さらに、バイオイメージング及びバイオ標識の分野におけるＷＨＷ－ＣｕＮＣの適用は、良好な光安定性及び生体適合性を必要とする。生理学的条件でＷＨＷ－ＣｕＮＣの光安定性を適正にチェックするために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中及びヒト血漿（ＨＰ）中で安定性試験を実施した。図２に示されるように、ＷＨＷ－ＣｕＮＣは、ＰＢＳ中及びＨＰ中において室温で１週間にわたり非常に良好な安定性を有しており、ＰＢＳの場合にはその蛍光性はほぼ一定に維持され、ＨＰの場合にはその蛍光性は増加する。
【0197】
ＷＨＷ－ＣｕＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性試験は、アラマーブルー細胞生存能アッセイにより検査した。ＭＣＦ７乳癌細胞におけるインキュベーションによりＷＨＷ－ＣｕＮＣの可能な細胞傷害性を評価するために、生存能アッセイを実施した。使用したＷＨＷ－ＣｕＮＣの濃度は２から２０μＭであった。標準的細胞培養条件でさまざまな濃度のＷＨＷ－ＣｕＮＣと共にＤＭＥＭ中でＭＣＦ７乳癌細胞をインキュベートした。インキュベーションの７２時間後、アラマーブルー細胞生存能アッセイにより細胞生存能を決定した。ＷＨＷ－ＣｕＮＣは、高濃度でさえも細胞傷害作用がないことが、結果から示唆された。
【0198】
そのほか、異なる貴金属ＮＣ（Ａｕ及びＡｇ）のＮＣを安定化させるＣＴＰＲタンパク質の多用途性を試験したところ、金属としてＣｕを使用したときに得られたものに類似した結果が得られたが、より小さい蛍光強度であった（図３）。また、材料及び方法のセクションに示されるように、いくつかの合成プロトコルパラメーターを変化させて異なる発光色を有するＣｕＮＣを形成する可能性を評価した。ＵＶから赤色まで異なる色の発光を有するＣｕＮＣが得られた。励起波長は、３２０、３７０、４４０、４８５、及び５３０ｎｍであり、且つ発光波長は、それぞれ、４０５、４５０、５２０、５６５、及び６０５ｎｍであった（データは示されていない）。したがって、一般式（ＩＩ）のタンパク質で安定されたＮＣは、蛍光色の発光に関して驚くべき多用途性を示した。
【0199】
ＷＨＨＷ（ＣＴＰＲ４）及びＷＨＨＨＷ（ＣＴＰＲ５）により形成されたＣＴＰＲタンパク質で得られた結果は、ＣｕＮＣのためのＷＨＷタンパク質に対して本明細書に記載されたものと同一であった（データは示されていない）。
【0200】
最後に、鋳型としてＷＨＷタンパク質及び構造中に核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＷＨＷ（ＮＬＳ－ＷＨＷ）を用いて、非特異的細胞マーカー又は特異的細胞マーカーとして、細胞標識分野におけるタンパク質安定化ＣｕＮＣの潜在的用途を評価した。以上に記載の手順に従って分子生物学技術によりＷＨＷタンパク質からＮＬＳ－ＷＨＷタンパク質を構築した。最初に、ＷＨＷタンパク質の構造中の核局在化配列の存在がＣｕＮＣの合成及び安定化に影響を及ぼさないこと、さらにはＮＬＳ－ＷＨＷ安定化ＣｕＮＣ（ＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣ）がＷＨＷ－ＣｕＮＣに類似した蛍光性を有することを確認した。３７℃のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＷＨＷ－ＣｕＮＣ及びＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣと共にＭＣＦ７細胞を１時間インキュベートすることにより、細胞標識用としてタンパク質安定化ＣｕＮＣの概念評価の証拠を探究した。培地の除去後、細胞をＰＢＳで十分に洗浄してフリーの非結合ＷＨＷ－ＣｕＮＣ及びＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣを除去し、最後に、蛍光顕微鏡法により細胞のイメージングを行った。比較として、ＷＨＷ－ＣｕＮＣで処理された細胞は、すべての細胞内で均一な蛍光シグナルを呈し、ＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣで処理された細胞は、細胞核内及び核膜内に局在化された蛍光シグナルを呈した。こうした結果から、非特異的細胞バイオマーカー（ＷＨＷ－ＣｕＮＣにより例証される）又は特異的核バイオマーカー（ＮＬＳ－ＷＨＷ－ＣｕＮＣにより例証される）として生細胞標識におけるタンパク質安定化ＣｕＮＣの有用性が明確に実証された。ＴＰＲタンパク質を細胞により内在化できないことを考慮して、ＴＰＲ－ＣｕＮＣの内在化は、ＴＰＲタンパク質の構造中のＣｕＮＣの存在により提供されると推定可能である。
【0201】
さらに、金属ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の特異的金属結合部位（ヒスチジン（Ｈｉｓ）クランプ）の異なる数の存在の影響を調べた。ＷＨＷ、ＷＨＨＷ、及びＷＨＨＨＷタンパク質により形成されたナノクラスターの蛍光性を試験した。図４で観察できるように、タンパク質構造中の特異的金属結合部位（ヒスチジン（Ｈｉｓ）クランプ）の数を１から３に増加させた場合、安定化ＣｕＮＣの蛍光性の改善が見られた。
【0202】
結論として、貴金属ＮＣの合成及び安定化のために多用途鋳型として設計されたリピートタンパク質を使用可能であることが実証された。異なるＣＴＰＲタンパク質を構築するためのカセットとして異なるモジュールの使用が記述された。この例では、構造中に標的化剤として局在化ペプチドを含有可能なＣＴＰＲタンパク質の設計が示されるが、同一の手順は多くの目標に使用しうる。タンパク質安定化ＣｕＮＣは、高いフォトルミネセンス量子収率、高い光安定性、及び良好な生体適合性を示した。それは、細胞、核、又はいずれかの他の細胞区画の標識に使用しうる。フォトルミネセンス性と生理学的条件における安定性とその低い細胞傷害性とが組み合わさることにより、本発明の金属ＮＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏさらにはｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的及びバイオ医学的用途に対する理想的選択肢となる。
【0203】
システインクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光金属ナノクラスター：
金属ＮＣの合成及び安定化のための鋳型として作用するように異なる数のＣＴＰＲモジュールにより形成されたＣＴＰＲタンパク質の能力並びに金属ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のシステイン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を探究した。
金属ＮＣの合成及び安定化のための鋳型として作用するように異なる数のＣＴＰＲモジュールにより形成されたＣＴＰＲタンパク質の能力並びに金属ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のシステイン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を探究した。
【0204】
表２並びに材料及び方法のセクションに示されるように、金属ＮＣ（Ｃｕ、Ａｇ、及びＡｕ）の合成及び安定化のために、Ｃ、Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３モジュールと野生型ＣＴＰＲモジュール（Ｗ）とを組み合わせることにより、ＷＣＣ１Ｗ、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ１Ｃ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗの１０種の異なるＣＴＰＲタンパク質の設計、発現、及び作製を行った。設計されたＣＴＰＲをタンパク質安定化金属ＮＣの形成に関して試験した。最初に、材料及び方法に記載したのと同一の実験条件を用いて、金属ＮＣの合成及び安定化におけるタンパク質配列の影響を評価した。サンプルの蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化金属ＮＣに対応する特性蛍光を示した。
【0205】
また、システイン残基の位置の重要性に関する比較としてCouleaud P et al. 2015により示唆されるようにタンパク質ＷＷＷ＿Ｃｙｓを形成した。
【0206】
図５で観測されたように、タンパク質構造中のシステイン残基の存在は、ＡｕＮＣの合成及び安定化に有利である。システインを有していないＷＷＷタンパク質は、ナノクラスターの有意な生成をもたらさなかった。タンパク質配列のＣ末端の単一システイン残基の存在（ＷＷＷ＿Ｃｙｓ）（配列番号１０７）は、ナノクラスターの形成に関連する弱い蛍光発光を示した（図７から９も参照されたい）。注目すべき点として、設計されたシステインクランプをタンパク質内に導入したところ、蛍光強度が５倍に増加した。そのほか、システインモジュールＣＣ１及びＣ１Ｃ１の組合せにより同一の蛍光性を有するＡｕＮＣを生成することが観測された。最後に、ＷＣＣ１Ｗ－ＡｕＮＣ及びＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣが類似の蛍光性を示したことから、ＣｕＮＣの合成及び安定化に対するヒスチジンクランプの場合と同様に、タンパク質構造中のシステインクランプを有するモジュールの位置は、ＡｕＮＣの合成及び安定化にそれほど重要でないことが観察された。
【0207】
図６に示されるように、異なるＣＴＰＲタンパク質を用いてより大きな蛍光発光強度を有するＡｕＮＣを得た。Ｃｙｓ残基の存在及び位置の重要性を評価した後、Ｃｙｓ残基数を１６から２０に増加させることにより、安定化ＡｕＮＣの蛍光性の改善が観察され、Ｃｙｓ残基数を２０以上に増加させたとき、安定化ＡｕＮＣの蛍光性の減少が観察された。励起スペクトルは、すべての場合に３７０から３８０ｎｍに最大を有する単一ピークを示した。生成物の蛍光発光スペクトルは、３７０から３８０ｎｍで励起したとき、４４０から４５０ｎｍに最大を有する単一ピークからなっていた（図６）。
【0208】
異なるＣＴＰＲタンパク質を用いてより大きな蛍光発光強度を有するＡｕＮＣ、ＡｇＮＣ、及びＣｕＮＣを得た（材料及び方法で説明したのと同一の実験条件を用いて得た）（ＷＷＷ、ＷＸ１Ｗ、ＷＸＷ、ＷＣ１Ｗ、ＷＨＷ、ＷＣ１Ｃ１Ｗ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ）。サンプルの蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化金属ＮＣに対応する特性蛍光を示した。Ｃｙｓ及び／又はＨｉｓ残基の存在及び位置の重要性を評価した後、Ｃｙｓ残基数を１６から２０に増加させて安定化金属ＮＣの蛍光性の顕著な改善を検出した（図７、８、及び９を参照されたい）。主生成物の蛍光発光スペクトルは、３７０ｎｍで励起したとき、４４０から４６０ｎｍ（青色発光）に最大を有する単一ピークからなっていた。ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ足場上で安定化されたＡｇナノクラスターの場合、サンプルを４５５ｎｍで励起したとき、６２０ｎｍに最大を有する赤色発光が得られ（ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ＿ＡｇＮＣ＊）、一方、サンプルを３７０ｎｍで励起したとき、４４０から４６０ｎｍに最大を有する単一ピークが得られた（ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ＿ＡｇＮＣ）（図８）。
【0209】
ＮＣの形成及び安定化に及ぼす金属の比の影響：
ここでは、異なる金属（Ａｕ、Ａｇ、及びＣｕ）ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のシステイン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を探究した。また、鋳型として同一のタンパク質（この場合にはＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ）を用いて異なる混合金属（Ａｕ、Ａｇ、及びＣｕ）ＮＣの形成及び安定化に及ぼすＡｕ及びＡｇの比の影響を探究した。
ここでは、異なる金属（Ａｕ、Ａｇ、及びＣｕ）ＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のシステイン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を探究した。また、鋳型として同一のタンパク質（この場合にはＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ）を用いて異なる混合金属（Ａｕ、Ａｇ、及びＣｕ）ＮＣの形成及び安定化に及ぼすＡｕ及びＡｇの比の影響を探究した。
【0210】
設計されたＣＴＰＲ、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、及びＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗに対して、サンプルの蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化金属ＮＣに対応する特性蛍光を示した。
【0211】
金属ＮＣの形成時の反応温度として３７℃と５０℃との比較を実施した。
【0212】
以上に説明したように、本発明の異なるＣＴＰＲタンパク質を用いてより大きい蛍光発光強度を有するＡｕＮＣ、ＡｇＮＣ、及びＣｕＮＣを得た。Ｃｙｓ残基の存在及び位置の重要性を評価した後、Ｃｙｓ残基数を２０まで増加させて且つ反応温度として５０℃を用いて、安定化金属ＮＣの蛍光性の一般的改善を観測した。反応のほとんどの蛍光発光スペクトルは、３６０から３８０ｎｍで励起したとき、４４０から４６０ｎｍ（青色発光）に最大を有する単一ピークからなっていた。詳細には、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ（２０Ｃｙｓ残基）を用いて、５０℃で最良の蛍光発光強度を有するＡｕＮＣを得た。Ａｇの場合、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ（１６Ｃｙｓ残基）を用いて、５０℃で最大蛍光発光強度を有するＡｇＮＣを得た。最後に、Ｃｕの場合、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ（２０Ｃｙｓ残基）を用いて、５０℃で最大蛍光発光を有するＣｕＮＣを得た。興味深いことに、ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ（９Ｃｙｓ残基）により安定させたＡｇＮＣの場合、３６０から３８０ｎｍの励起で青色発光及び４３０から４６０ｎｍの励起で赤色発光の二重発光が観察された。
【0213】
また、鋳型として同一のタンパク質（この場合にはＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ）を用いて、異なる混合Ａｕ－ＡｇＮＣの合成、安定化、及び蛍光性に及ぼすＡｕ及びＡｇの比の影響を探究した。
【0214】
ＷＣ２Ｃ２Ｃ２Ｗ ＣＴＰＲタンパク質を用いて、より大きい蛍光発光強度を有するＡｕＮＣ、ＡｇＮＣ、及び混合ＡｕＡｇＮＣｓを得た。Ａｕ／Ａｇ比の重要性を評価した後、９：１（Ａｕ：Ａｇ）のモル比でＡｇを添加したとき安定化ＡｕＮＣの蛍光性が改善され、４：１及び３：１（Ａｕ：Ａｇ）の比でＡｇを添加したとき安定化ＡｕＮＣの蛍光性に影響がなく、且つ２：１（Ａｕ：Ａｇ）の比でＡｇを添加したとき安定化ＡｕＮＣの蛍光性が減少することを、我々は観察した。
【0215】
システインクランプと比較してヒスチジンクランプに基づく配位残基を有するいくつかのモジュールを含有するＣＴＰＲ変異体を含む蛍光金ナノクラスター：
金ＮＣの形成及び安定化に及ぼすＣＴＰＲタンパク質構造中の同数のシステイン又はヒスチジン残基により構成された特異的金属結合部位の性質及び位置の影響を探究した。
金ＮＣの形成及び安定化に及ぼすＣＴＰＲタンパク質構造中の同数のシステイン又はヒスチジン残基により構成された特異的金属結合部位の性質及び位置の影響を探究した。
【0216】
金ＮＣの合成及び安定化のために、６つのＣＴＰＲモジュールを有する３つの異なるＣＴＰＲタンパク質の設計、発現、及び作製を行った。Ｃ３、Ｈ１、及びＨ２モジュールと野生型ＣＴＰＲモジュール（Ｗ）とを組み合わせることにより、次のタンパク質、すなわち、表２並びに材料及び方法のセクションに示されるように、ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗを形成した。
【0217】
設計されたＣＴＰＲをタンパク質安定化金ＮＣの形成に関して試験した。材料及び方法に記載のものと同一の実験条件を用いて、金ＮＣの合成及び安定化におけるタンパク質配列の影響を評価した。サンプルの蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化金ＮＣに対応する特性蛍光を示した。
【0218】
図１０に示されるように、異なるＣＴＰＲタンパク質を用いて大きい蛍光発光強度を有するＡｕＮＣを得た。Ｈｉｓクランプを有するタンパク質（ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）による安定化ＡｕＮＣと比較してＣｙｓクランプを有するタンパク質（ＷＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｗ）による安定化ＡｕＮＣの蛍光性の改善を観察した。また、Ｈｉｓクランプを有するタンパク質（ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗ）による安定化ＡｕＮＣの場合、Ｈ２モジュール上のＨｉｓクランプ塩基は、Ｈ１モジュールと比較して安定化ＡｕＮＣの蛍光性を増加させることが観察された。ただし、両方とも４ヒスチジン残基を有する。生成物の蛍光発光スペクトルは、３７０から３８０ｎｍで励起したとき、すべての場合に４４０から４５０ｎｍに最大を有する単一ピークからなっていた（図１０）。
【0219】
本発明の設計タンパク質とシステイン残基を含有する可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体との間の金属ナノクラスターの合成及び安定化の効率の比較
同一の実験条件（還元剤、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、金属ナノクラスターの合成及び安定化に関して、システイン残基を含有する他の可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体と比較して、本発明の設計タンパク質の効率を評価した。
同一の実験条件（還元剤、タンパク質：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、金属ナノクラスターの合成及び安定化に関して、システイン残基を含有する他の可能なＣＴＰＲベースランダム突然変異体と比較して、本発明の設計タンパク質の効率を評価した。
【0220】
金属ナノクラスターの合成及び安定化に関して、異なるＣＴＰＲタンパク質（ＷＷＷ、ＷＷＷ＿ｃｙｓ、ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、ＷＣ３Ｗ、ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、ＷＨ３Ｗ、ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗ）を試験した。材料及び方法に記載のものと同一の実験条件を用いて、金属ナノクラスターの合成及び安定化におけるタンパク質配列の影響を評価した。サンプルの蛍光スペクトルを取得したところ、すべての場合にタンパク質安定化金属ＮＣに対応する特性蛍光を示した（図１１、１２及び１３）。Ｃｙｓ及び／又はＨｉｓ残基の存在及び位置の重要性を評価した後、システイン残基を含有するＣＴＰＲベースランダム突然変異体（ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ及びＷＲ２Ｗ）と比較して、本発明の設計タンパク質を用いて安定化金属ＮＣの蛍光性における顕著な改善を検出した。
【0221】
図１１、１２、及び１３に示されるように、異なるＣＴＰＲタンパク質を用いて大きい蛍光発光強度を有する金属ＮＣを得た。システイン残基を含有するＣＴＰＲタンパク質塩基ランダム突然変異体（ＷＲＷ、ＷＲ１Ｗ、及びＷＲ２Ｗ）による安定化金属ＮＣと比較して、設計されたＨｉｓクランプを有するタンパク質（ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、及びＷＨ３Ｗ）及びＣｙｓクランプを有するタンパク質（ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、及びＷＣ３Ｗ）による安定化金属ＮＣの蛍光性の改善を観察したことから、リピートモジュール中のヒスチジン及びシステイン残基の位置は、強い蛍光を有する金属ＮＣの合成及び安定化に重要であることが示される。そのほか、設計されたｃｙｓクランプ（ＷＣ１Ｗ、ＷＣ２Ｗ、及びＷＣ３Ｗ）により安定された金属ＮＣは、Ｈｉｓクランプ（ＷＨＷ、ＷＨ２Ｗ、及びＷＨ３Ｗ）により安定された金属ＮＣと比較して蛍光の増加を示すことが観察された。Ｃｙｓ残基数を４まで増加させて（２つのシステインを有するＷＣ１Ｗから４つのシステインを有するＷＣ３Ｗに）、安定化金属ＮＣの蛍光性の一般的改善を観察した。生成物の蛍光発光スペクトルは、３７０から３８０ｎｍで励起したとき、すべての場合に４４０から４５０ｎｍに最大を有する単一ピークからなっていた。
【0222】
ヒスチジンクランプに基づく配位残基を有する変異ＣＴＰＲを含む蛍光ＣｄＳナノクラスター：
ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化のために鋳型として作用するように、異なる数のＣＴＰＲモジュールにより形成されたＣＴＰＲタンパク質の能力を探究した。そのほか、ＣｄＳＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のヒスチジン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を評価した。
ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化のために鋳型として作用するように、異なる数のＣＴＰＲモジュールにより形成されたＣＴＰＲタンパク質の能力を探究した。そのほか、ＣｄＳＮＣの形成及び安定化に及ぼすタンパク質構造中の異なる数のヒスチジン残基により構成された特異的金属結合部位の存在及び位置の影響を評価した。
【0223】
Ｈ１及びＨ２モジュールと野生型ＣＴＰＲモジュール（Ｗ）とを組み合わせることにより、ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化のために、表２並びに材料及び方法のセクションに示されるように、ＷＷＷＷＷＷ、ＷＨ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１Ｗ、及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２Ｗの６つの異なるＣＴＰＲタンパク質の設計、発現、及び作製を行った。タンパク質安定化ＣｄＳナノクラスターの形成に関して、設計されたＣＴＰＲを試験した。材料及び方法に記載のものと同一の実験条件を用いて、ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化におけるタンパク質配列の影響を評価した。
【0224】
図１４で観測されたように、タンパク質構造中のシステイン残基の存在は、ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化に有利である。ヒスチジンを有していないＷＷＷＷＷＷタンパク質は、ＣｄＳナノクラスターの有意な生成をもたらさなかった。注目すべき点として、設計されたヒスチジンクランプをタンパク質に導入したところ、タンパク質安定化ＣｄＳナノクラスターの蛍光強度が増加した。Ｈｉｓ残基数を１６に増加させて安定化ＣｄＳナノクラスターの蛍光性の顕著な改善を検出した。最後に、モジュールＨ１又はＨ２中のヒスチジン残基の異なる位置は、ＣｄＳナノクラスターの合成及び安定化に関係しないことが観察された。ＷＨ１Ｈ１Ｈ１Ｈ１ＷＣｄＳＮＣ及びＷＨ２Ｈ２Ｈ２Ｈ２ＷＣｄＳＮＣは類似の蛍光性を示した。
【0225】
主生成物の蛍光発光スペクトルは、３６５ｎｍで励起したとき、５１５から５２０ｎｍに最大を有するピークからなっていた（図１４）。励起スペクトルは、すべての場合に３６０から３６５ｎｍに最大を有する単一ピークを示した（図１５）。
【0226】
リガンドのセンサーとして本発明のタンパク質により安定した金属ＮＣ：
ＣＴＰＲの性質は、結合認識部位などに容易にモジュレート可能であるので、
一次配列にほとんど変化を導入することになく、異なる結合活性を有するが同一の構造を有するＴＰＲタンパク質が形成された。調整されたセンサー、バイオマーカー、又はバイオメディカル用途のさまざまなツールを設計するために、さまざまな結合活性を有するこうしたＣＴＰＲモジュールをＣｙｓクランプモジュールと組み合わされて蛍光ＡｕＮＣを作製可能である。ＡｕＮＣの蛍光とタンパク質の結合能とを組み合わせることにより、分子プローブとしてのＣＴＰＲ安定化ＡｕＮＣの潜在能力を調べた。概念実証として、多くの発癌性タンパク質のフォールディングに不可欠なひいては腫瘍進行に関与するシャペロンであるＨｓｐ９０のＣ末端ペプチドに結合する３つのＣＴＰＲ足場（ＣＴＰＲ３９０、ＴＰＲ２Ａ、及びＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋ）と、ＡｕＮＣの形成に使用されるＣＣ１＿４Ｃｙｓクランプと、を組み合わせた。これをもって、ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣ、ＣＣ１－ＴＰＲ２ＡＡｕＮＣ、及びＣＣ１ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４ＫＡｕＮＣ錯体は、蛍光を発してそれらのリガンド分子を特異的に認識可能であることが実証された。
ＣＴＰＲの性質は、結合認識部位などに容易にモジュレート可能であるので、
一次配列にほとんど変化を導入することになく、異なる結合活性を有するが同一の構造を有するＴＰＲタンパク質が形成された。調整されたセンサー、バイオマーカー、又はバイオメディカル用途のさまざまなツールを設計するために、さまざまな結合活性を有するこうしたＣＴＰＲモジュールをＣｙｓクランプモジュールと組み合わされて蛍光ＡｕＮＣを作製可能である。ＡｕＮＣの蛍光とタンパク質の結合能とを組み合わせることにより、分子プローブとしてのＣＴＰＲ安定化ＡｕＮＣの潜在能力を調べた。概念実証として、多くの発癌性タンパク質のフォールディングに不可欠なひいては腫瘍進行に関与するシャペロンであるＨｓｐ９０のＣ末端ペプチドに結合する３つのＣＴＰＲ足場（ＣＴＰＲ３９０、ＴＰＲ２Ａ、及びＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋ）と、ＡｕＮＣの形成に使用されるＣＣ１＿４Ｃｙｓクランプと、を組み合わせた。これをもって、ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣ、ＣＣ１－ＴＰＲ２ＡＡｕＮＣ、及びＣＣ１ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４ＫＡｕＮＣ錯体は、蛍光を発してそれらのリガンド分子を特異的に認識可能であることが実証された。
【0227】
最初に、材料及び方法のセクションで以上に記載したように、ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０ ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ、及びＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋタンパク質の発現、設計、作製、及び特徴付けを行った。次いで、それらのフォールディング、安定性（熱アンフォールディング）、及びリガンド結合親和性をチェックすることにより、こうした新規なタンパク質の特徴付けを行った（図１６）。
【0228】
図１６に見られるように、新たに設計されたタンパク質ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０、ＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ、及びＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋは、十分にフォールディングされ、５８、５６、及び５２℃の融解温度（Ｔｍ）並びに１１０μＭ、５μＭ、及び５５ｎＭのＫｄ値を呈した（元のＣＴＰＲ３９０、ＴＰＲ２Ａ、及びＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４Ｋに類似する）。
【0229】
次いで、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを用いて且つ材料及び方法のセクションに記載したのと同一の実験条件（還元剤、システイン：金属：還元剤比、及び反応時間）を用いて、タンパク質安定化金ＮＣの形成に関して、こうした３つの設計されたＣＴＰＲを試験した。３つの異なるタンパク質安定化金ＮＣの蛍光励起スペクトルは、３７０ｎｍに最大を示し、発光スペクトルは、３７０ｎｍで励起したとき、４５０ｎｍに最大を示した。ＣＴＰＲリピートの構造的及び機能的性質は興味深かったので、ＣＴＰＲ－ＡｕＮＣ合成後にタンパク質二次構造及びリガンド結合活性が維持されるかを試験した。
【0230】
マイルドな還元剤を用いてＣＴＰＲ－ＡｕＮＣを形成した後、サンプルのＣＤ分析により、タンパク質構造が保持されることが明らかにされた（図１６）。そのため、アスコルビン酸ナトリウムを用いた最適化ＡｕＮＣ合成プロトコルは、良好な蛍光性及びタンパク質足場の構造健全性を有するタンパク質安定化ＡｕＮＣをもたらした。
【0231】
最後に、蛍光異方性を用いて、ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣ、ＣＣ１－ＴＰＲ２ＡＡｕＮＣ、及びＣＣ１－ＴＰＲ２Ａ＿Ｔ３３２Ｒ＿Ｄ３３４ＫＡｕＮＣ錯体とフルオレセイン標識Ｈｓｐ９０ペプチドとの間の相互作用をモニターして、対応するＫｄ値を決定した。その結果、Ｈｓｐ９０ペプチドを認識するタンパク質の能力はナノクラスター形成の影響を受けないことが示された。相互作用で得られたＫｄ値は、１１０μＭ、５μＭ、及び５５ｎＭであり、タンパク質に対して同一のアッセイを用いたときに得られる値に匹敵する（図１６）。金ナノクラスターの形成は結合ドメインを変化させないので、バイオイメージング及びセンシングのツールを開発するうえでこの新たな方法の使用が鍵となることが、こうしたデータから確認された。
【0232】
Ｈｓｐ９０ペプチドの存在を検出するセンサーとしてＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣ錯体のＡｕＮＣの蛍光を使用した。ＣＣ１－ＣＴＰＲ３９０－ＡｕＮＣを含有する溶液にＨｓｐ９０ペプチドを添加したとき、ＡｕＮＣ蛍光の増加が観測された。リガンドペプチドは、そのコグネイトペプチド（Ｈｓｐ９０）との相互作用に起因してＡｕＮＣの蛍光の用量依存的増加を誘発した。蛍光強度変化の線形反応は、５μから６００μＭの濃度領域で観測された。
【0233】
温度センサーとしての本発明の金属蛍光ＮＣの使用：
材料及び方法のポイント５（異なる発光色を有するタンパク質安定化銅ナノクラスターの合成）に記載されるように合成された青色発光ＷＨＷ安定化ＣｕＮＣを温度センサーとして使用した。
材料及び方法のポイント５（異なる発光色を有するタンパク質安定化銅ナノクラスターの合成）に記載されるように合成された青色発光ＷＨＷ安定化ＣｕＮＣを温度センサーとして使用した。
【0234】
タンパク質安定化銅ナノクラスターの蛍光発光強度は、図１７で観測されるように２５から６５℃の範囲内で温度に対して線形従属性を有していた。
【0235】
イメージング剤としての本発明の金属蛍光ＮＣの使用。
イメージング用途の従来のフルオロフォアとしては、有機色素及び工学操作蛍光タンパク質が挙げられるが、生細胞における長期実験で欠点となりうる限定された光安定性を有する。本発明の金属蛍光ＮＣは、通常使用される蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）よりも良好な光安定性を示すことが、本発明から実証される。図１８では、蛍光顕微鏡照明下で光漂白曲線を観測しうるが、ＷＨＷ安定化ＡｇＮＣの光安定性はＧＦＰ及びＤＡＰＩを上回ることが実証される。したがって、本発明の金属蛍光ＮＣは、イメージング剤としてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ用途に好適なツールであることが示される。
イメージング用途の従来のフルオロフォアとしては、有機色素及び工学操作蛍光タンパク質が挙げられるが、生細胞における長期実験で欠点となりうる限定された光安定性を有する。本発明の金属蛍光ＮＣは、通常使用される蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）よりも良好な光安定性を示すことが、本発明から実証される。図１８では、蛍光顕微鏡照明下で光漂白曲線を観測しうるが、ＷＨＷ安定化ＡｇＮＣの光安定性はＧＦＰ及びＤＡＰＩを上回ることが実証される。したがって、本発明の金属蛍光ＮＣは、イメージング剤としてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ用途に好適なツールであることが示される。
【0236】
引用文献リスト
Couleaud P et al. 2015 Biomacromolecules 16:3836-3844.
D’Andrea L et al. 2003 Trends Biochem. Sci., 2003, 28, 655-662.
Huang H et al. 2014 The Royal Society of Chemistry DOI: 10.1039/c4an01757a
Li J et al. 2014 Trend in Analytical Chemistry 58:90-98.
Qu X et al. 2015 Journal of Nanomaterials Article ID 784097
Shang L et al. 2011 Nano Today 6:401-418
Xie J et al. 2009 J Am Chem Soc 131:888-889
Couleaud P et al. 2015 Biomacromolecules 16:3836-3844.
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Shang L et al. 2011 Nano Today 6:401-418
Xie J et al. 2009 J Am Chem Soc 131:888-889
【0237】
完全を期して、本発明の各種態様を以下の番号付き条項に明記する。
【0238】
条項１．以下の配列番号１：
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表し、
－Ｘ２がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ３はＮであり、且つ
－Ｘ３がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ２はＹである）
の配列からなるアミノ酸配列又はその塩。
ＡＸ１ＡＷＸ２Ｘ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｈ、Ｃ、及びＤから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、及びＥから選択されるアミノ酸であり、
ただし、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、同一であるか又は異なり、且つＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥを表し、
－Ｘ２がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ３はＮであり、且つ
－Ｘ３がＨ、Ｃ、Ｄ、又はＥであるとき、Ｘ２はＹである）
の配列からなるアミノ酸配列又はその塩。
【0239】
条項２．以下：
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号２）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号３）、
ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号４）、
ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号５）、
ＡＥＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号６）、
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号７）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号８）、
ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号９）、
ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１０）、
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１１）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１２）、及び
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１３）
からなる群から選択される、条項１に記載のアミノ酸配列。
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号２）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＮＡＹＹＫ（配列番号３）、
ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号４）、
ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号５）、
ＡＥＡＷＹＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号６）、
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号７）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＹＫ（配列番号８）、
ＡＥＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号９）、
ＡＥＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１０）、
ＡＸ１ＡＷＸ２ＮＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１１）、
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｋ（配列番号１２）、及び
ＡＸ１ＡＷＹＸ３ＬＧＸ４ＡＹＸ５Ｘ６（配列番号１３）
からなる群から選択される、条項１に記載のアミノ酸配列。
【0240】
条項３．以下の式（Ｉ）：
Ｚ－（Ｂ）ｎ－Ｆ－（Ｇ）ｍ （Ｉ）
（式中、
ｎ及びｍは、０又は１であり、
Ｚは、条項１又は２に記載のアミノ酸配列を表し、ただし、Ｘ１がＣであるとき、Ｘ４は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、又はＮであり、
Ｂは、リンカーを表し、
Ｆは、αヘリックス二次モチーフを有するアミノ酸配列であり、且つ
Ｇは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列である）
のペプチド又はその塩。
Ｚ－（Ｂ）ｎ－Ｆ－（Ｇ）ｍ （Ｉ）
（式中、
ｎ及びｍは、０又は１であり、
Ｚは、条項１又は２に記載のアミノ酸配列を表し、ただし、Ｘ１がＣであるとき、Ｘ４は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、又はＮであり、
Ｂは、リンカーを表し、
Ｆは、αヘリックス二次モチーフを有するアミノ酸配列であり、且つ
Ｇは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列である）
のペプチド又はその塩。
【0241】
条項４．以下：
ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２７）、
ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２９）、
ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３１）、
ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３３）、及び
ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲ（配列番号３５）
からなる群から選択される、条項３に記載のペプチド。
ＡＥＡＷＨＮＬＧＨＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２７）、
ＡＥＡＷＣＮＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号２９）、
ＡＣＡＷＹＣＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３１）、
ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳ（配列番号３３）、及び
ＡＣＡＷＹＣＬＧＣＡＹＬＣＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲ（配列番号３５）
からなる群から選択される、条項３に記載のペプチド。
【0242】
条項５．以下の一般式（ＩＩ）：
ＷｎＺｐＷｑ （ＩＩ）
（式中、
ｎ及びｑは、０から１０の値を有する整数を表し、且つｐは、１から１０の値を有する整数を表し、ただし、ｎ＋ｐ＋ｑは、２以上であり、
Ｗは、配列番号３７の配列ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳを含むペプチドであり、且つ
Ｚは、条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列又は条項３若しくは４に記載のペプチドを含むアミノ酸配列である）
のタンパク質又はその塩。
ＷｎＺｐＷｑ （ＩＩ）
（式中、
ｎ及びｑは、０から１０の値を有する整数を表し、且つｐは、１から１０の値を有する整数を表し、ただし、ｎ＋ｐ＋ｑは、２以上であり、
Ｗは、配列番号３７の配列ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＲＳを含むペプチドであり、且つ
Ｚは、条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列又は条項３若しくは４に記載のペプチドを含むアミノ酸配列である）
のタンパク質又はその塩。
【0243】
条項６．配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、及び配列番号６７からなる群から選択される、条項５に記載のタンパク質。
【0244】
条項７．ペプチド、ナノ粒子、核酸、無機分子、有機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体、抗原、タグペプチド、ＭＲＩコントラスト剤、ＰＥＴコントラスト剤、配位金属コントラスト剤、及びそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるエレメントに結合される、条項５又は６に記載のタンパク質。
【0245】
条項８．条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列又は請求項３若しくは４に記載のペプチド又は請求項５から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。
【0246】
条項９．金属ナノクラスター足場としての条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列又は条項３若しくは４に記載のペプチド又は条項５から７のいずれか一つに記載のタンパク質の使用。
【0247】
条項１０．条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列又は条項３若しくは４に記載のペプチド又は条項５から７のいずれか一つに記載のタンパク質を含む金属ナノクラスター。
【0248】
条項１１．銅、金、銀、ニッケル、亜鉛、チタン、クロム、鉄、コバルト、パラジウム、カドミウム、ルテニウム、ロジウム、イリジウム、白金、又はそれらの組合せを含む、条項１０に記載の金属ナノクラスター。
【0249】
条項１２．以下：
ａ）条項５から７のいずれか一つに記載のタンパク質と金属含有化合物とを混合する工程と、
ｂ）混合物を還元反応に付す工程と、
を含む、条項１０又は１１に記載の金属ナノクラスターの作製プロセス。
ａ）条項５から７のいずれか一つに記載のタンパク質と金属含有化合物とを混合する工程と、
ｂ）混合物を還元反応に付す工程と、
を含む、条項１０又は１１に記載の金属ナノクラスターの作製プロセス。
【0250】
条項１３．金属含有化合物が金属塩であり、且つ還元が金属塩のモル濃度を基準にしてモル過剰の還元剤を添加することにより実施される、条項１２に記載のプロセス。
【0251】
条項１４．イメージング剤としての、薬剤送達担体としての、代謝干渉剤としての、触媒としての、検体としての、結晶学的データセットの位相調整用としての、細胞標識剤としての、特異的タンパク質標識剤としての、バイオセンサーとしての、温度センサーとしての、光増感剤としての、又は光電子デバイスの製造用としての、条項１０又は１１に記載の金属ナノクラスターの使用。
【0252】
条項１５．条項１若しくは２に記載のアミノ酸配列、条項３若しくは４に記載のペプチド、条項５から７のいずれか一つに記載のタンパク質、条項８に記載の核酸配列、又は条項１０若しくは１１に記載の金属ナノクラスターを含むキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】