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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-30
(45)【発行日】2023-02-07
(54)【発明の名称】ＭＨＣ結合ペプチドアレイおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230131BHJP
C07K 14/74 20060101ALI20230131BHJP
C07K 1/04 20060101ALI20230131BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230131BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230131BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230131BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230131BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20230131BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230131BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230131BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20230131BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/74
C07K1/04
C12N15/09 Z
A61P37/04
A61P35/00
A61K39/00 H
A61K38/00
A61K38/17
G01N33/53 S
G01N37/00 102
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019512661
(86)(22)【出願日】2017-09-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-11-14
(86)【国際出願番号】 EP2017072165
(87)【国際公開番号】W WO2018046468
(87)【国際公開日】2018-03-15
【審査請求日】2020-07-27
(31)【優先権主張番号】62/384,088
(32)【優先日】2016-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100120112
【氏名又は名称】中西 基晴
(72)【発明者】
【氏名】クライン，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】リアミチェフ，ヴィクター
(72)【発明者】
【氏名】メスナー，エッケハルト
(72)【発明者】
【氏名】パテル，ジガー
(72)【発明者】
【氏名】リー，ハンイーン
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０９５８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２２２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００１９８４３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／０３８０２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／１５１１４６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２０１６－１０８２５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００４／０９４４５８（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００ － １４／００
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のペプチドを含むペプチドマイクロアレイであって、前記ペプチドが、ペプチド－主要組織適合遺伝子複合体（ペプチド－ＭＨＣ）会合体を形成し、それぞれの会合体がマイクロアレイペプチドおよび主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を含み、ここで、前記ペプチドがＭＨＣの必須構成要素であり、リンカーを介してそのＣ末端で前記ペプチドマイクロアレイの表面に結合され、
前記ＭＨＣは、α鎖およびβ鎖を含むクラスＩ ＭＨＣであり、 ここで、前記ＭＨＣのα鎖がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子から誘導される配列によってコードされ、および前記ＭＨＣのα鎖は切断され、Ｃ末端のヒンジ領域、膜貫通領域または細胞質領域が除去されており、
前記複数のペプチドが前記表面上で合成され、
前記複数のペプチドが空間的に順序付けられており、それらの配列が事前に決定されている、前記ペプチドマイクロアレイ。
【請求項2】
ＭＨＣが、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である担体分子を含む、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項3】
α鎖が、膜貫通領域または細胞質領域を含まない、請求項１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項4】
α鎖が、ヒンジ領域を含まない、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項5】
前記ペプチドマイクロアレイが、少なくとも１０６個の特有のペプチドを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項6】
α鎖が、α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項7】
前記ＭＨＣが、野生型クラスＩ ＭＨＣである、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチドマイクロアレイを作製する方法であって、複数のペプチドを含むマイクロアレイの表面と、ＭＨＣ組成物とを、複数のペプチド－ＭＨＣ会合体を生成するために適切な条件下で接触させる工程を含み、ここで前記ペプチドがＭＨＣの必須構成要素であり、リンカーを介してそのＣ末端で前記ペプチドマイクロアレイの表面に結合され、
前記ＭＨＣは、α鎖およびβ鎖を含むクラスＩ ＭＨＣであり、 ここで、前記ＭＨＣのα鎖がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子から誘導される配列によってコードされ、および前記ＭＨＣのα鎖は切断され、Ｃ末端のヒンジ領域、膜貫通領域または細胞質領域が除去されており、
前記複数のペプチドが前記表面上で合成され、
前記複数のペプチドが空間的に順序付けられており、それらの配列が事前に決定されている、前記方法。
【請求項9】
表面に接触させる前に、ＭＨＣ組成物が、（ａ）ＭＨＣ組成物を４℃で一晩インキュベートする工程、
（ｂ）ＭＨＣ組成物から沈殿物を分離する工程、および
（ｃ）沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を、表面に接触させるために回収する工程、
を含む方法によって作製される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるときに免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチドマイクロアレイの使用。
【請求項11】
ペプチド抗原が、がん抗原である、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
がん抗原を含むワクチンを調製するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
ペプチドマイクロアレイの少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチドマイクロアレイの使用であって、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞とペプチドマイクロアレイとを接触させる工程、
（ｂ）活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から分泌される少なくとも１つの分子を検出する工程、および、
（ｃ）少なくとも１つのＴ細胞を画像化する工程、
を含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[01]本開示は、分子生物学、合成生物学、タンパク質アレイおよび免疫学、ならびに医学および研究ツールを対象とする。
【背景技術】
【0002】
[02]正確な生物学的状況でペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ分析するための、ｉｎ ｓｉｔｕ合成することができる、適切に会合した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される表面結合ペプチドについて、当技術分野において長く切望されながら満たされていないニーズがあった。本開示は、この長く切望されながら満たされていないニーズに対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【0003】
[03]本開示は、会合した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチドと免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）との間の相互作用をアッセイして、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に関連するペプチドと細胞とを同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏシステムを提供する。本開示の組成物は、各ペプチドが空間的に順序付けられたアレイで表面に結合した表面を提供することによってｉｎ ｖｉｖｏで免疫優性である単一のペプチドを同定する特有の能力を提供する。ペプチドの空間的順序は、表面上で各ペプチドをｉｎ ｓｉｔｕ合成することによって可能となる。
【0004】
[04]本開示の組成物が成功したことは、他者が試みて失敗しただけでなく、現状技術で支配的な意見に対向するものである。例えば、クラスＩ ＭＨＣを含む組成物について、支配的な知識は、ＭＨＣにおいて適切に会合させるために、ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）とカルボキシ末端（Ｃ末端）の両方が、遊離、非結合、または非係留でなければならないことを指示する。
【0005】
[05]本開示の組成物を使用して、免疫優性ペプチドを、あらゆる状態について同定することができる。さらに、現状技術は、ｉｎ ｖｉｖｏで関連するまたは関連しない可能性がある免疫優性ペプチドをコンピュータアルゴリズムに依存して予測する。対照的に、本開示の組成物は、免疫細胞を活性化する特有のペプチドを特異的に同定するために少なくとも１０６個の特有のペプチドを同時に分析する能力を有する。表面上のＭＨＣが、アレイの表面上で、ペプチド－ＭＨＣ会合体がｉｎ ｖｉｖｏで細胞の表面上に現れるようにペプチド－ＭＨＣ会合体を正確に再現することから、本開示の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで関連するペプチドを同定し、したがって、さらなる実験的検証を必要とせず、既存の技術で必要とされる時間のかかる高価な工程を排除する。これらのペプチドはそれぞれ空間的に順序付けられており、それらの配列が事前に決定されているので、免疫優性ペプチドの配列はすぐに分かり、関連ペプチドの配列決定という、これまた既存の技術で必要とされる、別の時間のかかる高価な工程も排除する。
【0006】
[06]ペプチドバリアントを分析することによって、本開示の組成物は、各ペプチド－ＭＨＣの成功した会合について、クラス（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ）にかかわらず、またどの白血球抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ）がＭＨＣに寄与するかにかかわらず、必須のアミノ酸（「アンカーポイント」とも呼ばれる）を同定するために使用することができる。
【0007】
[07]詳細には、本開示は、ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）とを含む少なくとも１つの会合体を含む組成物であって、ペプチドがＭＨＣの必須構成要素であり、ペプチドがリンカーを介してそのＣ末端で表面に結合しており、ペプチドが表面上で合成される、組成物を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体は、複数の会合体である。
【0008】
[08]ＭＨＣは、ヒト（つまり、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子）、霊長類（例えば、類人猿、サル、チンパンジー、およびボノボ）、ならびにマウス（つまり、マウス白血球抗原（ＭＬＡ）遺伝子）を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物種由来の白血球抗原遺伝子によってコードされ得る。
【0009】
[09]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣである。
【0010】
[010]ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は切断されていてもよい。例えば、特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、膜貫通領域または細胞質領域を含まない。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖はヒンジ領域を含まない。ＭＨＣはクラスＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、膜貫通領域、ヒンジ領域または細胞質領域を含まない。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含む。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｋ偽遺伝子およびＨＬＡ－Ｌ偽遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。代替的に、ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである場合、ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。代替的に、ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである場合、ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。
【0011】
[011]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣである。ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、特にＨＬＡ－Ａ＊１１：０１から誘導される配列によってコードされ得る。ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１のアミノ酸配列は、ＭＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＱＥＴＲＮＶＫＡＱＳＱＴＤＲＶＤＬＧＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＩＱＩＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＲＱＤＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＩＴＫＲＫＷＥＡＡＨＡＡＥＱＱＲＡＹＬＥＧＲＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＴＤＰＰＫＴＨＭＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号１）を含むまたはそれからなることができる。
【0012】
[012]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣである。ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、特にＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２から誘導される配列によってコードされ得る。ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２のアミノ酸配列は、ＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＥＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＮＴＱＩＹＫＡＱＡＱＴＤＲＥＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＳＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＬＬＲＧＨＤＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＷＥＡＡＲＥＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＥＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＤＫＬＥＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号２）を含むまたはそれからなることができる。
【0013】
[013]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣである。ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、特にＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２から誘導される配列によってコードされ得る。ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２のアミノ酸配列は、ＳＨＳＭＲＹＦＤＴＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＧＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＥＴＱＫＹＫＲＱＡＱＡＤＲＶＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＬＱＲＭＳＧＣＤＬＧＰＤＧＲＬＬＲＧＹＤＱＳＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＬＥＡＡＲＡＡＥＱＬＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＬＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＱＥＱＲＹＴＣＨＭＱＨＥＧＬＱＥＰＬＴＬＳＷＥ（配列番号３）を含むまたはそれからなることができる。
【0014】
[014]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースからのＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アミノ酸配列を切断して、Ｃ末端でヒンジ、膜貫通および細胞質領域を、Ｎ末端からリーダーペプチド配列を除去した。
【0015】
[015]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩＩ ＭＨＣである。
【0016】
[016]ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は切断されていてもよい。例えば、特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、膜貫通領域または細胞質領域を含まない。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、α１ドメインおよびα２ドメインを含む。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのα鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＲ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのβ鎖は切断されている。例えば、特定の実施形態では、ＭＨＣのβ鎖は、膜貫通領域または細胞質領域を含まない。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのβ鎖は、β１ドメインおよびβ２ドメインを含む。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、ＭＨＣのβ鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＲ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。
【0017】
[017]本開示の組成物の特定の実施形態では、ＭＨＣおよび／または少なくとも１つの会合体は、担体分子を含む。本開示の担体分子は、ＭＨＣ成分と表面上の各ペプチドとが統合して少なくとも１つのペプチド－ＭＨＣ会合体を形成することを促進する。この促進を達成し得る多くの機構があるが、特定の実施形態では、本開示の担体分子はＭＨＣの１つまたは複数の成分が表面上のペプチドと接触する前に、該１つまたは複数の成分と結合することができる。ＭＨＣの１つまたは複数の成分が表面上のペプチドと接触する前に該１つまたは複数の成分と結合する担体分子は、ペプチドが該ＭＨＣの１つまたは複数の成分に結合するために必須の１つまたは複数の成分の残基および／または結合部位には結合しない。担体分子は、表面上の完全に会合したＭＨＣに結合したままでもよく、またはＭＨＣの成分が表面上のペプチドと会合した後、解離してもよい。本開示の担体分子は、表面上のＭＨＣによって提示されるペプチドへのＴ細胞の応答を変化させない。
【0018】
[018]本開示の組成物の特定の実施形態では、担体分子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、担体分子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0019】
[019]本開示の組成物の特定の実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、３～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含んでもよい。例えば、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位は、負に荷電されたアミノ酸を含むことができる。負に荷電されたアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であってもよい。特定の実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸と、５個のモノマーの長さを有する少なくとも１つの負に荷電されたアミノ酸とを含み得る。リンカーの例には、（表面）－５ＨＥＸ、（表面）－ＨＥＸ－Ｅ－３ＨＥＸ、（表面）－ＨＥＸ－Ｄ－３ＨＥＸ、（表面）－２ＨＥＸ－Ｅ－ＨＥＸが含まれるが、これらに限定されない。
【0020】
[020]本開示の組成物の特定の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、３～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含んでもよい。例えば、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位は、負に荷電されたアミノ酸を含むことができる。負に荷電されたアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であってもよい。
【0021】
[021]本開示の組成物の特定の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）アミノ酸の混合物を含む。例えば、リンカーは、グリシン（Ｇ）：セリン（Ｓ）アミノ酸の３：１比率の混合物を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、１～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、３～５個のモノマー単位を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含んでもよい。例えば、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位は、負に荷電されたアミノ酸を含むことができる。負に荷電されたアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であってもよい。
【0022】
[022]本開示の組成物の特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含み、会合体は、ＨＬＡ２遺伝子によってコードされるＭＨＣを含む。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含み、リンカーは、３～５個のモノマーからなり、会合体は、ＨＬＡ２遺伝子によってコードされるＭＨＣを含む。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含み、リンカーは、３個のモノマーからなり、会合体は、ＨＬＡ２遺伝子によってコードされるＭＨＣを含む。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含み、リンカーは、５個のモノマーからなり、会合体は、ＨＬＡ２遺伝子によってコードされるＭＨＣを含む。
【0023】
[023]本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む６～３０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む６～２０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む６～１２個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである本開示の組成物の特定の実施形態では、端点を含む６～１２個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、９個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＭＨＣがクラスＩ ＭＨＣである本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、９個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む１２～３０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体または複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む１２～３０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0024】
[024]本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体のペプチドは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成される。本開示の組成物の特定の実施形態では、複数の会合体のペプチドは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成される。特定の実施形態では、ＤＭＤは、少なくとも１つのマイクロミラーを含む。特定の実施形態では、ＤＭＤは、複数のマイクロミラーを含む。特定の実施形態では、各マイクロミラーは、表面の微小領域に対応し、微小領域に対応するマイクロミラーは、微小領域における各ペプチドの合成に向けられる。特定の実施形態では、表面は、複数の微小領域を含み、ここでマイクロミラーの数は、微小領域の数に等しい。本明細書で使用されるとき、「微小領域（ｍｉｃｒｏａｒｅａ）」という用語は、表面自体に存在する物理的境界でなく、仮想境界（ｖｉｒｔｕａｌ ｂｏｕｎｄａｒｙ）を記載することを意味する。マイクロミラーは表面の任意の部位におけるペプチドの合成に向けることができるが、マイクロミラーによって影響を受ける微小領域は、好ましくは、マイクロミラーと垂直に整列するように表面上に配置される。したがって、マイクロミラーによって影響を受ける微小領域は、マイクロミラーの真下またはマイクロミラーの縁部に垂直の配列から数ミリメートルまたは数センチメートル内にあることができる。
【0025】
[025]本開示の組成物の特定の実施形態では、特にペプチドがデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成される実施形態では、各微小領域は、１０３～１０８個のペプチドを含み得る。特定の実施形態では、表面は、１ｃｍ２あたり１．２４×１０１３個のアミン密度を有することができ、ここでアミンは、表面に結合した第１の官能基であり、これに対して後にリンカーおよびペプチドがｉｎ ｓｉｔｕ合成の間に結合する。表面が１ｃｍ２あたり１．２４×１０１３個のアミン密度を有するとき、表面は少なくとも１０６個のペプチドを含むことができ、これは少なくとも１０６個のペプチド－ＭＨＣ会合体に対応する。表面が１ｃｍ２あたり１．２４×１０１３個のアミン密度を有するとき、表面は、１マイクロミラーあたり１０３～１０８個の「特有の」ペプチドを含むことができる。表面が１ｃｍ２あたり１．２４×１０１３個のアミン密度を有するとき、表面は、各微小領域が１つのマイクロミラーに対応する場合、１微小領域あたり１０３～１０８個の「特有の」ペプチドを含むことができる。「特有のペプチド」という用語は、特有のペプチド配列を記述することを意味する。特有のペプチドに加えて、各マイクロミラーは、複製ペプチド、つまり換言すると、同じ配列を有し、マイクロミラーを向けて同じ表面または同じ表面の区画のペプチドのうち特有の配列を有するペプチドを合成する特有のプログラムまたは特徴（指示のセット）によって作製される複数のペプチドを作製することができる。
【0026】
[026]本開示の組成物の特定の実施形態では、特にペプチドがデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成される実施形態では、第１の微小領域は、各第２のまたは次の微小領域内の少なくとも第２のまたは次のペプチドのアミノ酸配列と比較するとき特有のアミノ酸配列を有する第１のペプチドを少なくとも含む。特定の実施形態では、特有のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む第１の微小領域は、特有のアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つの複製をさらに含む。例えば、第２のまたは次の微小領域は、第１の微小領域に並置されてもよい。並置されるとは、第１および第２の微小領域の仮想境界が物理的に並置される（例えば、微小領域が隣接する）ことを意味する。特定の実施形態では、第１の微小領域は、第１の微小領域に並置される各第２のまたは次の微小領域内の少なくとも第２のまたは次のペプチドのアミノ酸配列と比較するとき特有のアミノ酸配列を有する第１のペプチドを少なくとも含む。特定の実施形態では、第１の微小領域は、表面上の各第２のまたは次の微小領域内の少なくとも第２のまたは次のペプチドのアミノ酸配列と比較するとき特有のアミノ酸配列を有する第１のペプチドを少なくとも含む。
【0027】
[027]本開示の組成物の特定の実施形態では、特にペプチドがデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成される実施形態では、表面は１平方センチメートルあたり１．２４×１０１３個のペプチドを含み得る。
【0028】
[028]本開示の組成物の特定の実施形態では、表面は、２つ以上の区画を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、表面は、端点を含む２～４８区画を含む。
【0029】
[029]本開示の組成物の特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＴ細胞をさらに含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、組成物は、１区画あたり少なくとも１つのＴ細胞をさらに含む。任意選択的に、少なくとも１つのＴ細胞は表面に結合することができる。
【0030】
[030]特定の実施形態では、本開示の組成物は、表面上の少なくとも１つのペプチドによる少なくとも１個のＴ細胞の活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から放出される分子を認識する検出可能な薬剤をさらに含んでもよい。検出可能な薬剤は、活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から放出される少なくとも１つの分子に特異的に結合することができる検出可能な標識を有する任意の有機または無機分子であることができる。特定の実施形態では、検出可能な薬剤は、抗体である。少なくとも１つのＴ細胞から放出される分子は細胞のセクレトームの任意の分子であり得るが、特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞から放出される分子はサイトカインである。サイトカインの例としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＮＦγ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0031】
[031]特定の実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも２つの表面を含んでもよい。本開示の組成物の表面は、平坦でもよい。例えば、本開示の組成物の表面は、チップ、プレート、またはスライドでもよい。
【0032】
[032]特定の実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも２つの表面を含んでもよい。本開示の組成物の表面は、湾曲していても、凸面でも、または凹面でもよい。特定の実施形態では、表面はビーズである。
【0033】
[033]本開示の組成物の特定の実施形態では、複数の会合体の各ペプチドは、空間的に順序付けられたアレイを生成するように表面上で合成される。ＤＭＤ技術を使用する合成のコンテキストでは、各マイクロミラーは、表面上の光を反射するためのまたは表面からの光を偏光するための特有のプログラムを有する。本開示の表面上のペプチドは、光保護アミノ酸を使用して合成されてもよい。マイクロミラーが表面に光を向けるとき、成長するペプチドに付加される最後のアミノ酸は、脱保護され、別のアミノ酸に結合するために利用可能になる。特有の配列の移動を各マイクロミラーに提供することにより（「仕事（ｊｏｂ）」とも呼ばれる）、ＤＭＤは、各マイクロミラーに対応する少なくとも１つの特有のペプチド配列を合成することができる。所定のパターンでミラーを事前プログラミングすることによって、表面上で合成される各ペプチドの配列は、それを合成するために使用されるマイクロミラーに対するその相対的位置によって分かる。
【0034】
[034]特定の実施形態では、表面はチップであり、３つのチップが同時に製造および使用するためにスライド上に配置される。特定の実施形態では、これらの３つのチップのそれぞれに対する複数のペプチドの空間的配置は、実験的複製物を提供するように同一であり得る。特定の実施形態では、これらの３つのチップのそれぞれに対する複数のペプチドの空間的配置は、より高度なスループットアッセイを提供するように明確であり得る。
【0035】
[035]本開示は、本開示の組成物を作製する方法であって、少なくとも１つのペプチドを含む表面と、ＭＨＣ組成物とを、少なくとも１つのペプチド－ＭＨＣ会合体を生成するために適切な条件下で接触させる工程を含み、ペプチドが会合体の必須構成要素であり、少なくとも１つのペプチドがリンカーを介してそのＣ末端で表面に結合しており、少なくとも１つのペプチドが表面上で合成される、方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つの会合体は、複数の会合体である。
【0036】
[036]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、接触工程の前に、表面を結合バッファーで処理してもよい。特定の実施形態では、結合バッファーは、１％のカゼイン、１０ｍＭのｐＨ７．４のＴｒｉｓ、および０．２５％のＴｗｅｅｎを含む。任意選択的に、結合バッファーは、ブロッキング剤をさらに含んでもよい。
【0037】
[037]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、表面とＭＨＣ組成物とは、端点を含む８～２４時間、接触したままである。本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、表面とＭＨＣ組成物とは約１２時間、接触したままである。接触工程は、室温で行うことができる。代替的に、接触工程は、４℃で行うことができる。
【0038】
[038]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、ＭＨＣ組成物は、ＢＳＡ、可溶化β２－ミクログロブリン（β２ｍ）および可溶化α鎖を含む。特定の実施形態では、ＭＨＣ組成物は、可溶化α鎖：可溶化β２ｍを、端点を含む１：１～１：２のモル：モル比で含む。可溶化α鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子によってコードされ得る。特定の実施形態では、可溶化α鎖は、（ａ）可溶化α鎖をコードするアミノ酸配列を、コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に逆翻訳する工程、（ｂ）コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を二本鎖ＤＮＡ分子として合成する工程、（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を封入体の形態で発現してα鎖を作製する工程、および（ｄ）α鎖を可溶化する工程を含む方法によって作製される。可溶化α鎖を作製する方法の特定の実施形態では、コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列は、大腸菌での発現のために最適化される。可溶化α鎖を作製する方法の特定の実施形態では、発現工程は、二本鎖ＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングする工程を含み、ここで、任意選択的に、発現ベクターは、プラスミドである。
【0039】
[039]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、ＭＨＣ組成物は、担体分子、可溶化β鎖、および可溶化α鎖を含む。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、担体分子は、インバリアント鎖、ＣＬＩＰ、ＣＤ７４ペプチドまたはその機能的断片であることができる。ＭＨＣがクラスＩＩ ＭＨＣである特定の実施形態では、担体分子は、ＢＳＡであることができる。
【0040】
[040]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、ＭＨＣ組成物は、端点を含む０．１％～１０％のＢＳＡを含む。ＭＨＣ組成物は、端点を含む１％～５％のＢＳＡを含むことができる。ＭＨＣ組成物は、端点を含む２％～３％のＢＳＡを含むことができる。任意選択的に、ＢＳＡは、ＢＳＡバッファー中に配合される。特定の実施形態では、ＢＳＡバッファーは、２０ｍＭのｐＨ７．８のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。
【0041】
[041]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、ＭＨＣ組成物は、バッファーをさらに含むことができる。ＭＨＣバッファーは、１０ｍＭのｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むことができる。
【0042】
[042]本開示の組成物を作製する方法の特定の実施形態では、表面に接触させる前に、ＭＨＣ組成物は、（ａ）ＭＨＣ組成物を４℃で一晩インキュベートする工程、（ｂ）ＭＨＣ組成物から沈殿物を分離する工程、および（ｃ）沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を、表面に接触させるために回収する工程を含む方法によって作製される。特定の実施形態では、分離工程は、遠心分離工程を含むことができ、ここで沈殿物を含まないＭＨＣ組成物は、遠心分離から生じる上清である。分離工程の特定の実施形態では、回収工程は、沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を濃縮する工程をさらに含む。特定の実施形態では、回収工程は、沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を濾過する工程をさらに含む。
【0043】
[043]本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるときに免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための、本開示の組成物の使用を提供する。例えば、本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるときに免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用であって、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞と組成物とを接触させる工程、（ｂ）Ｔ細胞の活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から分泌される少なくとも１つの分子を検出し、それにより、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるときに免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原を同定する工程を含む、使用を提供する。この使用の特定の実施形態では、免疫優性ペプチド抗原は、免疫原性である。
【0044】
[044]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣである。
【0045】
[045]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩＩ ＭＨＣである。
【0046】
[046]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は、ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、ＭＨＣに結合するために必須の１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態では、ＭＨＣに結合するために必須ではないネオ抗原の１つまたは複数のアミノ酸（「非必須」アミノ酸）は、ペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸配列に１つまたは複数の置換を含んでもよい。
【0047】
[047]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は自己抗原である。特定の実施形態では、自己抗原は、Ｔ細胞を刺激し、自己免疫応答を誘導する。
【0048】
[048]本開示は、自己免疫応答を減少または予防する医薬の製造のための、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示の自己抗原、該自己抗原に相補的な配列、該自己抗原に特異的に結合する抗体、または該自己抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体の使用を提供する。
【0049】
[049]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は、がん抗原である。特定の実施形態では、がん抗原は、Ｔ細胞を刺激し、免疫応答を誘導する。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、がん抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、がん抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0050】
[050]本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示のがん抗原を含むワクチンを提供する。
【0051】
[051]本開示は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のための、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示のがん抗原、該がん抗原に相補的な配列、該がん抗原に特異的に結合する抗体、または該がん抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体の使用を提供する。
【0052】
[052]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は、細菌、ウイルス、または微生物抗原である。
【0053】
[053]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原はウイルス抗原であり、ここでウイルス抗原はＴ細胞を刺激し、免疫応答を誘導する。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、ウイルス抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ウイルス抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0054】
[054]本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示のウイルス抗原を含むワクチンを提供する。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。
【0055】
[055]本開示は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のための、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示のウイルス抗原、該ウイルス抗原に相補的な配列、該ウイルス抗原に特異的に結合する抗体、または該ウイルス抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体の使用を提供する。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。
【0056】
[056]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は細菌抗原であり、ここで細菌抗原は、Ｔ細胞を刺激し、免疫応答を誘導する。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、細菌抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、細菌抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0057】
[057]本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示の細菌抗原を含むワクチンを提供する。
【0058】
[058]本開示は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のための、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示の細菌抗原、該細菌抗原に相補的な配列、該細菌抗原に特異的に結合する抗体、または該細菌抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体の使用を提供する。
【0059】
[059]ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性である１つまたは複数のペプチド抗原の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、ペプチド抗原は微生物抗原であり、ここで微生物抗原は、Ｔ細胞を刺激し、免疫応答を誘導する。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、微生物抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、微生物抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0060】
[060]本開示は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示の微生物抗原を含むワクチンを提供する。
【0061】
[061]本開示は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のための、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性として同定される本開示の微生物抗原、該微生物抗原に相補的な配列、該微生物抗原に特異的に結合する抗体、または該微生物抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体の使用を提供する。
【0062】
[062]本開示は、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞と該組成物とを接触させる工程、（ｂ）活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から分泌される少なくとも１つの分子を検出する工程、および（ｃ）少なくとも１つのＴ細胞を画像化する工程を含む、少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための本開示の組成物の使用を提供する。
【0063】
[063]少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞は、遺伝子修飾されない。
【0064】
[064]少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞は、遺伝子修飾される。例えば、特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞は、少なくとも１つのペプチドに特異的に結合する修飾されたＴ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞は、少なくとも１つのペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【0065】
[065]少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための本開示の組成物の使用の特定の実施形態では、画像化工程は、少なくとも１つのＴ細胞を、１つまたは複数の細胞表面マーカーを認識する１つまたは複数の検出可能な薬剤と接触させる工程を含む。検出可能な薬剤は、活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から放出される少なくとも１つの分子に特異的に結合することができる検出可能な標識を有する任意の有機または無機分子であることができる。特定の実施形態では、検出可能な薬剤は、抗体である。細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１５、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ６１、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、幹細胞は、ＣＤ３４の発現によって同定することができる。顆粒球は、ＣＤ４５およびＣＤ１５の発現によって同定することができる。単球は、ＣＤ４５およびＣＤ１４の発現によって同定することができる。Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも呼ばれる）は、ＣＤ４５およびＣＤ３の発現によって同定することができる。Ｂ細胞（Ｂリンパ球とも呼ばれる）は、ＣＤ４５およびＣＤ１９の発現によって同定することができる。血小板は、ＣＤ４５およびＣＤ６１の発現によって同定することができる。Ｔ細胞のうち、ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ４の発現によって同定することができる。Ｔ細胞のうち、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ８の発現によって同定することができる。Ｔ細胞のうち、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ２５の発現によって同定することができる。
【0066】
[066]少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のための本開示の組成物の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞は、細胞集団に含まれてもよい。細胞集団は、全血、血清、血漿、末梢血、臍帯血、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、および羊水を含むがこれらに限定されない任意の生体液から単離することができる。細胞集団は、リンパ組織、骨髄、腫瘍組織、および生検組織を含むがこれらに限定されない、任意の生体組織から単離することができる。細胞集団は、均一であっても不均一であってもよい。細胞集団は、免疫細胞またはＴ細胞を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。細胞集団は、本開示の組成物を接触させる前に、ヘルパーＴ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞との混合物を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。特定の実施形態では、細胞集団は、本開示の組成物を接触させる前に、任意の活性化Ｔ細胞を含まない。したがって、本発明は、ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）とを含む少なくとも１つの会合体または複数の会合体を含む組成物であって、ペプチドがＭＨＣの必須構成要素であり、ペプチドがリンカーを介してそのＣ末端で表面に結合しており、ペプチドが表面上で合成される、組成物を提供する。
【0067】
[067]ＭＨＣは、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣであることができる。ＭＨＣは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であってもよい担体分子を含むことができる。リンカーは、ヘキサン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはグリシン（Ｇ）：セリン（Ｓ）アミノ酸の３：１比率の混合物を含むことができる。リンカーは、１～５モノマー単位、好ましくは３～５モノマー単位を含むことができる。リンカーは、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）などの負に荷電されたアミノ酸であり得る少なくとも１つの負に荷電されたモノマー単位を含むことができる。一実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸と、好ましくは５モノマー単位内である少なくとも１つのアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）とを含む。
【0068】
[068]ＭＨＣは、ヒト白血球抗原２（ＨＬＡ２）遺伝子によって、別のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によって、哺乳類白血球抗原遺伝子によって、霊長類白血球抗原遺伝子によって、マウス白血球抗原（ＭＬＡ）遺伝子によって、またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされ得、ここでＭＨＣのα鎖は切断されている。後者の場合に、α鎖は、膜貫通領域または細胞質領域を含まない。α鎖は、ヒンジ領域を含まなくてもよい。α鎖は、α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含むことができる。α鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｋ偽遺伝子およびＨＬＡ－Ｌ偽遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。α鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。またα鎖は、α１ドメインおよびα２ドメインを含むことができる。一実施形態（ｅｗｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＲ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。
【0069】
[069]ＭＨＣのβ鎖は切断されていてもよく、例えば、膜貫通領域または細胞質領域を含まなくてもよい。β鎖は、β１ドメインおよびβ２ドメインを含むことができる。β鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＲ遺伝子からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子から誘導される配列によってコードされ得る。
【0070】
[070]複数の会合体の各ペプチドは、端点を含む６～３０、好ましくは６～２０、より好ましくは６～１２、最も好ましくは９アミノ酸で構成することができる。少なくとも１つの会合体のペプチドは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕ合成することができ、ここで各マイクロミラーは表面の微小領域に対応し、微小領域に対応するマイクロミラーは、微小領域における各ペプチドの合成に向けられる。
【0071】
[071]この状況において、本発明は、上記に開示される組成物を作製する方法であって、少なくとも１つのペプチドを含む表面と、ＭＨＣ組成物とを、少なくとも１つのペプチド－ＭＨＣ会合体を生成するために適切な条件下で接触させる工程を含み、ペプチドがＭＨＣの必須構成要素であり、ペプチドがリンカーを介してそのＣ末端で表面に結合しており、ペプチドが表面上で合成される、方法も提供する。接触工程の前に、表面は、結合バッファー、例えば、１％のカゼイン、１０ｍＭのｐＨ７．４のＴｒｉｓ、０．２５％のＴｗｅｅｎ２０、および任意選択的にブロッキング試薬を含むバッファーで処理されてもよい。表面とＭＨＣ組成物とは、端点を含む８～２４時間、例えば約１２時間、例えば室温でまたは４℃で、接触したままであってもよい。ＭＨＣ組成物は、ＢＳＡ、可溶化β２－ミクログロブリン（β２ｍ）および可溶化α鎖を含んでもよい。また前記組成物は、担体分子、可溶化β鎖、および可溶化α鎖を含んでもよい。担体分子は、インバリアント鎖、ＣＬＩＰ、ＣＤ７４ペプチドまたはその機能的断片、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、好ましくは、端点を含む０．１％～１０％のＢＳＡ、より好ましくは１％～５％のＢＳＡ、最も好ましくは、２％～３％のＢＳＡであることができる。ＢＳＡは、例えば、２０ｍＭのｐＨ７．８のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むＢＳＡバッファー中に配合されてもよい。またＭＨＣ組成物は、バッファー、例えば１０ｍＭのｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌをさらに含む。
【0072】
[072]表面に接触させる前に、ＭＨＣ組成物は、
（ａ）ＭＨＣ組成物を４℃で一晩インキュベートする工程、
（ｂ）ＭＨＣ組成物から沈殿物を分離する工程、および
（ｃ）沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を、表面に接触させるために回収する工程
を含む方法によって作製される。
（ａ）ＭＨＣ組成物を４℃で一晩インキュベートする工程、
（ｂ）ＭＨＣ組成物から沈殿物を分離する工程、および
（ｃ）沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を、表面に接触させるために回収する工程
を含む方法によって作製される。
【0073】
[073]分離工程は、遠心分離工程をさらに含んでもよく、ここで沈殿物を含まないＭＨＣ組成物は、遠心分離から生じる上清である。回収工程は、沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を濃縮する工程をさらに含んでもよい。回収工程は、沈殿物を含まないＭＨＣ組成物を濾過する工程をさらに含んでもよい。ＭＨＣ組成物は、可溶化α鎖：可溶化β２ｍを、端点を含む１：１～１：２のモル：モル比で含んでもよい。可溶化α鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子によってコードされ得る。前記可溶化α鎖は、
（ａ）可溶化α鎖をコードするアミノ酸配列を、コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に逆翻訳する工程、
（ｂ）コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を二本鎖ＤＮＡ分子として合成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を封入体の形態で発現してα鎖を作製する工程、および
（ｄ）α鎖を可溶化する工程
を含む方法によって作製される。
（ａ）可溶化α鎖をコードするアミノ酸配列を、コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に逆翻訳する工程、
（ｂ）コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を二本鎖ＤＮＡ分子として合成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を封入体の形態で発現してα鎖を作製する工程、および
（ｄ）α鎖を可溶化する工程
を含む方法によって作製される。
【0074】
[074]任意選択的に、コドン最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列は、大腸菌での発現のために最適化される。
【0075】
[075]上記に開示される組成物は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性であり、任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌ）免疫原性である、１つまたは複数のペプチド抗原の同定のために使用することができる。ＭＨＣは、クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣであってもよく、ペプチド抗原は、ＭＨＣに結合するために必須の１つまたは複数のアミノ酸を含み得るネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅ）であってもよい。ＭＨＣに結合するために必須ではないネオ抗原の１つまたは複数のアミノ酸は、ペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸配列に１つまたは複数の置換を含み得る。またペプチド抗原は、Ｔ細胞を刺激することができ、自己免疫応答を誘導する、自己抗原であってもよい。
【0076】
[076]自己抗原、該自己抗原に相補的な配列、該自己抗原に特異的に結合する抗体、または該自己抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体は、自己免疫応答を減少または予防する医薬の製造のために使用することができる。
【0077】
[077]ペプチド抗原は、Ｔ細胞を刺激することができ、免疫応答を誘導するがん抗原であってもよく、ワクチンに含めてもよい。またがん抗原、該がん抗原に相補的な配列、該がん抗原に特異的に結合する抗体、または該がん抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のために使用することができる。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよく、がん抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含むことができる。Ｔ細胞は、がん抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0078】
[078]ペプチド抗原は、細菌、ウイルス、または微生物抗原であってもよい。ウイルス抗原は、Ｔ細胞を刺激し、免疫応答を誘導することができる。ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来してもよく、および／またはワクチンまたはワクチンの一部として機能してもよい。ウイルス抗原、該ウイルス抗原に相補的な配列、該ウイルス抗原に特異的に結合する抗体、または該ウイルス抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体は、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のために使用することができる。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよく、ウイルス抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。Ｔ細胞は、ウイルス抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0079】
[079]細菌抗原も、Ｔ細胞を刺激し、ワクチンまたはワクチンの一部として機能することができるように免疫応答を誘導する。該細菌抗原に相補的な配列、該細菌抗原に特異的に結合する抗体、または該細菌抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を、免疫応答を増強または誘導する医薬の製造のために使用してもよい。Ｔ細胞は、遺伝子修飾されてもよく、細菌抗原に特異的に結合する遺伝子修飾Ｔ細胞受容体を含んでもよい。Ｔ細胞は、細菌抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含んでもよい。
【0080】
[080]また上記に開示される組成物は、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞と組成物とを接触させる工程、
（ｂ）活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から分泌される少なくとも１つの分子を検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのＴ細胞を画像化する工程
を含む組成物の少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のために使用されてもよい。
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞と組成物とを接触させる工程、
（ｂ）活性化に際し、少なくとも１つのＴ細胞から分泌される少なくとも１つの分子を検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのＴ細胞を画像化する工程
を含む組成物の少なくとも１つのペプチドによって刺激される少なくとも１つのＴ細胞の同定のために使用されてもよい。
【0081】
[081]少なくとも１つのＴ細胞は、遺伝子修飾されてもよく、少なくとも１つのＴ細胞が、組成物の少なくとも１つのペプチドに特異的に結合する修飾されたＴ細胞受容体を含んでもよい。また、組成物の少なくとも１つのペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでもよい。画像化工程は、少なくとも１つのＴ細胞を、１つまたは複数の細胞表面マーカーを認識する１つまたは複数の検出可能な薬剤と接触させる工程を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【0082】
【図1】[082]図１は、ｂ２ｍサブユニット有り（上部プロット）またはｂ２ｍサブユニット無し（下部プロット、陰性対照）のいずれかでの、ｐＣｙ５抗体（Ｗ６／３２）で標識された９マー・ペプチド（配列番号７）－ＭＨＣＩ会合体についての位置の関数としての蛍光強度を示す一対のプロットである。実施例１のセット１は、このデータが由来する組成物についての実験的セットアップを提供する。抗体に関するさらなる情報については、Ｄａｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３年３月１３日：第５巻、第１７６号、１７６ｒａ３３頁）を参照。
【図2】[083]図２は、それぞれ９アミノ酸長であり、それぞれがＷＴ１タンパク質の野生型配列に沿った特有の配列を有し、本開示の表面上のＭＨＣＩに結合し、標識抗体によって検出されるときのそのシグナル強度、またはＮｅｔＭＨＣ３．４（ペプチド抗原を同定するために当分野で広く使用されているアルゴリズム）によって評価されるその予測される結合親和性に基づいて、象限に組織化される、複数のＷＴ１ペプチドを示すプロットである。完全に会合したＭＨＣＩ複合体を特異的に認識する任意の抗体を、ＭＨＣＩによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるであろうそれらのペプチドを同定するために使用することができる。この分析を行い、結果を、ＮｅｔＭＨＣ３．４によってＭＨＣＩと複合体を形成すると同定される予測ペプチドと比較し、ＮｅｔＭＨＣ３．４によってＭＨＣＩと複合体を形成すると予測されるペプチドと比較した。プロットされた４４０種のペプチドのうち、ＮｅｔＭＨＣ３．４により、４３３種のペプチドは親和性が低すぎてＭＨＣＩと結合できないと同定され、対照的に、７つのみのペプチドが、ＭＨＣＩと結合する理論的能力を有するとして同定された。際立って対照的に、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣ３．４アルゴリズムが破棄するであろう１３種のペプチド（右上の象限）を含む、ＭＨＣＩと実際に結合する１８種のペプチドを同定した。
【図3】[084]図３は、図２に示されるのと同じプロットであるが、左上の象限を特に強調している。この象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で結合するとアルゴリズムによって予測されるであろう、本開示の組成物および方法にしたがってＭＨＣＩへの実証された結合能力を有するペプチドを表す。特に興味深いのは、本明細書でＷＴ１ペプチド１２６と参照される（アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７）を有する）、強調されたペプチドである。
【図4】[085]図４は、図２に示されるのと同じプロットであるが、右上の象限を特に強調している。この象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で論理的に結合できないとアルゴリズムによって破棄されるであろう、本開示の組成物および方法にしたがってＭＨＣＩへの実証された結合能力を有するペプチドを表す。換言すれば、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣプログラムのみを使用して分析するとき偽陰性であろう、１３種のペプチドを経験的に検証した。
【図5】[086]図５は、図２に示されるのと同じプロットであるが、左下の象限を特に強調している。この象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で結合すると予測されるが、本開示の組成物および方法を使用して試験するとき、完全に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体を形成しないと経験的に示されたペプチドを表す。換言すれば、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣプログラムのみを使用して分析するとき偽陽性であろう、２つのペプチドを経験的に同定した。
【図6】[087]図６は、ＨＬＡ－Ａ２と共に会合した十分に研究されたワクシニアウイルスペプチドＬＭＹＤＩＩＮＳＶ（配列番号８）のＨＬＡ－Ａ２ローディング特異性を示すプロットである。重要な残基の相互作用の特異性は、置換プロットで確かめることができる。[088]９つのアミノ酸ペプチドのそれぞれのアミノ酸を、可能性のある２０種のアミノ酸のそれぞれに置換して、適切なペプチド－ＭＨＣＩ複合体を形成するために必須である、このペプチド内のアミノ酸の位置を同定した。図は、２０種のアミノ酸全てを、１列で、アミノ酸１文字コードによって、特徴によってグループ分けして示す：ＡＦＩＬＭＶＷＰＧＳＹＣＱＴＮＲＫＨＤＥ。アミノ酸Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＰは、非極性アミノ酸である。アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｎは、極性アミノ酸である。アミノ酸Ｒ、ＫおよびＨは、塩基性アミノ酸である。アミノ酸ＤおよびＥは、酸性アミノ酸である。
【図7】[089]図７は、ＷＴ１の９マー・ペプチドについてのペプチド－ＭＨＣ会合体に対するＥＳＫ１抗体結合特異性を示すプロットである。データは、特定の標的（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７））および交差反応標的（ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ（配列番号９））についての相対蛍光強度を示す。
【図8】[090]図８は、「ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ」（配列番号７）バリアントについて、ＥＳＫ１抗体結合特異性を示すプロットである。９つのアミノ酸ペプチドのそれぞれのアミノ酸を、可能性のある２０種のアミノ酸のそれぞれに置換して、適切なペプチド－ＭＨＣＩ複合体を形成するために必須であるこのペプチド内のアミノ酸の位置を同定した。図は、２０種のアミノ酸全てを、１列で、アミノ酸１文字コードによって、特徴によってグループ分けして示す：ＡＦＩＬＭＶＷＰＧＳＹＣＱＴＮＲＫＨＤＥ。アミノ酸Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＰは、非極性アミノ酸である。アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｎは、極性アミノ酸である。アミノ酸Ｒ、ＫおよびＨは、塩基性アミノ酸である。アミノ酸ＤおよびＥは、酸性アミノ酸である。
【図9】[091]図９は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）をどのように使用して、表面上の各ペプチドをｉｎ ｓｉｔｕ合成することにより本開示の組成物を作製し得るかを実証する一連の模式図である。左のパネルは、ガラススライド上に含まれる一連の３つの表面の１つの表面の上に直接位置する複数のマイクロミラーを含む例示的なＤＭＤを示す。光が複数のマイクロミラー上へ示されるように、複数のマイクロミラーのそれぞれが傾斜するように独立してプログラムされ、マイクロミラーの下の表面の領域に向けて光を反射するか、またはマイクロミラーの下の表面の領域から光を偏光する。個々のマイクロミラーの傾斜を中央パネルに示す。右側のパネルは、それぞれのマイクロミラーの傾斜によって制御される光のパルスがどのように表面上のペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで構築するかを示す。本開示の組成物のペプチドは、そのＣ末端でリンカーによって表面に結合する。ペプチドに付加される各アミノ酸は、光の非存在下で、ペプチドへの別のアミノ酸の付加を予防する光不安定性保護基を含む。しかし、光が保護基に接触するとき、アミノ酸は脱保護され、アミノ酸が付加され得る。アミノ酸が表面を横切って流れるとき、それぞれのマイクロミラーは、ペプチド配列で意図される次のアミノ酸が表面を横切って流れるときアミノ酸を脱保護するように、予めプログラムされた時間で光を反射する。任意の所与のマイクロミラーによって制御される表面の領域は、本明細書で「微小領域」と呼ばれる。本開示の微小領域は、物理的境界でなく、仮想境界を有する。この図の右側のパネルで示されるように、本開示の表面の好ましい実施形態では、ペプチド合成の間に表面を横切るアミノ酸の流れを妨害する物理的境界は存在しない。
【図10】[092]図１０Ａは、標準５ＨＥＸリンカーを使用するＨＬＡ－Ａ２／ＲＬＹＤＹＦＴＲＶペプチド－ＭＨＣ会合体形成を示すプロットである（「ＲＬＹＤＹＦＴＲＶ」は配列番号１０として開示される）。結合は、ｐＨ６．５で、４℃で一晩行った。[093]図１０Ｂは、負に荷電されたＨＥＸ－ａｓｐ－３ＨＥＸリンカーを使用するＨＬＡ－Ａ２／ＲＬＹＤＹＦＴＲＶペプチド－ＭＨＣ会合体形成を示すプロットである（「ＲＬＹＤＹＦＴＲＶ」は配列番号１０として開示される）。結合は、ｐＨ６．５で、４℃で一晩行った。破線は、標準５ＨＥＸリンカーとは反対に、負に荷電されたリンカーを使用するときの元のペプチド配列に対するペプチド－ＭＨＣ会合シグナルの増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【0083】
[094]Ｔ細胞（胸腺細胞またはＴリンパ球としても知られる）は、１種のリンパ球（１種の白血球）であり、ファゴサイトーシス、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球、および抗原に応答した様々なサイトカインの放出が関与する細胞媒介免疫において中心的な役割を果たす。Ｂ細胞による抗原認識と異なり、抗原のＴ細胞認識は、目障りな抗原への直接結合には関与しないが、Ｔ細胞受容体と病原体由来ペプチドエピトープおよびエピトープを細胞表面に移動させる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の複合表面との相互作用に関与する。ヒト免疫系は、自己および外来抗原に対する細胞性免疫応答の進展する広範囲のレポジトリを定義する明確な特異性を有する約２５００万個のＴ細胞クローンを宿すと推定される。したがって、これらのＴ細胞集団を検出および調査することは、根本的および治療的に重要である。残念なことに、ヒトＴ細胞レパートリーの広範囲の認識能力は、免疫モニタリングおよびＴ細胞エピトープ発見のための現行の確立された方法にはあまり適合しない。
【0084】
[095]抗原特異的Ｔ細胞応答を分析するためにしばしば使用される方法には、細胞内サイトカイン染色、ＣＤ１０７細胞傷害性アッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔ、殺傷アッセイなどが含まれる。これらのアッセイは、ある特定のＴ細胞機能に対処する点で全て非常に有用であるが、労働集約的であることが多く、大量の臨床末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）検体を必要とし、空間解像度が乏しく、および／または分泌応答に対して感度が低い。最近、蛍光標識多量体ペプチド－ＭＨＣ複合体（ｐ／ＭＨＣ）を用いた抗原特異的Ｔ細胞の染色が、抗原の小セットに対するＴ細胞応答の分析のために広範囲に使用されるようになっている。しかしながら、ｐＭＨＣ四量体の合成は、時間がかかり、容易にスケール変更できない。結果として、限られた数のｐＭＨＣ複合体しか調査できず、したがって、異なる機能性事象について複数のＴ細胞特異性を追跡することは困難である。
【0085】
[096]前記制限を克服するために、本開示は、ＴＣＲ、ＴＣＲ様抗体、および抗原特異的Ｔ細胞を、それらのｐ／ＭＨＣ複合体への接着性に基づいて捕捉および特性決定するためのアレイベースのアプローチを提供する。
【0086】
[097]スケール変更可能なペプチドマイクロアレイは、タンパク質科学において、パラダイムシフト的に進歩している。例えば、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、最大で２９０万個の特有のおよび空間的に順序付けられたペプチドを単一の表面上で合成することにより、何千のもの標的を同時に試験することができる。加えて、本開示の組成物および方法は、リン酸化などの修飾、シトルリンなどの非天然アミノ酸、ならびに拘束性ペプチド（例えば、環状ペプチド）をペプチドに組み込むことができる。
【0087】
[098]本開示の組成物の別の特有の特徴は、表面でのｐ／ＭＨＣ複合体の直接形成である。伝統的に、ｐ／ＭＨＣ複合体をハイスループット形式で試験する場合、それぞれ個々のｐ／ＭＨＣ複合体が最初に構築される。ＭＨＣ分子の（適切なペプチドの存在無しの）欠如は不安定であるので、ペプチドとＭＨＣ成分との両方が折り畳み反応において存在する必要がある。次いで、多量体を形成し、処理されたおよび／または誘導体化された表面上にスポッティングする。複数のｐ／ＭＨＣを試験する必要があるとき、この製造プロセスは、実に大変な作業となり得る。さらに、処置されたおよび／または誘導体化された表面上にｐ／ＭＨＣをスポッティングすることにより、既存の技術は、タンパク質変性およびタンパク質吸着を含む表面が不活性な方向に誘導される作用を被る。
【0088】
[099]本開示の組成物を作製する方法は、適切なＭＨＣ結合ペプチドの非存在下でさえ、タンパク質を変性から効果的に救済するＭＨＣαおよびβサブユニット混合物の調製プロセスへ担体分子を導入することによって、既存の技術の技術的ハードルを克服する。次いで、混合物をアレイ表面に直接適用し、ここでの結合ペプチドの存在がＭＨＣリフォールディングをもたらす。このように、何千ものｐＭＨＣが同時に会合する。Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、天然および／またはキメラ抗原受容体）またはＴＣＲ様抗体が表面に適用され得る。インキュベーション後、ペプチド標的特異的Ｔ細胞を、例えば、対応するｐ／ＭＨＣ分子に接着させると、異なる抗原特異的Ｔ細胞／ＴＣＲ集団の空間的分離を生じる。アッセイの読み出しは、全体的な蛍光シグナルよりむしろ位置に依存するので、本開示の組成物および方法は、高度に多重性の反応を特有に行うことができる。
【0089】
ペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成
[0100]本開示のペプチドまたは複数のペプチドの表面上のｉｎ ｓｉｔｕ合成は、パターニングプロセスを使用して、迅速かつ効率的に行われる。プロセスは、ペプチドの一または二次元アレイの作製が可能になるように自動化およびコンピュータ制御されてもよい。リソグラフィーマスクは必要でなく、したがってリソグラフィーマスクの作製に関連する多大なコストおよび時間的遅延がなくなり、ペプチドアレイの作製プロセスの間の時間のかかる操作および複数のマスクの整列が不要となる。
[0100]本開示のペプチドまたは複数のペプチドの表面上のｉｎ ｓｉｔｕ合成は、パターニングプロセスを使用して、迅速かつ効率的に行われる。プロセスは、ペプチドの一または二次元アレイの作製が可能になるように自動化およびコンピュータ制御されてもよい。リソグラフィーマスクは必要でなく、したがってリソグラフィーマスクの作製に関連する多大なコストおよび時間的遅延がなくなり、ペプチドアレイの作製プロセスの間の時間のかかる操作および複数のマスクの整列が不要となる。
【0090】
[0101]ペプチド合成リンカーが適用された活性表面を使用して、作製されるペプチドを支持してもよい。活性表面から開始して第１のレベルのアミノ酸を提供するために、高精度二次元光像を表面上に投影し、第１のアミノ酸に結合するように活性化される活性表面上のアレイの微小領域（例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３７５，９０３号および米国特許第８，０３０，４７７号において、ピクセルまたはタイルとも称される）を照射する。光が適用されるアレイの微小領域に入射する光は、結合したアミノ酸を脱保護し、さらなるアミノ酸の結合に利用できるようにする。この発展工程の後に、適切なアミノ酸を含有する流体が活性表面に適用され、選択されたアミノ酸が露出部位に結合する。その後、このプロセスを繰り返して、別のアミノ酸を異なる微小領域位置のセットに結合させ、表面上の二次元アレイの全ての要素がそれに結合する適切なアミノ酸を有するまで行う（例えば、図９参照）。基板上に結合したアミノ酸は、アミノ酸に結合することができる化学物質、または結合アミノ酸の全てを覆うフォトレジストの層で保護されており、その後、新たなアレイパターンが表面上へ投影および結像され、第１の新たなアミノ酸が付加されるそれらの微小領域における保護材料を活性化させる。次いでこれらの微小領域を露出させ、選択されたアミノ酸を含有する溶液を、アミノ酸が露出された微小領域位置に結合するように、アレイに適用する。次いで、このプロセスを、第２のレベルのアミノ酸の他の微小領域の全てに対して繰り返す。その後、ペプチド配列の選択された二次元アレイの全てが完了するまで、各所望のレベルのアミノ酸に対して、記載されたプロセスを繰り返すことができる。
【0091】
[0102]画像は、それぞれが選択的に少なくとも二つの別々の位置のうちの１つとの間に傾斜されることができる電子的にアドレス指定可能なマイクロミラーの二次元アレイを含むマイクロミラーデバイスへ光を提供する適切な光源を有する画像形成機を利用して、表面上に投影される。各マイクロミラーの位置の１つでは、マイクロミラー上の入射源からの光は、光軸から外して、表面から離して偏光され、各マイクロミラーの少なくとも２つの位置の第２の位置では、光が、光軸に沿って、表面に向けて反射される。投影光学系は、マイクロミラーから反射された光を受け、活性表面上にマイクロミラーを正確に結像する。コリメート光学系を使用して、光源からの光を、マイクロミラーアレイまたはビームスプリッタへ直接提供されるビームへコリメートすることができ、ここでビームスプリッタは、ビームの一部をマイクロミラーアレイへ反射し、マイクロミラーアレイから反射された光を、ビームスプリッタを通じて送る。マイクロミラーから直接反射される光またはビームスプリッタを通じて送られる光は、投影光学系レンズに向けられ、投影光学系レンズは、活性表面上でマイクロミラーアレイを結像する。マイクロミラーアレイにおける選択的にアドレス指定可能なマイクロミラーはそれに提供される光を完全に反射または完全に偏光し得るので、マイクロミラーアレイの画像は「オン」と「オフ」の微小領域の間で非常に高いコントラストを示す。またマイクロミラーは、３つ以上の位置にインデックスすることができ、この場合、追加の光学系を与えて、単一のマイクロミラーアレイデバイスを使用して２つ以上の表面の露出を可能にすることができる。さらにマイクロミラーは、それらを損傷することなく任意の波長の光を反射することができるので、紫外線から近紫外線の範囲の光を含む短波長の光を光源から利用することを可能にする。
【0092】
[0103]マイクロミラーアレイを、適切な微小領域アドレスシグナルをマイクロミラーアレイに与えるコンピュータの制御下で操作して、適切なマイクロミラーをその「反射」または「偏光」位置にさせることができる。ペプチドに添加されるアミノ酸の各レベルでの各活性化工程のための適切なマイクロミラーアレイパターンが、コンピュータ制御装置にプログラムされる。このようにコンピュータ制御装置は、表面に提供される試薬と協調して、マイクロミラーアレイによって提示される画像の配列を制御する。
【0093】
[0104]表面は、マイクロミラーアレイの画像を、表面を通して投影することができるように透明であってもよい。表面は、フローセル内にアレイの活性表面を囲い込み封入してマウントされてもよく、フローセルを通じて適切な試薬をアレイの活性表面にわたって適切な順序で流して、アレイにペプチドを構築することができる。
【0094】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）
[0105]ＭＨＣのクラスＩまたはクラスＩＩは、ヒトの全ての有核細胞の表面にわたって発現される。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体は、全ての有核細胞に存在するが、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）複合体は、免疫系の細胞（つまり、マクロファージおよびリンパ球）にのみ存在する。ＭＨＣ複合体は細胞内の中身のペプチド断片を提示して、免疫系が、非自己ペプチド配列の提示によって決定される外来の侵略者の存在についての本体の調査を行うことを可能にする。自己免疫状態の場合には、ＭＨＣが自己ペプチドを提示するとき、免疫系は、免疫系が非自己ペプチドに反応するのと同様の様式で刺激される。ＭＨＣの成分をコードする、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子を含む白血球抗原遺伝子は非常に多様で、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ両方のＭＨＣの多くの可能な順列をもたらす。
[0105]ＭＨＣのクラスＩまたはクラスＩＩは、ヒトの全ての有核細胞の表面にわたって発現される。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体は、全ての有核細胞に存在するが、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）複合体は、免疫系の細胞（つまり、マクロファージおよびリンパ球）にのみ存在する。ＭＨＣ複合体は細胞内の中身のペプチド断片を提示して、免疫系が、非自己ペプチド配列の提示によって決定される外来の侵略者の存在についての本体の調査を行うことを可能にする。自己免疫状態の場合には、ＭＨＣが自己ペプチドを提示するとき、免疫系は、免疫系が非自己ペプチドに反応するのと同様の様式で刺激される。ＭＨＣの成分をコードする、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子を含む白血球抗原遺伝子は非常に多様で、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ両方のＭＨＣの多くの可能な順列をもたらす。
【0095】
[0106]ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子配列を含む白血球抗原遺伝子配列は、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｕ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）およびＵＮＩＰＲＯＴ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を含むいくつかの公的に利用可能なデータベースで見出すことができる。本開示のＭＨＣＩ複合体のα鎖は、膜貫通、ヒンジおよび／または細胞質領域を除去するように修飾されてもよい。この修飾を達成するために、ＭＨＣＩ複合体のα鎖の全長核酸配列を公的データベースから取得し、膜貫通、ヒンジおよび／または細胞質領域をコードする配列を除去するように編集し、任意選択的に核酸が発現される宿主Ｔ細胞（例えば、大腸菌）のために最適化されたコドン表を使用して、逆翻訳する。本開示のＭＨＣＩＩ複合体のα鎖は、膜貫通および／または細胞質領域を除去するように修飾されてもよい。この修飾を達成するために、ＭＨＣＩＩ複合体のα鎖の全長核酸配列を公的データベースから取得し、膜貫通および／または細胞質領域をコードする配列を除去するように編集し、任意選択的に核酸が発現される宿主Ｔ細胞（例えば、大腸菌）のために最適化されたコドン表を使用して、逆翻訳する。本開示のＭＨＣＩＩ複合体のβ鎖は、膜貫通および／または細胞質領域を除去するように修飾されてもよい。この修飾を達成するために、ＭＨＣＩＩ複合体のβ鎖の全長核酸配列を公的データベースから取得し、膜貫通および／または細胞質領域をコードする配列を除去するように編集し、任意選択的に核酸が発現される宿主Ｔ細胞（例えば、大腸菌）のために最適化されたコドン表を使用して、逆翻訳する。
【0096】
[0107]ペプチドおよびＭＨＣ成分は、各細胞の小胞体（ＥＲ）で会合してから、細胞表面に提示される。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＭＨＣと複合体を形成するペプチドは、プロテアソームによる細胞質タンパク質の分解の副産物である。本開示のペプチドは、任意の配列を含むまたはそれからなることができ、配列は、任意のポリペプチドから誘導することができる。例えば、本開示のペプチドは、各工程で１つのアミノ酸（または２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）を、ポリペプチドの配列のＮ末端からＣ末端へ、例えば６～３０アミノ酸の間隔（つまり、本開示の組成物の表面で合成することが意図されるペプチドの長さ）で、ポリペプチドの長さが横断されるまで、組織的に移動させることによって設計することができる。さらに、工程で配列に沿って移動させることによって生成されるペプチド配列のセットを使用して、さらなるペプチドのセットを、例えば、それらのペプチドの各１つの配列に存在するアミノ酸を可能性のある２０のアミノ酸の各１つに置換することによって展開し、全ての可能な配列バリエーションを提供することができる。この例では、実施例１と同様に、ＷＴ１タンパク質が、各工程で１個のアミノ酸が移動する９個のアミノ酸を有するペプチドに分割される場合、図１で提供されるペプチドのセットが生成されるであろう。その後、これらのペプチドが実施例１に示されるように置換される場合、さらなるペプチドのセット、つまり置換セットが生成され得る。このプロセスを任意のポリペプチドに適用して、本開示の組成物の少なくとも１つのペプチドまたは複数のペプチドを生成することができる。
【0097】
[0108]免疫系を阻害するかまたは免疫系を刺激する介入点を同定するための課題は、いくつかのペプチドがＭＨＣにローディングされる一方で他のペプチドはローディングされないことを許可する規則を定義することである。高度に多重化された形式を使用して、本開示の組成物および方法は、ペプチドのＭＨＣＩおよび／またはＭＨＣＩＩと会合する実証された能力または無能力を示す経験的な証拠を提供する。
【0098】
[0109]ペプチドが、安定なＭＨＣ複合体の一部として細胞の表面に提示されると、免疫系（例えば、Ｔ細胞）は、外来または非自己抗原である配列を見い出すためにペプチド－ＭＨＣ複合体をサンプリングする。自己免疫条件では、免疫系が自己抗原と非自己抗原とを区別することができず、最終的に自己抗原を示す細胞を外来侵略者として扱い、健康な組織を攻撃する。免疫優性ペプチドを同定するために使用されるのと同じ高度に多重化された反応では、本開示の組成物および方法は、対象をがん細胞に対する免疫系とするまたは免疫系を感染とより良好に戦うように刺激するために使用することができる合成ペプチド、修飾ペプチドおよび／またはネオ抗原を含む免疫系を刺激するペプチドを同定するために使用することができる。本開示の組成物および方法は、天然の免疫系が認識しない細胞上のペプチド－ＭＨＣ複合体、例えば、がん細胞上のペプチド－ＭＨＣ複合体を同定するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞の能力を検証するために使用することができる。
【0099】
定義
[0110]本開示で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照物を含む。したがって、例えば、「方法」への参照は、複数のそのような方法を含み、「用量」への参照は、１つまたは複数の用量および当業者に既知の同等物を含むなどである。
[0110]本開示で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照物を含む。したがって、例えば、「方法」への参照は、複数のそのような方法を含み、「用量」への参照は、１つまたは複数の用量および当業者に既知の同等物を含むなどである。
【0100】
[0111]「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、値を測定し、または決定する方法、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、１以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、該用語は、好ましくは値の５倍以内、より好ましくは２倍以内の桁内を意味することができる。別段に記載がない限り、本出願および特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、「約」という用語は、特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味すると推定される。
【0101】
[0112]本開示は、単離されたまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、天然の環境で見出されるポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随するまたはそれらと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。したがって、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術によって生成されるとき、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まず、化学的に合成されるとき、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおけるポリヌクレオチドにおいて天然に隣接する配列（つまり、ポリヌクレオチドの５’および３’端に位置する配列）を含まない（最適にはタンパク質コード配列）。例えば、様々な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡのポリヌクレオチドに天然に隣接するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、混入タンパク質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％または１％未満であるタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に産生されるとき、最適な培養培地は、化学物質前駆体または目的のタンパク質以外の化学物質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％または１％未満である。
【0102】
[0113]本開示は、これらのＤＮＡ配列によってコードされる開示されたＤＮＡ配列およびタンパク質の断片およびバリアントを提供する。本開示全体にわたって使用されるとき、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部、またはアミノ酸配列したがってそれによってコードされるタンパク質の一部を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然のタンパク質の生物学的活性、したがって本明細書に記載される標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識または結合活性を保持するタンパク質断片をコードすることができる。代替的に、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるＤＮＡ配列の断片は、一般的に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしないまたはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、最大で本発明の全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【0103】
[0114]本開示の核酸またはタンパク質は、後に最終的な目的ベクターに組み立てることができる標的ベクターにおける仮組み立てのモノマー単位および／または反復単位を含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを含んでもよく、後に最終的な目的ベクターに組み立てることが可能な標的ベクターにおける仮組み立て反復単位によるモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示は、本方法によって作製されるポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって作製されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【0104】
[0115]本明細書で使用されるとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【0105】
[0116]「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合の相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）。
【0106】
[0117]「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合に、タンパク質は、それ自身に結合する（そしてホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができ、および／または異なるタンパク質（１種または複数種）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１種より多くの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【0107】
[0118]「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが他を排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」とは、意図する目的のために使用するときの組合せに何らかの重要な意義を持つ他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、微量混入物質または不活性担体を排除しない。「からなる」とは、他の成分の微量を超える要素および実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【0108】
[0119]「連結された」または「作動可能に連結された」またはその等価物（例えば、「作動可能的に連結された」）は、２つ以上の分子が、１つまたは両方の分子またはその組合せに起因する機能に影響を与えるために相互作用することができるように互いに配置されることを意味する。ペプチドとそれに対応するリンカーは、作動可能に連結することができる。
【0109】
[0120]本開示のペプチドは、ペプチドまたはペプチド－ＭＨＣ複合体を検出するために使用される抗体のエピトープを含むことができる。さらに、抗体は、天然に存在する抗体を含む抗体のエピトープを決定するために、本開示の組成物に接触することができる。「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的コンフォメーションで３個のアミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは少なくとも４、５、６または７個のそのようなアミノ酸からなり、より通常は、少なくとも８、９または１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む。
【0110】
[0121]「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的に、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）ならびにポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を包含する。本明細書に定義されるその抗体の天然または合成のアナログ、変異体、バリアント、対立遺伝子、ホモログおよびオルソログ（本明細書中で集約的に「アナログ」と呼ばれる）を使用することもその範囲内である。したがって、その一実施形態によれば、その最も広い意味での「その抗体」という用語は、そのようなアナログも包含する。一般に、そのようなアナログでは、１つまたは複数のアミノ酸残基が、本明細書に定義される抗体と比較して、置換、欠失および／または付加されてもよい。
【0111】
[0122]本開示のペプチドおよび／またはペプチド－ＭＨＣ複合体を検出するために使用される抗体を任意の種から惹起させてもよい。特定の実施形態では、これらの抗体は、フレームワーク領域が非ヒト種由来であっても、ヒトＣＤＲ配列を有する。特定の実施形態では、これらの抗体は完全にヒトであるが、非天然であるように１つまたは複数の修飾を含んでもよい。特定の実施形態では、これらの抗体は、ヒト免疫系が本開示の組成物の表面に結合した本開示のペプチドおよび／またはペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣するように完全にヒトである。
【0112】
[0123]抗体断片は、本開示の組成物の表面に結合した本開示のペプチドおよび／またはペプチド－ＭＨＣ複合体を認識するための検出可能な薬剤に組み込まれてもよい。「抗体断片」およびその文法的変形は、本明細書で使用されるとき、インタクト抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクト抗体の一部として定義され、ここでその一部は、インタクト抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（つまり、抗体アイソタイプに依存してＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続するアミノ酸残基の１つの中断されない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書で「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」として参照される）、例えば、限定されないが、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）１つの軽鎖可変ドメインのみを有する一本鎖ポリペプチド、または関連する重鎖部分なしで軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、または関連する軽鎖部分なしで重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する断片；ならびに抗体断片から形成される多重特異性または多価構造が含まれる。１つまたは複数の重鎖を含む抗体断片では、重鎖は、インタクト抗体の非Ｆｃ領域で見出される任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプのＣＨＩ）を含むことができ、および／またはインタクト抗体で見出される任意のヒンジ領域配列を含むことができ、ならびに／あるいは重鎖のヒンジ領域配列に融合もしくは配置されたロイシンジッパー配列または定常ドメイン配列を含むことができる。該用語はさらに、一般的に単一のモノマー可変抗体ドメイン（例えば、ラクダ科由来）を有する抗体断片を指す単一のドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）をさらに含む。そのような抗体断片のタイプは、当業者によって容易に理解される。
【0113】
[0124]用語「ｓｃＦｖ」は、一本鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーペプチドは、長さが約５～４０アミノ酸、または約１０～３０アミノ酸、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０アミノ酸であり得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子で見出される定常Ｆｃ領域、したがって抗体を精製するために使用される共通の結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠く。この用語はさらに、イントラボディ、つまり細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合し得る抗体であるｓｃＦｖを含む。
【0114】
[0125]「単一ドメイン抗体」という用語は、特定の抗原に選択的に結合することができる単一のモノマー可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、一般的に、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨ）または一般的なＩｇＧの可変ドメインを含む約１１０アミノ酸長のペプチド鎖であり、一般的に、全抗体と同様の抗原に対する親和性を有するが、より耐熱性であり、界面活性剤および高濃度の尿素に対してより安定である。例として、ラクダ科または魚の抗体から誘導される抗体がある。あるいは、単一ドメイン抗体は、４本の鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから作製することができる。
【0115】
[0126]本明細書で使用される「特異的に結合する」および「特異的結合」という用語は、異なる抗原の均質な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体、抗体断片またはナノボディの能力を指す。特定の実施形態では、特異的な結合作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを、一部の実施形態では、約１０倍を超えて１００倍またはより高く（例えば、約１０００倍もしくは１０，０００倍を超えて）識別することができる。「特異性」は、様々な抗原標識に対して１つの抗原標的に優先的に結合する免疫グロブリンまたはナノボディなどの免疫グロブリン断片の能力を指し、必ずしも高親和性を示唆するものではない。
【0116】
[0127]「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の記述は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示された一本鎖の相補鎖を包含することができる。本開示の核酸は、同じ構造を保持するまたは同じタンパク質をコードする実質的に同一の核酸またはその相補物も包含する。
【0117】
[0128]本開示の核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であっても二本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であっても一本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドを含むことができる。本開示の核酸は、デオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドを含むことができる。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含むことができる。本開示の核酸は、非天然アミノ酸修飾を含むように合成することができる。本開示の核酸は、化学的合成方法または組換え方法によって得ることができる。
【0118】
[0129]本開示の核酸は、その配列全体またはその任意の部分が、天然に存在しないものであってもよい。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない１つまたは複数の変異、置換、欠失または挿入を含んでもよい。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにする、結果となる配列が天然に存在しない１つまたは複数の重複、反転または反復配列を含むことができる。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない修飾、人工または合成ヌクレオチドを含むことができる。
【0119】
[0130]遺伝暗号における縮重を考慮すると、複数のヌクレオチド配列が、任意の特定のタンパク質をコードすることができる。そのようなヌクレオチド配列の全てが本明細書で企図される。
【0120】
[0131]本開示全体にわたって使用されるとき、核酸を記載するために使用される「バリアント」という用語は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその部分の相補物、（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその相補物と実質的に同一の核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その相補物もしくはそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
【0121】
[0132]本開示全体にわたって使用されるとき、「ベクター」という用語は、複製起点を含む核酸配列を指す。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであることができる。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【0122】
[0133]本開示全体にわたって使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドを記載するために使用されるときの「バリアント」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。さらにバリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。
【0123】
[0134]アミノ酸の保存的置換、つまりアミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、典型的に、軽微な変化を伴うものとして認識される。当技術分野で理解されるように、これらの軽微な変化は、部分的に、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することによって同定することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸のヒドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。ヒドロパシー指数が類似のアミノ酸は、置換しても依然としてタンパク質機能を保持することができる。一態様では、±２のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性も、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドのコンテキストでアミノ酸の親水性を考慮することは、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度であるペプチドの最大局所平均親和性の計算を可能にする。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。
【0124】
[0135]類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方が、アミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特にアミノ酸側鎖の疎水性、親水性、電荷、大きさおよび他の特性によって明らかにされる相対的類似性に依存すると理解される。
【0125】
[0136]本明細書で使用されるとき、「保存的」アミノ酸置換は、下記の表Ａ、Ｂ、またはＣに示されるように定義され得る。一部の実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与にしたがって分類することができる。保存的置換は、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸に置換することである。例示的な保存的置換を表Ａに示す。
【0126】
[0137]
【表1】
【0127】
[0138]代替的に、保存的アミノ酸は、表Ｂに示されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９７５）、７１～７７頁）に記載されるように分類することができる。
【0128】
[0139]
【表2】
【0129】
[0140]代替的に、例示的な保存的置換を表Ｃに示す。
【0130】
[0141]
【表3】
【0131】
[0142]本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠失もしくは置換、またはその任意の組合せ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換以外の修飾を保持するポリペプチドを含むことが意図されると理解されるべきである。本開示のポリペプチドまたは核酸は、１つまたは複数の保存的置換を含むことができる。
【0132】
[0143]本開示全体にわたって使用されるとき、「１つより多くの」前述のアミノ酸置換という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはより多くの参照されたアミノ酸置換を指す。「１より多くの」という用語は、２、３、４または５より多くの参照されたアミノ酸置換を指すことができる。
【0133】
[0144]本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、その配列全体またはその任意の部分が天然に存在しないものであってもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする天然に存在しない１つまたは複数の変異、置換、欠失または挿入を含んでもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする、結果となる配列が天然に存在しない１つまたは複数の重複、反転または反復配列を含んでもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない修飾、人工または合成アミノ酸を含んでもよい。
【0134】
[0145]本開示全体にわたって使用されるとき、「配列同一性」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｆｔｐサイトから、デフォルトパラメータを使用して検索することができる２つの配列をブラストするための独立型の実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用して決定することができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．、１９９９、１７４、２４７－２５０）。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列のコンテキストで使用されるとき、「同一」または「同一性」とは、配列のそれぞれの指定された領域にわたって同一である残基の指定されたパーセンテージを指す。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域における位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出することができる。２つの配列が異なる長さであるまたはアライメントが１つもしくは複数の食違い末端を生じ、比較の特定の領域に単一の配列のみが含まれる場合には、該単一の配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とは同等と考えることができる。同一性は、手動で行われるものでもよく、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用するものでもよい。
【0135】
[0146]特に断らない限り、全てのパーセンテージおよび比率は、重量基準で計算される。
【0136】
[0147]特に断らない限り、全てのパーセンテージおよび比率は、全組成物に基づいて計算される。
【0137】
[0148]本開示全体を通じて記載されるあらゆる最大数値限定は、あらゆる低い数値限定が本明細書に明確に記載されるかのように、そのような低い数値限定を含む。本開示を通じて記載される所与の最小数値限定のいずれも、それより大きいあらゆる数値限定を、そのような大きい数値限定が本明細書に明確に記載されるかのように含む。本開示を通じて記載される所与の数値範囲のいずれも、そのような広い数値範囲内に入るあらゆる狭い数値範囲を、そのような狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されるかのように含む。
【0138】
[0149]本明細書に開示された値は、列挙した正確な数値に厳密に制限されるものとして理解されるべきではない。代わりに、特に断りのない限り、そのような値のそれぞれは、列挙された値とその値周辺の機能的に同等の範囲との両方を意味することが意図される。例えば、「２０μｍ」として開示される値は、「約２０μｍ」を意味することを意図する。
【実施例】
【0139】
実施例１：ＨＬＡクラスＩ調製およびアレイ上の会合
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）およびβ２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）タンパク質の起源：
[0150]クローニングおよび大腸菌における発現
[0151]ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびｂ２ｍは、Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、スイス）およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）によって提供された。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）およびβ２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）タンパク質の起源：
[0150]クローニングおよび大腸菌における発現
[0151]ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびｂ２ｍは、Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、スイス）およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）によって提供された。
【0140】
[0152]ＵｎｉＰｒｏｔデータベースからのＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２アミノ酸配列を切断して、Ｃ末端でヒンジ、膜貫通および細胞質領域を、Ｎ末端からリーダーペプチド配列を除去した。
【0141】
[0153]ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１：
ＭＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＱＥＴＲＮＶＫＡＱＳＱＴＤＲＶＤＬＧＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＩＱＩＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＲＱＤＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＩＴＫＲＫＷＥＡＡＨＡＡＥＱＱＲＡＹＬＥＧＲＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＴＤＰＰＫＴＨＭＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号１）
ＭＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＱＥＴＲＮＶＫＡＱＳＱＴＤＲＶＤＬＧＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＩＱＩＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＲＱＤＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＩＴＫＲＫＷＥＡＡＨＡＡＥＱＱＲＡＹＬＥＧＲＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＴＤＰＰＫＴＨＭＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号１）
【0142】
[0154]ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：
ＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＥＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＮＴＱＩＹＫＡＱＡＱＴＤＲＥＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＳＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＬＬＲＧＨＤＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＷＥＡＡＲＥＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＥＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＤＫＬＥＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号２）
ＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＥＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＮＴＱＩＹＫＡＱＡＱＴＤＲＥＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＳＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＬＬＲＧＨＤＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＷＥＡＡＲＥＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＥＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＤＫＬＥＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥ（配列番号２）
【0143】
[0155]ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２
ＳＨＳＭＲＹＦＤＴＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＧＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＥＴＱＫＹＫＲＱＡＱＡＤＲＶＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＬＱＲＭＳＧＣＤＬＧＰＤＧＲＬＬＲＧＹＤＱＳＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＬＥＡＡＲＡＡＥＱＬＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＬＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＱＥＱＲＹＴＣＨＭＱＨＥＧＬＱＥＰＬＴＬＳＷＥ（配列番号３）
ＳＨＳＭＲＹＦＤＴＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＧＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＥＴＱＫＹＫＲＱＡＱＡＤＲＶＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＬＱＲＭＳＧＣＤＬＧＰＤＧＲＬＬＲＧＹＤＱＳＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＬＥＡＡＲＡＡＥＱＬＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＬＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＱＥＱＲＹＴＣＨＭＱＨＥＧＬＱＥＰＬＴＬＳＷＥ（配列番号３）
【0144】
[0156]ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２タンパク質についてのアミノ酸配列を、大腸菌最適コドン表を使用してＤＮＡ配列に逆翻訳し、二本鎖ＤＮＡとして合成し、ＤＮＡ２．０（ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ）によってプラスミドＤＮＡにクローニングした。タンパク質を、ＤＮＡ２．０（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）またはＰｅｎｚｂｅｒｇ（ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２）のいずれかによって、封入体の形態で、大腸菌で発現した。発現したタンパク質を有する封入体を、可溶化の前に－８０℃で保存した。
【0145】
[0157]封入体の可溶化
[0158]１００ｍｇの封入体を、２．０ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１ｍｌのｐＨ７．８の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｗｅｅｎ２０、２ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁し、２，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをボルテックスによってほぐした。
[0158]１００ｍｇの封入体を、２．０ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１ｍｌのｐＨ７．８の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｗｅｅｎ２０、２ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁し、２，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをボルテックスによってほぐした。
【0146】
[0159]ペレットを、１ｍｌのｐＨ７．８の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、２ｍＭのＤＴＴと混合し、４，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをボルテックスによってほぐした。
【0147】
[0160]ペレットを、１ｍｌの１×ＰＢＳ、０．５ ｍＭのＰＭＳＦと混合し、２，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをボルテックスによってほぐした。
【0148】
[0161]ペレットを、１ｍｌのｐＨ７．８の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍの尿素、１００μＭのβ－メルカプトエタノール中に溶解し、完全に溶解させるために４℃で一晩保存した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍの吸光度で、１つのＡ２８０単位＝１ｍｇ／ｍｌと仮定して決定した。タンパク質の純度は、ＥＺｂｌｕｅ染色試薬（Ｓｉｇｍａ）で染色して、１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－ＴｒｉｓゲルおよびＭＥＳランニングバッファー（Ｎｏｖｅｘ）を用いて試験した。
【0149】
ＨＬＡクラスＩ複合体の調製およびアレイ上の会合
[0162]ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体の調製
[0163]典型的には、６３０μｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを、２０μｌのｐＨ７．８の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中１０％ ＢＳＡ、３００μｇの３０ｍｇ／ｍｌ可溶化ｂ２ｍおよび６００μｇの１５～４０ｍｇ／ｍｌ可溶化α鎖と室温（ＲＴ）で示された順序で混合した。対照試料は、ｂ２ｍタンパク質を含めなかった。混合試料を４℃で一晩インキュベートし、１２，０００×ｇで４分間遠心分離して沈殿物を除去した。上清を、およそ４００μｌの２回の試料ロードを使用してＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、それぞれ１２，０００×ｇで２分間遠心分離した。試料バッファーを、３５０μｌのｐＨ８．８の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌをフィルター保持体積に加えることによってｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓに置き換え、１２，０００×ｇで４分間の遠心分離によって濃縮した。バッファー交換手順をさらに２回、各回で３５０μｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを使用して、繰り返した。最終の遠心分離工程後、保持体積（およそ１００μｌ）を１，０００×ｇで２分間の遠心分離によって新鮮なチューブに回収し、５．０μｍのＵｌｔｒａｆｒｅｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、４℃で保存した。
[0162]ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体の調製
[0163]典型的には、６３０μｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを、２０μｌのｐＨ７．８の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中１０％ ＢＳＡ、３００μｇの３０ｍｇ／ｍｌ可溶化ｂ２ｍおよび６００μｇの１５～４０ｍｇ／ｍｌ可溶化α鎖と室温（ＲＴ）で示された順序で混合した。対照試料は、ｂ２ｍタンパク質を含めなかった。混合試料を４℃で一晩インキュベートし、１２，０００×ｇで４分間遠心分離して沈殿物を除去した。上清を、およそ４００μｌの２回の試料ロードを使用してＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、それぞれ１２，０００×ｇで２分間遠心分離した。試料バッファーを、３５０μｌのｐＨ８．８の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌをフィルター保持体積に加えることによってｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓに置き換え、１２，０００×ｇで４分間の遠心分離によって濃縮した。バッファー交換手順をさらに２回、各回で３５０μｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを使用して、繰り返した。最終の遠心分離工程後、保持体積（およそ１００μｌ）を１，０００×ｇで２分間の遠心分離によって新鮮なチューブに回収し、５．０μｍのＵｌｔｒａｆｒｅｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、４℃で保存した。
【0150】
[0164]ＨＬＡクラスＩのアレイ上の複合体会合および検出
[0165]合成および脱保護後のペプチドアレイスライドを、密封された容器に－２０℃で保存するかまたは直ぐに使用した。試料を適用する前に、スライドを、アレイブロッキングおよび基準マークの染色のために、０．７μｇ／ｍｌのＣｙ－５標識ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１×結合バッファー（１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間、室温でインキュベートし、水で濯ぎ、スライドホルダーを備えた卓上遠心分離機を使用して３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。
[0165]合成および脱保護後のペプチドアレイスライドを、密封された容器に－２０℃で保存するかまたは直ぐに使用した。試料を適用する前に、スライドを、アレイブロッキングおよび基準マークの染色のために、０．７μｇ／ｍｌのＣｙ－５標識ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１×結合バッファー（１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間、室温でインキュベートし、水で濯ぎ、スライドホルダーを備えた卓上遠心分離機を使用して３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。
【0151】
[0166]調製されたＨＬＡクラスＩ試料を、何ら追加の処理または希釈なしに、ペプチドアレイの表面に付けたインキュベーションチャンバーに装填した。室温で一晩インキュベーションした後、インキュベーションチャンバーを除去し、アレイを水で濯ぎ、ＨＬＡ複合体を室温で抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃコンフォメーション抗体（Ａｌｅｘａ６４７－ＭＥＭ１２３（Ｎｏｖｕｓ）１×結合バッファー中で３００倍希釈）を用いて１時間染色した。染色後、アレイを水で濯ぎ、乾燥し、６３５ｎｍでスキャンした。
【0152】
アレイ上のペプチド／ＨＬＡ複合体会合に影響を与えるパラメータ：
[0167]ペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ会合が成功するための影響力のあるパラメータ：
[0168]本実施例に関して、ＢＳＡの最適濃度は、ＨＬＡ／ｂ２ｍ混合物に対して２～３％の添加であることが分かった。ＢＳＡなしでは、複合体形成は観察されなかった。
[0167]ペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ会合が成功するための影響力のあるパラメータ：
[0168]本実施例に関して、ＢＳＡの最適濃度は、ＨＬＡ／ｂ２ｍ混合物に対して２～３％の添加であることが分かった。ＢＳＡなしでは、複合体形成は観察されなかった。
【0153】
[0169]本実施例に関して複合体調製物のためのｂ２ｍモル／モル比に対する最適ＨＬＡは、１：１～１：２であることが分かった。
【0154】
[0170]ＨＬＡ／ｂ２ｍ混合物調製のプロセスでは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２タンパク質は、８Ｍ尿素ストックから希釈する間に沈殿物を形成した。この効果はｐＨ依存性であり、１０ｍＭのｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーを使用して最小化することができる。
【0155】
[0171]複合体会合強度シグナルは、ＨＬＡ／ｂ２ｍ濃度に比例する。最適濃度のために、２つの因子、つまり、第１にＨＬＡ／ｂ２ｍ漸増濃度は特異的および非特異的シグナル（バックグラウンド）の両方を増加させること、第２にＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ／ｂ２ｍ濃度に対するシグナルに依存して変動することを考慮すべきである。このことは、最適濃度が、各対立遺伝子に対して独立して見出されるべきであることを意味する。「ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体調製」セクションに記載する条件は、最適化のためのテンプレートとして使用することができる。
【0156】
[0172]少なくとも一晩のインキュベーションが、ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体調製およびアレイ上のペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合両方の工程のために推奨される。
【0157】
[0173]スライド表面へのペプチド結合のためにリンカーを最適化するために、３つの異なるリンカー、ヘキサン酸、ＰＥＧおよびＧ／Ｓアミノ酸の３：１比率のミックスを、１～５の５つの異なる長さで試験した。３つのヘキサン酸分子からなるリンカーが、メトリックとしてシグナル／バックグラウンド比を使用して最適であることが分かった。さらに、特に表面が正味の正電荷を有する場合、リンカーは、少なくとも１つの負のモノマーを含むように最適化することができる。例えば、リンカーは、少なくとも１つの負に荷電されたアミノ酸を含んでもよい。
【0158】
[0174]ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体を検出するコンフォメーション抗体のＣｙ５－標識Ｗ６／３２（ＮＢＰ２－００４３９）またはＡｌｅｘａ６４７－標識ＭＥＭ１２３（ＮＢ５００－５０５ＡＦ６４７）（いずれもＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製）を、ペプチドアレイ上で会合したＨＬＡ／ｂ２ｍの検出のために、それぞれ最適抗体希釈係数１：１００および１：３００で使用することができる。
【0159】
[0175]ペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ会合に対して最小または負の効果を有するパラメータ：
[0176]いくつかの試薬が、効率的なペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合のために重要であるとして文献で報告された。それらの中には、０．４ＭのＬ－アルギニン、０．２５％のグルコピラノシド、５ｍＭの還元型Ｌ－グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈａｔｉｏｎｅ）／０．５ｍＭの酸化型Ｌ－グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈａｔｉｏｎｅ）、Ｌ－ＧＬジペプチドなどの補助ペプチドおよび低親和性ペプチドがある。これらの試薬は、ペプチドアレイ上のＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合に対して最小限の効果または阻害性効果を有することが分かった。
[0176]いくつかの試薬が、効率的なペプチド／ＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合のために重要であるとして文献で報告された。それらの中には、０．４ＭのＬ－アルギニン、０．２５％のグルコピラノシド、５ｍＭの還元型Ｌ－グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈａｔｉｏｎｅ）／０．５ｍＭの酸化型Ｌ－グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈａｔｉｏｎｅ）、Ｌ－ＧＬジペプチドなどの補助ペプチドおよび低親和性ペプチドがある。これらの試薬は、ペプチドアレイ上のＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合に対して最小限の効果または阻害性効果を有することが分かった。
【0160】
[0177]５．５～８．５の範囲のｐＨ、２０ｍＭ～１ＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２、０．１％カゼイン、６０ｍＭの尿素を含む他のパラメータを試験し、ペプチドアレイ上のＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体会合に対して最小限の効果または阻害性効果を有することが分かった。
【0161】
[0178]いくつかの他の抗体を、会合したＨＬＡ／ｂ２ｍ複合体：抗ｂ２ｍ、抗ＨＬＡ ＭＥＭ８１、ＭＥＭ１４７およびＢＢ７．２の検出のために試験した。これらの抗体は、良好なシグナル／バックグラウンド比を示したＢＢ７．２を除き、全てｗ６／３２およびＭＥＭ１２３抗体と比較して低いシグナルまたは高いバックグラウンドを示した。しかし、ＢＢ７．２は、ＨＬＡ－Ａに制限があり、ならびにＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を検出不能であることから、この試験では使用しなかった。
【0162】
実施例２：ＭＨＣＩ表面アレイ設計
セット１
[0179]１２プレックスのレイアウト：
[0180]バッチ処理９マー・ペプチド（１２３，６７５ペプチド）：５つの対照タンパク質；ＮＹ－ＥＳ０１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＦＯＸＰ３；３つの異なるリンカーのタイプ（ＰＥＧ８、６－アミノヘキサン酸、Ｇｌｙ：ＳＥＲ ４：１ミックス）および５つの異なるリンカーの長さを表す、１アミノ酸工程サイズのタイル状の９マー・ペプチド。
セット１
[0179]１２プレックスのレイアウト：
[0180]バッチ処理９マー・ペプチド（１２３，６７５ペプチド）：５つの対照タンパク質；ＮＹ－ＥＳ０１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＦＯＸＰ３；３つの異なるリンカーのタイプ（ＰＥＧ８、６－アミノヘキサン酸、Ｇｌｙ：ＳＥＲ ４：１ミックス）および５つの異なるリンカーの長さを表す、１アミノ酸工程サイズのタイル状の９マー・ペプチド。
【0163】
[0181]
【表4】
【0164】
[0182]ｐＭＨＣ形成および検出を最適化するための最初の実験設計は、５つの既知のがんタンパク質、３つの異なるペプチドリンカーのタイプ、および５つの異なるリンカーの長さ（１～５反復／モノマー）を含んだ。
【0165】
セット２
[0183]１２プレックスのレイアウト：Ｗｉｌｍｓ腫瘍からの２つのペプチドおよび１つの他のペプチド。Ｗｉｌｍｓ腫瘍は、腎芽腫としても知られる稀な腎臓がんである。
[0183]１２プレックスのレイアウト：Ｗｉｌｍｓ腫瘍からの２つのペプチドおよび１つの他のペプチド。Ｗｉｌｍｓ腫瘍は、腎芽腫としても知られる稀な腎臓がんである。
【0166】
[0184]単一アミノ酸置換分析（４０，５００ペプチド）：対応する抗体が利用可能であり、ＭＨＣＩに結合したペプチドを認識することができる３つのよく研究された対照ペプチドを合成する。抗体はナノモル結合親和性を有し、したがって、抗体は、ペプチド－ＭＨＣＩ複合体に特異的に結合すると予測される。９マー・ペプチドの各位置について、全部で２０種のアミノ酸に置換することによって、２０個のペプチドを合成する。９マーでは、２０＊９＝１８０個のペプチドが、完全な単一アミノ酸置換分析を実行するために必要とされる。３つの異なるペプチドリンカーのタイプ（ＰＥＧ８、６－アミノヘキサン酸、Ｇｌｙ：ＳＥＲ ４：１ミックス）および５つの異なるリンカーの長さ（リンカーの長さは、各リンカーモノマーの合成サイクルの数１／２／３／４／５として定義される）も含める。全てのペプチドを、５反復で、各リンカーのタイプおよび長さで試験する。
【0167】
セット１および２の最適化のもとでの変数
【0168】
[0185]
【表5】
【0169】
[0186]セット１および２の両方について、ｐＭＨＣ複合体が表面上で上手く形成された。
【0170】
[0187]セット１に関して、ｐＣｙ５で標識した抗体Ｗ６／３２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、表面に加え、任意の適切に会合したｐＭＨＣ複合体に結合させた。図１の上部パネルで、各ピークは、別個のｐＭＨＣ複合体である。一部の複合体は文献で報告されているが、他の複合体は報告されていない。ほとんどの複合体が、２番目の位置にロイシンを有する（位置２および８はアンカー位置と考えられる）。図１（下部パネル）は、ＨＬＡαサブユニットのみ（「ｂ２ｍ」またはβサブユニットなし）の陰性対照である。
【0171】
実施例３：免疫優性ペプチドの同定およびＮｅｔＭＨＣ３．４との比較
[0188]本開示の組成物および方法は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性であろうこれらのペプチドを同定するために使用することができる。本開示の組成物は、少なくとも１０６個の特有のペプチドを、表面に同時に含むことができるので、目的の任意の抗原を、例えば、表面上のＭＨＣＩ複合体に結合した９アミノ酸配列の全ての順列で提示することができる。単一の高度多重化実験では、完全かつ適切に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体を特異的に認識する任意の抗体を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで提示され得るペプチドが容易に同定される。同じ実験で、１つまたは複数のＴ細胞を表面に導入して、適切に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体に含まれるペプチドのどれが１つまたは複数のＴ細胞を刺激するかを決定することができる。いずれも少なくとも１０６個の特有のペプチドについて単一の実験で決定することができる、これらの２つの基準（ペプチドが適切なペプチド－ＭＨＣ複合体を形成するかおよびＴ細胞を刺激するかの基準）のみに基づいて、本開示の組成物および方法は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示される場合に免疫優性であろうこれらのペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで同定するための優れた手段を提供する。
[0188]本開示の組成物および方法は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるとき免疫優性であろうこれらのペプチドを同定するために使用することができる。本開示の組成物は、少なくとも１０６個の特有のペプチドを、表面に同時に含むことができるので、目的の任意の抗原を、例えば、表面上のＭＨＣＩ複合体に結合した９アミノ酸配列の全ての順列で提示することができる。単一の高度多重化実験では、完全かつ適切に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体を特異的に認識する任意の抗体を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで提示され得るペプチドが容易に同定される。同じ実験で、１つまたは複数のＴ細胞を表面に導入して、適切に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体に含まれるペプチドのどれが１つまたは複数のＴ細胞を刺激するかを決定することができる。いずれも少なくとも１０６個の特有のペプチドについて単一の実験で決定することができる、これらの２つの基準（ペプチドが適切なペプチド－ＭＨＣ複合体を形成するかおよびＴ細胞を刺激するかの基準）のみに基づいて、本開示の組成物および方法は、ＭＨＣによってｉｎ ｖｉｖｏで提示される場合に免疫優性であろうこれらのペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで同定するための優れた手段を提供する。
【0172】
[0189]本開示の組成物および方法の能力を、免疫優性ペプチドを予測するための現行の業界標準方法であるコンピュータアルゴリズムＮｅｔＭＨＣ３．４の能力と比較した。
【0173】
[0190]図２は、それぞれ９アミノ酸長であり、それぞれがＷＴ１タンパク質の野生型配列に沿った特有の配列を有し、本開示の表面上のＭＨＣＩに結合し、標識抗体によって検出されるときのそのシグナル強度、またはＮｅｔＭＨＣ３．４によって評価されるその予測される結合親和性に基づいて象限に組織化される複数のＷＴ１ペプチドを示すプロットを提供する。完全に会合したＭＨＣＩ複合体を特異的に認識する任意の抗体を、ＭＨＣＩによってｉｎ ｖｉｖｏで提示されるであろうそれらのペプチドを同定するために使用することができる。
【0174】
[0191]プロットされた４４０種のペプチドのうち、ＮｅｔＭＨＣ３．４により、４３３種のペプチドは親和性が低すぎてＭＨＣＩと結合できないと同定され、対照的に、７つのみのペプチドが、ＭＨＣＩに結合する理論的能力を有するとして同定された。際立って対照的に、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣ３．４アルゴリズムが破棄するであろう１３種のペプチド（右上の象限）を含む、ＭＨＣＩに実際に結合する１８種のペプチドを同定した。
【0175】
[0192]図３は、左上の象限を強調している。左上の象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で結合するとアルゴリズムによって予測されるであろう、本開示の組成物および方法にしたがって実証されるＭＨＣＩへの結合能力を有するペプチドを表す。特に興味深いのは、本明細書でＷＴ１ペプチド１２６として参照される、強調されたペプチドである。
【0176】
[0193]図４は、右上の象限を強調している。右上の象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で論理的に結合できないとアルゴリズムによって破棄されるであろう、本開示の組成物および方法にしたがって実証されるＭＨＣＩへの結合能力を有するペプチドを表す。換言すれば、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣプログラムのみを使用して分析するとき偽陰性であろう、１３種のペプチドを経験的に検証した。
【0177】
[0194]図５は、左下の象限を強調している。左下の象限は、免疫優性ペプチドを同定する現行の業界標準方法ＮｅｔＭＨＣを使用して分析するときＭＨＣＩに十分な親和性で結合すると予測されるであろうが、本開示の組成物および方法を使用して試験するとき、完全に会合したペプチド－ＭＨＣＩ複合体を形成しないと経験的に示されるペプチドを表す。換言すれば、本開示の組成物および方法は、ＮｅｔＭＨＣプログラムのみを使用して分析するとき偽陽性であろう２つのペプチドを経験的に同定した。
【0178】
[0195]ＭＨＣ成分は多様であり、ＭＨＣと複合体を形成するペプチドについてほぼ無限の考えられる配列があるため、ＥＲの環境を再現することができ、ＭＨＣのどの成分が利用可能なペプチドの広大なアレイと複合体を形成することができるか、その後ペプチド－ＭＨＣ複合体のいずれが免疫系（例えば、Ｔ細胞）を刺激することができるかを経験的に迅速に決定することができる、高度に多重化されたシステムについて、長く切望され、満たされていない必要性がある。
【0179】
[0196]この複合体システムについてコンピュータモデリングは不十分である。その理由は、本開示に示されるように、実際に形成される多くのペプチド－ＭＨＣ複合体が、既存のアルゴリズムの使用では会合すると予測されないからである。逆に、会合すると予測されるペプチド－ＭＨＣ複合体の一部は、本開示で示される試験によって、不安定な複合体を形成すると示された。
【0180】
[0197]本開示の高度に多重化された経験ベースの方法の能力をさらに実証するために、図７および図８は、ＥＳＫ１が様々な親和性で結合することができる「ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ」（配列番号７）バリアントの配列分析を提供する。表面上のペプチドのアレイは空間的に順序付けられるので、あらゆるペプチドの配列がすぐに分かる。９つのアミノ酸ペプチドのそれぞれのアミノ酸を、可能性のある２０種のアミノ酸のそれぞれに置換して、適切なペプチド－ＭＨＣＩ複合体を形成するために必須である、このペプチド内のアミノ酸の位置を同定した。図８は、２０種のアミノ酸全てを、１列で、アミノ酸１文字コードによって、特徴によってグループ分けして示す：ＡＦＩＬＭＶＷＰＧＳＹＣＱＴＮＲＫＨＤＥ。アミノ酸Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＰは、非極性アミノ酸である。アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｎは、極性アミノ酸である。アミノ酸Ｒ、ＫおよびＨは、塩基性アミノ酸である。アミノ酸ＤおよびＥは、酸性アミノ酸である。
【0181】
実施例４：負に荷電されたモノマーを有するリンカー
[0198]先に、いくつかのリンカーを、会合体の表面上の最適化されたペプチド－ＭＨＣ会合体に対するアレイ表面へのペプチドの結合について評価した。その試験から、３～５個のＨＥＸ部分（各部分が６アミノヘキサン酸を含む）からなるリンカーが、ＨＬＡ特異的抗体でのｐＭＨＣ複合体検出後の最も高いシグナルおよび低バックグラウンドの基準に基づいて好ましいリンカーとして選択された。
[0198]先に、いくつかのリンカーを、会合体の表面上の最適化されたペプチド－ＭＨＣ会合体に対するアレイ表面へのペプチドの結合について評価した。その試験から、３～５個のＨＥＸ部分（各部分が６アミノヘキサン酸を含む）からなるリンカーが、ＨＬＡ特異的抗体でのｐＭＨＣ複合体検出後の最も高いシグナルおよび低バックグラウンドの基準に基づいて好ましいリンカーとして選択された。
【0182】
[0199]継続試験は、強力なＨＬＡ２結合剤であるだけでなく、強力な免疫原性効果を有する、生物学的に関連するペプチドであると十分に特徴づけられたＨＬＡ２特異的ペプチドを用いたアレイ実験を含んだ。正の「黄金基準」対照としてこれらのペプチドの１５種を使用するとき、これらのペプチドの７種のみが、好ましいＨＥＸリンカーを使用して、本開示の表面上でｐＭＨＣ複合体の形成を示すと分かった。
【0183】
[0200]ｐＭＨＣ形成に対する対照ペプチドの各位置での２０種のアミノ酸全ておよび欠失の効果を示す置換プロットの分析は、７つのＨＬＡ２結合ペプチドの一部に対する複数の位置での負に荷電されたアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）の嗜好性を明らかにした。理論に縛られることを望まないが、表面は過剰の正電荷を有することができ、ペプチド上の好ましい負の電荷は、電荷代償的役割を果たし得る。
【0184】
[0201]電荷の効果を調べるために、負電荷および正電荷の両方を有する下記に列挙される様々なリンカーを本開示の組成物に導入した：
１．表面－５ＨＥＸ－ペプチド
２．表面－ＨＥＸ－Ｅ－３ＨＥＸ－ペプチド
３．表面－ＨＥＸ－Ｄ－３ＨＥＸ－ペプチド
４．表面－ＨＥＸ－Ｋ－３ＨＥＸ－ペプチド
５．表面－２ＨＥＸ－Ｅ－ＨＥＸ－ペプチド
６．表面－３ＨＥＸ－ＧｌｕＢ－ペプチド（ＧｌｕＢ＝側鎖を介して連結されたｔ－ブチル保護グルタミン酸）
１．表面－５ＨＥＸ－ペプチド
２．表面－ＨＥＸ－Ｅ－３ＨＥＸ－ペプチド
３．表面－ＨＥＸ－Ｄ－３ＨＥＸ－ペプチド
４．表面－ＨＥＸ－Ｋ－３ＨＥＸ－ペプチド
５．表面－２ＨＥＸ－Ｅ－ＨＥＸ－ペプチド
６．表面－３ＨＥＸ－ＧｌｕＢ－ペプチド（ＧｌｕＢ＝側鎖を介して連結されたｔ－ブチル保護グルタミン酸）
【0185】
[0202]リンカー１は、５ヘキサン（ＨＥＸ）部分を含有する。リンカー２～４は、３つのＨＥＸ部分によってペプチドからそれぞれ分離された負に荷電されたグルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）部分または正に荷電されたリジン（Ｋ）を有する。リンカー５は、リンカー２に類似するが、Ｅとペプチドとの間にＨＥＸを１つのみ有する。リンカー６は、負の電荷を有する遊離カルボキシル基を有するアミノ酸アナログＧｌｕＢの側鎖に接続された３つのＨＥＸ部分を有する別の負に荷電したリンカーである。
【0186】
[0203]１５種の対照ペプチドについてのペプチド－ＭＨＣ会合体形成の分析は、ＨＥＸのみのリンカーで検出される７種のペプチドと比較して、１１種のペプチドの検出を可能にする負に荷電されたリンカーが結合したペプチドの改善された結合を示した。この改善は、ＧｌｕＢアミノ酸を有するリンカー６についてはあまり顕著でなかった。対照的に、正に荷電されたリンカー４の使用は、検出可能なペプチドの数を７から５に減少させた。
【0187】
[0204]図１０Ａおよび１０Ｂは、この例ではアスパラギン酸（Ｄ）である少なくとも１つの負に荷電されたモノマーを組み込むリンカーが使用されるとき、ペプチド－ＭＨＣ会合体から観察される増加したシグナル強度を示す。図１０Ｂで試験されたリンカーは、上記リンカー３に相当する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】