特許 7219705 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-01-31

(45)【発行日】2023-02-08

(54)【発明の名称】ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230201BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230201BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230201BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230201BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230201BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230201BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230201BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230201BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230201BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/137 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/428 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/4152 20060101ALI20230201BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20230201BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/705

C12N15/12

C12N15/13

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N15/85 Z

A61K38/43

A61K38/17

A61K45/00

A61P21/04

A61P21/00

A61P35/00

A61P11/00

A61P11/06

A61P29/00

A61P13/12

A61P37/06

A61P17/00

A61P9/00

A61P1/16

A61P3/00

A61P7/00

A61P1/04

A61P1/18

A61P3/10

A61P3/04

A61P3/06

A61P9/12

A61P9/10

A61P9/10 101

A61P9/10 103

A61P9/04

A61P19/06

A61P15/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P19/00

A61P13/02

A61P35/02

A61P31/04

A61K31/7088

A61K31/573

A61K31/137

A61K31/428

A61K31/4152

A61K31/496

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2019518299

(86)(22)【出願日】2017-10-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-12-19

(86)【国際出願番号】 US2017055426

(87)【国際公開番号】W WO2018067879

(87)【国際公開日】2018-04-12

【審査請求日】2020-10-02

(31)【優先権主張番号】62/510,417

(32)【優先日】2017-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/404,727

(32)【優先日】2016-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509125475

【氏名又は名称】アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クマール， ラビンドラ

(72)【発明者】

【氏名】グリンバーグ， アシャ

(72)【発明者】

【氏名】サコ， ダイアン エス．

(72)【発明者】

【氏名】カストンギー， ロズリーヌ

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５１８００９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－０３７４８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５００００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Caterina Bianco et al.，Cripto-1 Activates Nodal- and ALK4-Dependent and -Independent Signaling Pathways in Mammary Epithelial Cells，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2002年，Vol. 22、No.8，pp. 2586-2597

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
（ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、
（１）配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインと、
（２）ＩｇＧ１ ＦｃドメインであるＦｃドメインと
を含み、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１の位置Ｎ１６２におけるアルギニン置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１の位置Ｄ１７９におけるアルギニン置換（Ｄ１７９Ｒ）を含み、前記アミノ酸置換が、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させ、かつ
（ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、
（１）配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインと、
（２）ＩｇＧ１ ＦｃドメインであるＦｃドメインと
を含み、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１のＫ１３８位におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＤまたはＫ１３８Ｅ）、および／または配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＤまたはＫ２１７Ｅ）を含み、アミノ酸の前記置換が、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項2】

前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１の位置Ｋ１３８におけるグルタミン酸置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１の位置Ｋ２１７におけるアスパラギン酸置換（Ｋ２１７Ｄ）を含む、請求項１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項3】

アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドによるシグナル伝達を阻害する、請求項１または２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。

【請求項4】

ＢＭＰ９のシグナル伝達を持続的に阻害しない、請求項１から３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。

【請求項5】

対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して強いアクチビンＢの阻害剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。

【請求項6】

前記リガンドシグナル伝達が、細胞に基づくアッセイにおいて測定される、請求項３から５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。

【請求項7】

ヘテロ二量体である、請求項１から６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。

【請求項8】

前記１つまたは複数のアミノ酸修飾が、ｐＩを少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０変化させる、請求項１から７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体またはＦｃ融合タンパク質。

【請求項9】

ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与されるか、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与されるか、または
ｃ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与され、かつ前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与される、請求項１～８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬調製物。

【請求項11】

請求項１から９のいずれか一項に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む、組換え核酸。

【請求項12】

請求項１から９のいずれか一項に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む、組換え核酸。

【請求項13】

１）請求項１１に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列、および／または
２）請求項１２に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列
を含む、組換えポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項15】

請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載のベクターによって形質転換された細胞。

【請求項16】

ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製す
る方法であって、
１）ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップであって、前記細胞が、請求項１１に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項１２に記載の組換えポリヌクレオチドを含むか、もしくは前記細胞が、請求項１３に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップ、または
２）ａ）第１の細胞をＡＬＫ４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第１の細胞が、請求項１１に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと；
ｂ）そのように発現したＡＬＫ４ポリペプチドを回収するステップと；
ｃ）第２の細胞をＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第２の細胞が、請求項１２に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと；
ｄ）そのように発現したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップと；
ｅ）前記回収したＡＬＫ４ポリペプチドと前記回収したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとをＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成に適した条件下で組み合わせるステップと
を含む、方法。

【請求項17】

少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項18】

前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項19】

前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３８のリーダー配列を含むか、または前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３８のリーダー配列を含む、請求項１７に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項20】

前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項21】

前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。

【請求項22】

筋肉喪失または不十分な筋肉の成長に関連する障害の処置を必要とする患者において、筋肉喪失または不十分な筋肉の成長に関連する障害を有する患者を処置するための医薬の製造における、請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の使用。

【請求項23】

前記患者が筋萎縮または筋ジストロフィーを有する、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

前記患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを有する、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

線維症または線維症に関連する障害もしくは状態の処置を必要する患者において、線維症または線維症に関連する障害もしくは状態を処置するための医薬の製造における請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の使用。

【請求項26】

前記線維症に関連する障害または状態が、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、ペイロニー病、肝線維症、ウィルソン病、グリコーゲン蓄積症（特に、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＩＸ型、およびＸ型）、鉄過剰症、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性の脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症、後腹膜線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、膵線維症から選択される、請求項２５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互作用
本出願は、２０１６年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／４０４，７２７号および２０１７年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／５１０，４１７号からの優先権の利益を主張する。前記出願の明細書は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
形質転換増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物どちらにおいても多種多様な細胞型に対して生物学的効果を発揮することが公知である。当該スーパーファミリーのメンバーは、胚発生中にパターン形成および組織特定化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含めた種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。当該ファミリーは、２つの一般的な系統学的クレード：ＴＧＦ－ベータ、アクチビン、およびノーダルを含む、つい最近進化したスーパーファミリーのメンバー、ならびに、いくつものＢＭＰおよびＧＤＦを含む、当該スーパーファミリーの、関連性がより遠いタンパク質のクレードに分類される［Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。ＴＧＦ－ベータファミリーメンバーは、多様な、多くの場合に相補的である生物学的効果を有する。ＴＧＦ－ベータファミリーのメンバーの活性を操作することにより、多くの場合、生物体において有意な生理的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ピエモンテおよびベルジャンブルーウシ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも称される）遺伝子に、筋肉量の顕著な増加を引き起こす機能喪失型突然変異を有する［Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（１号）：７１～４頁］。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子が筋肉量の増加、および報告によれば、例外的な強度に関連付けられている［Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁］。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁

【文献】Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（１号）：７１～４頁

【文献】Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

線維症、筋肉、骨、脂肪、および他の組織における変化は、ＴＧＦ－ベータファミリーのリガンドによって媒介される細胞内シグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５、および／または８）を増強または阻害することによって実現することができる。したがって、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの種々のリガンドの活性を制御する作用剤が必要とされている。
本明細書に記載される通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体タンパク質は、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドの優れたアンタゴニストであり、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４のホモ二量体と比較して、異なるリガンド結合プロファイル／選択性を示すことが発見されている。特に、例示的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体について観察されるように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。実際、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ９に対する低いか、または観察不可能な親和性を示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。図４を参照されたい。したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｒＲＩＩＢホモ二量体と比較して、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの特定のリガンドのより選択的なアンタゴニスト（阻害剤）であることを示している。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりも有用である。例としては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数を、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３のうちの１つまたは複数の拮抗作用を低下させて拮抗することが望ましい治療適用が挙げられる。

【0005】

さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、２つの複合体の異なるリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体のものと著しく類似した特定の生物学的効果をもたらした。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のものと非常に類似する、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果を発揮する。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と違って、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する低親和性のみ、または一過的な結合を示し、したがって、血管新生などの、これらのリガンドによって媒介されるプロセスをほとんどまたは全く、同時に阻害しない。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激効果、ならびに／または脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更を必要としない患者の処置において有用であり得る。さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、腎臓疾患のマウスモデルにおいて、特に腎損傷、炎症、および線維症の処置または予防に対して、種々の有益な効果を及ぼした。したがって、特定の作用機序に拘束されることを望まないが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１の少なくとも１つまたは複数に結合／阻害するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、およびそのバリアントが、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、脂肪組織に対する異化効果、ならびに腎臓疾患に対する有益な効果を促進するための有用な薬剤となることが予想される。

【0006】

したがって、本開示は部分的に、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）に関する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４受容体のリガンド結合ドメイン、例えばＡＬＫ４細胞外ドメインの一部を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合ドメイン、例えばＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部を一般に含む。好ましくは、そのようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチド、ならびにその結果得られるヘテロ多量体は可溶性である。好ましくは、そのようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチド、ならびにその結果得られるヘテロ多量体は組換えタンパク質である。好ましくは、そのようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチド、ならびにその結果得られるヘテロ多量体は単離されたタンパク質である。

【0007】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸２４～３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）で始まり、配列番号９のアミノ酸１０１～１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）で終わる、ポリペプチドと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸２４～１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４のアミノ酸配列を含み得る。

【0008】

他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１９のアミノ酸２４～３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）で始まり、配列番号１９のアミノ酸１０１～１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）で終わる、ポリペプチドと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１９のアミノ酸２４～１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４のアミノ酸配列を含み得る。

【0009】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０～２９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）で始まり、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４のいずれか１つ（１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および１３４）で終わる、ポリペプチドと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸ＥもしくはＤ、または人工の酸性アミノ酸）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。

【0010】

他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４のアミノ酸２０～２９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）で始まり、配列番号４のアミノ酸１０９～１３４のいずれか１つ（１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および１３４）で終わる、ポリペプチドと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸ＥもしくはＤ、または人工の酸性アミノ酸）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。

【0011】

本明細書に記載される通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の構造は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、およびより高次のヘテロ多量体複合体を含む。例えば、図６を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はヘテロ二量体である。

【0012】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡＬＫ４）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質（例えば、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質）であり得る。同様に、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質）であり得る。

【0013】

一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。同様に、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。従来のＦｃ融合タンパク質および抗体は無誘導相互作用対の例であり、一方で種々の工学的に作製されたＦｃドメインは非対称相互作用対として設計されている［Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］。したがって、本明細書に記載の相互作用対の第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含めた免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、相互作用対の第１のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭの免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する、１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。同様に、相互作用対の第２のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用対の第２のメンバーは、配列番号２３～３７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。一部の実施形態では、相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、同じ免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。他の実施形態では、相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンのクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。

【0014】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含むＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシル末端アミノ酸異種性、リン酸化、およびグリコシル化）を含み、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与される。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与される。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与され、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与される。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異は少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０であるまたはそれよりも大きい）。

【0015】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む。例えば、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３２のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；ｂ


）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

【0016】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と、ＡＬＫ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質とを含む。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＤ１８３位におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸また


はグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３１ Ｆｃドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

【0017】

本明細書に記載される通り、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ多量体形成（例えば、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体化）を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み得る。同様に、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ多量体形成（例えば、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体化）を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み得、ホモ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ３ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ３ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を含む。

【0018】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質；およびｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７の１４６に対応する位置のアラニン、および配列番号６７の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。

【0019】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、Ｆｃドメインを有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質；およびｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、Ｆｃドメインを有するＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７の１４６に対応する位置のアラニン、および配列番号６７の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。

【0020】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0021】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0022】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0023】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0024】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0025】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0026】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0027】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0028】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0029】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み；ｂ）ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。

【0030】

任意選択で、ＡＬＫ４ポリペプチドは、１つもしくは複数の異種ドメインと直接接続（融合）している、またはリンカーなどの介在配列が、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列と１つもしくは複数の異種ドメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃドメイン）の間に位置していてよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つもしくは複数の異種ドメインと直接接続（融合）していてもよく、またはリンカーなどの介在配列が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列と１つもしくは複数の異種ドメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃドメイン）の間に位置していてもよい。リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４の細胞外ドメインのＣ末端（「尾部」）におけるおよそ１５アミノ酸の構造化されていない領域に対応するものであってもよく、または二次構造が比較的自由な５アミノ酸から１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸もしくはそれよりも多くのアミノ酸の間の人工的な配列であってもよい。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基に富むものであってよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含有するものであってよい。リンカーの例としては、これだけに限定されないが、配列ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、およびＧＧＧ（配列番号１３）が挙げられる。

【0031】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、ａ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン；ｂ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７６のＤ２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン（Ｙ２９２Ｖ）、および配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２位のバリン、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、ａ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、および配列番号７２の２６２位のトリプトファン；ｂ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、Ｒ、Ｋ、もしくはＨ）アミノ酸である。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基はＲである。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、ＤもしくはＥ）アミノ酸である。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＤである。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＥである。

【0032】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン；ｂ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２位のバリン、および配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、Ｒ、Ｋ、またはＨ）アミノ酸である。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基はＲである。

【0033】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ａ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、および配列番号７２の２６２に対応する位置のトリプトファン；ｂ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、ＤまたはＥ）アミノ酸である。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＤである。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＥである。

【0034】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、および配列番号７４の３１６位のバリン；ｂ）配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６位のバリン、および配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６に対応する位置のバリン、および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸；ｇ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６に対応する位置のバリン、配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、Ｒ、Ｋ、またはＨ）アミノ酸である。一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基はＲである。

【0035】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、および配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン；ｂ）配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｃ）配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｄ）配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｅ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、および配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸；ｆ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基は、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、ＤまたはＥ）アミノ酸である。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＤである。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸残基はＥである。

【0036】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号４８の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号４８の２５１に対応する位置のセリン、配列番号４８の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号４８の２９２位のバリンを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号８０の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号８０の２６２に対応する位置のトリプトファン、および配列番号８０の３３１に対応する位置のアルギニンを含む。

【0037】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号４８の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号４８の２５１に対応する位置のセリン、配列番号４８の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号４８の２９２位のバリンを含む。

【0038】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号８０の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号８０の２６２に対応する位置のトリプトファン、配列番号８０の３３１に対応する位置のアルギニンを含む。

【0039】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号４７の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号４７の２７５に対応する位置のセリン、配列番号４７の２７７に対応する位置のアラニン、および配列番号４７の３１６位のバリンを含む。

【0040】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号７８の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７８の２８７に対応する位置のトリプトファン、配列番号７８の３５６に対応する位置のアルギニンを含む。

【0041】

ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８のリーダー配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８のリーダー配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。

【0042】

任意選択で、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸、および有機誘導体化剤とコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、少なくとも１つのＮ連結糖を含み得、２つ、３つまたはそれよりも多いＮ連結糖を含み得る。そのようなポリペプチドはまた、Ｏ連結糖も含み得る。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、工学的に作製された昆虫または酵母の細胞、ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む、患者の使用に適した方法でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞系において産生し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から入手可能なグリコシル化パターンを有する。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも４時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間の血清中半減期を示すことが好ましい。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも６日、８日、１０日、１２日、１４日、２０日、２５日、または３０日の血清中半減期を示し得る。

【0043】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドに結合する。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、これらのリガンドの１つまたは複数に、１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、または１０^－１２Ｍ未満か、またはそれと同等のＫ_Ｄで結合する。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＥに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１０^－８または１０^－７より大きいか、またはそれと同等のＫ_Ｄで結合する）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して強い親和性でアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ９に結合する。

【0044】

一般に、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、少なくとも１つのＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドの１つまたは複数の活性に拮抗し（を阻害し）、そのような活性の変更は、例えば、本明細書に記載の細胞に基づくアッセイを含めた、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、細胞に基づくアッセイにおいて、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドによって媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）を阻害するのに使用され得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＡＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＣのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＡＣのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＢＣのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＥのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＡＥのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＣＥのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＧＤＦ１１のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＧＤＦ８のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＢＭＰ６のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＧＤＦ３のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＢＭＰ１０のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＢＭＰ９のシグナル伝達を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビンＢのシグナル伝達のより強い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＧＤＦ３のシグナル伝達のより弱い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＢＭＰ１０のシグナル伝達のより弱い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＢＭＰ９のシグナル伝達のより弱い阻害剤である。

【0045】

本明細書に記載されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のうちのいずれも、医薬調製物（組成物）として製剤化し得る。一部の実施形態では、医薬調製物は薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、医薬調製物は、パイロジェンフリーである（治療使用の製品の品質を管理する規制によって要求される範囲でパイロジェンフリーであることを意味する）。医薬調製物はまた、本明細書に記載される障害／状態を処置するのに使用される化合物のような１つまたは複数の追加の化合物を含み得る。一般に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体および約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。

【0046】

ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸を提供する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７の７３～３９６の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸を含み得るか、または、ストリンジェントな条件下で配列番号７のヌクレオチド７３～３９６の相補体とハイブリダイズするものを含み得る。そのような核酸は、配列番号８の配列を含むものであり得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0047】

ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸を提供する。例えば、ＡＬＫ４核酸は、配列番号１１の７０～３７８の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸を含み得るか、それらから本質的になり得るか、もしくはそれらからなり得、または、ストリンジェントな条件下で配列番号１１のヌクレオチド７０～３７８の相補体とハイブリダイズするものを含み得るか、それらから本質的になり得るか、もしくはそれらからなり得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４核酸は、配列番号７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４核酸は、配列番号７７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４核酸は、配列番号８２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４核酸は、配列番号８３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0048】

ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む核酸配列を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示の核酸は、ａ）配列番号７１、７３、７９、および７７のいずれか１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｂ）配列番号７５、７７、８２、および８３のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0049】

好ましくは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢの核酸は、単離されたおよび／または組換え核酸である。本明細書に開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得る。本開示は、そのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにそのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリヌクレオチドならびにそのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、好ましくはヒトまたは他の脊椎動物種から単離された細胞を、さらに提供する。

【0050】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、哺乳動物細胞系、任意選択でＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４タンパク質の適切な天然のグリコシル化を媒介して、患者（獣医学の患者の可能性を含む）における望ましくない免疫応答の可能性を減退する細胞系において発現し得る。ヒトおよびＣＨＯ細胞系が成功裏に使用されてきたが、他の一般的な哺乳動物発現ベクターも有用であろうことが予想される。したがって、本開示は、本明細書に開示される核酸のいずれかを含む培養細胞を提供する。そのような細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞であり得る。意図した患者の種に応じて、他の細胞も選択し得る。他の細胞は本明細書に開示されている。培養細胞は、実験室または他の人工的な環境（例えば、凍結または培地中）において維持され、生存生物の一部ではない細胞を意味すると理解される。

【0051】

ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドのいずれかならびにそのようなポリヌクレオチドを含むＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体を作製する方法を提供する。そのような方法は、本明細書に開示される核酸のいずれかを適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において発現させるステップを含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下でＡＬＫ４ポリヌクレオチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含む細胞を培養するステップと、任意選択でそのように発現したヘテロ多量体を回収するステップとを含む。代替的に、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法は、ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドの発現に適した条件下でＡＬＫ４ポリヌクレオチドを含む第１の細胞を培養するステップと；ｂ）そのように発現したＡＬＫ４ポリペプチドを回収するステップと；ｃ）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下でＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含む第２の細胞を培養するステップと；ｄ）そのように発現したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップと；ｅ）回収したＡＬＫ４ポリペプチドと回収したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとをＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成に適した条件下で組み合わせるステップと；任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を回収するステップとを含み得る。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、ＴＰＡリーダー配列（例えば、配列番号３８）を使用して発現する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドは、ＣＨＯ細胞で発現する。本明細書に記載されるＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチド、ならびにそのタンパク質複合体は、細胞培養物からタンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用し、粗製物、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収することができる。一般に、そのような方法は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まないＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をもたらす。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を産生する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体をもたらす。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を産生する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体をもたらす。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を産生する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体および約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体をもたらす。

【0052】

本開示は、例えば、筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織に関連する種々のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢに関連する疾患および状態の処置または予防において使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をさらに提供する。そのような疾患および障害としては、これだけに限定されないが、筋肉喪失または不十分な筋肉の成長（例えば、筋萎縮；デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを含めた筋ジストロフィー；筋萎縮性側索硬化症；孤発性封入体筋炎、遺伝性封入体筋炎、および悪液質）に関連する障害、ならびに望ましくない体重増加に関連する障害（例えば、肥満症、２型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、高血圧症、変形性関節症、脳卒中、呼吸障害、および胆嚢疾患）が挙げられる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、それを必要とする対象において体脂肪含有量を減少させるまたは体脂肪含有量の増加率を低下させるために使用することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、患者におけるコレステロールおよび／またはトリグリセリドレベルを低下させるために使用することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、線維症または線維症に関連する障害もしくは状態（例えば、腎不全、慢性腎疾患、嚢胞性線維症、および骨髄線維症）を処置または予防するのに使用され得る。

【0053】

本開示は、例えば、腎臓に関連する種々のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢに関連する疾患および状態の処置または予防における使用のための、方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をさらに提供する。そのような疾患または状態には、例えば、慢性腎臓疾患または腎臓不全、急性腎臓疾患または腎臓不全、ステージ１の腎臓疾患を有する患者、ステージ２の腎臓疾患を有する患者、ステージ３の腎臓疾患を有する患者、ステージ４の腎臓疾患を有する患者、ステージ５の腎臓疾患を有する患者、非糖尿病性腎臓疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化群、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人）多発性嚢胞腎臓疾患、常染色体劣性（小児）多発性嚢胞腎臓疾患、急性腎臓障害、ネフローゼ症候群、腎虚血、有足細胞疾患または障害、タンパク尿、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎臓病変、膠原病性脈管疾患、良性起立性（体位性）タンパク尿、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物による腎臓損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型グリコーゲン蓄積症、慢性腎臓疾患、慢性腎不全、低糸球体濾過量（ＧＦＲ）、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性の微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性同種移植腎症、腎毒性（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎毒性（ｒｅｎａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎臓壊死、腎臓損傷、糸球体および尿細管障害、腎臓機能障害、腎炎症候群、急性腎不全、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎臓移植拒絶反応、慢性腎臓移植拒絶反応、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後の糸球体腎炎、任意の種類の腎臓病変を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧、糖尿病、および自己免疫疾患）に関連する腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎臓疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、クリオグロブリン血症に関連する糸球体腎炎、ヘノッホ・シェーンライン病、感染後の糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体媒介性糸球体腎炎、アミロイドーシス、単クローン性免疫グロブリン沈着症、繊維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管障害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、中毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染症またはＨＩＶ感染症に起因するウイルス性感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合疾患、円柱腎症、尿酸塩、シュウ酸塩、または薬物誘導性の結晶沈着に起因し得る結晶性腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶反応、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患に起因する腫瘍浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管同種移植片拒絶反応、急性体液性同種移植片拒絶反応、早期腎機能低下（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、腎閉塞、急性間質性腎炎、既往慢性腎臓疾患、腎動脈狭窄、虚血性腎症、尿毒症、薬物および毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流性腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎臓疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル・リンドウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質嚢胞性腎臓疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流障害、腎異形成、高窒素血症、両側動脈閉塞、急性尿酸腎症、血液量減少症、急性両側閉塞性尿路疾患、高カルシウム血症性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿閉、悪性腎硬化症、産後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー病の抗ＧＢＭ疾患、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鎮痛薬腎症、動静脈瘻、動静脈グラフト、透析、異所性腎臓、海綿腎臓、腎性骨ジストロフィー、単腎症、水腎症、微量アルブミン尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂質尿、アシドーシス、ならびに高カリウム血症が含まれる。一部の実施形態では、本開示は、ステージ１からステージ２の腎臓疾患への、ステージ２からステージ３の腎臓疾患への、ステージ３からステージ４の腎臓疾患への、またはステージ４からステージ５の腎臓疾患への進行を遅延させるかまたは防止するのに使用するための、方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎炎を予防または低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎損傷を予防または低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎臓線維症を予防または低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をさらに提供する。

【0054】

ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載されるもののようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）を投与するステップを含む、肺動脈性肺高血圧症を処置する方法に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における心室肥大を減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における心室肥大を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における平滑筋肥大を減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における平滑筋肥大を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における肺細動脈の筋肉質を減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における肺細動脈の筋肉質を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における肺血管抵抗を減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における肺血管抵抗を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の投与は、患者における肺血管抵抗を少なくとも２５～３０％減少させる。一部の実施形態では、患者は肺動脈性肺高血圧症を有し、世界保健機関の肺高血圧症の機能分類システムに従って、機能クラスＩＩまたはクラスＩＩＩの肺高血圧症を有する。一部の実施形態では、患者は、特発性または遺伝性の肺動脈性肺高血圧症、薬物誘導および／または毒素誘導の肺高血圧症、結合組織疾患に関連する肺高血圧症、ならびにシャント手術後少なくとも１年間の先天性の体－肺シャントに関連する肺高血圧症からなる群から選択される１つまたは複数のサブタイプとして分類される肺動脈性肺高血圧症を有する。一部の実施形態では、患者は１つまたは複数の血管拡張薬で処置されている。一部の実施形態では、患者は、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤で処置されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の血管拡張薬の投与をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤の投与をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、１５０～４００メートルの６分間歩行距離を有する。一部の実施形態では、方法は、患者の６分間歩行距離を少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、または４００メートルを超えて）増加させる。一部の実施形態では、患者は、８ｇ／ｄｌより大きく、１５ｇ／ｄｌ未満のヘモグロビンレベルを有する。一部の実施形態では、方法は肺動脈性肺高血圧症の臨床的悪化を遅延させる。一部の実施形態では、方法は、世界保健機関の肺高血圧症の機能分類システムに従って、肺高血圧症の臨床的悪化を遅延させる。一部の実施形態では、方法は、肺動脈性肺高血圧症に関連する１つまたは複数の合併症による入院のリスクを低減する。

【0055】

一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症を処置する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症を予防する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の進行速度を低減する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、間質性肺疾患を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、間質性肺疾患の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法を提供する。一部の実施形態では、間質性肺疾患は特発性肺線維症である。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の重症度を低減する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大、および肺線維症）を処置する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大、および肺線維症）を予防する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大、および肺線維症）の進行速度を低減する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大、および肺線維症）の重症度を低減する方法に関する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺動脈性肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも２５ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍＨｇ）の安静時肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＰＡＰを低減する。例えば、方法は、肺高血圧症を有する患者において、ＰＡＰを少なくとも３ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも３、５、７、１０、１２、１５、２０、または２５ｍｍＨｇ）低減し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における肺血管抵抗を低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における肺動脈楔入圧を増加させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における左室拡張末期圧を増加させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における運動能力（能力、耐性）を増加（向上）させる。例えば、方法は、肺高血圧症を有する患者における６分間歩行距離を増加させ得、任意選択で少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれより多いメートル）、６分間歩行距離を増加させ得る。さらに、方法は、任意選択で６分間歩行試験の後に評定され得る、患者のボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を低減し得る。一部の実施形態では、方法は、患者のボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を、少なくとも０．５指数ポイント（例えば、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０指数ポイント）、低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、世界保健機関によって認識されているクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、またはクラスＩＶの肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺高血圧症の臨床的進行（悪化）（例えば、世界保健機関の規格によって測定される進行）を遅延させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症のクラス進行を防止または遅延させる（例えば、世界保健機関によって認識されるような、クラスＩからクラスＩＩ、クラスＩＩからクラスＩＩＩ、またはクラスＩＩＩからクラスＩＶへの肺高血圧症の進行を防止または遅延する）。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症のクラス後退を促進または増加させる（例えば、世界保健機関によって認識されるような、クラスＩＶからクラスＩＩＩ、クラスＩＩＩからクラスＩＩ、またはクラスＩＩからクラスＩへの肺高血圧症の後退を促進または増加させる）。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストに加えて、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の支持療法または活性剤がさらに投与される。例えば、患者にはまた、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、およびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタン、およびボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピン）；抗凝固薬（例、ワルファリン）；利尿薬；酸素療法；心房中隔切開術；肺血栓内膜摘除術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化剤（例えば、シナシグアットおよびリオシグアット）；ＡＳＫ－１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－デ］キニリン（ｑｕｉｎｉｌｉｎｅ）－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２，２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－オイック酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ａ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシルオレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ２）；メチル３，１１－ジオキソオレアン－１２－エン－２８－オレート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ_４－２；ベンジル３－デヒドロ－オキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノレート）、肺および／または心臓移植からなる群から選択される１つまたは複数の支持療法または活性剤がさらに投与され得る。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】図１は、囲みで示されるリガンドと直接接触する、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の合成分析に基づく、本明細書で推定される残基を有するヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号４９）とヒトＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号２）との細胞外ドメインのアラインメントを示す。

【0057】

【図2】図２は、その細胞内ドメインを含まない様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号５０～５５）、その細胞内ドメインを含まないヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号５６）、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質（配列番号５７）の複数の配列アラインメントを示す。

【0058】

【図3】図３は、Ｃｌｕｓｔａｌ ２．１を使用したヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの複数の配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は点線の下線で示される。二重下線は、非対称鎖対合を促進するためにＩｇＧ１ Ｆｃ中で工学的に作製された位置の例ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置を示す。

【0059】

【図4】図４は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較した、比較ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。各タンパク質複合体について、リガンドは、リガンドシグナル伝達阻害と良好に相関する速度定数ｋ_ｏｆｆによって順位付けられ、結合親和性の降順に列挙される（最も強固に結合したリガンドは上に列挙される）。左の黄色、赤色、緑色、および青色の線は、解離速度定数の規模を示す。黒色の実線は、ヘテロ二量体に対する結合がホモ二量体と比較して増強しているか、または変化していないリガンドを示すが、赤色の破線は、ホモ二量体と比較して実質的に減少した結合を示す。示されるように、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体について観察されるようにアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対する中間レベルの結合を保持する。

【0060】

【図5】図５は、様々な脊椎動物種に由来するＡＬＫ４細胞外ドメインの複数の配列アラインメントを示す（配列番号５９～６５）。

【0061】

【図6-1】図６Ａ～６Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。

【図6-2】図６Ａ～６Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。

【図6-3】図６Ａ～６Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。

【図6-4】図６Ａ～６Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。

【0062】

例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチド（左から右へ）は、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。好適な相互作用対は、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、短縮、および本明細書に記載されるものなどのそのバリアント［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］を含んでいた。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に配置することができる。相互作用対の第１および第２のメンバーは無誘導であってよく、これは、対のメンバーが互いに会合するか、または実質的な優先性なしに自己会合してよく、それらが同じまたは異なるアミノ酸配列を有してよいことを意味する。図６Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導（非対称）対であってよく、これは、対のメンバーが自己会合ではなく互いに優先的に会合することを意味する。図６Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図６Ｃおよび６Ｄを参照されたい。

【0063】

【図7】図７は、本明細書に記載されるＡ－２０４ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙによって決定された、比較ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体／ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のＩＣ_５０データを示す。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体と同様、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかしながら、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路の阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体と比較して大幅に低下している。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。

【0064】

【図8-1】図８Ａ～８Ｃは、片側尿管結紮（ＵＵＯ）に供したマウス腎臓に由来する線維性遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症性遺伝子（ＴＮＦ－アルファ、およびＭＣＰ１）、サイトカイン遺伝子（ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、およびアクチビンＡ）、腎臓障害遺伝子（ＮＧＡＬ）、低酸素症誘導因子１－アルファ（ＨＩＦ１ａ）、およびアクチビンＡ受容体（Ａｃｖｒ２Ａ）の遺伝子発現プロファイルを示す。反対側の非手術腎臓に由来する試料を、対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。遺伝子発現プロファイルを、術後１７日で得た。マウスに、ＰＢＳまたはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれかを、術後３、７、１０、および１４日目に投与した。（＄）は、ＡＬＫ７－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体を投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓と比較した、ＰＢＳのみを投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓間の統計的差異を示す。（＠）は、転写物が検出されなかったことを示す。

【図8-2】図８Ａ～８Ｃは、片側尿管結紮（ＵＵＯ）に供したマウス腎臓に由来する線維性遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症性遺伝子（ＴＮＦ－アルファ、およびＭＣＰ１）、サイトカイン遺伝子（ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、およびアクチビンＡ）、腎臓障害遺伝子（ＮＧＡＬ）、低酸素症誘導因子１－アルファ（ＨＩＦ１ａ）、およびアクチビンＡ受容体（Ａｃｖｒ２Ａ）の遺伝子発現プロファイルを示す。反対側の非手術腎臓に由来する試料を、対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。遺伝子発現プロファイルを、術後１７日で得た。マウスに、ＰＢＳまたはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれかを、術後３、７、１０、および１４日目に投与した。（＄）は、ＡＬＫ７－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体を投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓と比較した、ＰＢＳのみを投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓間の統計的差異を示す。（＠）は、転写物が検出されなかったことを示す。

【図8-3】図８Ａ～８Ｃは、片側尿管結紮（ＵＵＯ）に供したマウス腎臓に由来する線維性遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症性遺伝子（ＴＮＦ－アルファ、およびＭＣＰ１）、サイトカイン遺伝子（ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、およびアクチビンＡ）、腎臓障害遺伝子（ＮＧＡＬ）、低酸素症誘導因子１－アルファ（ＨＩＦ１ａ）、およびアクチビンＡ受容体（Ａｃｖｒ２Ａ）の遺伝子発現プロファイルを示す。反対側の非手術腎臓に由来する試料を、対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。遺伝子発現プロファイルを、術後１７日で得た。マウスに、ＰＢＳまたはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれかを、術後３、７、１０、および１４日目に投与した。（＄）は、ＡＬＫ７－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体を投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓と比較した、ＰＢＳのみを投与したマウスにおける１７日目のＵＵＯ腎臓間の統計的差異を示す。（＠）は、転写物が検出されなかったことを示す。

【0065】

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、ビヒクル（Ｃｏｌ４ａ３－ＶｅｈおよびＣｏｌ４ａ５－Ｖｅｈ）またはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質（Ｃｏｌ４ａ３－ＩＩＢ／ＡＬＫ４およびＣｏｌ４ａ５－ＩＩＢ／ＡＬＫ４）で処置されたＣｏｌ４ａ３およびＣｏｌ４ａ５ Ａｌｐｏｒｔマウスにおけるタンパク尿レベルを示す。図９Ａは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置が、Ｃｏｌ４ａ３ Ａｌｐｏｒｔマウスにおけるビヒクルと比較して、タンパク尿レベルを大幅に低下させたことを示す。図９Ｂは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置が、Ｃｏｌ４ａ５ Ａｌｐｏｒｔマウスにおけるビヒクルと比較して、タンパク尿レベルを大幅に低下させたことを示す。

【0066】

【図10】図１０Ａ～１０Ｃは、ビヒクル（Ｃｏｌ４ａ３－Ｖｅｈ）またはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体（Ｃｏｌ４ａ３－ＩＩＢ／ＡＬＫ４）で処置されたＣｏｌ４ａ３－／－Ａｌｐｏｒｔマウスに由来する腎臓組織の組織学的分析を示す。図１０Ａは、コラーゲン－Ｉ染色により明らかにされた組織線維化のパーセンテージを表す。コラーゲン－Ｉ染色は、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置が、このＡｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて腎臓線維化を大幅に減少させたことを示す。図１０Ｂは、トリクロム染色により明らかにされた組織線維化のパーセンテージを表す。トリクロム染色は、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置が、このＡｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて腎臓線維化を大幅に減少させたことを示す。図１０Ｃは、組織学的分析により明らかにされた硬化糸球体のパーセンテージを表す。データは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置が、このＡｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて硬化糸球体を大幅に減少させたことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0067】

１．概要
部分的には、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロ多量体、それらの使用、およびそのようなヘテロ多量体の作製方法に関する。例えば、図６を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態において、ヘテロ多量体は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む。特に、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供する。好ましくは、そのようなＡＬＫ４ポリペプチドはＡＬＫ４受容体のリガンド結合ドメインを含み、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合ドメインを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するホモ多量体の試料と比較して、変化したＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合プロファイル／特異性を有する（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体をＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体またはＡＬＫ４：ＡＬＫ４ホモ二量体と比較して）。

【0068】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、ＴＧＦ－ベータ、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含めた、３０種を超える分泌型因子で構成される［Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７～６３頁］。脊椎動物および無脊椎動物の両方において見いだされるスーパーファミリーのメンバーは、多様な組織において遍在的に発現し、発生の最も早い段階から動物の一生を通じて機能する。実際に、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織恒常性の重要なメディエーターである。この遍在する活性と一致して、異常なＴＧＦ－ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、例えば、自己免疫疾患、心血管疾患、線維性疾患、およびがんを含めた広範囲のヒト病理に関連付けられる。

【0069】

ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドは、一方の単量体の中心３－１／２ターンへリックスが他方の単量体のベータ鎖によって形成された凹表面に対してパッケージングされた、同じ二量体構造を共有する。大多数のＴＧＦ－ベータファミリーメンバーは、分子間ジスルフィド結合によってさらに安定化される。このジスルフィド結合は、２つの他のジスルフィド結合により形成された環を横切り、「システインノット」モチーフと称されているものが生成される［Ｌｉｎら、（２００６年）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９～１９０頁およびＨｉｎｃｋら（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。

【0070】

ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、リガンド刺激を受けると下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化し活性化するＩ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される［Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００年）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１巻：１６９～１７８頁］。これらのＩ型受容体およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は細胞内シグナル伝達を媒介し、一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型受容体とＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、それにより、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化がもたらされる。

【0071】

ＴＧＦ－ベータファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づいて２つの系統学的枝に分けることができる。一方は、つい最近進化した枝であり、例えば、ＴＧＦ－ベータ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびノーダルを含み、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を通じてシグナル伝達を行う［Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。他方の枝は、スーパーファミリーの、関連性がより遠いタンパク質を含み、それらとして、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７が挙げられ、Ｓｍａｄ１、５、および８を通じてシグナル伝達を行う。

【0072】

アクチビンは、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのメンバーであり、卵胞刺激ホルモンの分泌の制御因子として最初に発見されたが、その後、種々の生殖および非生殖に関する役割が特徴付けられている。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（それぞれβ_Ａβ_Ａ、β_Ｂβ_Ｂ、およびβ_Ａβ_Ｂ）である３つの主要なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムは、主に肝臓において発現するアクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、β_Ｃまたはβ_Ｅを含有するヘテロ二量体形態も公知である。ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーでは、アクチビンは、独特であり、卵巣細胞および胎盤細胞におけるホルモンの産生を刺激することができ、神経細胞の生存を支持することができ、細胞型に応じて細胞周期の進行に正または負の影響を及ぼすことができ、また、少なくとも両生類の胚において中胚葉の分化を誘導することができる多機能性因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．、１９８巻：５００～５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．、７巻：８１～８４頁；ならびにＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５５巻：９５３～９６３頁］。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連ヘテロ二量体であるインヒビンにより拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御では、アクチビンはＦＳＨ合成および分泌を促進するが、インヒビンはＦＳＨ合成および分泌を低減する。アクチビン生理活性を制御し、かつ／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）、およびα_２－マクログロブリンが挙げられる。

【0073】

本明細書に記載の通り、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、単離されたβ_Ａサブユニットの状況であるか二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ａホモ二量体またはβ_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）としてかにかかわらず、β_Ａサブユニットに特異的に結合する作用剤である。ヘテロ二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）の場合では、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、β_Ａサブユニット内に存在するエピトープに対して特異的であり、複合体の非β_Ａサブユニット（例えば、複合体のβ_Ｂサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗する（を阻害する）、本明細書に開示される作用剤は、単離されたβ_Ａサブユニットの状況であるか二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ａホモ二量体またはβ_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）としてかにかかわらずβ_Ａサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。β_Ａβ_Ｂヘテロ二量体の場合では、「アクチビンＡ」を阻害する作用剤は、β_Ａサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害し、複合体の非β_Ａサブユニット（例えば、複合体のβ_Ｂサブユニット）の活性は阻害しない作用剤である。この原則は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合する作用剤および／またはそれを阻害する作用剤にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」に拮抗する、本明細書に開示される作用剤は、β_Ａサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性およびβ_Ｂサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。同じ原則が、「アクチビンＡＣ」、「アクチビンＢＣ」、「アクチビンＡＥ」、および「アクチビンＢＥ」に結合する作用剤および／またはそれを阻害する作用剤にも当てはまる。

【0074】

ＢＭＰおよびＧＤＦは、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの特徴的なフォールディングを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを一緒に形成する［Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、４２９巻（１号）：１～１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５、およびデカペンタプレジックを含む。ＢＭＰにその名称を与えた、骨形成を誘導する能力に加えて、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範囲の組織の発生において形態形成活性を示す。ＢＭＰ／ＧＤＦホモ二量体およびヘテロ二量体は、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体二量体の組合せと相互作用して多数の可能性のあるシグナル伝達複合体を生じさせ、それにより、２つの競合するＳＭＡＤ転写因子のセットのうちの１つが活性化される。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的かつ局在する機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生的制限を含めたいくつものやり方で、およびサイトカインに高い親和性で結合するいくつかの特異的なＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を通じて制御される。不思議なことに、いくつものこれらのアンタゴニストは、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドに似ている。

【0075】

増殖分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の制御因子であり、発達中の骨格筋および成人の骨格筋において高度に発現する。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル突然変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８７巻：８３～９０頁］。ウシにおいて、および著しく、ヒトにおいて、ＧＤＦ８の天然に存在する突然変異に関して骨格筋量の同様の増加が明らかである［Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１～５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ．（１９９４年）３８巻：７５２～７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９７年）９４巻：１２４５７～１２４６１頁；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９７年）７巻：９１０～９１５頁；ならびにＳｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁］。試験により、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋消耗がＧＤＦ８タンパク質発現の増大を伴うことも示された［Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ（１９９８年）９５巻：１４９３８～４３頁］。さらに、ＧＤＦ８は、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートすることができ、筋芽細胞の細胞増殖をモジュレートすることができる［国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合し、それにより、その生物活性を不活化することができる［Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７～６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６～７６５４頁；ならびにＢｒｏｗｎら（１９９０年）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５～４３頁］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質としては、フォリスタチン、および潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～２３２頁］。

【0076】

ＧＤＦ１１は、ＢＭＰ１１としても公知であり、マウスの発達中に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する分泌型タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０～２６４頁；ならびにＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．、８０巻：１８５～１８９頁］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において独特の役割を果たす［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～３２頁を］。ＧＤＦ１１は、発達中のニワトリの肢における軟骨形成および筋形成の負の制御因子であることが示された［Ｇａｍｅｒら（２００１年）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７～２０頁］。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現からも、ＧＤＦ８と同様に、筋肉の成長の制御におけるその役割が示唆される。さらに、脳におけるＧＤＦ１１の発現により、ＧＤＦ１１が神経系の機能に関わる活性も有する可能性があることが示唆される。興味深いことに、ＧＤＦ１１が嗅上皮における神経発生を阻害することが見いだされた［Ｗｕら（２００３年）Ｎｅｕｒｏｎ．、３７巻：１９７～２０７頁］。したがって、ＧＤＦ１１には、筋疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の処置においてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの適用があり得る。

【0077】

本明細書に記載される通り、比較結合データは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４ホモ二量体のいずれかと比較して変更された結合プロファイル（リガンド選択性）を有することを示している。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体について観察されるように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持する。しかしながら、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。特に、ＢＭＰ９はＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に対する低いか、または観察不可能な親和性を示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。

【0078】

したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりも有用である。例としては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数の拮抗作用を最小化することが望ましい治療適用が挙げられる。

【0079】

さらに、本明細書に記載される通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体のものと非常に類似する、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果を発揮する。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と違って、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する低親和性のみ、または一過的な結合を示し、したがって、血管新生などの、これらのリガンドによって媒介されるプロセスをほとんどまたは全く、同時に阻害しない。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激効果、ならびに脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更を必要としない患者を処置において有用である。

【0080】

本明細書で使用される用語は、本開示の文脈の中で、および各用語が使用される特定の文脈において、概して、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語を、本開示の組成物および方法およびそれらの作製および使用の仕方の記載に関して実践者に追加的な手引きを提供するために以下または本明細書の他の箇所で考察する。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが使用される特定の文脈から明らかになるであろう。

【0081】

「ヘテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、少なくとも第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む複合体であり、第２のポリペプチド鎖は第１のポリペプチド鎖とはアミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸残基により異なる。ヘテロマーは、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖によって形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖に加えて１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在する高次構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造としては、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。ヘテロ二量体は、本明細書では、Ｘ：Ｙまたは同等にＸ－Ｙと称され、Ｘは第１のポリペプチド鎖を示し、Ｙは第２のポリペプチド鎖を示す。より高次のヘテロマーおよびオリゴマー構造は、対応する様式で本明細書中に示される。ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、組換え体（例えば、１つまたは複数のポリペプチド成分が組換えタンパク質であってよい）であり、単離され、および／または精製される。

【0082】

「相同」とは、その文法形式および綴りの変形全てが、同一種の生物体のスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに異なる種の生物体に由来する相同タンパク質を含めた、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関連性を指す。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性の観点からであるか特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものかにかかわらずそれらの配列類似性に反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用において、および本出願において、「相同」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾されている場合、配列類似性を指す場合があり、また、共通の進化的起源に関係する場合もあり、関係しない場合もある。

【0083】

「配列類似性」という用語は、その文法形式全てが、共通の進化的起源を共有する場合もありしない場合もある核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す。

【0084】

「パーセント（％）配列同一性」とは、参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関しては、配列をアラインメントし、必要であれば最大のパーセント配列同一性を実現するためにギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一である候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内に入る種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするための妥当なパラメーターを決定することができる。しかし、本発明の目的に関しては、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して％アミノ酸（核酸）配列同一性値を生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムの作者はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．であり、ソースコードはＵ．Ｓ． Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書にファイルされており、そこでＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能である、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルすべきである。配列比較パラメーターは全てＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変動しない。

【0085】

「作動させる」とは、その文法形式全てが、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、もしくは不活性タンパク質を活性な状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質活性および／もしくは遺伝子の活性を増大させるプロセスを指す。

【0086】

「拮抗する」とは、その文法形式全てが、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害するもしくは低減させることによって、もしくは活性なタンパク質を不活性な状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を低減させるプロセスを指す。

【0087】

「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、数値に関連して使用される場合、当業者によく知られており、許容される正確度の区間を示す。一般に、そのような正確度の区間は、±１０％である。その代わりに、特に生物システムにおいては、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、所与の値から１桁分以内、好ましくは５倍以下、より好ましくは２倍以下の値を意味し得る。

【0088】

本明細書に開示される数値範囲には、範囲を規定する数が含まれる。

【0089】

「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、この用語が使用される文脈によりそうでないことが明白に示される場合を除き、複数の指示対象を包含する。「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）という用語、ならびに「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。さらに、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」とは、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多くの指定の特徴または成分のそれぞれを、他方を伴うまたは伴わないとして具体的に開示するものとみなされるべきである。したがって、「および／または」という用語は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、および「Ｂ」（のみ）を含むものとする。同様に、「および／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される場合、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）のそれぞれを包含するものとする。
２．ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体

【0090】

ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、４８、７４および７６）と１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、４６、７０、７２、７８および８０）とを含むヘテロ多量体であって、本明細書では、「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と一般に称されるヘテロ多量体に関する。好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、可溶性であり、例えば、ヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含み得る。一般に、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインが、これらの受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインの例は、本明細書中で開示され、そのような配列はもちろん、それらの断片、機能的バリアントおよび修飾形態も、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体組成物およびそれらの使用）に従って使用され得る。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびより高次のオリゴマー構造を含む。例えば、図６を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。

【0091】

好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数と結合し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＣと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＥと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＢと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＣと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＥと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＥと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ１１と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ８と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ６と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ３と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ１０と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ９（例えば、ＢＭＰ９とＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の間の相互作用の一時的性質のため画定できないＫ_ａまたはＫ_ｄを有する）と結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して強い親和性でアクチビンＢと結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＧＤＦ３と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ９と結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ１０と結合する。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、さらに、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびレフティーのうちの１つまたは複数と結合することができる。

【0092】

一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドにより媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）を阻害する（そのようなシグナル伝達に拮抗する）ために使用され得る。詳細には、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を使用して、例えば、本明細書に記載されるものなどの、細胞に基づくアッセイで、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによる細胞内シグナル伝達を阻害することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイで、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＡシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＢシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＣシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＤシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＥシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＡＢシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＡＣシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＢＣシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＡＥシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでアクチビンＢＥシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＧＤＦ１１シグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＧＤＦ８シグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＢＭＰ６シグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＧＤＦ３シグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＢＭＰ９シグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイでＢＭＰ９シグナル伝達を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイで、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して、アクチビンＢシグナル伝達の強い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイで、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して、ＢＭＰ１０シグナル伝達の弱い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイで、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して、ＧＤＦ３シグナル伝達の強い阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイで、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して、ＢＭＰ９シグナル伝達の強い阻害剤である。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、さらに、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびレフティーのうちの１つまたは複数による細胞内シグナル伝達を阻害することができる。

【0093】

本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩＢ」という用語は、任意の種からの活性受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡｃｔＲＩＩＢへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。

【0094】

「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示の至る所で、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７、ＷＯ２００８／０９７５４１、およびＷＯ２０１０／１５１４２６に提供されており、これらの文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべてのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、特に別段の指定がない限り、下記で提供されるヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づいている。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列は、次の通りである：

【化1】

【0095】

シグナルペプチドは、一重下線で示され；細胞外ドメインは、太字フォントで示され；可能性のある内在性Ｎ連結グリコシル化部位は、二重下線で示されている。
プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、次の通りである：

【化2】

【0096】

一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が、産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は、次の通りである：

【化3】

【0097】

配列番号１の６４位にアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態も、文献で報告されている。例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３～２１７０頁を参照されたい。出願人は、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対して相対的に低い親和性を有することを突き止めた。対照的に、６４位にアルギニン（Ｒ６４）を有する同じＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対して低ナノモルから高ピコモルの範囲の親和性を有する。したがって、Ｒ６４を有する配列は、本開示でのヒトＡｃｔＲＩＩＢの「野生型」参照配列として使用される。
６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、次の通りである：

【化4】

【0098】

シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントにより示されている。
代替Ａ６４形態のプロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、次の通りである：

【化5】

【0099】

一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が、産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は、次の通りである：

【化6】

【0100】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記（配列番号７）で示され、これは、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１～５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５～１５６０を表す。示される配列は、６４位にアルギニンを備えており、その代わりにアラニンを備えるように配列を修飾してもよい。シグナル配列は、下線付きである。

【化7】

【0101】

プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、次の通り（配列番号８）である。示される配列は、６４位にアルギニンを備えており、その代わりにアラニンを備えるように配列を修飾してもよい。

【化8】

【0102】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列とヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、図１に示されている。このアラインメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドと直接接触すると考えられる両方の受容体中のアミノ酸残基を示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合ポケットが、一部は、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３～Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４～Ｆ１０１により規定されることを示した。これらの位置では、保存的突然変異が許容されると予想される。

【0103】

加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、脊椎動物間でよく保存され、細胞外ドメインの大きい伸長が完全に保存される。例えば、図２は、様々なＡｃｔＲＩＩＢオルソログと比較したヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢと結合するリガンドの多くもまた高度に保存される。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性に重要である、リガンド結合ドメイン内の肝要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性を有意に変化させることなく置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、今般開示される方法に従って有用な、活性、ヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置における１つもしくは複数のアミノ酸を含むこともあり、またはヒトもしくは他の脊椎動物の配列におけるものと同様である残基を含むこともある。限定する意図はないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントを定義するためのこの手法の説明に役立つ。ヒト細胞外ドメイン（配列番号５３）におけるＬ４６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号５５）ではバリンであり、そのためこの位置を変更してもよく、任意選択で、Ｖ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更してもよい。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、この部位が、多種多様な変化に対して許容性でありえ、したがって、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙおよび高い確実性でＡなどの、極性残基を含み得ることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＴ９３は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、幅広い構造的なバリエーションがこの位置では許容されることを示し、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの、極性残基が好適である。ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１０８は、ＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶもしくはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメインのＥ１１１は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨを含む荷電残基はもちろん、ＱおよびＮも、この位置において許容されるであろうことを示す。ヒト細胞外ドメインのＲ１１２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、ＲおよびＨを含む塩基性残基が、この位置において許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインにおける１１９位におけるＡは、相対的に保存されにくく、齧歯類ではＰおよびＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れ、したがって、本質的にあらゆるアミノ酸が、この位置において許容されるはずである。

【0104】

さらに、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的および機能的特性の点で、特に、リガンド結合に関して、当技術分野において特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ ６８巻（１号）：９７～１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６巻（１号）：１８～２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）ＰＮＡＳ １０３巻（２０号：７６４３～７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書での教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢバリアントを生成する方法についてのガイダンスを十分に提供している。

【0105】

例えば、３フィンガー毒素フォールドとして公知の決定的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存システイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６巻：１８～２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、これらの保存システインの最外部により画定されるような、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９～１０９位に対応する。したがって、これらのシステイン画定コア配列に隣接する構造的規則性の低いアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更することなく、Ｎ末端で残基約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８個分、および／またはＣ末端で残基約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個分、短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮についての例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、配列番号２、３、５および６を含む。

【0106】

Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失がアクチビンに対する受容体の親和性を低下させることを明らかにした。本配列番号１のアミノ酸２０～１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１１９）－Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃ（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）と比較して、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合が低減されている。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１２９）－Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して、幾分低減されてはいるが同様の活性を保持する。

【0107】

したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に関して）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、すべて、活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性が高いだろう。同様に、残基１２９～１３４（配列番号１に関して）のいずれかにおける突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変化させないと予想される。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に関して）の突然変異がリガンド結合を実質的に減少させないことは、当技術分野において公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、早くもアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終わることもあるが、１０９および１１９で、またはこれらの間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８もしくは１１９）で終わる形態は、リガンド結合が低減されていると予想される。アミノ酸１１９（配列番号１に関して）は、保存されにくく、そのため容易に変更または短縮される。１２８（配列番号１に関して）またはそれ以降で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号１に関して、１１９および１２７でまたはこれらの間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６もしくは１２７）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中等度の結合能力を有することになる。これらの形態のいずれかを、臨床状況または実験状況に依存して使用することが望ましいだろう。

【0108】

ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９（配列番号１に関して）またはそれより前で始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持すると予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインに相当する。２４位（配列番号１に関して）におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異は、リガンド結合に実質的に影響を与えることなくＮ連結グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、アミノ酸２０～２９に対応する、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域における突然変異が、十分に許容されることを確証する。特に、２０、２１、２２、２３および２４位（配列番号１に関して）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、全般的リガンド結合活性を保持するはずであり、２５、２６、２７、２８および２９位（配列番号１に関して）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドも、リガンド結合活性を保持すると予想される。驚くべきことに、２２、２３、２４または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も高い活性を有することになることが実証された、例えば、米国特許第７，８４２，６６３号。

【0109】

総合すると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０～２９のいずれか１つに対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のいずれか１つで始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４のいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４のいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である、アミノ酸配列を含み得るか、そのようなアミノ酸配列から本質的になり得るか、またはそのようなアミノ酸配列からなり得る。他の例は、配列番号１の２０～２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９位のいずれか１つ）または２１～２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９位のいずれか１つ）で始まり、配列番号１の１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２もしくは１３３位のいずれか１つ）、１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、または１２９～１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２もしくは１３３位のいずれか１つ）で終わるポリペプチドを含む。他の例は、配列番号１の２０～２４位（例えば、２０、２１、２２、２３もしくは２４位のいずれか１つ）、２１～２４位（例えば、２１、２２、２３もしくは２４位のいずれか１つ）、または２２～２５位（例えば、２２、２２、２３もしくは２５位のいずれか１つ）で始まり、配列番号１の１０９～１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）または１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）で終わる構築物を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するものも企図される。

【0110】

本明細書に記載される変形形態を、様々な方法で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、リガンド結合ポケットに１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、かつリガンド結合ポケットの４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位に０、１つまたは複数の非保存的変更を含む。可変性が特によく許容され得る結合ポケット外の部位は、細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端（上述の通り）、ならびに４２～４６および６５～７３位（配列番号１に関して）を含む。６５位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を実際に向上させるため、Ｒ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合に対して有害作用を及ぼさないと予想される［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化は、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化をおそらく消失させ、したがって、これは、この領域での有意な変化が許容される可能性が高いことを裏付ける。Ｒ６４Ａ変化は、許容されにくいが、Ｒ６４Ｋは、よく許容されるため、６４位ではＨなどの別の塩基性残基が許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。加えて、当技術分野において記載されている突然変異誘発プログラムの結果は、保存するのに有益であることが多いアミノ酸位置がＡｃｔＲＩＩＢ中にあることを示す。配列番号１に関して、これらは、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、および特にトリプトファン）、３７位（酸性、および特に、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特に、フェニルアラニンまたはチロシン）を含む。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが望ましい可能性がある他の位置は、次の通りである：すべて配列１に関して、５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特に、Ｅ、Ｄ、ＲまたはＫ）。

【0111】

ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、該ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドと結合する。したがって、一部の実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０～２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９で始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４のいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなる、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になる、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。他の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になる、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５もしくは４６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置が、酸性アミノ酸である（すなわち、天然に存在するＤもしくはＥアミノ酸残基でも、人工酸性アミノ酸でもない）、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。

【0112】

ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ４」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ－４タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ４タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ４への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは、一般に、高システイン領域を有するリガンド結合細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインとで構成されている膜貫通タンパク質である。

【0113】

「ＡＬＫ４ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含むポリペプチドを含む。本明細書に記載されるすべてのＡＬＫ４関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、特に別段の指定がない限り、下記で提供されるヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づいている。
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、次の通りである：

【化9】

【0114】

シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、次の通りである：

【化10】

【0115】

ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記（配列番号１１）で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８～１５９２に対応する。シグナル配列は、下線付きであり、細胞外ドメインは、太字フォントで示される。

【0116】

【化11】

【化12】

細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、次の通りである：

【0117】

【化13】

ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォームＣ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３３．３）は、次の通りである：

【化14】

【0118】

シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列（アイソフォームＣ）は、次の通りである：

【化15】

【0119】

ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列は、下記（配列番号２１）で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２８．３のヌクレオチド７８～１７１５に対応する。シグナル配列は、下線付きであり、細胞外ドメインは、太字フォントで示される。

【0120】

【化16】

細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列は、次の通りである：

【0121】

【化17】

【0122】

ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、該ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドと結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、４８、７４および７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、４８、７４および７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるか、またはそのようなＡＬＫ４ポリペプチドから本質的になる。

【0123】

ＡＬＫ４は、脊椎動物間でよく保存され、細胞外ドメインの大きい伸長が完全に保存される。例えば、図５は、様々なＡＬＫ４オルソログと比較したヒトＡＬＫ４細胞外ドメインの多配列アラインメントを描示する。ＡＬＫ４と結合するリガンドの多くもまた高度に保存される。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡＬＫ４－リガンド結合活性に重要である、リガンド結合ドメイン内の肝要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡＬＫ４－リガンド結合活性を有意に変化させることなく置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、今般開示される方法に従って有用な、活性、ヒトＡＬＫ４バリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡＬＫ４の配列からの対応する位置における１つもしくは複数のアミノ酸を含むこともあり、またはヒトもしくは他の脊椎動物の配列におけるものと同様である残基を含むこともある。限定する意図はないが、以下の例は、活性ＡＬＫ４バリアントを定義するためのこの手法の説明に役立つ。ヒトＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号５９）におけるＶ６は、Ｍｕｓ ｍｕｃｕｌｕｓ ＡＬＫ４（配列番号６３）ではイソロイシンであり、そのためこの位置を変更してもよく、任意選択で、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４（配列場号６２）に見られるように、Ｌ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更してもよい。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、これは、この部位が、多種多様な変化に対して許容性でありえ、したがって、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、および高い確実性でＡなどの非極性残基を含み得ることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＳ１５は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＤであり、これは、幅広い構造的なバリエーションがこの位置では許容されることを示し、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの、極性残基が好適である。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、これは、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈはもちろん、ＱおよびＮを含む荷電残基が、この位置において許容されるであろうことを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＲ８０は、Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ ｃｒｉｓｔａｔａ ＡＬＫ４（配列番号６０）ではＫであり、これは、Ｒ、ＫおよびＨを含む塩基性残基が、この位置において許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＹ７７は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ＡＬＫ４（配列番号６４）ではＦであり、これは、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基が、この位置において許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＰ９３は、相対的に保存されにくく、Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ＡＬＫ４（配列番号６１）ではＳおよびＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＮとして現れ、したがって、本質的にあらゆるアミノ酸が、この位置において許容されるはずである。

【0124】

さらに、ＡＬＫ４タンパク質は、構造的および機能的特性の点で、特に、リガンド結合に関して、当技術分野において特徴付けられている［例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２００３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８巻（２３号）：２１１２９～２１１３５頁；Ｒｏｍａｎｏら（２０１２年）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｏｄｅｌ １８巻（８号）：３６１７～３６２５頁；およびＣａｌｖａｎｅｓｅら（２００９年）１５巻（３号）：１７５～１８３頁］。本明細書での教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡＬＫ４バリアントを生成する方法についてのガイダンスを十分に提供している。

【0125】

例えば、３フィンガー毒素フォールドとして公知の決定的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存システイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６巻：１８～２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、これらの保存システインの最外部により画定されるような、ヒトＡＬＫ４のコアリガンド結合ドメインは、配列番号９（ＡＬＫ４前駆体）の３４～１０１位に対応する。したがって、これらのシステイン画定コア配列に隣接する構造的規則性の低いアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更することなく、Ｎ末端で残基１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個分、またはＣ末端で残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６個分、短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮についての例示的なＡＬＫ４細胞外ドメインは、配列番号１０および２０を含む。

【0126】

したがって、ＡＬＫ４の活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、アミノ酸３４～１０１を含む。したがって、ＡＬＫ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２４～３４のいずれか１つに対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれか１つで始まり）、配列番号９のアミノ酸１０１～１２６のいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５もしくは１２６のいずれか１つで終わる）ＡＬＫ４の部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である、アミノ酸配列を含み得るか、そのようなアミノ酸配列から本質的になり得るか、またはそのようなアミノ酸配列からなり得る。他の例は、配列番号９の２４～３４位（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４位のいずれか１つ）、２５～３４位（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４位のいずれか１つ）または２６～３４位（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４位のいずれか１つ）で始まり、配列番号９の１０１～１２６位（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５もしくは１２６位のいずれか１つ）、１０２～１２６位（例えば、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５もしくは１２６位のいずれか１つ）、１０１～１２５位（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４もしくは１２５位のいずれか１つ）、１０１～１２４位（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３もしくは１２４位のいずれか１つ）、１０１～１２１位（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０もしくは１２１位のいずれか１つ）、１１１～１２６位（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５もしくは１２６位のいずれか１つ）、１１１～１２５位（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４もしくは１２５位のいずれか１つ）、１１１～１２４位（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３もしくは１２４位のいずれか１つ）、１２１～１２６位（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５もしくは１２６位のいずれか１つ）、１２１～１２５位（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４もしくは１２５位のいずれか１つ）、１２１～１２４位（例えば、１２１、１２２、１２３もしくは１２４位のいずれか１つ）または１２４～１２６位（例えば、１２４、１２５もしくは１２６位のいずれか１つ）で終わる、構築物を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号９の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するものも、企図される。

【0127】

本明細書に記載される変形形態を、様々な方法で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４バリアントは、リガンド結合ポケットに１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化を含む。可変性が特によく許容され得る結合ポケット外の部位は、細胞外ドメイン（上述の通り）のアミノおよびカルボキシ末端を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。バリアントを、アミノ酸置換、欠失、付加、またはこれらの組合せにより産生することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩での、トレオニンのセリンでの孤立した置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連性があるアミノ酸での同様の置き換え（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想することは理にかなっている。保存的置き換えは、側鎖に関連性があるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ホモログを生じさせる結果になるかどうかは、細胞において野生型ポリペプチドと同様の方法で応答を生じさせるバリアントポリペプチドの能力、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーを含む、１つもしくは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドと結合する、バリアントポリペプチドの能力を評定することによって、容易に判定することができる。

【0128】

一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性を増強すること（例えば、有効期間延長、および／または耐タンパク質分解性増大）などの目的で、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。

【0129】

一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるための、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的突然変異を企図している。そのような突然変異は、Ｏ連結またはＮ連結グリコシル化部位などの、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するために、または消失させるために、選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、適切な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列である、アスパラギン－Ｘ－トレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリン（ここでの「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を、一般に含む。ポリペプチドの配列への（Ｏ連結グリコシル化部位に対する）１つもしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基の付加により、またはそのような残基による置換により、変更を加えることもできる。グリコシル化認識部位の第１もしくは第３のアミノ酸位置の一方もしくは両方における様々なアミノ酸の置換もしくは欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチド上の糖鎖部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとポリペプチドとの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング方法に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の糖鎖部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に遂行することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処置は、アミノ酸配列を原形のまま残しつつ、連結している糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除いてほとんどのまたはすべての糖を切断する結果となる。ポリペプチド上の糖鎖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されたような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により果すことができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は、すべて、ペプチドのアミノ酸配列による影響を受け得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるので、使用する発現系のタイプに依存して、必要に応じてポリペプチドの配列を調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のヘテロマー複合体は、適切なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系において発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞系も有用であると予想される。

【0130】

本開示は、突然変異体、特に、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコンビナトリアル突然変異体のセット、ならびに短縮突然変異体を作製する方法を、さらに企図している。コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンド結合）ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ配列の同定に、特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変化またはリガンド結合の変化などの特性の変化を有するポリペプチドバリアントを生成することであり得る。様々なスクリーニングアッセイが下記で提供され、そのようなアッセイを使用してバリアントを評価することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ複合体バリアントを、１つもしくは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドと結合する能力、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドのＴＧＦ－ベータスーパーファミリー受容体との結合を防止する能力、および／またはＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドによって引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力について、スクリーニングすることができる。

【0131】

ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の活性を、例えば、細胞に基づくアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで、試験することもできる。例えば、遺伝子の発現、または筋肉細胞での筋肉産生に関与するタンパク質の活性に対する、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の効果を、評定することができる。これを、必要に応じて、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドの存在下で行うことができ、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体および任意選択でＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドを産生するように細胞にトランスフェクトすることができる。同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をマウスまたは他の動物に投与することができ、当技術分野で認知されている方法を使用して、筋肉形成および強度などの１つまたは複数の測定値を評定することができる。同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体またはそのバリアントの活性を、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞および／または神経細胞において、これらの細胞の増殖に対する何らかの効果について、例えば、本明細書に記載のアッセイおよび当技術分野において常識のアッセイにより、試験することができる。ＳＭＡＤ反応性レポーター遺伝子をそのような細胞系において使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニターすることができる。

【0132】

参照ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と比較して選択性の増加または一般に効力の増大を有する、コンビナトリアル由来バリアントを、生成することができる。そのようなバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現された場合、遺伝子療法プロトコールで使用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する未修飾ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変化したタンパク質を、タンパク質分解に対して、または未修飾ポリペプチドの崩壊もしくは別様の不活性化を生じさせる他の細胞過程に対して、より安定にまたはより不安定にさせることができる。そのようなバリアント、およびそれらをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることによりポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より短期的な生物学的効果を生じさせることができ、誘導性発現系の部分の場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより厳格な調節を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において突然変異を生じさせて、例えば免疫原性、半減期および可溶性を含む、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の１つまたは複数の活性を変化させることができる。

【0133】

コンビナトリアルライブラリーは、可能性のあるＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ配列の少なくとも一部分を各々が含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に遺伝子配列にライゲーションすることができ、したがって、可能性のある、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢをコードするヌクレオチド配列の、縮重セットが、個々のポリペプチドとして発現可能であり、または代替的に、より大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能である。

【0134】

可能性のあるホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、次いで、合成遺伝子を、発現のための適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野において周知である［Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９巻：３号；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ． ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、編集ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２７３～２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８巻：１０５６頁；およびＩｋｅら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１巻：４７７頁］。そのような技術は、他のタンパク質の定方向進化に利用されてきた［Ｓｃｏｔｔら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：３８６～３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９巻：２４２９～２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：４０４～４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７巻：６３７８～６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号］。

【0135】

あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成し、ライブラリーから、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発［Ｒｕｆら（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３巻：１５６５～１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻：３０９５～３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）Ｇｅｎｅ １３７巻：１０９～１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１８巻：５９７～６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８巻：２８８８～２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０巻：１０８３２～１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４巻：１０８１～１０８５頁］を使用する、スクリーニングにより；リンカースキャニング突然変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３巻：６５３～６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２巻：２６４４～２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２巻：３１６頁］により；飽和突然変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２巻：６１３頁］により；ＰＣＲ突然変異誘発［Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １巻：１１～１９頁］により；または化学的突然変異誘発を含む、ランダム突然変異誘発「Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７巻：３２～３４頁］により、単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、短縮された（生物活性）形態のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドについての魅力的な同定方法である。

【0136】

点突然変異および短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、広範な技術が、当技術分野において公知である。そのような技術は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のコンビナトリアル突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに、一般に、適応可能であろう。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用されている技術は、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングすること、結果として得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させること、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する、条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを、概して含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）結合アッセイおよび／またはＴＧＦ－ベータリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイを含む。

【0137】

ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド中に天然に存在する何らかのものに加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。そのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加およびアシル化を含むが、これらに限定されない。結果として、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類または単糖類、およびリン酸塩などの、非アミノ酸エレメントを含み得る。ヘテロ多量体複合体の機能性に対するそのような非アミノ酸エレメントの効果は、他のヘテロ多量体バリアントについて本明細書で記載されるように試験することができる。本開示のポリペプチドが、新生形態のポリペプチドを切断することにより細胞において産生される場合、翻訳後プロセシングもタンパク質の適切なフォールディングおよび／または機能に重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、そのような翻訳後活性のための特異的細胞内機構および特徴的メカニズムを有し、それらの細胞を、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそれらを含むヘテロ多量体の適切な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。

【0138】

ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合している少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチドは、ヘテロ二量体複合体を形成するが、より高次のヘテロ多量体複合体、例えば、これらに限定されないが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらにオリゴマー構造（例えば、図６を参照されたい）も含まれる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書で開示される場合、「多量体化ドメイン」という用語は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合性または非共有結合性相互作用を促進する、アミノ酸またはアミノ酸配列を指す。本明細書で開示されるポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合でまたは非表有結合で連結されることもある。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）と第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の間の相互作用を促進してヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、および任意選択で、ホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるか、または別様に不利な状態にし、それによって所望のヘテロ多量体（例えば、図６を参照されたい）の収量を増加させる。

【0139】

ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成するために、当技術分野において公知の多くの方法を使用することができる。例えば、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）上の天然に存在するアミノ酸をシステインなどの遊離チオール含有残基で置き換え、その結果、遊離チオールが、第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）上の別の遊離チオール含有残基と、第１のポリペプチドと第２のポリペプチド間にジスルフィド結合が形成されるように相互作用することにより、天然に存在しないジスルフィド結合を構築することができる。ヘテロ多量体形成を促進するための相互作用のさらなる例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１に記載されているものなどのイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２に記載されているものなどの静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７に記載されているものなどのコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１巻：１５７９～１５８４頁に記載されているものなどのロイシンジッパー；およびＰａｃｋら（１９９３年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１巻：１２７１～１２７７頁に記載されているものなどのヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。様々なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィドブリッジなどによるような共有結合によって、またはアビジン－ビオチンもしくはロイシンジッパー技術によるような親和性相互作用によって、達成することができる。

【0140】

ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用対の一方の成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合している第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体であって、第１のポリペプチドが、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列と、相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列とを含み、第２のポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列と、相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列とを含む、タンパク質複合体を形成し得る。相互作用対は、複合体、特にヘテロ二量体複合体を形成するように相互作用するいずれの２つのポリペプチド配列であってよいが、効力のある実施形態は、ホモ二量体複合体を形成することができる相互作用対を利用することもある。相互作用対の一方のメンバーは、例えば、配列番号２、３、５、６、１０および２０のいずれか１つの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなる、ポリペプチド配列を含む、本明細書に記載のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、融合させることができる。相互作用対を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上を付与するように選択してもよく、または特性／活性の向上をもたらすために別の部分を結合させるアダプターとして作用するように選択してもよい。例えば、ポリエチレングリコール部分を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上をもたらすために相互作用対の一方または両方の成分に結合させてもよい。

【0141】

相互作用対の第１および第２のメンバーは、非対称対であってもよく、これは、対のメンバーが、自己会合するのではなく優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称の相互作用対の第１および第２のメンバーは、ヘテロ二量体複合体（例えば、図６を参照されたい）を形成するように会合し得る。あるいは、相互作用対は、無誘導であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性なく、互いに会合することもあり、または自己会合することもあり、したがって、同じアミノ酸配列を有することもあり、または異なるアミノ酸配列を有することもあることを意味する。したがって、無誘導相互作用対の第１および第２のメンバーは、ホモ二量体複合体を形成するように会合することもあり、またはヘテロ二量体複合体を形成するように会合することもある。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合で会合する。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合で会合する。

【0142】

具体的な例として、本開示は、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインなどの免疫グロブリンの定常ドメインまたはＦｃドメインを含むポリペプチドに融合しているＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢを含む融合タンパク質を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインは、本明細書で提供される。ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性のどちらかを低下させる他の突然変異は公知であり、まとめると、これらのバリアントのいずれもが本開示に含まれ、本開示のヘテロ多量体複合体の有利な成分として使用され得る。任意選択で、配列番号３１のＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、Ｌｙｓ－３２２およびＡｓｎ－４３４（対応する完全長ＩｇＧ１に従って番号付けされた）などの残基における１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ－２６５突然変異）を有する突然変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体と結合する能力が低下している。他の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ－４３４突然変異）を有する突然変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）と結合する能力が増大している。

【0143】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３１）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一つには、本開示は、配列番号３１に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在するバリアントは、配列番号３１で使用された番号付けシステム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７を参照されたい）に従ってＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。

【化18】

【0144】

ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３２）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、二重下線は、配列にデータベースコンフリクトがある位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従う）。一つには、本開示は、配列番号３２に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。

【化19】

【化20】

【0145】

ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用され得るアミノ酸配列の２つの例は、下記で示される。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖における場合の４倍以下の長さであることができ、３つの同一の１５残基セグメントを含有し、その前に同様の１７残基セグメントがある。下記で示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３３）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３４）は、完全長ヒンジ領域を含有する。各々の場合、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従って、点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一つには、本開示は、配列番号３３および３４に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。

【化21】

【0146】

Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０を参照されたい）は、配列番号３３に使用された番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらのバリエーションの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９を参照されたい］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域のすべてを欠いている。バリアントＷＩＳは、ヒンジ領域に通常は存在する１１個に加えて７位に追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部を欠く。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形を表すこともあり、または別のガンマ鎖サブクラスを表すこともある。本開示は、これらのバリアントの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含むさらなる融合タンパク質を提供する。

【0147】

ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３５）。点線下線は、ヒンジ領域を示す。一つには、本開示は、配列番号３５に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。

【化22】

【0148】

Ｆｃドメインにおける様々な改変突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３１）に関して本明細書で提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を図３におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。同一でないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図３）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号３１、３２、３３、３４および３５において異なるアミノ酸番号を有する。ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号３１、３２、３３、３４および３５）における所与のアミノ酸位置は、番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの場合のように（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域からなる）ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体を包含するときの同じ位置とは異なる番号によって特定されることになることも、理解され得る。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号３１）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣ_Ｈ３位置間の対応は、次の通りである。

【表1-1】

【表1-2】

【0149】

単一の細胞系からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生の際に生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生の際に主として直面するような、鎖会合課題は、異なる重鎖および／または軽鎖が単一の細胞系において産生される場合に本質的に生じる結果となる複数の組合せの中から所望の多鎖タンパク質を効率的に産生させるという難題に関する［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ ４巻：６５３～６６３頁］。この問題は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が同じ細胞において産生される場合、最も深刻であり、この場合、１つだけが概して所望されるのに、可能性のある鎖の組合せが（これらの一部は同一であるが）合計１６存在する。それにもかかわらず、同じ原理により、異なる（非対称）重鎖を２つだけ含む所望の多鎖融合タンパク質の収量減少が説明される。

【0150】

好ましい非対称の融合タンパク質を許容可能な収量で産生するために単一の細胞系においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望の対合を増加させる様々な方法が、当技術分野において公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ ４巻：６５３～６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］。Ｆｃ含有鎖の所望の対合を達成するための方法は、電荷に基づく対合（静電ステアリング）、「ノブ－イントゥ－ホール」立体的対合、ＳＥＥＤｂｏｄｙ対合、およびロイシンジッパーに基づく対合を含むが、これらに限定されない。［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９巻：６１７～６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６巻：６７７～６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３巻：１９５～２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０年）；２８５巻：１９６３７～１９６４６頁；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７巻：４３３３１～４３３３９頁；米国特許第５９３２４４８号；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４、およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書に記載される通り、これらの方法を使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ多量体複合体を生成することができる。図６を参照されたい。

【0151】

例えば、特定のポリペプチド間の相互作用を促進することができる１つの手段は、Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびＣａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８に記載されているものなどの、突出－イントゥ－空洞（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ）（ノブ－イントゥ－ホール）相補領域を工学的に作製することによるものである。「突出」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用対）の境界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突出と同一のまたは同様のサイズの相補的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用対）の境界面に任意選択で作出される。適切な位置にあり、適切な寸法を有する突出または空洞が、第１または第２のポリペプチドのどちらかの境界面に存在する場合、対応する空洞または突出を、それぞれ、隣接する境界面に工学的に作製するだけでよい。

【0152】

中性ｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電しており、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、正に荷電している。これらの荷電残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進すること、および同時にホモ二量体形成を妨げることができる。引力相互作用が、反対の電荷間で起こり、反発相互作用が、同じ電荷間で起こる。一部には、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、荷電境界面残基の部位特異的突然変異誘発を行うことにより、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するために引力相互作用を、および任意選択で、ホモ二量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるために反発相互作用を使用する。

【0153】

例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン境界面は、ドメイン－ドメイン相互作用に関与する４種の特有の荷電残基（ｃｈａｒｇｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）対：Ａｓｐ３５６－Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７－Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２－Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９－Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖における残基番号付けが（’）により示されている］を含む。ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにおける残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームが、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３－ＣＨ３ドメイン相互作用に存在する２回対称性のため、各々の特有の相互作用は、構造に２回示されることになる（例えば、Ａｓｐ－３９９－Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９－Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９－Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体形成とホモ二量体形成の両方に有利である。第１の鎖における電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；正電荷から負電荷へ）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不利な相互作用をもたらす。不利な相互作用は、同じ電荷（負－負；Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９’およびＤ３９９－Ｋ４０９Ｅ’）間で起こる反発相互作用に起因して生じる。第２の鎖における電荷極性を切り替える同様の突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモ二量体形成に不利な相互作用（Ｋ４０９’－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ－Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これら２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体形成に有利な相互作用（Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９－Ｋ４０９’）をもたらす。

【0154】

ヘテロ二量体形成およびホモ二量体防止に対する静電ステアリング効果を、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む第２の鎖における反対の電荷を有する残基と対合することもあり、またはしないこともある、さらなる荷電残基の突然変異によって、さらに増強することができる。下記の表は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を増進するために単独でまたは組み合わせて使用することができる、可能性のある電荷変化突然変異を収載するものである。

【表2】

【0155】

一部の実施形態では、本願の融合タンパク質におけるＣＨ３－ＣＨ３境界面を構成する１つまたは複数の残基は、相互作用が静電的に不利になるような荷電アミノ酸で置き換えられる。例えば、境界面における正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）は、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換えられる。あるいは、または前述の置換と組み合わせて、境界面における負荷電アミノ酸は、正荷電アミノ酸で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、所望の電荷特性を有する天然に存在しないアミノ酸で置き換えられる。負荷電残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）のＨｉｓへの突然変異が、立体的課題の原因になり得る、側鎖体積の増加につながることになることに留意されたい。さらに、Ｈｉｓプロトン供与体および受容体形態は、局在環境に依存する。これらの課題を設計戦略とともに考慮するべきである。境界面残基は、ヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスにおいて高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果をヒトおよびマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略をＣＨ３ドメイン境界面における非荷電残基の荷電残基への修飾に拡大することもできる。

【0156】

一つには、本開示は、電荷対合（静電ステアリング）に基づいて相補性になるように改変されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。静電相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意に融合させて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。静電ステアリングに基づくこの例では、改変アミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２３［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号２４［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］が、相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを、配列番号２３または配列番号２４の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２３および２４）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは、理解され得る。

【化23】

【0157】

一つには、本開示は、立体的相補性のために改変されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。一つには、本開示は、ノブ－イントゥ－ホール対合を立体的相補性の例として提供する。立体相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意に融合させて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。ノブ－イントゥ－ホール対合に基づくこの例では、改変アミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２５［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号２６［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］が、相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号２５または配列番号２６の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２５および２６）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは、理解され得る。

【化24】

【0158】

改変ジスルフィド結合と組み合わせられたノブ－イントゥ－ホール対合に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号２７［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号２８［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］で開示される。これらの配列中の改変アミノ酸置換は二重下線付きであり、構築物のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを、配列番号２７または配列番号２８の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２７および２８）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは、理解され得る。

【化25】

【0159】

一つには、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ Ｃ_Ｈ３ドメインの指状嵌入β鎖セグメントを生成するように改変されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にする鎖交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ）Ｃ_Ｈ３ヘテロ二量体の使用を含む［Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌ ２３巻：１９５～２０２頁］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢに任意に融合させて、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）対合に基づくこの例では、ＩｇＡ Ｆｃからの改変アミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２９［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓｂ_ＡＧ）］および配列番号３０［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓｂ_ＧＡ）］が、相補的ＩｇＧ Ｆｃ配列の例であり、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号２９または配列番号３０の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置でのアミノ酸置換（図３を参照されたい）が、下記の相補的ＩｇＧ－ＩｇＡ対（配列番号２９および３０）に使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは、理解され得る。

【化26】

【化27】

【0160】

一つには、本開示は、Ｆｃ Ｃ_Ｈ３ドメインのＣ末端に結合された切断可能ロイシンジッパードメインを用いる非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体抗体重鎖の優先的構築を生じさせるのに十分なものである［Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７巻：４３３３１～４３３３９頁］。本明細書で開示される通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合された１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意に融合させて、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、相補的ロイシンジッパー形成鎖に結合されたＦｃ配列とともに共発現させることができる。精製後の細菌エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃでの構築物のタンパク質消化は、ロイシンジッパードメインを放出して、構造が天然Ｆｃの構造と同一であるＦｃ構築物をもたらすことができる。ロイシンジッパー対合に基づくこの例では、改変された相補的ロイシンジッパー配列が二重下線付きである、配列番号３６［ｈＧ１Ｆｃ－Ａｐ１（酸性）］および配列番号３７［ｈＧ１Ｆｃ－Ｂｐ１（塩基性）］が、相補的ＩｇＧ Ｆｃ配列の例であり、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号３６または配列番号３７の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずにｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）に結合されたロイシンジッパー形成配列が、下記の相補的ロイシンジッパー形成対（配列番号３６および３７）において使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは、理解され得る。

【化28】

【化29】

【0161】

ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドの等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含むＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質）、および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの等電点を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質）に関する。一部の実施形態では、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０より高いｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全多ドメインタンパク質の構築に選択される。他の実施形態では、約９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５または５．０未満のｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全多ドメインタンパク質の構築に選択される。単一のタンパク質が複数の電荷形態を有することになることは、当業者には理解されるであろう。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、タンパク質の電荷は、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシル末端アミノ酸不均質、リン酸化およびグリコシル化を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるメカニズムにより修飾することができる。

【0162】

タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動および様々なコンピュータアルゴリズムを含むがこれらに限定されない、様々な方法により決定することができる（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら、１９９３年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４巻：１０２３頁を参照されたい）。一実施形態では、ｐＩは、多重温度冷蔵バス再循環ユニットおよびＥＰＳ ３５０１ ＸＬ電源を備えた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ２電気泳動システムを使用して決定される。プレキャストアンフォラインゲル（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＩ範囲２．５～１０）に、タンパク質試料が負荷される。広範囲ｐＩマーカー標準物質（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｐＩ範囲３～１０、８μＬ）が、タンパク質の相対ｐＩを決定するために使用される。電気泳動は、例えば、１５００Ｖ、５０ｍＡで１０５分間、行われる。ゲルは、例えば、精製水で１×に希釈されたＳｉｇｍａ固定液（５×）を使用して固定される。染色は、例えば、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一晩、室温で行われる。脱染は、例えば、２５％エタノール、８％酢酸および６７％精製水からなる溶液で行われる。等電点は、例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ密度計を使用して標準物質の検量線と比較して決定される。１または複数の計量は、異なるｐＨ値、異なる温度、異なる剪断応力および異なる凍結／融解サイクルからなる群から選択される１つまたは複数の異なる条件下でドメインの安定性を特徴付ける計量をさらに含み得る。

【0163】

一つには、本開示は、所望のヘテロマー種の精製を助長するＦｃドメインにおけるさらなる突然変異と組み合わせての上記の方法により、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）および相補的Ｆｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの正荷電アミノ酸（例えば、アルギニン）（配列番号６６～６７）のさらなる置換を加えた、配列番号２７～２８で開示されるような、改変ジスルフィド結合と組み合わせられたノブ－イントゥ－ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性である。これら４つのアミノ酸置換は、等電点または正味の分子電荷の差異に基づいて異種ポリペプチド混合物からの所望のヘテロマー融合タンパク質の選択的精製を助長する。これらの配列中の改変アミノ酸置換は、下に二重下線が付いており、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号６６または配列番号６７の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号６６～６７）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは、理解され得る。

【化30】

【0164】

別の例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号６８）の２１３位におけるヒスチジンのアルギニンへの置換を加えた、配列番号２７～２８で開示されるような、改変ジスルフィド結合と組み合わせられたノブ－イントゥ－ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性を含む。この置換（Ｋａｂａｔらの番号付けシステムではＨ４３５Ｒと示される）は、プロテインＡに対する親和性の差異に基づいて望ましくないホモ二量体からの所望のヘテロマーの分離を助長する。改変アミノ酸置換は、二重下線により示され、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号６８または配列番号２８の、両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図３を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、配列番号６８（下記）および配列番号２８の相補的ｈＧ１Ｆｃ対の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは、理解され得る。

【化31】

【0165】

Ｆｃドメインにおける様々な改変突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３１）に関して上に提示されている。Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を、図３中のＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。同一でないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図３）に基づく類似のＦｃ位置は、次の表で要約される通り、配列番号３１、３２、３３、３４および３５において異なるアミノ酸番号を有する。

【表3-1】

【表3-2】

【0166】

融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントを、所望の機能性と一致する様式で配列することができることは理解される。例えば、ＡＬＫ４および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを、異種ドメインのＣ末端側に配置してもよく、または代替的に、異種ドメインをＡＬＫ４および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインのＣ末端側に配置してもよい。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインならびに異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列を、どちらかのドメインのＣもしくはＮ末端側に含んでいてもよく、またはドメイン間に含んでいてもよい。

【0167】

例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含むことがある。Ｂ部分は、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立して、０、１つ、または１つより多数のアミノ酸であってもよく、Ａ部分とＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に結合されていてもよい。リンカーは、グリシン残基を多く含むことがあり（例えば、グリシン残基２～１０、２～５、２～４、２～３個）、またはグリシンおよびプロリン残基を多く含むこともあり、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはトレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号１３）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＳＧＧＧ（配列番号１８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号５８）シングレットまたはリピートを含有することもある。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃ（式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１つまたは複数を向上させるポリペプチド部分である）で示されるようなアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃ（式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである）で示されるようなアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号３９、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７８および８０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。

【0168】

一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、所望の特性を付与するための１つまたは複数の異種部分（ドメイン）をさらに含む。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。そのような融合ドメインの周知の例は、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。親和性精製を目的として、グルタチオンコンジュゲート樹脂、アミラーゼコンジュゲート樹脂、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲート樹脂などの、親和性クロマトグラフィー用の適切なマトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ_６）融合パートナーとともに有用なＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、リガンド捕捉ポリペプチドの検出を助長するように選択され得る。そのような検出ドメインの例は、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）はもちろん「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常は、特異的抗体が利用できる短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用できる周知のエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ－ｍｙｃタグを含む。一部の場合、融合ドメインは、適切なプロテアーゼによる融合タンパク質の部分的消化を可能にし、それによって融合タンパク質からの組換えタンパク質の遊離を可能にする、プロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのプロテアーゼ切断部位を有する。その場合、遊離されたタンパク質をその後のクロマトグラフ分離により融合ドメインから単離することができる。

【0169】

ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することができる１つまたは複数の修飾を含有し得る。例えば、そのような修飾は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を向上させ、ポリペプチドの循環半減期を向上させ、および／またはポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。そのような安定化修飾は、融合タンパク質（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインとスタビライザードメインとを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および糖鎖部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの糖鎖部分の除去を含む）を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すばかりでなく、非タンパク質様修飾、例えば、糖鎖部分、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性部分も含む。

【0170】

好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単離された複合体である。本明細書で使用される場合、単離されたタンパク質（もしくはタンパク質複合体）またはポリペプチド（もしくはポリペプチド複合体）は、その天然環境の成分から分離されているものである。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により判定して、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い純度に精製される。抗体純度を評定するための方法は、当技術分野において周知である［Ｆｌａｔｍａｎら（２００７年）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ ８４８巻：７９～８７頁］。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に欠く。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体、および約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。

【0171】

ある特定の実施形態では、本開示の、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにこれらを含むヘテロ多量体は、当技術分野公知の様々な技術により産生することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ， Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編集）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して、合成することができる。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、ポリペプチドは、それらの断片またはバリアントを含めて、当技術分野において周知であるような様々な発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して組換えにより産生することができる。さらなる実施形態では、修飾または未修飾ポリペプチドは、組換えにより産生された完全長ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対合している塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによって消化することにより、産生され得る。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）を使用して、タンパク質切断部位を同定することができる。
３．ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸

【0172】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（それらの断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１１は、天然に存在するヒトＡＬＫ４前駆体ポリペプチドをコードし、その一方で、配列番号１２は、ＡＬＫ４のプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖状であってもよく、また二本鎖状であってもよい。そのような核酸は、ＤＮＡ分子であってもよく、またはＲＮＡ分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、本明細書に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製するための方法において使用することができる。

【0173】

本明細書で使用される場合、単離された核酸は、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を元々含有する細胞内に含有されている核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0174】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２または８３のいずれか１つ、およびそのバリアントを含むと理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントを含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失の点で異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２または８３のいずれか１つで指定されるヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むことになる。

【0175】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２もしくは８３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる、単離された核酸配列または組換え核酸配列によりコードされる。配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２もしくは８３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である配列に相補的な配列を含むか、そのような相補的な配列から本質的になるか、またはそのような相補的な配列からなる、核酸配列も、本開示の範囲内であることは、当業者には理解されるであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていてもよく、組換えであってもよく、および／または異種ヌクレオチド配列ともしくはＤＮＡライブラリー内で融合されていてもよい。

【0176】

他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２もしくは８３で指定されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２もしくは８３の相補配列、またはその断片と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができるだろう。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーより選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度を、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃での高ストリンジェンシー条件へと増大させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または温度もしくは塩濃度を、他方の変数は変化させて、一定に保持してもよい。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣ、続いて室温で２×ＳＳＣでの洗浄という、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。

【0177】

遺伝子コードの縮重に対して配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８２または８３で示されるような核酸とは異なる、単離された核酸も、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多くのトリップレットにより指定される。同じアミノ酸を規定するコドン、または同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３～５％以下）におけるこれらのバリエーションが、自然の対立遺伝子のバリエーションのために所与の種の個体間に存在し得ることを、当業者は理解するであろう。任意のおよびすべてのそのようなヌクレオチドのバリエーションならびに結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。

【0178】

ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適しているであろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび好適な制御配列が、様々な宿主細胞について当技術分野では公知である。典型的には、前記１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。当技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターが、本開示により企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターのエレメントを併せ持つハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は染色体内に挿入されることもある。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変わることになる。

【0179】

ある特定の態様では、対象核酸は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む、発現ベクター内に備えられている。制御配列は、当技術分野で認知されており、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントを含む。例示的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動的に連結したときそのＤＮＡ配列の発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれかをこれらのベクターにおいて使用して、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配列は、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α－接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが公知の他の配列、ならびにそれらの様々な組合せを含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプなどの因子に依存し得ることは理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによりコードされている任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮するべきである。

【0180】

本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物細胞）のどちらかまたは両方における発現に好適なベクターにライゲーションすることにより、産生させることができる。組換えＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む例えば、好適なベクターは、次のタイプのプラスミドを含む：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。

【0181】

一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの伝播を助長するための原核生物配列と、真核細胞において発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞と真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を助長するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子療法送達系の説明の中で見つけることができる。プラスミドの調製の際および宿主生物の形質転換の際に利用される様々な方法が、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方についての他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順について［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年］。一部の事例では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β－ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）を含む。

【0182】

好ましい実施形態では、ベクター、例えば、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）は、ＣＨＯ細胞における対象ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生用に設計されることになる。明らかであろうが、対象遺伝子構築物を使用して、精製のために、培養で繁殖された細胞において対象ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を生じさせて、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む、タンパク質を産生させることができる。

【0183】

本開示は、対象ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの１つまたは複数についてのコード配列を含む組換え遺伝子がトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は、いずれの原核または真核細胞であってもよい。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母、または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系］において発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。

【0184】

したがって、本開示は、対象ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを産生させる方法に、さらに関する。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞を、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を起こさせるのに適切な条件下で、培養することができる。ポリペプチドを分泌させ、細胞とポリペプチドを含有する培地との混合物から単離することができる。あるいは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、回収して溶解した細胞から得られる細胞質画分または膜画分から単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当技術分野において周知である。対象ポリペプチドは、当技術分野において公知のタンパク質精製技術を使用して、細胞培地、宿主細胞、または両方から単離することができ、そのようなタンパク質精製技術は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いる免疫親和性精製、ならびにＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合したドメインと結合する薬剤を用いる親和性精製（例えば、プロテインＡカラムが、ＡＬＫ４－Ｆｃおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を精製するために使用され得る）を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を助長するドメインを含有する融合タンパク質である。

【0185】

一部の実施形態では、精製は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成される。ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて精製を完了することができよう。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにそれらの融合タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより判定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度に、およびＳＤＳ ＰＡＧＥにより判定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度に精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）、およびヒトにおいて所望の結果を達成するのに十分であるレベルであるべきである。

【0186】

別の実施形態では、組換えＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ^２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その場合、精製リーダー配列を、その後、エンテロキナーゼでの処置により除去して、精製されたＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにそれらのヘテロ多量体を得ることができる［Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７年）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８巻：８９７２頁］。

【0187】

融合遺伝子を作製する技術は、周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、従来の技術に従って、ライゲーションのために平滑末端または付着末端を利用して、適切な末端をもたらすために制限酵素消化を利用して、付着末端の埋め込みを適宜利用して、望ましくない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処置を利用して、および酵素的ライゲーションを利用して行われる。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、２つの連続した遺伝子断片をアニールして、キメラ遺伝子配列を生成することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照されたい。
４．例示的な治療使用

【0188】

ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドの異常な活性に関連する疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。これらの疾患、障害または状態は、一般に、本明細書では「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連障害」と称される。ある特定の実施形態では、本開示は、個体におけるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする個体に治療有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することによる方法を提供する。「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書を通して置き換え可能である。本開示のいずれのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体も、本明細書で開示される治療使用のために個々にまたは組み合わせて利用することができる可能性がある。これらの方法は、例えば齧歯類、霊長類およびヒトを含む哺乳動物の治療的および予防的処置を特に目的とする。

【0189】

本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計学的試料において、未処置対照試料と比較して処置試料において障害または状態の発生率を低下させる、あるいは未処置対照試料と比較して障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか、または症状の重症度を低下させる化合物を指す。「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、一旦確立された状態の改善または除去を含む。いずれにせよ、予防または処置は、医師または他の医療提供者により提供される診断、および治療剤の投与についての意図した結果で識別され得る。

【0190】

一般に、本開示に記載の疾病または状態の処置または予防は、本開示の、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を「有効量」で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起するその薬剤の能力によって変わり得る。「予防有効量」は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。

【0191】

天然に存在するＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体－リガンド複合体は、組織成長はもちろん、初期発生過程、例えば様々な構造の適切な形成にも、または性発達、下垂体ホルモン産生ならびに骨および軟骨の生成を含む、１つもしくは複数の発生後の能力にも、不可欠な役割を果す。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、異常な組織成長および発達異常を含むが、これらに限定されない。加えて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、炎症、アレルギー、自己免疫疾患および腫瘍などの、細胞増殖および分化の障害を含むが、これらに限定されない。

【0192】

例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮症）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニア、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、成人発症型糖尿病）、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、筋変性および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）、ならびに免疫障害（例えば、リンパ球の異常な増殖または機能に関連する障害）を含む。

【0193】

一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症）である。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、肺線維症である。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、次のうちのいずれか１つにより引き起こされる：珪肺症、石綿肺、ベリリウム肺症、過敏性肺炎、薬物使用（例えば、抗生物質、化学療法薬、抗不整脈剤、スタチン）、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、感染症（例えば、非定型肺炎、ニューモシスチス肺炎、結核、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、および／もしくは呼吸器合胞体ウイルス）、癌性リンパ管症、喫煙、または発達障害。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症、ハーマン・リッチ症候群、および／または抗シンセターゼ症候群）である。特定の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性肺線維症である。一部の実施形態では、特発性肺線維症の処置は、さらなる治療剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ピルフェニドン、Ｎ－アセチルシステイン、プレドニゾン、アザチオプリン、ニンテダニブ、これらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0194】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、筋ジストロフィーの処置の一部として使用することができる。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋ならびに時には心筋および呼吸筋の漸進的衰弱および低下を特徴とする変性筋疾患群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化で始まる進行性筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が徐々に変性するにつれて、その人の筋力が低下する。対象ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を含むレジメンで処置することができる例示的な筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エミリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー・デジュリン型としても公知）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としても公知）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）を含む。

【0195】

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代にフランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこのバリアントを最初に記載したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒにちなんで名付けられたものである。ＤＭＤは、男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、男児３，５００名に１名が発症する。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が欠損している場合に起こる。男性は、Ｘ染色体のコピーを１つしか保有しないので、ジストロフィンのコピーを１つしか有さない。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は、収縮および弛緩のサイクル中に容易に損傷される。この疾患の早期の間は、筋肉は再生により代償するが、後になると、筋肉前駆細胞は進行中の損傷についていくことができず、健常な筋肉は非機能性線維脂肪組織に置き換えられる。

【0196】

ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における種々の突然変異の結果として生じる。ＢＭＤ患者は、多少のジストロフィンを有するが、それは、不十分な量であるか、または質が悪い。多少のジストロフィンの存在は、ＢＭＤを有する患者の筋肉を、ＤＭＤを有する患者の筋肉ほど重度にまたは急速に変性しないように保護する。

【0197】

動物での研究は、ＧＤＦ８シグナル伝達経路の阻害が、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者における疾患の様々な態様を有効に処置し得ることを示す（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ ４２０巻：４１８～４２１頁；Ｐｉｓｔｉｌｌｉら、２０１１年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７８巻：１２８７～１２９７頁）。したがって、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ＧＤＦ８阻害剤（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者においてｉｎ ｖｉｖｏでＧＤＦ８および／または関連ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによるシグナル伝達を遮断する代替手段となり得る。

【0198】

同様に、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、筋肉成長を必要とする他の疾患状態において筋肉量を増加させるための有効な手段となり得る。例えば、ルー・ゲーリック病または運動ニューロン疾患とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、骨格筋収縮の開始に必要な中枢神経系の成分である運動ニューロンを攻撃する、慢性、進行性かつ不治のＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンが劣化して最終的には死滅し、人の脳は通常は十分に機能および警告し続けるが、筋収縮の開始は脊髄レベルで遮断される。ＡＬＳを発症する個体は、典型的には４０～７０歳の間であり、変性する最初の運動ニューロンは、腕または脚の神経を支配するものである。ＡＬＳを有する患者は、歩行が困難であることがあり、物を落とすことがあり、転倒することがあり、発語が不明瞭になることがあり、こらえきれずに笑うまたは泣くことがある。疾患が進行するにつれて、肢の筋肉が、廃用により萎縮し始める。筋力低下は、衰弱させることになり、患者は、最終的には、車椅子を必要とするか、または寝たきりになる。大部分のＡＬＳ患者は、呼吸不全がもとで、または肺炎のような人工呼吸器による補助の合併症がもとで、疾患発症から３～５年で死亡する。

【0199】

一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、皮膚筋炎、封入体筋炎または多発性筋炎などの、炎症性筋疾患／障害を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、炎症性筋疾患／障害は、皮膚筋炎である。一部の実施形態では、炎症性筋疾患／障害は、多発性筋炎である。一部の実施形態では、炎症性筋疾患／障害は、封入体筋炎である。一部の実施形態では、封入体筋炎は、遺伝性封入体筋炎である。一部の実施形態では、封入体筋炎は、孤発性封入体筋炎である。

【0200】

孤発性封入体筋炎は、自己免疫および変性過程に関連している。この障害は、概して、第一に５０歳より高齢である患者に現れ、主として男性に現れる。臨床的には、孤発性封入体筋炎は、大腿四頭筋および深屈筋の筋力低下および筋萎縮を特徴とする。多くの患者は、車椅子に依存することになり、症状発現の１０～１５年後には重度障害者になる。患者はまた、食道および咽頭筋罹患に起因して嚥下障害を示すことが多い。孤発性封入体筋炎の診断は、通常、血中クレアチンキナーゼレベル上昇、異常な心電図検査結果などの、因子の何らかの組合せに基づくか、または筋肉の炎症細胞浸潤、空胞変性および／もしくは異常なタンパク質のプラークを含むことを示す筋生検に基づく。

【0201】

ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体による筋肉量増加の促進は、筋消耗疾患に罹患している者にも恩恵をもたらす可能性がある。Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら（上掲）は、ＧＤＦ８発現が、ヒトの除脂肪体重と逆相関すること、およびＧＤＦ８遺伝子の発現増加が、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する男性の体重減少に関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全には除去しないにしても、緩和することができ、したがって、ＡＩＤＳ患者の生活の質を有意に向上させることができる。

【0202】

ＧＤＦ８機能の喪失は、栄養摂取量の減少のない脂肪減少にも関連する（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、上掲）ので、対象ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、さらに、肥満および２型糖尿病の発生を緩徐化および予防するための治療剤として使用することができる。

【0203】

がん食欲不振－悪液質症候群は、がんの最も衰弱性および致死性の高い態様の１つである。この症候群は、多くのタイプのがんの－死亡時にがん患者のおおよそ８０％に存在する－共通の特徴であり、生活の質不良および化学療法に対する応答不良の原因になるばかりでなく、同等の腫瘍を有するが体重減少のない患者で見出される生存期間より短い生存期間の原因にもなる。がんを有する患者において、発病前の体重の５パーセントより大きい不随意の体重減少が、６カ月以内に起こった場合、悪液質が概して疑われる。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗ならびに精神的苦痛を伴い、悪液質は、がんと宿主間の複雑な相互作用から生じる。がん悪液質は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変化に影響を与える。食欲不振は一般的であるとはいえ、食物摂取量減少単独ではがん患者に見られる体組成の変化を説明することができず、栄養摂取量を増加させることで消耗症候群を好転させることはできない。成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒト悪液質症候群に見られるものに類似した顕著な筋肉および脂肪減少を誘導することが判明した（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上掲）ので、対象ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、筋肉成長が所望される悪液質症候群の症状の予防、処置または緩和に有益に使用することができる。上記の筋肉喪失の予防、処置または緩和に有用なヘテロマー複合体の例は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。

【0204】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、骨および／もしくは軟骨形成を誘発する方法、骨量減少を予防する方法、骨石灰化を増加させる方法、骨の脱灰を予防する方法、ならびに／または骨密度を増加させる方法において、使用することができる。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、潜在性低骨密度と診断された患者において、骨粗鬆症の発症に対する防御対策として有用であり得る。

【0205】

一部の実施形態では、本開示の、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒に医療利用され得る。対象方法および組成物はまた、開放性骨折ばかりでなく非開放性骨折の整復の際にも、およびまた人工関節の固定の改善にも、予防的に使用され得る。骨形成剤により誘発される新規骨形成は、先天性である、外傷により誘発される、または腫瘍学的切除により引き起こされる、頭蓋顔面欠損の修復に有用であり、美容整形外科にも有用である。さらに、本発明の方法および組成物は、歯周病の処置において、および他の歯修復過程において使用することができる。ある特定の場合、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、造骨細胞を引きつけるための、造骨細胞の増殖を刺激するための、または造骨細胞の前駆細胞の分化を誘導するための環境に提供することができる。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、骨粗鬆症の処置にも有用であり得る。さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、軟骨欠損の修復、および変形性関節症の予防／好転に使用することができる。本明細書に記載の骨形成の誘発、骨量減少の予防、骨石灰化の増加、骨の脱灰の予防および／または骨密度の増加に有用なヘテロマー複合体の例は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。

【0206】

Ｒｏｓｅｎら（編集）Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（参照により本明細書に組み込まれる）は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体での処置の対象になり得る骨障害についての広範な論考を提供している。一部の事項は、本明細書で提供される。本発明の方法および組成物は、骨量減少を特徴とするまたは引き起こす状態、例えば、骨粗鬆症（二次性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常症、性ホルモン枯渇もしくは除去（例えば、アンドロゲンおよび／もしくはエストロゲン）、グルココルチコイド処置、関節リウマチ、重症熱傷、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、低リン血症、骨軟化症（腫瘍性骨軟化症を含む）、高リン血症、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能亢進症（家族性副甲状腺機能亢進症を含む）および偽性副甲状腺機能低下症、骨への腫瘍転移、腫瘍もしくは化学療法の結果としての骨量減少、骨および骨髄の腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）、虚血性骨障害、歯周病および口腔骨量減少、クッシング病、パジェット病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不全、腎尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症に適用することができる。本発明の方法および組成物は、偽関節骨折、別様に治りが遅い骨折、胎児および新生児骨異形成症（例えば、低カルシウム血症、高カルシウム血症、カルシウム受容体欠損およびビタミンＤ欠乏症）、骨壊死（顎の骨壊死を含む）ならびに骨形成不全症を含む、骨形成または治癒不全を特徴とする状態にも適用することができる。加えて、同化作用に起因して、そのようなアンタゴニストは、骨損傷または侵食に関連する骨痛を軽減することになる。骨吸収抑制作用の結果として、そのようなアンタゴニストは、異常骨形成の障害、例えば、骨芽球性腫瘍転移（例えば、原発性前立腺または乳がんに関連するもの）、骨原性骨肉腫、大理石骨病、進行性骨幹異形成症、骨内膜性骨増殖症、骨斑紋症、および流蝋骨症を処置するのに有用であり得る。処置することができる他の障害は、線維性異形成症および軟骨異形成症を含む。

【0207】

別の特定の実施形態では、本開示は、骨折あるいは軟骨および／もしくは骨欠損または歯周病に関連する他の状態を修復するための治療方法および組成物を提供する。本発明は、さらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物を提供する。創傷のタイプは、熱傷、切創および潰瘍を含むが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０１１０６を参照されたい。そのような組成物は、治療有効量の、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の少なくとも１つを、薬学的に許容されるビヒクル、担体またはマトリックスとの混合物で含む。

【0208】

一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、骨量減少を引き起こす状態、例えば、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不全、腎尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症に適用することができる。女性であること、低体重を有すること、およびセデンタリーライフスタイルにつながることが、骨粗鬆症（骨折リスクにつながる、骨塩密度の減少）のリスク因子であることは、一般に理解される。しかし、骨粗鬆症は、ある特定の医薬の長期使用の結果として生じることもある。薬物または別の医学的状態の結果として生じる骨粗鬆症は、二次性骨粗鬆症として公知である。クッシング病では、身体により産生される過剰量のコルチゾールが、骨粗鬆症および骨折をもたらす。二次性骨粗鬆症に関連する最も一般的な医薬は、副腎皮質ステロイド薬であり、これは、副腎により天然に産生されるホルモンであるコルチゾールのように作用する薬物群である。十分なレベルの甲状腺ホルモンが骨格の発達に必要とされるが、過剰な甲状腺ホルモンは、徐々に骨量を減少させ得る。アルミニウムを含有する制酸薬は、腎臓の問題を有する人々、特に、透析を受けている人々が高用量で摂取すると、骨量減少につながり得る。二次性骨粗鬆症を引き起こすことがある他の医薬は、てんかん発作を予防するために使用される、フェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）およびバルビツレート；一部の型の関節炎、がんおよび免疫障害のための薬物であるメトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置するために、および臓器移植患者において免疫系を抑制するために使用される薬物であるシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するために使用される黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；抗凝固薬であるヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）；ならびに高コレステロールを処置するために使用される、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）を含む。がん治療の結果として生じる骨量減少は、広く認知されており、がん治療関連骨量減少（ＣＴＩＢＬ）と称される。骨転移は、骨に空洞を生じさせることがあり、それらの空洞をＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体での処置により治すことができる。骨量減少は、歯肉の陥凹部にある細菌が毒素および有害酵素を産生する慢性感染症である歯肉疾患によっても引き起こされることがある。

【0209】

さらなる実施形態では、本開示は、異常なまたは望ましくない骨成長に関連する疾患または障害を処置するための方法および治療剤を提供する。例えば、先天性障害である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を有する患者は、生活の質に対して大きな影響を及ぼす、軟部組織において自然発症的にまたは組織外傷に応答して進行する異所性骨成長により苦しめられる。加えて、異常な骨成長は、人工股関節置換術後に起こることがあり、したがって、手術結果を損なわせ得る。これは、病的骨成長、ならびに対象方法および組成物が治療的に有用であり得る状況の、より一般的な例である。同方法および組成物は、他の形態の異常な骨成長（例えば、外傷、熱傷または脊髄傷害後の骨の病的成長）を処置するのに、および転移性前立腺がんまたは骨肉腫に関連して見られる異常な骨成長に関連する望ましくない状態を処置または予防するのにも有用であり得る。

【0210】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、がんを有する患者において骨形成を促進するために使用することができる。ある特定の腫瘍（例えば、前立腺、乳房、多発性骨髄腫、または副甲状腺機能亢進症の原因となる任意の腫瘍）を有する患者は、腫瘍誘発性骨量減少、骨転移および治療剤に起因する、骨量減少のリスクが高い。そのような患者を、骨量減少または骨転移の証拠の非存在下であっても、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体、または複合体の組合せで、処置することができる。患者を、骨量減少または骨転移の証拠についてモニターすることもでき、指標がリスク増大を示唆する場合であってもＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体で処置することができる。一般に、ＤＥＸＡスキャンが骨密度の変化を評定するために利用されるが、骨リモデリングの指標を使用して、骨転移の尤度を評定してもよい。血清マーカーをモニターしてもよい。骨型アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）は、骨芽細胞中に存在する酵素である。ＢＳＡＰの血中レベルは、骨転移および骨リモデリング増加をもたらす他の状態を有する患者において増加する。オステオカルシンおよびプロコラーゲンペプチドも、骨形成および骨転移に関連付けられる。前立腺がんにより引き起こされる骨転移を有する患者において、およびそれ程ではないが、乳がんからの骨転移において、ＢＳＡＰの増加が検出されている。ＢＭＰ７レベルは、骨に転移した前立腺がんでは高いが、膀胱、皮膚、肝臓または肺がんに起因する骨転移では高くない。Ｉ型カルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）は、骨吸収中に形成されるコラーゲンにおいて見出される架橋である。骨は、絶えず破壊され、再形成されるので、ＩＣＴＰは、全身で見出されるであろう。しかし、骨転移部位でのレベルは、正常な骨の領域より有意に高くなる。ＩＣＴＰは、前立腺、肺および乳がんに起因する骨転移において高レベルで見出された。別のコラーゲン架橋である、Ｉ型Ｎ末端テロペプチド（ＮＴｘ）は、骨代謝回転中にＩＣＴＰとともに産生される。ＮＴｘの量は、肺、前立腺および乳がんを含む多くの異なるタイプのがんにより引き起こされる骨転移において増加される。また、ＮＴｘのレベルは、骨転移の進行とともに増加する。したがって、このマーカーは、転移の検出にも、疾患の程度の測定にも、使用することができる。吸収についての他のマーカーは、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンを含む。吸収マーカーまたは骨転移マーカーの何らかの増加は、患者においてＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体での治療が必要であることを示す。

【0211】

別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常症（ＣＫＤ－ＭＢＤ）を有する患者において使用することができ、ＣＫＤ－ＭＢＤは、腎臓病から生じる、相互に関連する骨格障害と心血管障害とミネラル代謝障害についての広範な症候群である。ＣＫＤ－ＭＢＤは、腎性骨ジストロフィー（ＲＯＤ）と呼ばれることが多い様々な骨格病態を包含し、これは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体での処置の好ましい実施形態である。異なる病原因子の相対的寄与に依存して、ＲＯＤは、骨リモデリングの多様な病的パターンとして顕在化する（Ｒｏｓｅｎら（編集）Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、３４３～３４９頁におけるＨｒｕｓｋａら、２００８年、Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｂｏｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ （ＣＫＤ－ＭＢＤ））。その範囲の一端には、尿毒症性骨ジストロフィーおよび低い骨代謝回転を伴うＲＯＤがあり、これは、少ない活性リモデリング部位数、骨形成の顕著な抑制、および低い骨吸収を特徴とする。もう一方の端には、副甲状腺機能亢進症、高い骨代謝回転、および線維性骨炎を伴うＲＯＤがある。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体が、同化効果と骨吸収抑制効果の両方を発揮し得ることを考えると、これらの薬剤は、患者においてＲＯＤ病態範囲にわたって有用であり得る。

【0212】

本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、他の骨活性医薬剤と併せて投与することができる。併せての投与は、単一の共製剤の投与により遂行してもよく、同時投与により遂行してもよく、または別々の時点での投与により遂行してもよい。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、他の骨活性薬剤とともに投与されると、特に有利であり得る。患者は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の摂取と、カルシウムサプリメント服用、ビタミンＤ服用、適切な運動の実施、および／または、一部の場合、他の医薬の利用とを併せて行うことから恩恵を受けることができる。他の医薬の例は、ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモンおよびラロキシフェンを含む。ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲンおよびラロキシフェンは、骨リモデリングサイクルに影響を与え、骨吸収抑制薬として分類される。骨リモデリングは、骨吸収および骨形成という２つの異なるステージからなる。骨吸収抑制薬は、骨リモデリングサイクルの骨吸収部分を緩徐化するか、または停止させるが、このサイクルの骨形成部分を緩徐化しない。結果として、新たな形成が骨吸収より速い速度で継続し、骨密度が徐々に増加し得る。副甲状腺ホルモンの１形態であるテリパラチドは、骨リモデリングサイクルにおける骨形成の速度を増大させる。アレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防（１日に５ｍｇまたは週１回３５ｍｇ）と処置（１日に１０ｍｇまたは週１回７０ｍｇ）の両方に認可されている。アレンドロネートは、骨量減少を低減させ、骨密度を増加させ、脊椎、手首および股関節骨折のリスクを低下させる。アレンドロネートは、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期使用の結果としての男性および女性におけるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症の処置ならびに男性における骨粗鬆症の処置にも認可されている。アレンドロネート＋ビタミンＤは、閉経後の女性における骨粗鬆症の処置（週１回７０ｍｇ＋ビタミンＤ）に、および骨粗鬆症を有する男性における骨量を改善する処置に認可されている。イバンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。月１回のピル（１５０ｍｇ）として摂取する場合、イバンドロネートを毎月同じ日に摂取するべきである。イバンドロネートは、骨量減少を低減させ、骨密度を増加させ、脊椎骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。毎日（５ｍｇ用量）または週１回（３５ｍｇ用量、または３５ｍｇ用量とカルシウム）を摂取すると、リセドロネートは、骨量減少を緩徐化し、骨密度を増加させ、脊椎および非脊椎骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンまたはコルチゾン）の長期使用の結果として生じるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症を予防および／または処置するための男性および女性による使用にも認可されている。カルシトニンは、カルシウム制御および骨代謝に関与する、天然に存在するホルモンである。閉経してから５年を超えている女性では、カルシトニンは、骨量減少を緩徐化し、脊椎骨密度を増加させ、骨折に関連する疼痛を軽減し得る。カルシトニンは、脊柱骨折のリスクを低下させる。カルシトニンは、注射（１日に５０～１００ＩＵ）または鼻腔用スプレー（１日に２００ＩＵ）として利用可能である。

【0213】

患者はまた、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とさらなる骨活性薬とを併せて摂取することから恩恵を受けることができる。エストロゲン療法（ＥＴ）／ホルモン療法（ＨＴ）は、骨粗鬆症の予防に認可されている。ＥＴは、骨量減少を低減させ、脊椎と股関節の両方における骨密度を増加させ、閉経後の女性における股関節および脊椎骨折のリスクを低下させることが証明されている。ＥＴは、最も一般的には、１日におおよそ０．３ｍｇの低用量または１日におおよそ０．６２５ｍｇの標準用量を送達するピルまたは皮膚パッチの形態で投与され、７０歳を過ぎてから開始した場合でさえ有効である。エストロゲンは、単独で利用された場合、女性の子宮内膜のがん（子宮内膜がん）を発症するリスクを増加させることがある。このリスクをなくすために、医療提供者は、無傷の子宮を有する女性に、ホルモンプロゲスチンをエストロゲンと組み合わせて処方する（ホルモン補充療法またはＨＴ）。ＥＴ／ＨＴは、更年期症状を軽減し、骨の健康に対して有益な効果があることが証明されている。副作用は、膣出血、乳房圧痛、気分障害および胆嚢疾患を含み得る。ラロキシフェン、１日に６０ｍｇは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。ラロキシフェンは、エストロゲンの有益な効果を、それらの潜在的欠点を伴うことなく、提供するために開発されてきた、選択的エステロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）と呼ばれる薬物群からのものである。ラロキシフェンは、骨量を増加させ、脊椎骨折のリスクを低下させる。ラロキシフェンが、股関節および他の非脊椎骨折のリスクを低下させることができることを実証するためのデータは、まだ入手できない。副甲状腺ホルモンの１形態であるテリパラチドは、閉経後の女性および骨折リスクの高い男性における骨粗鬆症の処置に認可されている。この医薬は、新たな骨形成を刺激し、骨塩密度を有意に増加させる。閉経後女性では、脊椎、股関節、足、肋骨および手首において骨折低減が認められた。男性では、脊椎で骨折低減が認められたが、他の部位での骨折低減を評価するのに十分なデータはなかった。テリパラチドは、２４カ月以下の間、連日注射として自己投与される。

【0214】

他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、動物における体脂肪含量を制御するために、および体脂肪含量に関連する状態、特に、体脂肪含量に関連する健康を損なう状態を処置または予防するために使用することができる。本発明によれば、体重を制御する（調節する）ことは、体重を低下もしくは増加させること、体重増加率を低下もしくは上昇させること、または体重減少率を上昇もしくは低下させることを指すことができ、体重を積極的に維持することまたは有意に変化させないこと（例えば、そうしなければ体重を増加または減少させる可能性がある外的または内的影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することにより、体重を制御することに関する。

【0215】

一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、動物における体重を低下させるおよび／または体重増加を減少させるために、より詳細には、肥満のリスクがあるまたは肥満に罹患している患者において肥満を処置または改善するために使用することができる。別の特定の実施形態では、本発明は、体重を増加させることまたは保持することができない動物（例えば、消耗症候群を有する動物）を処置するための方法および化合物に関する。そのような方法は、体重および／またはボディマスを増加させるのに、あるいは体重および／またはボディマス減少を低減させるのに、あるいは望ましくない低い（例えば、不健康な）体重および／もしくはボディマスに関連する状態または望ましくない低い（例えば、不健康な）体重および／もしくはボディマスにより引き起こされる状態を改善するのに、有効である。加えて、高コレステロールの障害（例えば、高コレステロール血症または脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））を、本開示の、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体で処置することができる。

【0216】

他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、動物における体脂肪含量を制御するために、および体脂肪含量に関連する状態、特に、体脂肪含量に関連する健康を損なう状態を処置または予防するために使用することができる。本発明によれば、体重を制御する（調節する）ことは、体重を低下もしくは増加させること、体重増加率を低下もしくは上昇させること、または体重減少率を上昇もしくは低下させることを指すことができ、体重を積極的に維持することまたは有意に変化させないこと（例えば、そうしなければ体重を増加または減少させる可能性がある外的または内的影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することにより、体重を制御することに関する。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、肥満（例えば、腹部肥満）；過体重；インスリン抵抗性；メタボリックシンドロームおよび他の代謝性疾患または状態；脂質障害、例えば、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高脂血症、高トリグリセリド血症または脂質異常症；リポタンパク質異常；トリグリセリド減少；炎症（例えば、肝臓炎症および／もしくは脂肪組織の炎症）、脂肪肝疾患；非アルコール性脂肪肝疾患；高血糖症；耐糖能障害（ＩＧＴ）；高インスリン血症；高コレステロール（例えば、高ＬＤＬレベルおよび高コレステロール血症）；心血管疾患、例えば、冠動脈心疾患、うっ血性心不全を含む心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、アテローム動脈硬化症；動脈硬化症、および高血圧症；シンドロームＸ；血管再狭窄；ニューロパチー；網膜症；神経変性疾患；内皮機能不全；呼吸機能障害；膵炎；多嚢胞性卵巣症候群；尿酸レベル上昇；ヘモクロマトーシス（鉄過剰）；黒色表皮腫（皮膚の黒っぽい斑点）；もしくはがん（例えば、卵巣、乳、子宮内膜および結腸がん）；または上記疾患もしくは状態の１つもしくは複数に関連する別の障害／状態から選択される、障害または状態を処置または予防するために使用することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を使用して処置される疾患または状態は、過体重（例えば、≧２５ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩ）に関連するか、または過剰な体脂肪に関連する。

【0217】

一実施形態では、本開示は、体重を低下させる方法であって、体重を低下させることを望んでいる対象、またはそれを必要とする対象に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、過体重（例えば、前肥満）である。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２～２９．９ｋｇ／ｍ^２、３０ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、２５ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または２５ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、肥満している。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または３０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、病的に肥満している。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２～４５ｋｇ／ｍ^２、または４０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、おなかの脂肪および／または内臓脂肪を含む、腹部における過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれよりも多い胴囲／臀囲比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を単独で投与してもよく、または他のタイプの支持療法との併用療法として投与してもよい。例えば、一部の実施形態では、支持療法は、食事および／または運動である。

【0218】

一実施形態では、本開示は、体重増加を減少させる方法であって、体重増加を減少させることを望んでいる対象、またはそれを必要とする対象に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、過体重（例えば、前肥満）である。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２～２９．９ｋｇ／ｍ^２、３０ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、２５ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または２５ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、肥満している。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または３０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、病的に肥満している。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２～４５ｋｇ／ｍ^２、または４０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。

【0219】

過体重に関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、処置または予防を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も、提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、肥満である。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、インスリン抵抗性である。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、脂質異常症、高脂血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低い血清ＨＤＬレベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高い血清ＬＤＬレベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。ある特定の事例では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食事および／または運動の補助である。

【0220】

別の実施形態では、本開示は、過体重である対象の体重を低下させる方法を提供する。方法は、過体重対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ^２～２９．９ｋｇ／ｍ^２、３０ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、２５ｋｇ／ｍ^２～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または２５ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２、または２７～４０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、肥満している。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または３０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２）ＢＭＩを有する。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単独で投与されるか、または併用療法として投与される。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0221】

一実施形態では、本開示は、肥満している対象の体重を低下させる方法を提供する。方法は、対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または３０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、おなかの脂肪および／または内臓脂肪を含む、腹部における過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれよりも多い胴囲／臀囲比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0222】

別の実施形態では、本開示は、肥満、または肥満に関連する疾患もしくは状態を、処置および／または改善する方法であって、肥満している対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多いＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２、または３０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、病的に肥満している。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い身体ＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ^２～４５ｋｇ／ｍ^２、または４０ｋｇ／ｍ^２～５０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも４０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、おなかの脂肪および／または内臓脂肪を含む、腹部における過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれよりも多い胴囲／臀囲比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0223】

肥満に関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、処置または予防を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も、提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、脂質異常症、高脂血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低い血清ＨＤＬレベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高い血清ＬＤＬレベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、心血管疾患である。さらなる実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血圧調節機能障害、動脈硬化症、うっ血性心不全、アテローム動脈硬化症、冠動脈心疾患、または微小血管疾患である。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、肝疾患である。一実施形態では、処置または予防される肝疾患または状態は、ＮＡＦＬＤである。一実施形態では、肝疾患は、脂肪肝である。一実施形態では、肝疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、脂肪性肝炎、脂肪過多症、線維症および／または肝硬変の群から選択されるメンバーである。ある特定の事例では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0224】

別の実施形態では、本開示は、２型糖尿病、または糖尿病に関連する疾患もしくは状態を、処置、改善および／または予防する方法であって、２型糖尿病を有する対象、または２型糖尿病を発症するリスクがある対象に、有効量のヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ^２またはそれよりも多い（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ^２）ボディマスインデックスＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも４０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、おなかの脂肪および／または内臓脂肪を含む、腹部における過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれよりも多いＷＨＲを有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な体脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0225】

糖尿病に関連する疾患または状態を処置、改善または予防する方法であって、糖尿病を有する対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も、提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、脂質異常症、高脂血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低い血清ＨＤＬレベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高い血清ＬＤＬレベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、心血管疾患である。さらなる実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血圧調節機能障害、または動脈硬化症である。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、肝疾患である。別の実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、脂肪肝疾患、脂肪性肝炎、脂肪過多症、および／または肝硬変の群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、白内障、閉塞性睡眠時無呼吸、静脈炎、痛風、変形性関節症、胆嚢疾患、および高コレステロールからなる群から選択されるメンバーである。ある特定の事例では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。

【0226】

本開示は、対象における血中脂質プロファイルを向上させるための方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるまたはＨＤＬコレステロールレベルを上昇させるための方法を提供する。一実施形態では、対象は、脂質異常症を有する。別の実施形態では、対象は、上昇した血清脂質（例えば、コレステロール（高コレステロール血症）および／またはトリグリセリド（例えば、高トリグリセリド血症））を有する。一実施形態では、対象は、ＬＤＬ－Ｃ≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、または≧１６０ｍｇ／ｄＬを有する。一実施形態では、対象は、ＴＧ≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、≧１７０ｍｇ／ｄＬを有する。一実施形態では、血漿インスリンレベル上昇（高インスリン血症；例えば、＞２０ｕｇ／ｍｌの空腹時インスリンレベルが１００を超え得る）を有する。一部の実施形態では、対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。

【0227】

一実施形態によれば、本開示は、代謝性疾患もしくは障害、または代謝性疾患もしくは障害に関連する状態を、処置または予防する方法であって、それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、高血糖症（例えば、空腹状態で、または経口グルコース負荷試験中のグルコース投与後に、＞１３０ｍｇ／ｄＬ）である。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、脂質代謝疾患、障害または状態である。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、脂質異常症である。さらなる実施形態では、脂質代謝疾患、障害または状態は、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高トリグリセリドレベル、高脂血症、およびリポタンパク質異常から選択されるメンバーである。一実施形態では、対象は、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベルを有する。一実施形態では、対象は、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬの血清ＨＤＬレベルを有する。一実施形態では、対象は、血清ＬＤＬレベル≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬを有する。一実施形態では、対象は、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベルを有する。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、グルコース代謝疾患、障害または状態である。さらなる実施形態では、グルコース代謝疾患、障害または状態は、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、耐糖能障害（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、高尿酸レベル、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、ＮＡＳＨおよび多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置される対象は、高インスリン血症を有する。一実施形態では、処置される対象は、肥満している（例えば、対象は、腹部肥満を有する）。別の実施形態では、処置される対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。

【0228】

メタボリックシンドロームは、心疾患のリスクを増強する一連の障害を含む状態である。メタボリックシンドロームの主要構成要素は、過体重、心血管パラメーター（高血圧、脂質異常症、血中の高いトリグリセリドレベルおよび／もしくは低いＨＤＬレベル）、アテローム動脈硬化症、糖尿病、および／またはインスリン抵抗性である。これらの構成要素のいくつか、すなわちメタボリックシンドローム、を有する対象は、各々の構成要素がリスク因子ではあるが、心疾患に非常に罹患しやすい。本開示は、メタボリックシンドロームの上記構成要素のうちの１つ、２つ、３つまたはそれより多くを処置または予防するための方法であって、処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も提供する。

【0229】

加えて、心血管疾患または状態を処置、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法が、提供される。一実施形態では、処置、予防または改善される心血管疾患または状態は、アテローム動脈硬化症である。一実施形態では、処置、予防または改善される心血管疾患または状態は、高血圧症（例えば、安静状態で、血圧＞１３０／８０ｍｍＨｇ、または＞１４０／９０ｍｍＨｇ）である。一実施形態では、心血管疾患は、アテローム動脈硬化症（冠動脈心疾患）である。

【0230】

一実施形態では、本開示は、炎症性肝疾患または状態を処置および／または改善するための方法であって、それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、疾患または状態は、ＮＡＦＬＤである。さらなる実施形態では、疾患または状態は、脂肪肝である。さらなる実施形態では、疾患または状態は、脂肪過多症（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））である。さらなる実施形態では、疾患または状態は、アルコール性脂肪肝疾患である。

【0231】

本開示は、血糖管理を向上させる方法であって、処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も提供する。一実施形態では、投与される対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、投与される対象は、摂食２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。ある特定の事例では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、食事および／または運動の補助である。投与により、体重を低下させること、または肥満を処置することもできる。ある特定の事例では、対象は、２型糖尿病を有する。ある特定の事例では、対象は、２７～４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。ある特定の事例では、対象は、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。ある特定の事例では、対象は、少なくとも４０のＢＭＩを有する。ある特定の事例では、対象は、過体重である。ある特定の事例では、対象は、肥満している。血糖管理の向上は、混合食試験などの、当技術分野において公知の技術を使用して評定することができる。

【0232】

本開示は、対象における高血糖症または高血糖症に関連する状態を処置、予防または改善するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も提供する。一実施形態では、投与される対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、投与される対象は、摂食２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、処置、予防または改善の結果は、処置前の対象における血清中レベルと比較して、グルコースの血清中レベルの低下、トリグリセリドの血清中レベルの低下、インスリンの血清中レベルの低下、および／または非エステル型脂肪酸の血清中レベルの低下からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置、予防または改善の結果は、処置前の対象の体温と比較して約０．４℃～１℃の体温の上昇である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ処置は、対象の体重も低下させる。

【0233】

別の実施形態では、本開示は、対象における血漿インスリンレベルを低下させる方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、摂食２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、過体重である。一実施形態では、対象は、肥満している。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。

【0234】

本開示は、対象における高血糖症または高血糖症に関連する状態を処置、予防または改善するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法も提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、摂食２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、処置、予防または改善の結果は、処置前の対象における血清中レベルと比較して、グルコースの血清中レベルの低下、トリグリセリドの血清中レベルの低下、インスリンの血清中レベルの低下、および／または非エステル型脂肪酸の血清中レベルの低下からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置、予防または改善の結果は、処置前の対象の体温と比較して約０．４℃～１℃の体温の上昇である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は、対象の体重も低下させる。

【0235】

別の実施形態では、本開示は、対象における血漿インスリンレベルを低下させる方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、摂食２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、過体重である。一実施形態では、対象は、肥満している。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。

【0236】

別の実施形態では、本開示は、対象における肝疾患を処置、予防または改善する方法であって、肝疾患を有する対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、肝臓の炎症を有する。一実施形態では、対象は、ＮＡＦＬＤを有する。一実施形態では、対象は、脂肪肝を有する。別の実施形態では、対象は、ＮＡＳＨを有する。一実施形態では、対象は、脂肪肝を有する。別の実施形態では、対象は、アルコール性脂肪肝疾患を有する。一実施形態では、処置、予防または改善される肝疾患は、線維症、瘢痕、硬変、または肝不全である。別の実施形態では、処置、予防または改善される肝疾患は、肝がんである。一実施形態では、対象は、過体重である。別の実施形態では、対象は、肥満している。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。

【0237】

線維症は、臓器または組織内の細胞数の相対的低下と組み合わさった、コラーゲン繊維と細胞外基質の両方の過剰な沈着を一般に指す。この過程は、障害後の自然創傷治癒の重要な特徴であるが、線維症は、例えば肺、腎臓、肝臓、骨、筋肉および皮膚を含む、様々な組織および臓器における病的損傷につながり得る。線維症におけるＴＧＦ－ベータの役割は、広範に研究されている。しかし、例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびＧＤＦ８を含む、他のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドも、線維症に関係付けられている［Ｈｅｄｇｅｒら（２０１３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４巻：２８５～２９５頁；Ｈａｒｄｙら（２０１５年）９３巻：５６７～５７４頁；およびＣａｎｔｉｎｉら（２００８年）Ｊ Ｓｅｘ Ｍｅｄ ５巻：１６０７～１６２２頁］。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、線維症、特に、線維症関連障害および状態を処置するために使用することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）不全、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、ペイロニー病、肝線維症、ウイルソン病、グリコーゲン蓄積症（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰症、ゴーシェ病、ツェルベーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性の脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、縦隔線維症、腎性線維症、後腹膜線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、膵線維症および特発性肺線維症のうちの１つまたは複数を処置または予防するために使用することができる。

【0238】

腎臓は、毒素および老廃物濾過の責任を負うばかりでなく、体積、ｐＨバランス、電解質濃度および血圧を含む、血液の多くの特徴を維持する。これらの機能は、腎臓ネフロンの複雑な構造に、腎臓の様々な毛細血管を通る一定の血流に、および内分泌ホルモンを含む、体の他の部位からのシグナルによる腎臓の制御に、依存する。腎臓機能に関する問題は、直接的メカニズム（例えば、遺伝子欠陥、感染、または毒素への曝露）により、ならびに肥大および過剰濾過（それら自体、多くの場合、腎臓機能へのより直接的な侵襲の結果）のような、長期ストレス要因から漸進的に進行する間接的メカニズムにより、顕在化する。血液維持および老廃物排泄における腎臓の中心的役割のため、腎臓関連疾患の徴候は、多数あり、多様であり、それらは、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１８版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｙ．、１３部、２７７～２８９章において概説されている。

【0239】

本明細書に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、腎臓疾患モデルにおいて様々な有益な効果を有した。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体での処置は、片側性尿管閉塞を有する対象において腎臓組織損傷、炎症および線維症を軽減した。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体が、腎臓疾患の処置または予防、特に、例えば腎臓組織損傷、炎症および／または線維症を含む、腎臓疾患の様々な合併症（徴候）の処置または予防に使用することができることを示す。

【0240】

したがって、本発明の方法は、様々な腎臓関連疾患または状態に適用することができる。本明細書で使用される場合、「腎関連疾患または状態」は、腎臓または腎系を冒す任意の疾患、障害または状態を指すことができる。腎臓関連疾患または状態の例は、慢性腎臓疾患（または腎臓不全）、急性腎臓疾患（または腎臓不全）、原発性腎臓疾患、非糖尿病性腎臓疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化群、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人）多発性嚢胞腎臓疾患、常染色体劣性（小児）多発性嚢胞腎臓疾患、急性腎臓障害、ネフローゼ症候群、腎虚血、有足細胞疾患または障害、タンパク尿、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎臓病変、膠原病性脈管疾患、良性起立性（体位性）タンパク尿、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物による腎臓損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型グリコーゲン蓄積症、慢性腎臓疾患、慢性腎不全、低糸球体濾過量（ＧＦＲ）、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性の微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性同種移植腎症、腎毒性（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎毒性（ｒｅｎａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎臓壊死、腎臓損傷、糸球体および尿細管障害、腎臓機能障害、腎炎症候群、急性腎不全、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎臓移植拒絶反応、慢性腎臓移植拒絶反応、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後の糸球体腎炎、任意の種類の腎臓病変を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧、糖尿病、および自己免疫疾患）に関連する腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎臓疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、クリオグロブリン血症に関連する糸球体腎炎、ヘノッホ・シェーンライン病、感染後の糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体媒介性糸球体腎炎、アミロイドーシス、単クローン性免疫グロブリン沈着症、繊維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管障害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、中毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染症またはＨＩＶ感染症に起因するウイルス性感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合疾患、円柱腎症、尿酸塩、シュウ酸塩、または薬物誘導性の結晶沈着に起因し得る結晶性腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶反応、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患に起因する腫瘍浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管同種移植片拒絶反応、急性体液性同種移植片拒絶反応、早期腎機能低下（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、急性間質性腎炎、既往慢性腎臓疾患、腎動脈狭窄、虚血性腎症、尿毒症、薬物および毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流性腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎臓疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル・リンドウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質嚢胞性腎臓疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流障害、腎異形成、高窒素血症、両側動脈閉塞、急性尿酸腎症、血液量減少症、急性両側閉塞性尿路疾患、高カルシウム血症性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿閉、悪性腎硬化症、産後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー病の抗ＧＢＭ疾患、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鎮痛薬腎症、動静脈瘻、動静脈グラフト、透析、異所性腎臓、海綿腎臓、腎性骨ジストロフィー、単腎症、水腎症、微量アルブミン尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂質尿、アシドーシス、ならびに高カリウム血症、ならびに浮腫を含むが、これらに限定されない。

【0241】

一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患を処置または予防するために使用することができる。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患の１つまたは複数の合併症（症状または徴候）を処置または予防するために使用することができる。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、末期腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、末期腎臓不全を処置または予防するために使用することができる。慢性腎疾患としても公知の、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、何カ月もまたは何年もの期間をかけての漸進的腎機能喪失である。悪化する腎臓機能の症状は、全身の体調が優れないと感じること、および食欲低下を経験することを含み得る。多くの場合、慢性腎臓疾患は、高血圧または糖尿病を有する者およびＣＫＤを有する血縁者がいる者などの、腎臓の問題のリスクがあることが分かっている人々のスクリーニングの結果として診断される。この疾患は、その認知されている合併症の１つ、例えば、心血管疾患、貧血または心膜炎に至った場合に同定されることもある。最近の専門ガイドラインは、ＣＫＤの重症度を５ステージで分類し、ステージ１は、軽度で、通常はほとんど症状を生じさせず、ステージ５は、未処置の場合、平均余命の短い重病である。ステージ５のＣＫＤは、末期腎臓疾患、末期腎疾患、または末期腎臓不全と呼ばれることが多く、今や時代遅れの用語である慢性腎不全または慢性腎臓不全とおおむね同義であり、患者が、理想的には腎臓移植に相当するが透析の形態を含むこともある腎代替療法を必要とすることを、通常は意味する。ＣＫＤは、初期には特異的症状がなく、一般に、血清クレアチニンまたは尿中のタンパク質の増加としてしか検出されない。腎臓機能が低下するにつれて、様々な症状が、下記のように顕在化し得る。体液過剰、および腎臓によりレニン－アンジオテンシン系経由で生成される血管作用性ホルモンの産生に起因して、血圧が上昇されて、高血圧症を発症するリスクおよび／またはうっ血性心不全に罹患するリスクが上昇し得る。尿素が蓄積して、高窒素血症および最終的には尿毒症（嗜眠から心膜炎および脳症までの様々な症状）に至り得る。その高度な体循環に起因して、尿は、エクリン汗に高濃度で排泄され、汗が蒸発するにつれて皮膚上に晶出する（尿素霜）。カリウムが血中に蓄積し得る（倦怠感を含み、致死的な不整脈を含む可能性もある、様々な症状を伴う高カリウム血症）。高カリウム血症は、糸球体濾過量が、２０～２５ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満に降下する、腎臓がカリウムを排出する能力を低下させてしまうその時点まで、通常は発症しない。ＣＫＤにおける高カリウム血症は、酸性血（カリウムの細胞外移行につながる）により、およびインスリンの欠乏から、憎悪され得る。エリスロポエチン合成が減少されて、貧血を引き起こし得る。軽度水腫から致死性の肺水腫までの様々な体液体積過剰症状が起こり得る。リン酸塩排泄低下に起因する高リン血症が、一般に、糸球体濾過の減少後に起こり得る。血管石灰化への直接的刺激となる、高リン血症は、心血管リスク増加を伴う。低カルシウム血症が顕在化することもあり、これは、一般に、線維芽細胞増殖因子２３の刺激により引き起こされる。骨細胞は、酵素１－アルファ－ヒドロキシラーゼ（２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３への変換に関与する）の強力な阻害剤である、ＦＧＦ２３の産生増加に関与する。その後、これは、続発性副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、および血管石灰化へと進行し、血管石灰化は、さらに、心機能を損なわせる。代謝性アシドーシス（硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積に起因する）が起こり、酵素に対する過剰な酸の作用により酵素活性の変化を引き起こすことがあり、過剰な酸（酸性血）に起因する高カリウム血症の促進により心膜およびニューロン膜の興奮性の増大を引き起こすこともある。アシドーシスはまた、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力の低下に起因する。腎臓機能が低下するにつれて有病率が増加する、鉄欠乏性貧血は、血液透析を必要とする者に特に高頻度に見られる。鉄欠乏性貧血は、原因の点で多因子であるが、炎症増大、エリスロポエチンの低減、および高尿酸血症を含み、これらは骨髄抑制につながる。ＣＫＤを有する人々は、急速進行型アテローム動脈硬化症に罹患し、一般の人々よりも心血管疾患を発症する可能性が高い。ＣＫＤおよび心血管疾患に罹患している患者は、心血管疾患のみに罹患している者よりも予後が有意に悪い傾向がある。

【0242】

本明細書で使用される場合、「～と組み合わせて」、「～の組合せ」、または「併せての投与」は、さらなる治療（例えば、第２の治療、第３の治療、第４の治療など）が、体内でまだ有効である（例えば、複数の化合物が患者において同時に有効であり、これは、それらの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度と相関しないこともある。例えば、異なる治療用化合物を、同じ製剤でまたは別々の製剤で、同時にまたは逐次的に、および異なるスケジュールで投与することができる。したがって、そのような処置を受ける個体は、異なる治療の組み合わせられた効果からの恩恵を受けることができる。本開示の１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、１つもしくは複数の他のさらなる薬剤もしくは支持療法と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各治療剤は、その個々の薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。レジメンに用いられる特定の組合せは、本開示のアンタゴニストと治療の適合性、および／または所望されることを考慮に入れることになる。

【0243】

一部の実施形態では、患者が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、エテプリルセン、副腎皮質ステロイド薬（例えば、デフラザコート）、ステロイド（例えば、プレドニゾン）、血圧および／または心臓の薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ベータブロッカー、および利尿薬）、抗喘息薬（例えば、アルブテロール）、ビタミン／栄養素／抗酸化剤（例えば、アミノ酸、カルニチン、コエンザイムＱ１０、クレアチン、魚油、緑茶抽出物、ビタミンＥ）、外科手術、理学療法、幹細胞療法、遺伝子療法、補助換気、食事および／または運動のうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0244】

一部の実施形態では、患者が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、アルブテロール、言語療法、手術、歩行補助具、脊柱装具、Ｔ細胞阻害剤（例えば、短縮型ヒスチジル－ｔＲＮＡシンテターゼ）、幹細胞療法、遺伝子療法、および／または足部支持デバイスのうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0245】

一部の実施形態では、患者が、筋萎縮性側索硬化症を有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、リルゾール、エダラボン、マシチニブ、抗酸化剤、理学療法、言語療法、栄養補給、呼吸補助（例えば、非侵襲的人工呼吸器）、幹細胞療法、および／または遺伝子療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0246】

一部の実施形態では、患者が、孤発性封入体筋炎を有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、副腎皮質ステロイド薬、プレドニゾン、オキサンドロロン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、静脈内免疫グロブリン、ベータインターフェロン－１ａ、エタネルセプト、アレムツズマブ、フォリスタチン、リチウム、ビマグルマブ、アリモクロモル、ラパマイシン、抗酸化剤、カルニチン、コエンザイムＱ１０、理学療法、作業療法、幹細胞療法、および／または遺伝子療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0247】

一部の実施形態では、患者が、アルポート症候群を有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、ベナゼプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｏｐｒｉｌ）、ラミプリル（ｒａｍａｐｒｉｌ）およびキナプリル）、アンジオテンシン受容体遮断薬（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン（ｅｐｒｅｓａｒｔａｎ）、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタンおよびバルサルタン）、スタチン（例えば、フルバスタチン）、非ジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬（例えば、ジルチアゼム）、シクロスポリン、および／またはアルドステロン阻害剤のうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0248】

一部の実施形態では、患者が、サルコペニアを有する場合、本明細書で開示されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のいずれかを、ウロコルチンＩＩ、ホルモン補充療法（例えば、テストステロンまたはヒト成長ホルモン）、クレアチン、ビタミンＤ、運動、食事、および／または筋力トレーニングのうちの１つまたは複数と組み合わせて、投与することができる。

【0249】

肺高血圧症（ＰＨ）は、以前は原発性（特発性）または続発性として分類されていた。最近、世界保健機関（ＷＨＯ）は、肺高血圧症を５群に分類した：第１群：肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）；第２群：左心疾患による肺高血圧症；第３群：肺疾患および／または低酸素血症による肺高血圧症；第４群：慢性血栓性および／または塞栓性疾患に起因する肺高血圧症；および第５群：種々の状態（例えば、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、リンパ管腫症および肺血管圧迫）。例えば、Ｒｕｂｉｎ（２００４年）Ｃｈｅｓｔ １２６巻：７～１０頁を参照されたい。

【0250】

ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させる（例えば、肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはそれらの進行速度および／もしくは重症度を低下させる）方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、肺動脈性肺高血圧症を有する、肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、左心疾患による肺高血圧症を有する、肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、肺疾患および／または低酸素血症を有する、肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、慢性血栓性および／または塞栓性疾患を有する、肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、またはリンパ管腫症および肺血管圧迫を有する、肺高血圧症患者に関する。

【0251】

肺動脈性肺高血圧症は、肺動脈の顕著な血管狭窄および肺動脈壁の平滑筋細胞の異常増殖を特徴とする、肺血管系の重篤な、進行性かつ致死性の疾患である。肺における血管の重度狭窄は、非常に高い肺動脈圧をもたらす。これらの高い圧力は、心臓が血液を酸素化するために肺に送り出すことを困難にする。ＰＡＨを有する患者は、心臓がこれらの高い圧力に対抗して必死に送り出そうとするので、極度の息切れに苦しむ。ＰＡＨを有する患者は、概して、肺血管抵抗（ＰＶＲ）の有意な上昇および肺動脈圧（ＰＡＰ）の持続的上昇を起こし、最終的には、右室不全および死に至る。ＰＡＨと診断された患者は、予後が不良であり、同時に生活の質も損なわれ、未処置の場合、平均余命は、診断時期から２～５年である。

【0252】

血管リモデリング（すなわち、増生）の一因となり得る肺細胞の増殖を含む、様々な因子が、肺高血圧症の病態の一因となる。例えば、肺血管リモデリングは、肺高血圧症を有する患者の動脈内皮細胞および平滑筋細胞の増殖によって、主として起こる。様々なサイトカインの過剰発現が肺高血圧症を促進すると考えられている。さらに、肺高血圧症は肺動脈平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｃｅｌｌｓ）および肺内皮細胞の過剰増殖から生じ得ることが判明した。なおさらに、進行ＰＡＨは、遠位肺細動脈の筋性化、求心性内膜肥厚、および増殖性内皮細胞による血管腔の閉塞を特徴とし得る。Ｐｉｅｔｒａら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．、４３巻：２５５～３２５頁（２００４年）。

【0253】

ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させる（例えば、肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはそれらの進行速度および／もしくは重症度を低下させる）方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含み、該患者が、少なくとも２５ｍｍ（例えば、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｍＨｇ）の安静時肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する、方法に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも２５ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも３０ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも３５ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも４０ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも４５ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも５０ｍｍＨｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。

【0254】

一部の実施形態では、本開示は、ＰＨ患者における１つまたは複数の血行動態パラメーターを、より正常なレベル（例えば、同様の年齢および性別の健常な人々と比較して正常）を目指して調整する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ＰＡＰを低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも３ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも５ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも７ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１０ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１２ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１５ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも２０ｍｍＨｇ低下させることに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも２５ｍｍＨｇ低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺血管抵抗（ＰＶＲ）を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺毛細血管楔入圧（ＰＣＷＰ）を上昇させることに関する。一部の実施形態では、方法は、左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）を上昇させることに関する。

【0255】

ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはそれらの進行速度および／もしくは重症度を低下させる方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における細胞増殖を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における平滑筋および／もしくは内皮細胞増殖を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における血管新生を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の身体活動を増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における呼吸困難を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における胸痛を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における疲労を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における肺線維症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における線維症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における肺血管リモデリングを処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者における右室肥大を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させることに関する。

【0256】

ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を有する患者における運動能力を増加させる方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含む方法に関する。運動能力についての任意の好適な評価基準を使用することができる。例えば、対象が６分間にどれ程の距離を歩くことができるのか、すなわち、６分間歩行距離（６ＭＷＤ）を測定する、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）での運動能力は、肺高血圧症の重症度および疾患進行を評定するために使用されることが多い。Ｂｏｒｇ呼吸困難指数（ＢＤＩ）は、知覚される呼吸困難（呼吸に伴う不快感）を評定するための数値尺度である。ＢＤＩは、息切れ度、例えば、６ＭＷＴ完了後の息切れ度を測定するものであり、０のＢＤＩは、息切れがないことを示し、１０は、最大の息切れを示す。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも１０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも２０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも３０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも４０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも５０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも６０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも７０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも８０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも９０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者における６ＭＷＤを少なくとも１００メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも０．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも１インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも１．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも２インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも２．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも３インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも３．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも４インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも４．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも５．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも６インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも６．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも７インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも７．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも８インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも８．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも９インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも９．５インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを少なくとも３インデックスポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＢＤＩを１０インデックスポイント低下させることに関する。

【0257】

ベースラインでの肺高血圧症は、例えば、肺高血圧症を有する患者の疾患重症度の測定基準である世界保健機構（ＷＨＯ）機能クラスにより測定して、軽度、中等度または重度であり得る。ＷＨＯ機能分類は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）システムの改作であり、例えば疾患進行および処置への応答のモニタリング時に、活動耐性を定性的に評定するために日常的に使用される（Ｒｕｂｉｎ（２００４年）Ｃｈｅｓｔ １２６巻：７～１０頁）。４つの機能クラスがＷＨＯシステムにおいて認定されている：クラスＩ：身体活動を制限することにならない肺高血圧症；通常の身体活動によって過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛、または失神寸前状態にならない；クラスＩＩ：身体活動をわずかに制限することになる肺高血圧症；患者は安静時には快適である；通常の身体活動によって過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛、または失神寸前状態になる；クラスＩＩＩ：身体活動を著しく制限することになる肺高血圧症；患者は安静時には快適である；通常よりも少ない活動によって過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛、または失神寸前状態になる；クラスＩＶ：前兆なく、あらゆる身体活動を実施することができなくなる肺高血圧症；患者は右心不全の兆候を明示する；安静時でも呼吸困難および／または疲労が存在し得る；あらゆる身体活動によって不快感が増大する。

【0258】

ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させる（例えば、肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはそれらの進行速度および／もしくは重症度を低下させる）方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与することを含み、該患者が、ＷＨＯによる認定に従ってクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、またはクラスＩＶ肺高血圧症を有する、方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従ってクラスＩ肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従ってクラスＩＩ肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩ肺高血圧症からクラスＩＩ肺高血圧症への患者の進行を予防することまたは遅らせることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＩ肺高血圧症からクラスＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従ってクラスＩＩＩ肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＩ肺高血圧症からクラスＩＩＩ肺高血圧症への患者の進行を予防することまたは遅らせることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＩＩ肺高血圧症からクラスＩＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＩＩ肺高血圧症からクラスＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従ってクラスＩＶ肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＩＩ肺高血圧症からクラスＩＶ肺高血圧症への患者の進行を予防することまたは遅らせることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＶ肺高血圧症からクラスＩＩＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＶ肺高血圧症からクラスＩＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによる認定に従って、クラスＩＶ肺高血圧症からクラスＩ肺高血圧症への患者の退行を促進または増進することに関する。

【0259】

肺高血圧症には公知の治療法がなく、現行の処置方法は、患者の寿命を延ばすこと、および患者の生活の質を向上させることに重点を置いている。肺高血圧症の現行の処置方法は、血管拡張薬、例えば、プロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィル；エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えば、ボセンタン；カルシウムチャネル遮断薬、例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン；抗凝固薬、例えば、ワルファリン、ならびに利尿薬の投与を含む。肺高血圧症の処置はまた、酸素療法、心房中隔裂開術、肺血栓内膜摘除術、ならびに肺および／または心臓移植を使用して行われている。しかし、これらの方法の各々には、有効性の欠如、重篤な副作用、低い患者コンプライアンスおよび高額な費用を含み得る、１つまたは複数の欠点がある。ある特定の態様では、方法は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低下させる（例えば、肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはそれらの進行速度および／もしくは重症度を低下させる）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数のさらなる活性薬剤および／または支持療法（例えば、血管拡張薬、例えば、プロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィル；エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えば、ボセンタン；カルシウムチャネル遮断薬、例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン；抗凝固薬、例えば、ワルファリン；利尿薬；酸素療法；心房中隔裂開術；肺血栓内膜摘除術；ならびに肺および／または心臓移植）；ＢＭＰ９ポリペプチド；ＢＭＰ１０ポリペプチド；バルドキソロンメチルまたはその誘導体；オレアノール酸またはその誘導体と組み合わせて投与すること（例えば、同時にまたは異なる時点で投与されるが、一般に、薬理学的／生理学的効果の重複を達成するような様式で投与される）を含む方法に関する。
５．医薬組成物

【0260】

ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を単独で投与することができ、または医薬製剤の成分（治療用組成物もしくは医薬組成物とも称される）として投与することができる。医薬製剤は、含有する活性成分（例えば、本開示の薬剤）の生物活性が有効であることを可能にするような形態である調製物であって、その製剤が投与されることになる対象に許容され難いほど毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。対象化合物は、ヒト医学または獣医学において使用するための任意の適便な方法での投与のために製剤化することができる。例えば、本開示の１つまたは複数の薬剤を、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学的に許容される担体は、活性成分以外の医薬製剤中の成分であって、対象にとって一般的に非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤および／または保存料を含むが、これらに限定されない。一般に、本開示での使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質不含の生理的に許容される形態である。上記の製剤に任意選択で含めることができる、本明細書に記載されるもの以外の治療的に有用な薬剤を、本開示の方法で対象薬剤と組み合わせて投与することができる。

【0261】

ある特定の実施形態では、組成物は、非経口的に［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射または皮内注射により］投与されることになる。非経口投与に好適な医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用直前に再構成して滅菌注射用溶液または分散液にすることができる滅菌粉末と組み合わせて、本開示の１つまたは複数の薬剤を含み得る。注射用溶液または分散液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、または製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤に利用することができる好適な水性または非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびそれらの好適な混合物を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング材（例えば、レシチン）の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。

【0262】

一部の実施形態では、本開示の治療方法は、埋込物またはデバイスからの医薬組成物の全身または局所投与を含む。さらに、医薬組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）への送達のための形態に封入または注入することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、本開示の薬剤の１つまたは複数を標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に送達することができ、発達中の組織に構造を持たせることができ、最適には体内に再吸収され得る、マトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、本開示の１つまたは複数の薬剤の徐放をもたらすことができる。そのようなマトリックスを、他の埋込み型医療用途に現在使用されている材料で形成することができる。

【0263】

マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、審美的外観、および界面特性のうちの１つまたは複数に基づき得る。対象組成物の特定の用途により、適切な製剤が規定されることになる。可能性のある組成物用マトリックスは、生分解性で化学的に定義されている硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、例えば、骨および真皮コラーゲンを含む、生分解性で生物学的に明確に定義されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質成分で構成されている。他の可能性のあるマトリックスは、例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスを含む、非生分解性で化学的に定義されているものである。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムを含む、上述のタイプの材料のいずれの組合せで構成されていてもよい。バイオセラミックスは、組成を変化させることができ（例えば、アルミン酸カルシウム－リン酸カルシウム）、ならびに細孔経、粒径、粒子の形状、および生分解性の１つまたは複数を変化させるように加工することができる。

【0264】

ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を局所投与することができる。「局所適用」または「局所的に」は、医薬組成物と、例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜を含む体表との接触を意味する。局所医薬組成物は、様々な適用形態を有することができ、組成物の局所投与時に組織付近に配置されるようにまたは組織と直接接触している状態になるように適合された薬物含有層を概して含む。局所投与に好適な医薬組成物は、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペースト、パテ、半固体または固体として製剤化された組合せでの本開示の１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を含み得る。液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペーストまたはパテ形態の組成物は、標的組織上に組成物を塗り広げる、噴霧する、塗り付ける、軽く塗る、またはローラーで延ばすことにより、適用することができる。組成物を滅菌包帯材、経皮パッチ、ギプスおよび絆創膏に含浸させることもできる。パテ、半固体または固体形態の組成物は、変形可能であり得る。それらは、弾性または非弾性（例えば、可撓性もしくは剛性）であり得る。ある特定の態様では、組成物は、複合剤の一部を構成し、繊維、微粒子、または同じもしくは異なる組成を有する複数の層を含み得る。

【0265】

液体形態の局所組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液を含み得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水もしくは他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む、当技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤を含有し得る。

【0266】

局所ゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固体または固体組成物は、１つまたは複数の増粘剤、例えば、多糖類、合成ポリマーまたはタンパク質に基づくポリマーを含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書でのゲル化剤は、好適には非毒性であり、所望の粘度をもたらすものである。増粘剤は、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ－ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、プルロニック、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノースまたはラクトース）で置換されているポリアクリレート、アクリルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖類、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、変性セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアー、カラゲナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、加工デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ゴム、ヒアルロナン（ｈｙｌａｒｏｎａｎｓ）、ヒドロゲル、ゼラチン、グルコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン・アクリロニトリルグラフトコポリマー、デンプンポリアクリル酸ナトリウム、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシルエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、スルホン化ヒドロゲル、ＡＭＰＳ（２－アクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（メタクリル酸スルホエチル）、ＳＰＭ（メタクリル酸スルホプロピル）、ＳＰＡ（アクリル酸スルホプロピル）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－メタクリルオキシエチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ）アミドプロピル－ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸－ビス（１－プロピルスルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｚａｃｉｄ）－３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３－アクリルアミド－３－メチルブタン酸）、ベータ－カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、および無水マレイン酸－メチルビニルエーテルポリマー、これらの誘導体、これらの塩、これらの酸、ならびにこれらの組合せのポリマー、コポリマー、および単量体を含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、所定量の本開示の化合物および任意選択で１つまたは複数の他の活性成分を各々が含有する、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、薬用キャンディー（スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガントなどの着香基剤を使用する）、粉末、顆粒、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型もしくは油中水型液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤を使用する）、および／またはマウスウォッシュの形態で、経口投与することができる。本開示の化合物および任意選択で１つまたは複数の他の活性成分を、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。

【0267】

経口投与のための固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末および顆粒）では、本開示の１つまたは複数の化合物は、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴム）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯またはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、およびこれらの混合物を含む、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合され得る。カプセル、錠剤およびピルの場合、医薬製剤（組成物）は、緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物を、例えば、ラクトースまたは乳糖はもちろん高分子量ポリエチレングリコールも含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することもできる。

【0268】

医薬組成物の経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含み得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水もしくは他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む、当技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口製剤は、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤、保存剤、およびこれらの組合せを含む、アジュバントも含むことができる。

【0269】

懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカント、およびこれらの組合せを含む、懸濁化剤を含有し得る。

【0270】

微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸を含む、様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることにより確保することができる。

【0271】

ある特定の実施形態では、組成物に、例えば糖または塩化ナトリウムを含む等張剤を含めることが望ましいことがある。加えて、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅らせる薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の持続的吸収をもたらすことができる。

【0272】

投薬量レジメンが、本開示の薬剤の１つまたは複数の作用を修飾する様々な因子を考慮して担当医により決定されることになることは理解される。赤血球形成を促進するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の場合、様々な因子は、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、患者の食事、赤血球レベル低下の一因となり得る任意の疾患の重症度、投与の回数、および他の臨床学的因子を含み得るが、これらに限定されない。最終組成物への他の公知の活性薬剤の添加も、投薬量に影響を与え得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血過程の他の指標のうちの１つまたは複数の定期的評定により、進展をモニターすることができる。

【0273】

ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の薬剤の１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法も提供する。そのような療法は、上記に列挙されたような障害の１つまたは複数を有する細胞または組織への薬剤配列の導入により、その治療効果を達成することになる。薬剤配列の送達は、例えば、キメラウイルスまたはコロイド分散系などの、組換え発現ベクターを使用することにより、達成することができる。本開示の薬剤配列の１つまたは複数の好ましい治療的送達は、標的化リポソームの使用である。

【0274】

本明細書で教示されるような遺伝子療法に利用することができる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）を含む。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの派生物であってもよい。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これらに限定されない。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターのすべてが、選択マーカー用の遺伝子を移入するまたは組み込むことができ、その結果、形質導入された細胞を同定および生成することができる。例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることにより、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することにより遂行される。特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入して、またはウイルス包膜に結合させて、本開示の薬剤の１つまたは複数を含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを、当業者は認識するであろう。

【0275】

あるいは、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを組織培養細胞に直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞に、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドがトランスフェクトされる。得られた細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。

【0276】

本開示の薬剤の１つまたは複数のための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系を含む。ある特定の実施形態では、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および無傷のウイルス粒子を水性内部に封入し、生物活性形態で細胞に送達することができる［Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、６巻：７７頁］。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入方法は、当技術分野において公知である［Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年］。

【0277】

リポソームの組成は、通常、ステロイド（例えば、コレステロール）含み得るリン脂質の組合せである。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む、他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づく、リポソームの標的化も可能であり、当技術分野において公知である。
参照による組み入れ

【0278】

本明細書において言及されるすべての公表文献および特許は、個々の公表文献または特許の各々が参照により組み入れられていると具体的にかつ個々に示されているかのごとく、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0279】

主題についての特定の実施形態を論じてきたが、上記明細書は、説明に役立つものであり、限定的なものではない。本明細書および下記の請求項を再考することにより、多くの変形形態が当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、請求項をそれらの等価物の全範囲とともに、および本明細書をそのような変形形態とともに参照することにより、決定されるべきものである。

【実施例】

【0280】

ここで、本発明を一般的に記載し、単に、ある特定の実施形態および本発明の実施形態の例示のために含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されるであろう。
（実施例１）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の生成

【0281】

細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてそれぞれ別々にＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は以下に提供される。

【0282】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃまたはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体複合体とは反対に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進するための方法論は、非対称ヘテロマー複合体の形成を誘導するためにＦｃドメインのアミノ酸配列中に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なる手法が本開示に記載される。

【0283】

それぞれ、配列番号３９～４１および４２～４４のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列に例示される、１つの手法では、一方のＦｃドメインを相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３８）を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号３９）を、以下に示す：

【化32】

【0284】

リーダー（シグナル）配列およびリンカーは、下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号３９のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号４０）によってコードされる：

【化33】

【0285】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。

【化34】

【化35】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４２）は、以下の通りである：

【化36】

【0286】

リーダー配列およびリンカーは、下線付きである。上記の配列番号３９および４１のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して提供することができる。
このＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号４３）によってコードされる：

【化37】

【化38】

【0287】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４４）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して提供することができる。

【化39】

【0288】

それぞれ、配列番号４１および配列番号４４のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。

【0289】

非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、それぞれ、配列番号４５～４６および４７～４８のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列中に例示されるように、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３８）を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４５）を、以下に示す：

【化40】

【化41】

リーダー（シグナル）配列およびリンカー配列は、下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４５のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りである：

【化42】

【0290】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４７）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。

【化43】

【0291】

リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号４５および４６のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。

【0292】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。

【化44】

【0293】

それぞれ、配列番号４６および配列番号４８のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。

【0294】

様々なＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。

【0295】

非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、それぞれ、配列番号７０～７３および７４～７７のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列に例示されるように、正味の分子電荷に基づいて精製を容易にするために２つのＦｃドメイン間に相補的疎水性相互作用、さらなる分子間ジスルフィド結合、および静電気的差異を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３８）を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７０）を、以下に示す：

【化45】

【0296】

リーダー配列およびリンカーは下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（リシンを酸性アミノ酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７０のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号７１）によってコードされる：

【化46】

【化47】

【0297】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通り（配列番号７２）であり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。

【化48】

このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７３）によってコードされる：

【化49】

【化50】

【0298】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号７４）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。

【化51】

【0299】

リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号７０および７２のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換（チロシンをシステインで、トレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、チロシンをバリンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンで、アスパラギン酸をアルギニンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７５）によってコードされる：

【化52】

【0300】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通り（配列番号７６）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。

【化53】

このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７７）によってコードされる：

【化54】

【0301】

それぞれ、配列番号７２および配列番号７６のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。

【0302】

様々なＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、エピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）、およびマルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、静電気的および疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。

【0303】

非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、配列番号７８～８１のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列ならびに配列番号４７、４８、８２、および８３のＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列中に例示されるように、プロテインＡの親和性に基づく精製を容易にするために、具体的にＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド鎖中に、相補的疎水性相互作用、さらなる分子間ジスルフィド結合、およびヒスチジンからアルギニンへの置換を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、ＴＰＡリーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３８）を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７８）を、以下に示す：

【化55】

【0304】

リーダー配列およびリンカーは下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、別のアミノ酸置換（リシンを酸性アミノ酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７８のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号７９）によってコードされる：

【化56】

【化57】

【0305】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通り（配列番号８０）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。

【化58】

このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８１）によってコードされる：

【化59】

【化60】

【0306】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態は、配列番号４７（上に示されている）であり、配列番号７８および８０のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために４つのアミノ酸置換を含有し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８２）によってコードされる：

【化61】

【化62】

【0307】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、配列番号４８（上に示されている）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８３）によってコードされる：

【化63】

【化64】

【0308】

それぞれ、配列番号８０および配列番号４８のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。

【0309】

様々なＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（静電気的および疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル

【0310】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用するシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋ_ｄ）は、灰色の影付きで示す。

【表4-1】

【表4-2】

【0311】

これらの比較結合データは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃまたはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体のいずれかと比べて変更された結合プロファイル／選択性を有することを示している。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体について観察されるように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対する低いか、または観察不可能な親和性を示すが、このリガンドは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対する中間レベルの結合を保持する。図４を参照されたい。

【0312】

さらに、Ａ－２０４ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙを使用して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に対するＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果を評価した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉由来）。リポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ １７巻：３０９１～３１００頁に記載されている）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ－ベータ応答遺伝子（ＰＡＩ－１遺伝子）中に存在し、したがって、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を介してシグナル伝達する因子に対して一般的に使用されているものである。例示的なＡ－２０４ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙは、以下に概略される。

【0313】

１日目：Ａ－２０４細胞を４８ウェルプレート中に分割する。
２日目：Ａ－２０４細胞に、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。

【0314】

３日目：因子（培地＋０．１％ＢＳＡ中に希釈したもの）を添加する。阻害剤を、細胞に添加する前に約１時間、因子と共に予備インキュベートする必要がある。約６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、次いで溶解させる。

【0315】

上記ステップの後、出願人は、ルシフェラーゼアッセイを行った。

【0316】

ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体は両方とも、このアッセイにおいてアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８の強力な阻害剤であると決定された。特に、図７に例示される比較ホモ二量体／ヘテロ二量体ＩＣ_５０データに見られるように、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかしながら、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路の阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して大幅に低下する。このデータは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体とＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の両方がアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強い結合を示すが、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較してＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対する大幅に低下した親和性を有することが観察された上で考察された結合データと一致している。

【0317】

まとめると、これらのデータはしたがって、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用ではＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体よりも有用である。例としては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数の拮抗作用を最小化することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較した、マウスにおけるＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の活性プロファイル

【0318】

ホモ二量体およびヘテロ二量体複合体をマウスにおいて試験して、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの活性プロファイルの差異を調査した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、約１０週齢で開始して４週間、週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体（３または１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）を皮下投薬した（ｎ＝群あたり９匹のマウス）。ＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体は、表面プラズモン共鳴によって決定された場合、無細胞条件下で高い親和性でリガンドに結合することができないため、ｉｎ ｖｉｖｏで試験しなかった。研究評価項目は、体重；ベースラインおよび研究完了（４週）時に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された全身除脂肪量および全身脂肪量；ベースラインおよび４週時に二重エネルギーｘ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって決定された全身骨塩密度；ならびに４週時に決定された腓腹筋、大腿直筋、および胸筋の重量を含んでいた。

【表5】

【0319】

研究結果は、上記の表にまとめられている。予想通り、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体は、体組成の顕著な変化を引き起こし、多くはＧＤＦ８およびアクチビン阻害の公知の効果と一致していた。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体による野生型マウスの処置は、ビヒクル処置された対照と比較して、研究の経過にわたって２倍を超える体重増加をもたらした。これに伴って、ビヒクルと比較して、正味の体重増加は、全身除脂肪量および全身骨塩密度の大幅な増加、ならびに全身脂肪量での大幅な減少があった。除脂肪量（典型的には、マウスにおいては体重の約７０％）は脂肪量（典型的には、体重の約１０％）よりもはるかに大きいため、除脂肪および脂肪組織の正規化された（パーセンテージに基づく）変化は、絶対的変化とのその一致において異なることが認識されるべきである。腓腹筋、大腿直筋、および胸筋を含む、検査した個々の骨格筋は全て、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体を用いる処置の経過にわたって、ビヒクル対照と比較して重量が大幅に増加した。

【0320】

ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、２つの複合体の示差的なリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のものと著しく類似するある特定の効果をもたらした。上記の表に示されたように、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルのＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を用いたマウスの処置は、列挙された全ての評価項目について同じ用量レベルのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果と一致していた、ほぼ一致していた、またはそれを超えていた。３ｍｇ／ｋｇのＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果は、１０ｍｇ／ｋｇと比較して、いくつかの評価項目について軽度に減弱し、したがって、用量効果関係に関する証拠を提供した。

【0321】

したがって、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のものと非常に類似する、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果を発揮する。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と違って、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する低親和性のみ、または一過的な結合を示し、したがって、血管新生などの、これらのリガンドによって媒介されるプロセスに対して同時的阻害をほとんどか全く有さないべきである。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激効果、ならびに脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更を必要としない患者の処置において有用である。

【0322】

（実施例４）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は腎臓線維化および炎症を抑制し、腎臓障害を軽減する

【0323】

腎臓疾患に対する、実施例２に記載されたＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果を、マウス片側尿管結紮モデルにおいて評価した。例えば、ＫｌａｈｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ（２００２年）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８３巻：Ｆ８６１～Ｆ８７５頁を参照されたい。

【0324】

２４匹のＣ５７ＢＬ／６オスマウス、１２週齢が、腎臓の下極のレベルで２回、左片側尿管ライゲーションを受けた。３日後、８匹のマウスを安楽死させ、個々の動物から腎臓を採集して、腎臓障害を評価した。残りのマウスを、２つの群に無作為化した：ｉ）８匹のマウスに、術後３日目、７日目、１０日目、および１４日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を皮下注射し、（ｉｉ）８匹のマウスに、術後３日目、７日目、１０日目、および１４日目にビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を皮下注射した。両群を、関連するＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅに従って１７日目に屠殺した。個々の動物からの腎臓の半分を、ＵＵＯ腎臓と反対側の腎臓との両方から、組織学分析（Ｈ＆Ｅ、およびＭａｓｓｏｎのトリクロム染色）のために収集し、１／４の腎臓を、ＲＮＡ抽出（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＩＬ）のために使用した。

【0325】

ＵＵＯ腎臓試料に関する遺伝子発現分析を行って、様々な遺伝子のレベルを評価した。ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ）上でＱＲＴ－ＰＣＲを行って、様々な線維性遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症性遺伝子（ＴＮＦａ、およびＭＣＰ１）、サイトカイン（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびアクチビンＡ）、および腎臓障害遺伝子（ＮＧＡＬ）の発現を評価した。図８を参照されたい。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるマウスの処置は、線維性および炎症性遺伝子の発現を大幅に抑制し、ＴＧＦβ１／２／３の上方制御を阻害し、腎臓障害を軽減した。組織学データにより、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体処置がＵＵＯモデルにおいて腎臓線維化を大幅に阻害し、腎臓障害を軽減することが確認された。

【0326】

まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置が、腎臓線維化および炎症を抑制し、腎臓障害を軽減することを示している。さらに、これらのデータは、例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドのアンタゴニスト、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体のアンタゴニスト、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢの下流のシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト、ならびにＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢと会合するＴＧＦβスーパーファミリー共受容体のアンタゴニストを含む、他のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、腎臓疾患の処置または防止において有用であり得ることを示している。

【0327】

（実施例５）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置はＡｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて腎臓線維化を抑制し、タンパク尿を減少させる

【0328】

腎臓疾患に対する、実施例２に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果を、Ｃｏｌ４ａ３－／－およびＣｏｌ４ａ５ Ａｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて評価した。例えば、Ｃｏｓｇｒｏｖｅ Ｄら（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０巻（２３号）：２９８１～９２頁；Ｒｈｅａｕｌｔ ＭＮら（２００４年）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． １５巻（６号）：１４６６～７４頁を参照されたい。

【0329】

１６匹のＣｏｌ４ａ３－／－オスマウス、２週齢を、２つの群に無作為化した：ｉ）８匹のマウスに、５週間、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を週２回皮下注射し、ｉｉ）８匹のマウスに、５週間、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を皮下注射した。個々の動物からの尿試料を、それぞれ、４週齢、５週齢、６週齢、および７週齢で代謝ケージによって収集した。両群を７週齢で屠殺し、個々の動物から腎臓を採集して、腎臓障害を評価した。個々の動物からの腎臓の半分を、組織学分析（Ｈ＆Ｅ、およびＭａｓｓｏｎのトリクロム染色）のために収集し、個々の動物からの尿試料を使用して、Ａｌｐｏｒｔ症候群における糸球体損傷の顕著な特徴であるアルブミン尿を評価した（Ｍｏｕｓｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｓｓａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＭＩ；ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ）。

【0330】

アルブミン尿分析を行って、尿中クレアチニンに対して正規化した後の尿中のアルブミンレベルを評価した（ＡＣＲ：アルブミン対クレアチニン比）。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるマウスの処置は、アルブミン尿を大幅に減少させ（図９Ａ）、コラーゲン－Ｉの免疫蛍光染色によって測定される細胞外基質沈着を抑制した（図１０Ａ）。アルブミン尿の結果と一致して、組織学データにより、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体処置が、Ｃｏｌ４ａ３－／－マウスにおいて腎臓線維化を大幅に阻害し（図１０Ｂ）、硬化糸球体を減少させる（図１０Ｃ）ことが確認された。

【0331】

Ａｌｐｏｒｔマウスモデルにおけるアルブミン尿の抑制を確認するために、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を、Ｃｏｌ４ａ５ Ｘ連鎖Ａｌｐｏｒｔマウスモデルにおいて評価した。３０匹のＣｏｌ４ａ５半接合型オスマウス、１７週齢を、２つの群に無作為化した：ｉ）１５匹のマウスに、１２週間、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を週２回、皮下注射し、ｉｉ）１５匹のマウスに、１２週間、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を皮下注射した。個々の動物からの尿試料を、アルブミン尿分析のために、それぞれ、１７週齢、２０週齢、２３週齢、２６週齢、および２９週齢で代謝ケージによって収集した。Ｃｏｌ４ａ３－／－マウスにおける結果と一致して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるＣｏｌ４ａ５半接合型マウスの処置は、アルブミン尿を大幅に減少させた（図９Ｂ）。

【0332】

まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体処置が、Ａｌｐｏｒｔマウスモデルにおけるアルブミン尿の改善と関連して、腎臓線維化を抑制し、硬化糸球体を減少させることを示している。さらに、これらのデータは、他のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、Ａｌｐｏｒｔ症候群における腎臓機能障害の処置または防止において有用であり得ることを示している。

【0333】

（実施例６）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のマウスモデルにおいて筋肉の量および強度を改善する

【0334】

疾患状態における筋肉の量および強度に対する、実施例２に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果を、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のＳＯＤ１マウスモデルにおいて評価した。例えば、Ｇｕｒｎｅｙら（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４巻（５１６６号）：１７７２～１７７５頁を参照されたい。ＳＯＤ１モデルでは、マウスは、約１２週齢で、軽度の疾患症状、筋力低下および／または筋硬直を生じ、それらは、約１６週齢で、より重度の症状、筋麻痺および／または呼吸不全を生じる。この研究では、ＳＯＤ１マウスを８週齢（「発症前」段階）、１２週齢（「疾患開始」段階）、および１６週齢（「疾患進行」段階）で検査した。

【0335】

５週齢のＳＯＤ１［Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１^＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ］マウスを、別々の群：ｉ）週２回、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水を皮下注射したマウス；およびｉｉ）週２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を皮下注射したマウスに分けた。これらの２つの処置群を、週２回、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水の皮下注射を受ける５週齢の野生型マウスとも比較した。マウスを、１１週の過程にわたって、筋肉量、筋線維面積の変化、および筋強直力の変化について観察した。野生型マウスと比較して、ビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスは、１２週齢（約５５ｍｇ対４０ｍｇの筋肉量）および１６週齢（約６０ｍｇ対３５ｍｇの筋肉量）で前脛骨（ＴＡ）の筋肉量の大幅な減少を示した。対照的に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを受けるＳＯＤ１マウスは驚くべきことに、８週齢（約５５ｍｇ対８０ｍｇの筋肉量）および１２週齢（約６０ｍｇ対８５ｍｇの筋肉量）で野生型マウスよりも大幅に多いＴＡ筋肉量を示した。疾患進行段階のマウスでは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを受けるＳＯＤ１マウスは、野生型動物と比較してＴＡ筋肉量のわずかな減少を示したが、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃで処置された動物は、ビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスと比較して大幅に多い（８０％を超える）ＴＡ筋肉量を有していた。ＴＡ筋線維面積（μｍ^２）を検査する際にも同様の傾向が観察された。特に、野生型マウスと比較して、ビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスは、１２週齢でＴＡ筋線維のわずかな減少を示し（約１９００μｍ^２対１７００μｍ^２の筋線維）、ＴＡ筋線維の劇的な減少が、疾患進行段階のマウスにおいて観察された（約２２００μｍ^２対１４５０μｍ^２の筋線維）。対照的に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを受けるＳＯＤ１マウスは、１２週齢の野生型マウスよりも大幅に多いＴＡ筋肉量を示した（約２３００μｍ^２対１９００μｍ^２の筋肉量）。疾患進行段階のマウスでは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを受けるＳＯＤ１マウスは、野生型動物と比較してＴＡ筋線維濃度のわずかな減少を示したが、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃで処置された動物は、ビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスと比較して大幅に多い（２９％を超える）ＴＡ筋線維濃度を有していた。ＴＡ筋肉量および線維含量の増加は、強度の増加と相関していた。例えば、野生型マウスと比較して、ビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスは、１２週齢で、筋肉のピーク強直力（ｍＮ）により測定された、ＴＡ筋肉強度の中程度の低下を示し（約１３００ｍＮ対９００ｍＮのピーク強直力）、ＴＡ筋肉強度の劇的な低下が、疾患進行段階のマウスにおいて観察された（約１２５０ｍＮ対６００ｍＮのピーク強直力）。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを受けるＳＯＤ１マウスは、１２週齢（２５％を超える筋肉強度の増大）および１６週齢（４３％を超える筋肉強度の増大）でビヒクルを受けるＳＯＤ１マウスよりも大幅に増大したＴＡ筋肉強度を示した。

【0336】

総合すると、データは、ＡＬＫ４－ｍＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ療法がＡＬＳのマウスモデルにおいて筋肉の量および強度を増加させることができることを示している。したがって、データは、ＡＬＫ４－ｍＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ、および潜在的には他のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、他の筋肉障害、特に、運動ニューロンおよび神経筋の疾患を処置することができることを示している。

【0337】

（実施例７）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体処置は筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて横隔膜強度を改善する

【0338】

疾患状態における筋肉の量および強度に対する、実施例２に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果を、筋ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｙ）のｍｄｘマウスモデルにおいてさらに評価した。このｍｄｘモデルでは、ジストロフィン欠損の表現型を、任意の早期齢（すなわち、約７週齢）で観察することができる。

【0339】

５週齢のｍｄｘ（Ｄ２．Ｂ１０－Ｄｍｄ^ｍｄｘ／Ｊ）マウスを、別々の群：ｉ）週２回、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水を皮下注射したマウス、およびｉｉ）週２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を皮下注射したマウスに分けた。これらの２つの処置群を、週２回、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水の皮下注射を受ける５週齢の野生型マウスとも比較した。マウスを、処置の８週後に筋肉強度の変化について観察した。野生型マウスと比較して、ビヒクルを受けるｍｄｘマウスは、８週後に、筋肉の特定の力（ｋＰａ）によって測定された、横隔膜筋肉強度の大幅な低下を示した［すなわち、約８９ｋＰａ（野生型）対３２ｋＰａ（ｍｄｘ）］。対照的に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ処置は、ビヒクル対照を受けるｍｄｘマウスと比較して横隔膜強度を大幅に増大させる（６３％を超える）ことが観察された。

【0340】

データは、ＡＬＫ４－ｍＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ療法がｍｄｘのマウスモデルにおいて強度を増大させることができることを示している。したがって、データは、ＡＬＫ４－ｍＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ、および潜在的には他のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、他の筋肉障害、特に、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤを含む筋ジストロフィーを処置することができることを示している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含み、かつ／または前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与されるか、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与されるか、または
ｃ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与され、かつ前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間のｐＩの差異の増大が付与される、
項目１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
項目２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４)
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目７に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９)
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目９のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；
ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０ＫまたはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１３)
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１４)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１６)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；
ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１７)
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１８)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目１７に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１９)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１８に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；
ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３２のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目１９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２１)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の置換を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の置換を含む、
項目３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２３)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２４)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目２３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２５)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目２４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２６)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目２５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２７)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２８)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目２７に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２９)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目２８に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３０)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；
ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目２９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３１)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目３１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３３)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目３２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３４)
前記修飾されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；
ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目３３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３５)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３６)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目３５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３７)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目３６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３８)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；
ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目３７に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目３９)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
項目２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４０)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の置換を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の置換を含む、
項目３９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４１)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目３９または４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目４１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４３)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目４２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４４)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目４３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４５)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；
ｂ）配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目４４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４６)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目３９または４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４７)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目４６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４８)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目４７に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目４９)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；
ｂ）配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３２のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０ＫまたはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目４８に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５０)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目３９または４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５１)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目５０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５３)
前記修飾されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；
ｂ）配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３３のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５４)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目３９または４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５５)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目５４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５６)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＤ１８３位におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５７)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；
ｂ）配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３５のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５８)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質の前記１つまたは複数のアミノ酸修飾が、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる、項目２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目５９)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目２または３９から４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６０)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目５９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６１)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目５９または６０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６２)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６３)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；
ｂ）配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６４)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目２または３９から４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目６４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６６)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６４または６５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６７)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；
ｂ）配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３２のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６８)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目２または３９から４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目６９)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３１ Ｆｃドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目６８に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７０)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目６８または６９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７１)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；
ｂ）配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３３のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目７０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７２)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４ドメインが、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目２または３９から４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７３)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、項目７２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７４)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目７２または７３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；
ｂ）配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３５のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目７４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７６)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、
項目４から８および２２から２６のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７７)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、
項目４から８および２２から２６のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７８)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、
項目４１から４５および５９から６３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目７９)
ａ）前記修飾されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含み、
ｂ）前記修飾されたＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、
項目４１から４５および５９から６３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８０)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含む、
項目９から１２および２７から３０のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８１)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含む、
項目９から１２および２７から３０のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８２)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含む、
項目４６から４９および６４から６７のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８３)
ａ）修飾された前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含み、
ｂ）修飾された前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含む、
項目４６から４９および６４から６７のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８４)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含む、
項目１３から１６および３１から３４のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８５)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含む、
項目１３から１６および３１から３４のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８６)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含む、
項目５０から５３および６８から７１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８７)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３ Ｆｃドメインが、配列番号３３のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含む、
項目５０から５３および６８から７１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８８)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含む、
項目１７から２０および３５から３８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目８９)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含む、
項目１７から２０および３５から３８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９０)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含む、
項目５４から５８および７２から７５のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９１)
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含む、
項目５４から５８および７２から７５のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９２)
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、項目２２または５９に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９３)
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸；
ｂ）配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびに
ｃ）配列番号６６の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６の２１７に対応する位置のアスパラギン酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目９２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９４)
前記修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号６６の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６の１４４に対応する位置のトリプトファンを含む、項目９２または９３に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９５)
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、項目４または４１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９６)
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニン；
ｂ）配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびに
ｃ）配列番号６７の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７の１７９に対応する位置のアルギニン
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項目９５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９７)
前記修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号６７の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７の１４６に対応する位置のアラニン、および配列番号６７の１８５に対応する位置のバリンを含む、項目９５または９６に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９８)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４４Ｗ）、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８５Ｖ）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目９９)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４４Ｗ）、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８５Ｖ）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１００)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４４Ｗ）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８５Ｖ）、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０１)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４４Ｗ）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＹ１２７に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１のＬ１４６に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１のＹ１８５に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８５Ｖ）、配列番号３１のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０２)
配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、項目９８から１０１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０３)
配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、項目９８から１０１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０４)
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、項目９８から１０３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０５)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４２Ｗ）、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８３Ｖ）ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０６)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４２Ｗ）、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８３Ｖ）ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０７)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４２Ｗ）ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８３Ｖ）、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０８)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＳ１３０に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４２Ｗ）ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２のＹ１２５に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２のＴ１４２に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２のＬ１４４に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２のＹ１８３に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８３Ｖ）、配列番号３２のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１０９)
配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、項目１０５から１０８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１０)
配列番号３２のＨ２１１に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、項目１０５から１０８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１１)
前記修飾されたＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、項目１０５から１１０のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１２)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４８Ｗ）、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８９Ｖ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１３)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファンを含み（Ｔ１４８Ｗ）、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリンを含む（Ｙ１８９Ｖ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１４)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４８Ｗ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８９Ｖ）、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１５)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＳ１３６に対応する位置にシステインを含み（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にトリプトファンを含む（Ｔ１４８Ｗ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５のＹ１３１に対応する位置にシステインを含み（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５のＴ１４８に対応する位置にセリンを含み（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５のＬ１５０に対応する位置にアラニンを含み（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５のＹ１８９に対応する位置にバリンを含み（Ｙ１８９Ｖ）、配列番号３５のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む、
組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１６)
配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、項目１１２から１１５のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１７)
配列番号３５のＨ２１７に対応する位置の前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、項目１１２から１１５のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１８)
前記修飾されたＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、項目１１２から１１７のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１１９)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号９のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つで始まり、
ｉｉ）配列番号９のアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終わる
ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｄ）
ｉ）配列番号１９のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つで始まり、
ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終わる
ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；および
ｆ）配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
から選択されるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ポリペプチドドメインを含む、項目１から１１８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２０)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まり、
ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる
ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；
ｆ）配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列；および
ｇ）配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを含む、項目のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２１)
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインが、配列番号１のＬ７９に対応する位置における酸性アミノ酸を含まない、項目１２０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２２)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４ドメインと前記Ｆｃドメインとの間に位置するリンカードメインをさらに含み、かつ／または前記ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記Ｆｃドメインとの間に位置するリンカードメインをさらに含む、項目１から１２１のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２３)
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧ（配列番号１３）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、ＳＧＧＧ（配列番号１８）、およびＧＧＧＧＳ（配列番号５８）から選択される、項目１２２に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２４)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン；
ｂ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７６のＤ２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン（Ｙ２９２Ｖ）、および配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２位のバリン、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ならびにｇ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２４に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２６)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、および配列番号７２の２６２位のトリプトファン；
ｂ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびに
ｇ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２４または１２５に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１２７)
配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１２８)
ａ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン；
ｂ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２位のバリン、および配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸；ならびに
ｇ）配列番号７６の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号７６の２５１に対応する位置のセリン、配列番号７６の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号７６の２９２に対応する位置のバリン、配列番号７６の２６９に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７６の２８６に対応する位置の正荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２７に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１２９)
配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３０)
ａ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、および配列番号７２の２６２に対応する位置のトリプトファン；
ｂ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７２の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびに
ｇ）配列番号７の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号７２の２６２位のトリプトファン、配列番号７２の２５６に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７２の３３５に対応する位置の負荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２９に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３１)
配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３２)
ａ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、および配列番号７４の３１６位のバリン；
ｂ）配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６位のバリン、および配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６に対応する位置のバリン、および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸
ｇ）配列番号７４の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号７４の２７５に対応する位置のセリン、配列番号７４の２７７に対応する位置のアラニン、配列番号７４の３１６に対応する位置のバリン、配列番号７４の２９３に対応する位置の正荷電アミノ酸、および配列番号７４の３１０に対応する位置の正荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１３１に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３３)
配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３４)
ａ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、および配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン；
ｂ）配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｃ）配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｄ）配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｅ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、および配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸；
ｆ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸；ならびに
ｇ）配列番号７０の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７０の２８７に対応する位置のトリプトファン、配列番号７０の２８１に対応する位置の負荷電アミノ酸、および配列番号７０の３６０に対応する位置の負荷電アミノ酸
から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１３３に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１３５)
前記正荷電アミノ酸残基が、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、Ｒ、Ｋ、もしくはＨ）アミノ酸である、項目１２５、１２８、および１３２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体または融合タンパク質。
(項目１３６)
前記正荷電アミノ酸残基がＲである、項目１３５に記載のヘテロ多量体または融合タンパク質。
(項目１３７)
前記負荷電アミノ酸残基が、修飾されているか、または天然に存在する（例えば、ＤもしくはＥ）アミノ酸である、項目１２６、１３０、および１３４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体または融合タンパク質。
(項目１３８)
前記負荷電アミノ酸残基がＤである、項目１３７に記載のヘテロ多量体または融合タンパク質。
(項目１３９)
前記負荷電アミノ酸残基がＥである、項目１３７に記載のヘテロ多量体または融合タンパク質。
(項目１４０)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１４１)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号４８の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号４８の２５１に対応する位置のセリン、配列番号４８の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号４８の２９２位のバリンを含む、項目１４０に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１４２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号８０の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号８０の２６２に対応する位置のトリプトファン、および配列番号８０の３３１に対応する位置のアルギニンを含む、項目１４０または１４１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目１４３)
配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４４)
配列番号４８の２３４に対応する位置のシステイン、配列番号４８の２５１に対応する位置のセリン、配列番号４８の２５３に対応する位置のアラニン、および配列番号４８の２９２位のバリンを含む、項目１４３に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４５)
配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４６)
配列番号８０の２５０に対応する位置のシステイン、配列番号８０の２６２に対応する位置のトリプトファン、および配列番号８０の３３１に対応する位置のアルギニンを含む、項目１４５に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４７)
配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４８)
配列番号４７の２５８に対応する位置のシステイン、配列番号４７の２７５に対応する位置のセリン、配列番号４７の２７７に対応する位置のアラニン、および配列番号４７の３１６位のバリンを含む、項目１４７に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１４９)
配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、組換えＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５０)
配列番号７８の２７５に対応する位置のシステイン、配列番号７８の２８７に対応する位置のトリプトファン、および配列番号７８の３５６に対応する位置のアルギニンを含む、項目１４５に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５１)
グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、項目１から１５０のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５２)
グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から入手可能なグリコシル化パターンを有する、項目１５１に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５３)
アクチビン（例えば、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、項目１から１５２のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５４)
ＢＭＰ９に実質的に結合しない、項目１から１５３のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１５５)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ１０に結合する、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１５４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１５６)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＢＭＰ９に結合する、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１５５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１５７)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱い親和性でＧＤＦ３に結合する、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１５６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１５８)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して強い親和性でアクチビンＢに結合する、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１５７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１５９)
アクチビン（例えば、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドによるシグナル伝達を阻害する、項目１から１５８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質、またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質。
(項目１６０)
ＢＭＰ９のシグナル伝達を持続的に阻害しない、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１５４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６１)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱いＢＭＰ１０のシグナル伝達の阻害剤である、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１６０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６２)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱いＢＭＰ９のシグナル伝達の阻害剤である、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１６１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６３)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して弱いＧＤＦ３のシグナル伝達の阻害剤である、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１６２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６４)
対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して強いアクチビンＢの阻害剤である、項目１から１２６、１３５から１４２、および１５１から１６３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６５)
前記リガンドシグナル伝達が、細胞に基づくアッセイにおいて測定される、項目１５９から１６４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６６)
ヘテロ二量体である、項目１から１２６、１３５から１４２、および１６０から１６５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
(項目１６７)
前記１つまたは複数のアミノ酸修飾が、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる、項目１から１６６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体またはＦｃ融合タンパク質。
(項目１６８)
ａ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与されるか、
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与されるか、または
ｃ）前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与され、かつ前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質における前記１つもしくは複数のアミノ酸修飾により、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質との間の等電点の差異の増大が付与される、前記項目のいずれかに記載のヘテロ多量体。
(項目１６９)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異が、少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０である）、項目１６７に記載のヘテロ多量体。
(項目１７０)
項目１から１２６、１３５から１４２、および１６０から１６９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬調製物。
(項目１７１)
実質的にパイロジェンフリーである、項目１７０に記載の医薬調製物。
(項目１７２)
約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む、項目１７０または１７１のいずれか一項に記載の医薬調製物。
(項目１７３)
約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む、項目１７０から１７２のいずれか一項に記載の医薬調製物。
(項目１７４)
項目１から１６９のいずれか一項に記載のＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む、組換え核酸。
(項目１７５)
配列番号７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７４に記載の組換え核酸。
(項目１７６)
配列番号７７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７４に記載の組換え核酸。
(項目１７７)
配列番号８２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７４に記載の組換え核酸。
(項目１７８)
配列番号８３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７４に記載の組換え核酸。
(項目１７９)
項目１から１６９のいずれか一項に記載のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む、組換え核酸。
(項目１８０)
配列番号７１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７９に記載の組換え核酸。
(項目１８１)
配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７９に記載の組換え核酸。
(項目１８２)
配列番号７９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７９に記載の組換え核酸。
(項目１８３)
配列番号８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１７９に記載の組換え核酸。
(項目１８４)
項目１７４から１７８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
(項目１８５)
項目１７９から１８３のいずれか一項に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
(項目１８６)
項目１７４から１７８のいずれか一項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列および項目１７９から１８３のいずれか一項に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
(項目１８７)
項目１７４から１８６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目１８８)
項目１７４から１８６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは項目１８７に記載のベクターによって形質転換された細胞。
(項目１８９)
ＣＨＯ細胞である、項目１８６に記載の細胞。
(項目１９０)
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、項目１７４から１７６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドおよび項目１７９から１８３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
(項目１９１)
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、項目１８６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
(項目１９２)
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、
ａ）第１の細胞をＡＬＫ４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第１の細胞が、項目１７４から１７８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと；
ｂ）そのように発現したＡＬＫ４ポリペプチドを回収するステップと；
ｃ）第２の細胞をＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第２の細胞が、項目１７９から１８３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと；
ｄ）そのように発現したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップと；
ｅ）前記回収したＡＬＫ４ポリペプチドと前記回収したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとをＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成に適した条件下で組み合わせるステップと
を含む、方法。
(項目１９３)
前記ヘテロ多量体を回収するステップをさらに含む、項目１９０から１９２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９４)
前記ＡＬＫ４ポリペプチドを、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させる、項目１９０から１９３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９５)
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させる、項目１９０から１９３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９６)
前記ＴＰＡリーダーが、配列番号３８のコード配列を含む、項目１９４または１９５に記載の方法。
(項目１９７)
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目１９０から１９６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９８)
前記ヘテロ多量体がヘテロ二量体である、項目１９０から１９７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９９)
少なくとも１つのＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質と少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質とを含む組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体であって、前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２００)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、項目１９９に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０１)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３８のリーダー配列を含む、項目１９９に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０２)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１９９から２０１のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０３)
前記ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、項目１９９から２０２のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０４)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３８のリーダー配列を含む、項目１９９から２０３のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０５)
前記ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１９９から２０１のいずれか一項に記載の組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０６)
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号７４のアミノ酸配列を含む、組換えＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体。
(項目２０７)
筋肉喪失または不十分な筋肉の成長に関連する障害を有する患者を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２０８)
前記患者が筋萎縮を有する、項目２０７に記載の方法。
(項目２０９)
前記患者が筋ジストロフィーを有する、項目２０７に記載の方法。
(項目２１０)
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目２０８に記載の方法。
(項目２１１)
前記患者が若齢であり、処置がデュシェンヌ型筋ジストロフィーと診断された日から１～５年以内に開始される、項目２１０に記載の方法。
(項目２１２)
前記筋ジストロフィーがベッカー型筋ジストロフィーである、項目２０８に記載の方法。
(項目２１３)
前記ヘテロ多量体が、エテプリルセン、副腎皮質ステロイド薬（例えば、デフラザコート）、ステロイド（例えば、プレドニゾン）、血圧および／または心臓の薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ベータブロッカー、および利尿薬）、抗喘息薬（例えば、アルブテロール）、ビタミン／栄養素（例えば、アミノ酸、カルニチン、コエンザイムＱ１０、クレアチン、魚油、緑茶抽出物、ビタミンＥ）、幹細胞療法、遺伝子療法、補助換気、手術、理学療法、食事および／または運動のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２１０から２１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１４)
前記筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである、項目２０９に記載の方法。
(項目２１５)
前記ヘテロ多量体が、アルブテロール、言語療法、手術、歩行補助具、脊柱装具、Ｔ細胞阻害剤（例えば、短縮型ヒスチジル－ｔＲＮＡシンテターゼ）、幹細胞療法、遺伝子療法、および／または足部支持デバイスのうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２１４に記載の方法。
(項目２１６)
前記患者が筋萎縮性側索硬化症を有する、項目２０７に記載の方法。
(項目２１７)
前記患者が、筋萎縮性側索硬化症と診断された後に処置を受ける、項目２１６に記載の方法。
(項目２１８)
前記ヘテロ多量体が、リルゾール、エダラボン、マシチニブ、抗酸化剤、理学療法、言語療法、栄養補給、呼吸補助（例えば、非侵襲的人工呼吸器）、幹細胞療法、および／または遺伝子療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２１６または２１７に記載の方法。
(項目２１９)
前記障害が、がんまたはがん治療と関連する悪液質である、項目２０７に記載の方法。
(項目２２０)
前記障害がサルコペニアである、項目２０７に記載の方法。
(項目２２１)
前記ヘテロ多量体が、ウロコルチンＩＩ、ホルモン補充療法（例えば、テストステロンまたはヒト成長ホルモン）、クレアチン、ビタミンＤ、運動、食事、および／または筋力トレーニングと組み合わせて投与される、項目２２０に記載の方法。
(項目２２２)
前記障害が孤発性封入体筋炎である、項目２０７に記載の方法。
(項目２２３)
前記ヘテロ多量体が、副腎皮質ステロイド薬、プレドニゾン、オキサンドロロン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、静脈内免疫グロブリン、ベータインターフェロン－１ａ、エタネルセプト、アレムツズマブ、フォリスタチン、リチウム、ビマグマブ、アリモクロモル、ラパマイシン、抗酸化剤、カルニチン、コエンザイムＱ１０、理学療法、作業療法、幹細胞療法、および／または遺伝子療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２２２に記載の方法。
(項目２２４)
神経変性に関連する障害を有する患者を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２２５)
前記障害が筋萎縮性側索硬化症である、項目２２４に記載の方法。
(項目２２６)
前記ヘテロ多量体が、リルゾール、エダラボン、マシチニブ、抗酸化剤、理学療法、言語療法、栄養補給、呼吸補助（例えば、非侵襲的人工呼吸器）、幹細胞療法、および／または遺伝子療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２２５に記載の方法。
(項目２２７)
線維症または線維症に関連する障害もしくは状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２２８)
前記線維症に関連する障害または状態が、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、ペイロニー病、肝線維症、ウィルソン病、グリコーゲン蓄積症（特に、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＩＸ型、およびＸ型）、鉄過剰症、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性の脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症、後腹膜線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、膵線維症から選択される、項目２２７に記載の方法。
(項目２２９)
前記線維症に関連する障害または状態が、特発性肺線維症である、項目２２７に記載の方法。
(項目２３０)
対象において体重を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３１)
対象における体重増加を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３２)
糖尿病を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３３)
前記対象がＩＩ型糖尿病を有する、項目２３２に記載の方法。
(項目２３４)
肥満症を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３５)
脂肪肝疾患を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３６)
前記対象が非アルコール性脂肪肝疾患を有する、項目２３５に記載の方法。
(項目２３７)
対象においてコレステロールおよび／またはトリグリセリドを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２３８)
前記対象が、２５ｋｇ／ｍ ^２ またはそれよりも多いボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する、項目２３０から２３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３９)
前記対象が肥満である、項目２３０から２３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４０)
前記対象が、３０ｋｇ／ｍ ^２ またはそれよりも多いボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する、項目２３９に記載の方法。
(項目２４１)
前記対象がインスリン抵抗性を有する、項目２３０から２４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４２)
前記対象がＩＩ型糖尿病を有する、項目２３０から２４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４３)
前記対象が、脂質異常症、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ血清レベル、高ＬＤＬ血清レベル、および高トリグリセリド血症からなる群から選択される疾患または状態を有する、項目２３０から２４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４４)
前記対象が、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血圧調節機能障害、動脈硬化、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、または微小血管疾患からなる群から選択される疾患または状態を有する、項目２３０から２４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４５)
前記対象が脂肪肝疾患を有する、項目２３０から２４４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４６)
前記対象が非アルコール性脂肪肝疾患を有する、項目２４５に記載の方法。
(項目２４７)
望ましくない体重増加および／または代謝障害に関連する障害または状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２４８)
前記障害または状態が、高血糖症、脂質代謝疾患、障害、脂質異常症、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高トリグリセリドレベル、高脂血症、リポタンパク質異常、グルコース代謝疾患、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、耐糖能障害（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、高尿酸レベル、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、ＮＡＳＨ、多嚢胞性卵巣症候群、高インスリン血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、心疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症、Ｘ症候群、メタボリックシンドローム、および高血圧からなる群から選択される、項目２４７に記載の方法。
(項目２４９)
対象において線維症または線維症に関連する障害もしくは状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２５０)
線維症に関連する前記障害または状態が、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、ペイロニー病、肝線維症、ウィルソン病、グリコーゲン蓄積症（特に、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＩＸ型、およびＸ型）、鉄過剰症、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性の脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、縦隔線維症、腎性線維症、後腹膜線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、膵線維症から選択される、項目２４８に記載の方法。
(項目２５１)
前記線維症に関連する障害または状態が、特発性肺線維症である、項目２４９に記載の方法。
(項目２５２)
腎臓疾患または腎臓疾患の合併症を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の項目１から１２６、１３５から１４２、１５１から１６９、および１９９から２０７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２５３)
前記患者が慢性腎臓疾患または腎臓不全を有する、項目２５２に記載の方法。
(項目２５４)
前記患者が急性腎臓疾患または腎臓不全を有する、項目２５２に記載の方法。
(項目２５５)
前記患者がステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、またはステージ５の腎臓疾患を有する、項目２５２に記載の方法。
(項目２５６)
ステージ１からステージ２の腎臓疾患への、ステージ２からステージ３の腎臓疾患への、ステージ３からステージ４の腎臓疾患への、またはステージ４からステージ５の腎臓疾患への進行を遅延させるかまたは防止する、項目２５５に記載の方法。
(項目２５７)
腎炎を予防するかまたは低減する、項目２５２から２５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５８)
腎臓組織損傷を予防するかまたは低減する、項目２５２から２５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５９)
腎臓線維症を予防するかまたは低減する、項目２５２から２５８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６０)
前記患者が、非糖尿病性腎臓疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化群、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人）多発性嚢胞腎臓疾患、常染色体劣性（小児）多発性嚢胞腎臓疾患、急性腎臓障害、ネフローゼ症候群、腎虚血、有足細胞疾患または障害、タンパク尿、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎臓病変、膠原病性脈管疾患、良性起立性（体位性）タンパク尿、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物による腎臓損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型グリコーゲン蓄積症、慢性腎臓疾患、慢性腎不全、低糸球体濾過量（ＧＦＲ）、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性の微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性同種移植腎症、腎毒性（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎毒性（ｒｅｎａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎臓壊死、腎臓損傷、糸球体および尿細管障害、腎臓機能障害、腎炎症候群、急性腎不全（急性腎臓障害）、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎臓移植拒絶反応、慢性腎臓移植拒絶反応、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後の糸球体腎炎、任意の種類の腎臓病変を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧、糖尿病、および自己免疫疾患）に関連する腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎臓疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、クリオグロブリン血症に関連する糸球体腎炎、ヘノッホ・シェーンライン病、感染後の糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体媒介性糸球体腎炎、アミロイドーシス、単クローン性免疫グロブリン沈着症、繊維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管障害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、中毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染症またはＨＩＶ感染症に起因するウイルス性感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合疾患、円柱腎症、尿酸塩、シュウ酸塩、または薬物誘導性の結晶沈着に起因し得る結晶性腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶反応、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患に起因する腫瘍浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管同種移植片拒絶反応、急性体液性同種移植片拒絶反応、早期腎機能低下（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、腎閉塞、急性間質性腎炎、既往慢性腎臓疾患、腎動脈狭窄、虚血性腎症、尿毒症、薬物および毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流性腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎臓疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル・リンドウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質嚢胞性腎臓疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流障害、腎異形成、高窒素血症、両側動脈閉塞、急性尿酸腎症、血液量減少症、急性両側閉塞性尿路疾患、高カルシウム血症性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿閉、悪性腎硬化症、産後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー病の抗ＧＢＭ疾患、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鎮痛薬腎症、動静脈瘻、動静脈グラフト、透析、異所性腎臓、海綿腎臓、腎性骨ジストロフィー、単腎症、水腎症、微量アルブミン尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂質尿、アシドーシス、ならびに高カリウム血症のうちの１つまたは複数を有する、項目２５２から２５９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６１)
前記患者がアルポート症候群を有する、項目２６０に記載の方法。
(項目２６２)
前記ヘテロ多量体が、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、ベナゼプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、ラミプリルおよびキナプリル）、アンジオテンシン受容体遮断薬（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタン）、スタチン（例えば、フルバスタチン）、非ジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬（例えば、ジルチアゼム）、シクロスポリンおよび／またはアルドステロン阻害剤のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される、項目２６１に記載の方法。
(項目２６３)
肺動脈性肺高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量の前記項目のいずれかに記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２６４)
肺高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量の前記項目のいずれかに記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２６５)
肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量の前記項目のいずれかに記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２６６)
前記肺高血圧症の１つまたは複数の合併症が、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大、ならびに肺線維症からなる群から選択される、項目２６５に記載の方法。
(項目２６７)
前記肺高血圧症が肺動脈性肺高血圧症である、項目２６４から２６６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６８)
間質性肺疾患の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量の前記項目のいずれかに記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を投与するステップを含む、方法。
(項目２６９)
前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症である、項目２６９に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【図10】

【配列表】

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