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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-01
(45)【発行日】2023-02-09
(54)【発明の名称】アマニチンの新規な合成方法
(51)【国際特許分類】
C07D 487/04 20060101AFI20230202BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230202BHJP
C07K 7/64 20060101ALI20230202BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230202BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230202BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230202BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230202BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20230202BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230202BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230202BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20230202BHJP
A61K 47/51 20170101ALI20230202BHJP
【ＦＩ】
C07D487/04 137
C07D487/04 CSP
C07K7/06
C07K7/64
A61K38/08
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P11/00
A61P13/08
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K47/65
A61K47/51
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020506728
(86)(22)【出願日】2018-08-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-10-08
(86)【国際出願番号】 EP2018071265
(87)【国際公開番号】W WO2019030171
(87)【国際公開日】2019-02-14
【審査請求日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】17185181.9
(32)【優先日】2017-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】505348522
【氏名又は名称】ハイデルベルク ファルマ リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ジーモン ヴェルナー
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルナー ジーモン スザンネ
(72)【発明者】
【氏名】ルッツ クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ミュラー クリシュトフ
(72)【発明者】
【氏名】ヘヒラー トルシュテン
(72)【発明者】
【氏名】クルケ ミヒャエル
【審査官】宮田 透
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０４６６５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２２０６８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０５９６２２（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ２０１／００－５２１／００
Ａ６１Ｋ ３１／３３－ ３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－ ４３／００
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－ ４７／６９
ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉに示される、２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体。【化26】
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；
Ｐ1、Ｐ2は、独立して、水素および保護基から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリールから選択され；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ１、および１～７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【請求項2】
Ｒ１が、ＣＦ3である、請求項１に記載の、２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体。
【請求項3】
保護基が存在する場合、該保護基が、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ－、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ－ＣＯ－、およびトリチルから、独立して選択される、請求項１または２に記載の、２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体。
【請求項4】
６’－アミノ－置換されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の、８個のアミノ酸残基を含む、直鎖状前駆体の合成のための方法であって、前記前駆体のペプチド合成において、請求項１～３のいずれか一項に記載の、２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体を使用するステップを含む方法。
【請求項5】
６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の合成方法であって、（ｉ）システイン残基と、請求項４に記載された直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすか、または可能にし、そして
（ｉｉ）請求項４に記載の直鎖状前駆体のＮ末端を、前記前駆体のＣ末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の生成を引き起こすかまたは可能にするステップを含む。
【請求項6】
システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドまたはスルホンを形成することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
スルホキシドを形成するために、システイン部分の硫黄原子の酸化を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノ－アマニン、（ｉｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノーアマニンアミド、６’－アミノ－アマニンアミド、
から選択される、６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体。
【請求項9】
（ａ）請求項８の６’－アミノ－置換されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体；（ｂ）標的結合部分；および、
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー；
を含む複合体。
【請求項10】
請求項８に記載のアマニチン誘導体または請求項９に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項11】
患者における癌の治療に使用するための、請求項８に記載のアマニチン誘導体または請求項９に記載の複合体。
【請求項12】
癌が、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫から選択される、請求項１１に記載のアマニチン誘導体または複合体。
【請求項13】
患者における癌の治療に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項14】
癌が、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
（ａ）請求項８に記載のアマニチン誘導体；および（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に結合するための反応性基Ｙを有するリンカー部分；を含む、構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、中央のトリプトファン部分の６’位に結合したアミノ基を有するアマニチン誘導体を合成するための新規方法に関する。
本発明はさらに、中央のトリプトファン部分の６’位に結合するアミノ基を有する、新規なアマニチン誘導体、そのようなアマニチン誘導体の新規な複合体、およびそのような複合体を含む医薬組成物に関する。
本発明は、中央のトリプトファン部分の６’位に結合したアミノ基を有するアマニチン誘導体を合成するための新規方法に関する。
本発明はさらに、中央のトリプトファン部分の６’位に結合するアミノ基を有する、新規なアマニチン誘導体、そのようなアマニチン誘導体の新規な複合体、およびそのような複合体を含む医薬組成物に関する。
【0002】
発明の背景
アマトキシンは、Ａｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓのキノコに見られる８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである（図１を参照）。
アマトキシンは、哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより影響を受ける細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。
細胞での転写の阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。
共有結合はしないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩの複合体は非常に強固である（ＫＤ＝３ｎＭ）。
酵素からのアマニチンの解離は非常に遅いプロセスであるため、影響を受けた細胞の回復はほとんどない。
転写の阻害が長すぎると、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を起こす。
アマトキシンは、Ａｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓのキノコに見られる８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである（図１を参照）。
アマトキシンは、哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより影響を受ける細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。
細胞での転写の阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。
共有結合はしないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩの複合体は非常に強固である（ＫＤ＝３ｎＭ）。
酵素からのアマニチンの解離は非常に遅いプロセスであるため、影響を受けた細胞の回復はほとんどない。
転写の阻害が長すぎると、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を起こす。
【0003】
腫瘍治療のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用は、１９８１年に、ジアゾ化を介して、Ｔｒｐ（アミノ酸４；図１を参照）のインドールリングに結合したリンカーを使用して、抗Ｔｈｙ １．２抗体をα－アマニチンに結合することによって、既に検討されていた（Ｄａｖｉｓ＆Ｐｒｅｓｔｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３（１９８１）１３８５－１３８８）。
Ｄａｖｉｓ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎは、結合位置を、７’位と特定していた。
Ｍｏｒｒｉｓ ＆ Ｖｅｎｔｏｎは、７’位での置換が、細胞傷害活性を維持する誘導体を齎すことも実証した（Ｍｏｒｒｉｓ ＆ Ｖｅｎｔｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．２１（１９８３）４１９－４３０）。
Ｄａｖｉｓ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎは、結合位置を、７’位と特定していた。
Ｍｏｒｒｉｓ ＆ Ｖｅｎｔｏｎは、７’位での置換が、細胞傷害活性を維持する誘導体を齎すことも実証した（Ｍｏｒｒｉｓ ＆ Ｖｅｎｔｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．２１（１９８３）４１９－４３０）。
【0004】
特許出願ＥＰ １ ８５９ ８１１ Ａ１（２００７年１１月２８日公開）は、β－アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ－原子が、アルブミンまたはモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、またはＰＡ－１に直接、すなわちリンカー構造なしで結合した、複合体を記載した。
さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ－７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）およびＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果を示した。
アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーを含む、リンカーの使用が提案されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、結合部位などの詳細は、アマトキシンでは、提供されなかった。
さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ－７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）およびＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果を示した。
アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーを含む、リンカーの使用が提案されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、結合部位などの詳細は、アマトキシンでは、提供されなかった。
【0005】
特許出願ＷＯ ２０１０／１１５６２９およびＷＯ ２０１０／１１５６３０（両方とも、２０１０年１０月１４日公開）は、ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５などの抗ＥｐＣＡＭ抗体などの抗体が、
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ－原子
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ－原子、または
（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ－原子
を介してアマトキシンに結合している複合体を記載しており、それぞれの場合、当該抗体は、アマトキシンと、直接またはリンカーを介して抗体と結合する。
提案されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の要素を含む。
さらに、乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ－７）、膵臓がん（細胞株Ｃａｐａｎ－１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、および胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果が示された。
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ－原子
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ－原子、または
（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ－原子
を介してアマトキシンに結合している複合体を記載しており、それぞれの場合、当該抗体は、アマトキシンと、直接またはリンカーを介して抗体と結合する。
提案されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の要素を含む。
さらに、乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ－７）、膵臓がん（細胞株Ｃａｐａｎ－１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、および胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果が示された。
【0006】
特許出願ＷＯ ２０１２／１１９７８７は、そのようなアマトキシンと、その標的である哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を妨げることなく、トリプトファンアミノ酸４の追加の付着部位、すなわち、１’－Ｎ位で、リンカーを介して、標的結合部分をアマトキシンに結合できることを記載している。
【0007】
特許出願ＷＯ ２０１４／００９０２５は、出発物質の１つとして、γ，δ－ジヒドロキシイソロイシンの新規シントンを使用したアマニチン誘導体の全合成を記載している。
さらに、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８９８４［ＷＯ ２０１７／０８９６０７として公開］は、容易に入手可能な（２Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）－Ｌ－４－ヒドロキシイソロイシンを、出発材料の１つとして使用したγ－および(－アマニチンの誘導体の全合成について記述している。
しかしながら、これらの方法、および、これまで追求してきた、他のすべての完全な、または部分的な合成アプローチは、Ｓａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａに記載の方法を用いて、アマトキシンのコアに、中央のトリプトファン部分を組み込むものである。
この方法では、シス－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ、８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（「Ｈｐｉ」）が、直鎖アマニチン前駆体構造に組み込まれる。
酸触媒Ｈｐｉ－システインカップリング反応では、中心のトリプトファン部分を有するアマニチン環系が形成される。
さらに、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８９８４［ＷＯ ２０１７／０８９６０７として公開］は、容易に入手可能な（２Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）－Ｌ－４－ヒドロキシイソロイシンを、出発材料の１つとして使用したγ－および(－アマニチンの誘導体の全合成について記述している。
しかしながら、これらの方法、および、これまで追求してきた、他のすべての完全な、または部分的な合成アプローチは、Ｓａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａに記載の方法を用いて、アマトキシンのコアに、中央のトリプトファン部分を組み込むものである。
この方法では、シス－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ、８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（「Ｈｐｉ」）が、直鎖アマニチン前駆体構造に組み込まれる。
酸触媒Ｈｐｉ－システインカップリング反応では、中心のトリプトファン部分を有するアマニチン環系が形成される。
【0008】
ただし、Ｈｐｉは、Ｈｐｉのインドール部分のフェニル環に結合した官能基部分を持たない。
したがって、Ｓａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａによる方法から得られるアマニチン生成物は、さらなる置換基のない中心トリプトファン部分を含む。
天然に存在する(－、β－、γ－、およびε－アマニチンは、しかしながら、中心の６’－ヒドロキシ－トリプトファン部分を含み、その６’－ヒドロキシ基は、アマニチンの官能化のための官能基として、たとえば、直接またはリンカーを介して、標的部分に結合することによって、成功裏に使用されてきた（たとえば、ＷＯ ２０１０／１１５６２９、ＷＯ ２０１０／１１５６３０、およびＷＯ ２０１２／０４１５０４を参照）。
したがって、合成アマニチンの場合、上記のように、
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ－原子を介して、または
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ－原子を介して、あるいは、
ＷＯ２０１２／１１９７８７に記載されているように、トリプトファン部分の窒素原子を介して官能化を行う必要があった。
したがって、Ｓａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａによる方法から得られるアマニチン生成物は、さらなる置換基のない中心トリプトファン部分を含む。
天然に存在する(－、β－、γ－、およびε－アマニチンは、しかしながら、中心の６’－ヒドロキシ－トリプトファン部分を含み、その６’－ヒドロキシ基は、アマニチンの官能化のための官能基として、たとえば、直接またはリンカーを介して、標的部分に結合することによって、成功裏に使用されてきた（たとえば、ＷＯ ２０１０／１１５６２９、ＷＯ ２０１０／１１５６３０、およびＷＯ ２０１２／０４１５０４を参照）。
したがって、合成アマニチンの場合、上記のように、
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ－原子を介して、または
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ－原子を介して、あるいは、
ＷＯ２０１２／１１９７８７に記載されているように、トリプトファン部分の窒素原子を介して官能化を行う必要があった。
【0009】
Ｈｐｉは、トリプトファンを、過酢酸または光化学で、一重項酸素と反応させることによって得ることができる。
しかし、Ｈｐｉのインドール部分のフェニル環に結合した置換基を有する誘導体は、これまでに記載されていない。
しかし、Ｈｐｉのインドール部分のフェニル環に結合した置換基を有する誘導体は、これまでに記載されていない。
【0010】
アマトキシンへの完全合成経路の使用は、治療用途に必要な大量のアマトキシンの供給のオプションを提供し、そして、ビルディングブロックとして適切な出発材料を使用することにより、さまざまな新規アマトキシンバリアントの構築物を提供することができる。
過去に追行したアプローチは、これらのアマニチンにおいて、コアのトリプトファン部分に結合している６’－ヒドロキシ部分が、組み込まれないので、α－、β－、γ－、および／またはε－アマニチンの天然構造は、まだ得られなかったという事実によって制限されていた。
したがって、合成アマニチンを官能化するためのオプションはこれまでかなり制限されてきた。
さらに、フェノール性ヒドロキシ基の反応性は、いずれにせよ最適ではないため、アミノ基などの代替官能基は、特に興味深い。
なぜなら、官能化に利用可能なオプションの範囲を拡大することが非常に望ましいからである。なぜなら、立体障害や反応性のような因子は、合成アマニチンおよびその複合体の反応性、生物活性および／または安定性に強い影響を与える可能性があるからである。
しかし、非常に有毒のアマニチンを含む複合体の安定性および有効性は、ヒトへの投与のための治療分子として想定される使用のために最も重要である。
これまで、トリプトファン部分へのアミノ官能基の導入は、完全なアマトキシン部分の修飾、たとえば、ジアゾ化（Ｆａｌｃｋ－Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２１，１９８３、４３１－４３９）またはニトロ化（ＷＯ ２０１７／０４６６５８）によってのみ達成されてきた。
しかしながら、ＷＯ ２０１７／０４６６５８の場合、ニトロ化反応は、中央のトリプトファン部分の５’位でニトロ化されたアマトキシン誘導体を齎した。
したがって、６’位にアミノ基を導入することを可能にするアプローチは、これまで記載されていない。
過去に追行したアプローチは、これらのアマニチンにおいて、コアのトリプトファン部分に結合している６’－ヒドロキシ部分が、組み込まれないので、α－、β－、γ－、および／またはε－アマニチンの天然構造は、まだ得られなかったという事実によって制限されていた。
したがって、合成アマニチンを官能化するためのオプションはこれまでかなり制限されてきた。
さらに、フェノール性ヒドロキシ基の反応性は、いずれにせよ最適ではないため、アミノ基などの代替官能基は、特に興味深い。
なぜなら、官能化に利用可能なオプションの範囲を拡大することが非常に望ましいからである。なぜなら、立体障害や反応性のような因子は、合成アマニチンおよびその複合体の反応性、生物活性および／または安定性に強い影響を与える可能性があるからである。
しかし、非常に有毒のアマニチンを含む複合体の安定性および有効性は、ヒトへの投与のための治療分子として想定される使用のために最も重要である。
これまで、トリプトファン部分へのアミノ官能基の導入は、完全なアマトキシン部分の修飾、たとえば、ジアゾ化（Ｆａｌｃｋ－Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２１，１９８３、４３１－４３９）またはニトロ化（ＷＯ ２０１７／０４６６５８）によってのみ達成されてきた。
しかしながら、ＷＯ ２０１７／０４６６５８の場合、ニトロ化反応は、中央のトリプトファン部分の５’位でニトロ化されたアマトキシン誘導体を齎した。
したがって、６’位にアミノ基を導入することを可能にするアプローチは、これまで記載されていない。
【0011】
発明の目的
従って、特に、トリプトファン部分の６’位で、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したアミノ基を有するアマトキシンを合成する、コスト効率的かつ堅牢な方法の大きな必要性が依然として存在する。
特に、確立されたＳａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａ反応において使用でき、そして、そのようなアミノ基の取り込みを引き起こすことができるようにセットアップされた出発物質を特定する、強い必要性がある。
従って、特に、トリプトファン部分の６’位で、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したアミノ基を有するアマトキシンを合成する、コスト効率的かつ堅牢な方法の大きな必要性が依然として存在する。
特に、確立されたＳａｖｉｇｅ－Ｆｏｎｔａｎａ反応において使用でき、そして、そのようなアミノ基の取り込みを引き起こすことができるようにセットアップされた出発物質を特定する、強い必要性がある。
【0012】
発明の概要
本発明は、アマニチン誘導体の合成において、アミノ基の導入を可能にする、Ｈｐｉの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
本発明は、アマニチン誘導体の合成において、アミノ基の導入を可能にする、Ｈｐｉの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
【0013】
したがって、本発明は、一の態様において、式Ｉの、２－カルボキシ‐３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ、８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体に関する。
式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；特に、Ｒ１はＣＦ3であり；
Ｐ1、Ｐ2は、それぞれ、水素または保護基、特に、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ－、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ－ＣＯ－、およびトリチルから独立して選択される保護基であり、
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールから選択され；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ１、および１～７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【化1】
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；特に、Ｒ１はＣＦ3であり；
Ｐ1、Ｐ2は、それぞれ、水素または保護基、特に、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ－、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ－ＣＯ－、およびトリチルから独立して選択される保護基であり、
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールから選択され；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ１、および１～７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【0014】
第２の態様において、本発明は、６’－アミノ置換トリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基を含む直鎖状前駆体の合成方法に関し、前記前駆体のペプチド合成における本発明の２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ,８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体使用を使用するステップを含む。
【0015】
第３の態様では、本発明は、６’－アミノ置換トリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の合成方法に関し、以下のステップを含む。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして、
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ‐末端を、前記前駆体のＣ‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にする。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして、
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ‐末端を、前記前駆体のＣ‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にする。
【0016】
第４の局面において、本発明は、
（ｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノアマニン、
（ｉｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド、６’－アミノアマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチンの誘導体
から選択され、６’－アミノ－置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分を、カルボン酸エステル、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４または、部分－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ４へ変換される。
（ｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノアマニン、
（ｉｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド、６’－アミノアマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチンの誘導体
から選択され、６’－アミノ－置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分を、カルボン酸エステル、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４または、部分－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ４へ変換される。
【0017】
第５の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分、および；
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー；
を含む複合体に関する。
（ａ）本発明の６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分、および；
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー；
を含む複合体に関する。
【0018】
第６の態様では、本発明は、本発明のアマニチンまたは本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【0019】
第７の態様において、本発明は、本発明のアマニチン誘導体、本発明の複合体、または患者における癌（特に、前記の癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。）の治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【0020】
第８の態様では、本発明は、
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、を含む構築物に関連する。
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、を含む構築物に関連する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】は、さまざまなアマトキシンの構造式を示す。 太字の数字（１～８）は、アマトキシンを形成する８つのアミノ酸の標準的ナンバリングを示す。 アミノ酸１、３、および４の原子の標準的な名称も表示されている（それぞれ、ギリシャ文字α～γ、ギリシャ文字α～δ、および１’～７’の数字）。
【0022】
【図2】は、アミノ置換Ｈｐｉ誘導体ＨＤＰ ３０．２４１６の合成スキームを示す。
【0023】
【図3】は、６’－アミノ－アマニンアミド（ＨＤＰ ３０．２５２８）の合成スキームを示す。
【0024】
【図4】は、ＨＥＫ２９３細胞（ＥＣ50＝３．０ｘ１０-6Ｍ）およびＨＥＫ２９３ ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞（ＥＣ50＝３．０×１０-8Ｍ）における、６’－アミノ－アマニンアミド（ＨＤＰ ３０．２５２８）の細胞毒性を示す。
【0025】
【図5】は、前記構築物を標的連結部位にリンクするための反応基Ｙの例として、６’－ヒドロキシ基および末端マレイミド基に結合した切断可能なリンカーを有する、６’－アミノ－アマニンアミド（ＨＤＰ ３０．２５２８）に基づく構築物、および対応する６’－ヒドロキシ誘導体（ＨＤＰ ３０．１６９９）を示す。
【0026】
【図6A】図６は、Ａ）ＳＫＢＲ－３細胞（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ＋＋＋）とＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ＋）におけるＨＥＲ－２／ｎｅｕ、Ｂ）ＬｎＣａｐ細胞（ＰＳＭＡ＋＋＋）および２２ｒｖ１細胞（ＰＳＭＡ＋＋）におけるＰＳＭＡ、およびＣ）Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋＋＋）およびＮａｌｍ－６細胞（ＣＤ１９＋＋）におけるＣＤ１９；を標的とする、ＨＤＰ ３０．１６９９のＡＤＣ細胞毒性を、ＨＤＰ ３０．２５６０と比較して示す。
【0027】
【図7】は、ＳＫＢＲ－３細胞（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ＋＋＋）およびＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ＋）における、ＨＥＲ－２／ｎｅｕを標的とする、Ｔ－Ｄ２６５Ｃ－３０．２５４０の細胞毒性を、Ｔ－Ｄ２６５Ｃ－３０．１６９９と比較して示す。
【0028】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の、特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは異なる場合があることを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の、特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは異なる場合があることを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0029】
特に、本明細書で使用する用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（ＩＵＰＡＣ勧告）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、ＨＧＷ、Ｎａｇｅｌ、Ｂ．、Ｋoｌｂｌ、Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、スイス、バーゼル、ＣＨ－４０１０）に記載されているように定義される。
【0030】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および、たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、文脈がそうでない場合を必要としない限り、述べられた整数、組成物または工程あるいは、整数または工程の群の包含を意味すると理解されるであろう。
一方、任意の追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群も、追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群が存在しない実施態様を含めて、所望により、存在していてもよい。
そのような後者の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」と隣接して使用される。
一方、任意の追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群も、追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群が存在しない実施態様を含めて、所望により、存在していてもよい。
そのような後者の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」と隣接して使用される。
【0031】
いくつかのドキュメントがこの明細書のテキスト中で引用される。
ここで引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号シーケンス・サブミッションなどを含む）は、上記または下記にかかわらず、それぞれの特許法において、可能な範囲でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書のいかなるものも、本発明が、先行発明のおかげでそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
ここで引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号シーケンス・サブミッションなどを含む）は、上記または下記にかかわらず、それぞれの特許法において、可能な範囲でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書のいかなるものも、本発明が、先行発明のおかげでそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【0032】
本発明についてさらに説明する。
以下の節で、本発明の異なる側面をより詳細に定義する。
そのように定義された各局面は、明確に反対に示されない限り、他の任意の局面と組み合わすことができる。
特に、好ましいまたは有利であると示されている特徴は、好ましいまたは有利であると示されている他の特徴と組み合わせることができる。
以下の節で、本発明の異なる側面をより詳細に定義する。
そのように定義された各局面は、明確に反対に示されない限り、他の任意の局面と組み合わすことができる。
特に、好ましいまたは有利であると示されている特徴は、好ましいまたは有利であると示されている他の特徴と組み合わせることができる。
【0033】
本発明は、アマニチン誘導体の合成中にアミノ基の導入を可能にする、Ｈｐｉの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
【0034】
したがって、本発明は、一の態様において、式Ｉの、２－カルボキシ‐３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ,８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体に関する。
式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；特に、Ｒ１はＣＦ3であり、
Ｐ1、Ｐ2は、それぞれ、水素または保護基であり；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールから選択され；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ１、および１～７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【化2】
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；特に、Ｒ１はＣＦ3であり、
Ｐ1、Ｐ2は、それぞれ、水素または保護基であり；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールから選択され；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ１、および１～７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【0035】
本発明の文脈において、「保護基」という用語は、式Ｉに係る化合物を、合成および／または更なる官能化をするために使用される他の反応物との反応から、窒素原子をブロックするために、中央のヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール部分の１位または８位の窒素原子に結合している基を意味する。
当業者は、当技術分野で利用可能であり、窒素原子を保護する必要がある場合には、対応する窒素原子に結合することができ、Ｎ－保護はもはや必要でないときには除去することができる、異なる保護基に非常に詳しい。
特定の実施形態では、Ｎ－保護は、Ｎ－アシル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ1および／またはＰ2はアシル基である。
特定の他の実施形態では、Ｎ－保護は、Ｎ－アルキル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ1および／またはＰ2はアルキル基である。
当業者は、当技術分野で利用可能であり、窒素原子を保護する必要がある場合には、対応する窒素原子に結合することができ、Ｎ－保護はもはや必要でないときには除去することができる、異なる保護基に非常に詳しい。
特定の実施形態では、Ｎ－保護は、Ｎ－アシル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ1および／またはＰ2はアシル基である。
特定の他の実施形態では、Ｎ－保護は、Ｎ－アルキル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ1および／またはＰ2はアルキル基である。
【0036】
特定の実施形態では、保護基Ｐ1またはＰ2は存在する場合、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ－、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ－ＣＯ－、およびトリチルから独立して選択される。
特定の実施形態では、２位に結合した官能基に関して、位置３ａのヒドロキシ基と位置８ａの水素原子はシス配置である。
特定の実施形態では、２位に結合した官能基に関して、位置３ａのヒドロキシ基と位置８ａの水素原子はシス配置である。
【0037】
別の特定の実施形態では、２位に結合した官能基に関して、位置３ａのヒドロキシ基と位置８ａの水素原子がトランス配置である。
特定の実施形態では、本発明によるアミノ置換誘導体は、シスーおよびトランスー配置を有する化合物の混合物である。
特定の実施形態では、本発明によるアミノ置換誘導体は、シスーおよびトランスー配置を有する化合物の混合物である。
【0038】
第２の態様において、本発明は、６’－アミノ－置換されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基を含む、直鎖状前駆体の合成のための方法に関し、前記前駆体のペプチド合成における本発明の２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－１，２，３，３ａ,８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドールのアミノ置換誘導体を使用する工程を含む。
【0039】
第３の態様では、本発明は、６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の合成方法に関し、以下のステップを含む。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ－末端を、前記前駆体のＣ－末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすまたは可能にする。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ－末端を、前記前駆体のＣ－末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすまたは可能にする。
【0040】
さらなる態様では、本発明は、実施例に示すように合成された、個々のアマニチン前駆体、特に、化合物ＨＤＰ ３０．２５１６、ＨＤＰ ３０．２５２８、および［０１３７］に従って合成された、固相ベースの中間体に関係する。
【0041】
特定の実施形態では、本発明の方法は、システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドまたはスルホン、特にスルホキシドを形成することをさらに含む。
【0042】
第４の態様では、本発明は、６’－アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、
（ｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノ－アマニン、
（ｉｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド、６’－アミノ－アマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチン誘導体の誘導体；
から選択され、ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステルＣ－（＝Ｏ）ＯＲ４または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ４部分に変換される。
（ｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノ－アマニン、
（ｉｉ）Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド、６’－アミノ－アマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチン誘導体の誘導体；
から選択され、ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステルＣ－（＝Ｏ）ＯＲ４または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ４部分に変換される。
【0043】
特定の実施形態において、本発明のアマニチン誘導体は、Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニン、６’－アミノ－アマニン、Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド、および６’－アミノ－アマニンアミドから選択される。
【0044】
第５の局面において、本発明は、以下を含む、複合体に関する。
（ａ）本発明の６’－アミノ－置換されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分；および
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー。
（ａ）本発明の６’－アミノ－置換されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分；および
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー。
【0045】
第６の態様では、本発明は、本発明のアマニチンまたは本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【0046】
第７の態様において、本発明は、本発明のアマニチン誘導体、本発明の複合体、または患者における癌（特に、前記の癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。）の治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【0047】
第８の態様では、本発明は、
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、
を含む構築物に関連する。
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、
を含む構築物に関連する。
【0048】
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎｓ）の特定の群を指す。
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、アマニタ属から単離された、８個のアミノ酸から構成されるすべての環状ペプチドを含み、Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｔ．およびＦａｕｌｓｔｉｃｈ Ｈ．（Ｗｉｅｌａｎｄ Ｔ，Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ Ｈ．，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（１９７８）１８５－２６０）に記載されている。
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、以下に基いた、二環式構造を指す。
１位のアスパラギン酸またはアスパラギン残基、
２位のプロリン残基、特に、ヒドロキシプロリン残基、
３位のイソロイシン、ヒドロキシイソロイシンまたはジヒドロキシイソロイシン、
４位のトリプトファンまたはヒドロキシトリプトファン残基、
５位および７位のグリシン残基、
６位のイソロイシン残基、および
８位のシステイン残基、特に、酸化されてスルホキシドまたはスルホン誘導体になったシステイン誘導体（アマニチンの番号付けと代表例については、図１を参照してください）。
さらに、そのすべての化学誘導体を含み、
さらにそのすべての半合成類似体；
さらに、天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造によるビルディングブロックから構築されたそのすべての合成類似体、
さらに、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに、非ヒドロキシル化アミノ酸を含むすべての合成または半合成類似体、
さらに、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することによる、任意のそのような誘導体または類似体が機能的に活性である各場合の、すべての合成または半合成類縁体。
本発明の文脈において、４位のトリプトファン残基は、６’－アミノ置換誘導体で置換される。
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、アマニタ属から単離された、８個のアミノ酸から構成されるすべての環状ペプチドを含み、Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｔ．およびＦａｕｌｓｔｉｃｈ Ｈ．（Ｗｉｅｌａｎｄ Ｔ，Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ Ｈ．，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（１９７８）１８５－２６０）に記載されている。
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、以下に基いた、二環式構造を指す。
１位のアスパラギン酸またはアスパラギン残基、
２位のプロリン残基、特に、ヒドロキシプロリン残基、
３位のイソロイシン、ヒドロキシイソロイシンまたはジヒドロキシイソロイシン、
４位のトリプトファンまたはヒドロキシトリプトファン残基、
５位および７位のグリシン残基、
６位のイソロイシン残基、および
８位のシステイン残基、特に、酸化されてスルホキシドまたはスルホン誘導体になったシステイン誘導体（アマニチンの番号付けと代表例については、図１を参照してください）。
さらに、そのすべての化学誘導体を含み、
さらにそのすべての半合成類似体；
さらに、天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造によるビルディングブロックから構築されたそのすべての合成類似体、
さらに、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに、非ヒドロキシル化アミノ酸を含むすべての合成または半合成類似体、
さらに、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することによる、任意のそのような誘導体または類似体が機能的に活性である各場合の、すべての合成または半合成類縁体。
本発明の文脈において、４位のトリプトファン残基は、６’－アミノ置換誘導体で置換される。
【0049】
したがって、本発明の文脈において、「アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基」という用語は、二環式アマニチンポリペプチド構造を形成する特定のアミノ酸を指す。
【0050】
機能的には、アマトキシンは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。
好ましいアマトキシンは、上に定義した、リンカー分子または標的結合部分と反応できる官能基（たとえば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸などのカルボン酸基またはカルボン酸誘導体、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕捉基）を有するものである。
本発明の複合体に特に適しているアマトキシンは、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン、またはアマヌリン酸のジデオキシ変異体、あるいは、アマニン、アマニンアミド、γ－アマニン、またはγ－アマニンアミドのモノデオキシ変異体（図１に示す）、ならびにその塩、化学誘導体、半合成類似体、および合成類似体である。
好ましいアマトキシンは、上に定義した、リンカー分子または標的結合部分と反応できる官能基（たとえば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸などのカルボン酸基またはカルボン酸誘導体、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕捉基）を有するものである。
本発明の複合体に特に適しているアマトキシンは、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン、またはアマヌリン酸のジデオキシ変異体、あるいは、アマニン、アマニンアミド、γ－アマニン、またはγ－アマニンアミドのモノデオキシ変異体（図１に示す）、ならびにその塩、化学誘導体、半合成類似体、および合成類似体である。
【0051】
特定の実施形態において、アミノ置換誘導体、アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体および／または本発明の複合体は、９０％を超える、特に９５％を超える、より好ましくは９８％を超える、または、９９％を超える純度を有する。
【0052】
本発明の文脈において、「純度」という用語は、たとえば、存在する複合体の総量を指す。
たとえば、９０％を超える純度は、本発明の複合体を、９０％を超えて含む組成物１ミリグラムを意味し、すなわち、９００マイクログラムを超えるそのような複合体を含むことを意味する。
残りの部分、すなわち不純物には、未反応の出発物質と他の反応物、溶媒、切断生成物および／または副産物が含まれる可能性がある。
たとえば、９０％を超える純度は、本発明の複合体を、９０％を超えて含む組成物１ミリグラムを意味し、すなわち、９００マイクログラムを超えるそのような複合体を含むことを意味する。
残りの部分、すなわち不純物には、未反応の出発物質と他の反応物、溶媒、切断生成物および／または副産物が含まれる可能性がある。
【0053】
特定の実施形態では、アミノ置換誘導体、アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体、および／または本発明の複合体を含む組成物は、そのようなアミノ置換誘導体、アミノ置換トリプトファン部分を含むアマニチン誘導体、および／または複合体の、１００ミリグラム超、特に５００ミリグラム超、および更に特に、１グラム超を含む。
したがって、たとえば、従来技術の複合体の複雑な調製物におそらく存在する可能性がある本発明の複合体の微量は、明示的に除外される。
したがって、たとえば、従来技術の複合体の複雑な調製物におそらく存在する可能性がある本発明の複合体の微量は、明示的に除外される。
【0054】
本明細書で使用される「標的結合部分」という用語は、標的分子または標的エピトープに特異的に結合することができる任意の分子または分子の一部を指す。
本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、
（ｉ）抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）抗体様タンパク質；および
（ｉｉｉ）核酸アプタマー、である。
本発明における使用に適した「標的結合部位」は、典型的に、分子量４０、０００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上を有する。
本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、
（ｉ）抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）抗体様タンパク質；および
（ｉｉｉ）核酸アプタマー、である。
本発明における使用に適した「標的結合部位」は、典型的に、分子量４０、０００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上を有する。
【0055】
本明細書で使用されるように、もし、それが、１００マイクロモル以下、特に、５０マイクロモル以下、特に、３０マイクロモル以下、特に、２０マイクロモル以下、特に、１０マイクロモル以下、特に、５マイクロモル以下、より特に、１マイクロモル以下、より特に、９００ナノモル以下、より特に、８００ナノモル以下、より特に、７００ナノモル以下、より特に、６００ナノモル以下、より特に、５００ナノモル以下、より特に、４００ナノモル以下、より特に、３００ナノモル以下、より特に、２００ナノモル以下、さらにより特には、１００ナノモル以下、さらにより特に、９０ナノモル以下、さらにより特に、８０ナノモル以下、さらにより特に、７０ナノモル以下、さらにより特に、６０ナノモル以下、さらにより特に、５０ナノモル以下、さらにより特に、４０ナノモル以下、さらに特に、３０ナノモル以下、さらに特に、２０ナノモル以下、および、さらにより特に、１０ナノモル以下、の前記第二の化合物に対する解離定数ＫＤを有する場合、第一の化合物（たとえば、抗体）は、第二の化合物（たとえば、標的タンパク質のような抗原）に、「特異的に結合する」と考えられる。
【0056】
本出願の文脈において、用語「標的分子」および「標的エピトープ」は、それぞれ、標的結合部分により特異的に結合される、抗原および抗原のエピトープをそれぞれ指す。
特に、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に、非腫瘍細胞の表面と比較して、増加した濃度および／または異なる立体配置で存在する抗原またはエピトープである、
特に、前記抗原またはエピトープは、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。
特定の実施形態では、標的結合部分は、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、シアリルルイサ（ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓａ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕおよび上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）から選択される抗原のエピトープに特異的に結合する。
他の実施形態において、前記抗原またはエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞において優先的に発現される。
特定のそのような実施形態では、標的結合部分は、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。
特に、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に、非腫瘍細胞の表面と比較して、増加した濃度および／または異なる立体配置で存在する抗原またはエピトープである、
特に、前記抗原またはエピトープは、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。
特定の実施形態では、標的結合部分は、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、シアリルルイサ（ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓａ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕおよび上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）から選択される抗原のエピトープに特異的に結合する。
他の実施形態において、前記抗原またはエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞において優先的に発現される。
特定のそのような実施形態では、標的結合部分は、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。
【0057】
本明細書で使用される、「抗体またはその抗原結合フラグメント」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。
したがって、「その抗原結合断片」という用語は、少なくとも機能的な抗原結合ドメインを含む抗体の断片を指す。
また、含まれるのは、標的タンパク質、たとえば、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓａ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕおよびＥｐＣＡＭから選択される標的タンパク質に、特異的に結合する、たとえば、ファージディスプレイを含む技術を介して選択される、免疫グロブリン様タンパク質である。
本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
本発明での使用に適した「抗体およびその抗原結合断片」には、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロ複合体、多重特異性、ヒト、ヒト化（特に、ＣＤＲ移植）、脱免疫、または、キメラ抗体、単鎖抗体（たとえば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、ダイアボディまたはテトラボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１９９３）６４４４－８）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
したがって、「その抗原結合断片」という用語は、少なくとも機能的な抗原結合ドメインを含む抗体の断片を指す。
また、含まれるのは、標的タンパク質、たとえば、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓａ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕおよびＥｐＣＡＭから選択される標的タンパク質に、特異的に結合する、たとえば、ファージディスプレイを含む技術を介して選択される、免疫グロブリン様タンパク質である。
本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
本発明での使用に適した「抗体およびその抗原結合断片」には、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロ複合体、多重特異性、ヒト、ヒト化（特に、ＣＤＲ移植）、脱免疫、または、キメラ抗体、単鎖抗体（たとえば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、ダイアボディまたはテトラボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１９９３）６４４４－８）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【0058】
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、および、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されない。
単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変ドメインを単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて含んでもよい：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。
また、ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと可変ドメインの任意の組み合わせを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。
単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変ドメインを単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて含んでもよい：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。
また、ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと可変ドメインの任意の組み合わせを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。
【0059】
本発明で使用可能な抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源のものであり得る。
特に、抗体は、ヒト、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、またはイヌの起源からです。
抗体が、ヒトまたはマウス起源であることが特に好ましい。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、そして、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックであって、そして、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体が含まれる（たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されている。）。
特に、抗体は、ヒト、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、またはイヌの起源からです。
抗体が、ヒトまたはマウス起源であることが特に好ましい。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、そして、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックであって、そして、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体が含まれる（たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されている。）。
【0060】
「抗体様タンパク質」という用語は、標的分子に特異的に結合するように（たとえば、ループの突然変異誘発によって）操作されたタンパク質を指す。
典型的には、そのような抗体様タンパク質は、両端でタンパク質足場に結合した、少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。
この二重構造上の制約により、抗体様タンパク質の結合親和性が抗体のそれに匹敵するレベルまで大幅に増加する。
可変ペプチドループの長さは、通常、１０～２０個のアミノ酸から成る。
足場タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。
特に、足場タンパク質は小さな球状タンパク質である。
抗体様タンパク質には、アフィボディ、アンチカリン、および設計されたアンキリンリピートタンパク質が含まれるが、これらに限定されない（レビューについては、Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、１２５７－６８を参照）。
抗体様タンパク質は、変異体の大きなライブラリーに由来し、たとえば、大きなファージディスプレイライブラリーからパニングされ（ｐａｎｎｅｄ）、通常の抗体と同様に単離される。
また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質の表面に露出した残基のコンビナトリアル変異誘発によって得ることができる。
典型的には、そのような抗体様タンパク質は、両端でタンパク質足場に結合した、少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。
この二重構造上の制約により、抗体様タンパク質の結合親和性が抗体のそれに匹敵するレベルまで大幅に増加する。
可変ペプチドループの長さは、通常、１０～２０個のアミノ酸から成る。
足場タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。
特に、足場タンパク質は小さな球状タンパク質である。
抗体様タンパク質には、アフィボディ、アンチカリン、および設計されたアンキリンリピートタンパク質が含まれるが、これらに限定されない（レビューについては、Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、１２５７－６８を参照）。
抗体様タンパク質は、変異体の大きなライブラリーに由来し、たとえば、大きなファージディスプレイライブラリーからパニングされ（ｐａｎｎｅｄ）、通常の抗体と同様に単離される。
また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質の表面に露出した残基のコンビナトリアル変異誘発によって得ることができる。
【0061】
「核酸アプタマー」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択またはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を繰り返して、標的分子に結合するように操作された核酸分子を指す（レビューについては、ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（２０００）５－１３を参照）。
核酸アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。
アプタマーは、修飾、たとえば、２’－フッ素置換ピリミジンなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
核酸アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。
アプタマーは、修飾、たとえば、２’－フッ素置換ピリミジンなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【0062】
本発明の文脈における、「リンカー」は、それぞれがリンカーの一端に結合している２つの成分を接続している構造を指す。
リンカーが結合の場合、アマトキシンの抗体への直接結合により、アマトキシンがＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力が低下する可能性がある。
特定の実施形態では、リンカーは、２つの成分間の距離を増加させ、本事例では、抗体とアマトキシンとの間など、これらの成分間の立体干渉を軽減する。
特定の実施形態では、リンカーは、その主鎖において、１～３０個の原子の連続鎖（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０原子）を有する。
つまり、リンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体の間の原子または結合の数によって測られる最も短い結合として定義される。
ここで、リンカー主鎖の一方の側はアマトキシンと反応し、他方の側は抗体と反応するか、または反応した。
本発明の文脈において、リンカーは、特に、所望により置換された、Ｃ1-20－アルキレン、Ｃ1-20－ヘテロアルキレン、Ｃ2-20－アルケニレン、Ｃ2-20－ヘテロアルケニレン、Ｃ2-20－アルキニレン、Ｃ2-20－ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基である。
リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの１つまたは複数の構造要素を含んでもよい。
リンカーは、これらの構造要素の２つ以上の組み合わせを含むこともできる。
これらの構造要素のそれぞれは、リンカー内に１回以上、たとえば、２回、３回、４回、５回、または６回存在してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでもよい。
リンカーは、アマトキシンおよび抗体に対して、単一のステップで、またはその後の２つ以上のステップで結合する必要があることが理解されている。
そのために、リンカーは、特に近位端と遠位端に２つの基を持つ。これは、
（ｉ）リンクされる成分の１つに存在する基、特にアマトキシンまたは標的結合ペプチドの活性化された基に共有結合を形成できるか、または
（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化されるか、または活性化できる。
したがって、そのようなカップリング反応の結果である化学基、たとえば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などがリンカーの遠位端および近位端にあることが好ましい。
リンカーが結合の場合、アマトキシンの抗体への直接結合により、アマトキシンがＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力が低下する可能性がある。
特定の実施形態では、リンカーは、２つの成分間の距離を増加させ、本事例では、抗体とアマトキシンとの間など、これらの成分間の立体干渉を軽減する。
特定の実施形態では、リンカーは、その主鎖において、１～３０個の原子の連続鎖（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０原子）を有する。
つまり、リンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体の間の原子または結合の数によって測られる最も短い結合として定義される。
ここで、リンカー主鎖の一方の側はアマトキシンと反応し、他方の側は抗体と反応するか、または反応した。
本発明の文脈において、リンカーは、特に、所望により置換された、Ｃ1-20－アルキレン、Ｃ1-20－ヘテロアルキレン、Ｃ2-20－アルケニレン、Ｃ2-20－ヘテロアルケニレン、Ｃ2-20－アルキニレン、Ｃ2-20－ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基である。
リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの１つまたは複数の構造要素を含んでもよい。
リンカーは、これらの構造要素の２つ以上の組み合わせを含むこともできる。
これらの構造要素のそれぞれは、リンカー内に１回以上、たとえば、２回、３回、４回、５回、または６回存在してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでもよい。
リンカーは、アマトキシンおよび抗体に対して、単一のステップで、またはその後の２つ以上のステップで結合する必要があることが理解されている。
そのために、リンカーは、特に近位端と遠位端に２つの基を持つ。これは、
（ｉ）リンクされる成分の１つに存在する基、特にアマトキシンまたは標的結合ペプチドの活性化された基に共有結合を形成できるか、または
（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化されるか、または活性化できる。
したがって、そのようなカップリング反応の結果である化学基、たとえば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などがリンカーの遠位端および近位端にあることが好ましい。
【0063】
特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される、１～２０原子、特に、２～１８原子、より特に、５～１６原子、さらにより特に、６～１５原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
【0064】
特定の実施形態において。リンカーＬは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１から４個のヘテロ原子を含む、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基であり、ここで、前記リンカーは、所望により置換される。
【0065】
「アルキレン」という用語は、１～１０個の炭素原子を有する基を含む、１～２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を指す。
特定の実施形態において、アルキレン基は、低級アルキレン基であってもよい。
「低級アルキレン」という用語は、１～６個の炭素原子、特定の実施形態では、１～５個または１～４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。
アルキレン基の例には、メチレン（－ＣＨ2－）、エチレン（－ＣＨ2－ＣＨ2－）、ｎ－プロピレン、ｎ－ブチレン、ｎ－ペンチレン、およびｎ－ヘキシレンが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、アルキレン基は、低級アルキレン基であってもよい。
「低級アルキレン」という用語は、１～６個の炭素原子、特定の実施形態では、１～５個または１～４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。
アルキレン基の例には、メチレン（－ＣＨ2－）、エチレン（－ＣＨ2－ＣＨ2－）、ｎ－プロピレン、ｎ－ブチレン、ｎ－ペンチレン、およびｎ－ヘキシレンが含まれるが、これらに限定されない。
【0066】
「アルケニレン」という用語は、炭素－炭素結合の少なくとも１つが二重結合であり、他の結合が単結合またはさらなる二重結合であり得る、２～２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基を指す。
本明細書における「アルキニレン」という用語は、炭素－炭素結合の少なくとも１つが三重結合であり、他の結合が、単結合、二重結合、またはさらなる三重結合であってもよい、２～２０個の炭素原子を有する基を指す。
アルケニレン基の例には、エテニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、１－プロペニレン、２－プロペニレン、１－ブテニレン、２－ブテニレン、３－ブテニレンなどが含まれる。
アルキニレン基の例には、エチニレン、１－プロピニレン、２－プロピニレンなどが含まれる。
本明細書における「アルキニレン」という用語は、炭素－炭素結合の少なくとも１つが三重結合であり、他の結合が、単結合、二重結合、またはさらなる三重結合であってもよい、２～２０個の炭素原子を有する基を指す。
アルケニレン基の例には、エテニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、１－プロペニレン、２－プロペニレン、１－ブテニレン、２－ブテニレン、３－ブテニレンなどが含まれる。
アルキニレン基の例には、エチニレン、１－プロピニレン、２－プロピニレンなどが含まれる。
【0067】
本明細書で使用する、「シクロアルキレン」は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は、３～１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は完全に飽和している。
そして、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３～１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は少なくとも部分的に不飽和である（ただし、任意のアリレン環を除く）。
シクロアルキレンの例には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンが含まれるが、これらに限定されない。
シクロアルケニレンの例には、シクロペンテニレンおよびシクロヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
そして、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３～１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は少なくとも部分的に不飽和である（ただし、任意のアリレン環を除く）。
シクロアルキレンの例には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンが含まれるが、これらに限定されない。
シクロアルケニレンの例には、シクロペンテニレンおよびシクロヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
本明細書で使用される、「ヘテロシクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式環系の一部である二価の環を指す意図であり、そのような環は、３～約１２個の原子を有し、そして、そのような環は、炭素原子および少なくとも１つのヘテロ原子、特に、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ヘテロシクロアルキレンは完全に飽和した環を指し、そして、ヘテロシクロアルケニレンは、少なくとも部分的に不飽和の環を指す（ただし、任意のアリレンまたはヘテロアリレン環を除く）。
【0069】
「アリレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環または環系を意味することを意図しており、そのような環または環系は、３～２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、その環または環系は、フェニレンを含む、「４ｎ＋２」π電子則で定義される芳香族部分からなる。
【0070】
本明細書で使用される、「ヘテロアリレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環または環系を指し、そのような環または環系は３～２０個の原子を有し、その環または環系は、「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、炭素原子と１つ以上の窒素、硫黄、および／または酸素ヘテロ原子を含む。
【0071】
本発明の文脈において、「置換された」という用語は、リンカーの骨格に存在する、１つまたは複数の水素が、示された群から選択された基で置換されていることを意図している。ただし、示された原子の通常の原子価または、置換されるグループの適切な原子の原子価を超えず、置換により安定な化合物が生成される。
「所望により置換された」という用語は、リンカーが非置換であるか、本明細書で定義されるように、１つ以上の置換基で、本明細書で定義されるように置換されることを意味するものとする。
置換基が、ケト（またはオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオまたはイミノ基などである場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置き換えられる。
例示的な置換基には、たとえば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ペルフルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（所望により、たとえばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより一置換または二置換）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（所望により、アルキル、アリール、またはヘテロアリールによりモノまたはジ置換）、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、または－Ｏ（ＣＨ2）n－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ2）n－ＮＨ2、－Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）nＲ、－（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ（ここで、ｎは１－４、そして、Ｒは、独立して、水素、－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、－シクロアルキル、－シクロアルケニル、－（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルキル）、－（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルケニル）、－アリール、および－ヘテロアリールを含み、複数の置換度が許可される。
適切な場合、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどの置換基、または－ＯＨ、－ＮＨＲなどの官能基をそれ自体が置換されることは、当業者には理解されよう。
適切な場合には、置換部分自体も、同様に置換されることも当業者には理解されよう。
「所望により置換された」という用語は、リンカーが非置換であるか、本明細書で定義されるように、１つ以上の置換基で、本明細書で定義されるように置換されることを意味するものとする。
置換基が、ケト（またはオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオまたはイミノ基などである場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置き換えられる。
例示的な置換基には、たとえば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ペルフルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（所望により、たとえばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより一置換または二置換）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（所望により、アルキル、アリール、またはヘテロアリールによりモノまたはジ置換）、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、または－Ｏ（ＣＨ2）n－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ2）n－ＮＨ2、－Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）nＲ、－（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ（ここで、ｎは１－４、そして、Ｒは、独立して、水素、－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、－シクロアルキル、－シクロアルケニル、－（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルキル）、－（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルケニル）、－アリール、および－ヘテロアリールを含み、複数の置換度が許可される。
適切な場合、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどの置換基、または－ＯＨ、－ＮＨＲなどの官能基をそれ自体が置換されることは、当業者には理解されよう。
適切な場合には、置換部分自体も、同様に置換されることも当業者には理解されよう。
【0072】
特定の実施形態では、リンカーＬは、以下の部分の１つから選択される部分を含む：ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミン（－ＮＨ－）、エステル（－ＯＣ（＝Ｏ）－または‐Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボキサミド（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－または－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、ウレタン（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、および尿素部分（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）。
【0073】
本発明の特定の実施形態では、リンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、およびヘテロアラルキレン基のリストから選択される、ｍ個の群を含む。
式中、各基は、所望により、独立して置換されていてもよく、リンカーはさらに、以下の部分の１つから独立して選択される、ｎ個の部分を含む：ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミン（－ＮＨ－）、エステル（－ＯＣ（＝Ｏ）－または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボキサミド（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－または－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、ウレタン（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、および尿素部分（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、ここで、ｍ＝ｎ＋１である。
特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは１であり、または、ｍは３であり、ｎは２である。
特定の実施形態において、リンカーは、２または３個の非置換アルキレン基、および、それぞれ、１または２個の非置換アルキレン基を結合する、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタンまたは尿素部分を含む。
式中、各基は、所望により、独立して置換されていてもよく、リンカーはさらに、以下の部分の１つから独立して選択される、ｎ個の部分を含む：ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミン（－ＮＨ－）、エステル（－ＯＣ（＝Ｏ）－または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボキサミド（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－または－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、ウレタン（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、および尿素部分（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、ここで、ｍ＝ｎ＋１である。
特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは１であり、または、ｍは３であり、ｎは２である。
特定の実施形態において、リンカーは、２または３個の非置換アルキレン基、および、それぞれ、１または２個の非置換アルキレン基を結合する、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタンまたは尿素部分を含む。
【0074】
特定の実施形態では、リンカーＬはヘテロアリレン基を含まない。
【0075】
特定の実施形態では、直鎖中のＣ原子は独立して、所望により置換されたメチレン基（－ＣＨ2－）の一部である。
特定のこのような実施形態では、任意の置換基は、ハロゲンおよびＣ1-6－アルキル、特にメチルから独立して選択される。
特定のこのような実施形態では、任意の置換基は、ハロゲンおよびＣ1-6－アルキル、特にメチルから独立して選択される。
【0076】
特定の実施形態では、リンカーＬは安定したリンカーである。
【0077】
本発明の文脈において、「安定なリンカー」という用語は、
（ｉ）酵素の存在下で、および
（ｉｉ）細胞内還元環境で、
安定しているリンカーを指す。
（ｉ）酵素の存在下で、および
（ｉｉ）細胞内還元環境で、
安定しているリンカーを指す。
【0078】
特定の実施形態では、安定したリンカーは、
（ｉ）酵素切断可能な基本構造、および／または
（ｉｉ）ジスルフィド基を含まない。
特定のそのような実施形態では、リンカーは、最長１２原子、特に、２～１０原子、より特に、４～９原子、そして、最も特に、６～８原子の長さを有する。
（ｉ）酵素切断可能な基本構造、および／または
（ｉｉ）ジスルフィド基を含まない。
特定のそのような実施形態では、リンカーは、最長１２原子、特に、２～１０原子、より特に、４～９原子、そして、最も特に、６～８原子の長さを有する。
【0079】
特定の他の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。
【0080】
本発明の文脈において、「切断可能なリンカー」という用語は、
（ｉ）酵素によって切断可能な、または
（ｉｉ）還元可能な
リンカーを指す。
特定の実施形態では、この用語は、酵素により切断可能なリンカーのみを指す（還元可能なリンカーではない）。
（ｉ）酵素によって切断可能な、または
（ｉｉ）還元可能な
リンカーを指す。
特定の実施形態では、この用語は、酵素により切断可能なリンカーのみを指す（還元可能なリンカーではない）。
【0081】
本発明の文脈において、用語「酵素により切断可能なリンカー」とは、酵素、特にリソソームペプチダーゼ（たとえば、カテプシンＢのような）により切断され得、内在化後に標的抗体に結合した毒素カーゴの細胞内放出をもたらすリンカーを指す（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１３（２００２）８５５－６９を参照）。
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、およびＶａｌ－Ｃｉｔから選択されるジペプチドを含み、特に、切断可能なリンカーは、ジペプチドとアマトキシンの間に、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーをさらに含む。
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、およびＶａｌ－Ｃｉｔから選択されるジペプチドを含み、特に、切断可能なリンカーは、ジペプチドとアマトキシンの間に、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーをさらに含む。
【0082】
特定のそのような実施形態では、切断可能なリンカーは、構造Ｌ1－Ｌ*－Ｌ2を含み、ここで、Ｌ*は、ｐ－アミノベンジルジペプチド部分であり、Ｌ1は、Ｌ*をアマトキシンに結合するリンカーの一部であり、特に、ここで、Ｌ1は、－ＮＨ－または－Ｏ－基、特に－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ｏ－または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基を介して、Ｌ*に結合する。そして、ここで、Ｌ2は、Ｌ*を標的結合部分に接続するリンカーの一部であり、特に、Ｌ2は、－（ＣＨ2）m－部分（ｍは、１から８、特に、１～５から選択される整数である）を介して、または－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－部分（ｎは１～３、特に、１～２から選択される整数である）を介して、Ｌ*に接続する。
たとえば、ジペプチドのＶａｌ－Ａｌａを含む切断可能なリンカーの場合には、Ｌ1－Ｌ*－Ｌ2の構造は以下の通りである。
たとえば、ジペプチドのＶａｌ－Ａｌａを含む切断可能なリンカーの場合には、Ｌ1－Ｌ*－Ｌ2の構造は以下の通りである。
【化3】
【0083】
特定の他のこのような実施形態では、Ｌ*は、以下の構造として、ジペプチドＶａｌ－Ｌｙｓを含む：
【化4】
【0084】
特定の実施形態では、リンカーＬ1は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳから独立して選択される１～４原子、特に、１～３原子、より特に、１～２原子、さらには単に１原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも５０％が、炭素原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも５０％が、炭素原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
【0085】
特定の実施形態では、Ｌ1は、アマトキシンの一部である－ＮＨ－または－Ｏ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明による中央のトリプトファン部分の６’位に付着したアミノ基に由来するｎ－ＮＨ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニン誘導体のアミノ酸残基１のカルボン酸基の一部であるヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基１のカルボキサミド基の一部であるアミノ基に由来する－ＮＨ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンまたはアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基３の一部であるヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明による中央のトリプトファン部分の６’位に付着したアミノ基に由来するｎ－ＮＨ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニン誘導体のアミノ酸残基１のカルボン酸基の一部であるヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基１のカルボキサミド基の一部であるアミノ基に由来する－ＮＨ－基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンまたはアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基３の一部であるヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基である。
【0086】
本発明の文脈において、用語「還元可能なリンカー」は、細胞内還元環境で切断できるリンカー、特に、ジスルフィド基を含むリンカーを指し、細胞内還元環境によって内在化後に、標的結合部分に結合した毒素カーゴの細胞内放出を齎すリンカーを指す（Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）１０９０５から１０９０８参照）。
特定の実施形態では、還元可能なリンカーは、以下の部分を含む。
式中、Ｒ１からＲ４は、独立して、Ｈおよびメチルから選択される。
特定の実施形態では、還元可能なリンカーは、以下の部分を含む。
【化5】
【0087】
特定のそのような実施形態では、そのような切断可能なリンカーは、最長２０原子、特に、６～１８原子、より特に、８～１６原子、そして、最も特に、１０～１５原子の長さを有する。
特定のこのような実施形態では、本発明による、アマトキシンに連結するリンカーの部分、および切断可能なジスルフィド基は、３または４個のＣ原子、特に、３個のＣ原子の直線鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の３または４個のＣ原子は単結合により結合している。
特定の実施形態では、リンカーはｎ－プロピレン基である。
特定のこのような実施形態では、本発明による、アマトキシンに連結するリンカーの部分、および切断可能なジスルフィド基は、３または４個のＣ原子、特に、３個のＣ原子の直線鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の３または４個のＣ原子は単結合により結合している。
特定の実施形態では、リンカーはｎ－プロピレン基である。
【0088】
特定の実施形態において、前記リンカーは存在し、片側で、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したアミノ基、すなわち、６’－アミノ置換基に結合している。
【0089】
特定の他の実施形態では、前記リンカーは存在し、そして、本発明のアマニチン誘導体中の特定の位置に片側で接続され、ここで、前記位置は、以下から選択される。
・Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）または６’－アミノ－アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）の場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子のアミド基の窒素原子（アミド結合）；
・Ｓ－デオキシ－６’－アミノ－アマニン（ａｍａｎｉｎ）または６’－アミノ－アマニン（ａｍａｎｉｎ）の場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子における酸基の酸素原子（エステル結合）；
・アミノ酸１の遊離カルボン酸部分が、部分－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ１に変換された、前記本発明のアマニチンの誘導体の場合には、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子でのヒドロキサム酸基の酸素原子；
・アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子のヒドロキシ基の酸素原子（特に、エステル結合、エーテル結合またはウレタン結合を介した）；または、
・アミノ酸４の環窒素。
・Ｓ－デスオキシ－６’－アミノ－アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）または６’－アミノ－アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）の場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子のアミド基の窒素原子（アミド結合）；
・Ｓ－デオキシ－６’－アミノ－アマニン（ａｍａｎｉｎ）または６’－アミノ－アマニン（ａｍａｎｉｎ）の場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子における酸基の酸素原子（エステル結合）；
・アミノ酸１の遊離カルボン酸部分が、部分－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－ＯＲ１に変換された、前記本発明のアマニチンの誘導体の場合には、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子でのヒドロキサム酸基の酸素原子；
・アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子のヒドロキシ基の酸素原子（特に、エステル結合、エーテル結合またはウレタン結合を介した）；または、
・アミノ酸４の環窒素。
【0090】
リンカーの標的結合部分への結合は、当業者、特に抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の分野の当業者に周知の様々な方法によって達成することができる。
【0091】
特定の実施形態では、前記リンカーは、尿素部分（…－リンカー－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－標的結合部分）を介して標的結合部分に結合する。
特定のそのような実施形態では、尿素部分は、リジン側鎖のアミノ基などの標的結合部分に元々存在する一級アミンとカルバミン酸誘導体…－リンカー－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｚ（ここで、Ｚは、第一級アミンで置き換えることができる脱離基である）との反応から齎される。
特定のそのような実施形態では、尿素部分は、リジン側鎖のアミノ基などの標的結合部分に元々存在する一級アミンとカルバミン酸誘導体…－リンカー－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｚ（ここで、Ｚは、第一級アミンで置き換えることができる脱離基である）との反応から齎される。
【0092】
特定の他の実施形態では、前記リンカーが存在し、チオエーテル部分（…－リンカー－Ｓ－標的結合部分）を介して標的結合部分に結合している。
したがって、そのような実施形態では、本発明は、下記一般式の複合体に関係する。
アマニチン－Ｌ－Ｘ*－Ｓ－Ｔｂｍ、
式中、
アマニチンは、本発明によるアマニチン誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｘ*は、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、
Ｓは、前記チオール基の硫黄原子、特に、システインアミノ酸残基のチオール基であり、そして、
Ｔｂｍは標的結合部分、特に、前記システインアミノ酸残基を含む抗体または機能的抗体断片である。
特定の実施形態では、前記システインアミノ酸残基は、
（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から選択される抗体ドメインに位置し、
（ｉｉ）前記抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す、生殖系列配列が、システインとは異なるアミノ酸残基を含む位置に位置し、そして、
（ｉｉｉ）溶剤に曝される位置にある。
したがって、そのような実施形態では、本発明は、下記一般式の複合体に関係する。
アマニチン－Ｌ－Ｘ*－Ｓ－Ｔｂｍ、
式中、
アマニチンは、本発明によるアマニチン誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｘ*は、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、
Ｓは、前記チオール基の硫黄原子、特に、システインアミノ酸残基のチオール基であり、そして、
Ｔｂｍは標的結合部分、特に、前記システインアミノ酸残基を含む抗体または機能的抗体断片である。
特定の実施形態では、前記システインアミノ酸残基は、
（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から選択される抗体ドメインに位置し、
（ｉｉ）前記抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す、生殖系列配列が、システインとは異なるアミノ酸残基を含む位置に位置し、そして、
（ｉｉｉ）溶剤に曝される位置にある。
【0093】
本発明の文脈において、「チオール反応性基」という用語は、たとえば、特に、６．０～８．０の範囲のｐＨ値で、より特に、６．５～７．５の範囲のｐＨ値において、抗体の遊離システインのチオール基と選択的に反応する基を指す。
特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の１０％未満（特に５％未満、より特に２％未満）が、抗体の非システイン残基（たとえば、リジン残基）とのカップリング反応であることを意味する。
特定の実施形態では、チオール反応性基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、３位に脱離基（特に、脱離基は、－Ｂｒおよび置換チオールから選択される）を有するマレイミド（たとえば、ＵＳ ９，２９５，７２９を参照）、４位に脱離基（特に、－Ｂｒおよび置換チオールから選択される脱離基）を有する１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン（たとえば、ＵＳ ９，２９５，７２９を参照）、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール（Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、５２（２０１３）１２５９２－６参照）、３－アリールプロピオニトリル（Ｋｏｌｏｄｙｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、１９７－２００を参照）、および５－ニトロ－ピリジン－２－イル－ジスルフィド（…－Ｌ―Ｓ－Ｓ－（５－ニトロ－ピリジン－２－イル）から選択される。
特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の１０％未満（特に５％未満、より特に２％未満）が、抗体の非システイン残基（たとえば、リジン残基）とのカップリング反応であることを意味する。
特定の実施形態では、チオール反応性基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、３位に脱離基（特に、脱離基は、－Ｂｒおよび置換チオールから選択される）を有するマレイミド（たとえば、ＵＳ ９，２９５，７２９を参照）、４位に脱離基（特に、－Ｂｒおよび置換チオールから選択される脱離基）を有する１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン（たとえば、ＵＳ ９，２９５，７２９を参照）、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール（Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、５２（２０１３）１２５９２－６参照）、３－アリールプロピオニトリル（Ｋｏｌｏｄｙｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、１９７－２００を参照）、および５－ニトロ－ピリジン－２－イル－ジスルフィド（…－Ｌ―Ｓ－Ｓ－（５－ニトロ－ピリジン－２－イル）から選択される。
【0094】
特定の実施形態では、リンカーに接続された一方の側にあり、そして、標的結合部分に存在する位置または官能基に、直接または間接的に接続できる、前記位置または官能基は、１つの標的結合部分または２つの標的結合部分に存在する、２つのチオール基と反応できる部分である。
特定の実施形態において、チオール反応性基は、３および４位に２つの脱離基を有するマレイミドであり、特に、３，４－ジブロモマレイミド、３，４－ビス（アリールチオ）－マレイミド、特に、３，４－ジフェニルチオ－マレイミド、および３，４－ビス（ヘテロアリールチオ）－マレイミド、特に、３，４－ビス（２－ピリジニル－スルファニル）－マレイミドから選択され、
特定の他の実施形態では、チオール反応性基は、特に、４，５－ブロモ－１，２－ジヒドロピリダジン－３、６－ジオン、４，５－ビス（アリールチオ）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、特に、４，５－ジフェニルチオ－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、および４，５－ビス（ヘテロアリールチオ）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、特に、４，５－ビス（２－ピリジニル－スルファニル）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオンから選択される、４および５位に２つの脱離基を有する、１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオンである。
特定の実施形態において、チオール反応性基は、３および４位に２つの脱離基を有するマレイミドであり、特に、３，４－ジブロモマレイミド、３，４－ビス（アリールチオ）－マレイミド、特に、３，４－ジフェニルチオ－マレイミド、および３，４－ビス（ヘテロアリールチオ）－マレイミド、特に、３，４－ビス（２－ピリジニル－スルファニル）－マレイミドから選択され、
特定の他の実施形態では、チオール反応性基は、特に、４，５－ブロモ－１，２－ジヒドロピリダジン－３、６－ジオン、４，５－ビス（アリールチオ）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、特に、４，５－ジフェニルチオ－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、および４，５－ビス（ヘテロアリールチオ）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオン、特に、４，５－ビス（２－ピリジニル－スルファニル）－１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオンから選択される、４および５位に２つの脱離基を有する、１，２－ジヒドロピリダジン－３，６－ジオンである。
【0095】
特定の実施形態では、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、以下から選択される：
・チオール置換アセトアミド；
・チオール置換スクシンイミド；
・チオール置換スクシンアミド酸；
・チオール置換ヘテロアリール；特に、チオール－置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾールおよびチオール置換フェニルオキサジアゾール；および
・ジスルフィド。
但し、１つの硫黄原子が抗体のシステイン残基に由来する。
・チオール置換アセトアミド；
・チオール置換スクシンイミド；
・チオール置換スクシンアミド酸；
・チオール置換ヘテロアリール；特に、チオール－置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾールおよびチオール置換フェニルオキサジアゾール；および
・ジスルフィド。
但し、１つの硫黄原子が抗体のシステイン残基に由来する。
【0096】
特定の実施形態において、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、チオール置換スクシンイミドである。
特定の実施形態では、段落［００９２］一般式に存在する、部分Ｌ－Ｘ*－Ｓにおける、リンカーＬは、以下の部分の群から選択される。
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＸーＳ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）3－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）3－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）4－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）4－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－ＣＭｅ2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－ＣＭｅ2－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）5－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）5－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｍｅｔ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
そして、ここで、ジペプチド配列に隣接する－ＮＨ－および－ＣＯ－は、それぞれジペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端にアミド結合を形成するリンカーのアミノおよびカルボニル部分を表す。
特定の実施形態では、段落［００９２］一般式に存在する、部分Ｌ－Ｘ*－Ｓにおける、リンカーＬは、以下の部分の群から選択される。
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＸーＳ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）3－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）3－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）4－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）4－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－ＣＭｅ2－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）2－Ｓ－Ｓ－ＣＭｅ2－（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－（ＣＨ2）3－Ｓ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）5－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）5－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ｍｅｔ－Ｖａｌ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）－ＣＨ2－Ｃ6Ｈ4－ＮＨ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－ＣＯ（ＣＨ2）2－Ｘ－Ｓ－（Ｔｂｍ側）；
そして、ここで、ジペプチド配列に隣接する－ＮＨ－および－ＣＯ－は、それぞれジペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端にアミド結合を形成するリンカーのアミノおよびカルボニル部分を表す。
【0097】
本発明の文脈において、「チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分」という用語は、以下の反応から生じる構造を指す。
（ｉ）チオール反応性基に存在する脱離基Ｙの、システイン残基の硫黄原子による求核置換、たとえば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジン－２－イルアミノ基、アルキルスルホンまたはヘテロアリールスルホン；
（ｉｉ）チオール反応性基の活性化二重結合へのシステイン残基のＨＳ基の付加、たとえば、マレイミド；または、
（ｉｉｉ）システインの残基の硫黄原子（たとえば、脱離基として、ピリジン－２－チオール、５－ニトロピリジン－２－チオールまたはメタンスルフィネート）と、活性化ジスルフィドまたはメタンチオスルホネートのジスルフィド交換、；または
（ｉｖ）システイン残基の硫黄原子とチオール反応性基の一部である反応性部分との間に安定した結合をもたらす他の化学反応。
（ｉ）チオール反応性基に存在する脱離基Ｙの、システイン残基の硫黄原子による求核置換、たとえば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジン－２－イルアミノ基、アルキルスルホンまたはヘテロアリールスルホン；
（ｉｉ）チオール反応性基の活性化二重結合へのシステイン残基のＨＳ基の付加、たとえば、マレイミド；または、
（ｉｉｉ）システインの残基の硫黄原子（たとえば、脱離基として、ピリジン－２－チオール、５－ニトロピリジン－２－チオールまたはメタンスルフィネート）と、活性化ジスルフィドまたはメタンチオスルホネートのジスルフィド交換、；または
（ｉｖ）システイン残基の硫黄原子とチオール反応性基の一部である反応性部分との間に安定した結合をもたらす他の化学反応。
【0098】
チオール基のカップリングから生じる一次部分は、所望により、さらに誘導体化されてもよく、たとえば、マレイミドから生じるスクシンイミジルチオエーテルは、次の一般構造のスクシンアミド酸チオエーテルに加水分解され得る。
【化6】
【0099】
特定の他の実施形態では、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド架橋を還元させ、そして、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物に存在する架橋部分Ｘ*と、２つのシステイン残基を反応させることにより、達成することができる（Ｂａｄｅｓｃｕら、安定で、明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ）抗体薬物複合体のためのジスルフィドの架橋、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５（２０１４）１１２４－１１３６参照）。
【0100】
同様の実施形態において、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド架橋を還元させ、そして、２つのシステイン残基を、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物に存在する架橋部分Ｘ*と反応させることにより達成できる。特に、ここで、Ｘ*は
である（Ｂｒｙｄｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２５（２０１４）６１１－６１７； Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ、２０１４、７２６１－７２６９を参照）
【化7】
【0101】
特定の他の実施形態では、カップリングは、特に、抗体のグルタミンＱ２９５への結合により、トランスアミナーゼを介して、リンカーに存在するアミノ基を、標的結合部分に存在するグルタミン残基へ、位置特異的カップリングにより達成される。
【化8】
【0102】
特定の実施形態では、カップリングは、Ｎ－グリカン側鎖を含む標的結合部分への、部位特異的コンジュゲーションにより達成される。
特に、Ｎ－グリカン側鎖は酵素的に分解され、続いて、アジド－ガラクトースとの糖転移が起こる。
クリックケミストリーを使用して、そのような修飾された標的結合部分は、適宜変更された構築物であるアマニチン－Ｌ－Ｘ*（Ｘ*は、たとえば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）またはＣ－Ｃ三重結合を含む類似の部分である）にカップリングさせることができる。
たとえば、構築物である、アマニチン－Ｌ－ＮＨ２は、ヒドロキシスクシンイミド部分の求核置換によって、ＤＩＢＯ－ＳＥに結合させることができる。
次に、得られたＤＩＢＯ修飾リンカー構築物を、上記のアジド誘導体に結合させることができる。
別の実施形態において、標的結合部分は、クリックケミストリーを可能にする非天然アミノ酸の取り込みにより、特に、パラアジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）の取り込みにより、修飾され得る。
特に、Ｎ－グリカン側鎖は酵素的に分解され、続いて、アジド－ガラクトースとの糖転移が起こる。
クリックケミストリーを使用して、そのような修飾された標的結合部分は、適宜変更された構築物であるアマニチン－Ｌ－Ｘ*（Ｘ*は、たとえば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）またはＣ－Ｃ三重結合を含む類似の部分である）にカップリングさせることができる。
たとえば、構築物である、アマニチン－Ｌ－ＮＨ２は、ヒドロキシスクシンイミド部分の求核置換によって、ＤＩＢＯ－ＳＥに結合させることができる。
【化9】
別の実施形態において、標的結合部分は、クリックケミストリーを可能にする非天然アミノ酸の取り込みにより、特に、パラアジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）の取り込みにより、修飾され得る。
【0103】
特定の実施形態では、－Ｌ－Ｘ*のリンカーＬは、少なくとも、５個、特に少なくとも１０個、より具体的には、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される１０～２０原子、特に１０～１８、より具体的には１０～１６原子、さらにより具体的には１０～１５原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
【0104】
別の実施形態では、標的結合部分に存在する、位置または官能基に直接または間接的に結合できる、位置または官能基は、エチニル基ではなく、より一般的にはアルキニル基ではない、または１，３－双極子環状付加（クリックケミストリー）における、１，３双極子と反応できる基ではない。
【0105】
特定の他の実施形態では、ケト基、特にｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む非天然アミノ酸を、標的結合部分に組み込むことにより、および、そのような修飾された標的結合部分を、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物と反応させることにより、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物の標的結合部分への部位特異的カップリングを達成することができる。ここで、Ｘ*はヒドロキシルアミン部分である。
【0106】
さらなる実施形態において、ホルミル基は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって導入することができ、これは、アルデヒドタグを生成するための認識配列ＣｘＰｘＲ中のシステイン基に対して高度に選択的である。
このようなアルデヒドタグは、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物に存在する適切な基Ｘ*と反応することができる。
特に、Ｘ*は
である（Ａｇａｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２４（２０１３）８４６－８５１を参照）。
このようなアルデヒドタグは、アマニチン－Ｌ－Ｘ*構築物に存在する適切な基Ｘ*と反応することができる。
特に、Ｘ*は
【化10】
【0107】
第２の態様では、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【0108】
第３の態様では、本発明は、患者における癌の治療に使用するための、本発明の複合体に関する。
特に、前記癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
特に、前記癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【0109】
本明細書で使用する場合、疾患または障害の「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、以下のうちの１つまたは複数を達成することを意味する。
（ａ）障害の重症度を軽減すること；
（ｂ）治療中の障害に特徴的な症状の発現を制限または防止すること；
（ｃ）治療中の障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること；
（ｄ）以前に障害を患っていた患者の障害の再発を制限または防止すること；および
（ｅ）以前に障害の症状を示していた患者の症状の再発を制限または防止すること。
（ａ）障害の重症度を軽減すること；
（ｂ）治療中の障害に特徴的な症状の発現を制限または防止すること；
（ｃ）治療中の障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること；
（ｄ）以前に障害を患っていた患者の障害の再発を制限または防止すること；および
（ｅ）以前に障害の症状を示していた患者の症状の再発を制限または防止すること。
【0110】
本明細書で使用する場合、治療は、本発明による複合体または医薬組成物を患者に投与することを含んでもよく、ここで、「投与」には、インビボ投与、ならびに静脈グラフトなどのエクスビボで、組織への直接投与が含まれる。
【0111】
特定の実施形態では、治療有効量の本発明の複合体が使用される。
【0112】
「治療有効量」は、意図された目的を達成するのに十分な治療薬の量である。
所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受領する動物のサイズと種、および投与の目的などの要因によって異なる。
各個々の場合の有効量は、当技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定され得る。
所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受領する動物のサイズと種、および投与の目的などの要因によって異なる。
各個々の場合の有効量は、当技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定され得る。
【0113】
別の態様において、本発明は、本発明による、アマニチン誘導体を含む医薬組成物、またはアマニチン誘導体と標的結合部分との本発明の複合体に関する。そして、さらに、１種以上の薬学的に許容される、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；および／または防腐剤を含む。
【0114】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されたもの、または米国薬局方または動物、より特にヒトで使用される、他の一般に認められた薬局方にリストされたものを意味する。
【0115】
特定の実施形態において、医薬組成物は、全身投与される薬剤の形態で使用される。
これには、特に注射剤と注入剤を含む非経口剤が含まれる。
注射剤は、アンプルの形またはいわゆる即使用可能な注射剤、たとえば、すぐに使える注射器または使い捨て注射器のいずれかで処方され、これとは別に、複数回の引出しのための穿刺可能なフラスコに製剤化される。
注射剤の投与は、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、静脈内（ｉｖ）または皮内（ｉｃ）投与の形態であり得る。
特に、結晶、溶液、ナノ粒子、またはたとえばヒドロゾルなどのコロイド分散系の懸濁液として、それぞれ適切な注射製剤を製造することが可能である。
これには、特に注射剤と注入剤を含む非経口剤が含まれる。
注射剤は、アンプルの形またはいわゆる即使用可能な注射剤、たとえば、すぐに使える注射器または使い捨て注射器のいずれかで処方され、これとは別に、複数回の引出しのための穿刺可能なフラスコに製剤化される。
注射剤の投与は、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、静脈内（ｉｖ）または皮内（ｉｃ）投与の形態であり得る。
特に、結晶、溶液、ナノ粒子、またはたとえばヒドロゾルなどのコロイド分散系の懸濁液として、それぞれ適切な注射製剤を製造することが可能である。
【0116】
注射可能な製剤は、濃縮物としてさらに製造することができ、これは水性等張性希釈剤で溶解または分散させることができる。
輸液は、等張液、脂肪乳剤、リポソーム製剤およびマイクロエマルジョンの形態で調製することもできる。
注射剤と同様に、輸液製剤は希釈用の濃縮液の形で調製することもできる。
注射製剤は、たとえば、ミニポンプを介して、入院治療と外来治療の両方で永続的な注入の形で適用することもできる。
輸液は、等張液、脂肪乳剤、リポソーム製剤およびマイクロエマルジョンの形態で調製することもできる。
注射剤と同様に、輸液製剤は希釈用の濃縮液の形で調製することもできる。
注射製剤は、たとえば、ミニポンプを介して、入院治療と外来治療の両方で永続的な注入の形で適用することもできる。
【0117】
たとえば、アルブミン、血漿、エキスパンダー、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ影響物質、錯化物質または高分子物質などの非経口製剤に、特に、本発明の標的結合部分毒素複合体のタンパク質またはポリマーへの吸収に影響を与える物質として添加することができるか、または、それらはまた、本発明の標的結合部分毒素複合体の、注射器具または包装材料、たとえば、プラスチックまたはガラスなどの材料への吸収を低減する目的でも加えることができる。
【0118】
標的結合部分を含む本発明のアマニチン誘導体は、たとえば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンに基づく、微細分散粒子のような非経口でマイクロキャリアまたはナノ粒子に結合することができる。
また、非経口製剤は、本発明の標的結合部分毒素複合体が、それぞれ、微細に、分散、分散および懸濁した形態で導入される場合、たとえば、「複数ユニット原理」に基づいた、デポー製剤として改変することもできる。
または、本発明の標的結合部分毒素複合体が、製剤中、たとえば、錠剤または後に埋め込まれるロッドに封入される場合、薬剤中の結晶の懸濁液として、または。「単一ユニット原理」に基づき、改変することもできる。
単一ユニットおよび複数ユニット製剤の、これらのインプラントまたはデポー薬剤は、多くの場合、たとえば、乳酸とグリコール酸のポリエステル、ポリエーテル、ウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖類などのいわゆる生分解性ポリマーで構成される。
また、非経口製剤は、本発明の標的結合部分毒素複合体が、それぞれ、微細に、分散、分散および懸濁した形態で導入される場合、たとえば、「複数ユニット原理」に基づいた、デポー製剤として改変することもできる。
または、本発明の標的結合部分毒素複合体が、製剤中、たとえば、錠剤または後に埋め込まれるロッドに封入される場合、薬剤中の結晶の懸濁液として、または。「単一ユニット原理」に基づき、改変することもできる。
単一ユニットおよび複数ユニット製剤の、これらのインプラントまたはデポー薬剤は、多くの場合、たとえば、乳酸とグリコール酸のポリエステル、ポリエーテル、ウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖類などのいわゆる生分解性ポリマーで構成される。
【0119】
非経口製剤として製剤化された本発明の医薬組成物の製造中に添加されるアジュバントおよび担体は、特に、アクアステリリサタ（滅菌水）、たとえば、有機または無機酸または塩基ならびにその塩などの、ｐＨ値に影響を与える物質、ｐＨ値調整用の緩衝物質、たとえば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなどの等張化のための物質、それぞれ、界面活性剤および界面活性剤、および、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（たとえば、Ｔｗｅｅｎ(R)）または、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（たとえばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ(R)）などの乳化剤、ピーナッツ油、大豆油、ヒマシ油などの脂肪油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸の合成エステル、および、中性油（たとえば、Ｍｉｇｌｙｏｌ(R)）、および、たとえば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなどの高分子アジュバント、たとえば、プロピレングリコール、エタノール、Ｎ、Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなどの有機溶媒の溶解度を高める添加剤、または、たとえば、クエン酸や尿素などの複合体形成物質、安息香酸ヒドロキシプロピルエステルやメチルエステルなどの防腐剤、ベンジルアルコール、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、ＥＤＴＡなどの安定剤である。
【0120】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物を懸濁液として製剤する場合、本発明の標的結合部分毒素複合体のセッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）を防ぐために、増粘剤、または、沈殿物（ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ）および／または複合体形成剤の再懸濁性を保証するために、界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）および高分子電解質（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）、たとえば、ＥＤＴＡが添加される。
活性成分とさまざまなポリマーの複合体を実現することも可能である。
そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ(R)またはポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。
本発明の標的結合部分毒素複合体は、たとえばシクロデキストリンを含む包接化合物の形態で液体製剤に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、さらなるアジュバントとして分散剤を加えることができる。
凍結乾燥物の製造には、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、または様々なゼラチンなどの足場剤を使用できる。
実施例
活性成分とさまざまなポリマーの複合体を実現することも可能である。
そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ(R)またはポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。
本発明の標的結合部分毒素複合体は、たとえばシクロデキストリンを含む包接化合物の形態で液体製剤に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、さらなるアジュバントとして分散剤を加えることができる。
凍結乾燥物の製造には、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、または様々なゼラチンなどの足場剤を使用できる。
実施例
【0121】
以下において、本発明を非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。
６’－アミノ－アマニンアミドの全合成（ＨＤＰ ３０．２５２８）
１．Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－ニトロ－Ｌ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３５３の調製
６’－アミノ－アマニンアミドの全合成（ＨＤＰ ３０．２５２８）
【化11】
【化12】
【0122】
９，０ｇ（２８．８ミリモル）の６－ニトロ－Ｌ－トリプトファン（Ｈｕ、Ｗｅｉｍｉｎ；Ｚｈａｎｇ、Ｆｅｎｇｙｉｎｇ；Ｘｕ、Ｚｈｅｎｇｒｅｎ；Ｌｉｕ、Ｑｉａｎｇ；Ｃｕｉ、Ｙｕｘｉｎ；Ｊｉａ、Ｙａｎｘｉｎｇ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌｕｍｅ １２ Ｉｓｓｕｅ ５ Ｐａｇｅｓ ９５６－９５９ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１０に準じて調製）を、１，４－ジオキサン６０ミリリットルと水３０ミリリットルの混合液に懸濁させた。
アルゴン下、５７．７ミリリットル（５７．７ミリモル）の１ＮのＮａＯＨを、周囲温度で加えた。
得られた溶液を、氷浴で０℃に冷却し、７．３ミリリットルの（６．９ｇ：３１．７ミリモル）の無水Ｂｏｃ（Ｂｏｃ2Ｏ）で処理した。
混合物を、２．５時間、室温で、撹拌し、１ＮのＫＨＳＯ4溶液で、ｐＨメーターを使用して、ｐＨ３．０に酸性化した。
水相を、酢酸エチル７５ミリリットルで、３回抽出した
合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
ろ過と蒸発乾固により、９．７ｇの粗物質が得られた。
粗Ｎ－Ｂｏｃ－６－ニトロ－Ｌ－トリプトファンを、ＣＨＣｌ3＋１％酢酸から、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（９：１）＋１％酢酸の勾配を用い、３３０ｇのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、蒸発およびトルエンとの共蒸発後に、３．８ｇ（３８％）のＨＤＰ ３０．２３５３を、白色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ－） 実測値：３４８．０７［Ｍ－Ｈ］-；
計算値：３４８，１２（Ｃ16Ｈ18Ｎ3Ｏ6）
２．Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－アミノ－Ｌ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３７５の調製
アルゴン下、５７．７ミリリットル（５７．７ミリモル）の１ＮのＮａＯＨを、周囲温度で加えた。
得られた溶液を、氷浴で０℃に冷却し、７．３ミリリットルの（６．９ｇ：３１．７ミリモル）の無水Ｂｏｃ（Ｂｏｃ2Ｏ）で処理した。
混合物を、２．５時間、室温で、撹拌し、１ＮのＫＨＳＯ4溶液で、ｐＨメーターを使用して、ｐＨ３．０に酸性化した。
水相を、酢酸エチル７５ミリリットルで、３回抽出した
合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
ろ過と蒸発乾固により、９．７ｇの粗物質が得られた。
粗Ｎ－Ｂｏｃ－６－ニトロ－Ｌ－トリプトファンを、ＣＨＣｌ3＋１％酢酸から、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（９：１）＋１％酢酸の勾配を用い、３３０ｇのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、蒸発およびトルエンとの共蒸発後に、３．８ｇ（３８％）のＨＤＰ ３０．２３５３を、白色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ－） 実測値：３４８．０７［Ｍ－Ｈ］-；
計算値：３４８，１２（Ｃ16Ｈ18Ｎ3Ｏ6）
２．Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－アミノ－Ｌ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３７５の調製
【化13】
【0123】
６，９グラム（１９．９ミリモル）のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－ニトロ－Ｌ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３５３を、２５０ミリリットルのメタノールに溶解した。
炭素上の１０％パラジウム１．７グラムを加え、混合物を、周囲温度および１ｂａｒの水素で、１９時間水素添加した。
触媒を濾別し、溶液を蒸発乾固した。
粗生成物は、ベージュ色の固体であり、これをさらに精製することなく、次のステップに使用した。
５．６ｇ（８９．０％収率）
ＭＳ（ＥＳＩ） 実測値：３２１．２３［Ｍ＋１］+；
計算値：３２０．１６（Ｃ16Ｈ22Ｎ3Ｏ4）
３．Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－６－トリフルオロアセトアミノ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３８１の調製
炭素上の１０％パラジウム１．７グラムを加え、混合物を、周囲温度および１ｂａｒの水素で、１９時間水素添加した。
触媒を濾別し、溶液を蒸発乾固した。
粗生成物は、ベージュ色の固体であり、これをさらに精製することなく、次のステップに使用した。
５．６ｇ（８９．０％収率）
ＭＳ（ＥＳＩ） 実測値：３２１．２３［Ｍ＋１］+；
計算値：３２０．１６（Ｃ16Ｈ22Ｎ3Ｏ4）
３．Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－６－トリフルオロアセトアミノ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３８１の調製
【化14】
【0124】
４．５ｇ（１４．２ミリモル）のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－アミノ－Ｌ－トリプトファン ＨＤＰ ３０．２３７５を、４５ミリリットルの乾燥テトラヒドロフランに懸濁した。
アルゴン下、１２．０ミリリットル（１４．４グラム、１０１．１ミリモル）のトリフルオロ酢酸エチルエステルおよび１７４ミリグラムのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を、周囲温度で加えた。
得られた溶液を、７時間還流し、そして、室温で１２時間撹拌した。
反応混合物を蒸発乾固させた。
残った固体残留物を、酢酸エチル１５０ミリリットルに溶解した。
有機相を、５％クエン酸水溶液で洗浄し、そして、水で３回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
濾過および蒸発乾固により、３．８グラムの粗材料が得られた。
粗製の、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－６－トリフルオロアセトアミノ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３８１を、ＣＨＣｌ3＋１％酢酸から、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（９：１）＋１％酢酸の勾配を用いた、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
蒸発およびトルエンと共蒸発させた後、ＨＤＰ ３０．２３８１を、白色固体（２．４グラム、４１％）として単離した。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４１［ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3］；３．１３－３．１８（ｍ、２Ｈ）；４．４６－４．５３（ｍ、１Ｈ）；６．８８（ｓ、１Ｈ）；７．４０－７．４２（ｍ、１Ｈ）；７．７１（ｓ、１Ｈ）；６．４３－６．４８（ｍ、１Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．２３、３１．１０、５４．２１、６９．４９、８０．５５、１０４．３９、１０９．７３、１１３．３１、１１４．７４、１１８．９６、１２４．３２、１２５．８４、１２９．５２、１３５．７２、１５４．８３、１５５．６６、１７５．７０
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：４１４．１７［Ｍ－Ｈ］-；
計算値：４１４．１３（Ｃ18Ｈ19Ｆ3Ｎ3Ｏ5）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：８２９．１７［２Ｍ－Ｈ］-；
計算値：８２９．２６（Ｃ36Ｈ39Ｆ6Ｎ6Ｏ10）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：１２４３．９２［３Ｍ－Ｈ］-；
計算値：１２４３．３９（Ｃ54Ｈ58Ｆ9Ｎ9Ｏ15）
４．ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－トリフルオロアセトアミノ－１，２，３，３ａ,８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（ｃｉｓ－ＨＤＰ ３０．２４１６およびｔｒａｎｓ-ＨＤＰ ３０．２４１６（ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ－６－トリフルオロアセトアミノ－Ｈｐｉ））の調製
アルゴン下、１２．０ミリリットル（１４．４グラム、１０１．１ミリモル）のトリフルオロ酢酸エチルエステルおよび１７４ミリグラムのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を、周囲温度で加えた。
得られた溶液を、７時間還流し、そして、室温で１２時間撹拌した。
反応混合物を蒸発乾固させた。
残った固体残留物を、酢酸エチル１５０ミリリットルに溶解した。
有機相を、５％クエン酸水溶液で洗浄し、そして、水で３回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
濾過および蒸発乾固により、３．８グラムの粗材料が得られた。
粗製の、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－６－トリフルオロアセトアミノ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３８１を、ＣＨＣｌ3＋１％酢酸から、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（９：１）＋１％酢酸の勾配を用いた、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
蒸発およびトルエンと共蒸発させた後、ＨＤＰ ３０．２３８１を、白色固体（２．４グラム、４１％）として単離した。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４１［ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3］；３．１３－３．１８（ｍ、２Ｈ）；４．４６－４．５３（ｍ、１Ｈ）；６．８８（ｓ、１Ｈ）；７．４０－７．４２（ｍ、１Ｈ）；７．７１（ｓ、１Ｈ）；６．４３－６．４８（ｍ、１Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．２３、３１．１０、５４．２１、６９．４９、８０．５５、１０４．３９、１０９．７３、１１３．３１、１１４．７４、１１８．９６、１２４．３２、１２５．８４、１２９．５２、１３５．７２、１５４．８３、１５５．６６、１７５．７０
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：４１４．１７［Ｍ－Ｈ］-；
計算値：４１４．１３（Ｃ18Ｈ19Ｆ3Ｎ3Ｏ5）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：８２９．１７［２Ｍ－Ｈ］-；
計算値：８２９．２６（Ｃ36Ｈ39Ｆ6Ｎ6Ｏ10）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：１２４３．９２［３Ｍ－Ｈ］-；
計算値：１２４３．３９（Ｃ54Ｈ58Ｆ9Ｎ9Ｏ15）
４．ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－トリフルオロアセトアミノ－１，２，３，３ａ,８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（ｃｉｓ－ＨＤＰ ３０．２４１６およびｔｒａｎｓ-ＨＤＰ ３０．２４１６（ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ－６－トリフルオロアセトアミノ－Ｈｐｉ））の調製
【化15】
【0125】
光酸素付加（Ｐｈｏｔｏｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）
光酸素付加は、４００Ｗの高圧ナトリウム蒸気ランプ（シリウスＸ４００ランプ２３０Ｖ、４００Ｗ；１．３メートルの距離で、５５，０００ルーメン）または代替的に、タングステン－ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて行われた。
タングステンーハロゲンランプには、λ＜４９０ナノメートルの光を遮断するフィルター溶液（ＣｕＣｌ2－ＣａＣＯ3）を使用した。
光酸素付加は、４００Ｗの高圧ナトリウム蒸気ランプ（シリウスＸ４００ランプ２３０Ｖ、４００Ｗ；１．３メートルの距離で、５５，０００ルーメン）または代替的に、タングステン－ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて行われた。
タングステンーハロゲンランプには、λ＜４９０ナノメートルの光を遮断するフィルター溶液（ＣｕＣｌ2－ＣａＣＯ3）を使用した。
【0126】
メチレンブルーまたはローズベンガルが、色素増感剤として使用された。
【0127】
反応は、ＧＬ １８スレッドを備えた２つのコネクタを備えた、ＤＵＲＡＮ(R)ホウケイ酸ガラス製の熱交換ジャケット、平底、およびフラットラボフランジ（ＤＮ）を備えた、５００ミリリットルの円筒形反応容器で行った。
ランプから反応容器までの距離は１５センチメートルであり、反応温度は３～４℃の範囲であった。
ランプから反応容器までの距離は１５センチメートルであり、反応温度は３～４℃の範囲であった。
【0128】
乾燥酸素（純度９９．５％）を、１分あたり２～４リットルの速度で、反応混合物に吹き込んだ。
【0129】
最終生成物は、３３０グラムの、Ｓｉｌｉｃａ Ｒｅｄｉ Ｓｅｐｔ Ｆｌａｓｈカラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ｃａｔ．６９－２２０３－３３０）を備えた、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ Ｆｌａｓｈクロマトグラフィーシステムで精製した。
溶媒ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＯＨ、ＣＨ3ＣＯＯＨは、標準的なＨＰＬＣまたはＢＰ等級であった。
溶媒ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＯＨ、ＣＨ3ＣＯＯＨは、標準的なＨＰＬＣまたはＢＰ等級であった。
【0130】
２．３０グラム（５．５４ミリモル）の、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－トリフルオロアセチルアミノ－Ｌ－トリプトファンＨＤＰ ３０．２３８１および１６０ミリグラムのローズベンガルを、５００ミリリットルのメタノールに溶解し、そして、冷却媒体としてのグリコール／水を用いたフーバークライオスタット（Ｈｕｂｅｒ ｃｒｙｏｓｔａｔ）を使用して、３℃に冷却した。
反応溶液に、４００Ｗ高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。照射中、酸素のゆっくりした流れを反応溶液に吹き込んだ。４時間照射した後、酸素付加および冷却は停止し、そして、反応媒体を、１５ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、２時間撹拌し、そして、水浴温度が３５℃のロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色残渣を、高真空中で、さらに乾燥させ、結晶性固体（２．６７グラム）を得た。
粗生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2＋５％酢酸から、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１５：１）＋５％酢酸の勾配で、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）で精製した。
収率
１６３ミリグラム（８％）のシス－ＨＤＰ ３０．２４１６および
４６６ミリグラム（２０％）のトランス－ＨＤＰ ３０．２４１６と共に
２９７ミリグラムのシス／トランス混合物。
生成物を、トルエンと共蒸発させた。ｔｅｒｔ－ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体がオフホワイトの粉末として得られた。
シス－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－トリフルオロアセトアミノ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（ｃｉｓ－ＨＤＰ ３０．２４１６）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４３、１．５４（ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3）；２．４５－２．６３（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）；４．１２－４．２７（ｍ、１Ｈ、２－Ｈ）；５．３５（ｄ、１Ｈ、８ａ－Ｈ）；６．９２－７．１２（ｍ、２Ｈ、７－Ｈ、５－Ｈ）；７．２０－７．２５（ｍ、１Ｈ、４－Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．７０、３１．１１、４２．８１、６１．７３、８２．１８、８５．１１、８６．７５、１０４．２０、１１２．８６、１２４．６４、１２９．４６、１３９．２１、１５１．１７、１５６．０６、１７６．１４
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４３２．００［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４３２．１４（Ｃ18Ｈ21Ｆ3Ｎ3Ｏ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４５４．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４５４．１３（Ｃ18Ｈ20Ｆ3Ｎ3ＮａＯ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８６２．９２［２Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：８６３．２６（Ｃ36Ｈ41Ｆ6Ｎ6Ｏ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８８５．０８［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：８８５．２６（Ｃ36Ｈ40Ｆ6Ｎ6ＮａＯ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１３１５．６７［３Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１３１６．３９（Ｃ54Ｈ60Ｆ9Ｎ9ＮａＯ18）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λｍａｘ＝３０９ナノメートル、２３１ナノメートル
λｍｉｎ＝２８５ナノメートル
トランス－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－アセトキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（トランスーＨＤＰ ３０．２４１６）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４４、１．５４（ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3）；２．５６－２．７２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）；４．５０－４．５６（ｍ、１Ｈ、２－Ｈ）；５．１９－５．２２（ｄ、１Ｈ、８ａ－Ｈ）；６．９０－７．０５（ｍ、２Ｈ、７－Ｈ、５－Ｈ）；７．１７－７．１８（ｍ、１Ｈ、４－Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．０５，３１．１２，４０．４０，６０．９４，６９．４５，８２，０１，８４．８７，８６．８１，１０３．６５，１１２．２５，１２４．９５，１２８．５５，１３９．４６，１５２．３０，１５６．０５，１７４．６７
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４３２．０８［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４３２．１４（Ｃ18Ｈ21Ｆ3Ｎ3Ｏ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４５４．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４５４．１３（Ｃ18Ｈ20Ｆ3Ｎ3ＮａＯ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８６３．００［２Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：８６３．２６（Ｃ36Ｈ41Ｆ6Ｎ6Ｏ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８８５．０８［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：８８５．２６（Ｃ36Ｈ40Ｆ6Ｎ6ＮａＯ12）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λｍａｘ＝３１２ナノメーター、２３３ナノメーター
λｍｉｎ＝２８６ナノメーター
５．ＨＤＰ ３０．２５２８の固相合成
ステップ１：ＨＤＰ ３０．００１３
反応溶液に、４００Ｗ高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。照射中、酸素のゆっくりした流れを反応溶液に吹き込んだ。４時間照射した後、酸素付加および冷却は停止し、そして、反応媒体を、１５ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、２時間撹拌し、そして、水浴温度が３５℃のロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色残渣を、高真空中で、さらに乾燥させ、結晶性固体（２．６７グラム）を得た。
粗生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2＋５％酢酸から、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１５：１）＋５％酢酸の勾配で、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）で精製した。
収率
１６３ミリグラム（８％）のシス－ＨＤＰ ３０．２４１６および
４６６ミリグラム（２０％）のトランス－ＨＤＰ ３０．２４１６と共に
２９７ミリグラムのシス／トランス混合物。
生成物を、トルエンと共蒸発させた。ｔｅｒｔ－ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体がオフホワイトの粉末として得られた。
シス－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－トリフルオロアセトアミノ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（ｃｉｓ－ＨＤＰ ３０．２４１６）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４３、１．５４（ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3）；２．４５－２．６３（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）；４．１２－４．２７（ｍ、１Ｈ、２－Ｈ）；５．３５（ｄ、１Ｈ、８ａ－Ｈ）；６．９２－７．１２（ｍ、２Ｈ、７－Ｈ、５－Ｈ）；７．２０－７．２５（ｍ、１Ｈ、４－Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．７０、３１．１１、４２．８１、６１．７３、８２．１８、８５．１１、８６．７５、１０４．２０、１１２．８６、１２４．６４、１２９．４６、１３９．２１、１５１．１７、１５６．０６、１７６．１４
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４３２．００［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４３２．１４（Ｃ18Ｈ21Ｆ3Ｎ3Ｏ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４５４．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４５４．１３（Ｃ18Ｈ20Ｆ3Ｎ3ＮａＯ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８６２．９２［２Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：８６３．２６（Ｃ36Ｈ41Ｆ6Ｎ6Ｏ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８８５．０８［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：８８５．２６（Ｃ36Ｈ40Ｆ6Ｎ6ＮａＯ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１３１５．６７［３Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１３１６．３９（Ｃ54Ｈ60Ｆ9Ｎ9ＮａＯ18）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λｍａｘ＝３０９ナノメートル、２３１ナノメートル
λｍｉｎ＝２８５ナノメートル
トランス－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－カルボキシ－３ａ－ヒドロキシ－６－アセトキシ－１，２，３，３ａ，８，８ａ－ヘキサヒドロピロロ［２，３－ｂ］インドール（トランスーＨＤＰ ３０．２４１６）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４４、１．５４（ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ3）3）；２．５６－２．７２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）；４．５０－４．５６（ｍ、１Ｈ、２－Ｈ）；５．１９－５．２２（ｄ、１Ｈ、８ａ－Ｈ）；６．９０－７．０５（ｍ、２Ｈ、７－Ｈ、５－Ｈ）；７．１７－７．１８（ｍ、１Ｈ、４－Ｈ）
13Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝２８．０５，３１．１２，４０．４０，６０．９４，６９．４５，８２，０１，８４．８７，８６．８１，１０３．６５，１１２．２５，１２４．９５，１２８．５５，１３９．４６，１５２．３０，１５６．０５，１７４．６７
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４３２．０８［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４３２．１４（Ｃ18Ｈ21Ｆ3Ｎ3Ｏ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４５４．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４５４．１３（Ｃ18Ｈ20Ｆ3Ｎ3ＮａＯ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８６３．００［２Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：８６３．２６（Ｃ36Ｈ41Ｆ6Ｎ6Ｏ12）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：８８５．０８［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：８８５．２６（Ｃ36Ｈ40Ｆ6Ｎ6ＮａＯ12）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λｍａｘ＝３１２ナノメーター、２３３ナノメーター
λｍｉｎ＝２８６ナノメーター
５．ＨＤＰ ３０．２５２８の固相合成
ステップ１：ＨＤＰ ３０．００１３
【化16】
【0131】
ＦｍｏｃＨｙｐＯＨ（１０．０グラム、２８．３ミリモル）を、１００ミリリットルの８０％ＭｅＯＨに懸濁し、そして、Ｃｓ2ＣＯ3（４．６グラム、１４．１ミリモル）を加えた。
完全に溶解するまで、懸濁液を５０℃で、３０分間撹拌した。
反応混合物を、濃縮乾固し、そして、ＤＭＦ１００ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル（１．６ミリリットル、３．６グラム、２９．７ミリモル）を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
ＤＭＦを留去し、そして、残渣を、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液を、カラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。化合物を、ｎ－ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて、２２０グラムのシリカゲルで精製した。
収率：１１．５グラム、１００％
ステップ２：ＨＤＰ ３０．０４００
完全に溶解するまで、懸濁液を５０℃で、３０分間撹拌した。
反応混合物を、濃縮乾固し、そして、ＤＭＦ１００ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル（１．６ミリリットル、３．６グラム、２９．７ミリモル）を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
ＤＭＦを留去し、そして、残渣を、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液を、カラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。化合物を、ｎ－ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて、２２０グラムのシリカゲルで精製した。
収率：１１．５グラム、１００％
ステップ２：ＨＤＰ ３０．０４００
【化17】
【0132】
ＨＤＰ ３０．００１３（５．０グラム、１４．１ミリモル）、ピリジニウム ４－トルエンスルホネート（１．３３グラム、５．３ミリモル）を、４０ミリリットルのジクロロエタンに、１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イルメトキシメチル樹脂（５．０グラム、１．０ミリモル／グラム ＴＨＰ樹脂）懸濁液に添加した。
反応物を、８０℃で、一晩撹拌した。
冷却した後、樹脂を濾過し、そして、広範囲に、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄した。
反応物を、８０℃で、一晩撹拌した。
冷却した後、樹脂を濾過し、そして、広範囲に、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄した。
【0133】
負荷は、０．６２ミリモル／グラムであった（脱保護後のフルオレニルメチル基のＵＶ分光法で測定）
ステップ３：ＨＤＰ ３０．２５１６（固相合成）
ステップ３：ＨＤＰ ３０．２５１６（固相合成）
【化18】
【0134】
樹脂の前処理：
ＨＤＰ ３０．０４００（０．３１グラム、０．２５ミリモル）を、Ｎ、Ｎ－ジメチルバルビツール酸（２４１ミリグラム、１．５５ミリモル）およびＰｄ（ＰＰｈ3）4（３５ミリグラム、０．０３ミリモル）で処理した。
樹脂を、室温で一晩振盪した。その後、樹脂を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
ＨＤＰ ３０．０４００（０．３１グラム、０．２５ミリモル）を、Ｎ、Ｎ－ジメチルバルビツール酸（２４１ミリグラム、１．５５ミリモル）およびＰｄ（ＰＰｈ3）4（３５ミリグラム、０．０３ミリモル）で処理した。
樹脂を、室温で一晩振盪した。その後、樹脂を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
【0135】
カップリング手順：
すべての反応物と試薬は、ジクロロメタン／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。
ＨＤＰ ３０．０４７７（ＥＰ ２８７２４７９Ｂ１に記載）（１０２ミリグラム、０．３０ミリモル）を、６．０ミリリットルのジクロロメタン／Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、そして、０．２Ｎ溶液のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔの４．０ミリリットルおよび２ミリリットルのＤＩＥＡ（４０％ＤＭＦ）で処理した。
２．０ミリリットルのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミドを添加後、反応物をマイクロ波照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロ波反応器）で、８分間、５０℃に加熱し、そして、カップリングした後、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドで洗浄した。
すべての反応物と試薬は、ジクロロメタン／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。
ＨＤＰ ３０．０４７７（ＥＰ ２８７２４７９Ｂ１に記載）（１０２ミリグラム、０．３０ミリモル）を、６．０ミリリットルのジクロロメタン／Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、そして、０．２Ｎ溶液のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔの４．０ミリリットルおよび２ミリリットルのＤＩＥＡ（４０％ＤＭＦ）で処理した。
２．０ミリリットルのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミドを添加後、反応物をマイクロ波照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロ波反応器）で、８分間、５０℃に加熱し、そして、カップリングした後、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドで洗浄した。
【0136】
Ｆｍｏｃ－脱保護：
脱保護は、２０％ピペリジンのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液６．０ミリリットルを、０℃で、１０分間添加した。樹脂を、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドで洗浄した（最後のアミノ酸のカップリングの後、脱保護しない）。
脱保護は、２０％ピペリジンのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液６．０ミリリットルを、０℃で、１０分間添加した。樹脂を、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドで洗浄した（最後のアミノ酸のカップリングの後、脱保護しない）。
【0137】
上記のプロトコルに従って、他のすべてのアミノ酸を結合した。重さを以下に示す。
(0.102グラム、 0.30ミリモル 1.5当量 HDP 30.0477 分子量:39.6、上記参照)
0.72グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocAsn(Trt)OH 分子量599.7
0.71グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocCys(OTrt)OH 分子量:586.7
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH 分子量:297.3
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmoclleOH 分子量:353.4
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH 分子量:297.3
0.161グラム、 0.37ミリモル 1.5当量 HDP 30.2416 分子量:431.1
(0.102グラム、 0.30ミリモル 1.5当量 HDP 30.0477 分子量:39.6、上記参照)
0.72グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocAsn(Trt)OH 分子量599.7
0.71グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocCys(OTrt)OH 分子量:586.7
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH 分子量:297.3
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmoclleOH 分子量:353.4
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH 分子量:297.3
0.161グラム、 0.37ミリモル 1.5当量 HDP 30.2416 分子量:431.1
【0138】
完了後、樹脂を、最終的に底部フリットを備えたシリンジに移し、ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【0139】
樹脂放出とＢリング形成
５ミリリットルのＴＦＡ、５ミリリットルのＤＣＭ＋１０％ＭｅＯＨの溶液を樹脂に吸引し、周囲温度で、１５分間振盪した。
溶液を５０ミリリットルの反応フラスコに分注し、樹脂をＴＦＡ／ＤＣＭ１：１＋１０％ＭｅＯＨで１回洗浄し、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを１６時間撹拌した。
トリイソプロピルシラン（０．５ミリリットル）を加え、反応物を真空で濃縮した。
残渣を、５００マイクロリットルのＭｅＯＨに溶解し、ペプチドを５０ミリリットルの氷冷ＴＢＭＥに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、沈殿物を５０ミリリットルのＴＢＭＥで１回洗浄し、減圧下で乾燥させた。
５ミリリットルのＴＦＡ、５ミリリットルのＤＣＭ＋１０％ＭｅＯＨの溶液を樹脂に吸引し、周囲温度で、１５分間振盪した。
溶液を５０ミリリットルの反応フラスコに分注し、樹脂をＴＦＡ／ＤＣＭ１：１＋１０％ＭｅＯＨで１回洗浄し、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを１６時間撹拌した。
トリイソプロピルシラン（０．５ミリリットル）を加え、反応物を真空で濃縮した。
残渣を、５００マイクロリットルのＭｅＯＨに溶解し、ペプチドを５０ミリリットルの氷冷ＴＢＭＥに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、沈殿物を５０ミリリットルのＴＢＭＥで１回洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【0140】
沈殿物を、２ミリリットルのメタノールに可溶化し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。メタノールを減圧下で留去し、残った水相を凍結乾燥させた。
収量：１１３ミリグラム、４１％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１１００．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１１００．１（Ｃ45Ｈ60Ｆ3Ｎ11Ｏ16Ｓ）
ＨＰＬＣ：９９．１面積％
ステップ４：環化（Ａ環形成、ＨＤＰ ３０．２５２４）
収量：１１３ミリグラム、４１％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１１００．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１１００．１（Ｃ45Ｈ60Ｆ3Ｎ11Ｏ16Ｓ）
ＨＰＬＣ：９９．１面積％
ステップ４：環化（Ａ環形成、ＨＤＰ ３０．２５２４）
【化19】
【0141】
上記凍結－乾燥単環式中間体ＨＤＰ ３０．２５１６（１１３ミリグラム、１０４マイクロモル）を、５ミリリットルのＤＭＦに溶解し、ジフェニルホスホリラジド（ＤＰＰＡ、２８マイクロリットル、５２２マイクロモル、５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、８８マイクロリットル、５２２マイクロモル、５当量）で処理した。
反応物を、１６時間攪拌し、完了したら、５００マイクロリットルの水でクエンチした。
変換をＨＰＬＣで監視した。混合物を減圧により濃縮し、１ミリリットルのメタノールに再溶解し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：４３．６ミリグラム、３８．６％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１０８２．３３［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１０８２．１（Ｃ45Ｈ58Ｆ3Ｎ11Ｏ15Ｓ）
ＨＰＬＣ：９７．８面積％
ステップ５：アセテート脱保護（ＨＤＰ ３０．２５２８）
反応物を、１６時間攪拌し、完了したら、５００マイクロリットルの水でクエンチした。
変換をＨＰＬＣで監視した。混合物を減圧により濃縮し、１ミリリットルのメタノールに再溶解し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：４３．６ミリグラム、３８．６％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１０８２．３３［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１０８２．１（Ｃ45Ｈ58Ｆ3Ｎ11Ｏ15Ｓ）
ＨＰＬＣ：９７．８面積％
ステップ５：アセテート脱保護（ＨＤＰ ３０．２５２８）
【化20】
【0142】
ＨＤＰ ３０．２５２４（３３．６ミリグラム、３１．１マイクロモル）を、７Ｎメタノール－ＮＨ3溶液（５．０ミリリットル）に溶解し、攪拌した。
変換は、ＨＰＬＣ／ＭＳで確認した。完了後（６～８時間）、反応物を真空濃縮し、１００マイクロリットルのＭｅＯＨに再懸濁し、分取ＨＰＬＣで精製した。
収量：１７．８ミリグラム、６３．５％
ＨＰＬＣ：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：９０２．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：９０２．００（Ｃ39Ｈ55Ｎ11Ｏ12Ｓ）
実測値：９２４．３［Ｍ＋Ｎａ］+
６．６－マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌ－ＰＡＢＡ－Ｓ－デオキシ－アマニチン ＨＤＰ ３０．２５６０の調製
６．１マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＡ ＨＤＰ ３０．２５５９の調製
変換は、ＨＰＬＣ／ＭＳで確認した。完了後（６～８時間）、反応物を真空濃縮し、１００マイクロリットルのＭｅＯＨに再懸濁し、分取ＨＰＬＣで精製した。
収量：１７．８ミリグラム、６３．５％
ＨＰＬＣ：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：９０２．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：９０２．００（Ｃ39Ｈ55Ｎ11Ｏ12Ｓ）
実測値：９２４．３［Ｍ＋Ｎａ］+
６．６－マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌ－ＰＡＢＡ－Ｓ－デオキシ－アマニチン ＨＤＰ ３０．２５６０の調製
【化21】
【化22】
【0143】
５．８７グラム（１０ミリモル）のＮＨ2－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－ＡＬＡ－ＰＡＢＡ（ＷＯ ２０１４／１９７８７１号パンフレットに従って調製された）を、１００ミリリットルの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。
アルゴン下、２．６６グラム（１０ミリモル）の３－（マレイミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＢＭＰＳ）および３．４０ミリリットル（２０ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を一度に加えた。
反応混合物を室温で２時間撹拌した。
ＤＭＦを真空下で蒸発させ、残渣を、１５０ミリリットルのメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで処理した。
有機溶媒を捨て、残渣（４．５７グラム）を、ＣＨ2Ｃｌ2からＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（９：１）の勾配で、１２０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２４６ナノメーター）で精製し、１．９８グラム（収率４４．６％）のＨＤＰ ３０．２５５９が褐色の固体として得られた。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４４５．１７［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４４５．２１（Ｃ22Ｈ29Ｎ4Ｏ6）；
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４６７．２５［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４６７．１９（Ｃ22Ｈ28Ｎ4ＮａＯ6）；
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：９１１．００［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：９１１．３９（Ｃ44Ｈ56Ｎ8ＮａＯ12）；
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ＝９．７６（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５８－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．２１（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），５．０６（ｂｓ，１Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝８．３，６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６９－３．５５（ｍ，２Ｈ），２．４９－２．４０（ｍ，２Ｈ），２．０３－１．８９（ｍ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ＝１７０．７８，１７０．６４，１７０．６２，１６９．７３，１３７．４７，１３７．３０，１３４．４４，１２６．８０，１１８．７８，６２．５２，５７．７１，４８．９３，３３．９６，３３．６４，３０．１８，１９．０２，１８．０７，１７．８３，０．０１．
６．２マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＡ－４－ニトロフェニル－カルボキシレート ＨＤＰ ３０．２５８６の調製
アルゴン下、２．６６グラム（１０ミリモル）の３－（マレイミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＢＭＰＳ）および３．４０ミリリットル（２０ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を一度に加えた。
反応混合物を室温で２時間撹拌した。
ＤＭＦを真空下で蒸発させ、残渣を、１５０ミリリットルのメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで処理した。
有機溶媒を捨て、残渣（４．５７グラム）を、ＣＨ2Ｃｌ2からＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（９：１）の勾配で、１２０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２４６ナノメーター）で精製し、１．９８グラム（収率４４．６％）のＨＤＰ ３０．２５５９が褐色の固体として得られた。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４４５．１７［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：４４５．２１（Ｃ22Ｈ29Ｎ4Ｏ6）；
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４６７．２５［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４６７．１９（Ｃ22Ｈ28Ｎ4ＮａＯ6）；
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：９１１．００［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：９１１．３９（Ｃ44Ｈ56Ｎ8ＮａＯ12）；
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ＝９．７６（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５８－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．２１（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），５．０６（ｂｓ，１Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝８．３，６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６９－３．５５（ｍ，２Ｈ），２．４９－２．４０（ｍ，２Ｈ），２．０３－１．８９（ｍ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ＝１７０．７８，１７０．６４，１７０．６２，１６９．７３，１３７．４７，１３７．３０，１３４．４４，１２６．８０，１１８．７８，６２．５２，５７．７１，４８．９３，３３．９６，３３．６４，３０．１８，１９．０２，１８．０７，１７．８３，０．０１．
６．２マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＡ－４－ニトロフェニル－カルボキシレート ＨＤＰ ３０．２５８６の調製
【化23】
【0144】
２００．０ミリグラム（０．４５ミリモル）のマレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－ＡＬＡ－ＰＡＢＡ ＨＤＰ ３０．２５５９を、４ミリリットルの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。
２７３．９ミリグラム（０．９０ミリモル）のビス（４－ニトロフェニルカーボネート）および１１７．６マイクロリットルのＤＩＰＥＡ（８７．３ミリグラム、０．６８ミリモル）を添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で３時間撹拌した。
反応混合物を４０ミリリットルの冷ｎ－ヘキサン／ＭＴＢＥ１：１で沈殿させ、遠心分離機で分離した。
固体を、冷ＭＴＢＥで２回洗浄し、ろ過した。
残りの固体は、次のステップに十分な純度であった。
収量２３１．３ミリグラムの白色固体（８４．３パーセント）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６１０．０８［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：６０９．２１（Ｃ29Ｈ31Ｎ5Ｏ10）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６３２．２５［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：６３２．４２（Ｃ29Ｈ31Ｎ5ＮａＯ10）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１２４１．００［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１２４１．４２（Ｃ58Ｈ62Ｎ10ＮａＯ20）
６．３ ６－マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌ－ＰＡＢＡ－Ｓ－デオキシ－６－アミノ－アマニチン ＨＤＰ ３０．２５６０の調製
２７３．９ミリグラム（０．９０ミリモル）のビス（４－ニトロフェニルカーボネート）および１１７．６マイクロリットルのＤＩＰＥＡ（８７．３ミリグラム、０．６８ミリモル）を添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で３時間撹拌した。
反応混合物を４０ミリリットルの冷ｎ－ヘキサン／ＭＴＢＥ１：１で沈殿させ、遠心分離機で分離した。
固体を、冷ＭＴＢＥで２回洗浄し、ろ過した。
残りの固体は、次のステップに十分な純度であった。
収量２３１．３ミリグラムの白色固体（８４．３パーセント）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６１０．０８［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：６０９．２１（Ｃ29Ｈ31Ｎ5Ｏ10）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６３２．２５［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：６３２．４２（Ｃ29Ｈ31Ｎ5ＮａＯ10）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１２４１．００［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１２４１．４２（Ｃ58Ｈ62Ｎ10ＮａＯ20）
６．３ ６－マレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌ－ＰＡＢＡ－Ｓ－デオキシ－６－アミノ－アマニチン ＨＤＰ ３０．２５６０の調製
【化24】
【0145】
６．７３ミリグラム（６．６２マイクロモル）の、６－アミノ－Ｓ－デオキシ－アマニチン ＨＤＰ ３０．２５２８および４．０４ミリグラム（６．６２マイクロモル）のマレイミドプロピオニル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＡ－４－ニトロフェニル－カルボキシレート ＨＤＰ ３０．２５８６を、１００マイクロリットルの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。
９．０２ミリグラム（６６．２マイクロモル）の１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）の、２．０７０マイクロリットルの乾燥ジメチルホルムアミド溶液２０７マイクロリットルを添加し、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）５．７７マイクロリットル（３３．６マイクロモル）を加えた。
溶液を、アルゴン下で、室温で７時間撹拌した。
溶媒を、高真空中で蒸発乾固させ、粗生成物を、９５％水／５％ＭｅＯＨから、９５％ＭｅＯＨ／５％水の勾配で、１５ミリリットル／分の流量にて、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ（商標）１０マイクロ、２５０ｘ２１ミリメーター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ(R)、２９０ナノメーター）で精製した。
純粋な画分を、乾燥状態まで蒸発させ、水にて凍結乾燥させ、３．７１ミリグラム（４１％）を、無定形固体として、ＨＤＰ ３０．２５６０を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１３９４．５０［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１３９４．５６（Ｃ62Ｈ81Ｎ15ＮａＯ19Ｓ）
７． ６－マレイミドヘキセノイル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－Ｓ－デオキシ－６－アミノアマニチン ＨＤＰ ３０．２５４０の調製
９．０２ミリグラム（６６．２マイクロモル）の１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）の、２．０７０マイクロリットルの乾燥ジメチルホルムアミド溶液２０７マイクロリットルを添加し、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）５．７７マイクロリットル（３３．６マイクロモル）を加えた。
溶液を、アルゴン下で、室温で７時間撹拌した。
溶媒を、高真空中で蒸発乾固させ、粗生成物を、９５％水／５％ＭｅＯＨから、９５％ＭｅＯＨ／５％水の勾配で、１５ミリリットル／分の流量にて、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ（商標）１０マイクロ、２５０ｘ２１ミリメーター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ(R)、２９０ナノメーター）で精製した。
純粋な画分を、乾燥状態まで蒸発させ、水にて凍結乾燥させ、３．７１ミリグラム（４１％）を、無定形固体として、ＨＤＰ ３０．２５６０を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１３９４．５０［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１３９４．５６（Ｃ62Ｈ81Ｎ15ＮａＯ19Ｓ）
７． ６－マレイミドヘキセノイル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－Ｓ－デオキシ－６－アミノアマニチン ＨＤＰ ３０．２５４０の調製
【化25】
【0146】
６－（マレイミド）ヘキサノイル－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＡ－４－ニトロフェニル－カルボキシレート（ＨＤＰ ３０．２０７９）は、出発材料として、６－（マレイミド）ヘキサン酸 Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を用いて、ステップ６．１／６．２と同様に調製した。
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ ９．９６（ｓ，１Ｈ），８．３５－８．２７（ｍ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｐ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２４―２．０８（ｍ，２Ｈ），１．９８（ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．５８‐１．４２（ｍ，４Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｐ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ １７２．２１，１７１．１０，１７０．９１，１７０．８９，１５５．１９，１５１．８２，１４５．０８，１３９．３２，１３４．３０，１２９．２８，１２９．１８，１２５．２５，１２２．４４，１１８．９８，７０．１６，５７．５０，４８．９６，３６．９２，３４．８３，３０．２３，２７．６４，２５．６９，２４．７７，１９．０９，１８．０６，１７．７８．
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６７４．３６［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：６７４．２４（Ｃ32Ｈ37Ｎ5ＮａＯ10）
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ ９．９６（ｓ，１Ｈ），８．３５－８．２７（ｍ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｐ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２４―２．０８（ｍ，２Ｈ），１．９８（ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．５８‐１．４２（ｍ，４Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｐ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）
δ １７２．２１，１７１．１０，１７０．９１，１７０．８９，１５５．１９，１５１．８２，１４５．０８，１３９．３２，１３４．３０，１２９．２８，１２９．１８，１２５．２５，１２２．４４，１１８．９８，７０．１６，５７．５０，４８．９６，３６．９２，３４．８３，３０．２３，２７．６４，２５．６９，２４．７７，１９．０９，１８．０６，１７．７８．
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：６７４．３６［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：６７４．２４（Ｃ32Ｈ37Ｎ5ＮａＯ10）
【0147】
ＨＤＰ ３０．２５２８（５ミリグラム、５．５マイクロモル）を、ＨＤＰ ３０．２０７９（７．１ミリグラム、１１．０マイクロモル）およびジイソプロピルエチルアミン（９．４マイクロリットル、５５マイクロモル）の添加と、２７５マイクロリットルのＤＭＦ中でカップリングさせた。
１６時間後、ＨＤＰ ３０．２０７９（３．５ミリグラム、５．４マイクロモル）およびジイソプロピルエチルアミン（９．４マイクロリットル、５５マイクロモル）を添加した。
反応物を、４日間撹拌した。
反応混合物を、分取クロマトグラフィーにより直接精製した。
収量：１．１８ミリグラム、１５．２％
ＨＰＬＣ：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１４３７．６［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１４１４．７（Ｃ65Ｈ87Ｎ15Ｏ19Ｓ）
１６時間後、ＨＤＰ ３０．２０７９（３．５ミリグラム、５．４マイクロモル）およびジイソプロピルエチルアミン（９．４マイクロリットル、５５マイクロモル）を添加した。
反応物を、４日間撹拌した。
反応混合物を、分取クロマトグラフィーにより直接精製した。
収量：１．１８ミリグラム、１５．２％
ＨＰＬＣ：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１４３７．６［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１４１４．７（Ｃ65Ｈ87Ｎ15Ｏ19Ｓ）
【0148】
８．ＨＤＰ ３０．２５４０および３０．２５６０複合体の合成
実施例：Ｔ－Ｄ２６５Ｃ－３０．２５６０の合成：
実施例：Ｔ－Ｄ２６５Ｃ－３０．２５６０の合成：
【0149】
ＰＢＳ緩衝液中の１０ミリグラムのチオマブ Ｔ－Ｄ２６５Ｃを、ＨＤＰ ３０．２５６０へのコンジュゲーションのために使用した。
抗体溶液を、１ミリモル ＥＤＴＡに調整する。
２ミリリットルの抗体溶液（１０．０ミリグラム）＋１００ミリモルのＥＤＴＡ ２０マイクロリットル、ｐＨ８．０。
抗体含量：１０ミリグラム＝６．９ｘ１０-8モル
抗体溶液を、１ミリモル ＥＤＴＡに調整する。
２ミリリットルの抗体溶液（１０．０ミリグラム）＋１００ミリモルのＥＤＴＡ ２０マイクロリットル、ｐＨ８．０。
抗体含量：１０ミリグラム＝６．９ｘ１０-8モル
【0150】
４０当量のＴＣＥＰと抗体との反応によるシステインのキャッピング解除（Ｕｎｃａｐｐｉｎｇ）：
－２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋５０ミリモルのＴＣＥＰ溶液の５５．２マイクロリットル（２．７６ｘ１０-6モル）
－シェーカーで、３７℃で、３時間インキュベートする。
－Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット２００００ ＭＷＣＯ内で、１×ＰＢＳ ２．０リットル、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で、４℃で、２回の連続透析、最初の透析 約４時間、２回目の透析は一晩。
－２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋５０ミリモルのＴＣＥＰ溶液の５５．２マイクロリットル（２．７６ｘ１０-6モル）
－シェーカーで、３７℃で、３時間インキュベートする。
－Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット２００００ ＭＷＣＯ内で、１×ＰＢＳ ２．０リットル、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で、４℃で、２回の連続透析、最初の透析 約４時間、２回目の透析は一晩。
【0151】
抗体と２０当量のデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
約２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋新しい５０ミリモル ｄｈＡＡ溶液を２７．６マイクロリットル（１．３８ｘ１０-6モル）。
シェーカー上、室温で、３時間インキュベートする。
約２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋新しい５０ミリモル ｄｈＡＡ溶液を２７．６マイクロリットル（１．３８ｘ１０-6モル）。
シェーカー上、室温で、３時間インキュベートする。
【0152】
６当量のＨＤＰ ３０．２５６０を使用した、アマニチンとの結合および２５当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインによるクエンチィング：
２００マイクロリットルのＤＭＳＯに、２ミリグラムのＨＤＰ ３０．２５６０を溶解＝１０マイクログラム／マイクロリットル。
－約２ミリリットルの抗体溶液（＝９．５ミリグラム；６．５３ｘ１０-8モル）＋５３．８マイクロリットルのＨＤＰ ３０．２５６０（＝５３８マイクログラム；３．９２ｘ１０-7モル）。
－室温で、１時間インキュベートする。
－１６．３マイクロリットルの１００ミリモル Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（１．６３ｘ１０-6モル）の添加によりクエンチする。
－室温で、１５分間（または４℃で一晩）インキュベートする。
－１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した１ｘＰＤ－１０カラムで反応混合物を精製する。
－パラフィルム上、ブラッドフォード試薬で、タンパク質含有画分を特定し、タンパク質含有画分を纏める。
－ｐＨ７．４の２．０リットルのＰＢＳおよびＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット２０、０００ ＭＷＣＯ中、４℃で、抗体溶液の透析を一晩。
２００マイクロリットルのＤＭＳＯに、２ミリグラムのＨＤＰ ３０．２５６０を溶解＝１０マイクログラム／マイクロリットル。
－約２ミリリットルの抗体溶液（＝９．５ミリグラム；６．５３ｘ１０-8モル）＋５３．８マイクロリットルのＨＤＰ ３０．２５６０（＝５３８マイクログラム；３．９２ｘ１０-7モル）。
－室温で、１時間インキュベートする。
－１６．３マイクロリットルの１００ミリモル Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（１．６３ｘ１０-6モル）の添加によりクエンチする。
－室温で、１５分間（または４℃で一晩）インキュベートする。
－１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した１ｘＰＤ－１０カラムで反応混合物を精製する。
－パラフィルム上、ブラッドフォード試薬で、タンパク質含有画分を特定し、タンパク質含有画分を纏める。
－ｐＨ７．４の２．０リットルのＰＢＳおよびＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット２０、０００ ＭＷＣＯ中、４℃で、抗体溶液の透析を一晩。
【0153】
ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析による、薬物抗体比（ＤＡＲ）の測定。
【0154】
タンパク質濃度を５．０ミリグラム／ミリリットル（３．４ｘ１０-5モル）に調整し、ろ過して無菌状態にする。４℃で保存する。
【0155】
以上のように、異なる抗体またはＨＤＰ ３０．２５４０を使用したＡＤＣが製造された。
抗体の分子量は、それぞれの抗体の分子量に従って計算された。
それに応じて、リンカー毒素、ＴＣＥＰ、ｄｈＡＡ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの量を調整して、それぞれ、等価にした。
抗体の分子量は、それぞれの抗体の分子量に従って計算された。
それに応じて、リンカー毒素、ＴＣＥＰ、ｄｈＡＡ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの量を調整して、それぞれ、等価にした。
【0156】
９． ６’－アミノ－アマニンアミド３０．２５２８のインビトロ細胞毒性
ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞に対する、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
ＨＥＫ２９３－ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞培養プレートを、ポリ－Ｄ－リジンで被覆した。
ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞に対する、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
ＨＥＫ２９３－ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞培養プレートを、ポリ－Ｄ－リジンで被覆した。
【0157】
ポリ－Ｄ－リジンによる被覆：
－５ミリグラムのポリＤ－リジンを５０ミリリットルの滅菌水に溶解した。
－９６ウェルプレートの各ウェルに５０マイクロリットル
－室温で、１時間のインキュベーション
－２００マイクロリットルの滅菌水でウェルを２回洗浄
－少なくとも２時間の乾燥（室温）。
－５ミリグラムのポリＤ－リジンを５０ミリリットルの滅菌水に溶解した。
－９６ウェルプレートの各ウェルに５０マイクロリットル
－室温で、１時間のインキュベーション
－２００マイクロリットルの滅菌水でウェルを２回洗浄
－少なくとも２時間の乾燥（室温）。
【0158】
２．０ｘ１０3のＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞／ウェル、および、１０％ＦＣＳおよびサプリメントを含む、ウェルあたり９０マイクロリットルの増殖培地を含む、透明な底の、黒い９６ウェルプレートを準備した。
対照：「ブランク」は、細胞を含まない、１００マイクロリットルの培地で設定され、「背景」および「１００％」は、１００マイクロリットルの培地中の細胞で設定した。
－３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間のインキュベーション。
ＨＤＰ ３０．２５２８およびα－アマニチンの希釈スキーム：
ストック溶液を、培地中、１：１０００（１：１０および１：１００希釈）希釈した：
１０マイクロリットルのアマニチン誘導体のストック溶液（１．０Ｘ１０-2モル）＋９０マイクロリットルのＰＢＳ＝１００マイクロリットルの１．０Ｘ１０-3モル。
２マイクロリットルの希釈液＋１９８マイクロリットルの培地＝２００マイクロリットルの１Ｘ１０-5Ｍ
さらなる希釈：
Ａ：１．０ｘ１０-5Ｍ ２００μＬ
Ｂ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ａ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｃ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｂ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｄ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｃ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｅ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｄ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｆ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｅ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｇ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｆ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｈ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｇ ２０μＬ（１：５希釈）
各溶液１０μＬを、ウェル３個に加えた。
最終容量：１００μＬ／ウェル。
最終用量：１ｘ１０-6モルから開始；１：５希釈系列。
●３７℃、５％ＣＯ2で、９６時間のインキュベーション
●９６時間後：ロシュ細胞増殖アッセイ。メーカーの指示に従って発光。
●ＥＣ50濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０データ分析ソフトウェア を使用して決定した。
対照：「ブランク」は、細胞を含まない、１００マイクロリットルの培地で設定され、「背景」および「１００％」は、１００マイクロリットルの培地中の細胞で設定した。
－３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間のインキュベーション。
ＨＤＰ ３０．２５２８およびα－アマニチンの希釈スキーム：
ストック溶液を、培地中、１：１０００（１：１０および１：１００希釈）希釈した：
１０マイクロリットルのアマニチン誘導体のストック溶液（１．０Ｘ１０-2モル）＋９０マイクロリットルのＰＢＳ＝１００マイクロリットルの１．０Ｘ１０-3モル。
２マイクロリットルの希釈液＋１９８マイクロリットルの培地＝２００マイクロリットルの１Ｘ１０-5Ｍ
さらなる希釈：
Ａ：１．０ｘ１０-5Ｍ ２００μＬ
Ｂ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ａ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｃ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｂ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｄ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｃ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｅ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｄ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｆ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｅ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｇ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｆ ２０μＬ（１：５希釈）
Ｈ：増殖培地８０μＬ＋溶液Ｇ ２０μＬ（１：５希釈）
各溶液１０μＬを、ウェル３個に加えた。
最終容量：１００μＬ／ウェル。
最終用量：１ｘ１０-6モルから開始；１：５希釈系列。
●３７℃、５％ＣＯ2で、９６時間のインキュベーション
●９６時間後：ロシュ細胞増殖アッセイ。メーカーの指示に従って発光。
●ＥＣ50濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０データ分析ソフトウェア を使用して決定した。
【0159】
１０．ＨＤＰ ３０．２５６０およびＨＤＰ ３０．２５４０複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒
ＳＫＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＬｎＣａｐ、および２２ｒｖ１細胞でのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
アッセイは、以下の変更を加えて上記（９．）に従って行った。
ＳＫＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＬｎＣａｐ、および２２ｒｖ１細胞でのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
アッセイは、以下の変更を加えて上記（９．）に従って行った。
【0160】
細胞培養プレートは、ポリ－Ｄ－リジンを用いて被覆されていなかった。
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、増殖培地で、１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００μｌ １．０ｘ１０-6Ｍ
Ｂ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３組に加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：開始１ｘ１０-7Ｍから；１：５希釈系列
Ｒａｊｉ細胞およびＮａｌｍ－６細胞における、ＷＳＴ－Ｉアッセイ：
●２．０ｘ１０3細胞／ウェルを有する透明なＦボトムの９６ウェルプレートおよび１０％のＦＣＳおよびサプリメントを含む、ウェル当たり９０マイクロリットルのそれぞれの増殖培地を準備した。
対照：「ブランク」は、細胞を含まない１００マイクロリットルの培地で設定した。「細胞のみ」は、１００マイクロリットルの培地中の細胞を設定した。
●３７℃、５％ＣＯ2で２４時間のインキュベーション
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、増殖培地で、１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００μＬ １．０ｘ１０-6モル
Ｂ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３づつに加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：開始１ｘ１０-7モルから；１：５希釈系列
●３７℃、５％ＣＯ2で、９６時間のインキュベーション
●９６時間後：製造元の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイ。
●ＥＣ50濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、増殖培地で、１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００μｌ １．０ｘ１０-6Ｍ
Ｂ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３組に加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：開始１ｘ１０-7Ｍから；１：５希釈系列
Ｒａｊｉ細胞およびＮａｌｍ－６細胞における、ＷＳＴ－Ｉアッセイ：
●２．０ｘ１０3細胞／ウェルを有する透明なＦボトムの９６ウェルプレートおよび１０％のＦＣＳおよびサプリメントを含む、ウェル当たり９０マイクロリットルのそれぞれの増殖培地を準備した。
対照：「ブランク」は、細胞を含まない１００マイクロリットルの培地で設定した。「細胞のみ」は、１００マイクロリットルの培地中の細胞を設定した。
●３７℃、５％ＣＯ2で２４時間のインキュベーション
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、増殖培地で、１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００μＬ １．０ｘ１０-6モル
Ｂ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０μＬ増殖培地＋２０μＬ溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３づつに加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：開始１ｘ１０-7モルから；１：５希釈系列
●３７℃、５％ＣＯ2で、９６時間のインキュベーション
●９６時間後：製造元の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイ。
●ＥＣ50濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
