特許 7217043 ＰＣＳＫ９発現を特徴とする癌の治療のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-25

(45)【発行日】2023-02-02

(54)【発明の名称】ＰＣＳＫ９発現を特徴とする癌の治療のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20230126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230126BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230126BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20230126BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61P35/00 ZNA

A61P43/00 121

A61P43/00 111

C07K16/46

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020572854

(86)(22)【出願日】2019-06-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-21

(86)【国際出願番号】 US2019038882

(87)【国際公開番号】W WO2020005869

(87)【国際公開日】2020-01-02

【審査請求日】2021-03-01

(31)【優先権主張番号】62/689,288

(32)【優先日】2018-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/771,293

(32)【優先日】2018-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502363490

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー、チュアン － ユアン

(72)【発明者】

【氏名】リュー、シンチャン

【審査官】山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０８７３９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／２１５５９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／００７７９６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＣＳＫ９阻害剤と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む、癌を治療するための医薬組成物であって、
前記ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体を含み、
前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体を含む、医薬組成物。

【請求項2】

少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて癌を治療するためのＰＣＳＫ９阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体を含み、
前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体を含む、医薬組成物。

【請求項3】

ＰＣＳＫ９阻害剤と組み合わせて癌を治療するための少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体を含み、
前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体を含む、医薬組成物。

【請求項4】

前記ＰＣＳＫ９阻害剤が、前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の投与前、投与後または同時に投与される、請求項１～３の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤が、更に、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される抗体を含む、請求項１～４の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体が、レパーサ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ １４５およびエボロクマブとしても知られている）、プラルエント（登録商標）（ＲＥＧＮ ７２７［Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ］およびＳＡＲ２３６５５３［Ｓａｎｏｆｉ］としても知られている）、ＬＹ３０１５０１４（フロボシマブ［Ｌｉｌｌｙ］としても知られている）、ＲＮ３１６（ボコシズマブ［Ｐｆｉｚｅｒ］としても知られている）、１Ｄ０５－ＩｇＧ２［Ｍｅｒｃｋ］、１Ｂ２０［Ｍｅｒｃｋ］、ＲＧ７６５２［Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、ＬＧＴ２０９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、またはＭＥＤＩ－４１６６［Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ］である、請求項１～５の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ＰＣＳＫ９阻害剤が二重特異性抗体を含み、前記二重特異性抗体の一方のアームがＰＣＳＫ９に対して拮抗的であり、他方のアームが少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質に対して拮抗的である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ＰＣＳＫ９阻害剤が二重特異性抗体を含み、前記二重特異性抗体の一方のアームがＰＣＳＫ９に対して拮抗的であり、他方のアームが免疫刺激標的に対して作動的である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記免疫刺激標的が、１ＢＢ、ＯＸ４０およびＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体が、レパーサ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ １４５およびエボロクマブとしても知られている）、またはプラルエント（登録商標）（ＲＥＧＮ ７２７［Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ］としても知られている）である、請求項６
に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６８９，２８８号明細書および２０１８年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／７７１，２９３号明細書の優先権を主張し、参照によりその全体を本明細書に組み込む。

【0002】

本開示の主題は、ＰＣＳＫ９発現の阻害を介して癌を治療する組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0003】

近年、癌治療では、免疫チェックポイント阻害剤療法の出現が主な進歩の１つである。免疫チェックポイントの阻害は、黒色腫、肺癌、膀胱癌などを含む多くの種類の癌に効果的であることが実証されている。しかし、それらの大きな成功にもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤は癌患者の１０～３０％に有効であるにとどまる。とはいえ、免疫チェックポイント療法に応答する患者のサブセットに観察される持続的な成功は前例のないものであり、癌免疫療法の大きな可能性を実証している。したがって、既存の免疫チェックポイント阻害剤を補完するか、それと相乗し得る追加の分子標的を見出す緊急の必要があることは明らかである。

【発明の概要】

【0004】

「発明の概要」は、以下の「発明を実施するための形態」でさらに説明される、選択された概念に触れるために提供される。この「発明の概要」は、主張された主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図するものではなく、主張された主題の範囲を限定する助けとして使用されることを意図するものでもない。

【0005】

本開示は、部分的に、ＰＣＳＫ（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型前駆体）が癌治療の新規の標的であるという本発明者らによる発見に基づいている。ＰＣＳＫ９は、肝細胞および他の細胞型のＬＤＬ－Ｒ（低密度リポタンパク質受容体）レベルの調節に重要な役割を果たすことが知られている分泌タンパク質である。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－Ｒに結合し、宿主細胞内でその分解を促進することにより、ＬＤＬ－Ｒを負に調節する。これまで、ＰＣＳＫ９遺伝子内の変異は、それらがＰＣＳＫ９のＬＤＬ－Ｒ分解機能を増強するか減弱するかに応じて、ＬＤＬ血中濃度を劇的に増加または低下させ得ることが分かっていた。ＰＣＳＫ９の枯渇はまた、腫瘍細胞の表面でＭＨＣ－Ｉ発現の顕著な増加を引き起こし、これにより、細胞傷害性Ｔ細胞の強力な腫瘍内浸潤が促進される。

【0006】

本発明の一実施形態では、個体の癌を治療するための方法は、治療有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を個体に投与することを含み得る。

【0007】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体であり得る。好ましい実施形態では、拮抗性抗体は、レパーサ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ １４５およびエボロクマブとしても知られている）、プラルエント（登録商標）（ＲＥＧＮ ７２７［Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ］およびＳＡＲ２３６５５３［Ｓａｎｏｆｉ］としても知られている）、ＬＹ３０１５０１４（フロボシマブ（Ｆｒｏｖｏｃｉｍａｂ）［Ｌｉｌｌｙ］としても知られている）、ＲＮ３１６（ボコシズマブ［Ｐｆｉｚｅｒ］としても知られている）、Ｊ１０［Ｐｆｉｚｅｒ］、Ｊ１６［Ｐｆｉｚｅｒ］、Ｊ１７［Ｐｆｉｚｅｒ］、１Ｄ０５－ＩｇＧ２［Ｍｅｒｃｋ］、１Ｂ２０［Ｍｅｒｃｋ］、ＲＧ７６５２［Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、ＬＧＴ２０９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、またはＭＥＤＩ－４１６６［Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ］であり得る。

【0008】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、二重特異性抗体であり得、二重特異性抗体の一方のアームは、ＰＣＳＫ９に対して拮抗的であり、他方のアームは、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質に対して拮抗的である。

【0009】

本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦ－βおよびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0010】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、二重特異性抗体であり得、二重特異性抗体の一方のアームは、ＰＣＳＫ９に対して拮抗的であり、他方のアームは、免疫刺激標的に対して作動的（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）である。

【0011】

本発明の別の実施形態では、免疫刺激標的は、１ＢＢ、ＯＸ４０およびＩＣＯＳからなる群から選択され得る。

【0012】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、融合タンパク質であり得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、アネキシンＡ２融合タンパク質またはアネキシンＡ２－Ｆｃ融合タンパク質であり得る。

【0013】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤はアドネクチンであり得る。好ましい実施形態では、アドネクチンは、ＢＭＳ０９６２４７６［Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ］であり得る。

【0014】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する単一ドメイン抗体であり得る。

【0015】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＥＤＦ－Ａドメイン模倣ペプチドであり得る。

【0016】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するＲＮＡｉ、Ａｌｎｙｌａｍ／ＡＬＮ－ＰＣＳ０２に対するＲＮＡｉであり得る。

【0017】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するＲＮＡｉ、Ａｌｎｙｌａｍ／Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃ／インクリシラン（Ｉｎｃｌｉｓａｒａｎ）であり得る。

【0018】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ３９４８１４、ＳＰＣ４０６１［Ｓａｎｔａｒｉｓ－Ｐｈａｒｍａ］またはＰＳＣ５０１１［Ｓａｎｔａｒｉｓ－Ｐｈａｒｍａ］であり得る。

【0019】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するペプチド系ワクチンであり得る。好ましい実施形態では、ペプチド系ワクチンは、ＡＴ０４Ａ［Ａｆｆｉｒｉｓ］、またはＷＩＰＯ特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０２７２５７に記載されているものなどの他のＰＣＳＫ９ワクチンであり得る。

【0020】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、低分子阻害剤であり得る。好ましい実施形態では、低分子阻害剤は、ＳＸ－ＰＣＳＫ９［Ｓｅｒｏｍｅｔｒｉｘ］、またはＷＩＰＯ特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１５０３９５に記載されているものなどの他の低分子ＰＣＳＫ９阻害剤であり得る。

【0021】

本発明の別の実施形態では、該方法は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与することをさらに含み得る。

【0022】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与され得る。

【0023】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与され得る。

【0024】

本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤と同時に投与され得る。

【0025】

本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0026】

本発明の別の実施形態では、該方法は、放射線療法、従来の化学療法、または標的化学療法からなる群から選択される抗癌治療を個体に投与することをさらに含み得る。

【0027】

本発明の別の実施形態では、該方法は、血管新生因子の少なくとも１つの阻害剤を個体に投与することをさらに含み得る。

【0028】

本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの血管新生因子は、ＶＥＧＦの阻害剤、ＶＥＧＦＲ１の阻害剤、ＶＥＧＦＲ２の阻害剤、ＴＥＫの阻害剤およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0029】

本発明の別の実施形態では、血管新生因子の少なくとも１つの阻害剤は、低分子を含む。

【0030】

本発明の別の実施形態では、血管新生因子の少なくとも１つの阻害剤は、抗体を含む。

【0031】

本発明の別の実施形態では、血管新生因子の少なくとも１つの阻害剤は、融合タンパク質を含む。

【0032】

本発明の別の実施形態では、癌は、ＰＣＳＫ９を発現する固形腫瘍であり得る。

【0033】

本発明の別の実施形態では、癌は、ＰＣＳＫ９を発現する血液由来癌（ｂｌｏｏｄ－ｂｏｒｎｅ ｃａｎｃｅｒ）であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】Ｂ２６Ｆ１０および４Ｔ１腫瘍細胞に対するＰＣＳＫ９のノックアウトの成功を示すウエスタンブロットである。（ａ）ＰＣＳＫ９細胞をノックアウトするために使用された２つのｓｇＲＮＡの配列；（ｂ）ｓｇＲＮＡ配列を組換えレンチウイルスベクターにクローニングし、Ｂ１６Ｆ１０および４Ｔ１細胞にそれぞれ感染させるために使用した。

【0035】

【図2】腫瘍増殖に対するＰＣＳＫノックアウトの効果を示す画像およびグラフである：（ａ）Ｃ５７／ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０モデルにおいて有意に遅延した腫瘍増殖；（ｂ）４Ｔ１腫瘍モデルにおいて有意に減弱した腫瘍増殖。

【0036】

【図3】ＰＣＳＫ９抗体レパーサ（登録商標）による、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおけるＰＤ１抗体に基づく免疫チェックポイント阻害剤療法の増強を示す画像およびグラフである。

【0037】

【図4A】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4B】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4C】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4D】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4E】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4F】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4G】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【図4H】ＰＣＳＫ９欠乏によって誘発された腫瘍増殖抑制を示す画像およびグラフである。

【0038】

【図5A】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5B】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5C】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5D】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5E】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5F】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5G】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5H】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5I】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5J】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【図5K】ＰＣＳＫ９阻害が抗ＰＤ１療法に対する腫瘍抵抗性を克服することを示す画像およびグラフである。

【0039】

【図6A】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6B】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6C】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6D】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6E】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6F】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6G】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6H】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【図6I】最初の腫瘍接種が治癒したマウスに対する再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す画像およびグラフである。

【0040】

【図7A】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍への全体的なリンパ球浸潤の免疫蛍光染色を示す画像およびグラフである。

【図7B】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍への全体的なリンパ球浸潤の免疫蛍光染色を示す画像およびグラフである。

【図7C】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍への全体的なリンパ球浸潤の免疫蛍光染色を示す画像およびグラフである。

【図7D】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍への全体的なリンパ球浸潤の免疫蛍光染色を示す画像およびグラフである。

【図7E】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍への全体的なリンパ球浸潤の免疫蛍光染色を示す画像およびグラフである。

【0041】

【図8A】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8B】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8C】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8D】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8E】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8F】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8G】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8H】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8I】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8J】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8K】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8L】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8M】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8N】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【図8O】ＰＣＳＫ９枯渇が腫瘍内Ｔ細胞浸潤およびＣＴＬ活性を増強することを示す画像およびグラフである。

【0042】

【図9A】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｏｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図9B】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図9C】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図9D】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図9E】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図9F】ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延を媒介する際の様々な免疫エフェクター細胞の役割に関するデータを示す画像およびグラフである。

【0043】

【図10A】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10B】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10C】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10D】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10E】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10F】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10G】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【図10H】ＰＣＳＫ９が腫瘍細胞内でＭＨＣ－Ｉのリソソーム媒介性分解を促進することを示す画像およびグラフである。

【0044】

【図11A】マウスまたはヒトの腫瘍組織内のＰＣＳＫ９とＭＨＣまたはＨＬＡとの間の関係に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図11B】マウスまたはヒトの腫瘍組織内のＰＣＳＫ９とＭＨＣまたはＨＬＡとの間の関係に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図11C】マウスまたはヒトの腫瘍組織内のＰＣＳＫ９とＭＨＣまたはＨＬＡとの間の関係に関するデータを示す画像およびグラフである。

【図11D】マウスまたはヒトの腫瘍組織内のＰＣＳＫ９とＭＨＣまたはＨＬＡとの間の関係に関するデータを示す画像およびグラフである。

【0045】

【図12】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内の抗ＰＤ１治療に対するＨ２－Ｋ１過剰発現の影響を示す画像およびグラフである。

【0046】

【図13】ＰＣＳＫ９とＨ２－Ｋ１タンパク質との間のエピスタシス関係の検討、および免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍の増殖に対するそれらの影響を示す画像およびグラフである。

【0047】

【図14】Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞の細胞表面ＭＨＣ－Ｉ発現と腫瘍形成能とを決定する際のＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の関係の検討を示す画像およびグラフである。

【0048】

【図15】ヒト肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、ブドウ膜黒色腫（ＵＶＭ）、ヒト膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、乳頭状腎細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｎａｌ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＫＩＲＰ）および卵巣癌（ＯＶ）におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルと生存率との間の相関を示すグラフである。

【0049】

【図16】リソソーム内のＰＣＳＫ９媒介性ＭＨＣ－Ｉ分解を示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下の記述では、説明を目的として、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が示されている。当業者であれば、本発明の実施形態が、これらの特定の詳細を用いることなく、または同等の構成を用いて実施され得ることを認識するであろう。他の例では、本発明の実施形態を不必要に曖昧にすることを避けるために、周知の構造および装置がブロック図の形態で示されている。

【0051】

本開示の主題は、さらに広範囲の発明の主題の１つ以上の特定の実施形態の理解を提供するのに十分な詳細とともに提示されている。説明は、本発明の主題を明示的に説明された実施形態および特徴に限定することなく、それらの特定の実施形態の特定の特徴を解説し、例示する。これらの説明を考慮した考察であれば、本開示の主題の範囲から逸脱することなく、追加の同様の実施形態および特徴をもたらす可能性が高い。

【0052】

定義
本明細書で使用される場合、「治療」、「療法」および／または「治療レジメン」は、患者が呈するか患者が感受性であり得る疾患、障害または生理学的状態に応答して行われる臨床的介入を指す。治療の目的には、症状の緩和または予防、疾患、障害または状態の進行または悪化の遅延または停止、および／または疾患、障害または状態の寛解が含まれる。

【0053】

用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。

【0054】

本明細書で使用される用語「対象」および「患者」は、本明細書では区別なく使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。

【0055】

本明細書で使用される用語「疾患」は、限定するものではないが、生物の一部に影響を与える構造または機能の異常な状態および／または障害を含む。これは、感染症などの外的要因によって、または癌、癌転移などの内的機能障害によって引き起こされ得る。

【0056】

当技術分野で公知のように、癌は、一般に、制御されていない細胞増殖と考えられる。本開示の方法は、ＰＣＳＫ９の発現を特徴とする任意の癌およびその任意の転移を治療するために使用することができる。そのような癌には、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれる。そのような癌のさらに具体的な例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌、唾液腺癌、中皮腫、腎癌、外陰癌、膵癌、甲状腺癌、肝細胞癌、皮膚癌、黒色腫、脳癌、神経芽細胞腫、骨髄腫、様々な種類の頭頸部癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫および末梢性神経上皮腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌は、ＰＣＳＫ９を発現する固形腫瘍を含む。他の実施形態では、癌は、ＰＣＳＫ９を発現する血液由来癌を含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、「プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９」または「ＰＣＳＫ９」は、阻害剤の投与時または投与後に対象内のＰＣＳＫ９の正常な活性を低下させることができる任意の分子を指すことを意味する。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）代謝に重要なタンパク質である。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の分解に重要な役割を果たす。ＬＤＬ代謝では、ＬＤＬＲは循環血液中のＬＤＬに結合し、リソソーム分解のために、クラスリンにより被覆された穴にＬＤＬを内在化する。ＬＤＬの内在化に続いて、ＬＤＬＲは原形質膜に戻され、そこでさらに多くのＬＤＬに結合することができる。この過程は連続的に繰り返される。ただし、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９分解は、膜へのＬＤＬＲの再循環を妨げ、その結果、血液からのＬＤＬクリアランスを低下させる。したがって、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－Ｃの減少を促進するための阻害のための重要な標的を有し、ひいては、高コレステロール血症および関連する心血管疾患の治療のための治療標的を有する。ＰＣＴ７ＵＳ２００８／０５６３１６には、ＰＣＳＫ９の結晶構造が記載された。さらに、ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１６８６は、高コレステロール血症に関連するヒトＰＣＳＫ９遺伝子の変異を記載している。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－Ｃ代謝経路の一部である。

【0058】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0059】

方法
本開示は、部分的に、ＰＣＳＫ（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型前駆体）が癌治療の新規の標的であるという本発明者らによる発見に基づいている。ＰＣＳＫ９は、肝細胞および他の細胞型のＬＤＬ－Ｒ（低密度リポタンパク質受容体）レベルの調節に重要な役割を果たすことが知られている分泌タンパク質である。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－Ｒに結合し、宿主細胞内でその分解を促進することにより、ＬＤＬ－Ｒを負に調節する。これまで、ＰＣＳＫ９遺伝子内の変異は、それらがＰＣＳＫ９のＬＤＬ－Ｒ分解機能を増強するか減弱するかに応じて、ＬＤＬ血中濃度を劇的に増加または低下させ得ることが分かっていた。

【0060】

本発明の一実施形態では、個体の癌を治療するための方法は、治療有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を個体に投与することを含み得る。本発明のさらに別の実施形態では、該方法は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与することをさらに含み得る。

【0061】

抗体
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体を含み得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、単一ドメインまたはそれらの断片であり得る。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、いくつかの自然発生変異は例外である可能性があるが、個々の抗体が互いに同一である場合）由来の抗体を指すことを意味する。ＭＡｂは高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものであり、多くの場合、抗原上の単一の決定基に対するものである。抗体はさらにヒト化され得る。本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の形態を指すことを意味する。多くのヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0062】

いくつかのＰＣＳＫ９拮抗性／阻害抗体（およびその断片）は、以下のような特許文献に記載されており、本明細書で提供される方法に使用するのに好適であり得る：ＭＥＲＣＫ／ＳＣＨＥＲＩＮＧ ＣＯＲＰ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３１ １）；ＳＣＨＥＲＩＮＧ ＣＯＲＰ．（ＰＣＴ／ＵＳ２０１ １／０５６６４９）；ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５４７５６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４８５７４；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８０１３）；ＳＡＮＯＦＩ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１３１８；ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１３２０；ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１３２１）；ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５４７３７）；ＡＦＦＩＲＩＳ ＡＧ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６７９５０）；ＰＦＩＺＥＲ（ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５３５３４；ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５０９２４；ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５３７８４）；ＮＯＶＡＲＴＩＳ ＡＧ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６１０４５；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４１２１４；ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５４４１７）；ＩＲＭ ＬＬＣおよびＮＯＶＡＲＴＩＳ ＡＧ（ＰＣＴ７ＵＳ２０１２／０２４６３３；ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９９５９）；ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ ＩＮＣ．およびＨＯＦＦＭＡＮＮ ＬＡ ＲＯＣＨＥ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１ １／０２４６３３）；ＭＥＲＣＫ ＳＨＡＲＰ＆ＤＯＨＭＥ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４７１４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４６４０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８８４９）；ＲＩＮＡＴ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯＲＰ／ＰＦＩＺＥＲ（ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５３９９０）；ＭＥＲＣＫ＆ＣＯ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３３３６９；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３３３４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３２２３；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３２１３；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３２１２；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３１６９）；ならびにＡＭＧＥＮ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４０９７）。他の実施形態では、本発明の方法によるＰＣＳＫ９に対する拮抗性抗体には、限定するものではないが、レパーサ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ １４５およびエボロクマブとしても知られている）、プラルエント（登録商標）（ＲＥＧＮ ７２７［Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ］およびＳＡＲ２３６５５３［Ｓａｎｏｆｉ］としても知られている）、ＬＹ３０１５０１４（フロボシマブ［Ｌｉｌｌｙ］としても知られている）、ＲＮ３１６（ボコシズマブ［Ｐｆｉｚｅｒ］としても知られている）、Ｊ１０［Ｐｆｉｚｅｒ］、Ｊ１６［Ｐｆｉｚｅｒ］、Ｊ１７［Ｐｆｉｚｅｒ］、１Ｄ０５－ＩｇＧ２［Ｍｅｒｃｋ］、１Ｂ２０［Ｍｅｒｃｋ］、ＲＧ７６５２［Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、ＬＧＴ２０９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］およびＭＥＤＩ－４１６６［Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ］が含まれる。

【0063】

別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、二重特異性抗体を含み得る。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＣＳＫ９に対して拮抗的である一方のアームと、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質に対して拮抗的である他方のアームとを含み得る。好適な免疫チェックポイントタンパク質には、限定するものではないが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦ－βおよびそれらの組合せが含まれる。

【0064】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＣＳＫ９に対して拮抗的である一方のアームと、免疫刺激標的に対して作動的である他方のアームとを含み得る。好適な免疫刺激標的には、限定するものではないが、１ＢＢ、ＯＸ４０およびＩＣＯＳが含まれる。

【0065】

融合タンパク質
別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、融合タンパク質を含み得る。融合タンパク質またはキメラタンパク質とは、別個のタンパク質を元々コードしていた２つ以上の遺伝子の結合によって作成されたタンパク質を指す。一実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、アネキシンＡ２融合タンパク質を含み得る。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、アネキシンＡ２－Ｆｃ融合タンパク質を含み得る。

【0066】

アドネクチン
別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、アドネクチンを含み得る。本明細書で使用される用語「アドネクチン」は、第１０のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいており、治療に関連する標的に高い親和性および特異性で結合するように設計された治療用タンパク質を指す。好適な例には、限定するものではないが、ＰＣＳＫ９阻害剤ＢＭＳ－９６２４７６（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。

【0067】

ＲＮＡｉ
ＰＣＳＫ９阻害分子は、ＲＮＡｉをさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）法を含め、当技術分野で公知の遺伝子サイレンシング法のいずれかを含むことを意味する。これらには、限定するものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）；低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）；非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）；低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｉｓｉＲＮＡ）；メロデュプレックスＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）；ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ二重鎖；トランスキングダムＲＮＡ（ｔｋＲＮＡ）；ｔＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ；タンデムｓｉＲＮＡ（ｔｓｉＲＮＡ）；タンデムヘアピンＲＮＡ（ｔｈＲ Ａ）；ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ模倣クラスター（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ ｃｌｕｓｔｅｒ）；および転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）のうちの任意の１つ以上が含まれ得る。一実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＥＤＦ－Ａドメイン模倣ペプチドを含み得る。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するＲＮＡｉ、Ａｌｎｙｌａｍ／ＡＬＮ－ＰＣＳ０２を含み得る。さらに別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するＲＮＡｉ、Ａｌｎｙｌａｍ／Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃ／インクリシランを含み得る。

【0068】

オリゴヌクレオチド
他の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。例には、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製のＰＣＳＫ９アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３９４８１４；ＢＭＳ－ＰＣＳＫ９Ｒｘ）が挙げられる同様に、Ｓａｎｔａｒｉｓ Ｐｈａｒｍａ製のロック核酸（ＳＰＣ４０６１；ＳＰＣ５０１１；ＬＮＡ ＡＳＯ）は、マウスのＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを低下させた。ＬＮＡ ＡＳＯは、ヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ（アクセッション番号ＮＭ１７４９３６およびＮＭ１５３５６５）に相補的であり、以下の配列、すなわちＧＴｃｔｇｔｇｇａａＧＣＧ（大文字はＬＮＡ、小文字はＤＮＡ）と、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合とを有する１３ヌクレオチドの長いギャップマーである。Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、ＰＣＳＫ９の阻害に関するｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ－ＰＣＳ）の臨床試験で肯定的な結果を示している。いくつかのＰＣＳＫ９阻害性オリゴヌクレオチドは、以下のような特許文献に記載されており、本開示の範囲内にある：ＳＡＮＴＡＲＩＳ ＰＨＡＲＭＡ Ａ／Ｓ（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７０３；ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４４９９；ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９２５７）；ＩＳＩＳ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８４０４）；ＳＩＲＮＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３７２３）；ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２０１ １／０５８６８２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７７２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８７０７；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３２７４３；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８６５５）；ＲＸＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯＲＰ．（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００００１９）ＩＮＴＲＡＤＩＧＭ ＣＯＲＰ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３６５５０）；およびＮＡＳＴＥＣＨ ＰＨＡＲＭ ＣＯ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５５５５４）。

【0069】

ペプチド系ワクチン
本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に対するペプチド系ワクチンであり得る。好ましい実施形態では、ペプチド系ワクチンは、ＡＴ０４Ａ［Ａｆｆｉｒｉｓ］、またはＷＩＰＯ特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０２７２５７に記載されているものなどの他のＰＣＳＫ９ワクチンであり得る。

【0070】

低分子
本発明の別の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、低分子阻害剤であり得る。好ましい実施形態では、低分子阻害剤は、ＳＸ－ＰＣＳＫ９［Ｓｅｒｏｍｅｔｒｉｘ］、またはＷＩＰＯ特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１５０３９５に記載されているものなどの他の低分子ＰＣＳＫ９阻害剤であり得る。上記の説明および図面は例示的なものであり、本発明を開示された正確な形態に限定するものと解釈されるべきではない。関連技術の当業者であれば、上記の開示に照らして多くの修正および変形が可能であることを理解することができる。本開示の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が説明されている。ただし、特定の例では、説明を曖昧にすることを避けるために、周知のまたは従来の詳細は説明されていない。

【0071】

ペプチド
ＰＣＳＫ９を阻害するために、ＰＣＳＫ９に結合するＬＤＬＲのＥＧＦＡドメインを模倣するペプチドが開発されている。同様に、ＥＧＦ－Ａペプチド、ＰＣＳＫ９に結合するフィブロネクチン系足場ドメインタンパク質、およびＰＣＳＫ９変異体（例えば、Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインを有する）の中和が開発されており、これらはいずれもＰＣＳＫ９活性を阻害することが示されている。いくつかのＰＣＳＫ９阻害ペプチドは、以下のような特許文献に記載されており、本開示の範囲内にある：ＳＣＨＥＲＩＮＧ ＣＯＲＰ．（ＰＣＴ ＵＳ２００９／０４４８８３）；ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ ＩＮＣ．およびＨＯＦＦＭＡＮＮ ＬＡ ＲＯＣＨＥ（ＰＣＴ ＵＳ２０１２／０４３３１５）；ＳＱＵＩＢＢ ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＣＯ．（ＰＣＴ／ＵＳ２０１ １／０３２２３１；ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５２９８）；ＡＮＧＥＬＥＴＴＩ Ｐ １ＳＴ ＲＩＣＨＥＲＣＨＥ ＢＩＯ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５４６４６）；ならびにＡＭＧＥＮ ＩＮＣ．（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４７７５）。

【0072】

治療的投与および医薬製剤
本発明による治療用組成物の投与は、好適な担体、賦形剤、および改善された伝達、送達、忍容性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与され得る。あらゆる医薬品化学者に公知の処方集、すなわち、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に、多数の適切な製剤を見出すことができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）など）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１を参照されたい。

【0073】

用量は、投与される対象の年齢および寸法、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。本開示のＰＣＳＫ９阻害剤が、成人患者に対して、癌などを含め、ＰＣＳＫ９に関連する様々な状態および疾患を治療するために使用される場合、本開示のＰＣＳＫ９阻害剤を通常、約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度および持続期間を調整してもよい。

【0074】

様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内のカプセル化、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体を介したエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照）が公知であり、本開示の医薬組成物を投与するために使用され得る。導入の方法には、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれ得る。組成物は、任意の都合の良い経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は全身的または局所的であり得る。

【0075】

医薬組成物はまた、小胞、特にリポソーム内で送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５；Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、ｐｐ．３１７－３２７を参照；全体的に同書を参照）。

【0076】

特定の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照）。別の実施形態では、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）に記載されているポリマー材料が使用され得る。さらに別の実施形態では、制御放出系が組成物の標的の近くに配置されてもよく、したがって、全身用量のごく一部しか必要とされない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８，１９８４を参照）。

【0077】

本発明の他の実施形態では、注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射に従来使用される無菌の水性媒体または油性媒体に、上記のＰＣＳＫ９阻害剤（例えば、拮抗性抗体またはその塩）を溶解、懸濁または乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含有する等張液などがあり、これらは、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルバート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などと組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが使用され、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このように調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。本開示の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下または静脈内送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本開示の医薬組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン送達装置は、再使用可能または使い捨てであり得る。再使用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が残らず投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換され得る。その後、ペン送達装置は再使用され得る。使い捨てペン送達装置には、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達装置は、装置内のリザーバに保持された医薬組成物によって予め充填されていてもよい。リザーバ内の医薬組成物が空になると、装置全体が廃棄されてもよい。

【0078】

多数の再使用可能なペン送達装置および自動注射器送達装置が、本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される。例には、確実に限定するものではないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（登録商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）ｐｅｎ（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（登録商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（登録商標）ｐｅｎ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（登録商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（登録商標）ｐｅｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（登録商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（登録商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、ここに挙げた例はわずかに過ぎない。本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン送達装置の例には、確実に限定するものではないが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（登録商標）ｐｅｎ（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が挙げられる。

【0079】

有利には、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量のそのような剤形には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが含まれる。

【0080】

投与量
本発明のいくつかの方法に従って個体に投与されるＰＣＳＫ９阻害剤の量は、一般に、治療有効量であり得る。抗体を含むＰＣＳＫ９阻害剤の場合、治療有効量は、約０．０５ｍｇ～約６００ｍｇ、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇまたは約６００ｍｇのＰＣＳＫ９阻害剤であり得る。

【0081】

個々の用量に含有されるＰＣＳＫ９阻害剤の量は、患者の体重１キログラム当たりの抗体のミリグラム数（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）で表され得る。例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体は、約０．０００１～約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で患者に投与され得る。

【0082】

投与レジメン
本発明の特定の実施形態によれば、定義された時間経過にわたって、ＰＣＳＫ９阻害剤の複数用量を対象に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、対象に複数用量のＰＣＳＫ９阻害剤を連続投与することを含み得る。本明細書で使用される場合、「連続投与」は、ＰＣＳＫ９阻害剤の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）によって隔てられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本発明は、ＰＣＳＫ９阻害剤の単一の初期用量、続いてＰＣＳＫ９阻害剤の１つ以上の二次用量、および場合によりＰＣＳＫ９阻害剤の１つ以上の三次用量を患者に連続投与することを含み得る方法を含む。

【0083】

用語「初期用量」、「二次用量」および「三次用量」は、ＰＣＳＫ９阻害剤の投与の時間的順序を指す。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」は、初期用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初期用量、二次用量および三次用量はいずれも同じ量のＰＣＳＫ９阻害剤を含有し得るが、一般に、投与頻度の点で互いに異なる。ただし、特定の実施形態では、初期用量、二次用量および／または三次用量に含有されるＰＣＳＫ９阻害剤の量は、治療の過程中に互いに変化する（例えば、必要に応じて上下に調整される）。

【0084】

本開示の特定の例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上）日後、または直前の用量の１～１２（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上）週間後に投与される。本明細書で使用される「直前の用量」という語句は、複数投与の順序では、その順序の次の用量の投与の前に患者に投与されるＰＣＳＫ９阻害剤の用量を意味し、介在する用量は存在しない。

【0085】

本発明のこの態様による方法は、任意の数の二次用量および／または三次用量のＰＣＳＫ９阻害剤を患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。

【0086】

複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～１２週間後に患者に投与され得る（例えば、週１回［Ｑ１Ｗ］、２週間に１回［Ｑ２Ｗ］、３週間に１回［Ｑ３Ｗ］、４週間に１回［Ｑ４Ｗ］、６週間に１回［Ｑ６Ｗ］、８週間に１回［Ｑ８Ｗ］など）。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の１～１２週間後に患者に投与され得る（例えば、週１回［Ｑ１Ｗ］、２週間に１回［Ｑ２Ｗ］、３週間に１回［Ｑ３Ｗ］、４週間に１回［Ｑ４Ｗ］、６週間に１回［Ｑ６Ｗ］、８週間に１回［Ｑ８Ｗ］など）。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの過程にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師による治療の過程で調整され得る。

【0087】

併用療法および補助療法
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、本開示の医薬組成物の投与時または投与直前に癌の治療のための抗癌治療レジメンを受けている患者に、ＰＣＳＫ９阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み得る。例えば、以前にＰＣＳＫ９発現を特徴とする癌（例えば、固形腫瘍または血液由来癌）と診断された患者が、ＰＣＳＫ９阻害剤を含む医薬組成物の投与の前および／または投与と同時に、別の薬剤の安定した治療レジメンを処方され、服用している場合がある。例えば、一実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、抗癌治療、および／または血管新生因子の阻害剤と同時に投与され得る。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、抗癌治療、および／または血管新生因子の阻害剤の投与前に投与され得る。さらに他の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、抗癌治療、および／または血管新生因子の阻害剤の投与後に投与され得る。

【0088】

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0089】

別の実施形態では、抗癌治療は、放射線療法、従来の化学療法、または標的化学療法からなる群から選択され得る。

【0090】

さらに別の実施形態では、血管新生因子の阻害剤は、ＶＥＧＦの阻害剤、ＶＥＧＦＲ１の阻害剤、ＶＥＧＦＲ２の阻害剤、ＴＥＫの阻害剤およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。他の実施形態では、血管新生因子の阻害剤は、低分子を含むか、低分子からなるか、低分子から本質的になり得る。さらに他の実施形態では、血管新生因子の阻害剤は、抗体を含むか、抗体からなるか、抗体から本質的になり得る。他の実施形態では、血管新生因子の阻害剤は、融合タンパク質を含むか、融合タンパク質からなるか、融合タンパク質から本質的になり得る。

【0091】

以下の例は、限定ではなく説明のために提供される。

【0092】

例１
ここで図１および図２を参照すると、ＰＣＳＫ９の阻害は、インビボで腫瘍増殖を有意に減弱することができる。図１で同定された２つのｓｇＲＮＡ配列を組換えレンチウイルスベクターにクローニングし、それぞれＢ１６Ｆ１０および４Ｔ１細胞に感染させるために使用した。ウエスタンブロット分析は、いずれかのｓｇＲＮＡ配列を使用して、Ｂ１６Ｆ１０および４Ｔ１細胞に対してＰＣＳＫ９のノックアウトが成功したことを示している。

【0093】

図２は、ＰＣＳＫ９をノックアウトすると、Ｂ１６Ｆ１０細胞ではインビボでの腫瘍増殖が有意に遅延し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの４Ｔ１細胞ではインビボでの腫瘍増殖が有意に減弱することを示している。上部のグラフは腫瘍のそれぞれの腫瘍増殖曲線を示し、中央のパネルは動物の殺処分の終了時の後のそれぞれの腫瘍サイズを示し、下部のグラフは腫瘍重量を示している。Ｂ１６Ｆ１０および４Ｔ１の両実験ではＮ＝６。

【0094】

ここで図３を参照すると、ＰＣＳＫ９の阻害は、免疫チェックポイント療法、ならびに他の確立された癌治療法、例えば、放射線療法、従来の化学療法、および標的化学療法と相乗して、腫瘍増殖をさらに減弱させることができる。図３は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおけるＰＣＳＫ９阻害、拮抗性抗体レパーサ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ １４５およびエボロクマブとしても知られている）、および免疫チェックポイント阻害剤抗ＰＤ１抗体の様々な組合せから得られた結果を示している。上部のグラフは腫瘍のそれぞれの腫瘍増殖曲線を示し、中央のパネルは動物の殺処分の終了時の後のそれぞれの腫瘍サイズを示し、下部のグラフは腫瘍重量を示している、ｎ＝５。５匹のマウスのうち２匹では、全３種類の処置の組合せを使用した実験の終了時に腫瘍は存在しなかった。

【0095】

例２
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して、４つの悪性マウス癌細胞株（Ｂ１６Ｆ１０、４Ｔ１、ＭＣ３８、ＣＴ２６）のＰＣＳＫ９遺伝子をノックアウトした。ＰＣＳＫ９ノックアウトは、腫瘍細胞の形態もしくはインビトロ増殖速度、または軟寒天中で３Ｄコロニーを形成する能力を変化させなかった。

【0096】

材料および方法
細胞株および組織培養
Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞、ＣＴ２６マウス結腸癌、４Ｔ１マウス乳癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入した。ＭＣ３８マウス結腸腺癌細胞は、Ｄｒ．Ｔａｋｕｙａ Ｏｓａｄａ（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から入手した。Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６、４Ｔ１、ＭＣ３８、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はいずれも、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ならびに１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で増殖させた。いずれの細胞株も、ユニバーサルマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）検出キット（ＡＴＣＣ）を使用して、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）試験に定期的に供した。

【0097】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＰＣＳＫ９の遺伝子ノックアウト
レンチウイルスを介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、ＰＣＳＫ９ノックアウト細胞を作製した。オンラインＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｃｈｏｐｃｈｏｐ）を使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を設計した。マウスおよびヒトのＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列を以下の表１に示す。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを同じベクター内で共発現するＢｓｍＢ１（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）消化プラスミドＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２（ＭＩＴのＤｒ．Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ博士によりＡｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡに寄託された）に、ｓｇＲＮＡ配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングした。次いで、Ｚｈａｎｇラボによって確立されたプロトコルに従って、ｓｇＲＮＡをコードするＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターを作製した。ノックアウト細胞株を作製するために、標的細胞を、ｓｇＲＮＡをコードするＣＲＩＳＰＲレンチウイルスに感染させ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、７～１０日かけてピューロマイシン（Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６、ＭＣ３８、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１では１μｇ／ｍｌおよび４Ｔ１では４μｇ／ｍｌ）中で選択した。ウエスタンブロットによって感染細胞内のＰＣＳＫ９タンパク質の発現を検出して、ノックダウンを検証した。一般に、実験に使用する前に、ＰＣＳＫ９ノックアウト細胞の混合集団をインビトロで１０～１２日間増殖させた。

【表1】

【0098】

軟寒天コロニー形成アッセイ
ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍細胞が３Ｄで増殖する能力を測定するために、確立されたプロトコルに従って軟寒天アッセイを行った。６ウェルプレートに、１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で２連で細胞を播種した。３週間の培養後、コロニーを固定し、０．００５％クリスタルバイオレットを用いて染色した。次いで、１ウェル当たりのコロニー数を計数した。２つの独立した実験を行った。

【0099】

マウスの腫瘍増殖
この試験で行われた動物実験はいずれも、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＯＴ－１トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。ＮＯＤ ＣＲＩＳＰＲ ＰｒｋｄｃＩｌ２ｒＧａｍｍａ（ＮＣＧ）三重免疫不全マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。腫瘍細胞を注射する前に、年齢を一致させた６～８週齢のマウスの脇腹を剃毛した。次いで、剃毛した脇腹に、１．０ｘ１０^５のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９改変対照または標的遺伝子ノックアウト腫瘍細胞とともに、腫瘍細胞を皮下注射した。

【0100】

ＰＣＳＫ９中和抗体を含む実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．５ｘ１０^５のＭＣ３８結腸癌細胞を皮下接種し、３、５、８および１１日目に２００μｇのヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を（腹腔内）注射した。さらに、５および８日目に、抗ＰＣＳＫ９抗体と組み合わせて、約１００μｇの抗ＰＤ１（クローン：ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）抗体を一部のマウスに注射した。その後、２～３日ごとにマウスの腫瘍増殖をモニタリングした。キャリパーを使用して腫瘍サイズを測定した。進行性に増殖する腫瘍が最長寸法で１．５ｃｍに達した時点として死亡を定義した。

【0101】

リンパ球の枯渇
マウスにおける免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の特定のサブセットの役割を評価するために、それぞれ－３、０、３および８日目に、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した１５０μｇの抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、１００μｇの抗ＣＤ８β（５３－５．８）および２００μｇの抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）をｉ．ｐ．注射することにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を枯渇させた。対照として、等量のＩｇＧアイソタイプ抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を注射した。

【0102】

インビボ競合アッセイ
ＥＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏを安定に発現するＢ１６Ｆ１０細胞を、それぞれＰＣＳＫ９標的（表１のｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２）または対照レンチウイルスベクターに感染させ、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて１０日かけて選択した。続いて、約５ｘ１０^４のＰＣＳＫ９ノックアウト細胞（ＥＧＦＰ発現）と５ｘ１０^４の対照細胞（ｔｄＴｏｍａｔｏ発現）とを混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに皮下接種した。接種後１２～１４日に腫瘍を切除した。次いで、それらを細かく切り刻み、ＤＮａｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびコラゲナーゼＰ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）中で３７^ｏＣで２０分間インキュベートした。解離した腫瘍細胞を７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ）に通した。腫瘍細胞を洗浄し、２％ＦＢＳを含む氷冷ＰＢＳに再懸濁した。ＢＤ Ｃａｎｔｏフローサイトメトリーシステム（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用して、ＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏ腫瘍細胞との比を分析した。

【0103】

フローサイトメトリーによる細胞表面ＭＨＣ－Ｉ発現の分析
インビボ実験では、ＰＣＳＫ９欠乏（ＦＧＰ発現）または対照ベクター（ｔｄＴｏｍａｔｏ発現）Ｂ１６Ｆ１０細胞をマウスに別個に接種し、１０～１２日後に腫瘍を採取した。次いで、腫瘍細胞を上記のように分解および処理し、抗Ｈ－２Ｋ^ｂ／Ｈ－２Ｄ^ｂ抗体（２８－８－６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してフローサイトメトリー分析に供した。

【0104】

インビトロ実験では、抗Ｈ－２Ｋ^ｂ／Ｈ－２Ｄ^ｂ（２８－８－６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）もしくは抗Ｈ－２Ｋ^ｄ／Ｈ－２Ｄ^ｄ（３４－１－２Ｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、またはＨＬＡ－Ａ２（ＢＢ７．２）抗体を用いて、それぞれ氷上で２０分かけて、Ｂ１６ Ｆ１０、４Ｔ１、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を染色した。いくつかの実験では、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ、４Ｔ１：４ｎｇ／ｍｌ；Ｂ１６Ｆ１０、１ｎｇ／ｍｌ）を用いて細胞を１２時間処理して、ＭＨＣ Ｉ発現を刺激した。ＰＢＳ＋２％ＰＢＳで洗浄した後、ＢＤ Ｃａｎｔｏフローサイトメトリーシステム（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用して、ＭＨＣ Ｉ表面分子の発現レベルを分析した。

【0105】

フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤リンパ球の分析
Ｂ１６Ｆ１０細胞をＰＣＳＫ９標的または対照レンチウイルスベクターに感染させ、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて１０日かけて選択した。次いで、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、約１ｘ１０^５のＰＣＳＫ９ノックアウトまたは対照細胞を皮下接種した。接種後１２日目に腫瘍を収集し、重量を測定し、機械的に細かく切り刻み、ＤＮａｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびコラゲナーゼＰ（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）中で２０分間３７°Ｃでインキュベートした。解離した細胞を７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ）に通した。次いで、濾過した細胞を抗ＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてブロックし、指定された表面抗体を用いて氷上で２０分間染色した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、死細胞を除外した。製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、固定および透過処理後に細胞内抗体を加えた。抗マウス蛍光色素コンジュゲート抗体を表２に示す。ＢＤ Ｃａｎｔｏフローサイトメトリーシステムを使用して、染色された細胞を分析した。

【表2】

【0106】

腫瘍浸潤リンパ球ＴＣＲ配列決定
上記のように腫瘍細胞を接種し、接種後１０日目にゲノムＤＮＡ抽出のためにそれらを収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、マウスＴＣＲＢ ＣＤＲ３サーベイ配列決定のためにＡｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに提出した。ＰＣＲ反応のインプットとして約２．６μｇの初期ＤＮＡを使用した。Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅオンライン分析プラットフォームを使用してデータを分析した。

【0107】

ＯＴ－１ Ｔ細胞培養
ＯＴ－１ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から、マウスＨ－２Ｋ^ｂに結合したＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを特異的に認識するＴＣＲをコードする導入遺伝子を発現するＯＴ－１ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を採取した。マウス組換えＩＬ２の存在下で、５ｘ１０^６細胞／ｍｌのＯＴ－１ ＳＩＩＮＦＥＫＬパルスマウス脾細胞を５～７日間インビトロでインキュベートすることにより、活性化されたＯＴ－１ Ｔ細胞を作製した。要約すると、ＯＴ－１マウスの脾臓を採取し、無菌技術を使用してホモジナイズした。放出された細胞をペレット化し、３ｍｌ ＡＣＫ緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ_３および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に２分間再懸濁して、室温で赤血球を溶解した。次いで、脾細胞をペレット化し、洗浄し、０．７５μｇ／ｍｌ ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含有する完全増殖培地（１０％ウシ胎児血清［Ｃｏｒｎｉｎｇ］、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、１Ｘピルビン酸ナトリウム［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］および１Ｘ ２－メルカプトエタノール［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を含むＲＰＭＩ１６４０［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）中に５ｘ１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、９５％空気／５％ＣＯ_２加湿環境で３７^ｏＣでインキュベートした。３および５日目に、新鮮な完全増殖培地とともに、マウス組換えＩＬ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３０ユニット／ｍｌで加えた。７日目に、アッセイのために細胞を回収した。ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０標識抗マウスＣＤ８およびＡＰＣ標識抗マウスＴＣＲＶβ５．１／５．２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用したフローサイトメトリー分析によって特異性を決定した。

【0108】

ウエスタンブロット
細胞をＰＢＳで洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤を添加したＲＩＰＡ緩衝液中に溶解した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより等量のタンパク質を分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。特異的な抗体、続いてＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体を用いてタンパク質をプローブした。ＥＣＬを使用してＨＲＰシグナルを発現させた。Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を使用して、目的のタンパク質の定量を分析した。

【0109】

細胞分画
リソソームおよび膜内のＭＨＣ－Ｉの分布を検討するために、５ｘ１０^７のＨ２－Ｋ１－Ｆｌａｇ形質導入ＰＣＳＫ９過剰発現またはノックアウトＢ１６Ｆ１０細胞を使用して、リソソームおよび膜画分を単離した。リソソームの単離には、製造業者の指示に従って（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、密度勾配超遠心分離法を使用した。膜分離緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）および緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ）を使用して、膜画分を分離した。マウス抗Ｆｌａｇ抗体を使用したウエスタンブロットによって、リソソームおよび膜画分内のＭＨＣ－Ｉ発現を検出した。それぞれリソソームおよび膜のマーカーとして、マウス抗ＬＡＭＰ２（Ｐｏｒｔｅｉｎｔｅｃｈ）およびウサギ抗パンカドヘリン（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。

【0110】

腫瘍細胞およびＯＴ－１ Ｔ細胞の共培養分析
１ｎｇ／ｍｌでマウス組換えＩＦＮγと１２時間インキュベーションすることによって、Ｂ１６Ｆ１０ Ｃｔｒｌ－Ｔｄ（ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現）、Ｂ１６Ｆ１０ ＰＣＳＫ９ＫＯ－Ｔｄ、Ｂ１６Ｆ１０ Ｃｔｒｌ－ＯＶＡ－Ｔｄ（ニワトリ卵白アルブミン遺伝子を発現）およびＢ１６Ｆ１０ ＰＣＳＫ９ ＫＯ－ＯＶＡＴｄ細胞を最初に刺激した。次いで、マウス組換えＩＬ２（３０ユニット／ｍｌ）を含むＯＴ－１ Ｔ細胞完全増殖培地中で、１：１の比でＯＴ－１ Ｔ細胞とともに、またはＯＴ－１ Ｔ細胞を用いず、刺激された腫瘍細胞を２４時間培養した。続いて、ＴｄＴｏｍａｔｏ発現腫瘍細胞を計数するために、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１蛍光顕微鏡イメージングステーションによってＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光および明視野画像（各ウェルについて３つの視野）を捕捉し、ＺＥＮイメージングソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ）およびＩｍａｇｅＪ １．５２ｈ（ＮＩＨ）によって分析した。二元配置分散分析とＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定とを使用して、統計的有意性を検討した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して結果をプロットした。

【0111】

免疫蛍光および免疫組織化学分析
免疫蛍光分析では、マウスから得られた腫瘍を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、薄片にした後、切片上に封入した。次いで、表２に記載されているマウスＣＤ４５またはＣＤ８ａに対する抗体を使用して、標準的な手順に従って染色した。

【0112】

リソソーム共局在化実験では、細胞をＬｙｓｏ－Ｔｒａｃｋｅｒ（ディープレッド、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と３７^ｏＣで２０分間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、５％ロバ血清、０．１％ジギトニン）を室温で３０分間浸透させた。次いで、細胞を抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）および抗ＰＣＳＫ９（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、５５２０６－１－ＡＰ）一次抗体と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩを含有する封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、染色した切片を封入した。共焦点顕微鏡を使用して画像を捕捉した。

【0113】

異所性遺伝子発現構築物の生成
表３に記載されている配列を有するＰＣＲプライマーを使用して、ｍｙｃタグ付きマウスＰＣＳＫ９の２．２ｋｂ断片と、ｆｌａｇタグ付きＨ２Ｋ^ｄの０．７ｋｂ断片とを得た。次いで、製造業者の指示（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って、ギブソンアセンブリのキットを使用して、ＧＦＰ－Ｎｅｏレンチウイルスベクターに、ＰＣＳＫ９－ｍｙｃおよびＨ２Ｋ^ｄ－Ｆｌａｇ断片をコードするＤＮＡ断片をクローニングした。遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを作製し、次いでＢ１６Ｆ１０細胞を感染させるために使用した。その後の分析の前に、Ｇ４１８を用いて５日かけて細胞を選択した。

【表3】

【0114】

タンパク質共免疫沈降（ＣＯ－ＩＰ）
１０ｃｍペトリ皿で培養した細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した５００μｌのＩＰ溶解緩衝液（１５０ｎＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ＮＰ－４０）を用いて、氷上で直接溶解した。細胞溶解物を１．７ｍｌチューブに移し、４^ｏＣで１５分間エンドツーエンド回転（ｅｎｄ－ｔｏ－ｅｎｄ ｒｏｔａｔｅｄ）させた。Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイによって溶解物中のタンパク質濃度を測定した。ＨＡタグ付きＰＣＳＫ９タンパク質のＩＰについては、ローテーター上で５００μｌの細胞溶解物を５μｌの抗ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４^ｏＣで一晩インキュベートした。次いで、ｃ－ＨＡ抗体を含む溶解物を２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４^ｏＣで２時間コンジュゲートさせた。ＩＰ溶解緩衝液で３回洗浄した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタン分析のために、プルダウン複合体（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を２Ｘ ＳＤＳローディング緩衝液中で煮沸した。

【0115】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター対照またはＰＣＳＫ９ノックアウトＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析に供した。Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｏｒｅによってＲＮＡ－ｓｅｑを行った。Ｋａｐａ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製キットを使用して、配列決定ライブラリーを作製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ４０００装置を使用して、５０ｂｐの単一末端読取り長により、ライブラリーを配列決定した。

【0116】

読取りの３’末端から低品質の塩基とＩｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターとをトリミングするためにＣｕｔａｄａｐｔを使用するＴｒｉｍＧａｌｏｒｅｔｏｏｌｋｉｔを使用して、ＲＮＡ－ｓｅｑデータを処理した。トリミング後、その後の分析のために、２０ｎｔ以上の読取りのみを保持した。ＳＴＡＲ ＲＮＡ－ｓｅｑアラインメントツールを使用して、マウスゲノムおよびトランスクリプトームのＧＲＣｍ３８．ｐ６に読取りをマッピングした。ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して単一のゲノム位置に読取りをマッピングした場合、その後の分析のために読取りを保持した。ＨＴＳｅｑツールを使用して遺伝子数を編集した。その後の分析では、任意の所与のライブラリー内の少なくとも１０の読取りを有した遺伝子のみを使用した。Ｒ統計プログラミング環境でＤＥＳｅｓｑ２ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、正規化および差次的発現を行った。Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を行って、行われた比較のために、差次的に調節された経路と遺伝子オントロジー用語とを識別した。

【0117】

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、担癌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９対照またはＰＣＳＫ９ノックアウトＢ１６Ｆ１０腫瘍（約２００～３００ｍｍ^３の体積）から全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してランダムヘキサマープライマーを用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に供した。ＱｕａｎｔｉＴｅｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行った。様々な遺伝子に使用したプライマーを表３に示した。

【0118】

シクロヘキシミドチェイスアッセイ
ＭＨＣ－Ｉタンパク質のリソソーム分解のＰＣＳＫ９の影響を決定するために、２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ＣＨＸ、Ｓｉｇｍａ）を用いて、ベクター対照またはＰＣＳＫ９ノックアウトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を処理して、タンパク質生合成を１、４、８、１８、２４時間阻害した。リソソーム阻害のために、２０ｎＭバフィロマイシン（Ｂａｆ Ａ１、Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１、２、４、８、２４時間処理した。次いで、細胞を回収し、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を使用したウエスタンブロットによりＭＨＣクラスＩタンパク質を検出した。

【0119】

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して統計分析を行い、０．０５未満のｐ値によって統計的有意性を決定した。腫瘍増殖遅延実験の多重比較には、二元配置分散分析を使用した。マウスの生存分析には、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用した。他の実験では、独立スチューデントのｔ検定を使用して、２つの群間の比較を行った。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅデータベース（ＧＥＮＴ）を使用して、示された患者コホートにおけるＰＣＳＫ９とＣＤ８Ａとの間の関係を分析した。ＴＣＧＡデータベースからＰＣＳＫ９遺伝子発現および患者生存率に関するデータを取得し、ログランク検定を使用してその関係を評価し、ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であると解釈した。

【0120】

結果
ここで図４Ａ～図４Ｈを参照すると、同系マウス宿主にＰＣＳＫ９欠乏細胞を接種すると、腫瘍を形成するそれらの能力は有意に減弱された（図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｅ、図４Ｇ）。さらに、試験した４つのマウス腫瘍系統いずれでも、ＰＣＳＫ９ノックアウト群では、腫瘍細胞接種後６０日まで宿主マウスに腫瘍が認められない長期生存マウスが存在した。対照的に、マウスにベクター対照形質導入腫瘍細胞を注射した群では、腫瘍増殖のために全マウスを最終的に殺処分しなければならなかった（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｆ、図４Ｈ）。蛍光タンパク質を使用することにより、ＰＣＳＫ９欠乏細胞の優先的な増殖抑制をインビボでさらに確認した。ＰＣＳＫ９ノックアウト細胞がほぼ完全に失われたのに対して、対照細胞が腫瘍塊に多数残っていたことは明らかである。約１ｘ１０^５のベクター対照およびＰＣＳＫ９ノックアウトマウス腫瘍細胞を同系マウスに皮下接種し、腫瘍形成を観察した。腫瘍サイズおよび無腫瘍生存率をともにモニタリングした。「ＴＦ」は、それらの特定の実験が示された数の無腫瘍マウスをもたらしたことを示す。

【0121】

ここで図５Ａ～図５Ｋを参照すると、ＰＣＳＫ９欠乏誘発性増殖抑制を媒介する免疫系の役割をさらに評価するために、ＰＣＳＫ欠乏Ｂ１６Ｆ１０黒色腫、ＭＣ３８結腸癌を接種したマウス、およびＣＴ２６結腸癌モデルに対して、抗ＰＤ１免疫チェックポイント阻害剤を用いて実験を行った。結果は、抗ＰＤ１抗体投与が、３つの腫瘍モデルいずれでも、腫瘍増殖を抑制する点でＰＣＳＫ９欠乏と相乗したことを示している。実際に、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍細胞を接種したマウスの大部分では、抗ＰＤ１抗体による処置後８０～１００日の時点で腫瘍が認められないままであった。図５Ａ～図５Ｃは、同系マウスに対して抗ＰＤ１抗体を用いた、ＰＣＳＫ９ノックアウトＢ１６Ｆ１０黒色腫の処置から得られた結果を示す。同位体対照抗体を使用して、抗ＰＤ１抗体を対照した。図５Ｄ～Ｆは、抗ＰＤ１抗体マウスを用いたＰＣＳＫ９ノックアウトＭＣ３８結腸癌の処置から得られた結果を示す。図５Ｇ～図５Ｋは、マウスに対して抗ＰＣＳＫ９抗体と抗ＰＤ１抗体とを併用した、野生型ＭＣ３８結腸癌の処置から得られた結果を示す。抗ＰＤ１抗体または抗ＰＣＳＫ９抗体を単独で投与すると、ＭＣ３８腫瘍の有意な増殖遅延を引き起こし得るが、その効果は抗ＰＤ１抗体を追加することにより有意に増強された。エボロクマブ＋抗ＰＤ１またはアリロクマブ＋抗ＰＤ１をそれぞれ用いて処置したＭＣ３８マウスの１０匹中５匹または１０匹中４匹では、接種後６０日まで腫瘍が認められないままであり、長期治癒が示された。結果は、様々なマウス腫瘍モデルでは、ＰＣＳＫ９阻害が、抗ＰＤ１免疫チェックポイント療法に対する抵抗性を効果的に克服し得ることを示唆している。

【0122】

ここで図６Ａ～図６Ｉを参照すると、最初の腫瘍細胞接種後、長期間（＞３０日）腫瘍が認められないままであるマウスが再チャレンジに抵抗する能力を評価した。最初のチャレンジ後に腫瘍が認められないままであるマウスに、野生型腫瘍細胞を注射した。結果は、Ｂ１６Ｆ１０（ＰＣＳＫ９欠乏＋ＰＤ１Ａｂ処置）を接種し、腫瘍が認められないマウス１３匹中１１匹、および４Ｔ１（ＰＣＳＫ欠乏のみ）を接種し、腫瘍が認められないマウス１２匹中４匹が、野生型親腫瘍細胞による再チャレンジに抵抗性であったことを示している。データは、抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＰＣＳＫ９阻害が、マウスの長期的な抗腫瘍記憶を誘発し得ることを示している。図６Ａ～図６Ｃは、ＰＣＳＫ９欠乏４Ｔ１細胞の最初の接種の４３日後に腫瘍が認められないままであったＢａｌｂ／Ｃマウスに対して野生型４Ｔ１腫瘍細胞を用いた再チャレンジ後の宿主マウスの腫瘍増殖速度および生存期間を示す。図６Ｄ～図６Ｆは、ＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０細胞の最初の接種および抗ＰＤ１抗体による処置の２６日後に腫瘍が認められないままであったＣ５７ＢＬ／６マウスに対して野生型Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いた再チャレンジ後の宿主マウスの腫瘍増殖速度および生存期間を示す。図６Ｇ～図６Ｈは、ＰＣＳＫ９欠乏ＭＣ３８細胞の最初の接種および抗ＰＤ１抗体による処置の３４日後に腫瘍が認められないままであったＣ５７ＢＬ／６マウスに対して野生型ＭＣ３８腫瘍細胞を用いた再チャレンジ後の宿主マウスの腫瘍増殖速度および生存期間を示す。

【0123】

ここで図７Ａ～図７Ｅおよび図８Ａ～図８Ｆを参照すると、抗腫瘍免疫に対するＰＣＳＫ９阻害の正の効果を理解するために、腫瘍への免疫細胞浸潤を分析した。図７Ａは、同系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで増殖した対照およびＰＣＳＫ９ ＫＯ腫瘍内のＣＤ４５陽性リンパ球の免疫蛍光染色を示す。図７Ｂは、対照およびＰＣＳＫ９ ＫＯ腫瘍内のＣＤ４５陽性リンパ球の定量的推定を示す。図７Ｃは、対照およびＰＣＳＫ９ ＫＯ腫瘍を有するマウスの脾臓内のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の定量的推定を示す。図７Ｄおよび図７Ｅは、対照およびＰＣＳＫ９ ＫＯ腫瘍内の腫瘍内ＩＦＮγおよびグランザイムＢ ｍＲＮＡレベルの定量的逆転写ＰＣＲ（Ｑ－ＲＴＰＣＲ）分析を示す。

【0124】

データは、ＣＤ４５^＋細胞の画分により識別されるように、ＰＣＳＫ９枯渇が、腫瘍内のリンパ球浸潤の全体的な増加を引き起こしたことを示している。さらに、腫瘍内ＣＤ４^＋Ｔヘルパー（Ｔ_ｈ）細胞、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞の有意な増加も観察された（図８Ａ）。対照的に、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞の増加は腫瘍内で観察されなかった（図８Ａ）。さらに、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加は宿主マウスの脾臓では観察されなかった（図７Ｃ）。免疫蛍光染色により、腫瘍へのＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞浸潤の増加をさらに確認した（図８Ｂ、図８Ｃ）。特に興味深いのは、ＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内の腫瘍細胞が豊富な領域内をＣＴＬが移動したという観察であった（図８Ｂ）。比較すると、ＣＴＬは対照Ｂ１６Ｆ１０腫瘍では主に末梢にとどまった（図８Ｂ）。追加の分析は、腫瘍内でＣＤ８^＋ＣＴＬ対Ｔｒｅｇ細胞の比が有意に増加したことを示した（図８Ｄ）。同様に、フローサイトメトリー（図３Ｅ、図３Ｆ）またはＱ－ＲＴ－ＰＣＲ（図７Ｄ、図７Ｅ）のいずれかにより評価した場合、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍ではＩＦＮγ^＋およびグランザイムＢ^＋ＣＴＬの数も有意に増加し、腫瘍内のＣＴＬ活性の増加と一致した。

【0125】

ここで図８Ｇ～図８Ｈおよび図９Ａ～Ｅを参照すると、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を枯渇させるために抗体に基づくアプローチを使用して、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍増殖に対するこれらの細胞成分の相対的重要性を決定した。データは、ＣＤ８^＋細胞の枯渇（図９Ａに示されるスケジュールに従う）が、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍（図８Ｇ、図８Ｈ）に観察された腫瘍増殖遅延を完全に無効にしたことを示している。対照的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の枯渇は、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍の増殖遅延に最小限の影響を及ぼしたのみであった（図９Ｂ～図９Ｅ）。

【0126】

腫瘍内Ｔ細胞の性質に対するＰＣＳＫ９欠乏の影響をさらに特性評価するために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの分子分析を行った。分析は、総ＴＣＲ数（図８Ｉ）と、固有のＴＣＲの数（図８Ｊ）とが、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍では有意に増加したことを示唆し、成熟Ｔ細胞の数および多様性の両方がＰＣＳＫ９欠乏腫瘍では有意に増加したことを示唆している。追加の分析は、個々のＴ細胞クローンの優位性の尺度である生産的クローン性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）が、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍では有意に増加したことを示し（図８Ｋ）、成熟Ｔ細胞の多様性の全体的な増加に加え、Ｔ細胞クローンのサブセットの有意な拡大および優位性を示した。精査により、対照およびＰＣＳＫ９欠乏腫瘍ではともに、個々のＴ細胞クローンの最大優位性は０．３近く（３０％）であったことが示され、これは、一部のＴ細胞クローンが腫瘍内Ｔ細胞集団全体の３０％を占めたことを示唆している（図８Ｌ）。ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍で最も優位であったクローンは、対照腫瘍で最も優位であったクローンとは異なっていた（図８Ｍ）。

【0127】

その後の実験では、ＣＴＬを介した腫瘍細胞の細胞殺傷に対するＰＣＳＫ９欠乏の影響を決定した。これを行うために、ニワトリＯＶＡ抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に特異的なＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞が単離されたＯＴ－Ｉトランスジェニックマウスモデルと、ＯＶＡ形質導入、ｔｄＴｏｍａｔｏ標識ベクター対照およびＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞に対するその細胞傷害性効果とをインビトロで評価した。結果は、ＰＣＳＫ９欠乏により、Ｂ１６Ｆ１０細胞が細胞傷害性Ｔ細胞活性に対して有意にさらに感受性になることを示している（図８Ｎおよび図９Ｆ）。

【0128】

公的に利用可能なデータベース（ＧＥＮＴ、ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ）を使用して、ヒト癌患者におけるＰＣＳＫ９発現と腫瘍免疫シグネチャーとの間の関係を評価した。所見は、ヒトの食道癌、結腸腺癌、膵臓腺癌および前立腺腺癌では、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現がＣＴＬマーカーＣＤ８Ａの発現と負に相関することを示し（図８Ｏ）、マウスにおける上記の所見がヒト患者の転帰に関連することを示唆している。

【0129】

ここで図１０Ａ～図１０Ｈを参照すると、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍細胞の増強されたＣＴＬ殺傷に関与する分子機構を検討した。ＬＤＬ‐Ｒなどの細胞表面タンパク質レベルの調節におけるＰＣＳＫ９の既知の活性のために、ＰＣＳＫ９欠乏が腫瘍細胞の表面上の抗原提示に影響を及ぼし得るという仮説を試験した。ＭＨＣ－Ｉは、ＣＴＬ活性を調節するのに主要な役割を果たす重要な抗原提示タンパク質複合体であるため、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞内で、十分に特徴付けられたＯＶＡ抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を提示するＭＨＣ－Ｉ複合体の能力に対するＰＣＳＫ９欠乏の影響を分析した。ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）遺伝子を発現する対照およびＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０細胞に対して、Ｈ－２Ｋ^ｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体に対する蛍光標識抗体を使用して、フローサイトメトリー分析を行った。結果は、対照Ｂ１６－Ｆ１０－ＯＶＡ細胞と比較した場合、ＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞の表面では、Ｈ－２Ｋ^ｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ染色が有意に増強されたことを明確に示している（図１０Ａおよび図１１Ａ）。結果は、ＰＣＳＫ９がペプチド抗原のＭＨＣ Ｉ提示の能力に強い影響を与えることを示している。

【0130】

インビボで増殖したＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の表面上のＨ－２Ｋ^ｂレベルに対するＰＣＳＫ９ノックアウトの効果を検討した。ｔｄＴｏｍａｔｏ形質導入ベクター対照およびＰＣＳＫ９欠乏Ｂ１６Ｆ１０細胞から増殖した腫瘍を脱凝集し、Ｈ－２Ｋ^ｂ表面発現についてフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞上のＭＨＣ－Ｉ発現が、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍では、対照Ｂ１６Ｆ１０腫瘍と比較してインビボで有意に増加したことを示している（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。同様に、ＰＣＳＫ９欠乏はまた、ＩＦＮγにより処理した４Ｔ１細胞では、インビトロでＭＨＣ－Ｉ（Ｈ－２Ｋ^ｄ）の有意な増加を引き起こした（図１０Ｄおよび図１１Ａ）。それと一致して、ＰＣＳＫ９の遺伝的枯渇（図１１Ｂ）は、ヒトトリプルネガティブ乳癌株ＭＤＡ－ＭＢ２３１（図１０Ｅ）のＨＬＡ－２レベルの有意な増加を引き起こした。他方では、外因性ＰＣＳＫ９タンパク質とＰＣＳＫ９欠乏ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞とのインキュベーションは、表面ＨＬＡ－Ａ２レベルの有意な減少を引き起こした（図１０Ｆ）。したがって、この結果は、ＰＣＳＫ９欠乏腫瘍細胞に対して増強されたＣＴＬ活性という発見に対する妥当な説明を提供する結果である、ＰＣＳＫ９がヒトおよびマウスの両腫瘍細胞で細胞表面ＭＣＨ‐Ｉ発現を負に調節することを示唆している。

【0131】

公的なドメインデータベース（ＧＥＮＴ）の調査から、いくつかのヒトの癌の種類（外陰、膵臓、食道、結腸および乳房）では、一致する正常組織よりも癌組織ではＰＣＳＫ９発現が高いことが示された（図１１Ｃ）。さらに、ヒト皮膚癌では、比較的高いＰＣＳＫ９発現が、患者の予後の悪化と相関していた（図１１Ｄ）。このデータは、ＰＣＳＫ９がヒト癌患者の治療転帰を決定する上で重要な役割を果たしていることを示している。

【0132】

ここで図１２および図１３を参照すると、免疫チェックポイント療法に関するＭＨＣ－Ｉ発現レベルの重要性を検討した。Ｈ２－Ｋ１はＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞内で過剰発現しており、その腫瘍形成能と抗ＰＤ１療法に対する応答とを検討した。結果は、Ｈ２－Ｋ１発現が腫瘍増殖を有意に減弱する可能性があることを示した。さらに、Ｈ２－Ｋ１発現は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の抗ＰＤ１療法の効果を有意に増強する可能性がある（図１２）。腫瘍免疫療法に果たすＭＨＣ－Ｉの重要な役割を確立した後、ＰＣＳＫ９阻害の抗腫瘍効果を媒介するのにＭＨＣ－Ｉが機能的に必要であるかどうかを検討した。Ｈ２－Ｋ１ ＫＯまたはＨ２－Ｋ１／ＰＣＳＫ９ダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｂ１６Ｆ１０を作製し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に、腫瘍を形成するそれらの能力を評価した。結果は、Ｈ２－Ｋ１欠乏が、対照と比較した場合に腫瘍増殖速度の有意な増加を引き起こしたことを示した。さらに、Ｈ２－Ｋ１欠乏は、ＰＣＳＫ９ノックアウト腫瘍に観察された腫瘍増殖遅延をほぼ完全に無効にした（図１３）。したがって、結果から、腫瘍増殖の調節におけるＰＣＳＫ９の必須の下流因子としてＨ２－Ｋ１が確立された。

【0133】

ここで図１４を参照すると、ＰＣＳＫ９が細胞表面ＰＣＳＫ９発現を制御する機構を検討した。以前に、コレステロールレベルがＭＨＣ－Ｉ再循環に影響を与え得ることが報告されていたため、ＰＣＳＫ９が、ＰＣＳＫ９の確立された下流標的でもある主要なコレステロール調節因子であるＬＤＬＲを介して間接的にＭＨＣ－Ｉを調節する可能性を仮定した。ＬＤＬＲレベルがＰＣＳＫ９の下流のＭＨＣ－Ｉレベルを調節する可能性があるかどうかを決定するために、ＬＤＬＲノックアウトまたはＬＤＬＲ／ＰＣＳＫ９ダブルノックアウトを有するＢ１６Ｆ１０細胞を作製した。続いて、２つの細胞株から得られた腫瘍形成率を比較したところ、データは、ＬＤＬＲノックアウトが、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内のＰＣＳＫ９欠乏によって引き起こされる増殖抑制を減少させなかったことを示した。次いで、フローサイトメトリーを使用して、インビボでの腫瘍細胞のＭＨＣ－Ｉレベルを決定した。データは、Ｂ１６Ｆ１０のＬＤＬＲノックアウトが、インビボでＢ１６Ｆ１０細胞表面上のＭＨＣ－Ｉ発現に有意な影響を及ぼさなかったことを示した。さらに、ＬＤＬＲノックアウトは、ＭＨＣ－Ｉ表面発現のＰＣＳＫ９欠乏誘発性アップレギュレーションを減少させなかった。次いで、ＭＨＣ ＩＩおよびＰＤ－Ｌ１の腫瘍細胞表面発現レベルを検討することによって、ＰＣＳＫ９阻害のＭＨＣ－Ｉブースト効果がＭＨＣ－Ｉに限定されるかどうかを決定した。データは、ＰＣＳＫ９の状態がＭＨＣ－ＩＩ発現に影響を与えず、ＰＤ－Ｌ１表面発現の低下に非常に小さい（が有意な）影響を及ぼしたに過ぎなかったことを示した。ＰＣＳＫ９の効果を無効にするＨ２－Ｋ１ノックアウトを示す以前のデータと組み合わせて、この発見は、ＭＨＣ－Ｉが腫瘍増殖の調節におけるＰＣＳＫ９の主要な下流標的であることを裏付ける。

【0134】

ＰＣＳＫ９阻害を介したＭＨＣ－Ｉ細胞表面発現のアップレギュレーションの分子機構を検討した。ＬＤＬ－Ｒタンパク質の分解のために物理的相互作用とリソソームへのエンドサイトーシスとを介してＬＤＬ‐Ｒタンパク質をダウンレギュレートするＰＣＳＫ９の既知の能力のため、ＰＣＳＫ９がＭＨＣ‐Ｉと直接結合し得るかどうかを検討した。結果は、抗ＰＣＳＫ９免疫沈降物中のＨ２－Ｋ^ｄの存在によって証明されるように、共発現したＰＣＳＫ９およびＨ２－Ｋ^ｄがＢ１６Ｆ１０細胞内で複合体を形成し得ることを示している（図１０Ｇ）。２つのタンパク質の関係をさらに検討するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対してＨ－２Ｋ^ｄとＰＣＳＫ９との免疫蛍光共染色を行った。ＰＣＳＫ９共発現の非存在下では、多くのＨ２－Ｋ^ｄタンパク質がリソソームの外側に位置することが見出された（図１０Ｈ）。ただし、ＰＣＳＫ９共発現の存在下では、Ｈ２－Ｋ^ｄとＰＣＳＫ９とは高度に共局在する（図１０Ｈ）。さらに重要なことに、リソソームへのタンパク質の広範囲な共局在化が認められた（図１０Ｈ）。したがって、結果は、ＰＣＳＫ９が、ＬＤＬ－Ｒのその負の調節と同様にＭＨＣ－Ｉ表面レベルをダウンレギュレートすることを示唆している。

【0135】

ここで図１５を参照すると、ヒト肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、ブドウ膜黒色腫（ＵＶＭ）、ヒト膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）および卵巣癌（ＯＶ）を含む９つのＴＣＧＡヒト癌患者コホートを対象としたＰＣＳＫ９関連生存率分析を行った。結果は、マウスのＭＨＣ－Ｉ表面発現を抑制するＰＣＳＫ９の能力の発見と一致して、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現が高い患者では、ＰＣＳＫ９発現が低い患者よりも生存率が低いことを示した。

【0136】

ここで図１６を参照すると、ＰＣＳＫ９の存在下で、ＭＨＣ－Ｉはリソソーム内に輸送され、分解される（左パネル）。ＰＣＳＫ９の非存在下では、抗体を介した中和、または遺伝子欠失のために、表面上のＭＨＣ－Ｉレベルは高いままであるため、Ｔ細胞に、腫瘍特異的消化性抗原を比較的効率的に提示することができる（右パネル）。

【0137】

本明細書中の「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書中の様々な箇所での「一実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではなく、他の実施形態を相互に排除する別個のまたは代替の実施形態を指すわけでもない。さらに、いくつかの実施形態によって示され得、他の実施形態によって示され得ない様々な特徴が説明される。同様に、いくつかの実施形態の要件であり得るが、他の実施形態の要件ではあり得ない様々な要件が説明される。

【0138】

文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、説明および特許請求の範囲全体を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「含むが、これに限定されない」という意味で解釈されるべきである。本明細書で使用される用語「接続された」、「結合された」またはそれらの任意の変形例は、２つ以上の要素間の直接または間接の任意の接続または結合を意味し、該要素間の接続の結合は、物理的、論理的またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、単語「本明細書では（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上（ａｂｏｖｅ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」および類似の意味の単語は、本出願において使用される場合、本出願の任意の特定の部分ではなく、本出願全体を指すものとする。文脈が許せば、単数または複数を使用する上記「発明を実施するための形態」中の単語は、それぞれ複数または単数を含んでいてもよい。２つ以上の項目の列挙に関連して、単語「または」は、単語の以下の解釈をいずれも包含する：列挙内の項目のいずれか、列挙内の項目のすべて、および列挙内の項目の任意の組合せ。

【0139】

本明細書で提供される本開示の教示は、必ずしも上記のシステムではなく、他のシステムに適用することができる。上記の様々な実施形態の要素および行為を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。

【0140】

上記「発明を実施するための形態」に照らして、これらおよび他の変更を本開示に加えることができる。上記の説明は、本開示の特定の実施形態を説明し、企図される最良の形態について説明しているが、上記が文章でどれほど詳細に表れていても、該教示は多くの方法により実施することができる。システムの詳細は、本明細書に開示された主題に依然として包含されているが、その実装の詳細においてかなり異なる場合がある。上記のように、本開示の所定の特徴または態様を説明する際に使用される特定の用語は、その用語に関連する、本開示の任意の所定の特性、特徴または態様に限定されるように本明細書において再定義されていることを意味すると解釈されるべきではない。概して、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、上記「発明を実施するための形態」セクションがそのような用語を明示的に定義しない限り、本明細書中に開示された特定の実施形態に本開示を限定するものと解釈されるべきではない。したがって、本開示の実際の範囲は、開示された実施形態だけでなく、特許請求の範囲の下で本開示を実施または実装するあらゆる同等の方法も包含する。

【0141】

本明細書中で使用される用語は、概して、本開示の文脈内で、および各用語が使用される特定の文脈において、技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本開示を説明するために使用される特定の用語は、本開示の説明に関して実施者に追加の指針を提供するために、上記、または本明細書中の他の箇所で説明されている。便宜上、大文字、斜体字および／または引用符などを使用して、特定の用語が強調表示され得る。強調表示を使用しても、用語の範囲および意味に影響を及ぼさない。強調表示されているかどうかにかかわらず、同じ文脈では、用語の範囲および意味は同じである。同じ要素が複数の方法で記述され得ることが理解されよう。

【0142】

したがって、本明細書中で説明されている用語のうちの任意の１つ以上について、代替の言語および同義語が使用され得、用語が本明細書中で詳述されているか説明されているかどうかに特別な意義はない。特定の用語の同義語が提供されている。１つ以上の同義語の詳説は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書中で説明される任意の用語の例を含む、本明細書中の任意の箇所での例の使用は、例示に過ぎず、本開示、または任意の例示された用語の範囲および意味をさらに限定することを意図するものではない。同様に、本開示は、本明細書中で与えられる様々な実施形態に限定されない。

【0143】

本開示の範囲をさらに限定することを意図することなく、本開示の実施形態による機器、装置、方法およびそれらに関連する結果の例を以下に示す。読者の便宜のために、例においてタイトルまたはサブタイトルが使用され得るが、それは決して本開示の範囲を限定するものではないことに留意されたい。他に定義されない限り、本明細書中で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本文書を優先するものとする。

【0144】

この説明のいくつかの部分は、情報に対する操作のアルゴリズムおよび記号表現の観点から本発明の実施形態を説明している。これらのアルゴリズムの説明および表現は、それらの作用の中身を他の当業者に効果的に伝えるためにデータ処理分野の当業者によって一般的に使用される。これらの操作は、機能的、計算的または論理的に説明されているが、コンピュータプログラムまたは同等の電気回路、マイクロコードなどによって実装されると理解される。さらに、操作のこれらの配置をモジュールと呼ぶことは、一般性を失うことなく、時として便利であることも証明されている。説明された操作およびそれらに関連するモジュールは、ソフトウェア、ファームウェア、ハードウェアまたはそれらの任意の組合せで具体化され得る。

【0145】

最後に、本明細書中で使用される言語は、読みやすさおよび教授目的のために主に選択されており、本発明の主題を描写または制限するために選択されていない場合がある。したがって、本発明の範囲は、この詳細な説明によってではなく、本明細書に基づく出願に関して発行される任意の請求項によって限定されることが意図されている。したがって、本発明の実施形態の開示は、以下の特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を例示することを意図しているが、限定することを意図していない。

【0146】

他に定義されない限り、本明細書中で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本開示の主題が関連する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法、装置および材料を、本開示の主題の実施または試験に使用することができ、代表的な方法、装置および材料がここで説明される。

【0147】

長年の特許法条約に従い、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含め、主題明細書で使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「添加剤」への言及は、複数のそのような添加剤などを含むことができる。

【0148】

特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される構成要素、条件などの量を表すすべての数字は、すべての場合に用語「約」によって修飾されるものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本開示の主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。

【0149】

本明細書で使用される用語「約」は、質量、重量、時間、体積、濃度および／またはパーセンテージの値または量を指す場合、そのような変動が、開示された製品および方法において適切であるように、特定の量から、いくつかの実施形態では＋／－２０％、いくつかの実施形態では＋／－１０％、いくつかの実施形態では＋／－５％、いくつかの実施形態では＋／－１％、いくつかの実施形態では＋／－０．５％、およびいくつかの実施形態では＋／－０．１％の変動を包含することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0150】

配列表１～１２ ＜２２３＞合成

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図8J】

【図8K】

【図8L】

【図8M】

【図8N】

【図8O】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図14G】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図16】

【配列表】

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