特許 7219919 触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びトランスデューサ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-01

(45)【発行日】2023-02-09

(54)【発明の名称】触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びトランスデューサ

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/416 20060101AFI20230202BHJP

【ＦＩ】

G01N27/416 336B

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2019094379

(22)【出願日】2019-05-20

(65)【公開番号】P2020190425

(43)【公開日】2020-11-26

【審査請求日】2022-02-01

(73)【特許権者】

【識別番号】000231073

【氏名又は名称】日本航空電子工業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121706

【弁理士】

【氏名又は名称】中尾 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128705

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 幸雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147773

【弁理士】

【氏名又は名称】義村 宗洋

(72)【発明者】

【氏名】國方 亮太

(72)【発明者】

【氏名】須田 篤史

(72)【発明者】

【氏名】林 泰之

(72)【発明者】

【氏名】伊野 浩介

(72)【発明者】

【氏名】末永 智一

【審査官】黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－２６６７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－０９２４３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－２２７０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０９６７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０５９９２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１２１３１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１０５４５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／００６２０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１８１４８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１６８２００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／２６－２７／４９

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１２

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の液体内で進行する触媒反応によって生成されて前記第１の液体に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法であって、
液槽に、前記第１の液体と、前記第１の液体と液液界面を形成して接し、前記触媒反応生成物が溶解しない第２の液体とを収容し、
前記第１の液体内に作用極を配置し、前記第２の液体内に対極及び参照極を配置し、
前記触媒反応生成物が前記作用極において酸化又は還元反応をすることで前記作用極に流れる電流を測定することを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項2】

請求項１に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記液槽は１つとされ、
前記作用極は複数配置され、
前記第１の液体は前記作用極の各々に対応して相互に連続することなく各独立に前記液槽に収容された複数の液塊とされ、
前記第２の液体は前記第１の液体の前記複数の液塊のすべてとそれぞれ液液界面を形成して接する連続した１つの液塊とされ、
前記対極及び前記参照極はそれぞれ１つとされていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記作用極は前記液槽の底面に位置し、
前記第１の液体は前記底面上に位置して前記第２の液体によって覆われていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項4】

請求項３に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記作用極の表面と、前記底面の、前記作用極の表面を囲む環状部位との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項5】

請求項３又は４に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記底面の前記第２の液体が位置する部位が疎水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項6】

請求項１に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記液槽の底面上にウェルが構成され、
前記作用極及び前記第１の液体は前記ウェルに位置していることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項7】

請求項２に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記液槽の底面上に複数のウェルが構成され、
複数の前記作用極はそれぞれ前記ウェルに位置し、
前記第１の液体の前記複数の液塊はそれぞれ前記ウェルに位置していることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項8】

請求項６又は７に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記作用極の表面と、前記ウェルに位置する前記底面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。

【請求項9】

溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサであって、
前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、前記ＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、
前記ＬＳＩチップは、前記複数の電極の表面と、前記複数の電極の表面をそれぞれ囲む複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とするトランスデューサ。

【請求項10】

請求項９に記載のトランスデューサにおいて、
前記センサ領域における前記複数の電極の表面と前記複数の環状表面以外の部位が疎水化処理されている、もしくは、前記センサ領域における前記複数の電極の表面以外の部位が疎水化処理されている、ことを特徴とするトランスデューサ。

【請求項11】

溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサであって、
前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、前記ＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、
前記センサ領域における前記複数の電極の表面と前記複数の電極の表面をそれぞれ囲む複数の環状表面以外の部位が疎水化処理されている、もしくは、前記センサ領域における前記複数の電極の表面以外の部位が疎水化処理されている、ことを特徴とするトランスデューサ。

【請求項12】

溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサであって、
前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列された複数のウェルが形成されており、
前記ＬＳＩチップに設けられている複数の電極はそれぞれ前記複数のウェルに位置していることを特徴とするトランスデューサ。

【請求項13】

請求項１２に記載のトランスデューサにおいて、
前記ＬＳＩチップは、前記複数の電極の表面と、前記複数の電極の表面をそれぞれ囲んで前記複数のウェルに位置する複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とするトランスデューサ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この発明は測定溶液内で進行する触媒反応によって生成されて測定溶液に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びその電気化学的測定方法に用いるトランスデューサに関する。

【背景技術】

【0002】

酵素反応等、触媒反応によって生成されて測定溶液に溶解している触媒反応生成物の測定においては、測定の感度は測定溶液中の触媒反応生成物の濃度によって決まり、測定溶液中の触媒反応生成物の濃度を向上させるためには例えば触媒反応時間をより長くするのが好ましく、また測定溶液の体積をより小さくするのが好ましい。

【0003】

しかるに、測定溶液を極微量とすると蒸発によって測定溶液の体積が減少し、測定が不可能になってしまうことがあり、このような問題の発生は触媒反応時間を長くすると、より顕著となる。

【0004】

このような測定溶液の蒸発を回避することができる構成が特許文献１や非特許文献１に記載されており、特許文献１にはＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）に関連する測定手法において、酵素反応場である親水性溶媒の液滴を収容部（ウェル）内に位置させ、その液滴が位置する収容部を疎水性溶媒によって密閉する構成が記載されている。

【0005】

また、非特許文献１には同様にＥＬＩＳＡに関連する測定手法において、親水性表面に疎水性領域を形成して親水性領域のパターンを形成し、その親水性領域のパターンに位置する酵素反応場である液滴をオイルによって覆う構成が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】ＷＯ２０１２／１２１３１０号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】S. Sakakihara et al., “A Single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array”, Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述したように、触媒反応場である測定溶液（以下、第１の液体と言う）を第２の液体で覆うようにすれば、第１の液体の蒸発を防ぐことができ、よって高感度の測定を良好に行うことができる。

【0009】

しかるに、特許文献１や非特許文献１に記載されている測定方法はいずれも蛍光基質を用いる分光学的測定によるものであって、比較的大がかりな測定装置を必要とし、また測定に用いる基質も高価であり、これらの点で測定コストがかかるものとなっていた。

【0010】

この発明の目的はこの問題に鑑み、触媒反応生成物の高感度の測定を安価かつコンパクトに実施可能な測定方法を提供することにあり、さらにその測定方法に用いるトランスデューサを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

請求項１の発明によれば、第１の液体内で進行する触媒反応によって生成されて第１の液体に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法は、液槽に第１の液体と、第１の液体と液液界面を形成して接し、触媒反応生成物が溶解しない第２の液体とを収容し、第１の液体内に作用極を配置し、第２の液体内に対極及び参照極を配置し、触媒反応生成物が作用極において酸化又は還元反応をすることで作用極に流れる電流を測定する。

【0012】

請求項２の発明では請求項１の発明において、液槽は１つとし、作用極は複数配置し、第１の液体は作用極の各々に対応して相互に連続することなく各独立に液槽に収容された複数の液塊とし、第２の液体は第１の液体の複数の液塊のすべてとそれぞれ液液界面を形成して接する連続した１つの液塊とし、対極及び参照極はそれぞれ１つとする。

【0013】

請求項３の発明では請求項１又は２の発明において、作用極は液槽の底面に位置し、第１の液体は前記底面上に位置して第２の液体によって覆われているものとされる。

【0014】

請求４の発明では請求項３の発明において、作用極の表面と、前記底面の、作用極の表面を囲む環状部位との少なくとも一方が親水化処理されているものとされる。

【0015】

請求項５の発明では請求項３又は４の発明において、前記底面の第２の液体が位置する部位が疎水化処理されているものとされる。

【0016】

請求６の発明では請求項１の発明において、液槽の底面上にウェルが構成され、作用極及び第１の液体はウェルに位置しているものとされる。

【0017】

請求７の発明では請求項２の発明において、液槽の底面上に複数のウェルが構成され、複数の作用極はそれぞれウェルに位置し、第１の液体の複数の液塊はそれぞれウェルに位置しているものとされる。

【0018】

請求項８の発明では請求項６又は７の発明において、作用極の表面と、ウェルに位置する前記底面との少なくとも一方が親水化処理されているものとされる。

【0019】

請求項９の発明によれば、溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサでは、液槽の底面に画定されたセンサ領域にＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、ＬＳＩチップは複数の電極の表面と、複数の電極の表面をそれぞれ囲む複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されているものとされる。

【0020】

請求項１０の発明では請求項９の発明において、センサ領域における複数の電極の表面と前記複数の環状表面以外の部位が疎水化処理されている、もしくは、センサ領域における複数の電極の表面以外の部位が疎水化処理されている、ものとされる。請求項１１の発明によれば、溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサでは、液槽の底面に画定されたセンサ領域にＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、センサ領域における複数の電極の表面と複数の環状表面以外の部位が疎水化処理されている、もしくは、センサ領域における複数の電極の表面以外の部位が疎水化処理されている、ものとされる。

【0021】

請求項１２の発明によれば、溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサでは、液槽の底面に画定されたセンサ領域にアレイ状に配列された複数のウェルが形成され、ＬＳＩチップに設けられている複数の電極はそれぞれ複数のウェルに位置しているものとされる。

【0022】

請求項１３の発明では請求項１２の発明において、ＬＳＩチップは複数の電極の表面と、複数の電極の表面をそれぞれ囲んで複数のウェルに位置する複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されているものとされる。

【発明の効果】

【0023】

この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法によれば、触媒反応が営まれる第１の液体は第２の液体によって覆われて蒸発が防がれるため、触媒反応生成物の高濃度を図るべく、第一の液体を極微量としても蒸発によって測定が不可能になるということは発生せず、よって高感度の測定を良好に実施することができる。そして、そのような高感度の測定を分光学的測定を用いる場合に比し、安価かつコンパクトに実施することができる。

【0024】

また、この発明によれば、このような触媒反応生成物の電気化学的測定に好適なトランスデューサを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法を説明するための図。

【図2】Ａは第１の液体の保持構造の第１の例を示す図、Ｂは第１の液体の保持構造の第２の例を示す図、Ｃは第１の液体の保持構造の第３の例を示す図、Ｄは第１の液体の保持構造の第４の例を示す図、Ｅは第１の液体の保持構造の第５の例を示す図。

【図3】Ａは第１の液体の保持構造の第６の例を示す図、Ｂは第１の液体の保持構造の第７の例を示す図、Ｃは第１の液体の保持構造の第８の例を示す図。

【図4】ウェルによる第１の液体の保持構造の一例を説明するための図。

【図5】ウェルによる第１の液体の保持構造の他の例を示す図。

【図6】Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図、Ｂはその断面図。

【図7】図６Ａに示したトランスデューサの斜視図。

【図8】図６Ａに示したトランスデューサにおける電極の配列を説明するための図。

【発明を実施するための形態】

【0026】

この発明の実施形態を図面を参照して実施例により説明する。

【0027】

この発明は第１の液体内で進行する触媒反応によって生成されて第１の液体に溶解している触媒反応生成物の測定に電気化学的測定を用いるものであり、図１はこの発明による電気化学的測定を行う電気化学測定装置の構成例を模式的に示したものである。

【0028】

電気化学測定装置は液槽１０を備え、液槽１０には第１の液体２０と、第１の液体２０と液液界面を形成して接する第２の液体３０とが収容されている。第１の液体２０は図１に示したように液槽１０の底面１１上に位置され、第２の液体３０によって覆われている。

【0029】

作用極４０は液槽１０の底面１１に配置されて第１の液体２０内に位置している。対極５０及び参照極６０は第２の液体３０内に配置され、第１の液体２０と第２の液体３０の液液界面を介して作用極４０と電気的に接続されている。図１中、７０は塩橋を示す。

【0030】

作用極４０、対極５０及び参照極６０はこの例ではポテンショスタット８０に接続されており、ポテンショスタット８０は可変電源８１と電圧計８２と電流計８３とを含んで構成されている。

【0031】

上記のような構成において、触媒反応生成物は第２の液体３０には溶解せず、第１の液体２０内に閉じ込められ、触媒反応生成物が作用極４０において酸化又は還元反応をすることで作用極４０に電流が流れ、この電流を測定することで触媒反応生成物の測定、即ち検出や定量を行えるものとなっている。

【0032】

なお、図１では簡略化して作用極４０を１つのみ示しているが、作用極４０は例えばアレイ状に配列されて複数配置される。複数の作用極４０に対し、第１の液体２０は作用極４０の各々に対応して相互に連続することなく各独立した液塊とされ、第２の液体３０はこれら第１の液体２０の複数の液塊のすべてとそれぞれ液液界面を形成して接する連続した１つの液塊とされる。

【0033】

以下、この発明による電気化学的測定方法をＥＬＩＳＡに用いる場合について説明する。

【0034】

ＥＬＩＳＡは試料中に含まれる抗原または抗体を酵素で標識し、その酵素の反応生成物を測定することで、抗原抗体複合体の検出、定量を行うもので、例えばサンドイッチ法のＥＬＩＳＡを電気化学的測定方法によって行う場合、
（１）作用極の直上または近傍表面を担体として捕捉抗体を固定化
（２）ブロッキング剤を添加
（３）検出抗原を添加
（４）一次抗体を添加
（５）酵素標識した二次抗体を添加
（６）基質を含む第１の液体（測定溶液）を添加、酵素反応により作用極近傍に酵素反応生成物を蓄積
（７）作用極を用い、酵素反応生成物を電気化学的に定量
といった操作を一般的に行う。なお、洗浄、インキュベーション等の操作は上記では省略している。

【0035】

この電気化学的測定方法において、この発明では図１に示したように第１の液体２０全体を第２の液体３０で覆う操作を追加する。

【0036】

第２の液体３０には第１の液体２０に不溶で、かつ導電性を有する液体を用いる。ＥＬＩＳＡにおいて第１の液体２０には通常緩衝能を有する水溶液を使用するため、第２の液体３０には水に不溶で、かつ導電性を得るための支持塩を溶解可能な有機溶媒を用いる。

【0037】

このような溶媒のうち、電気化学的測定の溶媒として扱いやすい、即ち常温において液状で、測定電位範囲内において水及び電極材料（金や白金等）との反応性が低い液体を用いるのが好ましい。例として挙げれば、ニトロベンゼン、ジクロロベンゼン、ニトロフェニルオクチルエーテル、ジクロロエタン、ジクロロブタン、ジクロロヘキサン、オクタノール、デカジエンが好適である。

【0038】

また、これらの溶媒に可溶で、液体に導電性を付与することが可能な支持塩には、一般的な非水溶液中での電気化学的測定に使用される支持塩を使用することができる。例として挙げれば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン及びスルホン酸イオンのうち、いずれか１つをアニオンとして有し、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオン及び任意のアルキル鎖長を有するテトラアルキルアンモニウムイオンのうち、いずれか１つをカチオンとして有する塩が好適である。

【0039】

標識酵素及び基質の組み合わせには、電気化学活性を有し、かつ第１の液体２０に可溶で第２の液体３０に不溶な生成物を生成可能な組み合わせが選択される。第１の液体２０が水溶液、第２の液体３０が前述した有機溶媒である場合、標識酵素と基質の組み合わせとしては例えばアルカリホスファターゼとｐ－アミノフェニルリン酸の組み合わせや西洋わさびぺルオキシダーゼとフェリシアン化カリウムの組み合わせが好適である。

【0040】

この発明では高感度な測定を行うべく、極微量な第１の液体２０が図１に示したように作用極４０と接触した状態で保持され、さらに作用極４０、対極５０、参照極６０が第１の液体２０及び第１の液体２０を覆う第２の液体３０を介して互いに電気的に接続されている状態を構築する必要がある。しかしながら、液槽１０の底面１１に位置する作用極４０に例えば第１の液体２０を滴下したのち、特段の工夫なしに第２の液体３０を導入すると、第２の液体３０の水力学的作用により第１の液体２０が作用極４０上より押し流されてしまうといったことが生じる。また、第１の液体２０の密度が第２の液体３０の密度より小さい場合には浮力の作用により第１の液体２０は作用極４０より引きはがされてしまう。このため、このような水力学的作用及び浮力の作用を上回る程度に第１の液体２０を作用極４０上に強く保持する必要がある。

【0041】

このような第１の液体２０の保持のため、この発明では第１の液体２０の保持構造を採用する。保持構造は、
ａ）作用極４０の表面と、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位との少なくとも一方の親水化処理
ｂ）液槽１０の底面１１の第２の液体３０が位置する部位の疎水化処理
ｃ）ａ），ｂ）の両方の処理
のいずれかとする。

【0042】

図２及び３は上記した処理による第１の液体２０の保持構造の各種例を示したものであり、図中、９１は親水化処理領域を示し、９２は疎水化処理領域を示す。なお、図２及び３では１つの作用極４０についてのみ示しており、液槽１０の底面１１に位置する作用極４０はこの例では円形の表面形状を有するものとなっている。

【0043】

図２Ａは作用極４０の表面と、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位を親水化処理し、液槽１０の底面１１の第２の液体３０が位置する部位を疎水化処理した例を示したものである。

【0044】

図２Ｂは作用極４０の表面は親水化処理せず、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位のみ親水化処理し、さらに液槽１０の底面１１の第２の液体３０が位置する部位を疎水化処理した例を示したものである。

【0045】

図２Ｃは作用極４０の表面と、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位を親水化処理しただけの例を示したものである。

【0046】

図２Ｄは作用極４０の表面は親水化処理せず、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位のみを親水化処理しただけの例を示したものである。

【0047】

図２Ｅは親水化処理せず、液槽１０の底面１１の第２の液体３０が位置する部位を疎水化処理しただけの例を示したものである。

【0048】

図３Ａは作用極４０の表面を親水化処理し、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面以外の部位、即ち第２の液体３０が位置する部位を疎水化処理した例を示したものである。

【0049】

図３Ｂは作用極４０の表面を親水化処理しただけの例を示したものである。

【0050】

図３Ｃは親水化処理せず、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面以外の部位、即ち第２の液体３０が位置する部位を疎水化処理しただけの例を示したものである。

【0051】

一般的には第１の液体２０の１つの液塊の、液槽１０の底面１１における大きさは作用極４０の大きさより大きくされ、よって図２Ａ～Ｅに示したような第１の液体２０の保持構造となるが、例えば作用極４０の大きさや第１の液体２０の液塊の大きさの選定によっては図３Ａ～Ｃに示したような第１の液体２０の保持構造も採用しうる。

【0052】

第１の液体２０を作用極４０上に強く保持する上では図２Ａや図３Ａに示したように上記ｃ）に記したａ），ｂ）両方の処理を行うのが好ましい。なお、作用極４０の親水化処理の仕方によっては、作用極４０表面の固液界面における電子移動速度を著しく低下させ、それによって測定の感度を低下させてしまうことも起こり得る。これを回避したい場合は図２Ｂ，Ｄ，Ｅや図３Ｃに示した第１の液体２０の保持構造とする。

【0053】

作用極４０の表面の親水化処理は、親水基を有する親水化剤を用いた作用極４０の表面の化学修飾によって行うことができる。作用極４０の材料が金や白金の場合、親水化剤には２－メルカプトエタンスルホン酸、２－アミノエタンチオール、３－メルカプトプロピオン酸等を用いることができる。これらの親水化剤は分子内に金や白金と選択的に結合可能な官能基を有するため、これらの親水化剤を含む溶液を液槽１０の底面１１に添加するだけで作用極４０の表面のみを選択的に化学修飾することができる。

【0054】

なお、親水化剤が２－アミノエタンチオール、３－メルカプトプロピオン酸等の場合は、後に行う捕捉抗体の作用極４０上への固定化の際、作用極４０上に導入された活性なアミノ基、カルボキシル基をアンカー分子として利用することもできる。

【0055】

次に、液槽１０の底面１１の、作用極４０の表面を囲む環状部位の親水化処理について説明する。作用極４０は前述したようにアレイ状に配列されて複数配置されており、これら作用極４０は具体的には基板等に配列形成されたものとなっており、この作用極４０が配列形成された基板等が液槽１０の底面１１に位置される。よって、作用極４０の表面を囲む環状部位は例えば基板の表面によって構成される。

【0056】

基板表面の親水化処理は、基板材料がガラス、石英、アルミナ、シリコン等の場合、さらにはシリコン表面にシリコン窒化膜が形成されているような場合、アッシング処理やＵＶオゾン処理等により一時的に表面を活性化した後、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基等の親水基を分子内に有するシランカップリング剤等で処理することで行うことができる。

【0057】

液槽１０の底面１１に上述したように作用極４０が配列形成された基板が位置する場合、第２の液体３０は基板上に位置することになる。

【0058】

基板表面の疎水化処理は疎水性の感光性樹脂を用いたフォトリソグラフィによって行うことができ、これにより所定の領域のみ選択的に疎水化処理することができる。また、適当な感光性樹脂により疎水化しない部分のみマスクし、基板表面全体を疎水化剤で処理したのち、マスクに用いた感光性樹脂を溶媒により溶解除去することによっても基板表面の選択的な疎水化処理を行うことができる。このような疎水化剤には基板材料が上記した材料の場合、ヘキサメチルジシラザン、ジメチルオクタデシルクロロシラン等、疎水基を有する有機シラン化合物を用いることができる。

【0059】

以上、第１の液体２０の保持構造として親水化処理や疎水化処理を行う場合について説明したが、次にウェルによる第１の液体２０の保持構造について図４を参照して説明する。

【0060】

図４（１）は液槽１０の底面１１上にウェル１００が構成された状態を示したものであり、作用極４０はウェル１００に位置している。このようなウェル１００は例えば感光性樹脂を用いたフォトリソグラフィによって形成することができる。図中、１０１は硬化した樹脂層を示す。

【0061】

図４（２）はウェル１００に第１の液体２０が滴下され、導入された状態を示したものであり、図４（３）はさらに第２の液体３０が液槽１０に導入された状態を示したものである。第１の液体２０及び第２の液体３０は前述した第１の液体２０及び第２の液体３０と同様の液体を用いることができ、このようなウェル１００を形成することによっても第１の液体２０を作用極４０上に保持することができる。

【0062】

なお、液槽１０の底面１１にアレイ状に配列されて複数の作用極４０が位置する場合、液槽１０の底面１１上には複数の作用極４０と対応して複数のウェル１００がアレイ状に配列されて構成され、作用極４０はそれぞれウェル１００に位置される。そして、複数のウェル１００にはそれぞれ第１の液体２０の液塊が位置される。

【0063】

図５はウェル１００における第１の液体２０の保持力を向上させるため、作用極４０の表面とウェル１００に位置する液槽１０の底面、具体的に言えば作用極４０の表面を囲む基板の表面とを前述した親水化処理と同様に親水化処理した例を示したものである。このようにウェル１００の内部底面を親水化処理してもよい。なお、親水化処理領域９１は作用極４０の表面だけとしてもよく、またウェル１００の内部底面における作用極４０の表面を囲む環状部位だけとしてもよい。

【0064】

ここまでＥＬＩＳＡを例に、この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法について説明したが、この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法によれば、以下の効果を得ることができる。

【0065】

１）第１の液体２０は第２の液体３０によって覆われているので蒸発を防ぐことができ、よって高感度の測定を良好に行うことができる。

【0066】

２）分光学的測定のように比較的大がかりな測定装置を必要とし、また高価な基質を用いる測定方法に比べ、安価かつコンパクトに測定を実施することができる。

【0067】

３）複数の作用極４０を備え、それら作用極４０によって多数の測定を同時に行う多点検出（網羅的多点検出）においては、第１の液体２０の液塊どうしが第２の液体３０によって相互に分離されているため、クロストークを防止することができ、高精度の測定を行うことができる。

【0068】

４）触媒反応生成物の濃度向上のため、第１の液体２０の液塊を微小としても、対極５０及び参照極６０は第２の液体３０に配置されるため、対極５０及び参照極６０を微小化する必要はなく、よって対極５０及び参照極６０を容易に構成、配置することができる。

【0069】

５）多点検出においては多数の作用極４０に対し、対極５０及び参照極６０はそれぞれ液槽１０に１つあればよく、この点でもコンパクトに測定を実施することができる。

【0070】

このような効果を奏するこの発明による電気化学的測定方法は、第１の液体２０中で進行する触媒反応による生成物が測定対象であり、その触媒反応の進行に伴って触媒反応生成物の第１の液体２０中での濃度が増大し、その触媒反応生成物が電気化学的に測定可能であって、かつそれが溶解しない第２の液体３０を選べるならば、その測定に適用することができる。

【0071】

なお、上述したＥＬＩＳＡの例では触媒として酵素を用いているが、触媒はこれに限らない。例えば、金属触媒、リボザイム、酵素を表面あるいは内部に有する細胞、オルガネラ、またはこれらを人工的に吸着、結合させた微粒子、ベシクル等を用いることもできる。

【0072】

また、上述したＥＬＩＳＡの例では触媒を作用極４０の直上または底面１１の作用極４０の近傍の部位に担持する手法として、予め作用極４０または底面１１のその近傍部位の表面に吸着させた捕捉抗体に、検出抗原、一次抗体を介して酵素標識二次抗体を相互作用させ、抗原－抗体－酵素複合体を形成することで、間接的に触媒を担持する手法を用いたが、触媒を担持する手法はこれに限らない。例えば、予め前記表面に吸着させたプローブＤＮＡに、プローブＤＮＡと相補的で、かつ触媒で標識された一本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることで、間接的に触媒を担持してもよい。

【0073】

同様に、予め前記表面に吸着させた抗原、ペプチド、糖鎖等に、これら分子に特異的に吸着し、かつ触媒で標識された抗体、レクチン等を相互作用させることで、間接的に触媒を担持してもよい。

【0074】

このような担持手順は、前記表面に吸着させた物質と、触媒で標識された物質との相互作用の有無や程度を測定する目的で、ＤＮＡチップやプロテインチップの測定を行う際に用いることができる。

【0075】

あるいは、触媒そのものの活性を測定することを目的とした場合は、触媒を直接前記表面に担持してもよい。

【0076】

次に、上述した触媒反応生成物の電気化学的測定に用いて好適なこの発明によるトランスデューサの構成について図６～８を参照して説明する。

【0077】

このトランスデューサはバイオＬＳＩチップと称されるもので、溶液１１０を収容することができる液槽１２０がＬＳＩチップ１３０上に搭載された構成となっている。液槽１２０の中央には穴１２１が形成されており、ＬＳＩチップ１３０はこの穴１２１の下端に穴１２１を塞ぐように配置されている。

【0078】

ＬＳＩチップ１３０及び液槽１２０は基板１４０上に搭載固定されており、基板１４０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン１４１が形成されている。図６Ｂ中、１５０はＬＳＩチップ１３０と配線パターン１４１とを接続するボンディングワイヤを示す。

【0079】

ＬＳＩチップ１３０の上面にはセンサ領域１３１が構成されている。図６Ａ及び図７ではセンサ領域１３１をハッチングを付して示しており、液槽１２０の底面の穴１２１の位置にセンサ領域１３１は画定されている。

【0080】

図６及び図７では詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域１３１に、作用極として機能するφ４０μｍの電極１３２が２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に配列されて形成されている。図８は電極１３２が配列形成されているセンサ領域１３１の一部を示したものである。電極１３２の構成材料はこの例では金とされ、電極１３２以外の少なくともセンサ領域１３１を含むＬＳＩチップ１３０の上面はシリコン窒化膜よりなるものとされている。ＬＳＩチップ１３０は各電極１３２での酸化又は還元反応を電流値として検出し、増幅する機能等を備えている。

【0081】

上記のような構成を有するＬＳＩチップ１３０において、この例では各電極１３２の表面と、各電極１３２の表面をそれぞれ囲む環状表面とに、前述の図２及び図３に示したような親水化処理や疎水化処理のいずれかが施されているか、あるいは図４及び図５を参照して説明したようなウェルがアレイ状に配列されて形成されているものとされる。このような構造を有することにより、このトランスデューサは触媒反応が営まれる第１の液体の液塊を各電極１３２上に強く保持することができるものとなっている。なお、図６及び図７において溶液１１０として示しているものは第１の液体を覆う第２の液体であって、第１の液体の微小な液塊の図示は省略している。

【0082】

図６中に示した対極１６０及び参照極１７０はトランスデューサとは別部品とされ、測定時に第２の液体中に投入される。

【符号の説明】

【0083】

１０ 液槽 １１ 底面
２０ 第１の液体 ３０ 第２の液体
４０ 作用極 ５０ 対極
６０ 参照極 ７０ 塩橋
８０ ポテンショスタット ８１ 可変電源
８２ 電圧計 ８３ 電流計
９１ 親水化処理領域 ９２ 疎水化処理領域
１００ ウェル １０１ 樹脂層
１１０ 溶液 １２０ 液槽
１２１ 穴 １３０ ＬＳＩチップ
１３１ センサ領域 １３２ 電極
１４０ 基板 １４１ 配線パターン
１５０ ボンディングワイヤ １６０ 対極
１７０ 参照極

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】