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特許7217921造血幹細胞を維持培養するための培地、及びそれを用いた培養方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-27
(45)【発行日】2023-02-06
(54)【発明の名称】造血幹細胞を維持培養するための培地、及びそれを用いた培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0789 20100101AFI20230130BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20230130BHJP
C07K 14/76 20060101ALN20230130BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0789
C07K14/52
C07K14/76
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2018100036
(22)【出願日】2018-05-24
(65)【公開番号】P2019201599
(43)【公開日】2019-11-28
【審査請求日】2021-05-07
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構「再生医療実現拠点ネットワークプログラム」「造血幹細胞の代謝制御メカニズム解明と機能増強法の探索」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】510192802
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立国際医療研究センター
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】田久保 圭誉
(72)【発明者】
【氏名】小林 央
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－０２４０８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２５８３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－２８８４０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－０２９００９（ＪＰ，Ａ）
【文献】EX-CYTE Growth Enhancement Media Supplement Data Sheet, [online], uploaded 2016, MERCK, retrieved on 16 FEB 2022，<URL: https://www.merckmillipore.com/Web-JP-Site/ja_JP/-/JPY/ShowDocument-File?ProductSKU=MM_NF-C100843&DocumentId=/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/223/980/ds1009en-mk.pdf&DocumentUID=357951086&DocumentType=DS&Language=EN&Country=NF&Origin=PDP >
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
幹細胞因子（ＳＣＦ）の濃度が１～１０ｎｇ／ｍＬであり、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の濃度が０．０２～６ｎｇ／ｍＬであり、かつ脂肪酸担持アルブミンの濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬである、造血幹細胞を静止期にて維持したまま培養するための培地。
【請求項2】
インスリン及びコレステロールからなる群から選択される少なくとも１の物質を、更に含有する、請求項１に記載の培地。
【請求項3】
前記脂肪酸担持アルブミンが、少なくとも飽和脂肪酸を担持するアルブミンである、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項4】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の培地中で、造血幹細胞を培養する工程を含む、造血幹細胞を静止期にて維持したまま培養するための方法。
【請求項5】
５体積％以下の酸素濃度下で造血幹細胞を培養する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
請求項４又は５に記載の方法にて、造血幹細胞を静止期にて維持したまま培養するためのキットであって、ＳＣＦと、ＴＰＯと、前記脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを含む、キット（但し、ストローマ細胞は含まない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、造血幹細胞を維持培養するための培地、該培地を用いた培養方法、並びに該培地を用いた培養にて得られる細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
造血幹細胞は、哺乳動物では骨髄中に存在し、生涯に渡って血球産生を維持する細胞である。生体内では、細胞周期が静止期の状態であり、未分化性（自己複製能及び分化した細胞を生み出す能力（多分化能）を併せ持った状態）を維持していることも知られている。また、造血幹細胞の移植は、造血器悪性腫瘍をはじめとする疾患の根治療法となっており、臨床応用が確立した細胞である。
【0003】
しかしながら、造血幹細胞を提供するドナーの数は限られている。また臍帯血から造血幹細胞を得ることはできるが、細胞数は少なく、生着不全を一定の割合で起こす。そのため、かかる問題を解決すべく、体外で造血幹細胞を増幅する試みがなされている。その結果、表面マーカー（造血幹細胞特異的マーカー）の発現上では、造血幹細胞の増幅が認められ、その点ではある程度の成功を収めている（非特許文献１～３）。しかし、増幅された細胞は、生着性や造血能といった機能においては劣っており、これらの細胞を用いることによって、臨床経過を改善するには至っていない。
【0004】
それは、かかる方法では、機能的な造血幹細胞を増幅することはできていないためであり、また培養系において未分化性を維持する方法が十分明らかになっていないためだと考えられる。事実、生体内と同じように静止期性（細胞周期を静止期に留める性質）及び未分化性を保ったまま造血幹細胞を維持する条件というのは、これまで殆ど検討されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０年９月１０日；３２９（５９９７）：１３４５－８ページ
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４年９月１９日；３４５（６２０３）：１５０９－１２ページ
【文献】Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１６年１月７日；１８（１）：１４４－５５ページ
【文献】Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３年１月３日；１２（１）：４９－６１ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、培養することを可能とする条件を見出し、その条件を反映した、造血幹細胞を維持培養するための培地、及びそれを用いた培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは従前、低酸素環境下での解糖系の活性化が、体内（骨髄内）における造血幹細胞の静止期性及び未分化性の維持に関与していることを見出している（非特許文献４）。そこで、この低酸素環境、並びに造血幹細胞の維持の必須因子とされている２つのサイトカイン（幹細胞因子（ＳＣＦ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ））に着目し、鋭意研究を更に重ねた。
【0008】
その結果、マウス由来の造血幹細胞の培養において、酸素の濃度を大気中の濃度よりも低濃度とし、また培地中のＳＣＦの濃度を１～１０ｎｇ／ｍＬとし、さらにＴＰＯの濃度を０．０２～６ｎｇ／ｍＬとした場合に、当該細胞の静止期性及び未分化性は維持され易いことが明らかになった。
【0009】
また、造血幹細胞のこれら性質の維持においては、脂肪酸を担持させたアルブミンも必須であることも見出し、更には、インスリン及び／又はコレステロールの存在下では、これらの性質はより維持され易いことが明らかになった。
【0010】
さらに、かかる条件にて長期間（約１ヶ月ほど）培養した造血幹細胞を移植しても、当該細胞はレシピエントマウス内にて、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）やミエロイドに分化しており、培養後に得られる造血幹細胞は、機能的にも維持されていることも明らかになった。
【0011】
また、上記マウスにて見出された条件は、ヒト由来の造血幹細胞の静止期性及び未分化性の維持においても適用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
したがって、本発明は、造血幹細胞を維持培養するための培地、該培地を用いた培養方法、並びに該培地を用いた培養にて得られる細胞に関し、より詳しくは以下のものを提供する。
＜１＞ 幹細胞因子（ＳＣＦ）の濃度が１～１０ｎｇ／ｍＬであり、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の濃度が０．０２～６ｎｇ／ｍＬであり、かつ脂肪酸担持アルブミンの濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬである、造血幹細胞を維持培養するための培地。
＜２＞ インスリン及びコレステロールからなる群から選択される少なくとも１の物質を、更に含有する、＜１＞に記載の培地。
＜３＞ 前記脂肪酸担持アルブミンが、少なくとも飽和脂肪酸を担持するアルブミンである、＜１＞又は＜２＞に記載の培地。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地中で、造血幹細胞を培養する工程を含む、造血幹細胞を維持するための培養方法。
＜５＞ ５体積％以下の酸素濃度下で造血幹細胞を培養する、＜４＞に記載の培養方法。
＜６＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地中で、造血幹細胞を培養して得られる細胞。
＜７＞ 前記培養が５体積％以下の酸素濃度下で行なわれる、＜６＞に記載の細胞。
＜８＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地を作製するためのキットであって、ＳＣＦと、ＴＰＯと、前記脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを少なくとも含む、キット。
＜１＞ 幹細胞因子（ＳＣＦ）の濃度が１～１０ｎｇ／ｍＬであり、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の濃度が０．０２～６ｎｇ／ｍＬであり、かつ脂肪酸担持アルブミンの濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬである、造血幹細胞を維持培養するための培地。
＜２＞ インスリン及びコレステロールからなる群から選択される少なくとも１の物質を、更に含有する、＜１＞に記載の培地。
＜３＞ 前記脂肪酸担持アルブミンが、少なくとも飽和脂肪酸を担持するアルブミンである、＜１＞又は＜２＞に記載の培地。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地中で、造血幹細胞を培養する工程を含む、造血幹細胞を維持するための培養方法。
＜５＞ ５体積％以下の酸素濃度下で造血幹細胞を培養する、＜４＞に記載の培養方法。
＜６＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地中で、造血幹細胞を培養して得られる細胞。
＜７＞ 前記培養が５体積％以下の酸素濃度下で行なわれる、＜６＞に記載の細胞。
＜８＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の培地を作製するためのキットであって、ＳＣＦと、ＴＰＯと、前記脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを少なくとも含む、キット。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、長期間（例えば、１ヶ月間）培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】サイトカイン（幹細胞因子（ＳＣＦ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ））の各濃度条件下で、マウス造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－Ｌｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃＫｉｔ＋細胞（ＬＳＫ））３００個を７日間培養して生じた総細胞数（ｌｏｇ１０）を示す、プロット図である。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、各濃度にて添加したＳＣＦ及びＴＰＯの他、４重量体積％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）を添加した培地を用いた。図中、左側は１体積％Ｏ２環境下で、右側は２０体積％Ｏ２環境下で培養した結果を示す。図中の破線は、細胞数が約３００個になる条件を示す（ｎ＝３、３つの独立した実験による）。
【図2】図１と同様の培養条件で生じた巨核球の細胞数（ｌｏｇ１０）を示す、プロット図である。図中、左側は１体積％Ｏ２環境下で、右側は２０体積％Ｏ２環境下で培養した結果を示す。図中の破線は、巨核球数約１０個になる条件を示す。
【図3】図１と同様の条件にて培養した後の、総細胞数に対する造血幹細胞分画（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）の細胞数の割合（％）を示す、プロット図である。図中、左側は１体積％Ｏ２環境下で、右側は２０体積％Ｏ２環境下で培養した結果を示す。
【図4】図１と同様の条件にて培養した後の、造血幹・前駆細胞分画の細胞数を示す、プロット図である。図中、上段は１体積％Ｏ２環境下で、下段は２０体積％Ｏ２環境下で培養した結果を示す。図中の破線は、造血幹細胞数が約１００個となる条件を示す。「ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫ」は造血幹細胞を示し、「ＣＤ１５０－ＣＤ４８－ＬＳＫ」、「ＣＤ１５０＋ＣＤ４８＋ＬＳＫ」及び「ＣＤ１５０－ＣＤ４８＋ＬＳＫ」は、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）を示す。
【図5】総細胞数及び巨核球数が増えず、造血幹細胞数が維持される条件を示すために、図１、図２及び図４の「ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫ」を重ね合わせたプロット図である。図中の各破線は、図１、２及び４におけるそれらを示す。また、それらの交点をｘ字で示す。
【図6】造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）３００個を、図中に示した各条件で７日間培養した結果を示す、顕微鏡写真（倍率ｘ４）である。スケールバーは２００μｍを示す。なお、図に示したＳＣＦ及びＴＰＯの他、４重量体積％ＢＳＡ及び２－ＭＥをＳＦ－Ｏ３培地に添加し、当該培養に供した。
【図7】造血幹細胞分画（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）３００個を、１体積％Ｏ２環境下で７日間培養した後、フローサイトメトリーに解析した結果を示す図である。培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、４重量体積％ＢＳＡ及び２－ＭＥを添加した培地を用いた。
【図8】造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）３００個を、図中に示した各条件で１６時間培養し、それらの細胞周期について、ＥｄＵ取り込みアッセイにより解析した結果を示す、図である（平均±標準偏差、ｎ＝４）。図中、左側が、各条件下で１６時間培養した細胞をフローサイトメトリーにて解析した結果を示すヒストグラムであり、右側はそれらの結果をまとめたグラフである。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、各濃度にて添加したＳＣＦ及びＴＰＯの他、４重量体積％ＢＳＡ及び２－ＭＥを添加した培地を用いた。
【図9】造血幹細胞移植実験の概要を示す、スキーム図である。
【図10】造血幹細胞移植してから４ヶ月間のレシピエントマウスにおける、ドナー細胞由来末梢血キメリズムを示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝６）。なお、移植には、各サイトカイン濃度条件下で１４日培養した造血幹細胞を用いた。また、対照として、新鮮な造血幹細胞も移植した。
【図11】造血幹細胞移植してから４ヶ月間のレシピエントマウスにおける、ドナー細胞由来末梢血キメリズムを示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝６）。なお、移植には、各サイトカイン濃度条件下で２７日培養した造血幹細胞を用いた。また、対照として、新鮮な造血幹細胞も移植した。
【図12】造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫ）３００個を、ＢＳＡ、並びに水溶化脂肪酸及びコレステロールからなる製剤を添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間培養した後の細胞数を示すグラフである（ｎ＝３）。図中、各グラフ右側の数値（×０～×１／１２５）は、前記製剤の各培地における希釈倍率を示す。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、各濃度にて添加したＢＳＡ及び前記各製剤の他、ＳＣＦ ３ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ ０．１ｎｇ／ｍＬ及び２－ＭＥを添加した培地を用いた。
【図13】ｃＤＮＡマイクロアレイ実験の概要を示す、スキーム図である。
【図14】新鮮な造血幹細胞及び培養後の造血幹細胞における遺伝子発現を、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し比較した結果を示す、ドット図である。図中、新鮮な造血幹細胞の遺伝子発現データをｘ軸に示し、培養後の造血幹細胞の遺伝子発現データをｙ軸に示す。また、脂肪酸生合成関連遺伝子を赤で図示した。なお、培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％ＢＳＡ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間行なった。
【図15】新鮮な造血幹細胞及び培養後の造血幹細胞における遺伝子発現を、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し比較した結果を示す、ドット図である。図中、新鮮な造血幹細胞の遺伝子発現データをｘ軸に示し、培養後の造血幹細胞の遺伝子発現データをｙ軸に示す。また、脂肪酸生合成関連遺伝子を赤の点で示した。なお、培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ、パルミチン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、オレイン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間行なった。
【図16】培養後の造血幹細胞における遺伝子発現を、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し比較した結果を示す、ドット図である。図中、ＢＳＡ存在下で培養した後の造血幹細胞の遺伝子発現データをｘ軸に示し、脂肪酸フリーＢＳＡ及び脂肪酸存在下で培養した後の造血幹細胞の遺伝子発現データをｙ軸に示す。また、脂肪酸生合成関連遺伝子を赤の点で示した。なお、ＢＳＡ存在下での培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％ＢＳＡ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間行なった。また、脂肪酸フリーＢＳＡ及び脂肪酸存在下での培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ、パルミチン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、オレイン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間行なった。
【図17】同条件にて独立して２回培養（♯１、♯２）し、それら培養後の造血幹細胞における遺伝子発現を、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し比較した結果を示す、ドット図である。図中、脂肪酸生合成関連遺伝子を赤の点で示す。なお、培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ、パルミチン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、オレイン酸ナトリウム２００μｇ／ｍＬ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加した培地にて、１体積％Ｏ２環境下で７日間行なった。
【図18】新鮮造血幹細胞と培養７日目の造血幹細胞とについて、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）法により解析した結果を示す、プロット図である。図中、左側に、造血幹細胞関連遺伝子セットのＧＳＥＡプロットを示し、右側に、細胞増殖にともなって発現の下がる遺伝子セットのＧＳＥＡプロットを示す。なお、培養７日目の造血幹細胞に関しては、図１６及び１７に示した、ＢＳＡ存在下で培養した造血幹細胞と、脂肪酸フリーＢＳＡ及び脂肪酸存在下♯１で培養した造血幹細胞と、脂肪酸フリーＢＳＡ及び脂肪酸存在下♯２で培養した造血幹細胞とを併せて解析した結果を示す。
【図19】脂肪酸フリーＢＳＡに、各混合比で脂肪酸（パルミチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、リノール酸ナトリウム）を担持（再構成）させたものの存在下、７日間、１体積％Ｏ２環境下、造血幹細胞分画を培養した後の総細胞数及び造血幹細胞数を示す、グラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。なお、図中、左側には、脂肪酸ナトリウム塩の混合比率を示す表を併せて示す。培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加し、前記表に記載の比率にて脂肪酸塩を合計４００μｇ／ｍＬになるよう更に加えた培地にて行なった。また、対照として、脂肪酸を添加せずに培養した結果を、図中の「ＦＡ－ｆｒｅｅ」として示す。さらに、脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡの代わりに、４重量体積％ＢＳＡを添加して培養した結果を、図中の「ＦＡ＋」として示す。
【図20】脂肪酸フリーＢＳＡに各濃度で脂肪酸（パルミチン酸ナトリウムとオレイン酸ナトリウムとを等質量にて混合した物）を担持させたものの存在下、７日間、１体積％Ｏ２環境下、造血幹細胞分画を培養した後の総細胞数及び造血幹細胞数を示す、グラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。Ｐ値はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによる。培養は、ＳＦ－Ｏ３培地に、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ、２－ＭＥ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加し、図中に記載の濃度にて脂肪酸を更に加えた培地にて行なった。また、対照として、脂肪酸を添加せずに培養した結果を、図中の「４％ ＦＡ－フリーＢＳＡ」として示す。さらに、脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡの代わりに、４重量体積％ＢＳＡを添加して培養した結果を、図中の「４％ＢＳＡ」として示す。
【図21】インスリン存在下又は非存在下にて、１体積％Ｏ２環境下、造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）３００個を７日間培養した後の細胞数（総細胞数及び造血幹細胞数）を示す、グラフである（ｎ＝４）。培養は、αＭＥＭに、４重量体積％ＢＳＡ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを添加し、更に４０００ｎｇ／ｍＬ インスリンを添加した又は添加しない培地にて行なった。
【図22】造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）３００個を１体積％Ｏ２環境下で７日間培養した後の細胞数（総細胞数及び造血幹細胞数）を示す、グラフである（ｎ＝４）。Ｐ値は、ｎＢＳＡ群を除いてｉｎｓｕｌｉｎ濃度とコレステロールの有無の２要素によって分けた２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによる。図中の「ｎＢＳＡ」に関し、培養は、αＭＥＭに、４重量体積％ＢＳＡ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、４０００ｎｇ／ｍＬ及びインスリンを添加した培地にて行なった。「ｎＢＳＡ＋ＦＡ」に関し、培養は、αＭＥＭに、４重量体積％ＢＳＡ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、０．１ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ及び脂肪酸に加え、更にインスリンを図中の指示濃度にて添加し、また２０μｇ／ｍＬのコレステロールを添加し、又は添加しない培地にて、行なった。なお、「ｎＢＳＡ＋ＦＡ」の培養に用いた脂肪酸は、パルミチン酸ナトリウム ３２０μｇ／ｍＬ、オレイン酸ナトリウム ２４０μｇ／ｍＬ、リノール酸ナトリウム １６０μｇ／ｍＬ及びステアリン酸ナトリウム ８０μｇ／ｍＬである。
【図23】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）６００個を、ＳＣＦ及びＴＰＯの各濃度条件下、１体積％Ｏ２環境下で、７日間培養した後の、総細胞数及び造血幹細胞数を示す、プロット図である（ｎ＝３）。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、各濃度にて添加したＳＣＦ及びＴＰＯの他、４重量体積％ＢＳＡ及び２－ＭＥを添加した培地を用いた。
【図24】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）６００個をＳＣＦ及びＴＰＯの各濃度条件下、１体積％Ｏ２環境下で、４週間培養し、一週間ごとの総細胞数及び造血未分化細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞）数を示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。図中、「Ｓ３Ｔ３」、「Ｓ１０Ｔ１０」及び「Ｓ１００Ｔ１００」は、各培養におけるＳＣＦ及びＴＰＯの培地への添加濃度が、３ｎｇ／ｍＬ及び３ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ、並びに、１００ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬであることを示す。
【図25】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）６００個を、ＢＳＡ存在下又は非存在下、１体積％Ｏ２環境下で、７日間培養した後の、総細胞、造血未分化細胞分画（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）及び造血幹細胞分画の細胞数を示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、図中にて示した濃度にて添加したＳＣＦ及びＴＰＯの他、２－ＭＥを添加し、さらに４重量体積％ＢＳＡを添加し（図中「＋ＢＳＡ」で示す）、または添加していない（図中「－ＢＳＡ」で示す）培地を用いた。また、図中、「Ｓ３Ｔ３」及び「Ｓ１０Ｔ１０」は、各培養におけるＳＣＦ及びＴＰＯの培地への添加濃度が、３ｎｇ／ｍＬ及び３ｎｇ／ｍＬ、並びに、１０ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬであることを示す。
【図26】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）６００個を、コレステロール存在下又は非存在下、１体積％Ｏ２環境下で、７日間培養した後の、総細胞、造血未分化細胞分画（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）及び造血幹細胞分画の細胞数を示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、図中にて示した濃度にて添加した脂肪酸（ＦＡ）の他、４重量体積％ＢＳＡ、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ及び２－ＭＥを添加し、さらにコレステロールを添加し、または添加していない培地を用いた。脂肪酸は、パルミチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、リノール酸ナトリウム及びステアリン酸ナトリウムを重量比４：３：２：１で混合したものを用いた。また、図中、「ＦＡ０」、「ＦＡ２５０」、「ＦＡ７５０」及び「ＦＡ１０００」は、脂肪酸の培地への添加濃度が、０、２５０．７５０及び１０００μｇ／ｍＬであることを示す。Ｐ値は、脂肪酸濃度とコレステロールの有無の２要素によって分けた２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによる。
【図27】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）６００個を、１体積％Ｏ２環境下で、７日間培養した後の、総細胞、造血未分化細胞分画（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）及び造血幹細胞分画の細胞数を示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。なお、培養には、ＳＦ－Ｏ３培地に、図中にて示した濃度にて添加した脂肪酸（ＦＡ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）の他、２－ＭＥと、３ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦと、３ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯと、４重量体積％ＢＳＡ又は４重量体積％ＦＡ－フリーＢＳＡとを添加した培地を用いた。脂肪酸は、パルミチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、リノール酸ナトリウム及びステアリン酸ナトリウムを重量比４：３：２：１で混合したものを用いた。また、図中、「ＦＡ０」、「ＦＡ１００」、「ＦＡ２００」、「ＦＡ３００」及び「ＦＡ４００」は、脂肪酸の培地への添加濃度が、０、１００．２００、３００及び４００μｇ／ｍＬであることを示す。「Ｃｈｏｌ０」、「Ｃｈｏｌ２０」及び「Ｃｈｏｌ４０」は、コレステロールの培地への添加濃度が、０、２０及び４０μｇ／ｍＬであることを示す。Ｐ値は脂肪酸濃度とコレステロールの有無の２要素によって分けた２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによる（平均±標準偏差、ｎ＝４）。
【図28】ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞）６００個を、１体積％Ｏ２環境下で、７日間培養した後の、総細胞、造血未分化細胞分画（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）及び造血幹細胞分画の細胞数を示すグラフである（平均±標準偏差、ｎ＝４）。なお、培養には、αＭＥＭ培地に、図中にて示した濃度にて添加したＳＣＦ、ＴＰＯ及びインスリンの他、２－ＭＥ、４重量体積％ＢＳＡ、脂肪酸、２０μｇ／ｍＬのコレステロールを添加した培地を用いた。脂肪酸は、パルミチン酸ナトリウム８０μｇ／ｍＬ、オレイン酸ナトリウム６０μｇ／ｍＬ、リノール酸ナトリウム４０μｇ／ｍＬ及びステアリン酸ナトリウム２０μｇ／ｍＬを混合したものを用いた。図中の「Ｓ３Ｔ３」、「Ｓ３Ｔ６」、「Ｓ６Ｔ３」及び「Ｓ６Ｔ６」は、各培養におけるＳＣＦ及びＴＰＯの培地への添加濃度が、３ｎｇ／ｍＬ及び３ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ及び６ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ及び３ｎｇ／ｍＬ、並びに、６ｎｇ／ｍＬ及び６ｎｇ／ｍＬであることを示す。また、インスリンの添加濃度は、０、０．４、４０又は４０００ｎｇ／ｍＬとした。Ｐ値はサイトカイン条件とインスリン濃度の２要素によって分けた２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによる。
【発明を実施するための形態】
【0015】
＜造血幹細胞の培地＞
本発明は、造血幹細胞を維持培養するための培地に関し、より詳しくは、１～１０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を含有し、０．０２～６ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチンを含有し、かつ１０～１００ｍｇ／ｍＬの脂肪酸担持アルブミンを含有することを特徴とする培地である。
本発明は、造血幹細胞を維持培養するための培地に関し、より詳しくは、１～１０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を含有し、０．０２～６ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチンを含有し、かつ１０～１００ｍｇ／ｍＬの脂肪酸担持アルブミンを含有することを特徴とする培地である。
【0016】
そして、かかる培地を用いることにより、長期間（例えば、１ヶ月間）であっても、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、培養することができる。
【0017】
本発明において「造血幹細胞」とは、血球の全ての血液細胞分化系列に分化し得る多分化能を有し、かつその多分化能を維持したまま自己複製することが可能な細胞である。
【0018】
造血幹細胞が由来とする動物種は特に制限されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。また、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目が挙げられるが、これらに限定されない。本発明にかかる造血幹細胞は、好ましくは、マウス等のげっ歯類、ヒト等の霊長類に由来する造血幹細胞であり、より好ましくは、ヒト由来の造血幹細胞である。
【0019】
また、造血幹細胞が由来とする組織としては、該細胞が存在する限り特に制限はないが、造血組織であることが好ましく、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、肝臓が挙げられる。
【0020】
造血幹細胞は、通常当該細胞に特異的な表面マーカー（造血幹細胞特異的マーカー）の発現を指標として、前記組織から単離される。かかるマーカーの発現に関し、ヒト由来の造血細胞は、通常、ＣＤ３４陽性（＋）ＣＤ３８陰性（－）ＣＤ９０陽性（＋）ＣＤ４５ＲＡ陰性（－）細胞であり、好ましくは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４９ｆ＋細胞である。また、マウス由来の造血細胞は、通常、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－Ｆｌｔ３－ＬＳＫであり、好ましくは、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ４１－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫである。なお、「ＬＳＫ」とは、Ｌｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃＫｉｔ＋細胞のことである。
【0021】
本発明において、造血幹細胞を維持するために培地に添加される「幹細胞因子（ＳＣＦ）」は、造血因子（サイトカイン）の一種であり、ＫＩＴ遺伝子座によってコードされるチロシンキナーゼ受容体のリガンドである。ＫＩＴリガンド又はＫＩＴＬＧとしても称され、典型的には、ヒト由来であれば、ＮＣＢＩレファレンス配列：ＮＰ＿０００８９０又はＮＰ＿００３９８５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、マウス由来であれば、ＮＣＢＩレファレンス配列：ＮＰ＿００１３３４０８５又はＮＰ＿０３８６２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【0022】
本発明の培地における、ＳＣＦの濃度は、１～１０ｎｇ／ｍＬであるが、造血幹細胞の静止期性及び未分化性をより維持し易いという観点から、その上限は、好ましくは７．５ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは３．５ｎｇ／ｍＬである。またＳＣＦ濃度の下限としては、同観点から、好ましくは１．５ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは２ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは２．５ｎｇ／ｍＬである。また、ＳＣＦ濃度は特に好ましくは約３ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは３ｎｇ／ｍＬである。
【0023】
なお、本発明において、「約」とは±１０％を許容する意味で用いる。また、本発明にかかる「濃度」は、特に断りがない限り、また後述の酸素及び二酸化炭素濃度を除き、本発明の培地における終濃度を意味する。
【0024】
本発明において、造血幹細胞を維持するために培地に添加される「トロンボポエチン（ＴＰＯ）」は、造血因子（サイトカイン）の一種であり、血小板前駆細胞（巨核球）の増殖及び分化に関与する糖タンパク質である。ＴＨＰＯ、血小板新生刺激因子（ＴＳＦ）、巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ－ＣＳＦ）、巨核球刺激因子又はメガカリオサイト（巨核球）増幅因子とも称され、典型的には、ヒト由来であれば、ＮＣＢＩレファレンス配列：ＮＰ＿０００４５１、ＮＰ＿００１１７１０６８、ＮＰ＿００１１７１０６９、ＮＰ＿００１２７６９２６又はＮＰ＿００１２７６９２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、マウス由来であれば、ＮＣＢＩレファレンス配列：ＮＰ＿００１１６６９７６、ＮＰ＿００１２７６８２３、ＮＰ＿００１２７６８２５又はＮＰ＿０３３４０５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【0025】
本発明の培地におけるＴＰＯの濃度は、０．０２～６ｎｇ／ｍＬであるが、造血幹細胞の静止期性及び未分化性をより維持し易いという観点から、その上限は、好ましくは５ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは４ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは３．５ｎｇ／ｍＬである。またＴＰＯ濃度の下限としては、同観点から、好ましくは０．０４ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０５ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．０６ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０８ｎｇ／ｍＬである。また、マウス由来の造血幹細胞を維持培養する場合、ＴＰＯの濃度は、好ましくは０．０８～０．１２ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬである。ヒト由来の造血幹細胞を維持培養する場合、ＴＰＯの濃度は、好ましくは２～４ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは約３ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは３ｎｇ／ｍＬである。
【0026】
本発明において、造血幹細胞を維持するために用いられる「アルブミン」は、種々の物質（脂肪酸、酵素、ホルモン、無機イオン）と結合する能力の高いタンパク質である。アルブミンとしては、脂肪酸と結合する能力を有するものであればよく、例えば、血清由来のアルブミン、卵白由来のアルブミン、乳由来のアルブミンが挙げられるが、血清由来のアルブミンが好ましい。なお、血清由来のアルブミンは、血清中に含まれる種々の物質と結合しており、脂肪酸の場合であれば、アルブミン１分子あたり通常脂肪酸２分子と結合する能力を有する。
【0027】
また、後述の実施例において示すとおり、造血幹細胞を維持するためには、アルブミンを介して脂肪酸を供給する必要がある。したがって、本発明の培地において、アルブミンは脂肪酸を担持している必要がある。アルブミンが担持する脂肪酸としては、特に制限はなく、飽和脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸等の炭素数８～２０からなる飽和脂肪酸）であってもよく、不飽和脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノール酸等の炭素数１６～２０からなる不飽和脂肪酸）であってもよい。造血幹細胞をより維持し易いという観点から、飽和脂肪酸が好ましく、炭素数１２～２０からなる飽和脂肪酸がより好ましく、炭素数１４～１８からなる飽和脂肪酸がより好ましく、パルミチン酸が特に好ましい。
【0028】
アルブミンに担持させる脂肪酸は、塩の形態（例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム等のアルカリ金属塩、脂肪酸マグネシウム、脂肪酸カルシウム、脂肪酸バリウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニア塩（脂肪酸アンモニウム））であってもよく、またエステルの形態であってもよい。
【0029】
また、アルブミンに担持させる脂肪酸は、単種（例えば、パルミチン酸のみ）であってもよく、また複数種（例えば、パルミチン酸及びオレイン酸の混合物）であってもよい。アルブミンに担持させる脂肪酸の好適な例として、少なくともパルミチン酸を含有する脂肪酸混合物、パルミチン酸とオレイン酸との混合物（重量比にて１：１）であること、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸及びステアリン酸の混合物（重量比にて４：３：２：１）等が挙げられる。なお、前者の比率は、本発明者らが測定した結果、ウシ血清アルブミンにおいて、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とが約１：１の比率にて担持されていたことに基づく。また、後者は、ヒトの骨髄における脂肪酸組成比に基づく（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１６年１０月；１１７（１０）：２３７０～２３７６ページ 参照）。
【0030】
また、脂肪酸担持アルブミンは、血清等の天然に由来するものであれば、通常脂肪酸がアルブミンに担持されているので、そのまま用いることができるが、前述のとおり、所定の脂肪酸を組み合わせて用いる場合には、アルブミン（脂肪酸不含（フリー）アルブミン等）に所望の脂肪酸を担持させることにより、調製することができる。かかる調製については特に制限はなく、当業者であれば、公知の手法を適宜選択して行なうことができる。例えば、後述の実施例において示すとおり、予め培養器において所望の脂肪酸を固相化しておき、該培養器にアルブミン（脂肪酸不含アルブミン等）を含む培地を添加し、超音波破砕等の処理により、前記脂肪酸を溶解させることで、前記アルブミンに前記脂肪酸を担持させることができる。
【0031】
本発明の培地における脂肪酸担持アルブミンの濃度は、１０～１００ｍｇ／ｍＬ（１～１０重量体積％）であるが、造血幹細胞をより維持し易いという観点から、その上限は、好ましくは８０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは７０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは６０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬである。またＴＰＯ濃度の下限としては、同観点から、好ましくは１５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは２５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは３０ｍｇ／ｍＬである。また、脂肪酸担持アルブミンの濃度は、特に好ましくは３５～４５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
【0032】
また、本発明の培地における脂肪酸の濃度は、造血幹細胞をより維持し易いという観点から、その上限は、好ましくは１ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５００μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは２００μｇ／ｍＬである。また脂肪酸濃度の下限としては、同観点から、好ましくは１０μｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは１００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは２５０μｇ／ｍＬである。
【0033】
なお、本発明の培地の必須成分となる、上述のＳＣＦ、ＴＰＯ及びアルブミンに関し、それらの動物種の由来について特に制限はなく、上記造血幹細胞の由来同様、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。また、本発明において得られた細胞を、後述のヒトにおける治療等に用いる場合には、拒絶反応を抑えるという観点から、ヒト由来であることが望ましい。また、これらタンパク質として、前記動物から単離された天然のものを用いてもよいが、遺伝子工学により調製した遺伝子組換え体（所謂、リコンビナントタンパク質）を用いてもよい。また、造血幹細胞の静止期性及び未分化性を維持し得る限りにおいて、これらタンパク質の全長を含む必要はなく、それらのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が欠失又は置換されている誘導体を含めることができる。
【0034】
上述のＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミンが添加される培地（所謂、基礎培地）としては、通常の細胞培養に用いられる培地や、造血細胞の培養のために調製された培地等、特に限定されずに利用することができる。例えば、通常の細胞培養に用いられる培地としては、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＩＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、ＥＭＥＭが挙げられる。造血細胞の培養に用いられる培地としては、Ｓ－Ｃｌｏｎｅ培地（例えば、ＳＦ－Ｏ３培地、エーディア社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（シグマアルドリッチ社製）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ロンザ社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ロンザ社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ ２０（ロンザ社製）、ＨＰＧＭ（ロンザ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）が挙げられる。また、本発明においては、これら培地を適宜混合して用いてよい。
【0035】
本発明に係る基礎培地としては、上記例に限定されるものではないが、造血幹細胞の培養において使用実績があるという観点から、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であり、より好ましくはＳＦ－Ｏ３培地である。また、ＳＦ－Ｏ３培地の代わりに、インスリン、亜セレン酸及びトランスフェリンを含有させたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；インスリン、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸銅、硫酸亜鉛、プトレスシン、リポ酸、アラニン、ピルビン酸、亜セレン酸及びトランスフェリンを含有させたＲＰＭＩ１６４０培地；インスリン及びヌクレオシドを含有させたαＭＥＭも、本発明に係る基礎培地として好適に用いられる。
【0036】
また、本発明の培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミン等の他、周知慣用の培地添加物を、更に含有するものであってもよい。かかる培地添加物としては、例えば、機能性タンパク質（インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン等）、脂肪酸以外の脂質（コレステロール等）、還元剤（２－メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ－アセチルシステイン等）、アミノ酸（アラニン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸等）、ペプチド（グルタチオン、還元型グルタチオン等）、ヌクレオチド等（ヌクレオシド、シチジン、アデノシン５’－一リン酸、ヒポキサンチン、チミジン等）、金属塩（硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸銅、硫酸亜鉛等）、無機塩類（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素等）、炭素源（グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等）、ビタミン、無機化合物（亜セレン酸）、有機化合物（パラアミノ安息香酸、エタノールアミン、コルチコステロン、プロゲステロン、リポ酸、プトレシン、ピルビン酸、乳酸、トリヨードチロニン等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）、緩衝化合物（ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム等）、ｐＨ指示薬（フェノールレッド等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0037】
また、これら培地添加物に関し、造血幹細胞がより維持し易くなるという観点から、インスリン及び／又はコレステロールを、本発明の培地は含有していることが望ましい。
【0038】
本発明の培地におけるインスリンの濃度は、前記観点から、４０～４０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２００～８００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、約４００ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。また、本発明の培地におけるコレステロールの濃度は、同観点から、１０～１００μｇ／ｍＬであることが好ましく、２０～４０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【0039】
また、本発明の培地には、２－メルカプトエタノールが含有していることが望ましく、かかる場合、培地における濃度は通常１０～１００μＭであり、好ましくは３０～８０μＭであり、より好ましくは５０～６０μＭ（例えば、５５μＭ）である。
【0040】
＜造血幹細胞の培養＞
後述の実施例において示すとおり、上述の培地を用いることによって、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、長期間培養することができる。したがって、本発明は、上述の培地中で、造血幹細胞を培養する工程を含む、造血幹細胞を維持するための培養方法を、提供する。
後述の実施例において示すとおり、上述の培地を用いることによって、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、長期間培養することができる。したがって、本発明は、上述の培地中で、造血幹細胞を培養する工程を含む、造血幹細胞を維持するための培養方法を、提供する。
【0041】
本発明の培養方法において、造血幹細胞をより維持し易いという観点から、通常の大気中の酸素濃度（２０体積％）よりも低い酸素濃度下（本明細書において、「低酸素条件下」とも称する）で培養することが好ましい。低酸素条件下としては、培養中の培地に接している気体中の酸素濃度が、好ましくは１～１５体積％であり、より好ましくは１～１０体積％であり、さらに好ましくは１～５体積％である。また、前記気体中の二酸化炭素の濃度は、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。かかる低酸素濃度下での培養は、例えば、市販の低酸素インキュベーター内で培養することによって、行うことができる。また、培養温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。
【0042】
造血幹細胞の培養に用いられる培養器には、造血細胞等を培養するために用いられる公知のものを適宜利用することができ、細胞非接着性の培養器であってもよく、細胞接着性の培養器（例えば、ＥＣＭ、マトリゲル、ゼラチン、コラーゲン等の細胞支持用基質にてコーティングされている培養器）であってもよい。また、造血幹細胞の培養は、非接着培養であってもよく、接着培養であってもよい。非接着培養としては、例えば、分散培養、凝集浮遊培養、担体上での浮遊培養が挙げられる。さらに、骨髄中の環境を再現し、造血幹細胞をより維持し易くするという観点から、骨髄ストローマ細胞との共培養であってもよい。
【0043】
また、本発明の培養に供する造血幹細胞としては、上述のとおりであり、哺乳動物の造血組織等から調製することができる。かかる調製において、前記造血組織等が細胞塊である場合には、先ず、プロテアーゼやコラゼナーゼ等で処理することによって、個々の細胞を解離させる。一方、血液（末梢血等）のように細胞が分離していれば、細胞の分離処理無しに、下記造血幹細胞の単離に供する。
【0044】
造血幹細胞の単離としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜用いることによって行なうことができる。例えば、後述の実施例において示すように、上述の造血幹細胞特異的マーカーに対する抗体を用い、セルソーター、磁気ビーズ等によって、造血幹細胞特異的マーカー特性を有する細胞を単離することができる。
【0045】
このようにして調製された造血幹細胞の、培養開始時に培地に添加する濃度としては特に制限はないが、通常５×１０２～５×１０３個／ｍＬであり、好ましくは１×１０３～３×１０３個／ｍＬである。
【0046】
本発明の培養における好適な条件としては、より具体的に以下が挙げられる（なお、下記条件にて基礎培地として用いられるＳＦ－０３培地には、そもそもインスリンが含まれている）。
【0047】
例えば、マウス由来の造血幹細胞を維持培養する条件としては、２～４ｎｇ／ｍＬ（例えば、３ｎｇ／ｍＬ）のＳＣＦ、０．０８～０．１２ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ）のＴＰＯ、３５～４５ｍｇ／ｍＬ（例えば、４０ｍｇ／ｍＬ）の血清アルブミン及び５０～６０μＭ（例えば、５５μＭ）の２－メルカプトエタノールを含有するＳＦ－０３培地にて、約３７℃、１体積％酸素濃度にて培養することが挙げられる。
【0048】
また、ヒト由来の造血幹細胞を維持培養する条件としては、２～４ｎｇ／ｍＬ（例えば、３ｎｇ／ｍＬ）のＳＣＦ、２～４ｎｇ／ｍＬ（例えば、３ｎｇ／ｍＬ）のＴＰＯ、３５～４５ｍｇ／ｍＬ（例えば、４０ｍｇ／ｍＬ）の血清アルブミン、１００～２５０μｇ／ｍＬの、少なくともパルミチン酸を含む脂肪酸、２０～４０μｇ／ｍＬのコレステロール及び５０～６０μＭ（例えば、５５μＭ）の２－メルカプトエタノールを含有するＳＦ－０３培地にて、約３７℃、１体積％酸素濃度にて培養することが挙げられる。なお、当該培養条件において、ＳＦ－０３培地の代わりに、約４００ｎｇ／ｍＬのインスリンを含有するαＭＥＭを、基礎培地として用いることができる。また、当該基礎培地として用いるαＭＥＭは、０．２～２０μｇ／ｍＬ（より好ましくは約２μｇ／ｍＬ）のチミジンを含有していることが望ましい。
【0049】
＜培養造血幹細胞＞
後述の実施例に示すとおり、上述の培地中で造血幹細胞を培養して得られる細胞群において、当該細胞の静止期性及び未分化性は高く維持されている。このような細胞は、後述の造血機能に関する疾患の治療及びスクリーニング等において有用である。したがって、本発明は、上述の培地中で造血幹細胞を培養して得られる細胞をも提供する。
後述の実施例に示すとおり、上述の培地中で造血幹細胞を培養して得られる細胞群において、当該細胞の静止期性及び未分化性は高く維持されている。このような細胞は、後述の造血機能に関する疾患の治療及びスクリーニング等において有用である。したがって、本発明は、上述の培地中で造血幹細胞を培養して得られる細胞をも提供する。
【0050】
造血幹細胞の培養方法については上述のとおりであるが、培養期間としては、通常１～３１日であり、好ましくは５～１４日である。
【0051】
また、上述の培養を経て得られる細胞において、造血幹細胞の割合は、通常３０％以上であり、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは７０％以上である。なお、造血幹細胞の割合は、後述の実施例に示すとおり、造血幹細胞特異的マーカーに対する抗体等を用いたセルソーター等によって同定することができる。
【0052】
また、培養後の細胞が造血幹細胞として機能するかどうかは、当該細胞を免疫不全マウス（例えば、ＮＯＧマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）に移植することによって確認することができる。すなわち、後述の実施例に示すように、対象となる細胞を前記マウスに移植し、移植された細胞の骨髄への移行・生着能、多分化能、骨髄再構築能等を検出することにより、造血幹細胞としての機能を維持していることを確認することができる。さらに、一度移植が成立した免疫不全マウスの骨髄を採取し、別の免疫不全マウスマウスに再度移植（２次移植）することによって、移植した細胞の自己複製能及び長期骨髄再構築能の測定も可能である。
【0053】
＜医薬組成物、造血機能に関する疾患の治療等＞
後述の実施例に示すとおり、本発明の培地を用いた培養によって得られる細胞をレシピエントに移植した場合、生着し、骨髄機能（造血能）を再構築することができる、そのため、当該細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる造血幹細胞治療用の移植片として用いることができる。
後述の実施例に示すとおり、本発明の培地を用いた培養によって得られる細胞をレシピエントに移植した場合、生着し、骨髄機能（造血能）を再構築することができる、そのため、当該細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる造血幹細胞治療用の移植片として用いることができる。
【0054】
したがって、本発明は。上述の培地中で造血幹細胞を培養して得られる細胞を、有効成分として含有する医薬組成物を、提供する。
【0055】
本発明の医薬組成物は、常套手段にしたがい、医薬上許容される担体を混合する等して、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造することができる。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム）等の注射用の水性液を挙げることができる。当該製剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、血清アルブミン、ポリエチレングリコール）、保存剤、酸化防止剤等と配合してもよい。
【0056】
また、造血幹細胞は、前記骨髄移植等を要する白血病等の治療の他、種々の疾患の治療において有効である。したがって、本発明の方法により維持した造血幹細胞は、造血細胞減少及び／又は造血機能低下を伴う疾患、造血機能障害を伴う疾患、免疫細胞減少、免疫細胞増大、自己免疫を伴う疾患、免疫機能障害、虚血性疾患に有効である。
【0057】
かかる造血機能に関する疾患として、具体的には、急性又は慢性白血病等の血液癌、慢性肉芽腫症、重症複合型免疫不全症候群、アデノシンデアミナ－ゼ（ＡＤＡ）欠損症、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｃｈｅｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の免疫不全症候群、Ｃ３欠損症、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Ｇａｕｃｈｅｒ病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、再生不良性貧血、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、突発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、Ｋａｓａｂａｃｈ－Ｍｅｒｒｉｔｔ症候群、悪性リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、慢性肝障害、自己免疫性溶血性貧血、骨髄異形成症候群、真性多血症、赤血球増多症、本態性血小板血症、骨髄増殖性疾患、外傷等による脊髄損傷が、挙げられる。
【0058】
また、固形癌患者に対する化学療法、放射線療法等により骨髄抑制が副作用として生じる場合、施術前に骨髄を採取しておき、本発明の方法により維持した造血幹細胞を、施術後に患者に戻すことで、造血系の障害から早期に回復させることができる。この方法により、更に強力な化学療法等を行えるようになり、当該治療効果を向上させることができる。
【0059】
さらに、本発明の医薬組成物に含まれる細胞は、遺伝子治療を行なうために、遺伝子改変が施された細胞であってもよい。改変される遺伝子は、対象となる疾患に応じて選択すればよく、特に限定されないが、例えば、ホルモン、サイトカイン、受容体、酵素、ポリペプチド等の遺伝子が挙げられる。また、遺伝子改変は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて行なうことができ、例えば、ウイルスベクター等を用いた遺伝子導入、ゲノム編集、ノックアウト法、ｓｉＲＮＡ法、ｓｈＲＮＡ法、リボザイム法、アンチセンス法を、適宜用いて行なうことができる。さらに、かかる造血幹細胞に対する遺伝子改変による治療は、先天性遺伝子疾患の治療に適用することができ、このような例として、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に対するＡＤＡ遺伝子の導入、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）におけるγｃ鎖遺伝子の導入、慢性肉芽腫症におけるｇｐ９１－ｐｈｏｘ遺伝子の導入、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ遺伝子の導入が、挙げられる。
【0060】
また、本発明は、本発明において得られる細胞又は当該細胞を有効成分として含む医薬組成物を患者に投与する、造血機能に関する疾患を治療する方法を提供する。
【0061】
前記細胞、医薬組成物及び造血機能に関する疾患については上述のとおりである。また、当該細胞等の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、状態等により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。また、前記細胞の投与量も、対象の年齢、体重、性別、状態等により異なるが、当業者であれば適宜調整し得る。
【0062】
＜スクリーニング方法＞
後述の実施例に示すとおり、本発明の培養方法は、生体内における造血幹細胞同様に、その静止期性及び未分化性を維持することができる。そのため、本発明は、当該機能を維持したまま造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物のスクリーニングに好適に用いることができる。
後述の実施例に示すとおり、本発明の培養方法は、生体内における造血幹細胞同様に、その静止期性及び未分化性を維持することができる。そのため、本発明は、当該機能を維持したまま造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物のスクリーニングに好適に用いることができる。
【0063】
したがって、本発明は、
（ｉ）上述の本発明の培地中、被験化合物の存在下、造血幹細胞を培養する工程、
（ｉｉ）前記培養後の造血幹細胞数を測定する工程、
（ｉｉｉ）前記工程において検出された細胞数が、被験化合物非存在下にて培養した後の造血幹細胞の細胞数より多ければ、前記被験化合物は、造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物であると判定する工程
を含む、造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物のスクリーニング方法を、提供する。
（ｉ）上述の本発明の培地中、被験化合物の存在下、造血幹細胞を培養する工程、
（ｉｉ）前記培養後の造血幹細胞数を測定する工程、
（ｉｉｉ）前記工程において検出された細胞数が、被験化合物非存在下にて培養した後の造血幹細胞の細胞数より多ければ、前記被験化合物は、造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物であると判定する工程
を含む、造血幹細胞を増幅する活性を有する化合物のスクリーニング方法を、提供する。
【0064】
かかるスクリーニングにおける培地及びそれを用いた培養方法については上述のとおりである。「被験化合物」としては、特に制限はないが、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを用いることにより、前記化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、培養期間については特に制限はなく、通常１～３１日であり、好ましくは５～１４日である。さらに、培養後の造血幹細胞数の測定は、上述のとおり、造血幹細胞特異的マーカーに対する抗体を用いたセルソーター等によって行なうことができる。
【0065】
また、本発明において維持培養する造血幹細胞の由来を、造血機能に関する疾患の罹患者とすることによって、当該疾患に対して治療活性を有する化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
【0066】
したがって、本発明は、
（ｉ）上述の本発明の培地中、被験化合物の存在下、造血機能に関する疾患罹患者に由来する造血幹細胞を培養する工程、
（ｉｉ）前記培養後の造血幹細胞の状態を検出する工程、
（ｉｉｉ）前記工程において検出された造血幹細胞の状態が、被験化合物非存在下にて培養した後の造血幹細胞の状態より良ければ、前記被験化合物は、前記疾患を治療する活性を有する化合物であると判定する工程
を含む、造血機能に関する疾患に対する治療活性を有する化合物のスクリーニング方法を、提供する。
（ｉ）上述の本発明の培地中、被験化合物の存在下、造血機能に関する疾患罹患者に由来する造血幹細胞を培養する工程、
（ｉｉ）前記培養後の造血幹細胞の状態を検出する工程、
（ｉｉｉ）前記工程において検出された造血幹細胞の状態が、被験化合物非存在下にて培養した後の造血幹細胞の状態より良ければ、前記被験化合物は、前記疾患を治療する活性を有する化合物であると判定する工程
を含む、造血機能に関する疾患に対する治療活性を有する化合物のスクリーニング方法を、提供する。
【0067】
かかるスクリーニングにおける培地、それを用いた培養方法、被験化合物及び培養期間については上述のとおりである。また「造血機能に関する疾患」は、特に制限されるものではなく、例えば、上記＜医薬組成物、造血機能に関する疾患の治療等＞において示した疾患が挙げられる。さらに、検出する「造血幹細胞の状態」については、対象となる疾患に応じて適宜選択すればよく、特に限定されないが、例えば、造血幹細胞の数、形成されるコロニーの大きさ、細胞表面マーカーの発現パターン、造血幹細胞の未分化性、静止期性及び機能（生着性、造血能）が挙げられる。
【0068】
＜造血幹細胞の培地を作製するためのキット等＞
ＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミン等の生理活性物質は、培地中において徐々にその活性を喪失していく。そのため、後述の実施例に示すとおり、本発明の培地は、造血幹細胞の培養の際に調製することが望ましい。したがって、本発明は、ＳＣＦと、ＴＰＯと、脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを含む、造血幹細胞の維持培養用培地を作製するためのキットを、提供する。
ＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミン等の生理活性物質は、培地中において徐々にその活性を喪失していく。そのため、後述の実施例に示すとおり、本発明の培地は、造血幹細胞の培養の際に調製することが望ましい。したがって、本発明は、ＳＣＦと、ＴＰＯと、脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを含む、造血幹細胞の維持培養用培地を作製するためのキットを、提供する。
【0069】
当該キットの構成品（ＳＣＦ、ＴＰＯ、脂肪酸担持アルブミン、基礎培地等）については上述のとおりであるが、脂肪酸担持アルブミンは、脂肪酸とアルブミンとが分かれた形態にて、当該キットに含まれていてもよい。また、本発明の培地作製用キットには、上記培地添加物が更に含まれていてもよく、さらに培地における各物質の濃度等を示した説明書を含めることができる。
【0070】
また、前記キットにおいては、混合するだけで本発明の培地が作製できるよう、ＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミンが前記所定量含まれるものであってもよい。すなわち、本発明の培地作製用キットは、「ＳＣＦと、ＴＰＯと、脂肪酸担持アルブミンと、基礎培地とを含み、前記ＳＣＦ、前記ＴＰＯ及び前記脂肪酸担持アルブミンの量が、前記基礎培地１ｍＬに対して、１～１０ｎｇ、０．０２～６ｎｇ及び１０～１００ｍｇである、造血幹細胞の維持培養用培地を作製するためのキット」という態様もとり得る。なお、ＳＣＦ、ＴＰＯ及び脂肪酸担持アルブミンのより好適な量については、上記＜造血幹細胞の培地＞の記載を参照のほど。
【0071】
また、本発明は、前記培地作製用キットを含む、造血幹細胞を維持培養するためのキットを提供する。当該キットにおいては、前述の構成品の他、上記培養器、骨髄ストローマ細胞、低酸素インキュベーター等を含めることができる、また、培養後の細胞において造血幹細胞が維持されていることを確認するための試薬を含めることもできる。当該試薬としては、造血幹細胞特異的マーカーを認識する抗体、該抗体を認識する標識された二次抗体、磁性ビーズ等が挙げられる。さらに、当該キットには、造血幹細胞を維持培養するための条件（酸素濃度）等を記載した使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【0072】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。先ず、本実施例にて用いた材料及び方法を、以下にて説明する。
【0073】
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．２マウス、８～１４週齢、日本ＳＬＣ又は日本クレアから購入）を、全ての実験において使用した。また、日本クレアから購入したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１コンジェニックマウスを、後述の造血幹細胞移植実験（競合的再構築アッセイ）におけるレシピエントマウスとして使用した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．２マウス、８～１４週齢、日本ＳＬＣ又は日本クレアから購入）を、全ての実験において使用した。また、日本クレアから購入したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１コンジェニックマウスを、後述の造血幹細胞移植実験（競合的再構築アッセイ）におけるレシピエントマウスとして使用した。
【0074】
全てのマウスを、特定の病原体フリー（ＳＰＦ）条件下で、国立国際医療研究センターの動物施設において、自由に飲食可能な環境下で飼育した。実験には、雄及び雌マウスの両方を使用した。また実験の際には、マウスは頸椎脱臼により安楽死させた。なお、動物実験は、国立国際医療研究センター動物実験委員会によって承認された上で、行なった。
【0075】
（マウスｃ－Ｋｉｔ陽性細胞の調製）
マウス骨髄細胞を、２本の大腿骨及び脛骨から単離した。具体的には先ず、２１ゲージ針（テルモ社製）を装着した１０ｍＬ注射器（テルモ社製）を用い、２体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、大腿骨及び脛骨にフラッシュすることにより、骨髄プラグを回収した。次いで、骨髄プラグを、２１ゲージ針内で出し入れすることによって細かく砕き、さらに遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製、ＫＵＢＯＴＡ ５９３０）による、４℃、６８０ｇ、５分間の遠心分離に供した。そして、上清を取り除き、得られた細胞を、室温で５分間、緩衝液（０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に懸濁した。さらに、その２倍量の２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し、６８０ｇで５分間、４℃で遠心分離することにより、細胞を洗浄した。次いで、その細胞を、２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、４０μｍのナイロンメッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通して濾過した。得られた濾液を、４℃、５分間、６８０ｇの遠心分離に再び供し、骨髄細胞を回収した。
マウス骨髄細胞を、２本の大腿骨及び脛骨から単離した。具体的には先ず、２１ゲージ針（テルモ社製）を装着した１０ｍＬ注射器（テルモ社製）を用い、２体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、大腿骨及び脛骨にフラッシュすることにより、骨髄プラグを回収した。次いで、骨髄プラグを、２１ゲージ針内で出し入れすることによって細かく砕き、さらに遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製、ＫＵＢＯＴＡ ５９３０）による、４℃、６８０ｇ、５分間の遠心分離に供した。そして、上清を取り除き、得られた細胞を、室温で５分間、緩衝液（０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に懸濁した。さらに、その２倍量の２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し、６８０ｇで５分間、４℃で遠心分離することにより、細胞を洗浄した。次いで、その細胞を、２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、４０μｍのナイロンメッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通して濾過した。得られた濾液を、４℃、５分間、６８０ｇの遠心分離に再び供し、骨髄細胞を回収した。
【0076】
回収した骨髄細胞に、非特異的なＩｇＧとＦｃ受容体との結合をブロックする抗ＣＤ１６／３２抗体（以下「Ｆｃブロック」とも称する。ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、マウス１個体あたり２μＬ使用）を添加し、４℃で５分間インキュベートした。続いて、抗ｃ－Ｋｉｔ磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を、反応液の総容量の２０体積％になるよう添加し、４℃で１５分間インキュベートした。その後、２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄することにより抗体を除去した後、ｃ－Ｋｉｔ＋細胞を、セルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、製品名：ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ、Ｐｏｓｓｅｌ－ｓモード）を用いて単離した。単離した細胞を、３４０ｇの遠心分離に５分間供した後、下記フローサイトメトリー用の抗体（抗体パネル）で染色した。
【0077】
（マウス造血幹細胞等の調製）
前記磁気ビーズを用いたｃ－Ｋｉｔ＋細胞選択の後、単離した細胞を、３４０ｇの遠心分離に５分間供し、下記抗体パネルを用い、マウス造血幹細胞及び造血前駆細胞の細胞画分を標識した。
前記磁気ビーズを用いたｃ－Ｋｉｔ＋細胞選択の後、単離した細胞を、３４０ｇの遠心分離に５分間供し、下記抗体パネルを用い、マウス造血幹細胞及び造血前駆細胞の細胞画分を標識した。
【0078】
抗体パネル：分化抗原マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８ａ、Ｇｒ－１、Ｍａｃ－１、Ｔｅｒ－１１９、Ｂ２２０）－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ｃ－Ｋｉｔ－ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｓｃａ－Ｃｙ７、ＣＤ１５０－ＰＥ、ＣＤ４１－ＦＩＴＣ、ＣＤ４８－ＦＩＴＣ、Ｆｌｔ３－ＡＰＣ、ＣＤ３４－ＢＶ４２１。なお、全ての抗体は、マウス１個体あたり各０．５μＬ使用した。
【0079】
標識した細胞を、２体積％ＦＢＳ及び０．１重量体積％ＰＩ含有ＰＢＳ ０．５～２ｍＬに再懸濁し、セルソーター（製品名：ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（登録商標）ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に供し、ソートされた細胞を、４重量体積％ＢＳＡを含有する、後述のＳＦ－Ｏ３、αＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２に回収した。また、脂肪酸非存在下での培養にマウス由来の細胞を供する場合には、前記４重量体積％ＢＳＡを含む培地の代わりに、脂肪酸フリーＢＳＡを含む培地を用い、ソートした細胞を回収した。
【0080】
なお、このソーティングにおいて、マウス造血幹細胞は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ細胞、ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＬＳＫ細胞、又は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫ細胞として定義した。また、ＭＰＰ１（ＣＤ１５０－ＣＤ４１－ＣＤ４８－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）、ＭＰＰ２（ＣＤ１５０＋ＣＤ４１／ＣＤ４８＋Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）、ＭＰＰ３（ＣＤ１５０－ＣＤ４１／ＣＤ４８＋Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）及びＭＰＰ４（Ｆｌｔ３＋ＬＳＫ）を、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）分画として定義した。
【0081】
（ヒト造血幹細胞等の調製）
ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞をＬｏｎｚａ社から購入し、使用するまで液体窒素中で保存した。実験に際しては先ず、バイアル中の凍結細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬチューブに移した。次いで、１０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｂｉｏｗｅｓｔ若しくはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入）及び２Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有する培地（ＳＦ－Ｏ３（エーディア社製）、αＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）又はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（ナカライテスク社製））を、ゆっくりと解凍した細胞に加え、穏やかに混ぜながらチューブを満たした。解凍し得られた細胞懸濁液を、室温で遠心分離機（ＴＯＭＹ社製、製品名：Ｅｘ－１２５）による１５分間２００ｇの遠心分離に供した。次いで、上清を吸引し、前記培地を用いた遠心分離による洗浄工程をもう一度繰り返した。
ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞をＬｏｎｚａ社から購入し、使用するまで液体窒素中で保存した。実験に際しては先ず、バイアル中の凍結細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬチューブに移した。次いで、１０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｂｉｏｗｅｓｔ若しくはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入）及び２Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有する培地（ＳＦ－Ｏ３（エーディア社製）、αＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）又はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（ナカライテスク社製））を、ゆっくりと解凍した細胞に加え、穏やかに混ぜながらチューブを満たした。解凍し得られた細胞懸濁液を、室温で遠心分離機（ＴＯＭＹ社製、製品名：Ｅｘ－１２５）による１５分間２００ｇの遠心分離に供した。次いで、上清を吸引し、前記培地を用いた遠心分離による洗浄工程をもう一度繰り返した。
【0082】
次に、洗浄後上清を取り除いた細胞に、抗体カクテル（５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ナカライテスク社製）、２体積％ＦＢＳ及び下記各抗体）を加え、氷上で３０分間維持した。細胞を、２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄し、０．１重量体積％ＰＩ及び２体積％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に再懸濁した。
抗ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） １０μＬ
抗ＣＤ３８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） ２μＬ
抗ＣＤ９０－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） ５μＬ
抗ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） １０μＬ。
抗ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） １０μＬ
抗ＣＤ３８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） ２μＬ
抗ＣＤ９０－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） ５μＬ
抗ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） １０μＬ。
【0083】
そして、前記抗体にて標識した細胞を、セルソーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）に供し、ソートされた細胞を、４重量体積％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び５５μＭ ２－ＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含有する、ＳＦ－Ｏ３又はαＭＥＭに回収した。また、脂肪酸非存在下での培養に供する場合には、上記マウス由来のそれとは異なり、ヒト由来の細胞は、脂肪酸フリーＢＳＡを用いた培養では生存率が低くなるため、この場合もソートした細胞を、前記４重量体積％ＢＳＡを含む培地に回収した。
【0084】
なお、このソーティングにおいて、ヒト造血幹細胞を、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞と定義した。
【0085】
（培地）
細胞培養には、ＳＦ－Ｏ３培地、αＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた。ＳＦ－Ｏ３培地の調製においては先ず、ＳＦ－Ｏ３基礎培地（エーディア社製）に対して、同製造元より提供されたサプリメント、及び最終濃度が０．１重量体積％になるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：エーディア社製又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した。更に、二酸化炭素を吹き込み十分に酸性化した後、０．２２μｍフィルターを通して４℃に保存したものを、ＳＦ－Ｏ３培地として使用した。
細胞培養には、ＳＦ－Ｏ３培地、αＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた。ＳＦ－Ｏ３培地の調製においては先ず、ＳＦ－Ｏ３基礎培地（エーディア社製）に対して、同製造元より提供されたサプリメント、及び最終濃度が０．１重量体積％になるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：エーディア社製又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した。更に、二酸化炭素を吹き込み十分に酸性化した後、０．２２μｍフィルターを通して４℃に保存したものを、ＳＦ－Ｏ３培地として使用した。
【0086】
なお、ＳＦ－Ｏ３基礎培地は、シチジン、グルタチオン、パラアミノ安息香酸及びコレステロールを添加したＲＰＭＩ１６４０と、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）と、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地とを、２：１：１の比率で混合した培地である。
【0087】
また、ＳＦ－Ｏ３基礎培地には、組換えヒトインスリン、組換えヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＨＥＰＥＳ及び２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを、前記サプリメントとして添加した。
【0088】
ＢＳＡ結晶（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、各実験における指示濃度になるよう、培地に直接溶解し、０．２２μｍフィルターを用いて濾過した。なお、濾過前には、最終濃度５５μＭとなるように、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）も添加した。また、濾過後には、各実験における指示濃度になるよう、ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、水溶化脂肪酸及びコレステロールからなる製剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、製品名：２５０ｘ コレステロール脂質濃縮物）を、前記培地に添加した。
【0089】
ＳＦ－Ｏ３以外の培地（αＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）については、前記濾過前に、場合によって各実験における指示濃度になるよう、ヒト組換えインスリン（ナカライテスク社製）を添加し、また最終濃度が５５μＭとなるように、２－ＭＥを添加した。
【0090】
（細胞培養）
上記のとおりにして調製したマウス又はヒト由来の造血幹細胞を、３４０ｇ、５分間の遠心分離に供し、上清を捨てた。そして、前記にて調製した培地を、（１ウェルあたりの細胞数）／１０μＬの濃度になるよう添加し、得られた細胞懸濁液１０μＬを、８ウェルピペットで、２００μＬの培地を各ウェルに事前に添加した９６ウェルプレートに、分注した。
上記のとおりにして調製したマウス又はヒト由来の造血幹細胞を、３４０ｇ、５分間の遠心分離に供し、上清を捨てた。そして、前記にて調製した培地を、（１ウェルあたりの細胞数）／１０μＬの濃度になるよう添加し、得られた細胞懸濁液１０μＬを、８ウェルピペットで、２００μＬの培地を各ウェルに事前に添加した９６ウェルプレートに、分注した。
【0091】
培養条件は、加湿インキュベーター中、３７℃で１体積％Ｏ２及び５体積％ＣＯ２（低酸素インキュベーター ＡＰＭ－３０ＤＲ：アステックを使用して調整）、又は、２０体積％Ｏ２及び５体積％ＣＯ２（ＳＣＩ－１６５Ｄ：アステックを使用して調整）のいずれかとした。
【0092】
なお、７日間培養の場合、培養期間中の培地交換は行なわなかった。しかしながら、より長期間（すなわち、１１日間～３１日間）の培養では、培地の半量交換を週に２回（３～５日ごとに）行った。
【0093】
（造血幹細胞の移植）
上記のとおりに調製したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．２マウス由来の造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）又はそれを所定の条件にて培養した細胞（培養造血幹細胞由来の細胞）を、コンペティター（４×１０５個のＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１マウス由来骨髄細胞）と共に、致死量（９．５Ｇｙ）の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１マウスの眼窩静脈叢に移植した。
上記のとおりに調製したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．２マウス由来の造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ）又はそれを所定の条件にて培養した細胞（培養造血幹細胞由来の細胞）を、コンペティター（４×１０５個のＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１マウス由来骨髄細胞）と共に、致死量（９．５Ｇｙ）の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１マウスの眼窩静脈叢に移植した。
【0094】
放射線照射は、ＭＢＲ－１５２０Ｒ－３（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｐｏｗｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて行なった（１２５ｋＶ １０ｍＡ、０．５ｍｍ Ａｌ、０．２ｍｍ Ｃｕフィルターを使用）。また、眼窩静脈叢への移植は、２７ゲージ針付き１ｍＬシリンジ（テルモ社製）を使用して行なった。
【0095】
造血幹細胞を移植してから、１、２、３及び４カ月後に、末梢血を採取し、ドナー由来細胞の割合及びそれらの分化状態を、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）により決定した。
【0096】
具体的には、末梢血４０～８０μＬを、眼窩静脈叢からガラスキャピラリーを用いて採取し、１ｍＬのヘパリン含有ＰＢＳに懸濁した。得られた血液懸濁液を、３４０ｇで３分間遠心分離した後、上清を捨て、１．２重量体積％デキストラン（２００ｋＤａ、ナカライテスク社製）含有ＰＢＳ １ｍＬに再懸濁した後、室温で４５分間インキュベートし、大部分の赤血球をチューブの底に沈殿させた。その上清を、３４０ｇの遠心分離に３分間供し、得られたペレットを０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ溶液に再懸濁し、細胞懸濁液が透明になるまで、残存赤血球を５～１０分間かけて溶解させた。再度遠心分離に供し、得られた細胞を、Ｆｃブロック０．３μＬ及び２体積％ＦＢＳを含むＰＢＳ ５０μＬに再懸濁した。
【0097】
次に、下記抗体を用いた表面抗原染色を施した後、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔによる解析に供した。
表面抗原染色に用いた抗体：Ｇｒ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｍａｃ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｂ２２０－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ８ａ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ４５．１－ＰＥ、ＣＤ４５．２－ＦＩＴＣ。全ての抗体は、１サンプルあたり０．３μＬ使用した。
表面抗原染色に用いた抗体：Ｇｒ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｍａｃ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｂ２２０－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ８ａ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ４５．１－ＰＥ、ＣＤ４５．２－ＦＩＴＣ。全ての抗体は、１サンプルあたり０．３μＬ使用した。
【0098】
なお、ドナー由来の細胞は、Ｌｙ５．２（ＣＤ４５．２）＋Ｌｙ５．１（ＣＤ４５．１）－細胞であり、コンペティター又はレシピエントに由来する細胞は、Ｌｙ５．２（ＣＤ４５．２）－Ｌｙ５．１（ＣＤ４５．１）＋細胞である。また、ミエロイド、Ｂ細胞、Ｔ細胞は、それぞれ、Ｇｒ－１＋又はＭａｃ－１＋細胞、Ｂ２２０＋細胞、ＣＤ４＋又はＣＤ８ａ＋細胞として同定した。
【0099】
そして、得られたデータに基づき、ドナー由来細胞の頻度（％）を以下のように算出した：
ドナー由来細胞の頻度（％）＝ドナー由来細胞（％）／［ドナー由来細胞（％）＋コンペティター及びレシピエント由来の細胞（％）］×１００。
ドナー由来細胞の頻度（％）＝ドナー由来細胞（％）／［ドナー由来細胞（％）＋コンペティター及びレシピエント由来の細胞（％）］×１００。
【0100】
また、総細胞キメリズムとして、単核球におけるＬｙ５．２－Ｌｙ５．１＋細胞の頻度に対するドナー由来のＬｙ５．２＋Ｌｙ５．１－細胞の頻度を算出した。
【0101】
また、前記造血幹細胞の移植（１次移植）をしてから４カ月後に、二次移植を実施した。具体的には、一次移植４カ月後のレシピエントマウスから、前記（マウスｃ－Ｋｉｔ陽性細胞の調製）に記載の方法により骨髄細胞を採取した。自動細胞カウンターＴＣ１０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて骨髄細胞の細胞数をカウントした後、各レシピエントから調製した細胞懸濁液全量の２０～３０％をプールした。
【0102】
また、各レシピエントあたり、２×１０６の骨髄細胞を、ＳＦ－Ｏ３培地（０．１％重量体積ＢＳＡ含有）２００μＬに懸濁した。そして、このようにして調製した細胞懸濁液（２００μＬ／レシピエント）を、前記一次移植同様に、放射線照射Ｃ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１マウスの眼窩静脈叢に注射し、移植した。
【0103】
（脂肪酸等のＢＳＡへの担持処理）
脂肪酸ナトリウム塩（パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、ステアリン酸塩、いずれも東京化成工業株式会社製）、コレステロール（東京化成工業株式会社製）、又はそれらを組み合わせたものを、それぞれガラスチューブ内で、４～２０ｍｇ／ｍＬ又は４ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう、メタノール（Ｗａｋｏ社製）に溶解した。
脂肪酸ナトリウム塩（パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、ステアリン酸塩、いずれも東京化成工業株式会社製）、コレステロール（東京化成工業株式会社製）、又はそれらを組み合わせたものを、それぞれガラスチューブ内で、４～２０ｍｇ／ｍＬ又は４ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう、メタノール（Ｗａｋｏ社製）に溶解した。
【0104】
このようにして調製した脂肪酸塩及び／又はコレステロールの溶液は、電動ピペットを用い、空気を吹き付けて、前記ガラスチューブ内で乾燥させた後、５０℃の水浴上でメタノールが完全に蒸発するまで（５～１０分間）加熱した。次いで、４重量体積％脂肪酸フリーＢＳＡ又はＢＳＡ結晶（共に、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む培地を、ガラスチューブに直接添加し、脂肪酸塩及びコレステロールが溶解するまで超音波処理した。そして、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた濾過に供した。なお、上記（培地）にて記載したように、ＳＦ－Ｏ３培地を用いる場合には、２－ＭＥを濾過直前に加えた。また、その他の培地を用いる場合には、必要に応じ、インスリンを濾過直前に加えた。
【0105】
（ＥｄＵ取り込みアッセイ）
造血幹細胞を、後述の各条件下で１６時間培養し、１０ｍＭのＥｄＵを最終濃度１０μＭとなるように培地に加え、３７℃で２時間インキュベートした。そして、細胞を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７フローサイトメトリーアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、分析した。また、細胞内ＥｄＵを検出するため、固定・膜透過処理し、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用い、分析した。
造血幹細胞を、後述の各条件下で１６時間培養し、１０ｍＭのＥｄＵを最終濃度１０μＭとなるように培地に加え、３７℃で２時間インキュベートした。そして、細胞を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７フローサイトメトリーアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、分析した。また、細胞内ＥｄＵを検出するため、固定・膜透過処理し、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用い、分析した。
【0106】
（ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔによる培養細胞の分析）
上記（細胞培養）の記載のとおりに造血幹細胞を播種した９６ウェルプレートの各ウェルから、培地を１７０μＬまで吸引し、続いて下記抗体カクテルを添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。
上記（細胞培養）の記載のとおりに造血幹細胞を播種した９６ウェルプレートの各ウェルから、培地を１７０μＬまで吸引し、続いて下記抗体カクテルを添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。
【0107】
マウス由来の細胞を対象とした実験では、分化抗原マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８ａ、Ｇｒ－１、Ｍａｃ－１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９）－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗ｃ－Ｋｉｔ－ＡＰＣ－Ｃｙ７、抗Ｓｃａ－１－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ＣＤ１５０－ＰＥ、抗ＣＤ４８－ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ４１－ＡＰＣからなる抗体カクテルを用いた。なお、全ての抗体は、０．１μＬ／ウェルとなるよう、プレートに添加した。
【0108】
ヒト由来の細胞を対象とした実験では、抗ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（０．１μＬ／ウェル）、抗ＣＤ３８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（０．１μＬ／ウェル）、抗ＣＤ９０－ＰＥ－Ｃｙ７（０．２５μＬ／ウェル）及び抗ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ（０．５μＬ／ウェル）からなる抗体カクテルを用いた。
【0109】
インキュベーション（前記抗体による染色）後、１００μＬの２体積％ＦＢＳ含有ＰＢＳを各ウェルに添加し、加速Ｌｏｗ及び減速度Ｍｅｄｉｕｍ、４００ｇ、４℃での遠心分離に、５分間供した。その後、１００μＬの上清を吸引し、２体積％ＦＢＳ、０．１重量体積％ＰＩ及び０．２５体積％Ｆｌｏｗ－Ｃｈｅｃｋ Ｆｌｕｏｒｅｓｐｈｅｒｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）含有ＰＢＳ ２００μＬを、各ウェルに添加し、細胞を懸濁させた。
【0110】
ＭＡＣＳ ＱｕａｎｔのＦａｓｔモードで、細胞懸濁液を採取し、１００μＬ（大コロニー）又は１５０－１７０μＬ（小コロニー）を吸引・分析した。データはＦＣＳファイルとしてエクスポートし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。細胞数はＦｌｏｗ－Ｃｈｅｃｋ（約１０００／μＬ）のビーズ数で補正した。巨核球は、高い前方散乱及び側方散乱、並びに高いＣＤ１５０及びＣＤ４１発現を有する細胞として定義した。
【0111】
（ｃＤＮＡマイクロアレイ解析）
先ず、上記（マウスｃ－Ｋｉｔ陽性細胞の調製）及び（マウス造血幹細胞等の調製）に記載の方法に沿って、マウス１０匹の骨髄から造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ細胞）を単離し、ＳＦ－Ｏ３培地にプールした。
先ず、上記（マウスｃ－Ｋｉｔ陽性細胞の調製）及び（マウス造血幹細胞等の調製）に記載の方法に沿って、マウス１０匹の骨髄から造血幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４１－ＣＤ４８－ＣＤ３４－Ｆｌｔ３－ＬＳＫ細胞）を単離し、ＳＦ－Ｏ３培地にプールした。
【0112】
プールした造血幹細胞を２等分し、半分はＲＬＴ緩衝液（０．７５μＬ ２－ＭＥ含有）７５μＬに溶解し、新鮮造血幹細胞試料として、下記マイクロアレイ解析等に供した。残り半分は、図１３に示す条件にて７日間の培養を行った後、３４０ｇで５分間４℃で遠心分離して培養細胞を回収し、７５μＬ ＲＬＴ緩衝液（０．７５μＬ ２－ＭＥ含有）７５μＬに溶解し、培養後の造血幹細胞試料として、下記マイクロアレイ解析等に供した。
【0113】
そして、このようにして調製した各造血幹細胞試料からの、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、マイクロアレイ解析及びデータ正規化（データの読み込み及び標準化）は、ＤＮＡチップ研究所に委託して行なってもらった。
【0114】
具体的には、前記造血幹細胞試料から、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、ＲＮＡを抽出した。ＷＴ－Ｏｖａｔｉｏｎ Ｐｉｃｏ ＲＮＡ増幅システム（ＮｕＧｅｎ社製）を用い、２ｎｇの前記抽出ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、増幅した。増幅したｃＤＮＡをＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて標識し、続いて、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）及びＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｐａｃｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用して、標識したｃＤＮＡを、Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ Ｍｏｕｓｅ ８ｘ６０ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）にハイブリダイゼーションした。
【0115】
ハイブリダイズした遺伝子チップを、ＤＮＡ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてスキャンした。スキャンした画像は、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｖｅｒ．９．５．３（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で解析した。
【0116】
さらに、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて正規化を行った。具体的には、生データを最初にｌｏｇ２スケールに変換し、発現レベル１．０未満を１．０に設定した。そして、７５パーセンタイルシフトアルゴリズムでサンプル間の遺伝子発現レベルを標準化した。
【0117】
また、標準化した発現データを、遺伝子名アノテーションによって散布図にして可視化した。当該可視化は、Ｒソフトウェアのｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて行った。その結果、遺伝子発現レベル＞１．５のｌｏｇ２倍の差異を有する遺伝子は、濃い青色で着色することによって強調され、目的の遺伝子（すなわち、脂肪酸関連遺伝子）は赤色で着色された。「検出されなかった」フラグを有する遺伝子は、散布図から除去された。
【0118】
（遺伝子セットエンリッチメント解析：ＧＳＥＡ）
前記のとおり標準化した発現データを、ＧＳＥＡ ｖ２．０．１３ソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて評価した。遺伝子セットは、ＧＳＥＡウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）で配布されているＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｖ４．０から入手した。順列の数は１０００に設定した。名目上のｐ値が０．０５未満であり、誤発見率ｑ値＜０．２５である遺伝子セットを統計的に有意と見なした。
前記のとおり標準化した発現データを、ＧＳＥＡ ｖ２．０．１３ソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて評価した。遺伝子セットは、ＧＳＥＡウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）で配布されているＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｖ４．０から入手した。順列の数は１０００に設定した。名目上のｐ値が０．０５未満であり、誤発見率ｑ値＜０．２５である遺伝子セットを統計的に有意と見なした。
【0119】
（サイトカイン応答の２Ｄ及び３Ｄプロットの作成）
様々なサイトカイン濃度にて培養した後の細胞数を、ＦＣＳファイルにエクスポートした後、Ｒソフトウェアを用いてデータを平滑化した。局所回帰は、ｌｏｅｓｓ関数を使用して、多項式表面をデータ点に適合させた。パラメータはｄｅｇｒｅｅ＝２、及びｓｐａｎ＝０．２５に設定した。Ｘ軸、Ｙ軸を７×７行列から６１×６１行列に拡張し、ｐｒｅｄｉｃｔ関数を用いてデータ予測を行った。データが対数スケール（すなわち、総細胞数及び巨核球数）である場合、対数変換後のデータが正になるように測定データに１を加えた。全てのデータから、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて２Ｄ等高線プロットが生成され、ｒｇｌパッケージを使用して３Ｄプロットが生成された。
様々なサイトカイン濃度にて培養した後の細胞数を、ＦＣＳファイルにエクスポートした後、Ｒソフトウェアを用いてデータを平滑化した。局所回帰は、ｌｏｅｓｓ関数を使用して、多項式表面をデータ点に適合させた。パラメータはｄｅｇｒｅｅ＝２、及びｓｐａｎ＝０．２５に設定した。Ｘ軸、Ｙ軸を７×７行列から６１×６１行列に拡張し、ｐｒｅｄｉｃｔ関数を用いてデータ予測を行った。データが対数スケール（すなわち、総細胞数及び巨核球数）である場合、対数変換後のデータが正になるように測定データに１を加えた。全てのデータから、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて２Ｄ等高線プロットが生成され、ｒｇｌパッケージを使用して３Ｄプロットが生成された。
【0120】
（統計解析）
他に記載がない限り、データは平均±標準偏差として示す。多重比較検定をする場合、ＲソフトウェアのＴｕｋｅｙＨＳＤ関数によるＴｕｋｅｙの多重比較検定、ａｎｏｖａ関数による一元配置分散分析（１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置分散分析（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって、統計的有意性を決定した。２群の比較では対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用した。誤発見率（ＦＤＲ）は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のｑｖａｌｕｅパッケージのｑｖａｌｕｅ関数を使用して算出した。
他に記載がない限り、データは平均±標準偏差として示す。多重比較検定をする場合、ＲソフトウェアのＴｕｋｅｙＨＳＤ関数によるＴｕｋｅｙの多重比較検定、ａｎｏｖａ関数による一元配置分散分析（１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置分散分析（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって、統計的有意性を決定した。２群の比較では対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用した。誤発見率（ＦＤＲ）は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のｑｖａｌｕｅパッケージのｑｖａｌｕｅ関数を使用して算出した。
【0121】
次に、上記材料及び方法を用いて行なった実験の結果を、以下に示す。
【0122】
＜実施例１＞ マウス由来造血幹細胞を維持するための培養条件（酸素、ＳＣＦ及びＴＰＯの濃度）についての検討
造血幹細胞は、骨髄環境中において低酸素環境下にあり、また静止期を維持した状態で未分化性を保っている。さらに、造血幹細胞の維持には、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）が必須因子であることも知られている。
造血幹細胞は、骨髄環境中において低酸素環境下にあり、また静止期を維持した状態で未分化性を保っている。さらに、造血幹細胞の維持には、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）が必須因子であることも知られている。
【0123】
そこで、造血幹細胞の静止期及び未分化性の維持を可能とする条件を、培養下でも再現すべく、酸素濃度、並びにＳＣＦ及びＴＰＯの濃度について、先ずは検討した。
【0124】
具体的には、条件を単純化するため、ＳＣＦとＴＰＯのみを、サイトカインとして、培地に添加することにした。そして、ＳＣＦとＴＰＯの至適条件を定めるため、ＢＳＡ４重量体積％を含むＳＦ－Ｏ３培地で、低酸素条件（１体積％酸素）又は高酸素条件（２０体積％酸素、大気濃度）下で造血幹細胞を７日間にわたって培養し、総細胞数（図１）、巨核球数（図２）、総細胞数に対する造血幹細胞分画の割合（図３）及び未分化細胞分画（ＬＳＫ分画）における、各分化段階の細胞数（図４）をＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔにより測定した。
【0125】
その結果、図１に示すとおり、総細胞数は、ＳＣＦ及びＴＰＯの添加濃度のいずれに対しても比例して増加した。Ｂｌｏｏｄ．１９９３年１０月１日；８２（７）：２０３１～２０３７ページにて報告されているとおり、低酸素条件の方が細胞数は少なかった。また、図２に示すとおり、巨核球については、低酸素条件下、ＴＰＯの濃度に強く依存する一方、高酸素条件ではＳＣＦ及びＴＰＯの濃度に依存して細胞数が増加した。一方、図３に示すとおり、造血幹細胞の割合は、ＳＣＦ及びＴＰＯ濃度が低いほうが高く、さらに低酸素条件の方が造血幹細胞の割合は高かった。さらに、ＬＳＫ分画の細胞数をみると、図４に示すとおり、高酸素条件では低酸素条件に比して分化細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８＋ＬＳＫ細胞及びＣＤ１５０－ＣＤ４８＋細胞）の細胞数が著増しており、前記Ｂｌｏｏｄ．１９９３年に記載のとおり、造血幹細胞は、低酸素条件でより未分化に維持されることが確認された。
【0126】
また、図３に示すように、造血幹細胞は、ＴＰＯ濃度を０～０．５ｎｇ／ｍＬとする培養条件下では、ＳＣＦの濃度が３ｎｇ／ｍＬ以下となると細胞数が減少したことから、ＴＰＯ濃度が低い条件下ではＳＣＦ濃度は３ｎｇ／ｍＬ以上であることが望ましいことが明らかになった。一方、ＴＰＯの濃度を２．５ｎｇ／ｍＬ以上とする培養条件下では、ＳＣＦの濃度を３ｎｇ／ｍＬ以下としても造血幹細胞は生存していた。特に、ＳＣＦの濃度が１ｎｇ／ｍＬであり、かつＴＰＯの濃度が６２．５ｎｇ／ｍＬである条件下で、造血幹細胞数の増加が認められた（図４の「１％Ｏ２ ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫ」 参照）。
【0127】
一方、造血幹細胞から派生し、自己複製能は失ったものの多分化能を有する多能性前駆細胞（ＭＰＰ）に関しては、ＳＣＦの濃度を３ｎｇ／ｍＬ以上とした場合、ＣＤ１５０－ＣＤ４８－ＬＳＫ分画（ＭＰＰ１）が増加した。さらに、ＴＰＯの濃度を２．５ｎｇ／ｍＬ以上とする条件下では、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８＋ＬＳＫ分画（ＭＰＰ２）が増加した。また、高酸素条件ではＣＤ１５０－ＣＤ４８＋ＬＳＫ（ＭＰＰ３）に分化する細胞は少なかった（図４ 参照）。
【0128】
以上の結果を総合して、静止期性を維持し（総細胞数が低い）、かつ未分化な細胞が維持される（巨核球数・分化細胞数が低く、かつ造血幹細胞数が多い）条件を検討した結果、図５に示すとおり、酸素の濃度は、大気中の濃度よりも低濃度であり、ＳＣＦの濃度は１～１０ｎｇ／ｍＬであり、かつＴＰＯの濃度は０．０２～６ｎｇ／ｍＬであることが望ましく、更には酸素濃度を１体積％とし、ＳＣＦを３ｎｇ／ｍＬの濃度にて、かつＴＰＯを０．１ｎｇ／ｍＬの濃度にて培地に添加して、マウス由来の造血幹細胞を培養することが、その静止期及び未分化性を維持する上で最適であることを見出した。
【0129】
実際、図６に示すとおり、酸素濃度を１体積％とし、３ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ及び０．１ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを添加した培地にて培養した場合（以下、この培養条件を「Ｓ３Ｔ０．１」とも称する）、既存の条件（高酸素、高サイトカイン、例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３年１月３日；１２（１）：４９～６１ページ 参照）で培養した場合と比較して、培養後の細胞コロニーは小さく維持されていることが明らかになった。
【0130】
さらに、フローサイトメトリー解析の結果でも、図７に示すとおり、Ｓ３Ｔ０．１条件下にて培養した結果、多くの細胞がＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＬＳＫという培養開始前の表面マーカーを維持していることも明らかになった。
【0131】
続いて、培養開始１６時間後の細胞周期について、ＥｄＵ取り込みアッセイにより解析し、Ｓ３Ｔ０．１条件と高サイトカイン（ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ）条件とを比較した。さらに、これら条件について、高酸素（２０体積％ Ｏ２）条件に関しても検討した。
【0132】
その結果、図８に示すとおり、図１～５に示した細胞数についての解析結果と合致して、低サイトカイン濃度においてＥｄＵ陽性細胞は低く抑えられており、造血幹細胞の細胞周期は低回転であることが明らかになった。しかしながら、この時間点において酸素濃度は細胞周期に大きく影響しなかった。
【0133】
次に、上記にて見出したＳ３Ｔ０．１条件下培養した造血幹細胞は、表面マーカーの発現だけではなく、機能的に維持されているかどうかを評価するために、図９に示すように、採取直後（Ｆｒｅｓｈ）の造血幹細胞、又は１４日間若しくは２９日間培養した造血幹細胞各５００個相当をレシピエントマウスに移植（１次移植）した。また、移植してから４ヶ月後のレシピエントマウスから骨髄細胞を回収し、それを別のマウスに移植する、骨髄移植実験（ＢＭＴ、２次移植））も行なった。
【0134】
その結果、図１０に示した結果から明らかなように、Ｓ３Ｔ０．１条件下１４日間培養した造血幹細胞においては、１次移植、２次移植ともに採取直後の造血幹細胞と遜色ない末梢血キメリズムが、いずれの血球分画（ミエロイド、Ｂ細胞、Ｔ細胞）でも認められた。また、Ｓ３Ｔ０．１条件下２９日間培養した造血幹細胞に関し、１次移植において末梢血キメリズムはＦｒｅｓｈ群に劣ったものの、図１１に示した結果から明らかなように、２次移植についてはいずれの分画でもキメリズムに遜色はなかった。
【0135】
＜実施例２＞ マウス由来造血幹細胞を維持するための培養条件（アルブミンの濃度）についての検討
次に、上記にて見出したＳ３Ｔ０．１条件下、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度の造血幹細胞の細胞数への影響について検討した。その結果、図１２に示すとおり、ＢＳＡ低濃度条件（ＢＳＡ １重量体積％（１０ｍｇ／ｍＬ）未満）下では、造血幹細胞は殆ど生存できないということが明らかになった。一方、ＢＳＡ濃度を１．３～４重量体積％（１３～４０ｍｇ／ｍＬ）とする条件下では、造血幹細胞数において大きな違いは認められなかった。しかし、ＢＳＡ１．３重量体積％濃度条件では、余剰な脂質（コレステロール及び脂肪酸）の負荷に対して脆弱であり、負荷した脂質の容量依存的に造血幹細胞の数は減少していった。また、ＢＳＡ高濃度条件（ＢＳＡ １．３重量体積％以上）下において、造血幹細胞数は、４～６重量体積％（４０～６０ｍｇ／ｍＬ）をピークとして、８重量体積％（８０ｍｇ／ｍＬ）では減少が認められた。
次に、上記にて見出したＳ３Ｔ０．１条件下、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度の造血幹細胞の細胞数への影響について検討した。その結果、図１２に示すとおり、ＢＳＡ低濃度条件（ＢＳＡ １重量体積％（１０ｍｇ／ｍＬ）未満）下では、造血幹細胞は殆ど生存できないということが明らかになった。一方、ＢＳＡ濃度を１．３～４重量体積％（１３～４０ｍｇ／ｍＬ）とする条件下では、造血幹細胞数において大きな違いは認められなかった。しかし、ＢＳＡ１．３重量体積％濃度条件では、余剰な脂質（コレステロール及び脂肪酸）の負荷に対して脆弱であり、負荷した脂質の容量依存的に造血幹細胞の数は減少していった。また、ＢＳＡ高濃度条件（ＢＳＡ １．３重量体積％以上）下において、造血幹細胞数は、４～６重量体積％（４０～６０ｍｇ／ｍＬ）をピークとして、８重量体積％（８０ｍｇ／ｍＬ）では減少が認められた。
【0136】
以上の結果から、造血幹細胞を維持するためには、アルブミン２～６重量体積％濃度下で培養することが望ましく、更には４重量体積％前後の濃度が至適であるということが、明らかになった。
【0137】
続いて、上記にて見出した培養条件による、造血幹細胞における遺伝子発現上の変化を調べるため、図１３に示すように、Ｓ３Ｔ０．１条件下７日間培養した造血幹細胞の遺伝子発現を、ｃＤＮＡマイクロアレイによって解析した。なお、当該培養におけるＢＳＡの濃度は４重量体積％とした。さらに、前記４重量体積％ＢＳＡの代わり、脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡを４重量体積％含有した培地で、Ｓ３Ｔ０．１条件下７日間培養した造血幹細胞の遺伝子発現についても解析した。また、比較検討のため、採取直後（Ｆｒｅｓｈ）の造血幹細胞についても解析した。
【0138】
その結果、図１４及び１５に示すとおり、Ｓ３Ｔ０．１条件、４重量体積％ ＢＳＡ又は脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡ存在下では、脂肪酸生合成経路の遺伝子発現がＦｒｅｓｈ群と近いレベルまで抑えられていることが明らかとなり、造血幹細胞の当該培養において、ＢＳＡからは脂肪酸が供給されていることが示唆された。
【0139】
また、４重量体積％ＢＳＡ存在下での培養と、４重量体積％脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡ存在下での培養とを比較した結果、図１６に示すとおり、脂肪酸生合成経路の遺伝子発現は同程度であった。前記図１４及び１５の結果と併せ、造血幹細胞を維持する上で、ＢＳＡは、脂肪酸フリーＢＳＡに脂肪酸（パルミチン酸およびオレイン酸）を担持させたものと置き換えることが可能であることが示唆された。
【0140】
なお、Ｓ３Ｔ０．１条件、脂肪酸を担持させた脂肪酸フリーＢＳＡ存在下での培養を、独立して２回行ない、それらを比較した。その結果、図１７に示すとおり、脂肪酸生合成経路の遺伝子発現は類似しており、再現性を有することが確認された。
【0141】
さらに、図１８に示すとおり、造血幹細胞の未分化性及び細胞周期に関連する遺伝子セットを用いてＧＳＥＡを行ったところ、両遺伝子セットとも、上記方法にて培養した造血幹細胞は、Ｆｒｅｓｈ群と有意差なく、大きな遺伝子変化は認められなかった。
【0142】
＜実施例３＞ マウス由来造血幹細胞を維持するための培養条件（脂肪酸）についての検討
ＢＳＡには、脂肪酸が通常結合している。そして、上記のとおり、造血幹細胞の維持培養において、脂肪酸を供給することがＢＳＡの重要な機能と考えられる。そこで、脂肪酸の組成が、造血幹細胞数に与える影響を評価するため、脂肪酸フリーＢＳＡにパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸の各脂肪酸を様々な比率で混合したものを用い、Ｓ３Ｔ０．１条件下７日間造血幹細胞を培養した。
ＢＳＡには、脂肪酸が通常結合している。そして、上記のとおり、造血幹細胞の維持培養において、脂肪酸を供給することがＢＳＡの重要な機能と考えられる。そこで、脂肪酸の組成が、造血幹細胞数に与える影響を評価するため、脂肪酸フリーＢＳＡにパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸の各脂肪酸を様々な比率で混合したものを用い、Ｓ３Ｔ０．１条件下７日間造血幹細胞を培養した。
【0143】
その結果、図１９に示すとおり、不飽和脂肪酸（オレイン酸、リノール酸）のみを含有する培地では造血幹細胞の生細胞数が著減することが明らかになった。その一方、パルミチン酸を含有していれば、それ以外の脂肪酸の比率は細胞数に大きく影響しないことも明らかになった。したがって、造血幹細胞の維持には、パルミチン酸が重要であると考えられる。
【0144】
さらに、アルブミンに担持させる（再構成する）脂肪酸の濃度による影響を評価するため、様々な量の脂肪酸を再構成させた脂肪酸フリーＢＳＡを用い、造血幹細胞を培養した。その結果、図２０に示すとおり、培養後の総細胞数及び造血幹細胞数は、脂肪酸の濃度依存的に維持され易い傾向にあることが明らかになった。
【0145】
＜実施例４＞ マウス由来造血幹細胞を維持するための培養条件（インスリン）についての検討
上記培養において用いたＳＦ－Ｏ３培地にはインスリンが含有されている。そこで、インスリンによる造血幹細胞への影響を評価するため、インスリン不含の培地（４重量体積％ＢＳＡ含有αＭＥＭ培地）に、インスリン４０００ｎｇ／ｍＬを加え、７日間Ｓ３Ｔ０．１条件下で培養した。その結果、図２１に示すとおり、培養後の造血幹細胞数においてインスリンの有無による違いはなかったが、総細胞数はインスリンが含まれない場合減少することがわかった。
上記培養において用いたＳＦ－Ｏ３培地にはインスリンが含有されている。そこで、インスリンによる造血幹細胞への影響を評価するため、インスリン不含の培地（４重量体積％ＢＳＡ含有αＭＥＭ培地）に、インスリン４０００ｎｇ／ｍＬを加え、７日間Ｓ３Ｔ０．１条件下で培養した。その結果、図２１に示すとおり、培養後の造血幹細胞数においてインスリンの有無による違いはなかったが、総細胞数はインスリンが含まれない場合減少することがわかった。
【0146】
さらに、脂肪酸がより高濃度の条件でインスリンの影響を評価するため、脂肪酸含有ＢＳＡ（ｎＢＳＡ）に、更に脂肪酸を高濃度（８００μｇ／ｍＬ）で添加したものをαＭＥＭに加え、造血幹細胞数をＳ３Ｔ０．１条件下で評価した。その結果、図２２に示すとおり、インスリン濃度依存的に、造血幹細胞数、総細胞数共に、維持され易い傾向にあることが明らかになった。
【0147】
次に、上記にて見出されたマウス由来の造血幹細胞についての培養条件が、ヒトのそれにおいても適用できるか検証するため、凍結ヒトＣＤ３４＋細胞を用いた同様の実験を行った。
【0148】
＜実施例５＞ ヒト由来造血幹細胞を維持するための培養条件（ＳＣＦ及びＴＰＯの濃度）についての検証
先ず、４重量体積％ＢＳＡ存在下におけるヒト由来の造血幹細胞の、サイトカイン濃度への依存性を評価するため、ＳＣＦ及びＴＰＯを様々な濃度で添加して７日間培養し、総細胞数及び造血幹細胞数を評価した。
先ず、４重量体積％ＢＳＡ存在下におけるヒト由来の造血幹細胞の、サイトカイン濃度への依存性を評価するため、ＳＣＦ及びＴＰＯを様々な濃度で添加して７日間培養し、総細胞数及び造血幹細胞数を評価した。
【0149】
その結果、図２３に示すとおり、マウスと同様に、ＳＣＦ及びＴＰＯの濃度が低い場合において、総細胞数が低く抑えられ、造血幹細胞の静止期性と未分化性が維持されていることが明らかになった。また、ヒト由来の造血幹細胞においては、ＴＰＯの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ以上であることが望ましいことも明らかとなった。
【0150】
続いて、ヒト造血幹細胞を１カ月間培養した際の造血未分化細胞数及び総細胞数を計測した。その結果、図２４に示すとおり、ＳＣＦの濃度を３ｎｇ／ｍＬとし、ＴＰＯの濃度を３ｎｇ／ｍＬとする培養条件下で、総細胞数及び未分化細胞数が維持され易いことが明らかになった。
【0151】
＜実施例６＞ ヒト由来造血幹細胞を維持するための培養条件（アルブミン）についての検証
ヒト由来造血幹細胞維持のアルブミンへの依存性を検証するために、ＢＳＡの存在下、非存在下で、ヒト造血幹細胞を培養した。その結果、図２５に示すとおり、ＢＳＡ非存在下では、総細胞数及び造血幹細胞数はいずれも減少した。一方、ＢＳＡ存在下では、細胞数が維持されており、ヒト由来造血幹細胞の維持においても、アルブミンが必須であることが明らかになった。
ヒト由来造血幹細胞維持のアルブミンへの依存性を検証するために、ＢＳＡの存在下、非存在下で、ヒト造血幹細胞を培養した。その結果、図２５に示すとおり、ＢＳＡ非存在下では、総細胞数及び造血幹細胞数はいずれも減少した。一方、ＢＳＡ存在下では、細胞数が維持されており、ヒト由来造血幹細胞の維持においても、アルブミンが必須であることが明らかになった。
【0152】
次に、ヒト由来造血幹細胞維持の、脂肪酸又はコレステロールへの依存性を評価するため、コレステロールの存在下、非存在下、様々な量の脂肪酸を再構成させたＢＳＡを用いてヒト造血幹細胞を培養した。
【0153】
その結果、図２６に示すとおり、培養後の総細胞及び造血幹細胞ともに、コレステロールが存在している場合の方が、それらの数が維持され易い傾向にあることが明らかになった。さらに、脂肪酸については、２５０～５００μｇ／ｍＬの濃度にて添加することによって、細胞数が維持され易いことが明らかになった。その一方で、高濃度では細胞数が減少し易い傾向にあることも判った。また、これらの傾向は、コレステロール非存在下においてより顕著に認められた。
【0154】
次に、添加する脂肪酸をより低濃度とした場合の、ヒト由来造血幹細胞への影響を評価するため、コレステロールの存在下、非存在下、１００～４００μｇ／ｍＬの脂肪酸を、脂肪酸フリーＢＳＡ又は（脂肪酸含有）ＢＳＡに結合させたものを用い、ヒト由来造血幹細胞を培養した。その結果、図２７に示すとおり、コレステロールの存在下、ＢＳＡに１００～２００μｇ／ｍＬの脂肪酸を添加した場合、造血幹細胞は最も維持され易いことも明らかになった。
【0155】
＜実施例７＞ ヒト由来造血幹細胞を維持するための培養条件（インスリン）についての検証
ヒト由来造血幹細胞維持における、インスリンの影響を評価するために、いくつかのＳＣＦ、ＴＰＯ濃度条件下のもと、インスリンの濃度を変えてヒト造血幹細胞を培養した。その結果、図２８に示すとおり、インスリンが添加されることによって、濃度依存的に、総細胞数及び造血幹細胞数は維持され易くなることが明らかになった。
ヒト由来造血幹細胞維持における、インスリンの影響を評価するために、いくつかのＳＣＦ、ＴＰＯ濃度条件下のもと、インスリンの濃度を変えてヒト造血幹細胞を培養した。その結果、図２８に示すとおり、インスリンが添加されることによって、濃度依存的に、総細胞数及び造血幹細胞数は維持され易くなることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0156】
以上説明したように、本発明によれば、造血幹細胞を、静止期にて、未分化性（多分化能及び自己複製能）を維持させたまま、長期間培養することができる。したがって、本発明は、白血病等の造血機能に関する疾患についての創薬ターゲットのスクリーニング、及び当該疾患の治療等に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
