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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-27
(45)【発行日】2023-02-06
(54)【発明の名称】抗ウイルス活性効能を有するペプチド及びこれを含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/45 20060101AFI20230130BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230130BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230130BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230130BHJP
【ＦＩ】
A61K38/45 ZNA
A61P31/14
A61P31/20
C07K14/47
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021124055
(22)【出願日】2021-07-29
(62)【分割の表示】P 2017567630の分割
【原出願日】2016-07-04
(65)【公開番号】P2021175746
(43)【公開日】2021-11-04
【審査請求日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】10-2015-0094840
(32)【優先日】2015-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2015-0115671
(32)【優先日】2015-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514286826
【氏名又は名称】ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド
(73)【特許権者】
【識別番号】514286848
【氏名又は名称】キム サン チェ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】キム サン チェ
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１４－００３７６９８（ＫＲ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１６７５７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５１５４９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１９３８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５２０２９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５００２７９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するペプチドからなる群より選ばれる一つ以上を有効成分として含む、ウイルス性疾病を予防又は治療するための抗ウイルス用組成物であって、ＨＳＰ９０によって媒介される、ウイルスの複製抑制、転写抑制、再活性化抑制、抗原発現抑制、及びビリオン（Virion）形成抑制からなる群より選ばれる一つ以上によりウイルスを抑制し、前記ウイルスが、レトロウイルス科（retroviridae family）、フラビウイルス科（Flaviviridae family）、及びヘパドナウイルス科（HepaDNAviridae family）からなる群より選ばれる一つ以上に属する、抗ウイルス用組成物。
【請求項2】
前記組成物中の前記ペプチドの濃度は、０．０００１～１００μＭである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項3】
前記ペプチドの一日投与量は、０．０１μｇ／ｋｇ／日～１０ｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項4】
前記組成物は、薬学組成物である、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項5】
前記ペプチドは、標識物質とコンジュゲートした形態で含まれる、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項6】
前記標識物質は、蛍光物質又は照影物質である、請求項５に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項7】
前記蛍光物質は、ＦＩＴＣである、請求項６に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項8】
請求項１～７のうちいずれか一項に記載の抗ウイルス用組成物、及びウイルス性疾病の予防及び治療のための指示書を含む、ウイルス性疾病の予防及び治療用キットであって、前記抗ウイルス用組成物が、ＨＳＰ９０によって媒介される、ウイルスの複製抑制、転写抑制、再活性化抑制、抗原発現抑制、及びビリオン（Virion）形成抑制からなる群より選ばれる一つ以上によりウイルスを抑制し、前記ウイルスが、レトロウイルス科（retroviridae family）、フラビウイルス科（Flaviviridae family）、及びヘパドナウイルス科（HepaDNAviridae family）からなる群より選ばれる一つ以上に属する、キット。
【請求項9】
前記ウイルス性疾病の予防及び治療は、前記抗ウイルス用組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、又はウイルスによる病理学的症状を示す個体に投与することを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
請求項１～７のうちいずれか一項に記載の抗ウイルス用組成物の製造のための、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、及び前記アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するペプチドからなるペプチドから選択されるペプチドの使用であって、前記抗ウイルス用組成物が、ＨＳＰ９０によって媒介される、ウイルスの複製抑制、転写抑制、再活性化抑制、抗原発現抑制、及びビリオン（Virion）形成抑制からなる群より選ばれる一つ以上によりウイルスを抑制し、前記ウイルスが、レトロウイルス科（retroviridae family）、フラビウイルス科（Flaviviridae family）、及びヘパドナウイルス科（HepaDNAviridae family）からなる群より選ばれる一つ以上に属する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、抗ウイルス活性効能を有するペプチド及びこれを含む組成物に関し、より詳しくは、テロメラーゼに由来のペプチドを含み、ウイルスの自己複製及び活性を抑制することにより、ウイルスによる疾病の治療に効果的なウイルス性疾病の予防及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
抗ウイルス活性は、ウイルスタンパク質又はその一部を、直接認識して攻撃する方法、ウイルスのライフサイクルの各段階を阻害する方法、免疫を増進する方法等に分けられる。ウイルスのライフサイクルの各段階を阻害する方法は、各段階に応じて様々に分類できる。例えば、宿主細胞への侵入前段階を阻害するウイルス剤として、ウイルスが、細胞に侵入する段階を妨害する侵入阻害剤（entry-inhibitor）、侵入遮断剤（entry-blocking agent）、又はウイルスの浸透（penetration）及び脱殻（uncoating）ブロッキング剤が可能である。また、ウイルスが、宿主細胞内へ侵入した後に、宿主細胞内でウイルスの複製を行う段階における抗ウイルス活性が可能であるが、この例として、ウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡのビルディングブロックと類似であるものの、ＲＮＡ、ＤＮＡの複製酵素を不活性化するヌクレオチド又はヌクレオシドの誘導体を通じて、ウイルスの複製を抑制する方法がある。代表的に、逆転写酵素阻害剤が挙げられる。その次の段階として、合成されたウイルスのＤＮＡを切断するためのインテグラーゼ（integrase）酵素を抑制するか、又はウイルスの転写、翻訳、翻訳後修飾、又はその後のターゲッティングを抑制する方法がある。その他にも、ウイルスのプロテアーゼ（protease）を阻害するか、ウイルスのアッセンブリー段階を遮断するか、最終段階の宿主細胞からウイルスの放出段階（release phase）を遮断する方法が可能である。前記のような、ウイルスに対する直接作用でない、ウイルスによる多様な症状を緩和する薬剤も可能である。例えば、ウイルスにより誘発された炎症を緩和する抗炎症剤、ウイルスにより誘発された高熱を下げる解熱剤などが可能であるが、これは、ウイルスに対する根本的な治療剤とは言えない。
【0003】
ウイルスは、細菌より小さいサイズの伝染性病原体である。遺伝物質であるＲＮＡ又はＤＮＡと、その遺伝物質を囲んでいるタンパク質とから構成される。自らは物質代謝ができないため、自分のＤＮＡやＲＮＡを、宿主細胞内に浸透させた後、浸透された細胞の小器官を利用して、自分の遺伝物質を複製し、自分自身と同様のウイルスを産生する。この過程において、宿主細胞が損傷されるか、破壊されることにより、宿主に疾病を引き起こすこともある。
【0004】
１９８９年に初めて究明されたＣ型肝炎ウイルス（Hepatitis C Virus、以下、ＨＣＶという）は、フラビウイルス科（Flaviviridae） に属し、約９．５ｋｂの遺伝子（genome）サイズを有す陽性一本鎖のＲＮＡウイルスである。初期感染の時には症状がなく、約５５～８５％の患者において、慢性肝炎（chronic hepatitis）へ進行し、この中で約５～１０％の患者は、肝硬変症（liver cirrhosis）に進み、次に肝癌に進行する。
【0005】
ＨＣＶは、その遺伝子の塩基配列の差異によって、大きく６個の遺伝子型に区分され、治療に対する反応等、臨床的差異が報告されている。地域によって、ＨＣＶ遺伝子型分布の差が知られており、韓国内では、１ｂ及び２ａが主種であるという一部の報告があったが、十分な資料があるわけではない。ＨＣＶは、感染後、他のウイルスに比べて、突然変異率が高く、ストランド数が６本ともなり、単一ストランド内にも多くの擬似種（quasi-species）を作る。このような性質により、ＨＣＶは、単一治療剤が耐性を誘発すると予想され、様々な治療剤の複合治療が必要な実情である。したがって、ＨＣＶによる肝疾患の予防及び治療が可能な、より安定的で効果的な研究及び治療剤の開発が緊急な実情である。
【0006】
ＨＣＶは、ウイルス感染の後、自己自身の遺伝体を気質にして、３，０３０個のアミノ酸からなる一つの複合タンパク質を作製する。特に、ＨＣＶが複製するにあたって、５’非翻訳領域（untranslated region, ＵＴＲ）と、３’ＵＴＲとが、非常に重要な役割を果たしていると知られている。５’ＵＴＲの場合、ＨＣＶストランドにおいて非常に保存されている内部リボソーム進入点（internal ribosome entry site, ＩＲＥＳ）を有していることで、キャップ非依存的（cap-independent）翻訳過程が行われる。感染後、まず、生成された複合タンパク質は、宿主とウイルスのプロテアーゼにより加工され、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２などの構造タンパク質と、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂなどのようなウイルス増殖に必要な調節タンパク質から作られるようになる。
【0007】
抗ＨＣＶ製剤として、最近まで活発に開発が進まれているものは、主にＨＣＶをターゲットにした阻害剤であって、ＮＳ３プロテアーゼと、ＮＳ５Ｂポリメラーぜ（polymerase）とがある。このようなウイルス特異酵素をターゲットにすることは、２００３年にベーリンガーインゲルハイム（Boehringer-Ingelheim）のＮＳ３プロテアーゼをターゲットにした薬物の臨床１相実験の結果が、ネイチャー雑誌に報告されてから知られている。しかし、ＮＳ３は、その構造上、薬物が浸透し難いので、基本構造に基づいた薬物のデザインに困っている反面、ＮＳ５Ｂは、典型的なポリメラーぜ構造である親指‐掌‐指（thumb-palm-finger）の形をしており、活性部位の他にも、非‐ヌクレオシド抑制剤（non-nucleoside inhibitor）をデザインできる可能性を持っていることが分かった。最近、ＨＣＶをターゲットにする治療法の開発でない、宿主をターゲットにする治療剤の開発が進行されている。
【0008】
また、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B Virus, 以下、ＨＢＶという）の感染は、大きく無症状感染、慢性感染、肝硬変、肝細胞癌に移行する様々な臨床経過を示し、慢性疾患への移患率及び死亡率を増加させる。ＨＢＶ保菌者は、全世界的に約３億５千万名が分布している程度に、ＨＢＶ由来の肝疾患は、人類の健康への脅威となる疾患であって、全肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, ＨＣＣ）の発生原因の５３％を占めているＨＢＶは、ＨＣＶ及び他の原因と共に、肝細胞癌を誘発する主要因子である。
【0009】
ＨＢＶは、３種のエンベロープ （envelope）タンパク質を生成し、これらは、全てｐｒｅ-Ｓ／Ｓオープンリーディングフレーム（open reading frame）でコードされる。ＨＢＶラージ表面タンパク質（large surface proteins, LHBs）の役割は、明らかになっていない。
【0010】
既存の標準肝癌及び抗ウイルス治療法では、肝硬変症がないか、残存の肝機能が十分である場合、肝切除術が優先的に考慮されており、肝機能障害が同伴された場合、肝移植が一次治療として考慮されるが、肝細胞癌患者の大部分が、門脈圧亢進症、肝機能低下、多発性腫瘍、門脈浸湿、高齢などの理由で、施術が困難である。非手術的治療法では、高周波熱治療術と、エタノール注入術とが、主に使用されているが、腫瘍のサイズが大きな場合、治療成功率が低い。
【0011】
このように、主に手術及び熱治療などに依存しており、抗癌化学療法の治療率が、非常に低く、代替薬物の開発を要する。国内の場合、特にＨＢＶ由来の肝細胞癌が多くて、Ｂ型ウイルス由来の慢性肝炎の先制的治療が求められ、Ｂ型肝炎を伴った肝細胞癌の場合、肝炎の治療が先制的又は同時に進行する場合、肝癌治療の成功率が増加する。特に、慢性肝炎及び肝硬化により、肝細胞癌が発生した場合、肝細胞癌の治療の後にも、これによる再発が非常に高く、このような慢性的炎症の治療が、同時に行わなければならず、国内に排他的に存在するＨＢＶ遺伝子Ｃ型による肝癌の発生及び進行に特化された慢性肝炎及び肝細胞癌への治療戦略が求められる。これに従い、既存には、インターフェロン及びラミブジンが、抗ウイルス剤で、慢性Ｂ型肝炎の治療剤として使用されたが、副作用及び低い反応性を示し、最近、アデホビル（Adefovir）、テノホビル（Tenofovir）などが開発され、ウイルスの増殖を抑制することにより、肝の損傷を緩める薬物として用いられている。このような薬物は、ウイルスの増殖を抑制して、肝の損傷を緩和する効果を有しているものの、完全にウイルスを除去するか、肝炎を治療することはできない。したがって、持続的な処方が必要であるので、耐性が現れるようになり、薬物本然の特性により、肝毒性と腎毒性を示す。現在、臨床的に使用中の唯一の肝癌標的治療剤であるソラフェニブ （sorafenib）は、制限的な治療範囲と、綿密な治療推移の観察が要求される限界とを持っているため、全世界的に、新しい肝癌標的治療剤の開発に関する研究が進行中である。開発中の大多数の物質は、多重キナーゼ阻害剤であるソラフェニブに由来のキナーゼ阻害剤、又は肝癌の進行に必須的な血管生成を阻害する血管新生抑制剤（angiogenic inhibitor）である。ＨＣＣ患者の６６％において過発現することが知られた表皮細胞成長因子受容体（epidermal growth factor receptor）阻害剤は、臨床２相実験の結果、有意すべき結果を得られなかった。血管新生の抑制を目標として開発された低分子チロシンキナーゼ阻害剤であるブリバニブ（brivanib）、及び単一クローン抗体であるラムシルマブ（ramucirumab）などは、臨床２相においてよい結果を得られなかった。ＨＣＣ患者の４０～５０％において、ｍＴＯＲシグナル伝達システムの異常が報告されており、エベロリムス（everolimus）を始めたｍＴＯＲ阻害剤が、ソラフェニブ不応性患者を対象にして進行された臨床３相実験に進入したが、プラセブ（placebo）に比べて、意味のある効果があることを立証できなかった。新しい治療戦略として、ｃ‐ＭＥＴ、ＭＥＫ阻害低分子物質を用いたＨＣＣ治療剤の開発も試みている。
【0012】
現在、開発が進行中である大多数の新規の治療物質は、臨床実験の初期段階への進入水準にあり、臨床が仕上がっていく薬物の場合、１次薬物としては使えないか、既存のソラフェニブと併用して使用しなければ、有意な効果が得られない。したがって、開発が進行中であるこれらの既存の薬物とは異なるメカニズムで働き、肝癌患者において有意な効果があると同時に、肝炎の進行を抑制する新規薬物の開発は、関連の肝疾患の治療に革新的な発展を図ることができるようにすると期待される。
【0013】
既存の薬物は、全身的抗癌療法において、大部分の抗癌剤が、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療効能を示すのに失敗し、ソラフェニブの場合のみが、約二ヶ月程度の生存期間の延長効果を示した。このようなソラフェニブの場合も、１次治療では考慮されていない。したがって、既存の製品を代替し、治療不応の患者に使用できるＨＣＣに特化された専門抗癌剤の開発が求められている。
【0014】
一方、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、以下、ＨＩＶ）は、レトロウイルス（retroviridae）科（family）レンチウイルス（Lentivirus）属（genus）に属するウイルスである。レンチウイルスは、様々な生物種に感染でき、長い潜伏期の慢性疾患を引き起こす原因体という特徴がある。
【0015】
ＨＩＶのライフサイクルは、大きく宿主細胞に侵入する段階、そして細胞内で複製及び転写をする段階、ウイルスが組換える段階、最終的に、ウイルスが合成され、細胞の外部に分泌される段階に分けられる。このようなＨＩＶの増殖過程のうちいずれか一つの段階を遮断すると、ＨＩＶを抑制することができる。
現在、治療剤として開発され、患者に使っている薬剤は、複合抑制剤（fusion inhibitors）、ＲＮＡからＤＮＡに変える逆転写酵素抑制剤（reverse transcriptase inhibitors）、タンパク質が切断される過程を、プロテアーゼにより遮断する薬物であるプロテアーゼ抑制剤（protease inhibitors）からなる。
現在、治療剤として開発され、患者に使っている薬剤は、複合抑制剤（fusion inhibitors）、ＲＮＡからＤＮＡに変える逆転写酵素抑制剤（reverse transcriptase inhibitors）、タンパク質が切断される過程を、プロテアーゼにより遮断する薬物であるプロテアーゼ抑制剤（protease inhibitors）からなる。
【0016】
抗ＨＩＶ治療の目標は、ＨＩＶを強力に抑制して、増殖できない状態にし、このような状態を、可能であれば、長期間維持することにより、患者の免疫能を回復させ、ＨＩＶ感染症を発生する移患率と死亡率とを減らすことである。しかし、抗ＨＩＶ治療を中断すると、ＨＩＶがさらに現れ、免疫能もまた低下するため、一度治療を始めたら、途中で中断できないことが、現在使用されている抗ＨＩＶ治療の限界である。抗ＨＩＶ治療は、少なくとも数年間に、完治法が開発されなければ、数十年間続けなければならないかも知れない問題があり、この問題は、患者に経済的な負担はもとより、薬物の長期間投与による副作用を甘受すべきことを意味し、特に薬物の副作用は、現在知られている副作用だけでなく、使用期間が長くなるにつれ、将来知られる副作用があり得ることを考慮すべき実情である。また、長い間、薬物をまともに服用することは、容易でないため、ＨＩＶが、薬剤耐性を獲得することにより、治療が困難になることも、現在、抗ＨＩＶ薬剤が抱えている大問題であると言える。したがって、既存の治療剤の様々な短所を克服し、ＨＩＶウイルス自体に抑制効果を有しながら、免疫細胞の活性を増強できる新しい概念の治療剤を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
一態様において、本発明の目的は、効果的でありながら、同時に副作用のない抗ウイルス及びウイルス性疾病の予防及び治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0018】
本発明の一態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドからなる群より選択される一つ以上を、有効成分として含む、抗ウイルス用組成物が提供される。
【0019】
本発明の一態様による組成物において、前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸から構成されたフラグメントであってもよい。
【0020】
本発明の一態様による組成物において、前記組成物は、ウイルスの複製を抑制することにより、対象のウイルスを抑制することをさらに特徴とする。
【0021】
本発明の一態様による組成物において、前記ウイルスの複製は、ＨＳＰ９０を媒介にすることをさらに特徴とする。
【0022】
本発明の一態様による組成物において、前記ウイルスは、ＨＣＶ、ＨＢＶ、又はＨＩＶを含むことをさらに特徴とする。
【0023】
本発明の他の一態様によると、薬学的に有効な量の本発明による組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、ウイルスによる病理学的症状を示す個体に投与する段階を含む、ウイルス性疾病の予防及び治療方法が提供される。
【0024】
本発明の他の一態様によると、前記ウイルス性疾病の予防及び治療方法を含むウイルス性疾病の予防及び治療方法が記載されている指示書を含む、ウイルス性疾病の予防及び治療用キットが提供される。
【0025】
本発明の他の一態様によると、抗ウイルス用組成物の製造のための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドの使用が提供される。
【0026】
本発明の一態様による抗ウイルス用組成物の製造用途において、前記組成物は、ウイルスのＲＮＡ複製を抑制することにより、対象のウイルスを抑制することをさらに特徴とする。
【0027】
本発明の一態様による抗ウイルス用組成物の製造用途において、前記ウイルスは、ＨＣＶ、ＨＢＶ、又はＨＩＶを含むことをさらに特徴とする。
【0028】
本発明の他の一態様によると、ウイルス性疾病の予防及び治療用の薬学的組成物の製造のための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドの使用が提供される。
【0029】
本発明の一態様によるウイルス性疾病の予防及び治療用の薬学的組成物の製造用途において、前記組成物は、ウイルスのＲＮＡ複製を抑制することにより、対象のウイルスを抑制することをさらに特徴とする。
【0030】
本発明の一態様によるウイルス性疾病の予防及び治療用組成物の製造用途において、前記ウイルスは、ＨＣＶ、ＨＢＶ、又はＨＩＶを含むことをさらに特徴とする。
【発明の効果】
【0031】
本発明の一態様による配列番号の配列を有するペプチド、又は前記配列と８０％の相同性を有する配列を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドは、抗ウイルス抑制効能を有するので、ウイルス性疾病の治療又は予防法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１は、ＪＦＨ‐１細胞株において、ビヒクル（vehicle）、既存の抗酸化剤（ＮＡＣ（２０ｍＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）、ビタミンＥ（１０μＭ））と、濃度の異なるＰＥＰ１と共に、それぞれ２時間培養し、ＲＯＳの生成程度を測定して示したグラフである。
【図2】図２は、ＪＦＨ‐１細胞株を、ビヒクル、ＰＥＰ１、ＮＡＣ（２０ｍＭ ）、 ＰＤＴＣ（１００μＭ）、及びビタミンＥ（１０μＭ）で２時間処理した後、 ＨＳＰ９０、ｐ‐ｐ‐３８、ｐ３８、ｐ-ＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐ‐ＥＲＫ、ＥＲＫ、及びＧＡＰＤＨに特異的な抗体で免疫ブロット分析を行った写真である。
【図3】図３は、ＪＦＨ‐１細胞株にアイソタイプ（isotype）、抗ＨＳＰ７０抗体、抗ＨＳＰ９０抗体を処理したものに、ＰＥＰ１を投与したとき、対照群（ＤＭＳＯ、vehicle）を処理したものと対比して、ＲＯＳの生成比率を示したグラフである。
【図4】図４は、ＪＦＨ‐１細胞株にアイソタイプ（isotype）、抗ＨＳＰ７０抗体、抗ＨＳＰ９０抗体を処理したものに、抗酸化剤であるＰＤＴＣを投与したとき、対照群（ＤＭＳＯ、vehicle）を処理したものと対比して、ＲＯＳの生成比率を示したグラフである。
【図5】図５は、ＪＦＨ‐１細胞株に対照群（ＤＭＳＯ、vehicle）、ＨＳＰ７０抑制剤であるＫＮＫ（１０μＭ）、ＨＳＰ９０抑制剤である１７ＡＡＧ（１μＭ）を処理したものに、ＰＥＰ１を投与したとき、対照群（ＰＢＳ）と対比して、ＲＯＳの生成比率を示したグラフである。
【図6】図６は、ＪＦＨ‐１細胞株に対照群（ＤＭＳＯ、vehicle）、ＨＳＰ７０抑制剤であるＫＮＫ（１０μＭ）、ＨＳＰ９０抑制剤である１７ＡＡＧ（１μＭ）を処理したものに、抗酸化剤であるＰＤＴＣを投与したとき、対照群（ＰＢＳ）と対比して、ＲＯＳの生成比率を示したグラフである。
【図9】図９は、ＪＦＨ‐１細胞株で、抗酸化剤ＰＤＴＣを処理したとき、ＨＳＰ９０の発現濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡを用いて、対照群（ＰＢＳ）の処理時と比較して示したグラフである（エラーバーは、平均の標準エラー（ＳＥＭ）を示す。ビヒクル対照群と比較して、＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１である。Ｐ値は、独立二票本ｔ検定に基づいて得ており、結果は、２回～５回の独立的実験の代表値である）。
【図10】図１０は、ＪＦＨ‐１細胞株で、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）‐コンジュゲートしたＰＥＰ１（ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１）と共に２時間、ＭｂＣＤ（５ｍＭ ）を培養の後、細胞をフローサイトメーターにより分析、測定したグラフであり、結果は、３回の独立的実験の代表値である。
【図11】図１１は、ＪＦＨ‐１細胞株で、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１（ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１）と共に２時間、抗ＬＲＰ１抗体と培養の後、細胞をフローサイトメーターにより分析、測定したグラフであり、結果は、３回の独立的実験の代表値である。
【図12】図１２は、ＪＦＨ‐１細胞株で、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１ （ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１）と共に２時間、ＬＲＰ１ ｓｉＲＮＡ（２００ｎＭ）と培養の後、細胞をフローサイトメーターにより分析、測定したグラフであり、結果は、３回の独立的実験の代表値である。
【図13】図１３は、ＪＦＨ‐１細胞株で、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１（ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１）と共に２時間、ＰＤＴＣと培養の後、細胞をフローサイトメーターにより分析、測定したグラフであり、結果は、３回の独立的実験の代表値である。
【図14】図１４は、ＪＦＨ‐１細胞株で、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１ （ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１）と共に２時間 、Ｈ２Ｏ２と培養の後、細胞をフローサイトメーターにより分析、測定したグラフであり、結果は、３回の独立的実験の代表値である。
【図15】図１５は、ＪＦＨ‐１細胞株を、ＰＥＰ１（１０μＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）又はＰＢＳで２時間処理する前に、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＬＲＰ１ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、ＤＣＦ－ＤＡ方法を用いて、ＲＯＳの生成を測定したグラフである（エラーバーは、ＳＥＭを示す。スクランブル対照群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１である。Ｐ値は、独立二票本ｔ検定に基づいて得ており、結果は、３回の独立的実験の代表値である）。
【図16】図１６は、ＪＦＨ‐１細胞株を、ＰＥＰ１、ＮＡＣ（２０ｍＭ ）、ＰＤＴＣ （１００μＭ）及びビタミンＥ（１０μＭ）で４８時間培養したとき、ＨＣＶのＮＳ２の転写量を、定量的ＰＣＲで測定して、イン・ビトロ（in vitro）でＰＥＰ１の抗ＨＣＶの活性を測定した結果を示す。
【図17】図１７は、ＪＦＨ‐１細胞株を、ＰＥＰ１（１０μＭ）が存在する状況で、 抗ＨＳＰ７０抗体、抗ＨＳＰ９０抗体、又はアイソタイプ（isotype）と共に、２時間培養した後、ＮＳ２の転写量を測定した結果を示す。
【図18】図１８は、ＪＦＨ‐１細胞株を、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＬＲＰ１ｓｉＲＮＡで１８時間トランスフェクションした後、ＰＥＰ１（１０μＭ）又はＰＢＳで２時間処理した結果を示す（エラーバーは、平均のＳＥＭを示す。ビヒクル又はＰＢＳ対照群と比較して、＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。Ｐ値は、独立二票本ｔ検定に基づいて得ており、結果は、３回又は４回の独立的実験の代表値である）。
【図20】図２０は、慢性ＨＣＶ感染患者の肝組織におけるＨＳＰ９０（赤色）の免疫蛍光染色で、核は、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色（counterstain）し、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）患者又はＢ型肝炎患者から得た肝組織を対照群として用いた。
【図23】図２３は、ＰＥＰ１のＨＩＶ‐１ウイルス産生への影響を示したことで、ＨＩＶ‐１に感染されたＭＴ‐４細胞を、増加する濃度別のＰＥＰ１で処理した結果を示す（上清でウイルス性粒子（viral particle）の量は、ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定した）。
【図24】図２４は、ＰＥＰ１のｅＧＦＰ発現への影響を示したことで（ｅＧＦＰは、ＨＩＶ‐１Ｎｅｆと共に発現する）、ＨＩＶ-4で感染したＭＴ‐４細胞を、増加する濃度別のＰＥＰ１で処理し、ｅＧＦＰの発現は、蛍光顕微鏡でモニターした結果を示す。
【図25】図２５は、ＨＩＶ‐１ウイルス性粒子生成の抑制を示したことで、ＨＩＶ‐１で感染されたＭＴ‐４細胞を、濃度を段階別に増加させたＡＺＴ又はＰＥＰ１で処理して、上清のウイルス性遺伝物質（viral genomes）のレベルを、ＲＴ‐ｑＰＣＲを用いて測定した。
【図26】図２６は、ＰＥＰ１のＨＩＶ‐１感染‐関連の細胞死滅から細胞の保護効果を示したことで、ＭＴ‐４細胞（１ｘ１０４個）は、ＨＩＶ‐１ウイルス（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０）で感染されたことであり、ＡＺＴで５日間処理し、細胞活性（viability）は、ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定した（データは、平均（means）±ＳＤ（標準偏差）と代表表記した）。
【図27】図２７は、ＰＥＰ１のＨＩＶ‐１感染‐関連の細胞死滅から細胞の保護効果を示したことで、ＭＴ‐４細胞（１ｘ１０４個）は、ＨＩＶ‐１ウイルス（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０）で感染されたことであり、ＰＥＰ１で５日間処理し、細胞活性（viability）は、ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定した（データは、平均（means）±ＳＤ（平均エラー）と代表表記した）。
【図28】図２８は、追加時間（Time-of-addition）アッセイであって、ＰＥＰ１を含んだ指名の抗‐ＨＩＶ‐１薬物を、ＨＩＶ‐１で感染されたＭＴ‐４細胞に、感染後、それぞれ異なる時間帯（time point）別に処理し、ＨＩＶ‐１の複製は、ＨＩＶ‐１感染の５日後、ｐ２４ＥＬＩＳＡで評価したことを示す。
【図30】図３０は、ＰＥＰ１のＨＩＶ‐１ウイルス性ｍＲＮＡ合成の抑制を示したことで、ＭＴ‐４細胞は、ＨＩＶ‐１により感染され、ビヒクル又は抗ウイルス薬物は、表示された時間帯に処理し、ウイルス性ｍＲＮＡは、ＲＴ‐ｑＰＣＲにより測定したことである（データは、平均（means）±ＳＤ（平均エラー）と代表表記した。＊は、ＤＭＳＯ対比ｐ＜０．０５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であることを表す）。
【図38】図３８は、ＭＴ‐４細胞を、ＮＦ‐κＢ蛍ルシフェラーゼ及びＣＭＶ‐プロモータレニラ（renilla）ルシフェラーゼリポータープラスミドで感染させ、その後、ＨＩＶ‐１（１ｘ１０６ＣＣＩＤ５０）で感染した後、指名された化合物で２４時間処理した後、二重（dual）‐ルシフェラーゼ アッセイを実施した結果を示す（データは、平均（means）±ＳＤ（標準偏差）と代表表記した。＊＊＊は、ＤＭＳＯ対比ｐ＜０．００１であることを表す）。
【図39】図３９は、ＭＴ‐４細胞を、ＨＩＶ‐１で感染させ、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１を、図３８で述べたように処理し、感染の後、２４時間後に、核分画（nuclear fraction）を抽出して、ＥＭＳＡアッセイ（electrophoretic mobility shift assay）を実施した結果を示す。
【図41】図４１は、ＡＣＨ‐２細胞を、ＴＮＦ‐α（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＰＭＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）（５０ｎＭ）を用いて１時間刺激し、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１を２４時間後処理した後、細胞を、抗ｐ６５ＮＦ‐κＢ抗体及びＡｌｅｘａ‐蛍光５９４‐コンジュゲートした２次抗体で透過した後、簡略なＤＡＰＩ核の染色後、共焦点顕微鏡で観察したことを示す。
【図42】図４２は、ＭＴ‐４細胞を、ＮＦ‐κＢ蛍ルシフェラーゼ及びＣＭＶ‐プロモータレニラ（renilla）ルシフェラーゼリポータープラスミドで感染させた後、細胞を、指名された抗体（１０ｎｇ／ｍｌ）又は１７‐ＡＡＧ（1μＭ）でＨＩＶ‐感染の前に１時間処理し、ＨＩＶ‐感染後、細胞をＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１で２４時間処理し、二重‐ルシフェラーゼ アッセイを実施した結果を示す（データは、平均（means）±ＳＤ（平均エラー）と代表表記した。＊＊＊は、ＤＭＳＯ対比ｐ＜０．００１であることを表す）。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明は、一態様において、多様な変換を加えてもよく、様々な実施例を有してもよい。以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に限定することではなく、本発明の一態様による思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明を説明するにあたって、関連の公知技術に関する具体的な説明が、本発明の一態様による要旨を曖昧にする恐れがあると判断する場合、その詳細な説明を省略する。
【0034】
テロメア（telomere）は、染色体の末端に繰り返して存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や他の染色体との結合を防止すると知られている。テロメアの長さは、細胞が分裂する度に、少しずつ短くなって、一定の回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死になる。その反面、テロメアを長くすると、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が過発現され、テロメアが短くなることを防ぐため、癌細胞が死ぬことなく、増殖し続けることができると知られている。本発明者らは、テロメラーゼに由来のペプチドが、抗ウイルス及びウイルス関連疾病の予防及び治療に効果的であることを確認し、本明細書を完成するに至った。
【0035】
ＨＳＰ９０タンパク質は、分子シャペロン（molecular chaperone）の一つで、細胞の成長、分化、生存に関連した多様なタンパク質の安定化及び活性、特にストレス環境の下で恒常性を担当する。ＨＳＰ９０は、「細胞内ＨＳＰ９０（intracellular HSP90）」と呼ばれるｉＨＳＰ９０として細胞内に存在するだけではなく、「細胞外ＨＳＰ９０（extracellular HSP90）」と呼ばれるｅＨＳＰ９０として細胞外にも存在する。興味深く、排出されたＨＳＰ９０及び細胞の表面ＨＳＰ９０が、がん細胞で観察され、これらの細胞外ＨＳＰ９０（ｅＨＳＰ９０）タンパク質は、癌の成長及び血管新生（angiogenesis）を促進する。癌細胞でない細胞も、様々な環境条件、例えば、熱、低酸素、飢餓、及びサイトカインの存在の下で、ｅＨＳＰ９０を生成する。ｅＨＳＰ９０は、ｉＨＳＰ９０とは異なる機能を発揮し、多様な細胞の表面タンパク質と相互作用をして、細胞シグナリング経路を調節することができる。
【0036】
本発明者らは、ＨＳＰ９０が、癌、硬化症、及びウイルス感染のような多数の病理学的症状と関連していることを確認した。ＨＳＰ９０と結合できる分子には、癌化、浸湿性及び転移と関連した多数のタンパク質を含むことを確認し、したがって、ＨＳＰ９０は、癌の治療剤として有力なターゲットになれることを確認した。
【0037】
本発明は、一態様において、ＰＥＰ１ペプチドと知られているｈＴＥＲＴ由来の１６ｍｅｒペプチド（611-EARPALLTSRLRFIPK-626、配列番号１）が、タンパク質の恒常性に重要な役割を果たしているＨＳＰ９０と相互作用をし、細胞のシグナルを調節することにより、抗ウイルス効果を示すことを確認したことである。
【0038】
本発明の他の一態様において、前記抗ウイルス効果は、ウイルスの複製抑制、転写抑制、再活性化抑制、及びビリオン（Virion）の形成抑制からなる群より選択される一つ以上によりウイルスを抑制することであってもよい。
【0039】
本発明は、一態様において、テロメラーゼ（telomerase）の逆転写酵素（reverse transcriptase）由来のペプチドワクチンを提供する。具体的には、本発明は、一態様において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase, ｈＴＥＲＴ）由来のアミノ酸ペプチドワクチンを提供する。より具体的には、本発明は、一態様において、ｈＴＥＲＴ由来の１６個のアミノ酸ペプチドで、ＧＶ１００１（登録商標）と知られているペプチドＰＥＰ１を、抗ウイルスワクチンとして提供する。
【0040】
本発明の一態様によるペプチド（以下、ＰＥＰ１）は、ヒトテロメラーゼ由来の合成ペプチドで、様々な生物学的役割を果たすことができることを確認した。
【0041】
本発明者らは、ＰＥＰ１は、熱ショックタンパク質（heat shock protein、ＨＳＰ）と相互作用をし、細胞内シグナリングを調節することを明らかにした。本発明の一態様において示されているように、ＨＳＰ９０は、 ＰＥＰ１が細胞内に透過することを助けることを確認し、ＰＥＰ１が、細胞外ＨＳＰと相互作用をし、細胞の細胞質内に透過できることを確認した。この研究は、ＰＥＰ１が、ＨＳＰを介した相互作用により、細胞内シグナリング経路を調節できることを示す。
【0042】
本発明は、他の一態様において、ＰＥＰ１の抗酸化効能が、活性酸素の増加したＨＣＶ感染細胞で、ＨＣＶの複製を阻害する効果があることを明らかにした。具体的に、本発明は、一態様において、ＨＣＶで感染された細胞において、活性酸素が増加し、増加した活性酸素が、ＨＳＰ９０の分泌能を増やせ、ＨＳＰ９０に結合したＰＥＰ１の細胞浸透能が向上することにより、細胞内でＨＣＶ複製増殖を抑制できることを明らかにした。本発明は、一態様において、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０を介して示す様々な生物学的活性により、ＨＣＶ複製増殖を抑制できる新規の薬物を提供する。
【0043】
本発明は、他の一態様において、ペプチドに基づいた、既存の抗レトロウイルス剤に対するＨＩＶ耐性及び薬剤の副作用を克服できる新しい形態の抗ＨＩＶ治療剤を提供する。感染された細胞は、細胞死滅のメカニズムの刺激を受けて、自ら細胞死が起こると知られている。本発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＩＶウイルス自体に対して、抗ウイルス効果を示してＨＩＶ増殖を抑制し、ＨＩＶが、感染された細胞株についての細胞死滅を防止することを確認した。本発明は、一態様において、細胞の状態を正常的に維持するようにし、ＨＩＶ細胞毒性や細胞死滅を最小化することを確認した。
【0044】
本発明は、また他の一態様において、ペプチドに基づいた、既存のウイルス性Ｂ型肝炎薬剤の肝毒性、及び持続的な服用の際に現れる腎毒性などの薬剤の副作用を克服できる新しい形態の抗ＨＢＶ治療剤を提供する。本発明者らは、ＰＥＰ１を介したＳＴＡＴ３シグナリング経路の抑制、直接的細胞毒性、ＩＬ－６生成の抑制による抗がん効能及び肝炎抑制効能の複合作用から、抗ウイルス抑制による新規のＨＣＣ治療物質を提供する。
【0045】
本発明の一態様において、配列番号１のペプチド、配列番号１のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的に、ヒト（Homo sapiens）テロメラーゼに由来のペプチドを含む。
本発明は、他の一態様において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントである抗ウイルス用ペプチドであってもよい。
本発明は、他の一態様において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントである抗ウイルス用ペプチドであってもよい。
【0046】
本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド又はそのフラグメントと、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸又は７個以上のアミノ酸が変化されたペプチドとを含んでもよい。
【0047】
本発明の一態様において, 前記ペプチドは、標識物質とコンジュゲートされた形態で、前記組成物に含まれてもよい。他の一態様によると、前記標識物質は、蛍光物質又は照影物質であってもよい。本発明の他の一態様において、前記蛍光物質は、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）であってもよい。
【0048】
本発明の一態様において、アミノ酸の変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上し、気質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるなどのアミノ酸の変化が行われてもよい。
【0049】
本明細書において、「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸のみならず、Ｄ－異性体及び変形されたアミノ酸を含む。これにより、本発明の一態様において、ペプチドは、Ｄ－アミノ酸を含むペプチドであってもよい。一方、本発明の別の態様において、ペプチドは、翻訳後修飾（post-translational modification）の非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後修飾の例には、リン酸化（phosphorylation）、グリコシル化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱アミド化 、脱アミド化）、及び構造的変化（例えば、二黄化物ブリッジの形成）が含まれる。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（cＲＯＳ slinker）との結合過程で起こる化学反応により生じるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボキシ基、又は側鎖における変化のようなアミノ酸の変化が含まれる。
【0050】
本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から、同定及び分離された野生型ペプチドであってもよい。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１のフラグメントであるペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸が、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体であってもよい。人工変異体のみならず、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／又は活性に有意義な影響を及ばさないアミノ酸の保存性置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般に、特異的活性を変更させないアミノ酸の置換が、本分野に公知されている。最も頻繁に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、そしてこれらと逆のものである。保存的置換の他の例は、以下の表に示している。
ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又は螺旋立体構造の保持におけるこれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷又は疎水性の保持におけるこれらの効果、又は（ｃ）側鎖のバルクの保持におけるこれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することにより行われる。天然の残基は、通常の側鎖の特性に基づいて、次のグループに分けられる：
（１） 疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、 ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２） 中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３） 酸性： ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４） 塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５） 鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、 ｐｒｏ、及び
（６） 芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらの類型のうちの一つの構成員を、また他の類型に交換することにより行われる。ペプチドの適当な立体構造の保持と関連のないいかなるシステイン残基も、一般にセリンに置換されて、前記分子の酸化的安定性を向上し、異常な架橋結合を防ぐことができる。逆に言えば、システイン結合（複数の結合）を前記ペプチドに加え、その安定性を向上することができる。
【表1】
（１） 疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、 ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２） 中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３） 酸性： ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４） 塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５） 鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、 ｐｒｏ、及び
（６） 芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらの類型のうちの一つの構成員を、また他の類型に交換することにより行われる。ペプチドの適当な立体構造の保持と関連のないいかなるシステイン残基も、一般にセリンに置換されて、前記分子の酸化的安定性を向上し、異常な架橋結合を防ぐことができる。逆に言えば、システイン結合（複数の結合）を前記ペプチドに加え、その安定性を向上することができる。
【0051】
ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化されたものである。変化とは、ペプチドで見付けられた一つ以上の炭水化物残基の欠失及び／又はペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【0052】
ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ－結合されるか、Ｏ－結合されるものである。Ｎ－結合されるとは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したものを言う。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基を、アスパラギン側鎖に酵素的付着するための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のうちの一つが、ポリペプチドに存在することにより、潜伏的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ－結合されたグリコシル化は、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース及びキシロースのうちの一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も通常的には、セリン又はトレオニンに付着することを意味するが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンを用いてもよい。
【0053】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、前に挙げられたトリペプチド配列の一つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化することで、便宜に行われる（Ｎ－結合されたグリコシル化部位の場合）。このような変化は、一つ以上のセリン又はトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、これらの残基で置換することにより行われてもよい（Ｏ－結合されたグリコシル化部位の場合）。
【0054】
また、本発明の一態様による配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内安定性が高いという長所を有する。本発明における配列番号１は、テロメラーゼに由来のペプチドとして、以下のように１６個のアミノ酸からなるペプチドである。
【0055】
配列番号１に記載されたペプチドは、以下の表２の通りである。以下の表２における「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一態様において、配列番号１に記載されたペプチドは、ヒトのテロメラーゼの全ペプチドを示す。本発明の他の態様において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。
本発明の一態様では、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、 抗ウイルス及びウイルス抑制の効能を有するペプチドを、有効成分として含む薬学的組成物を提供する。本発明の一態様によると、前記組成物は、薬学組成物であってもよい。
【表2】
【0056】
本発明の一態様によると、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、ダブルストランドＤＮＡ‐逆転写酵素（double-stranded DNA Reverse Transcriptase, dsDNA-RT）ウイルス、シングルストランドＲＮＡ‐逆転写酵素（single-stranded RNA Reverse Transcriptase, ssRNA-RT）ウイルス、又は ｓｓＲＮＡウイルスであってもよい。
本発明の他の一態様によると、前記ウイルスは、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、又はヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）であってもよい。
本発明の他の一態様によると、前記ウイルスは、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、又はヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）であってもよい。
【0057】
本発明のまた他の一態様によると、前記ウイルスは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、又はＨＢＶであってもよい。
【0058】
本発明の一態様による抗ウイルス及びウイルス抑制の効能を有する薬学組成物は、一態様においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、０．０７ｍｇ／ｍＬ以上、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、０．２ｍｇ／ｍＬ以上、０．２５ｍｇ／ｍＬ 以上、０．３ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以上、０．７ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以上、２ｍｇ／ｍＬ以上、３ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、７ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以上、３０ｍｇ／ｍＬ以上、４０ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、６０ｍｇ／ｍＬ以上、７０ｍｇ／ｍＬ以上、８０ｍｇ／ｍＬ以上、又は９０ｍｇ／ｍＬ以上であるか、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、７ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、０．７ｍｇ／ｍＬ以下、０．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．３ｍｇ／ｍＬ以下、０．２５ｍｇ／ｍＬ以下、０．２ｍｇ／ｍＬ以下，０．１５ｍｇ／ｍＬ以下、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０７ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．０２ｍｇ／ｍＬ以下の含量で含んでもよいが、容量による効果の差を示す場合、これを適切に調整することができる。前記範囲又はそれ以下の範囲で含む場合、本発明の一態様において意図した効果を奏するのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性の両方を満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切であり得る。
【0059】
本発明の一態様による前記組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、０．０００１μＭ以上、０．００１μＭ以上、０．００２μＭ以上、０．００５μＭ以上、０．００７μＭ以上、０．０１μＭ以上、０．０２μＭ以上、０．０５μＭ以上、０．０７μＭ以上、０．０９μＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．２５μＭ以上、０．３μＭ以上、０．３５μＭ以上、０．４μＭ以上、０．４５μＭ以上、０．５μＭ以上、０．５５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．６５μＭ以上、０．７μＭ以上、０．７５μＭ以上、０．８μＭ以上、０．８５μＭ以上、０．９μＭ以上、０．９５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、５μＭ以上、７μＭ以上、１０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、又は９０μＭ以上であるか、１００μＭ以下、９０μＭ以下、５０μＭ以下、３０μＭ以下、１０μＭ以下、９μＭ以下、７μＭ以下、５μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、０．９５μＭ以下、０．９μＭ以下、０．８５μＭ以下、０．８μＭ以下、０．７５μＭ以下、０．７μＭ以下、０．６５μＭ以下、０．６μＭ以下、０．５５μＭ以下、０．５μＭ以下、０．４５μＭ以下、０．４μＭ以下、０．３５μＭ以下、０．３μＭ以下、０．２５μＭ以下、０．２μＭ以下、０．１μＭ以下、０．０９μＭ以下、０．０７μＭ以下、０．０５μＭ以下、０．０２μＭ以下、０．０１μＭ以下、０．００７μＭ以下、０．００５μＭ以下、０．００２μＭ以下、０．００１μＭ以下、又は０．０００５μＭ以下の濃度で含んでもよく、好ましくは、０．００１μＭないし１０μＭの濃度で含んでもよいが、濃度による効果の差を示す場合、これを適切に調整することができる。前記範囲又はそれ以下の範囲で含む場合、本発明の一態様において意図した効果を奏するのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性の両方を満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切であり得る。
【0060】
本発明の一態様による組成物は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ギニアピグ又はサルを含む全ての動物に適用できる。
【0061】
本発明の一態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、抗ウイルス効能及びウイルス関連疾病の予防及び治療に効能を有するペプチドを含む薬学組成物を提供する。本発明の一態様による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内又は皮下内などに投与できる。
【0062】
経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質又は硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、又は乳濁剤であってもよいが、これに限定されない。非経口投与のための剤型は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ、又は噴霧剤であってもよいが、これに限定されない。
【0063】
本発明の一態様による薬学組成物は、必要に応じて、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩解剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一態様による薬学組成物は、当業界の通常的な方法により製造できる。
【0064】
本発明の一態様による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその重症度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。このような因子に基づいた適用量の決定は、当業者のレベル内にあり、この一日投与量は、０．０１μｇ／ｋｇ／日以上、０．１μｇ／ｋｇ／日以上、１μｇ／ｋｇ／日以上、０．００１６ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００６ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００９３ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０１６ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１ｍｇ／ｋｇ／日以上、５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１０ｍｇ／ｋｇ／日以上、５０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１００ｍｇ／ｋｇ／日以上、１ｇ／ｋｇ／日以上、５ｇ／ｋｇ／日以上、又は９ｇ／ｋｇ／日以上であるか、１０ｇ／ｋｇ／日以下、９ｇ／ｋｇ／日以下，５ｇ／ｋｇ／日以下，１ｇ／ｋｇ／日以下，１００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下、５ｍｇ／ｋｇ／日以下、１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０１７ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００９４ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００７ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００１７ｍｇ／ｋｇ／日以下、１μｇ／ｋｇ／日以下、０．１μｇ／ｋｇ／日以下、又は０．０５μｇ／ｋｇ／日以下であってもよい。例えば、０．０１μｇ／ｋｇ／日～１０ｇ／ｋｇ／日、具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日～１ｇ／ｋｇ／日、より具体的には、１μｇ／ｋｇ／日～０．１ｇ／ｋｇ／日、さらにより具体的には、１μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、１μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．００５ｍｇ／ｋｇ ／日～０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日となってもよいが、容量による効果の差を示す場合、これを適切に調整してもよい。成人（６０ｋｇ）の場合、一日投与の際、０．１ｍｇ～１ｍｇ、好ましくは、０．４ｍｇ～０．６ｍｇの投与、特に０．５６ｍｇの投与が好ましい。本発明の一態様による薬学組成物は、１日１回～３回投与してもよいが、これに限定されない。
【0065】
本発明の一態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising） ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、有効成分として含む抗ウイルス及びウイルス関連疾病の予防及び治療用組成物を提供する。
【0066】
本発明の一態様による組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化することができる。各剤形は、有効成分の他に、当該分野において通常用いられる成分を、剤形又は使用目的に応じて、当業者が容易に適宜選択して配合でき、他の原料と同時に適用する場合、上昇効果を奏することができる。
【0067】
本発明は、他の一態様において、前記組成物は食品組成物であってもよい。
【0068】
本発明の一態様による食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化することができる。各剤形は、有効成分の他に、当該分野において通常用いられる成分を、剤形又は使用目的に応じて、当業者が容易に適宜選択して配合でき、他の原料と同時に適用する場合、上昇効果を奏することができる。
本発明は、また他の一態様において、前記組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、ウイルスによる病理学的症状を見せる個体に投与することを含む、ウイルス性疾病の改善、予防、及び治療方法を提供する。
本発明は、また他の一態様において、前記組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、ウイルスによる病理学的症状を見せる個体に投与することを含む、ウイルス性疾病の改善、予防、及び治療方法を提供する。
【0069】
本発明の一態様によると、前記ウイルス性疾病は、後天性免疫不全症候群、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、それらによる肝硬変、又はそれらによる肝癌であってもよい。
【0070】
本発明は、また他の一態様において、前記組成物、及びウイルス性疾病の予防及び治療
方法が記載されている指示書を含む、ウイルス性疾病の予防及び治療用キットを提供する。
本発明の一態様によると、前記ウイルス性疾病の予防及び治療方法は、前記抗ウイルス用組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、ウイルスによる病理学的症状を示す個体に投与することを含んでもよい。
方法が記載されている指示書を含む、ウイルス性疾病の予防及び治療用キットを提供する。
本発明の一態様によると、前記ウイルス性疾病の予防及び治療方法は、前記抗ウイルス用組成物を、ウイルス性疾病にかかっているか、ウイルスによる病理学的症状を示す個体に投与することを含んでもよい。
【0071】
本発明は、また他の一態様において、前記組成物の製造に用いるための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドの使用を提供する。
【0072】
本明細書において用いられた用語は、特定の具体例を説明するための目的のみで意図されたものであり、本発明を限定しようとする意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞の物品が、一つ以上存在することを示すものである。用語「含む」、「有する」、及び「含有する」とは、包括的意味と解釈される（即ち、「含まれるが、これに限定されない」という意味）。
【0073】
数値の範囲を言及するのは、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を、個別的に言及することに代わる容易な方法であるためであり、それではないと明示されていない限り、各数値は、個別的に明細書に言及されているように本明細書に適用される。全ての範囲の限界値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【0074】
本明細書に述べられる全ての方法は、特に明示されているか、文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行われ得る。いずれか一つの実施例及び全ての実施例又は例示的言語（例えば、「～のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明の一態様の記載を容易にするためのものであり、本発明の一態様の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる言語も、請求されていない構成要素を、本発明の一態様による実施に必須的なものであると解釈してはいけない。特に定めのない限り、本明細書に用いられる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者により通常理解されるような意味を有する。
【0075】
本発明の一態様による好適な具体例は、本発明を実行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。好適な具体例の変形は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に利用することを期待し、発明者らは、本明細書の記載とは異なる方式で、本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、一態様において、特許法により許容されているように、添付の特許請求の範囲に述べられた発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変形内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示するか、文脈上、明白に矛盾しない限り、本発明に含まれる。本発明は、一態様において、例示的な具体例を参照して、具体的に開示し、記述されたが、当業者は、添付の特許請求の範囲により定められる発明の思想及び範囲を逸脱することなく、形態及びディテールにおいて多様な変化が可能であることがよく分かる。
【0076】
以下、実施例及び実験例をもって、本発明の一態様による構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例及び実験例は、本発明の一態様による理解を助けるために例示の目的にのみ提供されたものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0077】
実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下、「ＰＥＰ１」という）を、従来知られている固相ペプチド合成法（solid phase peptide synthesis, ＳＰＰＳ）に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron, Inc., 大韓民国・大田）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法でＣ－末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。次のように、ペプチドのＣ－末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、以下の通りである。
配列番号１のペプチド（以下、「ＰＥＰ１」という）を、従来知られている固相ペプチド合成法（solid phase peptide synthesis, ＳＰＰＳ）に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron, Inc., 大韓民国・大田）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法でＣ－末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。次のように、ペプチドのＣ－末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、以下の通りである。
【0078】
ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－２－クロロ－トリチルレジン
ＮＨ２－Ａｌａ－２－クロロ－トリチルレジン
ＮＨ２－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－２－クロロ－トリチルレジン
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、Ｎ－末端がＦｍｏｃで保護（protection）され、残基は全て酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ－Ｂｕ（t-ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２、２、４、６、７－ペンタメチルジヒドロ－ベンゾフラン－５－スルフォニル）などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。
ＮＨ２－Ａｌａ－２－クロロ－トリチルレジン
ＮＨ２－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－２－クロロ－トリチルレジン
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、Ｎ－末端がＦｍｏｃで保護（protection）され、残基は全て酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ－Ｂｕ（t-ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２、２、４、６、７－ペンタメチルジヒドロ－ベンゾフラン－５－スルフォニル）などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。
【0079】
Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－ＯＨ、Ｔｒｔ－メルカプト酢酸。
【0080】
カップリング試薬（Coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ[２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾル－１－イル）－１、１、３、３－テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート]／ＨＯＢｔ[Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾル]／ＮＭＭ［４－メチルモルホリン]を用いた。Ｆｍｏｃの除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を用いた。合成されたペプチドを、レジンから分離及び残基の保護基の除去には、切断カクテル（Cleavage Cocktail）［ＴＦＡ （トリフルオロ酢酸）／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ２Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を用いた。
【0081】
アミノ酸の保護基が結合された出発アミノ酸が、固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸を各々反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護の過程を繰り返すことにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを、レジンから切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで合成の可否を確認した後、凍結乾燥した。
【0082】
本実施例に用いられたペプチドへの高速液体クロマトグラフィーの結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。
【0083】
ペプチドＰＥＰ１の製造についての具体的な過程は、以下の通りである。
【0084】
１）カップリング
ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－２－クロロ－トリチルレジンに、保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解して加えた後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－２－クロロ－トリチルレジンに、保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解して加えた後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
【0085】
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を加えて、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を加えて、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
【0086】
３）前記１）と２）の反応を繰り返して行い、ペプチドの基本骨格ＮＨ２－Ｅ（ＯｔＢｕ）－Ａ－Ｒ（Ｐｂｆ）－Ｐ－Ａ－Ｌ－Ｌ－Ｔ（ｔＢｕ）－Ｓ（ｔＢｕ）－Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ－Ｒ（Ｐｂｆ）－Ｆ－Ｉ－Ｐ－Ｋ（Ｂｏｃ）－２－クロロ－トリチルレジンを作製した。
【0087】
４）切断（Cleavage）：合成が完了されたペプチドレジンに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加えて、レジンからペプチドを分離した。
【0088】
５）得られた混合物に、冷却ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈殿した。
【0089】
６）Ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認し、凍結してパウダーとして製造した。
【0090】
実施例２：ＨＣＶに対するＰＥＰ１の効能の確認
細胞株の培養
本発明の一態様による、ＰＥＰ１のＨＣＶ抗ウイルス効能の実施例において用いられた細胞株であるＨｕｈ７．５（human hepatocellular carcinoma）は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）から購入し、ＪＦＨ‐１細胞株は、Dr. Wakita（Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, Tokyo, Japan）から提供されたＨＣＶ２ａ ＪＦＨ‐１クローンで、Ｈｕｈ７．５細胞株から構築した。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ、１％抗生剤が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地で培養した。
細胞株の培養
本発明の一態様による、ＰＥＰ１のＨＣＶ抗ウイルス効能の実施例において用いられた細胞株であるＨｕｈ７．５（human hepatocellular carcinoma）は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）から購入し、ＪＦＨ‐１細胞株は、Dr. Wakita（Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, Tokyo, Japan）から提供されたＨＣＶ２ａ ＪＦＨ‐１クローンで、Ｈｕｈ７．５細胞株から構築した。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ、１％抗生剤が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地で培養した。
【0091】
試薬及び抗体
本発明の一態様による実施例において用いられた試薬は、ＮＡＣ（N-acetylcysteine）、ＰＤＴＣ（pyrolidine dithiocarbamate）、ビタミンＥ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ＭｂＣＤ（methyl-β-cyclodextrin）、ＫＮＫ－４３７（ＫＮＫとして、ＨＳＰ７０の抑制剤）、１７ＡＡＧ（17-N-Allylamino-17-demethoxy geldanamycin, ＨＳＰ９０の抑制剤）であり、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、及びカルバイオケム（Calbiochem, Temecula, CA, USA）から購買して用いた。
本発明の一態様による実施例において用いられた試薬は、ＮＡＣ（N-acetylcysteine）、ＰＤＴＣ（pyrolidine dithiocarbamate）、ビタミンＥ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ＭｂＣＤ（methyl-β-cyclodextrin）、ＫＮＫ－４３７（ＫＮＫとして、ＨＳＰ７０の抑制剤）、１７ＡＡＧ（17-N-Allylamino-17-demethoxy geldanamycin, ＨＳＰ９０の抑制剤）であり、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、及びカルバイオケム（Calbiochem, Temecula, CA, USA）から購買して用いた。
【0092】
本発明の一態様による、実施例において用いられた抗体は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、アイソタイプコントロール（isotype control）であり、サンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）から購買して用いた。抗ＬＲＰ１抗体は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA）から購買して用いた。
【0093】
細胞内の活性酸素（ＲＯＳ, Reactive Oxygen Species）の測定
ＪＦＨ‐１細胞株を、２４ウェルのプレートで５ｘ１０４（cells/well）個の細胞を注入した後、翌日様々な実験物質に応じて、細胞内の活性酸素の生成を測定した。細胞内活性の測定は、ＤＣＦ-ＤＡ（dichlorodihydrofluoresein diacetate, Invitrogen）を用い、染色後の蛍光測定は、Infinte M2000 Tecan（Tecan Trading AG, Switzerland）を用いて、４８５ｎｍ（emission）／５３５ｎｍ（excitation）で活性酸素の生成の可否を測定した。全ての蛍光単位は、任意の単位（arbitrary units）で表し、陽性対照群として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、２ｍＭ）を用いた。Ｈｕｈ７．５細胞に対するＲＯＳの測定も、同様な過程を通じて行った。
ＪＦＨ‐１細胞株を、２４ウェルのプレートで５ｘ１０４（cells/well）個の細胞を注入した後、翌日様々な実験物質に応じて、細胞内の活性酸素の生成を測定した。細胞内活性の測定は、ＤＣＦ-ＤＡ（dichlorodihydrofluoresein diacetate, Invitrogen）を用い、染色後の蛍光測定は、Infinte M2000 Tecan（Tecan Trading AG, Switzerland）を用いて、４８５ｎｍ（emission）／５３５ｎｍ（excitation）で活性酸素の生成の可否を測定した。全ての蛍光単位は、任意の単位（arbitrary units）で表し、陽性対照群として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、２ｍＭ）を用いた。Ｈｕｈ７．５細胞に対するＲＯＳの測定も、同様な過程を通じて行った。
【0094】
免疫ブロット分析
細胞は、プロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitors cocktail, Roche, Basel, Switzerland）と、ポスファたーゼ抑制剤（phosphatase inhibitor, Roche）とが含まれた細胞溶解液（lysis solution, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA）を用いて、タンパク質を獲得した。細胞溶解の後、溶解されない残骸を除去するために、４℃で１０分間遠心分離した。５０μｇのタンパク質を、１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）で電気永動の後、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride membrane, Millipore, Bedford, MA, USA）に転移した。移動されたメンブレンは、ＨＳＰ９０、ｐ３８、ｐ－ｐ３８（Thr180/Tyr182）、ＪＮＫ、ｐ-ＪＮＫ（Thr183/Tyr185）、ＥＲＫ、ｐ-ＥＲＫ（Thr202/Tyr204）、ＳＯＤ（superoxide dismutase oxidase）として、亜鉛‐銅含有酵素ＳＯＤ（CuZn-SOD）、マンガン化‐ＳＯＤ（Mn-SOD）、ＧＡＰＤＨ（いずれもCell Signaling Technology及びSanta Cruz Biotechnologyから購入）に対する抗体を付けた後、SuperSignal West Pico Chemiluminescence Substrate（Pierce, Rockford, USA）を用いて蛍光発色し、ImageQuantTM LAS 4000 Mini Biomolecular Imager（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）で現像した。Multi Gauge V 3.0（Fuji Film, Japan）を用いて、 β‐アクチン（β-actin）を補正値 （normalization）として使用し、濃度計（densitometry）で定量的分析を実施した。
細胞は、プロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitors cocktail, Roche, Basel, Switzerland）と、ポスファたーゼ抑制剤（phosphatase inhibitor, Roche）とが含まれた細胞溶解液（lysis solution, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA）を用いて、タンパク質を獲得した。細胞溶解の後、溶解されない残骸を除去するために、４℃で１０分間遠心分離した。５０μｇのタンパク質を、１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）で電気永動の後、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride membrane, Millipore, Bedford, MA, USA）に転移した。移動されたメンブレンは、ＨＳＰ９０、ｐ３８、ｐ－ｐ３８（Thr180/Tyr182）、ＪＮＫ、ｐ-ＪＮＫ（Thr183/Tyr185）、ＥＲＫ、ｐ-ＥＲＫ（Thr202/Tyr204）、ＳＯＤ（superoxide dismutase oxidase）として、亜鉛‐銅含有酵素ＳＯＤ（CuZn-SOD）、マンガン化‐ＳＯＤ（Mn-SOD）、ＧＡＰＤＨ（いずれもCell Signaling Technology及びSanta Cruz Biotechnologyから購入）に対する抗体を付けた後、SuperSignal West Pico Chemiluminescence Substrate（Pierce, Rockford, USA）を用いて蛍光発色し、ImageQuantTM LAS 4000 Mini Biomolecular Imager（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）で現像した。Multi Gauge V 3.0（Fuji Film, Japan）を用いて、 β‐アクチン（β-actin）を補正値 （normalization）として使用し、濃度計（densitometry）で定量的分析を実施した。
【0095】
免疫沈降法（immunoprecipitation）のために、４００μｇの細胞溶解液（cell lysate）は、プロテインＡ／Ｇプラス‐アガローズビーズ免疫沈降剤（Santa Cruz Biotechnology）で２時間 、予め洗浄処理し、遠心分離の後、ビーズを除去した。この上清は、４μｇの関連の抗体及び２０μlのビーズと、細胞溶解緩衝液と、４℃で一晩培養した。免疫沈降は、抗‐ＨＳＰ９０（Cell Signaling Technology）抗体及びＦＫＢＰ８（Thermo Fisher Scientific）の免疫ブロット分析のために用意した。
【0096】
ＬＲＰ１／ＣＤ９１ｓｉＲＮＡを用いた一時のノックダウン（transient knockdown）
低密度脂質タンパク質受容体関連のタンパク質１（ＬＲＰ１）／ＣＤ９１（即ち、ＬＲＰ１）は、表皮及び皮膚細胞の移動を促進するタンパク質であって、ＨＳＰに対する細胞受容体中の一つとして確認された。ＬＲＰ１は、ｇｐ９６、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、及び カルレクチクリンの受容体として、 ＨＳＰｓによりシャペロンされるペプチドは、受容体に結合して、ＨＳＰｓと共に抗原提示細胞に入り込む。ｅＨＳＰ９０と結合して、ＬＲＰ１複合体は、細胞内への入り込み及びシグナリング受容体としての役割を果たしていると提示される。これは、ＬＲＰ１が、病理的又はストレス環境の下で、ｅＨＳＰの役割に影響を及ぼすことを提示する。本発明の一態様によるペプチドＰＥＰ１の細胞内への進入が、ｅＨＳＰに依存し、ｅＨＳＰがその受容体ＬＲＰ１により受容されることが知られた。本発明者らは、本発明によるペプチドＰＥＰ１の酸化的ストレス環境における抗酸化活性において、ＬＲＰ１が重要であることを提示した。本発明の発明者らは、ＬＲＰ１が、本発明のペプチドの細胞内に進入、及びＪＦＨ‐１細胞におけるＲＯＳ生成の抑制に重要であることを示した。これを確認するために、抗体とＬＲＰ１に対するｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）を用いて、ＬＲＰ１の活性を抑制した。
低密度脂質タンパク質受容体関連のタンパク質１（ＬＲＰ１）／ＣＤ９１（即ち、ＬＲＰ１）は、表皮及び皮膚細胞の移動を促進するタンパク質であって、ＨＳＰに対する細胞受容体中の一つとして確認された。ＬＲＰ１は、ｇｐ９６、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、及び カルレクチクリンの受容体として、 ＨＳＰｓによりシャペロンされるペプチドは、受容体に結合して、ＨＳＰｓと共に抗原提示細胞に入り込む。ｅＨＳＰ９０と結合して、ＬＲＰ１複合体は、細胞内への入り込み及びシグナリング受容体としての役割を果たしていると提示される。これは、ＬＲＰ１が、病理的又はストレス環境の下で、ｅＨＳＰの役割に影響を及ぼすことを提示する。本発明の一態様によるペプチドＰＥＰ１の細胞内への進入が、ｅＨＳＰに依存し、ｅＨＳＰがその受容体ＬＲＰ１により受容されることが知られた。本発明者らは、本発明によるペプチドＰＥＰ１の酸化的ストレス環境における抗酸化活性において、ＬＲＰ１が重要であることを提示した。本発明の発明者らは、ＬＲＰ１が、本発明のペプチドの細胞内に進入、及びＪＦＨ‐１細胞におけるＲＯＳ生成の抑制に重要であることを示した。これを確認するために、抗体とＬＲＰ１に対するｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）を用いて、ＬＲＰ１の活性を抑制した。
【0097】
ｓｉＲＮＡ標的ＬＲＰ１と、対照用（scrambled）ｓｉＲＮＡは、バイオニア（Daejeon, Republic of Korea）から購入した。全てのｓｉＲＮＡは、ＪＦＨ‐１又はＨｕｈ７．５細胞株に、様々な濃度に応じて、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて注入した。１８時間後、細胞からＲＮＡを獲得した後、ｑＲＴ‐ＰＣＲ（quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction）を行い、ＲＮＡノックダウンを確認した。
【0098】
ＨＣＶ ＲＮＡの定量的測定
ＨＣＶ ＲＮＡレベルは、ＮＳ２遺伝子に対するプライマーを用いて、定量的ＰＣＲを行って測定した。細胞培養液の上清からＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するために、ＲＮＡは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）を用いて、細胞培養液１００μlから抽出した。抽出したＲＮＡは、ｃＤＮＡの合成に用いられ、Transcript First Strand ｃＤＮＡ合成キット（Roche Applied Science）を用いた。ＰＣＲには、1x SYBR Green Mix（Qiagen）を用いた。リアルタイムＰＣＲは、ＮＳ２順方向プライマー、５’‐ＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴ‐３’（配列番号３）、及び逆方向プライマー, ５’‐ＡＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴ‐３’（配列番号４）を、Bioneer Co.から購入して用いた。定量ＰＣＲには、7900HT Fast real-time PCR system（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた。
ＨＣＶ ＲＮＡレベルは、ＮＳ２遺伝子に対するプライマーを用いて、定量的ＰＣＲを行って測定した。細胞培養液の上清からＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するために、ＲＮＡは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）を用いて、細胞培養液１００μlから抽出した。抽出したＲＮＡは、ｃＤＮＡの合成に用いられ、Transcript First Strand ｃＤＮＡ合成キット（Roche Applied Science）を用いた。ＰＣＲには、1x SYBR Green Mix（Qiagen）を用いた。リアルタイムＰＣＲは、ＮＳ２順方向プライマー、５’‐ＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴ‐３’（配列番号３）、及び逆方向プライマー, ５’‐ＡＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴ‐３’（配列番号４）を、Bioneer Co.から購入して用いた。定量ＰＣＲには、7900HT Fast real-time PCR system（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた。
【0099】
フローサイトメトリー（Flow cytometric）分析
ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）‐コンジュゲートしたＰＥＰ１の細胞内への浸透を確認するために、様々な物質を、細胞株に処理したものに、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１を、２時間さらに処理した後、ＦＡＣＳ分析を行った。ＬＲＰ１のノックダウンのために、ｓｉＲＮＡを細胞に注入し、１８時間後、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１を、２時間処理した後、細胞に付いているペプチドは、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Invitrogen）で処理して完璧に除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ, ０．５％ＢＳＡ）で洗い出した後、BD FACSFortessa（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）で分析した。データ分析には、FlowJo software（version 9.7.7, TreeStar, Ashland, OR, USA）を用いた。
ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）‐コンジュゲートしたＰＥＰ１の細胞内への浸透を確認するために、様々な物質を、細胞株に処理したものに、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１を、２時間さらに処理した後、ＦＡＣＳ分析を行った。ＬＲＰ１のノックダウンのために、ｓｉＲＮＡを細胞に注入し、１８時間後、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１を、２時間処理した後、細胞に付いているペプチドは、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Invitrogen）で処理して完璧に除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ, ０．５％ＢＳＡ）で洗い出した後、BD FACSFortessa（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）で分析した。データ分析には、FlowJo software（version 9.7.7, TreeStar, Ashland, OR, USA）を用いた。
【0100】
ＥＬＩＳＡを用いたＨＳＰ９０の測定
Ｈｕｈ７．５と、ＪＦＨ‐１細胞株とに、酸化誘導剤である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２, ２ｍＭ）と、抗酸化剤であるＰＤＴＣ（１００μＭ）とを、２時間処理した。培養の上清のＨＳＰ９０（extra cellular ＨＳＰ９０, ｅＨＳＰ９０）は、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を使用し、製造社の指示書に記載の過程に従って行った。
Ｈｕｈ７．５と、ＪＦＨ‐１細胞株とに、酸化誘導剤である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２, ２ｍＭ）と、抗酸化剤であるＰＤＴＣ（１００μＭ）とを、２時間処理した。培養の上清のＨＳＰ９０（extra cellular ＨＳＰ９０, ｅＨＳＰ９０）は、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を使用し、製造社の指示書に記載の過程に従って行った。
【0101】
肝組織及びＪＦＨ‐１細胞の免疫蛍光染色及び測定
ヒトの肝の生検組織は、慢性ＨＣＶ又はＨＢＶを保有した患者及び対照群として、自己免疫性肝炎患者（ＡＩＨ）から採取し、Soon Chun Hyang University Bucheon Hospital（2014-12-034）のＩＲＢ（institutional review board）、及びSeoul National University Hospital（1410-136-621）の監督の下で行われた。肝細胞及びＪＦＨ‐１細胞でＨＳＰ９０の発現を測定するために、肝組織又はＪＦＨ‐１細胞は、抗‐ＨＳＰ９０抗体（Cell Signaling Technology）で染色した。視覚化のために、Alexa Fluor 594‐コンジュゲートした抗ラビットＩｇＧ（Invitrogen）を用いた。細胞核に対するカウンター染色のために、４‘、６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドル（ＤＡＰＩ, Sigma-Aldrich）を用いた。共焦点顕微鏡システムＡ１（Nikon, Minatoku, Tokyo, Japan）及びNIS‐Elements 4.20 Viewer（Nikon）を用いて、イメージの獲得及び処理を行った。
ヒトの肝の生検組織は、慢性ＨＣＶ又はＨＢＶを保有した患者及び対照群として、自己免疫性肝炎患者（ＡＩＨ）から採取し、Soon Chun Hyang University Bucheon Hospital（2014-12-034）のＩＲＢ（institutional review board）、及びSeoul National University Hospital（1410-136-621）の監督の下で行われた。肝細胞及びＪＦＨ‐１細胞でＨＳＰ９０の発現を測定するために、肝組織又はＪＦＨ‐１細胞は、抗‐ＨＳＰ９０抗体（Cell Signaling Technology）で染色した。視覚化のために、Alexa Fluor 594‐コンジュゲートした抗ラビットＩｇＧ（Invitrogen）を用いた。細胞核に対するカウンター染色のために、４‘、６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドル（ＤＡＰＩ, Sigma-Aldrich）を用いた。共焦点顕微鏡システムＡ１（Nikon, Minatoku, Tokyo, Japan）及びNIS‐Elements 4.20 Viewer（Nikon）を用いて、イメージの獲得及び処理を行った。
【0102】
統計分析
全てのデータは、平均±平均の標準エラー（ＳＥＭ）で表し、統計的比較は、 GraphPad Prism, version 5.01（GraphPad, La Jolla, CA, USA）、両側スチューデントｔ検定（Student’s t-test）で行い、Ｐ値が０．０５以下の場合、統計的で有意であると判定した。
全てのデータは、平均±平均の標準エラー（ＳＥＭ）で表し、統計的比較は、 GraphPad Prism, version 5.01（GraphPad, La Jolla, CA, USA）、両側スチューデントｔ検定（Student’s t-test）で行い、Ｐ値が０．０５以下の場合、統計的で有意であると判定した。
【0103】
実験結果の分析
１）ＰＥＰ１ ＨＣＶ ＲＮＡ複製の抑制効果
適切なＲＯＳのレベルが、ＨＣＶ、ＨＢＶ、及びＨＩＶの複製を調節することは広く知られている。したがって、本発明者らは、ＰＥＰ１のＲＯＳを抑制する効果を示すのが、ウイルスの複製を抑制するにあたって、効果を発揮できるという仮定を立て、ＪＦＨ‐１細胞において、ＰＥＰ１が、ＨＣＶ ＲＮＡの複製抑制の効果を奏するかどうかを調べるための実験を行った。
１）ＰＥＰ１ ＨＣＶ ＲＮＡ複製の抑制効果
適切なＲＯＳのレベルが、ＨＣＶ、ＨＢＶ、及びＨＩＶの複製を調節することは広く知られている。したがって、本発明者らは、ＰＥＰ１のＲＯＳを抑制する効果を示すのが、ウイルスの複製を抑制するにあたって、効果を発揮できるという仮定を立て、ＪＦＨ‐１細胞において、ＰＥＰ１が、ＨＣＶ ＲＮＡの複製抑制の効果を奏するかどうかを調べるための実験を行った。
【0104】
前記実験と分析方法に述べられた方法に従い、ＰＥＰ１が、ＨＣＶ ＲＮＡのうちの一つであるＮＳ２の複製を抑制するかどうかを調べるために、ＮＳ２の転写量を測定した。ＪＦＨ‐１細胞において、対照群（vehicle）、ＰＥＰ１投与群、既存の抗酸化剤（ＮＡＣ、ＰＤＴＣ、ビタミンＥ）投与群において、ＮＳ２の転写量を測定した結果、対照群に比べて、ＰＥＰ１は、濃度依存的に１０μＭまで、ＮＳ２の転写を抑制すると示された。対照的に、既存の抗酸化剤ＮＡＣ、ＰＤＴＣ、ビタミンＥは、ＮＳ２の転写を全く抑制しないと示された（図１６）。
【0105】
ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０に依存的にＲＯＳ活性の減少効果を示したことに基づいて、ＨＣＶ ＲＮＡ複製の抑制効果も、ＨＳＰ９０と関連があるかどうかを調べるための実験を行った。ＪＦＨ‐１細胞において、アイソタイプ（isotype）、抗ＨＳＰ７０処理群、抗ＨＳＰ９０処理群に分けて、対照群（ＰＢＳ）との比較時、ＰＥＰ１のＮＳ２転写量の抑制程度を測定した。ＰＥＰ１によるＨＣＶ ＲＮＡ増殖は、抗ＨＳＰ９０抗体の処理の際、増殖が抑制されなかった。しかしながら、抗ＨＳＰ７０抗体及びアイソタイプの場合、抗体と関係なく、ＰＥＰ１によりＨＣＶ ＲＮＡ増殖が抑制された（図１７）。追加に、ＨＳＰ９０の受容体であるＬＲＰ１の抑制の有無によるＰＥＰ１のＮＳ２転写量の抑制程度を測定した。ＬＲＰ１ ｓｉＲＮＡを処理して、ＬＲＰ１の発現がノックダウンされると、ＪＦＨ‐１細胞でＨＣＶ ＲＮＡの複製が、ＰＥＰ１により減少されなかった（図１８）。
【0106】
ＨＳＰ９０は、ＨＣＶ ＲＮＡ複製のために、ＮＳ５Ａ及びＦＫＢＰ８の結合体の形成に関与すると知られている。これにより、ＰＥＰ１によるＨＣＶ ＲＮＡ複製の抑制が、複製複合体の形成を妨げた結果であるか否かを調べた。ＰＥＰ１をＪＦＨ‐１細胞に処理して、ＨＳＰ９０とＦＫＢＰ８の結合を観察した。具体的に、ＪＦＨ‐１細胞を、ＰＥＰ１（１０μＭ）で４８時間培養した。その後、タンパク質を、抗ＦＫＢＰ８抗体又は抗ＨＳＰ９０抗体で免疫沈降（immunoprecipitation）法を実施した。ＨＳＰ９０及びＦＫＢＰ８の内在的（endogenous）発現を、処理していないＪＦＨ‐１細胞で測定した。
【0107】
その結果、対照群に比べて、ＰＥＰ１を処理したとき、ＦＫＢＰ８によるＨＳＰ９０の共沈殿を減少させた（図１９）。ＪＦＨ‐１細胞において、細胞溶解物、対照群（ＰＢＳ）、ＰＥＰ１処理群に分けて、それぞれ抗ＨＳＰ９０及び抗ＦＫＢＰ８免疫沈降反応の後、抗ＨＳＰ９０及び抗ＦＫＢＰ８抗体で免疫ブロットを実施した結果、抗ＨＳＰ９０免疫沈降反応では、ＰＥＰ１処理群においてＦＫＢＰ８の発現が減少し、抗ＦＫＢＰ８免疫沈降反応では、ＰＥＰ１処理群においてＨＳＰ９０の発現が減少したことを、各々の抗体による免疫ブロットで検出した（図１９）。このような結果は、ＰＥＰ１が、ＨＣＶ ＲＣＶ複製の複合体の形成を直接に抑制し、ＰＥＰ１がＦＫＢＰ８との相互作用に作用するＨＳＰ９０の主要部位に結合して作用することを提示する。
【0108】
前記実験の結果から、ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０と結合する特性を有すので、ＨＳＰ９０のＦＫＢＰ８に対する活性を減少させるメカニズムを通じて、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を抑制する効果を奏することが分かる。これは、ＰＥＰ１が、ＨＣＶの複製を抑制し、抗ウイルス効能を示すことも言える。
【0109】
２）ＰＥＰ１のＲＯＳ生成の抑制
ＰＥＰ１のウイルス感染細胞内で、ＲＯＳの生成を抑制する効能を調べるために、ＨＣＶ感染細胞株であるＪＦＨ‐１細胞に、ＰＥＰ１を投与したとき、ＲＯＳの生成が抑制されるかどうかについて、比較実験を行った。ＪＦＨ‐１細胞株は、Ｈｕｈ７．５細胞を、ＨＣＶ２ａ ＪＦＨ‐１クローンで感染させて生成したものである。ＨＣＶビリオンの合成により、ＪＦＨ‐１細胞株では、細胞内の活性酸素量が、Ｈｕｈ７．５細胞株（ＪＦＨ‐１の母細胞株）でより高く調節されている。本発明者らは、ＰＥＰ１が、ＪＦＨ‐１細胞でＲＯＳの生成は、１０μＭまで投与量依存的な方式で相当阻害することを確認した。１及び１０μＭで、ＰＥＰ１の抗酸化活性の効果は、ＮＡＣ、ＰＤＴＣ 、及びビタミンＥに匹敵した（図１）。
ＰＥＰ１のウイルス感染細胞内で、ＲＯＳの生成を抑制する効能を調べるために、ＨＣＶ感染細胞株であるＪＦＨ‐１細胞に、ＰＥＰ１を投与したとき、ＲＯＳの生成が抑制されるかどうかについて、比較実験を行った。ＪＦＨ‐１細胞株は、Ｈｕｈ７．５細胞を、ＨＣＶ２ａ ＪＦＨ‐１クローンで感染させて生成したものである。ＨＣＶビリオンの合成により、ＪＦＨ‐１細胞株では、細胞内の活性酸素量が、Ｈｕｈ７．５細胞株（ＪＦＨ‐１の母細胞株）でより高く調節されている。本発明者らは、ＰＥＰ１が、ＪＦＨ‐１細胞でＲＯＳの生成は、１０μＭまで投与量依存的な方式で相当阻害することを確認した。１及び１０μＭで、ＰＥＰ１の抗酸化活性の効果は、ＮＡＣ、ＰＤＴＣ 、及びビタミンＥに匹敵した（図１）。
【0110】
前記実験と分析方法に記載の方法に従い、ＪＦＨ‐１細胞及びＨｕｈ７．５細胞でＲＯＳを測定した。ＰＥＰ１を様々な濃度で２時間処理した後、ＤＣＦ‐ＤＡで３０分間染色後、蛍光を測定した。対照群として、ヒト肝細胞癌細胞株 Ｈｕｈ７．５と、ＪＦＨ‐１細胞株に代表的な抗酸化剤と知られたＮＡＣ（２ｍＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）、ビタミンＥ（１０μＭ）を処理して比較した。ＰＥＰ１を投与していない場合、ＪＦＨ‐１細胞株において、細胞内の活性酸素量が、Ｈｕｈ７．５細胞株より約２倍以上増加した（図１）。したがって、ＰＥＰ１を処理したとき、濃度依存的に活性酸素量が減少する。ＪＦＨ‐１細胞において、ＰＥＰ１を、濃度別（０．００１、０．０１、０．１、１、１０μＭ）に投与した実験群、及び既存の抗酸化剤（ＮＡＣ、ＰＤＴＣ、ビタミンＥ）を投与した実験群と、 対照群（vehicleを投与）とを比較した結果、ＰＥＰ１は、濃度依存的にＲＯＳの生成を減少させ、既存の抗酸化剤も、ＲＯＳの生成の減少を示した（図１）。
【0111】
ＲＯＳは、ＭＡＰＫシグナリング経路の活性を誘導できると知られているため、ＰＥＰ１が、ＭＡＰＫシグナリング経路に関連した因子（ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ）を減少するか否かを調べる実験を行った（図２）。前記実験と分析方法に記載の方法に従い、ＪＦＨ‐１細胞及びＨｕｈ７．５細胞において、免疫ブロットを実施した。ｐ３８及びＪＮＫのリン酸化は、ＰＥＰ１処理の後、ＪＦＨ‐１細胞で減少し、これは、抗酸化剤であるＮＡＣ、ＰＤＴＣ、及びビタミンＥを処理した結果と類似である。反面、ＥＲＫの活性は、ＰＥＰ１及びビタミンＥ処理の両方により増加した（図２）。
【0112】
これと共に、ＪＦＨ‐１細胞及びＨｕｈ７．５細胞において、各対照群及び実験群の両方が、ＨＳＰ９０の発現を測定した結果、全て強く発現すると示された（図２）。
【0113】
前記実験の結果により、ＰＥＰ１を投与することで、細胞内ＲＯＳの生成の減少効果を見ることができ、これは、ＪＦＨ‐１細胞内で特異的シグナリング、即ち、減少したＭＡＰＫシグナリングを通じて引き起こされることが分かる。
【0114】
【0115】
３）ＰＥＰ１の抗酸化効果におけるｅＨＳＰ９０の役割
本発明者らは、ＨＳＰ９０が、ＰＥＰ１の抗酸化効果の媒介であると仮定した。本発明では、ＰＥＰ１の抗酸化効果が、ＨＳＰ９０によることであるか否かを調べるために、ＨＳＰ９０の活性の有無によるＰＥＰ１のＲＯＳの生成程度を測定する実験をした。本発明者らは、ＨＳＰ９０との相互作用を、二つの方法で抑制した：ＨＳＰ７０に対する抗体、及びＨＳＰ９０に対する抗体を使用又は触媒位置（ＨＳＰ９０のＮ‐末端中のＡＴＰ‐結合のポケット）を占める抑制剤を用いた。前記実験と分析方法に記載の方法に従い、ＪＦＨ‐１細胞において、ＰＥＰ１投与群、抗酸化剤ＰＤＴＣ投与群と、対照群（ＰＢＳ）とのＲＯＳの生成を測定して比較した。
本発明者らは、ＨＳＰ９０が、ＰＥＰ１の抗酸化効果の媒介であると仮定した。本発明では、ＰＥＰ１の抗酸化効果が、ＨＳＰ９０によることであるか否かを調べるために、ＨＳＰ９０の活性の有無によるＰＥＰ１のＲＯＳの生成程度を測定する実験をした。本発明者らは、ＨＳＰ９０との相互作用を、二つの方法で抑制した：ＨＳＰ７０に対する抗体、及びＨＳＰ９０に対する抗体を使用又は触媒位置（ＨＳＰ９０のＮ‐末端中のＡＴＰ‐結合のポケット）を占める抑制剤を用いた。前記実験と分析方法に記載の方法に従い、ＪＦＨ‐１細胞において、ＰＥＰ１投与群、抗酸化剤ＰＤＴＣ投与群と、対照群（ＰＢＳ）とのＲＯＳの生成を測定して比較した。
【0116】
その結果、本発明では、ＰＥＰ１が、抗ＨＳＰ７０抗体の存在の下では、ＪＦＨ‐１細胞中でＲＯＳのレベルを抑制するが、抗ＨＳＰ９０抗体の存在の下では、抑制効果が観察されないことを示した（図３）。アイソタイプ（isotype）では、ＰＥＰ１による抑制が観察された（図３）。また、ＨＳＰ９０の抑制剤である１７ＡＡＧは、ＪＦＨ‐１細胞に処理したとき、活性酸素の抑制効果を示したが、ＨＳＰ７０抑制剤であるＫＮＫによる活性酸素の変化は、観察されなかった（図５）。対照薬物ＰＤＴＣは、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０を、特定の抗体でブロックすることと関係なく、ＲＯＳの生成を抑制して、全ての処理条件でＲＯＳの生成を抑制した（図４）。また、ＰＤＴＣは、ＫＮＫ及び１７ＡＡＧの存在の下で、全てＲＯＳの生成を抑制した（図６）。これは、ＰＥＰ１が、相異なメカニズムを通じて、ＲＯＳの生成を阻害することを提示する。このようなデータは、ｅＨＳＰ９０が、ＰＥＰ１の抗酸化活性で重要な媒介体であり、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０でＲＯＳの誘導に必須的な触媒位置に作用することを示す。
【0117】
１７ＡＡＧを処理したとき、ＰＥＰ１の抗酸化活性の効果が低下するという結果から、本発明者らは、ＰＥＰ１が、細胞内の活性酸素の濃度が非常に低いか、活性酸素が定常範囲にあるときには、活性酸素を抑制しない可能性について調べた。これは、抗酸化物質が、既に存在する状況では、ＰＥＰ１が、ＪＦＨ‐１細胞の中でもＲＯＳの生成を抑制できない可能性を提示する。本発明者らは、このような仮説を調べるために、抗酸化剤であるＰＤＴＣの濃度を増加させながら、細胞を処理した。その結果、ＰＥＰ１の抗酸化活性が、漸進的に減少することを確認した（図７）。これは、ＪＦＨ‐１細胞でＰＤＴＣ処理によりＲＯＳのレベルが下がったためであり、減少するか、定常レベルのＲＯＳを有する細胞と比較して、酸化的ストレス環境の下にある細胞では、ＰＥＰ１が、抗酸化剤として選択的に作用することを提示する。このようなＰＥＰ１の特性は、酸化的レベルに合わせた治療薬物の開発に寄与する。
【0118】
さらに、本発明では、活性酸素によるストレス状態で、ＰＥＰ１の特異的抗酸化機能を確認するための実験を行った。具体的に、既存の抗酸化剤の投与が、ＨＳＰ９０の発現を減少し、これにより、ＰＥＰ１が、既存の抗酸化剤と共に投与されるとき、抗酸化効能が、減少するか否かの可否を確認するための実験を行った。ＰＥＰ１の抗酸化活性は、ｅＨＳＰ９０に依存的であるので、本発明の実施例では、細胞からｅＨＳＰの分泌を測定した。Ｈｕｈ７．５細胞で、Ｈ２Ｏ２による刺激は、対照群よりかなり高いレベルで、ｅＨＳＰ９０の分泌を増やした（図８）。反面、抗酸化物質であるＰＤＴＣを、ＪＦＨ‐１細胞に処理したときには、対照群より低いレベルのｅＨＳＰ９０を生成した（図９）。このような結果は、酸化的ストレスが、ＨＳＰ９０の分泌を引き起こすことを提示する。また、ＰＥＰ１が、酸化的ストレス状態にある細胞において、ＲＯＳの生成を選択的に抑制することを提示する。
【0119】
【0120】
【0121】
４）ＰＥＰ１による抗酸化効果におけるＬＲＰ１の役割
ＰＥＰ１が、ｅＨＳＰ９０に結合して細胞内に流れ込まれることが知られており、ｅＨＳＰ９０が、細胞受容体であるＬＲＰ１に受容されることが知られている。ＬＲＰ１は、ｇｐ９６、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０及びカルレクチクリンの共通的な受容体であり、ＨＳＰによりシャペロンされるペプチドは、これらの受容体と結合して、ＨＳＰと共に、抗原提示細胞に入り込む。ＬＲＰ１複合体は、ｅＨＳＰとカップリングして，内包及びシクリング受容体として作用し、ＬＲＰ１が、病理的又はストレス状態で、ｅＨＳＰ９０の作用に影響を与えることを提示する。これと共に、ＨＳＰ９０は、ＦＫ５０６‐結合タンパク質ファミリーのうちの一つであるＦＫＢＰ８と、Ｃ型肝炎の非構造タンパク質（non-structural protein）５Ａ（ＮＳ５Ａ）と共に、ＨＣＶ ＲＮＡの複製コンプレクスを形成する。このような事実は、 ＨＳＰ９０が、その発現又は活性を通じて、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を調節できることを提示する。ＨＳＰ９０は、ＮＯＸ活性を調節して、スーパーオキシドの形成を誘導する。本発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０の主要位置に結合して、ＨＳＰ９０の活性を抑制する方式を通じて，選択的な抗酸化作用を達成し、酸化的ストレス状態にある細胞で，様々な生物学的影響を及ぼすことを明らかにした。
ＰＥＰ１が、ｅＨＳＰ９０に結合して細胞内に流れ込まれることが知られており、ｅＨＳＰ９０が、細胞受容体であるＬＲＰ１に受容されることが知られている。ＬＲＰ１は、ｇｐ９６、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０及びカルレクチクリンの共通的な受容体であり、ＨＳＰによりシャペロンされるペプチドは、これらの受容体と結合して、ＨＳＰと共に、抗原提示細胞に入り込む。ＬＲＰ１複合体は、ｅＨＳＰとカップリングして，内包及びシクリング受容体として作用し、ＬＲＰ１が、病理的又はストレス状態で、ｅＨＳＰ９０の作用に影響を与えることを提示する。これと共に、ＨＳＰ９０は、ＦＫ５０６‐結合タンパク質ファミリーのうちの一つであるＦＫＢＰ８と、Ｃ型肝炎の非構造タンパク質（non-structural protein）５Ａ（ＮＳ５Ａ）と共に、ＨＣＶ ＲＮＡの複製コンプレクスを形成する。このような事実は、 ＨＳＰ９０が、その発現又は活性を通じて、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を調節できることを提示する。ＨＳＰ９０は、ＮＯＸ活性を調節して、スーパーオキシドの形成を誘導する。本発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０の主要位置に結合して、ＨＳＰ９０の活性を抑制する方式を通じて，選択的な抗酸化作用を達成し、酸化的ストレス状態にある細胞で，様々な生物学的影響を及ぼすことを明らかにした。
【0122】
本発明者らは、酸化的ストレス状態で、ＬＲＰ１が、ＰＥＰ１の抗酸化効果に重要な役割を果たすと仮定した。本発明者らは、ＬＲＰ１の不在の時には、ＰＥＰ１が、細胞内に流れ込まれず、ＪＦＨ‐１細胞でＲＯＳの生成を抑制できないと仮定した。
【0123】
このような仮定を確認するために、前記実験と分析方法に記載の方法に従い、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０の細胞受容体であるＬＲＰ１の有無に応じて、細胞内に流れ込まれる程度を確認した。具体的に、ＬＲＰ１に対する抗体と、ｓｉＲＮＡを用いてＬＲＰ１活性を抑制し、ＦＩＴＣ‐コンジュゲートしたＰＥＰ１を用いて、フローサイトメトリーを実施した。
【0124】
【0125】
まず、クラトリン‐カベオリン‐、そしてクラトリン／カベオリン独立的な内包（ endocyto）経路を抑制するリピドラフト（lipid raft）形成の抑制剤であるＭｂＣＤで事前処理したとき、ＰＥＰ１がＪＦＨ‐１細胞に入り込めないことを確認した。以前に報告されたように、ＭｂＣＤは、ＪＦＨ‐１細胞の中にＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１が入り込むことを抑制し、これは、ＰＢＳ対照群と比較して減少された蛍光強度で立証される。ＦＩＴＣ‐ＰＥＰ１の細胞内への流れ込みは、対照群と比較して、抗‐ＬＲＰ１抗体のみならず、ＬＲＰ１に対するｓｉＲＮＡ（即ち、ＬＲＰ ｓｉＲＮＡ）によっとも抑制された（図１１及び図１２）。これは、ＬＲＰ１が、ＰＥＰ１のｅＨＳＰ９０依存的伝達において重要な受容体であることを提示する。
【0126】
また、酸化的ストレスが、ＰＥＰ１の浸透能に影響を及ぼすか否かを確認するために、ＪＦＨ‐１細胞にＰＤＴＣを添加し、Ｈｕｈ７．５細胞にＨ２Ｏ２を添加して、様々な酸化的レベルを生成した。これらの処理条件は、ＲＯＳレベルに応じて、ｅＨＳＰ分泌に相異な影響を与える（図８及び図９）。本発明者らが、仮定したのと一致するようにＰＤＴＣの存在の下で、ＪＦＨ‐１細胞中へのＰＥＰ１の浸透は減少し、Ｈ２Ｏ２の存在の下で、Ｈｕｈ７．５細胞でＰＥＰ１の浸透は増加した（図１３～図１４）。これは、ＰＥＰ１の細胞内への流れ込みと、生物学的活性とが、細胞内のＲＯＳのレベルに依存し、これに応じて、ｅＨＳＰのレベルに依存することを示す。
【0127】
次に、ＪＦＨ‐１細胞でＬＲＰ１をノックダウンさせ、ＲＯＳのレベルを測定して、前記仮説を追加に確認した。ＪＦＨ‐１細胞中のＰＥＰ１の抗酸化活性は、ＬＲＰ１ ｓｉＲＮＡの存在の下で観察されなかった（図１５）。
【0128】
前記実験の結果により、ＰＥＰ１の抗酸化メカニズムは、ＰＤＴＣと相異し、ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０の受容体であるＬＲＰ１の発現の有無に応じて、細胞内への流れ込みの程度が異なり、ＬＲＰ１の発現が、減少又は抑制される場合、細胞内への流れ込みが、減少することが分かり、これは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０に依存的に細胞内へ流れ込まれることを確認してくれると言える。
【0129】
５）ＨＣＶで感染された肝組織におけるＨＳＰ９０の発現
細胞でない臓器又は組織にＨＣＶが感染された場合、ＨＢＶ又はＡＩＨ（autoimmune hepatitis, 自己免疫性肝炎）で感染された場合と異なって、ＨＳＰ９０の発現が増加することを確認するための組織解剖学的実験を行った。
細胞でない臓器又は組織にＨＣＶが感染された場合、ＨＢＶ又はＡＩＨ（autoimmune hepatitis, 自己免疫性肝炎）で感染された場合と異なって、ＨＳＰ９０の発現が増加することを確認するための組織解剖学的実験を行った。
【0130】
前記実験及び分析方法に記載の方法に従い、ＨＣＶ、ＨＢＶ、及びＡＩＨで感染された肝組織において、ＨＳＰ９０の発現程度を比較した。その結果、ＨＢＶ及びＡＩＨの場合と比較して、ＨＣＶで感染された場合に、ＨＳＰ９０の発現が増加した（灰色部分、図２０）。興味深く、ＰＥＰ１は、ＪＦＨ‐１細胞中で、細胞内のＨＳＰ９０を減少させ、これは、恐らく減少されたＲＯＳのレベルによる付随的な結果であると思われる（図９）。また、ＨＣＶで感染された肝組織において、対照群（ＰＢＳ）と、ＰＥＰ１処理群とを比較したとき、ＨＳＰ９０が、ＰＥＰ１処理の時、対照群に比べて低く発現されることが示された（灰色部分、図２１）。
【0131】
【0132】
前記実験の結果は、ＨＣＶ感染により、細胞内部で定常細胞より高いレベルの活性酸素が誘導され、蓄積された活性酸素によりストレスを受けた細胞で、相対的にＨＳＰ９０が過発現されるので、ＰＥＰ１が、酸化的ストレス状態にあるＨＣＶ感染された細胞の治療剤として役割を果たすことを提示する。
【0133】
実施例３：ＨＩＶに対するＰＥＰ１の効能の確認
ウイルス感染の際、旺盛なウイルスタンパク質の生成はまた、ＨＳＰ機能を必要とすることを確認し、ＨＳＰ９０阻害剤により抑制されるウイルスリストが、続けて増えることを確認した。ヒト免疫不全ウイルス‐１（human immunodeficiency virus-1, ＨＩＶ‐１）感染もまた、単核球細胞で増加したＨＳＰ９０の発現を示すことを見出した。ＨＳＰ９０は、ウイルスのライフサイクルの多くの段階で作用して、ＨＩＶの複製において重要な役割を果たしていると示され、急性で感染された細胞で、ＨＩＶウイルスの転写及び複製において、ＨＳＰ９０の役割は、ＨＳＰ９０阻害剤により抑制されると示された。これと共に、ＨＳＰ９０は、ＮＦ-κＢシグナリングを調節することにより、潜伏性状態でＨＩＶ再活性を調節することを確認した。
ウイルス感染の際、旺盛なウイルスタンパク質の生成はまた、ＨＳＰ機能を必要とすることを確認し、ＨＳＰ９０阻害剤により抑制されるウイルスリストが、続けて増えることを確認した。ヒト免疫不全ウイルス‐１（human immunodeficiency virus-1, ＨＩＶ‐１）感染もまた、単核球細胞で増加したＨＳＰ９０の発現を示すことを見出した。ＨＳＰ９０は、ウイルスのライフサイクルの多くの段階で作用して、ＨＩＶの複製において重要な役割を果たしていると示され、急性で感染された細胞で、ＨＩＶウイルスの転写及び複製において、ＨＳＰ９０の役割は、ＨＳＰ９０阻害剤により抑制されると示された。これと共に、ＨＳＰ９０は、ＮＦ-κＢシグナリングを調節することにより、潜伏性状態でＨＩＶ再活性を調節することを確認した。
【0134】
細胞株の培養
本発明のＰＥＰ１のＨＩＶ抗ウイルス効能の実施例で用いられた細胞株は、ヒトＴ細胞白血病細胞株ＭＴ‐４、ＨＩＶ‐１で潜伏感染されたＡＣＨ‐２細胞株、Jurkatから由来し、安定的に挿入されたＨＩＶ‐ＬＴＲ－ルシフェラーゼ（luciferase）構造体を含む１Ｇ５細胞株であり、これらの細胞株を、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファランス試薬プログラム（ＮＩＨ, Bethesda, ＭＤ）から得た。２９３ＦＴ細胞は、ライフテクノロジー（Carlsbad, CA）から購入した。ＭＴ‐４及び１Ｇ５細胞株は、グルタミン（２ｍＭ）、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン‐ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で保持した。ＡＣＨ‐２細胞は、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、ペニシリン‐ストレプトマイシン及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２９３ＦＴ細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン‐ストレプトマイシン、６ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
本発明のＰＥＰ１のＨＩＶ抗ウイルス効能の実施例で用いられた細胞株は、ヒトＴ細胞白血病細胞株ＭＴ‐４、ＨＩＶ‐１で潜伏感染されたＡＣＨ‐２細胞株、Jurkatから由来し、安定的に挿入されたＨＩＶ‐ＬＴＲ－ルシフェラーゼ（luciferase）構造体を含む１Ｇ５細胞株であり、これらの細胞株を、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファランス試薬プログラム（ＮＩＨ, Bethesda, ＭＤ）から得た。２９３ＦＴ細胞は、ライフテクノロジー（Carlsbad, CA）から購入した。ＭＴ‐４及び１Ｇ５細胞株は、グルタミン（２ｍＭ）、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン‐ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で保持した。ＡＣＨ‐２細胞は、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、ペニシリン‐ストレプトマイシン及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２９３ＦＴ細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン‐ストレプトマイシン、６ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【0135】
試薬及び抗体
抗レトロウイルス薬物として、Ｔ‐２０、ラルテグラビル（Raltegravir）、フラボピリドル（Flavopiridol）、及びリトナビル（Ritonavir）を、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health;NIH, Bethesda, MD, USA）、ＡＩＤＳ部署、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファランス試薬プログラム（ＮＩＨ, Bethesda, MD, USA）から得て、指示の通り、Ｄ‐ＰＢＳ、ＤＭＳＯ又は蒸留水に溶解した。アジドチミジン（３－アジド‐３‐ジオキシチミジン、ＡＺＴ）は、シグマアルドリッチ（St.Louis, MO）から購入した。ＨＳＰ９０（＃４８７７Ｓ）、ホスホ（Phospho）‐ＮＦ-κＢ（ｐ６５、＃３０３３Ｓ）、IκＢ（＃４８１４Ｓ）、及びホスホ‐IκＢ（＃２８５９Ｓ）を、セルシグナリング（Cell Singaling, Danvers, MA）から得て、抗p２４抗体（ａｂ９０７１）を、アブカム（Abcam, Cambridge, MA）から購入した。ＨＳＰ７０に対する抗体（ｓｃ３２２３９）、ＧＦＰに対する抗体（ｓｃ８１０４５）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ２５７７８）、及びＮＦ‐κＢに対する抗体（ｐ６５、ｓｃ３７２）を、サンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz, Dallas, Texas）から購入した。
抗レトロウイルス薬物として、Ｔ‐２０、ラルテグラビル（Raltegravir）、フラボピリドル（Flavopiridol）、及びリトナビル（Ritonavir）を、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health;NIH, Bethesda, MD, USA）、ＡＩＤＳ部署、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファランス試薬プログラム（ＮＩＨ, Bethesda, MD, USA）から得て、指示の通り、Ｄ‐ＰＢＳ、ＤＭＳＯ又は蒸留水に溶解した。アジドチミジン（３－アジド‐３‐ジオキシチミジン、ＡＺＴ）は、シグマアルドリッチ（St.Louis, MO）から購入した。ＨＳＰ９０（＃４８７７Ｓ）、ホスホ（Phospho）‐ＮＦ-κＢ（ｐ６５、＃３０３３Ｓ）、IκＢ（＃４８１４Ｓ）、及びホスホ‐IκＢ（＃２８５９Ｓ）を、セルシグナリング（Cell Singaling, Danvers, MA）から得て、抗p２４抗体（ａｂ９０７１）を、アブカム（Abcam, Cambridge, MA）から購入した。ＨＳＰ７０に対する抗体（ｓｃ３２２３９）、ＧＦＰに対する抗体（ｓｃ８１０４５）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ２５７７８）、及びＮＦ‐κＢに対する抗体（ｐ６５、ｓｃ３７２）を、サンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz, Dallas, Texas）から購入した。
【0136】
プラスミド及びウイルス
単一のバイシストロニックＲＮＡ（Cat No. 11371, Dr. Daniel Sauter及びDr. Frank Kirchhoffより提供される）からＮｅｆと向上した緑色の蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）とを共に発現するｐＢＲ４３ＩｅＧ‐ｒｃｍＧＢ１ｎｅｆプロウイルスＨＩＶ‐１プラスミド、及びＴａｔタンパク質（残基１～７２）を産生するｐＳＶ２Ｔａｔ７２プラスミド（Cat. No. 294, Dr. Alan Frankeiより提供される）を、アメリカ国立衛生研究所、ＡＩＤＳ部署、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファレンス試薬プログラム（NIH, Bethesda, MD）から得た。ＨＩＶ‐１を産生するために、リポフェクタミン２０００試薬（Life Technologies）を、製造者の指示に従って用い、２９３ＦＴ細胞を、ｐＢＲ_ＨＩＶ‐１_Ｍ_ＮＬ４－３_ＩＲＥＳ_ｅＧＦＰベクターでトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、ウイルスを含有する培地を収集し、短く遠心分離及びフィルタリング（０．４５μＭ）をした。ウイルスの力価を、ｐ２４ＥＬＩＳＡ（ABL, city, MD）を用いて測定した。感染性ＨＩＶ‐１の増殖のために、ＭＴ‐４細胞を、生成されたＨＩＶ‐１（ＭＯＩ＝０．５）を用いて４８時間感染させた。短く遠心分離（１，３００ｒｐｍ、３ ｍｉｎ）した後、上清をフィルタリング（０．２２μＭ）し、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて力価測定を行った。
単一のバイシストロニックＲＮＡ（Cat No. 11371, Dr. Daniel Sauter及びDr. Frank Kirchhoffより提供される）からＮｅｆと向上した緑色の蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）とを共に発現するｐＢＲ４３ＩｅＧ‐ｒｃｍＧＢ１ｎｅｆプロウイルスＨＩＶ‐１プラスミド、及びＴａｔタンパク質（残基１～７２）を産生するｐＳＶ２Ｔａｔ７２プラスミド（Cat. No. 294, Dr. Alan Frankeiより提供される）を、アメリカ国立衛生研究所、ＡＩＤＳ部署、ＮＩＨ／ＡＩＤＳリサーチ及びレファレンス試薬プログラム（NIH, Bethesda, MD）から得た。ＨＩＶ‐１を産生するために、リポフェクタミン２０００試薬（Life Technologies）を、製造者の指示に従って用い、２９３ＦＴ細胞を、ｐＢＲ_ＨＩＶ‐１_Ｍ_ＮＬ４－３_ＩＲＥＳ_ｅＧＦＰベクターでトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、ウイルスを含有する培地を収集し、短く遠心分離及びフィルタリング（０．４５μＭ）をした。ウイルスの力価を、ｐ２４ＥＬＩＳＡ（ABL, city, MD）を用いて測定した。感染性ＨＩＶ‐１の増殖のために、ＭＴ‐４細胞を、生成されたＨＩＶ‐１（ＭＯＩ＝０．５）を用いて４８時間感染させた。短く遠心分離（１，３００ｒｐｍ、３ ｍｉｎ）した後、上清をフィルタリング（０．２２μＭ）し、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて力価測定を行った。
【0137】
抗‐ウイルス効果アッセイ
ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ‐１効果を測定するために、ＭＴ‐４細胞を用いて細胞基盤の抗‐ウイルス効果アッセイを行った。ＭＴ‐４細胞（４ｘ１０５細胞）を、ＨＩＶ‐１（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０；50% cell culture infective dose）で１時間感染させた。Ｄ‐ＰＢＳで２回洗浄した後、感染された細胞にＰＥＰ１又は抗ＨＩＶ‐１薬物を接種処理した。２日間培養した後、細胞を収集する前に、蛍光顕微鏡を用いて、ｅＧＦＰを発現するＭＴ‐４細胞のイメージを得た。収集した上清から残りの細胞残余物を除去するために、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞外ウイルス量を測定するにあたって、逆転写定量的ポリメラーぜ連鎖反応（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）のために、ｐ２４ＥＬＩＳＡ又はＲＮＡ抽出を行った。一方、細胞ペレットを、Ｄ‐ＰＢＳで２回洗浄し、細胞生存性（cell viability）アッセイに用いた。ＰＥＰ１の抗ウイルス作用におけるＨＳＰ９０の役割を調べるために、ＭＴ‐４細胞を、ＨＩＶで１時間感染させ、抗ＨＳＰ７０（１０ｎｇ）、抗ＨＳＰ９０（１０ｎｇ）（Cell Signaling, Danvers, MA）又は１７‐ＡＡＧ（１μＭ）（Calbiochem, Darmstadt, Germany）で処理した。ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて、ＨＩＶ‐１複製を分析し、蛍光顕微鏡を用いてｅＧＦＰをモニターリングした。また、細胞溶解液を、抗‐ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロットして、ＨＩＶ‐ＬＴＲ‐依存的ｅＧＦＰの合成を確認した。
ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ‐１効果を測定するために、ＭＴ‐４細胞を用いて細胞基盤の抗‐ウイルス効果アッセイを行った。ＭＴ‐４細胞（４ｘ１０５細胞）を、ＨＩＶ‐１（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０；50% cell culture infective dose）で１時間感染させた。Ｄ‐ＰＢＳで２回洗浄した後、感染された細胞にＰＥＰ１又は抗ＨＩＶ‐１薬物を接種処理した。２日間培養した後、細胞を収集する前に、蛍光顕微鏡を用いて、ｅＧＦＰを発現するＭＴ‐４細胞のイメージを得た。収集した上清から残りの細胞残余物を除去するために、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞外ウイルス量を測定するにあたって、逆転写定量的ポリメラーぜ連鎖反応（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）のために、ｐ２４ＥＬＩＳＡ又はＲＮＡ抽出を行った。一方、細胞ペレットを、Ｄ‐ＰＢＳで２回洗浄し、細胞生存性（cell viability）アッセイに用いた。ＰＥＰ１の抗ウイルス作用におけるＨＳＰ９０の役割を調べるために、ＭＴ‐４細胞を、ＨＩＶで１時間感染させ、抗ＨＳＰ７０（１０ｎｇ）、抗ＨＳＰ９０（１０ｎｇ）（Cell Signaling, Danvers, MA）又は１７‐ＡＡＧ（１μＭ）（Calbiochem, Darmstadt, Germany）で処理した。ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて、ＨＩＶ‐１複製を分析し、蛍光顕微鏡を用いてｅＧＦＰをモニターリングした。また、細胞溶解液を、抗‐ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロットして、ＨＩＶ‐ＬＴＲ‐依存的ｅＧＦＰの合成を確認した。
【0138】
細胞毒性アッセイ
ＭＴ‐４、１Ｇ５又はＡＣＨ‐２細胞を、９６ウェルのマイクロプレートで１ｘ１０４の密度で接種し、ＰＥＰ１の濃度を増加させて処理して、５日間培養した。細胞生存性をCellTiter96（登録商標）Aqueous One Solutionアッセイキット（Promega, WI）を用いて、製造社の指示の通り、色測定法で測定した。ＨＩＶ‐１誘導の細胞死滅からＰＥＰ１が細胞保護能力を付与することを測定するために、ＭＴ‐４細胞（１ｘ１０４）を、ＨＩＶ‐１ウイルス（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０）で５日間ＰＥＰ１と共に、又はＰＥＰ１なしで感染させ、細胞生存性を測定した。
ＭＴ‐４、１Ｇ５又はＡＣＨ‐２細胞を、９６ウェルのマイクロプレートで１ｘ１０４の密度で接種し、ＰＥＰ１の濃度を増加させて処理して、５日間培養した。細胞生存性をCellTiter96（登録商標）Aqueous One Solutionアッセイキット（Promega, WI）を用いて、製造社の指示の通り、色測定法で測定した。ＨＩＶ‐１誘導の細胞死滅からＰＥＰ１が細胞保護能力を付与することを測定するために、ＭＴ‐４細胞（１ｘ１０４）を、ＨＩＶ‐１ウイルス（４ｘ１０５ＣＣＩＤ５０）で５日間ＰＥＰ１と共に、又はＰＥＰ１なしで感染させ、細胞生存性を測定した。
【0139】
ＨＩＶ‐１ウイルス生成の測定
ＨＩＶ‐１ウイルス力価を測定するために、ＨＩＶ‐１ｐ２４抗原キャプチャＥＬＩＳＡ（ｐ２４ＥＬＩＳＡ、ＡＢＬ）及びＲＴ‐ｑＰＣＴアッセイを行った。ＥＬＩＳＡを、製造者の指示に従って行った。細胞培養の上清及びペレットから、ＱＩＡａｍｐウルトラセンス（Ultrasens）ウイルスキット（Quiagen, Hilden, Germany）を用いて、製造者の指示に従って、ＨＩＶ‐１ＲＮＡゲノムを精製した。ＨＩＶ‐１ＲＮＡのレベルを、ＨＩＶ‐１ｇａｇに特異的なプライマーペアを用いて、ＲＴ‐ｑＰＣＴにより定量化した。グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、標準化のための対照遺伝子として用いた。下記のプライマーペアをｑＰＣＲに用いた：Ｇａｇ、５’－ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ‐３’（sense, 配列番号５）及び５’－ＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ‐３’（antisense, 配列番号６）；及びＧＡＰＤＨ、５’－ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡ‐３’（sense, 配列番号７）及び５’－ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡ‐３’（antisense, 配列番号８）。ＨＩＶ１型ゲネシグスタンダード（Genesig Standard）キット（Primer design, Southampton, UK）を用いて、ウイルス力価を測定した。ストックウイルスの濃度は、２ｘ１０５copy/μlであった。
ＨＩＶ‐１ウイルス力価を測定するために、ＨＩＶ‐１ｐ２４抗原キャプチャＥＬＩＳＡ（ｐ２４ＥＬＩＳＡ、ＡＢＬ）及びＲＴ‐ｑＰＣＴアッセイを行った。ＥＬＩＳＡを、製造者の指示に従って行った。細胞培養の上清及びペレットから、ＱＩＡａｍｐウルトラセンス（Ultrasens）ウイルスキット（Quiagen, Hilden, Germany）を用いて、製造者の指示に従って、ＨＩＶ‐１ＲＮＡゲノムを精製した。ＨＩＶ‐１ＲＮＡのレベルを、ＨＩＶ‐１ｇａｇに特異的なプライマーペアを用いて、ＲＴ‐ｑＰＣＴにより定量化した。グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、標準化のための対照遺伝子として用いた。下記のプライマーペアをｑＰＣＲに用いた：Ｇａｇ、５’－ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ‐３’（sense, 配列番号５）及び５’－ＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ‐３’（antisense, 配列番号６）；及びＧＡＰＤＨ、５’－ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡ‐３’（sense, 配列番号７）及び５’－ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡ‐３’（antisense, 配列番号８）。ＨＩＶ１型ゲネシグスタンダード（Genesig Standard）キット（Primer design, Southampton, UK）を用いて、ウイルス力価を測定した。ストックウイルスの濃度は、２ｘ１０５copy/μlであった。
【0140】
実験結果の分析
１）ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制
本発明の発明者らは、ＨＳＰ９０が、ＨＩＶ‐１ライフサイクルにおいて重要な役割を果たし、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０と相互作用をすることから、ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１に対して、抗ウイルス活性を抑制できるという仮設を立て、この仮説を検証した。ＰＥＰ１の役割を調べる前に、まず、ＰＥＰ１の非特異的な細胞毒性が、ＨＩＶ‐１の複製に影響を及ぼす可能性を排除するために、ＰＥＰ１の細胞毒性を分析した。
１）ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制
本発明の発明者らは、ＨＳＰ９０が、ＨＩＶ‐１ライフサイクルにおいて重要な役割を果たし、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０と相互作用をすることから、ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１に対して、抗ウイルス活性を抑制できるという仮設を立て、この仮説を検証した。ＰＥＰ１の役割を調べる前に、まず、ＰＥＰ１の非特異的な細胞毒性が、ＨＩＶ‐１の複製に影響を及ぼす可能性を排除するために、ＰＥＰ１の細胞毒性を分析した。
【0141】
図２２～図２７は、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制を示すデータである。ＰＥＰ１は、ＭＴ‐４、１Ｇ５及びＡＣＨ‐２細胞に対して、２５μＭまでは、有意な細胞毒性を示さなかった（図２２）。まず、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ‐１活性を、ＭＴ‐４細胞におけるＨＩＶ‐１の複製への影響を分析して測定した。ＭＴ‐４細胞を、ｐＢＲ_ＨＩＶ‐１‐Ｍ‐ＮＬ４‐３_ＩＲＥＳ_ｅＧＦＰから生成したＨＩＶ‐１で感染させ、様々な濃度のＰＥＰ１で処理した。ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定したように、ＭＴ‐４細胞中のウイルス粒子の生成は、投与量に依存的な方式でＰＥＰ１により相当阻害され、平均５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）値は、約０．８５μＭ（図２３）であった。追加に、ＨＩＶ‐１の活性化に依存するｅＧＦＰの生成ももた、ＰＥＰ１で処理することにより減少した。このような結果は、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ‐１効果を追加的に支持する（図２４）。ＰＥＰ１によるウイルス粒子の生成の抑制は、生成されたウイルス粒子のＨＩＶ‐１ゲノムＲＮＡのレベルを測定することにより、追加的に確認した。ＰＥＰ１は、投与量依存的な抑制効果を示し、５μＭのＰＥＰ１は、ウイルスＲＮＡのレベルを、約１００倍程度減少する（図２５）。
【0142】
ＨＩＶで感染された細胞は、細胞内の細胞死滅メカニズムにより、アポトシス（apoptosis）が起こると知られている。ＰＥＰ１が、ＨＩＶ複製の抑制効果と共に、ＨＩＶが感染された細胞が自らアポトシスへ至る作用を抑制する効果があるか否かを調べるために、抗細胞変性効果（anti-cytopathic effect）アッセイを実施した。ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制と一致して、ＰＥＰ１は、ＨＩＶ‐１感染されたＭＴ‐４細胞において細胞の保護効果を示す。ＡＺＴ及びＰＥＰ１は、投与量依存的な方式で相当の細胞保護効果を示した（図２６及び図２７）。ＡＺＴと類似に、５μＭのＰＥＰ１は、ＨＩＶ‐１媒介の細胞死滅からほとんど１００％細胞保護作用を示す。このような細胞保護効果は、上清ｐ２４レベルが減少することと反比例するが、これは、ＰＥＰ１が、ウイルスの複製を抑制することにより、細胞を保護できることを提示する。
【0143】
２） ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１転写抑制
ＨＩＶ‐１ゲノムからｅＧＦＰの生成が、Ｎｅｆと同様の調節下にあることを考慮するとき、ＨＩＶ‐１感染の細胞で、ＰＥＰ１によるｅＧＦＰ発現の減少は、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１転写の抑制を示す（図３０）。ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１の抑制メカニズムをより調べるために、ＰＥＰ１と共に、複製の遮断段階が知られた既存の抗‐ＨＩＶ薬物を用いて、追加時間（ＴＯＡ）アッセイを実施した。対照群抗ＨＩＶ薬物は、その特性がよく知られており、各薬物のＨＩＶ増殖段階における抑制は、次のように起こる：ＡＺＴは、逆転写活性を抑制し、３～４時間の間に、ＨＩＶ増殖を抑制する；ラルテグラビル（raltegravir）は、ＨＩＶ ＤＮＡが宿主ＤＮＡゲノムに挿入されるようにするインテグラーゼ（integrase）活性を抑制し、６～８時間の間に、ＨＩＶの増殖を抑制する；リトナビル（ritonavir）は、プロテアーゼの活性を阻害して、ｇａｌ‐ｐｏｌポリペプチドの前躯体をプロセッシングできないようにして、非感染性未成熟のＨＩＶ粒子が生成されるようにし、１５時間までＨＩＶ増殖を抑制する；Ｔ‐２０は、ウイルスと、細胞膜との融合を阻害し、ＨＩＶウイルスが、細胞内に入り込むことを干渉し、さらに２４時間の培養を処理して、治療剤でない対照薬物のＤＭＳＯより１／３少ない量のＨＩＶ増殖が起こる。
図２８～図３０は、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制を、転写レベル （transcriptional level）で観察した写真である。ＴＯＡアッセイで、各薬物の結果は、ＨＩＶ複製の抑制が、各薬物によりターゲットされた複製段階に相応する時間帯でよく示され、ＰＥＰ１によるＨＩＶ抑制は、ＨＩＶ感染のＭＴ‐４細胞を、ＰＥＰ１で処理した後、１１～１３時間の間に起こることを示す（図２８）。ｅＧＦＰ発現の分析は、ＰＥＰ１の阻害活性が、感染後１２時間処理したとき、弱化されることを確認した（図２９）。ＴＯＡ典型的な結果によれば、挿入されたＨＩＶゲノムからＨＩＶウイルスの転写は、感染後１１～１３時間の間に起こる。このような結果は、ＨＩＶで感染されたＭＴ‐４細胞で、ＰＥＰ１の作用方式は、予測したように、転写活性を抑制して、ＨＩＶ増殖を抑制する方式であることを提示する。本発明者らの仮説は、ウイルスmＲＮＡレベルの分析を通じて、追加的に支持された。感染後、細胞をＰＥＰ１で９時間処理したとき、ＰＥＰ１は、ＨＩＶ‐１ウイルスmＲＮＡの生成を効果的に抑制したが、感染後１３時間後に処理したときには、ウイルスmＲＮＡを減少する能力を喪失した（図３０）。同時に、ハウスキーピングホストＧＡＰＤＨ mＲＮＡの合成において有意の変化はなく、これは、ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１ウイルス転写を選択的に調節することを提示する。
ＨＩＶ‐１ゲノムからｅＧＦＰの生成が、Ｎｅｆと同様の調節下にあることを考慮するとき、ＨＩＶ‐１感染の細胞で、ＰＥＰ１によるｅＧＦＰ発現の減少は、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１転写の抑制を示す（図３０）。ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１の抑制メカニズムをより調べるために、ＰＥＰ１と共に、複製の遮断段階が知られた既存の抗‐ＨＩＶ薬物を用いて、追加時間（ＴＯＡ）アッセイを実施した。対照群抗ＨＩＶ薬物は、その特性がよく知られており、各薬物のＨＩＶ増殖段階における抑制は、次のように起こる：ＡＺＴは、逆転写活性を抑制し、３～４時間の間に、ＨＩＶ増殖を抑制する；ラルテグラビル（raltegravir）は、ＨＩＶ ＤＮＡが宿主ＤＮＡゲノムに挿入されるようにするインテグラーゼ（integrase）活性を抑制し、６～８時間の間に、ＨＩＶの増殖を抑制する；リトナビル（ritonavir）は、プロテアーゼの活性を阻害して、ｇａｌ‐ｐｏｌポリペプチドの前躯体をプロセッシングできないようにして、非感染性未成熟のＨＩＶ粒子が生成されるようにし、１５時間までＨＩＶ増殖を抑制する；Ｔ‐２０は、ウイルスと、細胞膜との融合を阻害し、ＨＩＶウイルスが、細胞内に入り込むことを干渉し、さらに２４時間の培養を処理して、治療剤でない対照薬物のＤＭＳＯより１／３少ない量のＨＩＶ増殖が起こる。
図２８～図３０は、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１複製の抑制を、転写レベル （transcriptional level）で観察した写真である。ＴＯＡアッセイで、各薬物の結果は、ＨＩＶ複製の抑制が、各薬物によりターゲットされた複製段階に相応する時間帯でよく示され、ＰＥＰ１によるＨＩＶ抑制は、ＨＩＶ感染のＭＴ‐４細胞を、ＰＥＰ１で処理した後、１１～１３時間の間に起こることを示す（図２８）。ｅＧＦＰ発現の分析は、ＰＥＰ１の阻害活性が、感染後１２時間処理したとき、弱化されることを確認した（図２９）。ＴＯＡ典型的な結果によれば、挿入されたＨＩＶゲノムからＨＩＶウイルスの転写は、感染後１１～１３時間の間に起こる。このような結果は、ＨＩＶで感染されたＭＴ‐４細胞で、ＰＥＰ１の作用方式は、予測したように、転写活性を抑制して、ＨＩＶ増殖を抑制する方式であることを提示する。本発明者らの仮説は、ウイルスmＲＮＡレベルの分析を通じて、追加的に支持された。感染後、細胞をＰＥＰ１で９時間処理したとき、ＰＥＰ１は、ＨＩＶ‐１ウイルスmＲＮＡの生成を効果的に抑制したが、感染後１３時間後に処理したときには、ウイルスmＲＮＡを減少する能力を喪失した（図３０）。同時に、ハウスキーピングホストＧＡＰＤＨ mＲＮＡの合成において有意の変化はなく、これは、ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１ウイルス転写を選択的に調節することを提示する。
【0144】
前記実験の結果及び知られたＨＩＶの時間帯別の増殖段階を通じて、ＰＥＰ１が増殖の抑制を示す時間帯である１１～１３時間帯は、ＨＩＶが、細胞株の核内にＤＮＡを注入した後（integration）、細胞内転写因子を用いて、増殖を始める段階として、後期相（late phase）の初期段階に該当することが分かった。これは、ＰＥＰ１が、ＨＩＶの増殖に必要な多くの段階のライフサイクルの中で、細胞内の核に転写する時期にウイルスを抑制することを示し、ＰＥＰ１が抗ＨＩＶ抑制剤として優秀な効果を奏することがわかる。
【0145】
３）ＰＥＰ１によるＴａｔ依存的ＨＩＶ‐１転写の抑制
ＨＩＶ‐１転移活性化（transactivation）タンパク質（Ｔａｔ）は、Ｔａｔ‐転移活性反応性領域（ＴＡＲ）との相互作用を通じて、ＨＩＶ‐１転写を劇的に向上する調節タンパク質である。ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１転写を選択的に調節することを考慮して、本発明の発明者らは、ＰＥＰ１がＨＩＶ‐１Ｔａｔ転移活性に影響を及ぼすかを試した。本発明では、Jurkat派生の細胞株で、安定的に挿入されたＨＩＶ‐ＬＴＲ‐ルシフェラーゼ構造体を含有している１Ｇ５を用いた。１Ｇ５を、ＨＩＶ‐１で感染させるか、又はＡＺＴ又はＰＥＰ１の存在の下で、Ｔａｔ‐レトロウイルスベクター（pＳＶ２Ｔａｔ７２）で形質転換した後に、ルシフェラーゼ活性を分析した。
ＨＩＶ‐１転移活性化（transactivation）タンパク質（Ｔａｔ）は、Ｔａｔ‐転移活性反応性領域（ＴＡＲ）との相互作用を通じて、ＨＩＶ‐１転写を劇的に向上する調節タンパク質である。ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１転写を選択的に調節することを考慮して、本発明の発明者らは、ＰＥＰ１がＨＩＶ‐１Ｔａｔ転移活性に影響を及ぼすかを試した。本発明では、Jurkat派生の細胞株で、安定的に挿入されたＨＩＶ‐ＬＴＲ‐ルシフェラーゼ構造体を含有している１Ｇ５を用いた。１Ｇ５を、ＨＩＶ‐１で感染させるか、又はＡＺＴ又はＰＥＰ１の存在の下で、Ｔａｔ‐レトロウイルスベクター（pＳＶ２Ｔａｔ７２）で形質転換した後に、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【0146】
ＨＩＶ‐ＬＴＲ‐ルシフェラーゼ構造（construct）が注入されている１Ｇ５細胞にＨＩＶ‐１で感染させた後、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１で後処理した。感染させた後、４日後、細胞溶解液（lysate）ＨＩＶ‐ＬＴＲの転移活性（transactivation）を分析するためのルシフェラーゼアッセイを実施した。ＨＩＶ‐１で感染させた１Ｇ５細胞は、ルシフェラーゼ活性において急激な増加を示した（図３１）。ＡＺＴ又はＰＥＰ１の処理は、ＨＩＶ‐ＬＴＲ‐ルシフェラーゼ活性に対するＨＩＶ‐１感染の効果を５倍ほど減少させた（図３１）。
【0147】
１Ｇ５細胞を、Ｔａｔプラスミドで感染させた。感染させた後、１２時間後、細胞は、前述のようにビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＡＺＴ又はＰＥＰ１で処理した。感染させた後、４日後にＨＩＶ‐ＬＴＲの転写活性は、ルシフェラーゼアッセイにより分析した。データは、平均（means）±ＳＤ（標準偏差）と代表表記した。＊＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示す（図３２）。図３１の結果と一貫して、Ｔａｔの異所性（ectopic）発現により誘導されるＨＩＶ‐ＬＴＲルシフェラーゼ活性の活性化をＰＥＰ１が抑制した（図３２）。しかしながら、ＡＺＴは、このような実験のセッティングにおいて、ＨＩＶ‐ＬＴＲルシフェラーゼ活性を抑制しなかった。このような結果は、ＰＥＰ１が、ＨＩＶ‐１感染中、Ｔａｔの転移活性化機能を調節し、これにより、ＨＩＶ‐１の複製を抑制することを示す。
【0148】
４） ＰＥＰ１による潜伏期におけるＨＩＶ‐１の再活性化の抑制
ＨＩＶ複製は、高活性の抗レトロウイルス治療法（HAART, highly active antiretroviral therapy）により探知可能なレベル以下で成功的に抑制できるが、ＨＩＶは、休止状態メモリ（resting memory）ＣＤ４＋Ｔ‐細胞と共に、潜伏期の感染細胞内に留まることができる。
ＨＩＶ複製は、高活性の抗レトロウイルス治療法（HAART, highly active antiretroviral therapy）により探知可能なレベル以下で成功的に抑制できるが、ＨＩＶは、休止状態メモリ（resting memory）ＣＤ４＋Ｔ‐細胞と共に、潜伏期の感染細胞内に留まることができる。
【0149】
Ｔａｔは、多くの種類の関連したタンパク質との相互作用を通じて、再活性化を調節するようにする分子スイッチとして作動する。
【0150】
ＰＥＰ１が、Ｔａｔ依存的転写活性を調節することから、ＨＩＶ‐１の再活性化におけるＰＥＰ１の役割を調べた。ＨＩＶ‐１ＤＮＡの単一コピーを有しているヒトＴ細胞株であるＡＣＨ‐２細胞を、ビヒクル、ＡＺＴ又はＰＥＰ１と共に、ＰＭＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）で処理した。即ち、ＡＣＨ‐２細胞、即ち、ＨＩＶ‐１の潜伏性状態（latently）で感染された細胞を、ＰＭＡ（５０ｎＭ）で刺激してＨＩＶ‐１の再活性化を１時間誘導した。次に、細胞は、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ、又はＰＥＰ１で２４時間処理した。上清からウイルス性粒子の生成レベルを、ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定した。その結果、ＰＭＡ処理は、上清ｐ２４レベルを相当増加させ、ＰＥＰ１は、このような効果を殆ど消滅した（図３３、データは平均 （means）±ＳＤ（標準偏差）と代表表記した。＊＊＊は、ＤＭＳＯ対比 ｐ＜０．００１であることを表す）。
【0151】
ＡＣＨ‐２細胞は、ＰＭＡで処理した後、図３３のように、濃度を段階別に増加したＡＺＴ又はＰＥＰ１で処理した。生成されるウイルス性粒子は、ウイルス性遺伝ＲＮＡの量を、ＲＴ‐ｑＰＣＲを用いて測定した。その結果、ＡＺＴは、ＰＭＡの効果を変化しなかった。このような結果は、ＰＥＰ１がＰＭＡ‐誘導されたＨＩＶ‐１の再活性化を抑制し、ウイルス粒子の生成を抑制することを提示する。類似に、ＨＩＶ‐１ウイルスＲＮＡゲノムレベルもまた、ＰＭＡ‐処理した細胞由来の上清中でＰＥＰ１を処理した際、投与量依存的な方式で相当減少した（図３４、データは平均（means）±ＳＤ（標準偏差）と代表表記した。＊＊＊は、ＤＭＳＯ対比ｐ＜０．００１であることを表す）。
【0152】
５）ＰＥＰ１のＨＳＰ９０依存的抗ＨＩＶ‐１の活性
ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０との相互作用をすると提示された。ＰＥＰ１とＨＳＰｓとの相互作用は、ＨＩＦ‐１α-ＶＥＧＦシグナリング軸の阻害を招き、これは、ＰＥＰ１がＨＳＰｓとの相互作用を通じて、細胞内のシグナリング経路が調節できることを示す。本発明の発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰｓとの相互作用を通じて、ＨＩＶ‐１の複製が調節できるかを調べた。驚くほど、ＭＴ‐４細胞中のＰＥＰ１媒介のＨＩＶ‐１生成の抑制は、抗ＨＳＰ９０の中性化抗体を処理したとき、完全に復旧された。
ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０との相互作用をすると提示された。ＰＥＰ１とＨＳＰｓとの相互作用は、ＨＩＦ‐１α-ＶＥＧＦシグナリング軸の阻害を招き、これは、ＰＥＰ１がＨＳＰｓとの相互作用を通じて、細胞内のシグナリング経路が調節できることを示す。本発明の発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰｓとの相互作用を通じて、ＨＩＶ‐１の複製が調節できるかを調べた。驚くほど、ＭＴ‐４細胞中のＰＥＰ１媒介のＨＩＶ‐１生成の抑制は、抗ＨＳＰ９０の中性化抗体を処理したとき、完全に復旧された。
【0153】
反面、ＡＺＴ媒介の抑制は、全く影響を受けなかった（図３５）。即ち、ＭＴ‐４細胞は、ＨＩＶ‐１で１時間感染処理の後、抗ＧＡＰＤＨ、抗ＨＳＰ７０、抗ＨＳＰ９０抗体、又は１７ＡＡＧで１時間処理し、後続にＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１で処理した。感染の数時間後、ＨＩＶ‐１粒子の生成は、ｐ２４ＥＬＩＳＡで測定した。その結果、抗ＨＳＰ７０‐中性化抗体処理は、部分的復旧を招き、抗ＧＡＰＤＨ抗体のアイソタイプ（isotype）の調節は、有意の効果がなかった。これは、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶの役割が、主にＨＳＰ９０との相互作用により起こることを提示する（図３５）。
【0154】
また、ＨＳＰ抑制剤である１７‐ＡＡＧもまた、ＰＥＰ１の効果を完全に消滅させ、これは、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ活性が、ＨＳＰ９０を通じて起こることを確認した（図３５）。また、ＰＥＰ１によるＨＩＶ‐１の転写活性に依存するｅＧＦＰ発現の抑制は、抗ＨＳＰ９０抗体により戻った。
【0155】
ＭＴ‐４細胞は、ＨＩＶで感染され、抗ＧＡＰＤＨ、抗ＨＳＰ９０抗体で処理した。 細胞は、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ又はＰＥＰ１で２４時間、先に述べられたように、処理した。ｅＧＦＰの発現をテストするために、細胞を破裂して、免疫ブロットを通じて分析した。その結果、ＡＺＴの影響は受けなかった（図３６及び図３７）。このような結果は、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０との相互作用を通じて、ＨＩＶ‐１の転写活性が調節できることを示す。
【0156】
６）ＰＥＰ１の基底ＮＦ‐κＢ転写活性の抑制
ＮＦ‐κＢは、ＨＩＶ‐ＬＴＲ内にあるＮＦ‐κＢ結合位置と相互作用して、ＨＩＶの転写を触発し、Ｔａｔ‐媒介されたＬＴＲの転位活性化を増加させる。さらに、Ｔａｔは、ＮＦ‐κＢを直接活性化できる。最近、細胞のＨＳＰ９０が、ＮＦ‐κＢを含めて、多数の細胞内のシグナリング経路を調節できることを示す研究が行われた。ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ効果が、抗ＨＳＰ９０‐遮断抗体により消滅することは、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ機能で、細胞外ＨＳＰ９０の関与の可能性を提示するため、本発明の発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０関連の方式で、ＮＦ‐κＢの活性を調節して、ＨＩＶ‐１の転写活性を調節するかを調べた。ＰＥＰ１で処理すると、ＭＴ‐４細胞におけるＨＩＶ‐１感染の可否と関係なく、基底ＮＦ‐κＢの活性を劇的に減少した（図３８）。反面、ＡＺＴは、ＭＴ‐４細胞の中でＮＦ‐κＢ活性に有意の影響を及ぼさなかった。ＡＺＴは、ＨＩＶ‐１で感染されたＭＴ‐４細胞の中で中間程度の抑制効果を示したが、これは、おそらく低いＨＩＶ複製レベルのためであろう（図３８）。ＰＥＰ１の基底ＮＦ‐κＢ活性に対する抑制効果は、ＥＭＳＡで追加的に確認した（図３９）。ＰＥＰ１処理の細胞は、ｐ６５ＮＦ‐κＢ活性化の明白な減少を示した（図３９）。これは、核内でＮＦ‐κＢのＤＮＡ結合の基底レベルを抑制することを示す。また、ＰＥＰ１処理は、ＮＦ‐κＢ（ｐ６５）リン酸化の減少を招き、これは、ＰＥＰ１が、ＮＦ‐κＢ細胞質の活性化と、以降の核内転移を抑制することを示す（図４０）。ＨＩＶ‐１で潜伏感染されたＡＣＨ‐２細胞からも類似のことを得た（図４０）。仮定した通りに、ＰＥＰ１による処理は、ＤＭＳＯ処理の対照細胞と比較して、ＰＭＡ処理のＡＣＨ‐２細胞からＮＦ‐κＢ（ｐ６５）の核内への移動を減少させた（図４１）。本発明で、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ効果が、ＨＳＰ９０に依存することを示したため、本発明者らは、ＮＦ‐κＢ抑制効果が、ＨＳＰ９０に依存的であるかを試した。抗ＨＩＶ活性のデータと一貫して、ＰＥＰ１のＮＦ‐κＢ抑制効果は、ＨＳＰ９０遮断抗体又はＨＳＰ抑制剤を処理したとき、完全に消滅された。反面、抗ＧＡＰＤＨ抗体で処理したときには、有意の効果はなかった（図４２）。
ＮＦ‐κＢは、ＨＩＶ‐ＬＴＲ内にあるＮＦ‐κＢ結合位置と相互作用して、ＨＩＶの転写を触発し、Ｔａｔ‐媒介されたＬＴＲの転位活性化を増加させる。さらに、Ｔａｔは、ＮＦ‐κＢを直接活性化できる。最近、細胞のＨＳＰ９０が、ＮＦ‐κＢを含めて、多数の細胞内のシグナリング経路を調節できることを示す研究が行われた。ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ効果が、抗ＨＳＰ９０‐遮断抗体により消滅することは、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ機能で、細胞外ＨＳＰ９０の関与の可能性を提示するため、本発明の発明者らは、ＰＥＰ１が、ＨＳＰ９０関連の方式で、ＮＦ‐κＢの活性を調節して、ＨＩＶ‐１の転写活性を調節するかを調べた。ＰＥＰ１で処理すると、ＭＴ‐４細胞におけるＨＩＶ‐１感染の可否と関係なく、基底ＮＦ‐κＢの活性を劇的に減少した（図３８）。反面、ＡＺＴは、ＭＴ‐４細胞の中でＮＦ‐κＢ活性に有意の影響を及ぼさなかった。ＡＺＴは、ＨＩＶ‐１で感染されたＭＴ‐４細胞の中で中間程度の抑制効果を示したが、これは、おそらく低いＨＩＶ複製レベルのためであろう（図３８）。ＰＥＰ１の基底ＮＦ‐κＢ活性に対する抑制効果は、ＥＭＳＡで追加的に確認した（図３９）。ＰＥＰ１処理の細胞は、ｐ６５ＮＦ‐κＢ活性化の明白な減少を示した（図３９）。これは、核内でＮＦ‐κＢのＤＮＡ結合の基底レベルを抑制することを示す。また、ＰＥＰ１処理は、ＮＦ‐κＢ（ｐ６５）リン酸化の減少を招き、これは、ＰＥＰ１が、ＮＦ‐κＢ細胞質の活性化と、以降の核内転移を抑制することを示す（図４０）。ＨＩＶ‐１で潜伏感染されたＡＣＨ‐２細胞からも類似のことを得た（図４０）。仮定した通りに、ＰＥＰ１による処理は、ＤＭＳＯ処理の対照細胞と比較して、ＰＭＡ処理のＡＣＨ‐２細胞からＮＦ‐κＢ（ｐ６５）の核内への移動を減少させた（図４１）。本発明で、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ効果が、ＨＳＰ９０に依存することを示したため、本発明者らは、ＮＦ‐κＢ抑制効果が、ＨＳＰ９０に依存的であるかを試した。抗ＨＩＶ活性のデータと一貫して、ＰＥＰ１のＮＦ‐κＢ抑制効果は、ＨＳＰ９０遮断抗体又はＨＳＰ抑制剤を処理したとき、完全に消滅された。反面、抗ＧＡＰＤＨ抗体で処理したときには、有意の効果はなかった（図４２）。
【0157】
以上をまとめると、本発明者らは、ＰＥＰ１がＮＦ‐κＢ活性の基底レベルを抑制して、ＨＩＶ‐ＬＴＲ転移活性を抑制することを示した。結果は、ＨＳＰ９０が、このような活性に関与することを提示する。以前の研究で、細胞内のＨＳＰ９０が、ＮＦ‐κＢを直接調節して、ＨＩＶの再活性化において重要な役割を果たすことを示した。本発明で示された抗ＨＳＰ９０抗体によるＰＥＰ１効果の無効化は、ＰＥＰ１の抗ウイルス効果が、ＨＳＰ９０による、ＮＦ‐κＢシグナリングと、ＨＩＶ‐ＬＴＲの活性化とを通じて行われることを提示する。
【0158】
高活性の抗レトロウイルス治療法（ＨＡＡＲＴ）により、ＨＩＶ複製が成功的に抑制できるが、現在の治療法は、潜伏期感染のＨＩＶ‐１を根絶できていない。ウイルスの再活性化は、治療法が失敗する主要原因である。ＰＥＰ１は、多数の臨床実験を通じて、その安定性が既に立証されている。したがって、ＰＥＰ１の抗ＨＩＶ効果は、ＨＩＶ再活性の抑制のための効果的な治療法を提供することができる。
【0159】
実施例４：ＨＢＶに対するＰＥＰ１の効能の確認
肝癌の標的治療剤の開発のために、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ、ｃ‐ＭＥＴキナーゼのみならず、ＩＬ‐６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｒａｓ／ＥＲＫ、Ｗｎｔなどの様々なシグナリング経路を、標的候補群として研究した。この中で、ＩＬ‐６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路の場合、多様な研究の結果により、炎症と、癌化過程とを共に制御でき、ＨＢＶ由来の疾患及びＨＣＣの治療に効率的な標的となり得ることを確認した。７２．４％の肝細胞癌の組織で、ＳＴＡＴ３の非定常的活性化が観察され、ＳＴＡＴ３の阻害が、肝癌細胞株の成長及び動物モデルにおける成長の抑制を誘導することを確認した。ＳＴＡＴシグナリング阻害の目的で、現在、臨床実験に進入しているか、使用中の薬物は、殆どキナーゼ阻害剤であり、ＳＴＡＴ３を直接阻害する薬物は、その一部が全臨床段階に進入したが、標的自体の薬物性（druggability）及び化合物の標的への選択性が不足して、これについて追加的な研究を実施した。特に、ＪＡＫ２を阻害して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を遮断することと関連して、肝細胞癌を対象にして臨床実験が進行中であるＪＡＫ阻害化合物は全無である。また、このような単一の段階を抑制する化合物の場合、耐性発生の確率が非常に高い。したがって、本発明者らは、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３シグナリング経路の多くの段階において阻害活性を示し、シグナリング経路の全般を阻害できる新規化合物の開発のために研究した。
肝癌の標的治療剤の開発のために、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ、ｃ‐ＭＥＴキナーゼのみならず、ＩＬ‐６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｒａｓ／ＥＲＫ、Ｗｎｔなどの様々なシグナリング経路を、標的候補群として研究した。この中で、ＩＬ‐６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路の場合、多様な研究の結果により、炎症と、癌化過程とを共に制御でき、ＨＢＶ由来の疾患及びＨＣＣの治療に効率的な標的となり得ることを確認した。７２．４％の肝細胞癌の組織で、ＳＴＡＴ３の非定常的活性化が観察され、ＳＴＡＴ３の阻害が、肝癌細胞株の成長及び動物モデルにおける成長の抑制を誘導することを確認した。ＳＴＡＴシグナリング阻害の目的で、現在、臨床実験に進入しているか、使用中の薬物は、殆どキナーゼ阻害剤であり、ＳＴＡＴ３を直接阻害する薬物は、その一部が全臨床段階に進入したが、標的自体の薬物性（druggability）及び化合物の標的への選択性が不足して、これについて追加的な研究を実施した。特に、ＪＡＫ２を阻害して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を遮断することと関連して、肝細胞癌を対象にして臨床実験が進行中であるＪＡＫ阻害化合物は全無である。また、このような単一の段階を抑制する化合物の場合、耐性発生の確率が非常に高い。したがって、本発明者らは、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３シグナリング経路の多くの段階において阻害活性を示し、シグナリング経路の全般を阻害できる新規化合物の開発のために研究した。
【0160】
細胞株の培養
ヒト由来の肝細胞癌Ｈｕｈ７細胞株（human hepatocellular carcinoma）（ＡＴＣＣ （American Type Culture Collection）, Manassas, VA, USA）、Ｈｕｈ７．５細胞株、そしてＨｅｐＧ２細胞株（human hepatocellular carcinoma）（ＡＴＣＣ, Manassas, VA, USA）は、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％牛胎児血清（Invitrogen, USA）と、２ｍｍｏｌ／ｍｌのＬ‐グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリンと、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのストレプトマイシンとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。
ヒト由来の肝細胞癌Ｈｕｈ７細胞株（human hepatocellular carcinoma）（ＡＴＣＣ （American Type Culture Collection）, Manassas, VA, USA）、Ｈｕｈ７．５細胞株、そしてＨｅｐＧ２細胞株（human hepatocellular carcinoma）（ＡＴＣＣ, Manassas, VA, USA）は、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％牛胎児血清（Invitrogen, USA）と、２ｍｍｏｌ／ｍｌのＬ‐グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリンと、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのストレプトマイシンとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。
【0161】
Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオン形成抑制能
本発明者らは、肝癌において、性別の差による発生頻度の差が現れることに注目して、関連の研究を行い、男性で特異的に見付けられ、肝硬化及び肝癌の発生と関連した突然変異（Ｗ４Ｐ）を世界最初に明らかにした。Ｗ４Ｐは、新規のＰｒｅ‐Ｓ１置換のＷ４Ｐ突然変異であって、抗原タンパク質の４番（ Ｐｒｅ‐Ｓ１から４番目）アミノ酸をコードする遺伝子コードが、野生型ＴＧＧから突然変異ＣＣＧ（下線は、突然変異された部分を示す）に変異された結果から生じた翻訳産物で、４番目のアミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）からプロルリン（Ｐ）に置換されたタンパク質を言う。このような突然変異は、男性でＩＬ‐６を通じて、ＪＡＫ２‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達体系を調節することにより、肝癌の発生と進行を促進するという事実を明らかにし、臨床サンプルでも高いレベルのＩＬ‐６が現れることを確認した。
本発明者らは、肝癌において、性別の差による発生頻度の差が現れることに注目して、関連の研究を行い、男性で特異的に見付けられ、肝硬化及び肝癌の発生と関連した突然変異（Ｗ４Ｐ）を世界最初に明らかにした。Ｗ４Ｐは、新規のＰｒｅ‐Ｓ１置換のＷ４Ｐ突然変異であって、抗原タンパク質の４番（ Ｐｒｅ‐Ｓ１から４番目）アミノ酸をコードする遺伝子コードが、野生型ＴＧＧから突然変異ＣＣＧ（下線は、突然変異された部分を示す）に変異された結果から生じた翻訳産物で、４番目のアミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）からプロルリン（Ｐ）に置換されたタンパク質を言う。このような突然変異は、男性でＩＬ‐６を通じて、ＪＡＫ２‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達体系を調節することにより、肝癌の発生と進行を促進するという事実を明らかにし、臨床サンプルでも高いレベルのＩＬ‐６が現れることを確認した。
【0162】
ＰＥＰ１によるＷ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオン形成能を観察するために、１００ｍｍディシーにｈｕｈ７細胞２x１０６個を注入して、定常の全体ＨＢＶと、Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶを、トランスフェクション（transfection）の効率を補正するために、β‐ガラクトシダーゼ（galactosidase）を含むｐＣＭＶ‐β‐ｇａｌベクターをコ‐トランジエント（co-transient）トランスフェクションした後、三日間培養しながら、２４時間毎に培地を交替して、ｓｕｐ（上清）を集めた。これを分析するために、ＨＢｓＡｇ（Hepatitis B surface antigen）と、ＨＢｅＡｇ（Hepatitis B envelop Antigen）とを検出できる一般化されたBioelisa ＨＢｓＡｇカラーＥＬＩＳＡキット（BIOKIT S.A., Spain）と、 ＨＢｅＡｇＥＬＩＳＡキット（BIOKIT S.A., Spain）とを用いて、提供された実験方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。集めたｓｕｐから１００μｌをウェルに入れた後、１時間３７℃で反応させた。洗浄溶液を３００μｌずつ入れて３回洗浄した。コンジュゲート希釈溶液に３００μｌずつ入れて、３回洗浄した。基質（substrate）溶液にＴＭＢを２０μｌ／ｍｌ入れた後、９６ウェルに１００μｌずつ入れて、３０分間室温で光を遮断して反応させた。ストップ（Stop）溶液１００μｌを入れて反応を終結した。ＥＬＩＳＡリーダー（Beckman, USA）で４５０ｎｍで吸光度を読み取った。補正に用いられるβ‐ガラクトシダ‐ゼは、リポーター溶解緩衝液キットと、β‐ガラクトシダ‐ゼ酵素分析システム（Promega, USA）より提供した方法に従って実験を進み、ＥＬＩＳＡの結果を補正した。
【0163】
Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオンの外皮抗原発現抑制能
ＰＥＰ１による、Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶの外皮抗原発現能を確認するために、１００ｍｍディシーにｈｕｈ７細胞２ｘ１０６個を注入して、定常の全体ＨＢＶとＷ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶを、トランジエントトランスフェクションした後、三日間培地を交替しながら培養した後、細胞ペレットを集め、タンパク質を抽出してＩＰを行った。タンパク質にプロテインＡ／Ｇプラス‐アガローズ免疫沈降剤（Santa Cruz Biotechnology, USA）を２０μｌ加えて、４℃で２時間pre-clearingする。pre-clearingした溶解液４００μｇのタンパク質に、プロテインＡ／Ｇプラス‐アガローズ免疫沈降剤（Santa Cruz Biotechnology, USA）」を２０μｌ入れて、４μｇの１次抗体を添加し、４℃で２４時間反応させた。翌日、２，０００ｒｐｍで遠心分離し、洗浄した後、再びタンパク質溶解液５０μｌで解した。１次抗体ｐｒｅＳ１と、ＨＢｓ抗体とを用いてウェスタンブロットを行った。
ＰＥＰ１による、Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶの外皮抗原発現能を確認するために、１００ｍｍディシーにｈｕｈ７細胞２ｘ１０６個を注入して、定常の全体ＨＢＶとＷ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶを、トランジエントトランスフェクションした後、三日間培地を交替しながら培養した後、細胞ペレットを集め、タンパク質を抽出してＩＰを行った。タンパク質にプロテインＡ／Ｇプラス‐アガローズ免疫沈降剤（Santa Cruz Biotechnology, USA）を２０μｌ加えて、４℃で２時間pre-clearingする。pre-clearingした溶解液４００μｇのタンパク質に、プロテインＡ／Ｇプラス‐アガローズ免疫沈降剤（Santa Cruz Biotechnology, USA）」を２０μｌ入れて、４μｇの１次抗体を添加し、４℃で２４時間反応させた。翌日、２，０００ｒｐｍで遠心分離し、洗浄した後、再びタンパク質溶解液５０μｌで解した。１次抗体ｐｒｅＳ１と、ＨＢｓ抗体とを用いてウェスタンブロットを行った。
【0164】
Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオンの増殖の抑制能
Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオンの増殖能を観察するために、先の方法で２４時間毎に培地を交替しながら、交替したｓｕｐの全体を集めて、ビリオンＤＮＡを抽出し、Quantitech SYBR Green Master-Mixキット（Qiagen）でリアルタイム定量ＰＣＲを行った。全体ｓｕｐは、ＳＷ２８スウィングローターにより２０，０００ｒｐｍで２時間超遠心分離機でウイルスを沈殿した後、沈殿したウイルスペレットを、滅菌のＤＷ２００μｌで解した。ビリオンＤＮＡを抽出するために、１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ａを処理し、溶解緩衝液（０．２５％ＳＤＳ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ）１００μlを加えた後、プロテイナーゼＫを５００μｇ／ｍｌ入れて、３７℃で２時間反応させた。その後、フェノール：クロロフォルム抽出方法で抽出した。ウイルス増殖能を調べるために、ＨＢＶの小さい表面積部分を標的とするリアルタイムＰＣＲプライマーを、ＳＦ‐Ｒｅａｌ（５’－ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＣ‐３’、配列番号９）と、 ＳＲ‐Ｒｅａｌ（５’－ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＣＧＡ ＡＴ‐３’、配列番号１０）とを作製する。９６ウェルプレートに１２．５μｌのＩＱ ＳＹＢＲグリーンスパーメックス（Biorad, California, USA）、１．２５μｌのＳＦ‐Ｒｅａｌプライマー、１．２５μｌのＳＲ‐Ｒｅａｌプライマー、９μlの滅菌蒸留水、１μlのcＤＮＡを入れた。ExicyclerTM９６リアルタイム定量逆ブロックシステム（Bioneer Co., Korea）を用いて、９５℃で５分、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒で４０サイクルとし、 融解曲線（melting curve）分析のために、９５℃で０秒、５３℃で３０秒、及び秒当りの０．１℃ずつ調節して、５３℃から９０℃まで温度を上昇させた。
Ｗ４Ｐを含んだ全体ＨＢＶのビリオンの増殖能を観察するために、先の方法で２４時間毎に培地を交替しながら、交替したｓｕｐの全体を集めて、ビリオンＤＮＡを抽出し、Quantitech SYBR Green Master-Mixキット（Qiagen）でリアルタイム定量ＰＣＲを行った。全体ｓｕｐは、ＳＷ２８スウィングローターにより２０，０００ｒｐｍで２時間超遠心分離機でウイルスを沈殿した後、沈殿したウイルスペレットを、滅菌のＤＷ２００μｌで解した。ビリオンＤＮＡを抽出するために、１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ａを処理し、溶解緩衝液（０．２５％ＳＤＳ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ）１００μlを加えた後、プロテイナーゼＫを５００μｇ／ｍｌ入れて、３７℃で２時間反応させた。その後、フェノール：クロロフォルム抽出方法で抽出した。ウイルス増殖能を調べるために、ＨＢＶの小さい表面積部分を標的とするリアルタイムＰＣＲプライマーを、ＳＦ‐Ｒｅａｌ（５’－ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＣ‐３’、配列番号９）と、 ＳＲ‐Ｒｅａｌ（５’－ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＣＧＡ ＡＴ‐３’、配列番号１０）とを作製する。９６ウェルプレートに１２．５μｌのＩＱ ＳＹＢＲグリーンスパーメックス（Biorad, California, USA）、１．２５μｌのＳＦ‐Ｒｅａｌプライマー、１．２５μｌのＳＲ‐Ｒｅａｌプライマー、９μlの滅菌蒸留水、１μlのcＤＮＡを入れた。ExicyclerTM９６リアルタイム定量逆ブロックシステム（Bioneer Co., Korea）を用いて、９５℃で５分、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒で４０サイクルとし、 融解曲線（melting curve）分析のために、９５℃で０秒、５３℃で３０秒、及び秒当りの０．１℃ずつ調節して、５３℃から９０℃まで温度を上昇させた。
【0165】
形質転換マウス
ＨＢＶ形質転換マウスは、全てのＯＲＦ（open reading frame）を含むＨＢＶ塩基配列の１．１倍をマウスの受精卵に微細注入法で注入した。研究に用いられるＨＢＶ塩基配列は、ｐＨＹ９２‐Ｗ４Ｐプラスミドを用いて得た。ｐＨＹ９２‐Ｗ４Ｐプラスミドは、マウスの受精卵に注入する前に、ＥｃｏＲＩにより切断して最終的に３．９ｋｂ長さの塩基配列を微細注入法に用いた。生成された個体は、ＨＢｓＡｇ特定の配列を用いたＰＣＲにより選別した。ＰＣＲ‐陽性個体は、血清のＨＢｓＡｇと、ＨＢｅＡｇとの濃度に応じて選別して、最終的にＰＣＲ‐陽性、ＨＢｓＡｇ‐陽性、ＨＢｅＡｇ‐陽性のマウスを研究に用いた。このマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと逆交配して、異型のＨＢＶ形質転換マウスを産生する。子孫のうち高いＨＢｓＡｇ‐、ＨＢｅＡｇ‐陽性数値を表すマウスに対して、サザン（southern）、ノーザン（northern）の混成化を実施して、肝細胞のＨＢＶ複製の中間体と転写を確認した。このうち高い肝細胞のＨＢＶ複製の中間体と転写を示すＨＢＶ形質転換マウスを、ＰＥＰ１による抗ウイルスの研究に使用した。
ＨＢＶ形質転換マウスは、全てのＯＲＦ（open reading frame）を含むＨＢＶ塩基配列の１．１倍をマウスの受精卵に微細注入法で注入した。研究に用いられるＨＢＶ塩基配列は、ｐＨＹ９２‐Ｗ４Ｐプラスミドを用いて得た。ｐＨＹ９２‐Ｗ４Ｐプラスミドは、マウスの受精卵に注入する前に、ＥｃｏＲＩにより切断して最終的に３．９ｋｂ長さの塩基配列を微細注入法に用いた。生成された個体は、ＨＢｓＡｇ特定の配列を用いたＰＣＲにより選別した。ＰＣＲ‐陽性個体は、血清のＨＢｓＡｇと、ＨＢｅＡｇとの濃度に応じて選別して、最終的にＰＣＲ‐陽性、ＨＢｓＡｇ‐陽性、ＨＢｅＡｇ‐陽性のマウスを研究に用いた。このマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと逆交配して、異型のＨＢＶ形質転換マウスを産生する。子孫のうち高いＨＢｓＡｇ‐、ＨＢｅＡｇ‐陽性数値を表すマウスに対して、サザン（southern）、ノーザン（northern）の混成化を実施して、肝細胞のＨＢＶ複製の中間体と転写を確認した。このうち高い肝細胞のＨＢＶ複製の中間体と転写を示すＨＢＶ形質転換マウスを、ＰＥＰ１による抗ウイルスの研究に使用した。
【0166】
流体力学（Hydrodynamic）注入法を用いた動物実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体ＤＮＡ（1.8ml solution injected wittin 5s into 20g mice）を注入した後、翌日からＰＥＰ１（５０ μｇ／ｋｇ）を、１週間に２回皮下注射して処理した。血液サンプルは、１、３、７、１０、そして１４日、２週間獲得し、１４日目に麻酔した後、全血を獲得して犠牲した。血液を採取して、血清を分離し、肝は迅速に切開して均質化（homogenize）した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体ＤＮＡ（1.8ml solution injected wittin 5s into 20g mice）を注入した後、翌日からＰＥＰ１（５０ μｇ／ｋｇ）を、１週間に２回皮下注射して処理した。血液サンプルは、１、３、７、１０、そして１４日、２週間獲得し、１４日目に麻酔した後、全血を獲得して犠牲した。血液を採取して、血清を分離し、肝は迅速に切開して均質化（homogenize）した。
【0167】
ＨＢｓＡｇ測定、ＨＢＶ力価の定量及びウェスタンブロット
ＨＢＶ-形質転換マウスのＨＢｓＡｇ数値は、ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡキット（BIOKIT, Germany）を用いて測定した。ＨＢＶ力価を定量するために、全てのＤＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲにより確認した。ウェスタンブロットのために、８Ｍ尿素と同じ量のタンパク質溶解液を用いて細胞を溶解し、電気永動を用いて分離し、抗体と結合させ、化学発光探知ＥＣＬキット（Perkin Elmer, USA）を用いて確認した。
ＨＢＶ-形質転換マウスのＨＢｓＡｇ数値は、ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡキット（BIOKIT, Germany）を用いて測定した。ＨＢＶ力価を定量するために、全てのＤＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲにより確認した。ウェスタンブロットのために、８Ｍ尿素と同じ量のタンパク質溶解液を用いて細胞を溶解し、電気永動を用いて分離し、抗体と結合させ、化学発光探知ＥＣＬキット（Perkin Elmer, USA）を用いて確認した。
【0168】
ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット
ＲＥｚｏｌ（Protech Technologies, Taiwan）を用いた細胞溶解を通じて抽出された細胞ＲＮＡを、イソプロパノール沈殿を用いて分離した。得られたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ-ｆｒｅｅ ＤＮＡｓｅ Ｉ（Roche, Germany）を３７℃、３０分間処理して、残余ＤＮＡプラスミドを除去した。その後、フェノール／クロロフォルムを用いて抽出し、エタノール沈殿と再懸濁とを用いて、ＲＮＡを精製した。ノーザンブロットのために、同じ量のＲＮＡを、２％フォルムアルデヒドゲルによる電気永動により分離し、メンブレン（membrane）に移動して、ＨＢＶの全塩基に相応するＰ３２‐標識されたＨＢＶ全長プローブに染色を行った。ローディングコントロールとして、同一のメンブレンでＰ３２‐標識されたＧＡＰＤＨプローブの混成化を使用した。
ＲＥｚｏｌ（Protech Technologies, Taiwan）を用いた細胞溶解を通じて抽出された細胞ＲＮＡを、イソプロパノール沈殿を用いて分離した。得られたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ-ｆｒｅｅ ＤＮＡｓｅ Ｉ（Roche, Germany）を３７℃、３０分間処理して、残余ＤＮＡプラスミドを除去した。その後、フェノール／クロロフォルムを用いて抽出し、エタノール沈殿と再懸濁とを用いて、ＲＮＡを精製した。ノーザンブロットのために、同じ量のＲＮＡを、２％フォルムアルデヒドゲルによる電気永動により分離し、メンブレン（membrane）に移動して、ＨＢＶの全塩基に相応するＰ３２‐標識されたＨＢＶ全長プローブに染色を行った。ローディングコントロールとして、同一のメンブレンでＰ３２‐標識されたＧＡＰＤＨプローブの混成化を使用した。
【0169】
ＨＢＶコア結合のＤＮＡの分離及びサザンブロット
マウスの肝組織からＨＢＶ ＤＮＡを抽出するために、既存の過程に従い、次のような方法を用いる。細胞を溶解するために、１０ｃｍディシー当り１．２ｍＬのＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ‐４０）を添加して、３７℃で１時間、攪拌培養を実施し、遠心分離（１３ｋ ｒｐｍ、１０分、４℃）を実施して核を除去した。上清は、６ｍＭのＣａＣｌ２により調節して、Micrococcal Nuclease（Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden）を、３７℃で３０分間培養し、細胞質内のＲＮＡ又は残余のＤＮＡプラスミドを分解した。その後、ＥＤＴＡ２０ｍＭ を用いて、６５℃で１５分間、酵素を不活性化した。プロテイナーゼＫ（Sigma）２００μｇ／ｍｌと、ＳＤＳ０．５％と、５０℃で一晩反応させ、上清のタンパク質を分解し、ＨＢＶコア結合のＤＮＡを抽出した。ＨＢＶ ＤＮＡは、フェノール／クロロフォルムを用いて抽出し、エタノール沈殿とＴＥ緩衝液の再懸濁（resuspension）により精製した。サザンブロットのために、精製したＨＢＶ ＤＮＡ量の１／５を、１．５％電気永動により分離し、メンブレンに移動して、Ｐ３２‐標識されたＨＢＶ全長プローブを用いた。
マウスの肝組織からＨＢＶ ＤＮＡを抽出するために、既存の過程に従い、次のような方法を用いる。細胞を溶解するために、１０ｃｍディシー当り１．２ｍＬのＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ‐４０）を添加して、３７℃で１時間、攪拌培養を実施し、遠心分離（１３ｋ ｒｐｍ、１０分、４℃）を実施して核を除去した。上清は、６ｍＭのＣａＣｌ２により調節して、Micrococcal Nuclease（Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden）を、３７℃で３０分間培養し、細胞質内のＲＮＡ又は残余のＤＮＡプラスミドを分解した。その後、ＥＤＴＡ２０ｍＭ を用いて、６５℃で１５分間、酵素を不活性化した。プロテイナーゼＫ（Sigma）２００μｇ／ｍｌと、ＳＤＳ０．５％と、５０℃で一晩反応させ、上清のタンパク質を分解し、ＨＢＶコア結合のＤＮＡを抽出した。ＨＢＶ ＤＮＡは、フェノール／クロロフォルムを用いて抽出し、エタノール沈殿とＴＥ緩衝液の再懸濁（resuspension）により精製した。サザンブロットのために、精製したＨＢＶ ＤＮＡ量の１／５を、１．５％電気永動により分離し、メンブレンに移動して、Ｐ３２‐標識されたＨＢＶ全長プローブを用いた。
【0170】
ＩＬ６、ＴＮＦαサイトカインの分析
ＰＥＰ１処理をした形質転換マウスと、流体力学注入モデルから獲得したマウスとの血清において、ＩＬ６と、ＴＮＦαとのレベルを比較するために、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡキットを用い、提供された方式に従って行った。ＥＬＩＳＡリーダー（Beckman, USA）で４５０ｎｍ級光度として読み取った。
ＰＥＰ１処理をした形質転換マウスと、流体力学注入モデルから獲得したマウスとの血清において、ＩＬ６と、ＴＮＦαとのレベルを比較するために、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡキットを用い、提供された方式に従って行った。ＥＬＩＳＡリーダー（Beckman, USA）で４５０ｎｍ級光度として読み取った。
【0171】
ＲＮＡ発現の分析
マウスの肝組織から獲得したＲＮＡを用いて、炎症関連のサイトカインＩＬ６、ＩＬ１β、ＴＮＦαのＲＮＡレベルで比較観察し、肝繊維化のマーカーであるＴＧＦβ、コラーゲナーゼＩ及びＩＶの発現を比較し、免疫細胞マーカー４／８０、ＣＤ６８と、ケモカイン誘引剤（chemokine attractant）タンパク質と、その受容体のＲＮＡの発現程度を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。対照群ＲＮＡは、１８Ｓの発現と比較した。
マウスの肝組織から獲得したＲＮＡを用いて、炎症関連のサイトカインＩＬ６、ＩＬ１β、ＴＮＦαのＲＮＡレベルで比較観察し、肝繊維化のマーカーであるＴＧＦβ、コラーゲナーゼＩ及びＩＶの発現を比較し、免疫細胞マーカー４／８０、ＣＤ６８と、ケモカイン誘引剤（chemokine attractant）タンパク質と、その受容体のＲＮＡの発現程度を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。対照群ＲＮＡは、１８Ｓの発現と比較した。
【0172】
自然型及び全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体注入マウスの脾臓内免疫細胞の分析
形質転換マウスの脾臓を分離した後、脾臓内免疫細胞を収穫し、フローサイトメーターを用いて、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＴＦＨ細胞）、ＮＫＴ細胞などの分布を分析した。脾臓細胞を、精製された自然型及び変異株の外皮抗原と共に培養し、Ｔ細胞の増殖をチミジン吸収（thymidine uptake）技法を通じて測定した。同時に、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体などを処理し、Ｔ細胞の増殖を同一の方法で測定して、マイトジェン（mitogen）処理後のＴ細胞の増殖能を研究した。
形質転換マウスの脾臓を分離した後、脾臓内免疫細胞を収穫し、フローサイトメーターを用いて、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＴＦＨ細胞）、ＮＫＴ細胞などの分布を分析した。脾臓細胞を、精製された自然型及び変異株の外皮抗原と共に培養し、Ｔ細胞の増殖をチミジン吸収（thymidine uptake）技法を通じて測定した。同時に、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体などを処理し、Ｔ細胞の増殖を同一の方法で測定して、マイトジェン（mitogen）処理後のＴ細胞の増殖能を研究した。
【0173】
自然型及び全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体注入マウスの肝内免疫細胞の分析
肝文脈を通じて、コラーゲナーゼを含んだ消化（digestion）溶液を用いて、肝のかん流（perfusion）後、肝を均質化し、消化溶液から細胞を得た後、低い遠心分離（３０ ＲＣＦ／３分）を通じて、肝細胞を除去し、勾配（gradient）遠心分離により肝内免疫細胞を収穫した。Ｆｃ‐ブロック後、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＮＫ１．１、抗ＣＤ１９、 抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃなどの抗体を用いて、フローサイトメトリーを行い、肝内免疫細胞の分布を分析した。
肝文脈を通じて、コラーゲナーゼを含んだ消化（digestion）溶液を用いて、肝のかん流（perfusion）後、肝を均質化し、消化溶液から細胞を得た後、低い遠心分離（３０ ＲＣＦ／３分）を通じて、肝細胞を除去し、勾配（gradient）遠心分離により肝内免疫細胞を収穫した。Ｆｃ‐ブロック後、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＮＫ１．１、抗ＣＤ１９、 抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃなどの抗体を用いて、フローサイトメトリーを行い、肝内免疫細胞の分布を分析した。
【0174】
Ｔ‐細胞活性の分析
外皮抗原を発現するＰ８１５細胞株を製造して、脾臓及び肝から得た免疫細胞を５日間活性化した後、外皮抗原を発現するＰ８１５細胞を、ターゲット細胞として使用し、分離されたＴ細胞の細胞毒性（cytotoxicity）を分析し、細胞質Ｔ細胞の活性化程度を測定した。また、脾臓と肝から得た免疫細胞からＴ細胞を、Ｔ‐細胞濃縮カラム（R&D）を用いて分離した後、外皮抗原発現Ｐ８１５細胞株と共に、１６時間培養した後、２型インターフェロン（Interferon-γ）ＥＬＩＳＰＯＴキットを用いて、特異的にγ‐インターフェロンを産生するＴ細胞を測定した。
外皮抗原を発現するＰ８１５細胞株を製造して、脾臓及び肝から得た免疫細胞を５日間活性化した後、外皮抗原を発現するＰ８１５細胞を、ターゲット細胞として使用し、分離されたＴ細胞の細胞毒性（cytotoxicity）を分析し、細胞質Ｔ細胞の活性化程度を測定した。また、脾臓と肝から得た免疫細胞からＴ細胞を、Ｔ‐細胞濃縮カラム（R&D）を用いて分離した後、外皮抗原発現Ｐ８１５細胞株と共に、１６時間培養した後、２型インターフェロン（Interferon-γ）ＥＬＩＳＰＯＴキットを用いて、特異的にγ‐インターフェロンを産生するＴ細胞を測定した。
【0175】
統計処理
ＳＰＳＳ１２．０Ｋプログラムを用いて、各範疇間の差を比較する際には、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）やカイ二乗検定（Chi-square test）を用いる。連続変数には、値が正規分布を従う場合、スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用い、そうでない場合には、マン‐ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）を用いて分析した。Ｐ値が０．０５以下である場合、統計的に有意であると判定した。
ＳＰＳＳ１２．０Ｋプログラムを用いて、各範疇間の差を比較する際には、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）やカイ二乗検定（Chi-square test）を用いる。連続変数には、値が正規分布を従う場合、スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用い、そうでない場合には、マン‐ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）を用いて分析した。Ｐ値が０．０５以下である場合、統計的に有意であると判定した。
【0176】
実験結果の分析
１）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅｐＧ２細胞株におけるＰＥＰ１ペプチドによるＨＢｓＡｇ合成抑制能の確認
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇと、ビリオン分泌を誘導する本研究室で確立した全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を用い、様々なヒト肝細胞癌の細胞株を用いて、ＰＥＰ１のＨＢｓＡｇ分泌に及ぼす影響を観察した。Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、そしてＨｅｐＧ２細胞株に、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体をトランジエントトランスフェクション（transient transfection）した後、ＰＥＰ１ １０μＭと、代表的な抗ウイルス剤のラミブジン（ramivudine、以下３ＴＣ）１０μＭとを処理した後、４８時間後に、ペレット（pellet）と、ｓｕｐ（上清, supernatant）とを回収し、ＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＨＢｓＡｇのレベルにつき、 ＨｅｐＧ２細胞株においては、細胞内外で全てＰＥＰ１ により抑制効果を示し、Ｈｕｈ７細胞株においては、細胞内では抑制したが、細胞外では差がなかった。一方、Ｈｕｈ７．５細胞株においては、細胞内外で全て効果がなかった。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（polymerase inhibitor）である３ＴＣもまた、対照群に比べて、抑制効果を示してはいたが、ＰＥＰ１処理群と比較しては、大きな差を示さなかった（図４３）。このような結果から、代表的な抗ウイルス剤の３ＴＣと同様に、ＨＢＶのＨＢｓＡｇ合成におけるＰＥＰ１ペプチドによる抑制効果があることが立証された（データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
１）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅｐＧ２細胞株におけるＰＥＰ１ペプチドによるＨＢｓＡｇ合成抑制能の確認
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇと、ビリオン分泌を誘導する本研究室で確立した全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を用い、様々なヒト肝細胞癌の細胞株を用いて、ＰＥＰ１のＨＢｓＡｇ分泌に及ぼす影響を観察した。Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、そしてＨｅｐＧ２細胞株に、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体をトランジエントトランスフェクション（transient transfection）した後、ＰＥＰ１ １０μＭと、代表的な抗ウイルス剤のラミブジン（ramivudine、以下３ＴＣ）１０μＭとを処理した後、４８時間後に、ペレット（pellet）と、ｓｕｐ（上清, supernatant）とを回収し、ＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＨＢｓＡｇのレベルにつき、 ＨｅｐＧ２細胞株においては、細胞内外で全てＰＥＰ１ により抑制効果を示し、Ｈｕｈ７細胞株においては、細胞内では抑制したが、細胞外では差がなかった。一方、Ｈｕｈ７．５細胞株においては、細胞内外で全て効果がなかった。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（polymerase inhibitor）である３ＴＣもまた、対照群に比べて、抑制効果を示してはいたが、ＰＥＰ１処理群と比較しては、大きな差を示さなかった（図４３）。このような結果から、代表的な抗ウイルス剤の３ＴＣと同様に、ＨＢＶのＨＢｓＡｇ合成におけるＰＥＰ１ペプチドによる抑制効果があることが立証された（データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【0177】
２）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅｐＧ２細胞株におけるＰＥＰ１ペプチドによるビリオン（Virion）形成抑制能の確認
ＨＢｓＡｇ分泌能が、ＰＥＰ１ペプチドにより抑制されたことを観察した後、ｓｕｐでビリオン形成能も観察するために、先の方法で得たｓｕｐからＰＥＧ６０００を用いてビリオンを集めた後、ウイルスＤＮＡ prep kit（Intron, Korea）を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲで定量化した。その結果、ｓｕｐに形成されたビリオンのレベルが、ＨｅｐＧ２とＨｕｈ７細胞株では、３ＴＣと同様に、全てＰＥＰ１により抑制効果を示したが、Ｈｕｈ７．５細胞株では、ビリオン分泌に影響を及ぼさなかった。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（polymerase inhibitor）である３ＴＣもまた、対照群に比べて、抑制効果を示してはいたが、ＨＢｓＡｇ合成能と同様に、ＰＥＰ１処理群と比較しては大きな差を示していなかった（図４４ａ、図４４ｂ、及び図４４ｃ）。このような結果から、 代表的な抗ウイルス剤の３ＴＣと同様に、ＨＢＶのビリオン形成におけるＰＥＰ１ペプチドによる抑制効果があることが立証された（データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ ＜０．０５、＊＊*Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
ＨＢｓＡｇ分泌能が、ＰＥＰ１ペプチドにより抑制されたことを観察した後、ｓｕｐでビリオン形成能も観察するために、先の方法で得たｓｕｐからＰＥＧ６０００を用いてビリオンを集めた後、ウイルスＤＮＡ prep kit（Intron, Korea）を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲで定量化した。その結果、ｓｕｐに形成されたビリオンのレベルが、ＨｅｐＧ２とＨｕｈ７細胞株では、３ＴＣと同様に、全てＰＥＰ１により抑制効果を示したが、Ｈｕｈ７．５細胞株では、ビリオン分泌に影響を及ぼさなかった。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（polymerase inhibitor）である３ＴＣもまた、対照群に比べて、抑制効果を示してはいたが、ＨＢｓＡｇ合成能と同様に、ＰＥＰ１処理群と比較しては大きな差を示していなかった（図４４ａ、図４４ｂ、及び図４４ｃ）。このような結果から、 代表的な抗ウイルス剤の３ＴＣと同様に、ＨＢＶのビリオン形成におけるＰＥＰ１ペプチドによる抑制効果があることが立証された（データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ ＜０．０５、＊＊*Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0178】
３）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したＨｅｐＧ２細胞株におけるＰＥＰ１ペプチドの濃度によるＨＢｓＡｇ合成抑制能の確認
Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅｐＧ２細胞株において、ＰＥＰ１ペプチドによるＨＢｓＡｇ合成の抑制効果を観察した結果、最も効果的なＨｅｐＧ２細胞株を用いて、ＰＥＰ１の濃度による効果を観察するために、ＨｅｐＧ２細胞株に全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ペプチドを、０．０１、０．１、１、１０、１００μＭ濃度に応じて処理し、４８時間後、ペレットとｓｕｐとを集めて、ＥＬＩＳＡを行った。対照群として、抗ウイルス剤３ＴＣも同様な方法で処理した。その結果、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットで、０．０１μＭから抑制効果を示すが、濃度によって多少差があり、ｓｕｐでは、１０μＭ濃度まで抑制効果を示したが、１００μＭでは、全く効果がないと観察された。反面、３ＴＣは、ペレットとｓｕｐの両方において、濃度による抑制効果が観察できた。このような結果から、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットにおいて、ＨＢｓＡｇ合成能に濃度依存的な効果を示すことを確認した（図４５、データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ ＜０．００１）。
Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅｐＧ２細胞株において、ＰＥＰ１ペプチドによるＨＢｓＡｇ合成の抑制効果を観察した結果、最も効果的なＨｅｐＧ２細胞株を用いて、ＰＥＰ１の濃度による効果を観察するために、ＨｅｐＧ２細胞株に全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ペプチドを、０．０１、０．１、１、１０、１００μＭ濃度に応じて処理し、４８時間後、ペレットとｓｕｐとを集めて、ＥＬＩＳＡを行った。対照群として、抗ウイルス剤３ＴＣも同様な方法で処理した。その結果、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットで、０．０１μＭから抑制効果を示すが、濃度によって多少差があり、ｓｕｐでは、１０μＭ濃度まで抑制効果を示したが、１００μＭでは、全く効果がないと観察された。反面、３ＴＣは、ペレットとｓｕｐの両方において、濃度による抑制効果が観察できた。このような結果から、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットにおいて、ＨＢｓＡｇ合成能に濃度依存的な効果を示すことを確認した（図４５、データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ ＜０．００１）。
【0179】
４）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したＨｅｐＧ２細胞株におけるＰＥＰ１ペプチドの濃度によるビリオン形成抑制能
前記実験の細胞ｓｕｐにおいて、ペプチドの濃度によるビリオン形成能を観察するために、ｓｕｐからビリオンを取得して、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットにおいて、０．０１μＭの低濃度では効果がなく、その反面、１０μＭの濃度で約４８％の減少効果を示したが、１００μＭの高濃度では、返って全く効果を示さなかった。一方、３ＴＣは、ビリオン合成においても、濃度による抑制効果が観察できた。このような結果から、ＰＥＰ１ペプチドは、ビリオン形成において、１０μＭ濃度まで濃度依存的な効果を示すことを確認した（図４６、データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ ＜０．００１）。
前記実験の細胞ｓｕｐにおいて、ペプチドの濃度によるビリオン形成能を観察するために、ｓｕｐからビリオンを取得して、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、ＰＥＰ１ペプチドは、ペレットにおいて、０．０１μＭの低濃度では効果がなく、その反面、１０μＭの濃度で約４８％の減少効果を示したが、１００μＭの高濃度では、返って全く効果を示さなかった。一方、３ＴＣは、ビリオン合成においても、濃度による抑制効果が観察できた。このような結果から、ＰＥＰ１ペプチドは、ビリオン形成において、１０μＭ濃度まで濃度依存的な効果を示すことを確認した（図４６、データのＳＥＭは、duplicateで３回実験した値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ ＜０．００１）。
【0180】
５）ＰＥＰ１ペプチドによるＨＮＦ４αの発現に及ぼす影響
肝細胞核因子（Hepatocyte nuclear factor）４αは、ＨＢＶインヘンサー（enhancer）Ｉに結合することにより、ＨＢＶの合成に重要な役割をすると知られている。したがって、ＨｅｐＧ２細胞株に、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ １０μＭを処理し、４８時間後、ペレットからタンパク質を抽出して、ウェスタンブロットを行った。対照群として、mock vectorを注入して比較した。
肝細胞核因子（Hepatocyte nuclear factor）４αは、ＨＢＶインヘンサー（enhancer）Ｉに結合することにより、ＨＢＶの合成に重要な役割をすると知られている。したがって、ＨｅｐＧ２細胞株に、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ １０μＭを処理し、４８時間後、ペレットからタンパク質を抽出して、ウェスタンブロットを行った。対照群として、mock vectorを注入して比較した。
【0181】
その結果、ＨＢＶ増殖を誘導する全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したとき、増加したＨＮＦ４αの発現が観察されたが、ＨＮＦ４αの発現は、ＰＥＰ１ペプチドにより、３ＴＣより最も効果的に減少することがを確認した。これにより、ＰＥＰ１ペプチドのＨＢＶの抗ウイルス効果は、転写因子（transcription factor）であるＨＮＦ４αの発現調節によりウイルス増殖を抑制することを立証した（図４７）。
【0182】
６）ＰＥＰ１ペプチドによる炎症関連のサイトカインに及ぼす影響
ＨＢＶのｐｒｅＳ１Ｗ４Ｐ変異株は、炎症調節サイトカインＩＬ－６の形成にも密接な関連があると報告されている。したがって、ＩＬ－６ が誘導された細胞株において、ＰＥＰ１による抗炎症効果を観察するために、ＨｅｐＧ２とＨｕｈ７細胞株に全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ １０μＭと、３ＴＣ １０μＭとを それぞれ処理し、４８時間後、培養ｓｕｐからＩＬ－６のレベルを、ＥＬＩＳＡにより観察した。その結果、ＩＬ－６増殖を誘導する全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したとき、ＨｅｐＧ２細胞株では、ＩＬ－６レベルが全く検出されない程度に低いレベルで存在し、Ｈｕｈ７細胞株でも、ＰＥＰ１により、ＩＬ－６の抑制効果は観察されなかった。３ＴＣ処理群も同様に、全くＩＬ－６サイトカインの形成には影響を及ぼさないことを観察した（図４８）。
ＨＢＶのｐｒｅＳ１Ｗ４Ｐ変異株は、炎症調節サイトカインＩＬ－６の形成にも密接な関連があると報告されている。したがって、ＩＬ－６ が誘導された細胞株において、ＰＥＰ１による抗炎症効果を観察するために、ＨｅｐＧ２とＨｕｈ７細胞株に全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入した後、ＰＥＰ１ １０μＭと、３ＴＣ １０μＭとを それぞれ処理し、４８時間後、培養ｓｕｐからＩＬ－６のレベルを、ＥＬＩＳＡにより観察した。その結果、ＩＬ－６増殖を誘導する全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入したとき、ＨｅｐＧ２細胞株では、ＩＬ－６レベルが全く検出されない程度に低いレベルで存在し、Ｈｕｈ７細胞株でも、ＰＥＰ１により、ＩＬ－６の抑制効果は観察されなかった。３ＴＣ処理群も同様に、全くＩＬ－６サイトカインの形成には影響を及ぼさないことを観察した（図４８）。
【0183】
７）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体の形質転換マウスにおけるＰＥＰ１のＨＢｓＡｇ合成能と、ビリオンとへの影響
ＰＥＰ１ペプチドによる抗ウイルス効果を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＨＢｓＡｇ合成能を観察した。ＰＥＰ１ペプチドを、５０μｇ／ｋｇ濃度で１週間に２回ずつ、マウスの尾静脈に注入した。対照群として、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇを、ＰＥＰ１ペプチドと同様に注入して、４週、８週後、マウスの全血を採血して、血清からＨＢｓＡｇレベルを観察するために、ＨＢｓ ＥＬＩＳＡを行った。また、マウスの血清からＨＢＶビリオンＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲを行った。
ＰＥＰ１ペプチドによる抗ウイルス効果を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＨＢｓＡｇ合成能を観察した。ＰＥＰ１ペプチドを、５０μｇ／ｋｇ濃度で１週間に２回ずつ、マウスの尾静脈に注入した。対照群として、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇを、ＰＥＰ１ペプチドと同様に注入して、４週、８週後、マウスの全血を採血して、血清からＨＢｓＡｇレベルを観察するために、ＨＢｓ ＥＬＩＳＡを行った。また、マウスの血清からＨＢＶビリオンＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲを行った。
【0184】
その結果、血清内のＨＢｓＡｇのレベルは、４週まで処理したとき、ＰＥＰ１ペプチドと３ＴＣの両方とも減少効果を示さなかったが、８週目には、ＰＥＰ１ペプチドにより約１０％ほど減少効果を示し、その反面、３ＴＣは、効果がなかった。また、ビリオンレベルを観察するために、マウスの血清からビリオンＤＮＡを獲得して、リアルタイムＰＣＲを行った結果、４週目には、ＨＢｓＡｇと同様に、両方ともビリオンの抑制効果は、観察されなかったが、８週目には、ＰＥＰ１ペプチドが約５０％、３ＴＣは約５２％の抑制効果を示した。これにより、ＰＥＰ１が、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体が含まれた形質転換マウスで形成されるビリオンの形成及び分泌を抑制することを確認した（図４９）。
【0185】
８）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体の形質転換マウスにおけるＰＥＰ１ペプチドによるタンパク質発現への影響
ＰＥＰ１ペプチドによる抗ウイルス効果に及ぼすタンパク質発現の変化を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて観察した。ＰＥＰ１ペプチドを、５０μｇ／ｋｇの濃度で１週間に２回ずつマウスの尾静脈に注入した。対照群として、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇを、ＰＥＰ１ペプチドと同様に注入した。８週目に、マウスから全血を採血し、マウスの肝からタンパク質を抽出した後、ウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現を観察した。
ＰＥＰ１ペプチドによる抗ウイルス効果に及ぼすタンパク質発現の変化を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて観察した。ＰＥＰ１ペプチドを、５０μｇ／ｋｇの濃度で１週間に２回ずつマウスの尾静脈に注入した。対照群として、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇを、ＰＥＰ１ペプチドと同様に注入した。８週目に、マウスから全血を採血し、マウスの肝からタンパク質を抽出した後、ウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現を観察した。
【0186】
その結果、ＨＢＶの増殖に作用するにあたって重要なＨＢＶの逆転写酵素の活性と密接な関連のあるHeat Shock Protein 90（ＨＳＰ ９０）と、ＨＢＶにより慢性的に感染されている患者において活性が増加しているスーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase、ＳＯＤ）の発現において、ＰＥＰ１ペプチドによる影響は観察されなかったが、様々なシグナル経路で、転写活性化剤（transcriptional activator）として作用するHBxによる肝細胞癌の進行過程に密接な関連のあるｒａｓ／ｒａｆ‐分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（mitogen activated protein kinase、ＭＡＰＫ）のうち、特に細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（extracellular signal - regulated protein kinase、ＥＲＫ）タンパク質のリン酸化は、ＰＥＰ１ペプチドにより発現が抑制され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（Jenus kinase/signal and transducer and activator transcription factor）のシグナルのうち、ＪＡＫ２のリン酸化もまた、ＰＥＰ１ペプチドにより調節されることを確認した。対照群である３ＴＣもまた、ＥＲＫとＪＡＫ２シグナルのリン酸化を抑制することが確認できた。これにより、ＰＥＰ１ペプチドは、ＨＢＶの増殖を調節して、肝細胞癌の進行過程において重要な役割を果たすＭＡＰＫと、ＪＡＫ／ＳＴＡＴとのシグナルを調節することにより、ＨＢＶによる肝細胞癌の進行を抑制できる重要な役割を果たすと思料される（図５０）。
【0187】
９）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体の形質転換マウスにおけるＰＥＰ１ペプチドによる免疫細胞分布への影響
ＰＥＰ１は、テロメラーゼに由来のＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ結合ペプチドで、Ｔ‐細胞と、補助Ｔ－細胞との免疫反応を誘発する１６個のアミノ酸ペプチドである。したがって、ＰＥＰ１ペプチドによる腎臓の免疫細胞分布の変化を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、４週目にマウスから全血を採血し、マウスの腎臓を獲得して免疫細胞を分離した後、リンパー球マーカー（lymphocyte marker（Ｂ細胞（ＣＤ１９Ｂ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１細胞））と、骨髄細胞マーカー（ＤＣ（ＣＤ１１ｃ）、大食細胞（マクロファージ（Ｆ４／８０））、好中球（neutrophil）（Ｌｙ‐６Ｇ）、単核球（monocyte）（Ｇｒ１））を用いて細胞外細胞表面（extracellular cell surface）染色方法で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
ＰＥＰ１は、テロメラーゼに由来のＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ結合ペプチドで、Ｔ‐細胞と、補助Ｔ－細胞との免疫反応を誘発する１６個のアミノ酸ペプチドである。したがって、ＰＥＰ１ペプチドによる腎臓の免疫細胞分布の変化を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、４週目にマウスから全血を採血し、マウスの腎臓を獲得して免疫細胞を分離した後、リンパー球マーカー（lymphocyte marker（Ｂ細胞（ＣＤ１９Ｂ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１細胞））と、骨髄細胞マーカー（ＤＣ（ＣＤ１１ｃ）、大食細胞（マクロファージ（Ｆ４／８０））、好中球（neutrophil）（Ｌｙ‐６Ｇ）、単核球（monocyte）（Ｇｒ１））を用いて細胞外細胞表面（extracellular cell surface）染色方法で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0188】
その結果、ＰＥＰ１ペプチドにより、リンパー球（lymphocyte）であるＢ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１細胞のいずれも有意的な差を示さなく、骨髄系の細胞であるＤＣ、マクロファージ、好中球、単核球もまた、細胞分布に影響を及ぼさないと確認した。３ＴＣもまた、ＰＥＰ１と同様に、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ形質転換マウスの免疫細胞の分布に影響を及ぼさないと確認した（図５１ａ ～図５１ｈ ）。
【0189】
１０）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体の形質転換マウスにおけるＰＥＰ１ペプチドによるインターフェロンγ（ＩＮＦγ）活性への影響
ウイルスに対抗して、免疫細胞からホルモン様のサイトカインであるＩＮＦを分泌する。このようなＩＮＦでは、α、β、γが存在し、このうちＩＮＦγが、人体内でＢ型肝炎ウイルスの抑制に重要であることが知られている。したがって、ＰＥＰ１ペプチドによる免疫反応でＩＮＦγの活性に及ぼす影響を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＰＥＰ１ペプチド５０μｇ／ｋｇと、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇとの濃度で１週間に２回ずつ尾静脈に注入してから８週目に、マウスから全血を採血し、マウスの腎臓を獲得して免疫細胞を分離した後、ＨＢｓＡｇを処理して刺激した。７２時間の刺激後、ブレフェルジン（Brefeldin）Ａで細胞内にＩＮＦγサイトカインを置いた後、細胞内染色方法で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
ウイルスに対抗して、免疫細胞からホルモン様のサイトカインであるＩＮＦを分泌する。このようなＩＮＦでは、α、β、γが存在し、このうちＩＮＦγが、人体内でＢ型肝炎ウイルスの抑制に重要であることが知られている。したがって、ＰＥＰ１ペプチドによる免疫反応でＩＮＦγの活性に及ぼす影響を観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＰＥＰ１ペプチド５０μｇ／ｋｇと、３ＴＣ５００μｇ／ｋｇとの濃度で１週間に２回ずつ尾静脈に注入してから８週目に、マウスから全血を採血し、マウスの腎臓を獲得して免疫細胞を分離した後、ＨＢｓＡｇを処理して刺激した。７２時間の刺激後、ブレフェルジン（Brefeldin）Ａで細胞内にＩＮＦγサイトカインを置いた後、細胞内染色方法で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0190】
【0191】
１１）全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ遺伝体の形質転換マウスにおけるＰＥＰ１ペプチドによる大食細胞（マクロファージ）の分化への影響
マクロファージのＭ１への分化は、感染された細胞を、細胞死滅に誘導して抗ウイルス効果を示すと知られている。したがって、ＰＥＰ１ペプチドが、マクロファージをＭ１へ分化できる能力があるか否かを観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＰＢＳ、ＰＥＰ１ペプチド５０μｇ／ｋｇ、及び３ＴＣ５００μｇ／ｋｇをそれぞれ、１週間に２回ずつ尾静脈に注入してから８週目に、マウスから全血を採血した後、マウスの腎臓を獲得して、免疫細胞を分離後、マクロファージ（Ｆ４／８０）と、Ｍ１マーカーであるＭＨＣＩＩとを用いて、細胞外細胞表面（extracellular cell surface）染色方法で染色した。この後、ＦＡＣＳ分析を行った。
マクロファージのＭ１への分化は、感染された細胞を、細胞死滅に誘導して抗ウイルス効果を示すと知られている。したがって、ＰＥＰ１ペプチドが、マクロファージをＭ１へ分化できる能力があるか否かを観察するために、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体を注入してなった形質転換マウスを用いて、ＰＢＳ、ＰＥＰ１ペプチド５０μｇ／ｋｇ、及び３ＴＣ５００μｇ／ｋｇをそれぞれ、１週間に２回ずつ尾静脈に注入してから８週目に、マウスから全血を採血した後、マウスの腎臓を獲得して、免疫細胞を分離後、マクロファージ（Ｆ４／８０）と、Ｍ１マーカーであるＭＨＣＩＩとを用いて、細胞外細胞表面（extracellular cell surface）染色方法で染色した。この後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0192】
その結果、ＰＥＰ１ペプチドにおける骨髄系の細胞のうちマクロファージの分布は、有意的に増えたが、これらの細胞が、Ｍ１への分化においては、ＰＢＳ群に比べて増加してはいるが、有意的ではなかった。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（polymerase inhibitor）である３ＴＣは、細胞分布及び分化の両方とも差を示さなかった（図５３）。
【0193】
１２）全体ＨＢＶ野生株遺伝体の形質注入細胞におけるＨＳＰ９０の遮断によるＰＥＰ１ペプチドの抗ウイルス効果
ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０を媒介にして、シャトル（shuttle）式で細胞の外部から内部へ、細胞膜を通過すると知られている。このようなメカニズムに基づいて、ＨＳＰ９０の活性を遮断するようになると、細胞内で抗ウイルス効果が減少するかを確認するために、本研究では、ＨｅｐＧ２細胞株に全体ＨＢＶ野生株の遺伝体を一時的に形質注入した後、抗‐ＧＡＰＤＨ、抗‐ＨＳＰ（１μｇ／ｍｌ、ＨＳＰ９０の活性を遮断）と、１７‐ＡＡＧ（１ μＭ）とを１時間処理し、再びＰＢＳ（０．５％）、エンテカルビ（Entecavir、ＥＴＶ、３０ｎＭ）、ＰＥＰ１（５μＭ）を、２４時間処理した後、上清を集めてＰＥＧ６０００でウイルスを沈殿し、ウイルス性ＤＮＡを抽出して、リアルタイム定量ＰＣＲ（real-time quantitative PCR）を行い、抗ウイルス効果を観察した。全ての実験は、３回にかけて独立的に進行され、統計学的な有意性検定は、一元配置分散分析（one way ANOVA）を用いて、テューキーの多重比較法（Tukey’s Multiple Comparison Test）により実施した。＊＊p＜０．０５は、ＰＢＳに基づいて比較し、＃＃p ＜０．０５は、Noneに基づいて比較した。
ＰＥＰ１は、ＨＳＰ９０を媒介にして、シャトル（shuttle）式で細胞の外部から内部へ、細胞膜を通過すると知られている。このようなメカニズムに基づいて、ＨＳＰ９０の活性を遮断するようになると、細胞内で抗ウイルス効果が減少するかを確認するために、本研究では、ＨｅｐＧ２細胞株に全体ＨＢＶ野生株の遺伝体を一時的に形質注入した後、抗‐ＧＡＰＤＨ、抗‐ＨＳＰ（１μｇ／ｍｌ、ＨＳＰ９０の活性を遮断）と、１７‐ＡＡＧ（１ μＭ）とを１時間処理し、再びＰＢＳ（０．５％）、エンテカルビ（Entecavir、ＥＴＶ、３０ｎＭ）、ＰＥＰ１（５μＭ）を、２４時間処理した後、上清を集めてＰＥＧ６０００でウイルスを沈殿し、ウイルス性ＤＮＡを抽出して、リアルタイム定量ＰＣＲ（real-time quantitative PCR）を行い、抗ウイルス効果を観察した。全ての実験は、３回にかけて独立的に進行され、統計学的な有意性検定は、一元配置分散分析（one way ANOVA）を用いて、テューキーの多重比較法（Tukey’s Multiple Comparison Test）により実施した。＊＊p＜０．０５は、ＰＢＳに基づいて比較し、＃＃p ＜０．０５は、Noneに基づいて比較した。
【0194】
その結果、なんの処理もしていない細胞にＰＥＰ１を処理した群では、ＰＥＰ１による抗ウイルス効果が、ＥＴＶより統計的に有意であり、ＧＡＰＤＨを遮断した群でも同様な結果を示し、ＨＳＰ９０とＨＳＰ９０の抑制剤と知られた１７‐ＡＡＧとを処理した群では、ＰＥＰ１による抗ウイルス効果が、統計的に有意でなくなったことを確認した（図５４）。反面、ＥＴＶの抗ウイルス効果は、何の処理もしていない細胞やＧＡＰＤＨ、ＨＳＰ９０又は１７‐ＡＡＧを処理した細胞において、いずれも差がないことを確認した。
【0195】
上記のように、ＰＥＰ１ペプチドにより、ＨＢＶの転写過程で、ＨＢＶインヘンサーに結合してインヘンサーの活性を増加するにあたって重要な転写因子（transcription factor）であるＨＮＦ４αの発現を抑制して、ＨＢＶのＨＢｓＡｇとビリオンの形成を減少させることを確認した。
【0196】
また、ＰＥＰ１は、肝細胞癌の進行過程で重要なＥＲＫとＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル経路を抑制して、ＨＢＶの増殖を抑制することにより、ＨＢＶで感染された細胞の肝細胞癌への進行を防ぐにあたって重要な役割を担当している。
【0197】
ウイルスが人体に感染されると、このようなウイルスに対抗して、免疫細胞ではインターフェロン（ＩＮＦ）を分泌するが、特にＩＮＦγは、人体内でＢ型肝炎ウイルスを抑制するにあたって重要なものとして知られており、ＨＢＶで感染されたときの免疫細胞の分布と、ＩＮＦγ分泌活性を示す免疫細胞の比率が重要である。本発明のＰＥＰ１により、全体ＨＢＶ Ｗ４Ｐ変異株の遺伝体が含まれた形質転換マウスの免疫細胞比率と、ＩＮＦγサイトカインの活性が増加された免疫細胞とを比較したとき、対照群であるＰＢＳ処理群と差がないと確認された。これにより、ＨＢＶで感染された人体では、ＰＥＰ１ペプチドが、人体内の免疫システムを調節することによりＥＲＫやＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル経路を抑制するか、ＨＢＶインヘンサー（enhancer）に作用する転写因子（transcription factor）であるＨＮＦαの発現を減少することにより、ＨＢＶ ｍＲＮＡの合成を抑制して、ＨＢＶの増殖を抑制するのに重要な役割を担うと考えられる。
【0198】
このように、ＰＥＰ１は、ＨＢＶに対する抗ウイルス効果があることが分かっており、ＰＥＰ１は、多数の臨床実験により、その安定性が既に立証されている。したがって、ＰＥＰ１の抗ＨＢＶ効果は、肝毒性及び腎毒性のなく、安全であり、ＨＢＶ感染疾病の治療用組成物及び治療方法が提供できる。
【0199】
前記実施例から、本発明によるペプチドであるＰＥＰ１、及びＰＥＰ１を含む組成物は、ウイルスの複製の抑制効果及び抗ウイルス効果があることが分かった。これを利用して、ウイルス抑制剤及び抗ウイルス治療剤の開発、又はウイルス関連疾病の予防及び治療の方法を提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44a】
【図44b】
【図44c】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51a】
【図51b】
【図51c】
【図51d】
【図51e】
【図51f】
【図51g】
【図51h】
【図52a】
【図52b】
【図52c】
【図52d】
【図52e】
【図52f】
【図52g】
【図53】
【図54】
【配列表】