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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-02
(45)【発行日】2023-02-10
(54)【発明の名称】トレプロスチニルプロドラッグ
(51)【国際特許分類】
A61K 31/27 20060101AFI20230203BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20230203BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20230203BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230203BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230203BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230203BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230203BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20230203BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230203BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230203BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230203BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230203BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230203BHJP
C07C 271/34 20060101ALI20230203BHJP
C07C 271/12 20060101ALI20230203BHJP
C07C 235/20 20060101ALI20230203BHJP
C07C 59/72 20060101ALI20230203BHJP
【ＦＩ】
A61K31/27
A61K31/198
A61K31/192
A61P11/00
A61P9/12
A61P9/04
A61P9/00
A61P9/14
A61P17/00
A61P13/12
A61P17/02
A61P9/10
A61P43/00 105
A61P11/06
A61P43/00 123
C07C271/34 CSP
C07C271/12
C07C235/20 C
C07C59/72
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2019516117
(86)(22)【出願日】2017-09-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-12-19
(86)【国際出願番号】 US2017053503
(87)【国際公開番号】W WO2018058124
(87)【国際公開日】2018-03-29
【審査請求日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/399,737
(32)【優先日】2016-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】511266520
【氏名又は名称】ユナイテッド セラピューティクス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100139310
【弁理士】
【氏名又は名称】吉光 真紀
(72)【発明者】
【氏名】ファレス，ケン
(72)【発明者】
【氏名】バトラ，ヒテシュ
(72)【発明者】
【氏名】グオ，リアン
(72)【発明者】
【氏名】シルバーシュタイン，アダム，マーク
【審査官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００９／１５２１６０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５０１２８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０８１６５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０１０５３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許第０９３９４２２７（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】特表２０１６－５１０３２３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｃ １／００－４０９／４４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式：【化6】
【化7】
のうちの１つを有する化合物、または前記化合物の薬学的に許容される塩の有効量を含む、患者における疾患または状態を処置するための医薬組成物。
【請求項2】
下記式：【化8】
【化9】
のうちの１つを有する、化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
（Ａ）請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および（Ｂ）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
【請求項4】
経口医薬組成物である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
皮下医薬組成物である、請求項３に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１６年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／３９９，７３７号明細書の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、２０１６年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／３９９，７３７号明細書の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
本出願は、一般に、プロスタサイクリン、およびさらに特にトレプロスチニルのプロドラッグ、ならびにこうしたプロドラッグを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
肺高血圧症は、とりわけ心不全に至ることがある肺脈管構造における増圧によって特徴付けられる進行性かつ重篤な疾患である。
【0004】
肺高血圧症（ＰＨ）は、以前には、原発性（特発性）または続発性として分類されてきた。世界保健機関（ＷＨＯ）は、肺高血圧症を５つのグループに分類している：
グループ１：肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）；
グループ１’：肺静脈閉塞性疾患（ＰＶＯＤ）および／または肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）
グループ２：左心疾患を有するＰＨ；
グループ３：肺疾患および／または低酸素血症を有するＰＨ；
グループ４：慢性の血栓性および／または塞栓性疾患によるＰＨ；ならびに
グループ５：種々の条件；不明確な多因子機序（例えば、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、リンパ管腫症、および肺血管の圧縮）。
グループ１：肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）；
グループ１’：肺静脈閉塞性疾患（ＰＶＯＤ）および／または肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）
グループ２：左心疾患を有するＰＨ；
グループ３：肺疾患および／または低酸素血症を有するＰＨ；
グループ４：慢性の血栓性および／または塞栓性疾患によるＰＨ；ならびに
グループ５：種々の条件；不明確な多因子機序（例えば、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、リンパ管腫症、および肺血管の圧縮）。
【0005】
現在では、グループ１（ＰＡＨ）を含めて、ある特定の型の肺高血圧症のための多数の承認された製品がある。それらの製品としては、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ（登録商標）トレプロスチニル注射など、活性成分としてトレプロスチニルを含有する製品が挙げられる。しかしながら、トレプロスチニルは、皮下投与された場合、部位疼痛を時々伴う。したがって、部位疼痛を引き起こさずにトレプロスチニルを投与する必要が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一実施形態は、疾患または状態を患うとともにトレプロスチニルまたはその薬学的に許容される塩の皮下投与で部位疼痛を経験したことがある患者を選択すること、およびトレプロスチニルのプロドラッグの有効量を患者に皮下投与することを含む、疾患または状態を処置する方法であり、ここで、疾患または状態は、肺高血圧症、うっ血性心不全、末梢血管疾患、レイノー現象、強皮症、腎機能不全、末梢ニューロパチー、指潰瘍、間欠性跛行、虚血肢疾患、末梢性虚血性病変、肺線維症および喘息からなる群から選択される１つまたは複数の疾患または状態である。
【0007】
別の実施形態は、肺高血圧症を患う患者にトレプロスチニルのプロドラッグの有効量を皮下投与することを含む、肺高血圧症を処置する方法である。
【0008】
なお別の実施形態は、化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで化合物は、下記式：
【0009】
【化1-1】
【0010】
【化1-2】
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】シクロペンチル環カルバメートプロドラッグＩの合成を例示するスキームである。
【図2】側鎖カルバメートプロドラッグＩＩの合成を例示するスキームである。
【図3】シクロペンチル環カーボネートプロドラッグＩＩＩの合成を例示するスキームである。
【図4】側鎖カーボネートプロドラッグＩＶの合成を例示するスキームである。
【図5】アセテートアミドプロドラッグＶＩＩの合成を例示するスキームである。
【図6】鍵となる出発材料の合成を例示するスキームである。
【図7】選択されたプロドラッグの化学式を表示する図である。
【図8】時間の関数としてＲｅｍｏｄｕｌｉｎおよびトレプロスチニルのプロドラッグの血漿濃度を表示するプロットである。静脈内および皮下のＲｅｍｏｄｕｌｉｎ（図においてそれぞれ「ＩＶ」および「ＳＱ」として示されている）について示されているデータ点は、皮下投与されたトレプロスチニルが、静脈内投与されたトレプロスチニルと生物学的に同等であることを示すため、肺高血圧症を患う患者に関与する臨床試験から得られた。「上限」および「下限」と印されているプロットは、皮下Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎについて生物学的同等性の範囲を反映している。トレプロスチニルのプロドラッグ（「プロドラッグ」として示されている）についてのプロットは、皮下投与されたＲｅｍｏｄｕｌｉｎのプロットに近似する１つの可能なデータ点セットを表し、プロドラッグはインビボでトレプロスチニル遊離酸に変換されており、血漿中の遊離酸トレプロスチニルの量がプロットされている。
【図9】以下のうちの１つを投与された試験ラットにおける部位疼痛による引っ込め時間を報告する図である：ａ）生理食塩水、ｂ）クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有していたがトレプロスチニルを含有していなかった（Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ）プラセボ製剤；ｃ）１μｇ／ｍＬのトレプロスチニル濃度を有する第１のＲｅｍｏｄｕｌｉｎ製剤、ここで製剤は、トレプロスチニル、クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有していた；ｄ）１００μｇ／ｍＬのトレプロスチニル濃度を有する第２のＲｅｍｏｄｕｌｉｎ製剤、ここで製剤は、トレプロスチニル、クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有しており、縦バーは、ｔ＝０分、１５分および９０分での製剤の投与に続く熱刺激に対する応答において、どれほど迅速に試験ラットがそれの足を引っ込めたかを示している。
【図10A】選択されたプロドラッグを示す図である。
【図10B】選択されたプロドラッグを示す図である。
【図10C】選択されたプロドラッグを示す図である。
【図10D】選択されたプロドラッグを示す図である。
【図11】ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ２ Ｃ１８カラムを使用して、トレプロスチニルおよび８つの選択されたプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイを示す図である。特異性研究の結果は、トレプロスチニルが、共溶出するプロドラッグＸＩＶを除く全てのプロドラッグからよく分離されることを示している。
【図12】Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用して、トレプロスチニルおよび８つの選択されたプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイを示す図である。
【図13】ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ２ Ｃ１８－ＡＲカラム（Ｃ１８－フェニル相）を使用して、トレプロスチニルおよび８つの選択されたプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイを示す図である。
【図14】Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨフェニルヘキシルカラムを使用して、トレプロスチニルおよび８つの選択されたプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイを示す図である。
【図15】選択されたプロドラッグについての半減期値を要約する図である。
【図16】実施例９および１１において使用された足底内モデルの誘発および処置の模式図示である。熱的試験は、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験後（最大１０分までの差異）直ちに行った。
【図17】サイクル１のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果（ｇ）を表示する図である。より低い力は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：生理食塩水（群１）、ＰＢＳ（群２）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＶＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群７）。
【図18】サイクル２のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果（ｇ）を表示する図である。より低い力は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：生理食塩水（群８）、ＰＢＳ（群９）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１２）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１３）、プロドラッグＶＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１４）。
【図19】サイクル１の熱的応答試験についての結果（秒）を表示する図である。より低い／より速い時間は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：生理食塩水（群１）、ＰＢＳ（群２）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＶＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群７）。
【図20】サイクル２の熱的応答試験についての結果（秒）を表示する図である。より低い／より速い時間は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：生理食塩水（群８）、ＰＢＳ（群９）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１２）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１３）、プロドラッグＶＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１４）。
【図21】サイクル１の平均臨床スコア（点）を表示する図である。増加された／より高いスコアは、有害事象のより多くの観察を示す。１５分および９０分の試験時点の各々について、データは以下を左から右に表示する：生理食塩水（群１）、ＰＢＳ（群２）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＶＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群７）。１５分時点について、非ゼロ観察は、以下左から右の通りである：トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＶＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群７）。９０分時点について、非ゼロ観察は、以下左から右の通りである：トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群６）。
【図22】サイクル２の平均臨床スコア（点）を表示する図である。増加された／より高いスコアは、有害事象のより多くの観察を示す。１５分および９０分の試験時点の各々について、データは以下を左から右に表示する：生理食塩水（群８）、ＰＢＳ（群９）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１２）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１３）、プロドラッグＶＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１４）。１５分および９０分の試験時点の各々について、非ゼロ観察のみがトレプロスチニル１μｇ／ｍｌに対応する（群１０）。
【図23】実施例１０において使用された足底内モデルの誘発および処置の模式図示である。
【図24】Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果（ｇ）を表示する図である。より低い力は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＸＶ １μｇ／ｍｌ（群７）。
【図25】熱的応答試験についての結果（秒）を表示する図である。より低い／より速い時間は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＸＶ １μｇ／ｍｌ（群７）。
【図26】サイクル１の平均臨床スコア（点）を表示する図である。増加された／より高いスコアは、有害事象のより多くの観察を示す。１５分および９０分の試験時点の各々について、データは以下を左から右に表示する：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）、プロドラッグＸＶ １μｇ／ｍｌ（群７）。ゼロスコアは、１５分点および９０分点の各々についてリン酸緩衝液に対して観察された。したがって、左の非ゼロカラムから１番目は、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）を表す。
【図27】サイクル１のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果（ｇ）を表示する図である。より低い力は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）。
【図28】サイクル２のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果（ｇ）を表示する図である。より低い力は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群７）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群８）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群９）、プロドラッグＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＸＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１２）。
【図29】サイクル１の熱的応答試験についての結果（秒）を表示する図である。より低い／より速い時間は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）。
【図30】サイクル２の熱的応答試験についての結果（秒）を表示する図である。より低い／より速い時間は、より大きい感受性を示す。ベースライン、１５分および９０分の試験時点の各々について、カラムは以下を左から右に表す：リン酸緩衝液（群７）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群８）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群９）、プロドラッグＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＸＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１２）。
【図31】サイクル１の平均臨床スコア（点）を表示する図である。増加された／より高いスコアは、有害事象のより多くの観察を示す。１５分および９０分の試験時点の各々について、データは以下を左から右に表示する：リン酸緩衝液（群１）、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）、プロドラッグＶＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群３）、プロドラッグＩＩＩ １００μｇ／ｍｌ（群４）、プロドラッグＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群５）、プロドラッグＸＩＶ １００μｇ／ｍｌ（群６）。ゼロスコアは、１５分点および９０分点の各々についてリン酸緩衝液で観察された。したがって、左の非ゼロカラムから１番目は、トレプロスチニル１００μｇ／ｍｌ（群２）を表す。
【図32】サイクル２の平均臨床スコア（点）を表示する図である。増加された／より高いスコアは、有害事象のより多くの観察を示す。１５分および９０分の試験時点の各々について、データは以下を左から右に表示する：リン酸緩衝液（群７）、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群８）、プロドラッグＶＩＩ １μｇ／ｍｌ（群９）、プロドラッグＩＩＩ １μｇ／ｍｌ（群１０）、プロドラッグＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１１）、プロドラッグＸＩＶ １μｇ／ｍｌ（群１２）。ゼロスコアは、１５分点および９０分点の各々についてリン酸緩衝液で観察された。したがって、左の非ゼロカラムから１番目は、トレプロスチニル１μｇ／ｍｌ（群８）を表す。
【図33】心拍数についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図34】収縮期血圧についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図35】拡張期血圧についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図36】平均動脈圧についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図37】脈圧についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図38】体温についてラジオテレメトリーデータの要約を表示する図である。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。
【図39】プロドラッグＶＩＩＩの合成のためのスキームを模式的に図示する図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
別段に特定されていない限り、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を指す。
【0013】
Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ（登録商標）（注射または静脈内トレプロスチニル）、Ｔｙｖａｓｏ（登録商標）（吸入トレプロスチニル）およびＯｒｅｎｉｔｒａｍ（登録商標）（トレプロスチニルの経口固体剤形）の活性成分であるトレプロスチニルが米国特許第４，３０６，０７５号明細書に記載された。トレプロスチニルおよび他のプロスタサイクリン誘導体を作製する方法は、例えば、Moriarty, et al., J. Org. Chem. 2004, 69, 1890-1902, Drug of the Future, 2001, 26(4), 364-374、米国特許第６，４４１，２４５号明細書、同第６，５２８，６８８号明細書、同第６，７００，０２５号明細書、同第６，８０９，２２３号明細書、同第６，７５６，１１７号明細書、同第８，４６１，３９３号明細書、同第８，４８１，７８２号明細書；同第８，２４２，３０５号明細書、同第８，４９７，３９３号明細書、同第８，９４０，９３０号明細書、同第９，０２９，６０７号明細書、同第９，１５６，７８６号明細書および同第９，３８８，１５４号明細書、同第９，３４６，７３８号明細書；米国公開特許出願第２０１２－０１９７０４１号明細書、同第２０１３－０３３１５９３号明細書、同第２０１４－００２４８５６号明細書、同第２０１５－０２９９０９１号明細書、同第２０１５－０３７６１０６号明細書、同第２０１６－０１０７９７３号明細書、同第２０１５－０３１５１１４号明細書、同第２０１６－０１５２５４８号明細書および同第２０１６－０１７５３１９号明細書；ＰＣＴ公報番号国際公開第２０１６／００５５８１９号パンフレットおよび同国際公開第２０１６／０８１６５８号パンフレットに記載されている。
【0014】
トレプロスチニルの様々な使用および／または様々な形態は、例えば、米国特許第５，１５３，２２２号明細書、同第５，２３４，９５３号明細書、同第６，５２１，２１２号明細書、同第６，７５６，０３３号明細書、同第６，８０３，３８６号明細書、同第７，１９９，１５７号明細書、同第６，０５４，４８６号明細書、同第７，４１７，０７０号明細書、同第７，３８４，９７８号明細書、同第７，８７９，９０９号明細書、同第８，５６３，６１４号明細書、同第８，２５２，８３９号明細書、同第８，５３６，３６３号明細書、同第８，４１０，１６９号明細書、同第８，２３２，３１６号明細書、同第８，６０９，７２８号明細書、同第８，３５０，０７９号明細書、同第８，３４９，８９２号明細書、同第７，９９９，００７号明細書、同第８，６５８，６９４号明細書、同第８，６５３，１３７号明細書、同第９，０２９，６０７号明細書、同第８，７６５，８１３号明細書、同第９，０５０，３１１号明細書、同第９，１９９，９０８号明細書、同第９，２７８，９０１号明細書、同第８，７４７，８９７号明細書、同第９，３５８，２４０号明細書、同第９，３３９，５０７号明細書、同第９，２５５，０６４号明細書、同第９，２７８，９０２号明細書、および同第９，２７８，９０３号明細書、米国公開特許出願第２００９－００３６４６５号明細書、同第２００８－０２００４４９号明細書、同第２００８－０２８０９８６号明細書、同第２００９－０１２４６９７号明細書、同第２０１４－０２７５６１６号明細書、同第２０１４－０２７５２６２号明細書、同第２０１３－０１８４２９５号明細書、同第２０１４－０３２３５６７号明細書、同第２０１６－００３０３７１号明細書、同第２０１６－００５１５０５号明細書、同第２０１６－００３０３５５号明細書、同第２０１６－０１４３８６８号明細書、同第２０１５－０３２８２３２号明細書、同第２０１５－０１４８４１４号明細書、同第２０１６－００４５４７０号明細書および同第２０１６－０１２９０８７号明細書、ならびにＰＣＴ公報番号国際公開第００／５７７０１号パンフレット、同国際公開第２０１６０１０５５３８号パンフレットおよび同国際公開第２０１６０３８５３２号パンフレットに開示されている。
【0015】
トレプロスチニルは、以下の化学式：
【0016】
【化2】
【0017】
本発明者らは、皮下投与など注射によってトレプロスチニルのある特定のプロドラッグを投与することが、トレプロスチニルまたはトレプロスチニルの塩、例えばトレプロスチニルナトリウムを同じ投与経路を介して同じ濃度で投与することと比較して、より少ないまたは全くない疼痛に至り得ることを発見した。
【0018】
一実施形態は、トレプロスチニルのプロドラッグの有効量を患者に投与することによって処置することができる疾患または状態を処置する方法であり得る。状態は肺高血圧症であってよく、患者はヒトであってよい。投与は、皮下注射などの注射によって起こり得る。一部の実施形態において、プロドラッグは、適切なポンプを使用することなどによって、患者に実質的に連続して投与することができる。
【0019】
別の実施形態は、疾患または状態を患うとともにトレプロスチニルまたはトレプロスチニルの塩、例えばトレプロスチニルナトリウムを投与することで部位疼痛を経験したことがある患者の選択、およびトレプロスチニルのプロドラッグの有効量を患者に投与することを含む、トレプロスチニルによって処置することができる疾患または状態を処置する方法であり得る。状態は肺高血圧症であってよく、患者はヒトであってよい。投与は、皮下注射などの注射によって起こり得る。一部の実施形態において、プロドラッグは、適切なポンプを使用することなどによって、患者に実質的に連続して投与することができる。
【0020】
トレプロスチニルによって処置することができる疾患／状態としては、以下に限定されないが、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）および慢性血栓塞栓性肺高血圧症を含めた肺高血圧症；うっ血性心不全などの心不全；末梢血管疾患、レイノー現象、レイノー病、バージャー病、強皮症、腎機能不全、間欠性跛行、虚血肢疾患、末梢性虚血性病変などの虚血性疾患；糖尿病性ニューロパチーを含めた末梢ニューロパチー；四肢病変および／または潰瘍、例えば、末梢血管疾患、レイノー現象、レイノー病、バージャー病、強皮症、間欠性跛行、虚血肢疾患などの虚血性疾患によっておよび／または糖尿病性ニューロパチーなどの末梢ニューロパチーによって引き起こされ得るまたは引き起こされ得ない足部潰瘍および／または指潰瘍（手指および／またはつま先の両方）；肺線維症、嚢胞性線維症；喘息；肺、肝臓、脳、膵臓、腎臓、前立腺、乳房、結腸および頭頸部のがんからなる群から選択されるがんであり得るがんが挙げられる。
【0021】
一部の実施形態において、トレプロスチニルまたはトレプロスチニルの塩を投与することと比較した場合、トレプロスチニルプロドラッグを投与することに伴うほとんどないまたは全くない疼痛は、多数の利益を有する。例えば、トレプロスチニルに伴う疼痛を忍容できない患者は、プロドラッグを受けることによってトレプロスチニル処置の利益を得ることができ得る。視覚的アナログスコア（ＶＡＳスコア）は、皮下注入などの注入の持続期間全体にわたって患者から連続して収集することができる。ＶＡＳスコアは次いで、疼痛曲線下面積（ＡＵＣ）を算出するために時間の関数としてプロットすることができる。トレプロスチニルまたはトレプロスチニルの塩、例えばトレプロスチニルナトリウムを投与することと比較して、トレプロスチニルプロドラッグを投与することによって達成することができるほとんどないまたは全くない疼痛は、トレプロスチニルまたはトレプロスチニルの塩、例えばトレプロスチニルナトリウムと比較して、トレプロスチニルプロドラッグについてのより低い疼痛ＡＵＣを意味し得る。ＶＡＳスコア方法は、ただの疼痛強度のみでない定量化を可能にすることができ、というのはそれが、強度の積分ならびに時間をかけて強度の変化をモニタリングすることも可能にすることができるからである。ＶＡＳスコア方法は、例えばLydick E, et al. Quality of Life Research. 1995; 4:41-45;およびVan Wijk AJ et al. Eur J Pain. 2013; 17:394-401に開示されている。
【0022】
「有効量」という用語は、疾患または状態を処置するのに必要であり得るトレプロスチニルプロドラッグの量を意味し得る。一部の実施形態において、トレプロスチニルプロドラッグの有効量は、同じ疾患または状態を処置するためのトレプロスチニルの有効量と同じまたは同様であり得る。一部の実施形態において、トレプロスチニルプロドラッグの有効量は、同じ疾患または状態を処置するためのトレプロスチニルの有効量と異なることがある。当業者は、例えば、関連の疾患または状態、疾患または状態を処置、寛解または予防することが公知であるトレプロスチニルの量、およびプロドラッグがインビボでトレプロスチニルに変換する速度に基づき、トレプロスチニルプロドラッグの「有効量」を決定することができる。
【0023】
一部の実施形態において、プロドラッグは、米国特許第７，３８４，９７８号明細書、同第７，４１７，０７０号明細書、同第７，５４４，７１３号明細書、同第８，２５２，８３９号明細書、同第８，４１０，１６９号明細書、同第８，５３６，３６３号明細書、同第９，０５０，３１１号明細書、同第９，１９９，９０８号明細書、同第９，２７８，９０１号明細書、同第９，４２２，２２３号明細書および同第９，６２４，１５６号明細書に開示されているプロドラッグであってよく、これらを全体で参照により本明細書に組み込む。
【0024】
一部の実施形態において、プロドラッグは、米国特許第９，３７１，２６４号明細書、同第９，３９４，２２７号明細書、同第９，５０５，７３７号明細書および同第９，６４３，９１１号明細書に開示されているプロドラッグであってよく、これらを全体で参照により本明細書に組み込む。
【0025】
一部の実施形態において、プロドラッグは、下記で考察されているプロドラッグのうちの１つであり得る。
【0026】
例えば、一部の実施形態において、プロドラッグは、以下の式：
【0027】
【化3】
【0028】
【化4】
【0029】
【化5】
を有する化合物または化合物の薬学的に許容される塩であり得る。
【0030】
一部の実施形態において、プロドラッグは、以下の式：
【0031】
【化6】
【0032】
【化7】
【0033】
【化8】
を有する化合物または化合物の薬学的に許容される塩であり得る。
【0034】
一部の実施形態において、プロドラッグは、以下の式：
【0035】
【化9】
Ｘは、ＯＨまたは
【0036】
【化10】
Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、
【0037】
【化11】
の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【0038】
Ｃ１～４アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチルまたはｔ－ブチルを挙げることができる。
【0039】
末端のヒドロキシル基で置換されているＣ１～４アルキルの例としては、ヒドロキシメチル；ヒドロキシルエチル；ヒドロキシプロピル；４－ヒドロキシブチル；２－メチル－３－ヒドロキシプロピルを挙げることができる。
【0040】
末端のカルボキシ基で置換されているＣ１～４アルキルの例としては、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル、４－カルボキシブチル、２－メチル－３－カルボキシプロピルを挙げることができる。
【0041】
一部の実施形態において、ＸはＯＨであってよい。こうした場合において、ある特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｃ１～４アルキルから各々独立して選択することができる。Ｒ２およびＲ３は、同じまたは異なっていてよい。一部の場合において、Ｒ２およびＲ３は同じであってよい。例えば、Ｒ２およびＲ３の両方はエチルであってよい。なお、一部の他の場合において、Ｒ２およびＲ３は異なっていてよい。例えば、Ｒ２はメチルであってよく、Ｒ３はエチルであってよく、または逆もまた同じである。
【0042】
一部の実施形態において、ＸがＯＨである場合、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈおよび
【0043】
【化12】
【0044】
【化13】
【0045】
【化14】
【0046】
一部の実施形態において、ＸがＯＨである場合、少なくとも１つのＲ２およびＲ３はホスフェートであってよい。ある特定の場合において、Ｒ２およびＲ３の両方はホスフェートであってよい。ある特定の他の場合において、Ｒ２およびＲ３の一方はホスフェートであってよく、他方はＨであってよい。
【0047】
一部の実施形態において、ＸがＯＨである場合、Ｒ２またはＲ３のうちの少なくとも１つは、ＯＲ２（またはＯＲ３）がアミノ酸のエステルを形成する基であってよい。ある特定の実施形態において、Ｒ２またはＲ３の一方は、ＯＲ２（またはＯＲ３）がアミノ酸のエステルを形成する基であってよいが、他方はＨであってよい。例えば、ＯＲ２はアミノ酸のエステルを形成することができるが、Ｒ３はＨであり；またはＯＲ３はアミノ酸のエステルを形成することができるが、Ｒ２はＨである。ある特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、ＯＲ２およびＯＲ３が各々アミノ酸のエステルを形成するようなものであってよい。ある特定の場合において、ＯＲ２およびＯＲ３は、同じアミノ酸のエステルを形成することができる。なお、ある特定の場合において、ＯＲ２は、第１のアミノ酸のエステルを形成することができるが、ＯＲ３は、第１のアミノ酸と異なる第２のアミノ酸のエステルを形成することができる。
【0048】
アミノ酸は、Ｄ－異性体アミノ酸またはＬ－異性体アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態において、アミノ酸は自然発生アミノ酸であってよい。なお、一部の実施形態において、アミノ酸は人工的アミノ酸であってよい。アミノ酸の例としては、以下に限定されないが、カルバミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。ＯＲ２（ＯＲ３）がアミノ酸のエステルを形成する場合、Ｒ２（Ｒ３）は、
【0049】
【化15】
【0050】
【化16】
を有することができる。アミノ酸がプロリンである実施形態において、Ｒ１１はＲ１０と一緒に、ピロリジン環構造を形成するが、Ｒ１２はＨである。Ｒ１０は、例えば、天然アミノ酸側鎖のうちの１つ、例えば－ＣＨ３（アラニン）、－－（ＣＨ２）３ＨＣＮＨ２ＮＨ（アルギニン）、－－ＣＨ２ＣＯＮＨ２（アスパラギン）、－－ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、－－ＣＨ３ＳＨ（システイン）、－－（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２（グルタミン）、－－（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、－－Ｈ（グリシン）、－－ＣＨＣＨ３ＣＨ２ＣＨ３（イソロイシン）、－－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシン）、－－（ＣＨ２）４ＮＨ２（リジン）、－－（ＣＨ２）２ＳＣＨ３（メチオニン）、－－ＣＨ２Ｐｈ（フェニルアラニン）、－－ＣＨ２ＯＨ（セリン）、－－ＣＨＯＨＣＨ３（スレオニン）、－－ＣＨ（ＣＨ３）２（バリン）、
【0051】
【化17】
【0052】
一部の実施形態において、Ｒ２およびＲ３の各々はＨである。こうした場合において、ある特定の実施形態において、ＸはＮＲ１Ｒ６であってよい。Ｒ１は、ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルであってよい。Ｒ６は、
【0053】
【化18】
【0054】
ある特定の実施形態において、Ｒ１はＨであってよい。こうした場合において、一部の実施形態において、Ｒ６は、
【0055】
【化19】
であってよい。
【0056】
ある特定の実施形態において、Ｒ１はＨであってよく、Ｒ６は、
【0057】
【化20】
であってよい。
【0058】
ある特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は各々Ｈであり、ＮＲ１Ｒ６は、上記で考察されているアミノ酸であってよいアミノ酸のアミドを形成することができる。ＮＲ１Ｒ６は、例えば、
【0059】
【化21】
【0060】
ある特定の場合において、Ｒ２およびＲ３が各々Ｈである場合、ＸはＯＲ９であってよく、Ｒ９はＣ１～Ｃ４アルキル（末端のヒドロキシル基またはカルボキシ基で任意選択により置換されていてよい）であってよい。Ｒ９が、末端のカルボキシ基で置換されているＣ１～Ｃ４アルキルである場合、Ｒ９は、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル、４－カルボキシブチル、２－メチル－３－カルボキシプロピルであってよい。
【0061】
一部の実施形態において、プロドラッグは、下記式：
【0062】
【化22-1】
【0063】
【化22-2】
【0064】
【化22-3】
【0065】
【化22-4】
【0066】
これらのプロドラッグは、トレプロスチニルまたはその塩の投与と比較した部位疼痛の低減に加えてまたは代替として、トレプロスチニルと比較した１つまたは複数の利点を有することができる。例えば、これらのプロドラッグの一部は、少なくとも一部の患者集団において、改善された安定性またはより大きな耐性を有することができる。
【0067】
これらのプロドラッグの少なくとも一部は、１５０分未満または１２０分未満または９０分未満または６０分未満または５０分未満または４５分未満または４０分未満または３０分未満または２０分未満または１５分未満または１２分未満または約１０分のヒト血漿中半減期を有することができる。
【0068】
ある特定の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグは、少なくとも１ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも２ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも３ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも４ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも５ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも６ｍｇ／ｍＬの平衡水溶解度を有することができる。ある特定の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグは、３ｍｇ／ｍＬから４０ｍｇ／ｍＬ、もしくは３ｍｇ／ｍＬから３５ｍｇ／ｍＬ、もしくは５ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬ、またはこれらの範囲内の任意の値もしくはサブ範囲の平衡水溶解度を有することができる。プロドラッグの溶解度は、ｐＨが溶解度測定において使用されるビヒクル中で増加されるならば、および／または１種もしくは複数の塩がビヒクルから除去されるならば、より大きいことがある。
【0069】
Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ（登録商標）は皮下投与についてＦＤＡによって承認されているが、一部の患者はこうした投与の結果として部位疼痛を経験する。本発明は任意の特別な理論に拘束されないが、この部位疼痛は、ｍ－クレゾールなどの不活性成分に対立するものとしてトレプロスチニルそれ自体、または任意の不活性成分との組合せにおけるトレプロスチニルの存在の結果であり得る。図９は、ラット足疼痛モデルを使用して試験ラットによる部位疼痛に起因するｔ＝０分、１５分および９０分での引っ込め時間を報告しており、ここでラットは、以下のうちの１つを投与された：ａ）生理食塩水、ｂ）クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有していたがトレプロスチニルを含有していなかったプラセボ製剤（図９において「Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎプラセボ」として示されている）；ｃ）トレプロスチニル、クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有する、１μｇ／ｍＬのトレプロスチニル濃度を有するＲｅｍｏｄｕｌｉｎ製剤（図９において「トレプロスチニル１μｇ／ｍＬ」として示されている）；およびｄ）トレプロスチニル、クエン酸緩衝液、塩化ナトリウムおよびｍ－クレゾールを含有する、１００μｇ／ｍＬのトレプロスチニル濃度を有するＲｅｍｏｄｕｌｉｎ製剤（図９において「トレプロスチニル１００μｇ／ｍＬ」として示されている）。図９における縦バーは、どのくらい迅速に試験ラットが、ｔ＝０分、１５分および９０分で、製剤の投与に続く熱刺激に対する応答でそれらの足を引っ込めたかを示す。データは、試験ラットが、トレプロスチニルを含有した製剤の場合において、熱刺激に対してより感受性であったとともにより迅速にそれらの足を引っ込めたが、他方で、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎプラセボ（Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎの不活性成分を含有していたがトレプロスチニルを含有していなかった）は、それらの感受性を増加させなかったことを示している。
【0070】
本発明は、それの動作理論によって制限されないが、皮下投与中の部位疼痛は、注射の部位でのＩＰ、ＤＰまたはＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に結合するトレプロスチニルによるものであり得る。トレプロスチニルは、分子上の３個のヒドロキシル基に対応する３つの官能性位置でこれらの受容体に結合することがあり、例えば、Tsai and Wu, Eicosanoids, 2(3): 131-43 (1989)を参照されたい。したがって、トレプロスチニルのヒドロキシル基に結合している１個もしくは複数の基、またはこれらの受容体への結合を低減する他の修飾を有するトレプロスチニルのプロドラッグは、投与の部位で局所的に受容体に対して、トレプロスチニルよりも少ない親和性を有することができる。
【0071】
「トレプロスチニルのプロドラッグ」（文脈に依存して「トレプロスチニルプロドラッグ」または単に「プロドラッグ」とも称される）という成句は、本明細書で使用される場合、投与に続いてインビボでトレプロスチニルに全体的または部分的に変換するトレプロスチニルの任意の誘導体を指す。トレプロスチニルのプロドラッグは、トレプロスチニルと比較した場合、注射の部位で局所的にＩＰ、ＤＰまたはＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に対して、低減された親和性を有することができる。一部の実施形態において、「トレプロスチニルのプロドラッグ」は、トレプロスチニルと比較した場合、ＩＰ、ＤＰまたはＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に対して、低減された親和性を有するように修飾されたトレプロスチニル構造の、１個または複数のヒドロキシル基を有するトレプロスチニル誘導体であり得るが、皮下投与および後続の血液中への拡散に続いて活性トレプロスチニルにインビボで変換され得る。一部の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグは、血流などにおいて、皮下腔の外側のトレプロスチニルにインビボで完全にまたは実質的に変換される。好ましいプロドラッグは、上記の式Ｉの化合物を含む。トレプロスチニルの他の好ましいプロドラッグは、トレプロスチニルのアミド、カーボネートまたはカルバメートのエステルを含む。一部の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグは、投与に続いてインビボでトレプロスチニルへの５０％超、７５％、８５％、９０％、９５％または９８％の変換を有する。一部の実施形態において、この変換は、投与に続く１５分、３０分、４５分、１時間、２時間または３時間で行われる。トレプロスチニルのプロドラッグは、こうしたプロドラッグの薬学的に許容される塩を含む。
【0072】
好ましくは、トレプロスチニルのプロドラッグは、例えば溶液中で自発的にトレプロスチニルに加水分解しないことによって貯蔵中、投与前または初期注射中、および注射の部位で安定である。好ましくは、本発明のプロドラッグ製剤は、トレプロスチニルがないか、または遊離酸形態のトレプロスチニルが実質的にない。一部の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグの１０％未満、５％、２％、１％または０．１％が、定義されている貯蔵期間中にトレプロスチニルに変換する。一部の実施形態において、その定義されている貯蔵期間は、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月または１２カ月であり得る。
【0073】
皮下投与される場合のトレプロスチニルのプロドラッグは、好ましくは、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎの皮下投与と生物学的に同等である。一実施形態において、投与されたプロドラッグは、皮下ＲｅｍｏｄｕｌｉｎについてのＣｍａｘおよびＡＵＣの８０～１２５％の間であるトレプロスチニルの血漿濃度を提供する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ＵＣＭ３７７４６５．ｐｄｆを参照されたい。別の実施形態において、Ｃｍａｘ値およびＡＵＣ値は、皮下ＲｅｍｏｄｕｌｉｎのＣｍａｘレベルおよびＡＵＣレベルの９５％から１０５％の間である。Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎは、好ましくは、１．２５ｎｇ／ｋｇ／分で皮下に注入されるが、この初期用量が副作用により耐えられ得ないならば、ＦＤＡ承認ラベルは、注入速度を０．６２５ｎｇ／ｋｇ／分に低減することを規定している。
【0074】
図８は、トレプロスチニルの血漿濃度を時間の関数として表示している。図８における下限および上限は、皮下投与Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎについての血漿濃度の７５％および１２５％にそれぞれ対応しており、これは、本発明のプロドラッグで標的化するための生物学的に同等な血漿濃度の１つの好ましい範囲を表す。図８は、トレプロスチニルの１つの可能な皮下投与プロドラッグ製剤についてのプロットを示しており、これは、下限から上限の間でフィットし、そのため、ある特定の時間期間にわたって測定されたトレプロスチニルの血漿濃度の点から、皮下投与Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎと生物学的に同等である。
【0075】
開示されているトレプロスチニルプロドラッグ、例えばアミド、カルバメートおよびカーボネートのプロドラッグは、殊に、皮下投与を含めて非経口投与するための、一般のエステルプロドラッグを超える１つまたは複数の利点を有することができる。例えば、開示されているトレプロスチニルプロドラッグ、例えばアミド、カルバメートおよびカーボネートのプロドラッグは、一般のエステルプロドラッグよりも安定であり得、一般のエステルプロドラッグは加水分解する傾向を有することがあり、それによって、所望されない場合、例えば溶液中でまたは注射部位でトレプロスチニルに早期に変換する。
【0076】
「薬学的に許容される塩」は、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸、または塩基性もしくは酸性のアミノ酸との塩を含む。無機塩基の塩は、ナトリウムまたはカリウムなどのアルカリ金属の塩；カルシウムおよびマグネシウムまたはアルミニウムなどのアルカリ土類金属の塩；ならびにアンモニアの塩であってよい。有機塩基の塩は、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンであってよい。無機酸の塩は、例えば、塩酸の塩、ヒドロホウ酸の塩、硝酸の塩、硫酸の塩、またはリン酸の塩であってよい。有機酸の塩は、例えば、以下の酸：ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸のうちの１つの塩であってよい。塩基性アミノ酸の塩は、例えば、アルギニン、リジンまたはオルニチンの塩であってよい。酸性アミノ酸の塩は、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸の塩であってよい。
【0077】
「肺高血圧症」は、肺高血圧症の全ての形態、ＷＨＯグループ１～５を指す。ＰＡＨとも称される肺動脈高血圧症は、ＷＨＯグループ１肺高血圧症を指す。ＰＡＨは、新生児の特発性、遺伝性、薬物または毒素誘発性および遷延性の肺高血圧症（ＰＰＨＮ）を含む。
【0078】
本発明のトレプロスチニルプロドラッグは、薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤または希釈液などを含むこともできる医薬組成物の形態で提供することができる。こうした医薬組成物は、とりわけ、顆粒化プロセス、混合プロセス、溶解プロセス、カプセル化プロセス、凍結乾燥プロセス、乳化プロセスまたはゲル状化プロセスなど、当技術分野において公知である方法によって製造することができる。組成物は、例えば、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁液剤および溶液剤の形態であってよい。組成物は、経口投与、経粘膜的投与、直腸投与、経皮または皮下の投与、ならびにくも膜下腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、眼球内または脳室内の注射のためなど、多数の異なる投与経路のために製剤化することができる。トレプロスチニルプロドラッグは、注射としてまたは徐放性製剤としてを含めて、例えば全身的投与よりはむしろ局所的投与における上記経路のいずれかによって、投与することができる。
【0079】
一実施形態において、医薬組成物は、トレプロスチニルのプロドラッグおよび担体、例えば滅菌水を含むことができる。一部の実施形態において、トレプロスチニルのプロドラッグは皮下投与のために製剤化され、こうした製剤は、ｍ－クレゾールまたは別の保存剤を含むことがあるまたはない。
【0080】
経口投与、頬側投与および舌下投与のため、散剤、懸濁液剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲルキャップ剤およびカプレット剤が固体剤形として許容され得る。これらは、例えば、１つもしくは複数のトレプロスチニルプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩を、少なくとも１種の添加剤または賦形剤、例えばデンプンまたは他の添加剤と混合することによって調製することができる。適当な添加剤または賦形剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、ソルビトール、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアガム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成のポリマーもしくはグリセリド、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル－セルロース、および／またはポリビニルピロリドンであり得る。任意選択により、経口剤形は、投与を補助するための他の成分、例えば不活性希釈液、または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、または保存剤、例えばパラベンもしくはソルビン酸、または酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、トコフェロールもしくはシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝液、甘味剤、香味剤、または香剤を含有することができる。追加として、染料または顔料が、識別のために添加され得る。錠剤は、当技術分野において公知である適当なコーティング材料でさらに処理することができる。
【0081】
経口投与のための液体剤形は、水などの不活性希釈液を含有することができる薬学的に許容される乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液剤、スラリー剤および溶液剤の形態であってよい。医薬製剤は、以下に限定されないが、油、水、アルコールおよびこれらの組合せなどの滅菌液体を使用して、液体懸濁液または溶液として調製することができる。薬学的に適当な界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤は、経口または非経口投与のために添加することができる。
【0082】
上で注記されている通り、懸濁液は油を含むことができる。こうした油としては、以下に限定されないが、落花生油、ゴマ油、綿実油、コーン油およびオリーブ油が挙げられる。懸濁液調製物は、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドなど脂肪酸のエステルも含有することができる。懸濁液製剤は、以下に限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールなどのアルコールを含むことができる。エーテル、例えば、以下に限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、石油炭化水素、例えば鉱物油およびワセリン；ならびに水も、懸濁液製剤中に使用することができる。
【0083】
注射可能な剤形は一般に、適当な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる水性懸濁液剤または油懸濁液剤を含む。注射可能な形態は、溶媒または希釈液を用いて調製される溶液相または懸濁液の形態であってよい。許容される溶媒またはビヒクルは、滅菌水、リンゲル液または等張性生理食塩水溶液を含む。代替として、滅菌油が溶媒または懸濁化剤として用いられ得る。好ましくは、油または脂肪酸は、天然油または合成油、脂肪酸、モノ、ジまたはトリグリセリドを含めて、不揮発性である。
【0084】
注射のため、医薬製剤は、上に記載されている通りの適切な溶液を用いる再構成に適当な粉末であってよい。これらの例としては、以下に限定されないが、フリーズ乾燥、回転乾燥またはスプレー乾燥させた粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または粒子状物が挙げられる。注射のため、製剤は、任意選択により、安定剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、生物学的利用能調節剤およびこれらの組合せを含有することができる。化合物は、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための単位剤形は、アンプル中または多用量容器中にあってよい。
【0085】
上に記載されているそれらの代表的剤形の他に、薬学的に許容される賦形剤および担体は当業者に一般に知られており、したがって本発明に含まれる。こうした賦形剤および担体は、例えば、"Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)に記載されており、これを参照により本明細書に組み込む。
【0086】
トレプロスチニルプロドラッグは、トレプロスチニルプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩の滅菌水性調製物を含むことができる非経口投与に適当な製剤中に製剤化することができ、調製物は、意図されるレシピエントの血液と等張であり得る。これらの調製物は皮下注射の手段によって投与することができるが、投与は静脈内でまたは筋肉内もしくは皮内注射の手段によって達成することもできる。こうした調製物は、好都合には、化合物を水またはグリシンもしくはクエン酸緩衝液と添加混合すること、ならびに結果として得られた溶液を滅菌および血液と等張にすることによって調製することができる。本発明による注射可能な製剤は、プロドラッグ中のトレプロスチニルの重量に基づき０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖを含有することができ、０．１ｍｌ／分／ｋｇの速度で投与することができる。代替として、本発明は、プロドラッグ中のトレプロスチニルの重量に基づき０．６２５ｎｇ／ｋｇ／分から５０ｎｇ／ｋｇ／分の速度で投与することができる。代替として、本発明は、プロドラッグ中のトレプロスチニルの重量に基づき１０ｎｇ／ｋｇ／分から１５ｎｇ／ｋｇ／分の速度で投与することができる。
【0087】
一部の実施形態において、静脈内注入または皮下注入（連続的皮下注入を含める）などの非経口投与のための製剤中のトレプロスチニルプロドラッグの濃度は、０．０００５ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬ、もしくは０．０００７ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬ、もしくは０．００１ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬ、またはこれらの範囲内の任意の値もしくはサブ範囲であってよい。例証的な濃度としては、０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬを挙げることができる。
【0088】
一部の実施形態において、静脈内注入または皮下注入（連続的皮下注入を含める）などの非経口投与のためのトレプロスチニルプロドラッグの製剤は、プロドラッグを緩衝液などのビヒクルと添加混合することによって調製することができる。ある特定の実施形態において、ビヒクルは、リン酸塩含有ビヒクル、すなわち、例えば二塩基性リン酸ナトリウムもしくは二塩基性リン酸カリウムなどの二塩基性リン酸塩、または三塩基性リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムなどの三塩基性リン酸塩であってよい少なくとも１種のリン酸塩であってよい。ある特定の実施形態において、ビヒクルは、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであってよい塩化物塩などのハロゲン塩も含有することができる。塩化ナトリウムなどのハロゲン塩は、ビヒクルの張度を調整するために使用することができる。ある特定の実施形態において、リン酸塩およびハロゲン塩は同じカチオンを有することが好ましくあり得る。例えば、リン酸塩が、三塩基性リン酸ナトリウムなどのリン酸ナトリウムまたは三塩基性リン酸ナトリウムである場合、ハロゲン塩は、塩化ナトリウムなどのナトリウムハロゲン塩であり得る。同様に、リン酸塩が三塩基性リン酸カリウムなどのリン酸カリウムまたは三塩基性リン酸カリウムである場合、ハロゲン塩は、塩化カリウムなどのカリウムハロゲン塩であり得る。ビヒクル中の溶媒は、水を含有することができる。ある特定の実施形態において、水は、ビヒクル中で唯一の溶媒であってよい。なお、ある特定の実施形態において、ビヒクルは、水に加えて１種または複数の追加の溶媒を含有することができる。一部の実施形態において、追加の溶媒は、ｍ－クレゾールなどの保存剤であってよい。
【0089】
好ましくは、ビヒクルは、ヒトなどの患者の血液と等張である。等張という用語は、ビヒクルのモル浸透圧濃度およびイオン濃度が、ヒトなどの患者のものと一致することを意味し得る。ビヒクルの非限定的な例としては、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、ならびに一部の製剤において、塩化カリウムおよびリン酸二水素カリウムを含有する水ベースの塩溶液であるリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。他の例としては、１２５ｍＭの塩化ナトリウムとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含有するビヒクル、ならびに１５ｍＭの三塩基性リン酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．３％ｗ／ｗのｍ－クレゾールを含有するビヒクルを挙げることができる。
【0090】
ある特定の実施形態において、トレプロスチニルプロドラッグは皮下投与することができる。一部の実施形態において、皮下投与は、連続的皮下注入、例えば、好ましくは携帯可能または移植可能である注入ポンプによる連続的皮下注入であってよい。
【0091】
一部の実施形態において、トレプロスチニルプロドラッグは、プロドラッグ中のトレプロスチニルの重量に基づき０．１ｎｇ／ｋｇ／分から１００ｎｇ／ｋｇ／分、もしくは０．２ｎｇ／ｋｇ／分から７０ｎｇ／ｋｇ／分、もしくは０．３ｎｇ／ｋｇ／分から５０ｎｇ／ｋｇ／分、もしくは０．６ｎｇ／ｋｇ／分から１０ｎｇ／ｋｇ／分、またはこれらの範囲内の任意の値もしくはサブ範囲の速度（用量）で皮下投与することができる。一部の実施形態において、注入は、初速度（用量）で開始することができ、これは後に、初速度（用量）に対する患者の応答に基づき増加または減少することができる。例えば、初速度（用量）は１．２５ｎｇ／ｋｇ／分であってよく、これは、患者の耐性に依存して１週当たり１．２５ｎｇ／ｋｇ／分、または１週当たり２．５ｎｇ／ｋｇ／分の増分で増加することができる。患者が、例えば軽度から中程度の肝機能不全および／または頭痛であり得る例えば副作用により初速度（用量）に耐えられないならば、初速度（用量）は、０．６２５ｎｇ／ｋｇ／分に低減することができる。患者が、より低い速度（用量）に対する耐性を発達させた後、速度（用量）が増加され得る。
【0092】
トレプロスチニルプロドラッグは、トレプロスチニルが有用であることが公知である同じ目的のうちの１つまたは複数で使用することができる。例えば、トレプロスチニルプロドラッグは、肺動脈高血圧症および慢性血栓塞栓性肺高血圧症を含めた肺高血圧症など、トレプロスチニルで処置することができる疾患または障害を処置するため、ヒトなどの対象に投与するために使用することができる。肺高血圧症を処置することなどの治療目的で、トレプロスチニルプロドラッグは、肺高血圧症などトレプロスチニルで処置することができる疾患または障害の１つまたは複数の症状を寛解させるのに十分であるトレプロスチニルプロドラッグの量であり得る治療有効量で、ヒトなどの対象に投与することができる。
【0093】
トレプロスチニルプロドラッグは、細胞保護において、細胞増殖を低減すること、血管拡張を促進することおよび／または血小板凝集を阻害することを含めて、治療的に使用することができる。一部の実施形態において、トレプロスチニルプロドラッグは、肺高血圧症、心不全（うっ血性心不全を含める）または末梢血管疾患などの血管疾患の処置において使用することができる。トレプロスチニルプロドラッグは、血管拡張効果を有することができることで、それらは、例えば、ループス、強皮症または混合性結合組織病などの結合組織病の１つまたは複数の形態に起因し得る肺高血圧症を処置するために使用することができる。
【0094】
トレプロスチニルプロドラッグは、がん、凝固障害および炎症性疾患においても使用することができる。がん細胞の転移を阻害するためのトレプロスチニルの使用は、米国特許出願公開第２００３－０１０８５１２号明細書および米国特許第６，８０３，３８６号明細書に開示されており、これら両方を全体で本明細書に組み込む。
【0095】
【0096】
スキーム２は、アセテートアミドプロドラッグＶＩＩの合成を例示している。この合成は、ＮＨ２ＣＨ２ＣＯＯＢｎと反応させるトレプロスチニルで開始することで、以下の式：
【0097】
【化23】
【0098】
保護アセタトアミド化合物は次いで、アセタトアミドプロドラッグＶＩＩに移入させることができる。Ｂｎの場合において、こうした反応は、Ｐｄ／ＣおよびＨ２を使用することを伴うことがある。メチルまたはエチルなどのアルキルの場合において、保護アセタトアミド化合物は、ＮａＯＨまたはＫＯＨなどの塩基と反応させることで、アセタトアミドプロドラッグＶＩＩに移入させることができる。
【0099】
図６は、以下の式：
【0100】
【化24】
の出発化合物の合成を例示している。この化合物は、いくつかのトレプロスチニルプロドラッグを合成するための重要な出発化合物として使用することができる。図６におけるプロセスは、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９４０，９３０号明細書のスキーム２の最初の５つの反応に対応する。図６に開示されているプロセスの他に、出発化合物は、例えば、米国特許第６，７５６，１１７号明細書および同第６，８０９，２２３号明細書に開示されている方法を使用して合成することもできる。出発化合物の合成は、以下の式：
【0101】
【化25】
の化合物で開始することができる。置換ベンジル基は、－－ＮＯ２、－－ＣＮ、ハロゲン（例えば、－－Ｆ、－－Ｃｌ、－－Ｂｒまたは－－Ｉ）、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルコキシおよびハロ（Ｃ１～Ｃ３）アルコキシからなる群から独立して選択することができる１個または複数の置換基で１つまたは複数のメタ位、オルト位またはパラ位にて任意選択により置換されていてよい。この化合物
【0102】
【化26】
【0103】
【化27】
【0104】
【化28】
【0105】
以下の式
【0106】
【化29】
【0107】
シクロペンチル環プロドラッグを合成するため、以下の式
【0108】
【化30】
【0109】
【化31】
の二重保護化合物に変換することができる。例えば、以下の式
【0110】
【化32】
【0111】
【化33】
【0112】
【化34】
【0113】
【化35】
【0114】
【化36】
【0115】
【化37】
の二重保護プロドラッグ化合物に変換することができる。これは、二重保護化合物を
【0116】
【化38】
と反応させることによって達成することができる。例えば、Ｒ２が
【0117】
【化39】
【0118】
【化40】
【0119】
【化41】
【0120】
【化42】
【0121】
Ｐ０およびＰ１保護基の各々は次いでＨと置き換えられることで、カルボキシ基のヒドロキシルおよび側鎖のヒドロキシルを脱保護することができる。図１に例示されているものなど、一部の実施形態において、カルボキシ基のヒドロキシルおよび側鎖のヒドロキシルの脱保護（Ｐ０およびＰ１の各々の置き換え）は、単一の反応において行うことができる。なお、一部の他の実施形態において、カルボキシ基のヒドロキシルおよび側鎖のヒドロキシルの脱保護は、２つの別々の反応において行うことができる。一部の場合において、図３に例示されている通り、側鎖のヒドロキシル基が最初に脱保護され、その後、カルボキシ基のヒドロキシルの脱保護が続くことができる。なお一部の他の場合において、カルボキシ基のヒドロキシル基が最初に脱保護され、その後、側鎖のヒドロキシルの脱保護が続くことができる。側鎖のヒドロキシルの脱保護は、ＭｇＢｒ２などのルイス酸、硫酸銅などの銅の塩、アンバーリストなどの酸性樹脂、ＨＣｌおよびＨ２ＳＯ４などの鉱酸の存在下で行うことができる。ヒドロキシル保護基の脱保護は、"Green’s protecting groups in organic synthesis" ISBN 978-0-471-69754-1, 4th edition, 2007, page 62; John Wiley and Sons)に開示されている。カルボキシ基のヒドロキシルの脱保護は、例えば、パラジウム炭素触媒、酸化白金および水素ガスのうちの１つまたは複数の存在下で行うことができる。
【0122】
側鎖プロドラッグを合成するため、出発化合物
【0123】
【化43】
【0124】
【化44】
の三重保護トリオール化合物に変換することができる。一部の実施形態において、同じであるべきＰ’０およびＰ２を有することが好ましくあり得る。例えば、図２および図４において、鍵となる中間体化合物はＴＢＤＭＳＣｌと反応させることで、Ｐ’０およびＰ２の両方がＴＢＤＭＳである三重保護トリオール化合物を形成する。
【0125】
三重保護トリオール化合物は次いで、共役環のヒドロキシルを脱保護することによって、以下の式
【0126】
【化45】
【0127】
二重保護トリオール化合物は次いで、以下の式
【0128】
【化46】
の三重保護カルボキシ酸化合物に変換することができる。二重保護トリオール化合物は、
【0129】
【化47】
【0130】
三重保護カルボキシ酸化合物は次いで、側鎖のヒドロキシル基を脱保護することによって、以下の式：
【0131】
【化48】
【0132】
二重保護カルボキシ酸化合物は次いで、以下の式：
【0133】
【化49】
【0134】
【化50】
の二重保護プロドラッグ化合物に変換することができる。これは、二重保護カルボキシ酸化合物を
【0135】
【化51】
と反応させることによって達成することができる。例えば、Ｒ３が
【0136】
【化52】
【0137】
【化53】
【0138】
【化54】
【0139】
【化55】
【0140】
二重保護プロドラッグ化合物は、シクロペンチル環のヒドロキシルおよびカルボキシ基のヒドロキシルを脱保護することによって、側鎖プロドラッグ
【0141】
【化56】
【0142】
プロドラッグＪ、Ｋ、ＬまたはＭなどのトレプロスチニルアミノ酸アミドプロドラッグは、アミノ酸である保護アミノ酸とトレプロスチニルを反応させることによって調製することができ、それのカルボキシ基における水素は、ベンジルなどのヒドロキシル保護基と置き換えられる。こうした反応の結果として、保護アミノ酸アミドプロドラッグが形成され得る。ヒドロキシル保護基は次いで、保護アミノ酸アミドプロドラッグから除去されることで、プロドラッグＪ、Ｋ、ＬまたはＭなどのトレプロスチニルアミノ酸アミドプロドラッグを形成することができる。
【0143】
本明細書に記載されている実施形態は、以下の実施例によってさらに例示されているが、これらに決して限定されない。
【実施例】
【0144】
[実施例１]
トレプロスチニルカルバメートプロドラッグの合成
トレプロスチニルカルバメートプロドラッグの合成
【0145】
【化57】
トレプロスチニルモノ－ＴＥＳベンジルエステル（２ａおよび２ｂ）の合成：
【0146】
【化58】
注１：移動相として２０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0147】
側鎖カルバメートトレプロスチニルプロドラッグ（５ａ）の合成のための実験
ＴＥＳ側鎖カルバメートベンジルエステル（３ａ）の合成：
ＴＥＳ側鎖カルバメートベンジルエステル（３ａ）の合成：
【0148】
【化59】
注１：移動相として３０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0149】
側鎖カルバメートベンジルエステル（４ａ）の合成：
【0150】
【化60】
注１：移動相として６０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0151】
側鎖カルバメートトレプロスチニルプロドラッグ（５ａ）の合成：
【0152】
【化61】
注１：移動相として６０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0153】
シクロペンチルカルバメートトレプロスチニルプロドラッグ（５ｂ）の合成のための実験
ＴＥＳシクロペンチルカルバメートベンジルエステル（３ｂ）の合成：
ＴＥＳシクロペンチルカルバメートベンジルエステル（３ｂ）の合成：
【0154】
【化62】
注１：移動相として３０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0155】
シクロペンチルカルバメートベンジルエステル（４ｂ）の合成：
【0156】
【化63】
注１：移動相として６０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0157】
シクロペンチルカルバメートトレプロスチニルプロドラッグ（５ｂ）の合成：
【0158】
【化64】
注１：移動相として６０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用して反応の進行をモニタリングするため、シリカゲルＴＬＣを使用した。
【0159】
[実施例２]
トレプロスチニルグリコールアミドプロドラッグ（プロドラッグＶＩＩ）の合成
トレプロスチニルグリコールアミドプロドラッグ（プロドラッグＶＩＩ）の合成
【0160】
【化65】
グリコールアミドプロドラッグの合成のための２つの方法（スキーム２）を探索した：第１、トレプロスチニル（ＵＴ－１５）およびグリシンメチルエステルの反応を介することで、アミド中間体アミドＩを得て、その後、ＮａＯＨ加水分解が続く；第２、ＵＴ－１５とグリシンベンジルエステルｐ－トルエンスルホネートとの反応を介することで、アミド中間体アミドＩＩを形成し、その後、水素化が続く。第１の経路は、加水分解ステップのための強い塩基性条件を伴い、エステル結合およびアミド結合の両方の加水分解を引き起こし、ＵＴ－１５の形成に至った。第２の経路は、アミドＩＩの脱ベンジル化のための非塩基性水素化分解を伴い、任意のアミド結合切断なくクリーンな所望の生成物を提供し、ＵＴ－１５の形成に至らなかった。最終的に、第２の経路を使用することで、トレプロスチニルのグリコールアミドプロドラッグ（プロドラッグＶＩＩ）を作製した。
【0161】
【化66】
【0162】
スキーム２：グリコールアミドプロドラッグの合成
ステップ１：アミドＩＩの合成
ステップ１：アミドＩＩの合成
【0163】
【化67】
【0164】
ステップ２：グリコールアミドプロドラッグ（プロドラッグＶＩＩ）の合成
【0165】
【化68】
【0166】
[実施例３]
トレプロスチニルのプロドラッグ：トレプロスチニルの側鎖およびシクロペンチルメチルカーボネートの合成
トレプロスチニルのプロドラッグ：トレプロスチニルの側鎖およびシクロペンチルメチルカーボネートの合成
【0167】
【化69】
【0168】
【化70】
【0169】
スキーム３．トレプロスチニルの側鎖メチルカーボネート（６）の合成
【0170】
【化71】
【0171】
スキーム４．トレプロスチニルのシクロペンチルメチルカーボネート（９）の合成
実験：
モノ－ＴＥＳ保護トレプロスチニルベンジルエステル（２および３）の合成
実験：
モノ－ＴＥＳ保護トレプロスチニルベンジルエステル（２および３）の合成
【0172】
【化72】
【0173】
シクロペンチル－ＴＥＳ側鎖メチルカーボネートトレプロスチニルベンジルエステル（４）の合成
【0174】
【化73】
【0175】
側鎖メチルカーボネートトレプロスチニルベンジルエステル（５）の合成
【0176】
【化74】
【0177】
トレプロスチニルの側鎖メチルカーボネート（６）の合成
【0178】
【化75】
【0179】
側鎖－ＴＥＳシクロペンチルメチルカーボネートトレプロスチニルベンジルエステル（７）の合成
【0180】
【化76】
【0181】
シクロペンチルメチルカーボネートトレプロスチニルベンジルエステル（８）の合成
【0182】
【化77】
【0183】
トレプロスチニルのシクロペンチルメチルカーボネート（９）の合成
【0184】
【化78】
【0185】
[実施例４]
トレプロスチニルおよびそれのプロドラッグのインビトロ受容体活性
プロドラッグＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＩＸ（構造については、図７および図３９を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、サイクリンアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
トレプロスチニルおよびそれのプロドラッグのインビトロ受容体活性
プロドラッグＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＩＸ（構造については、図７および図３９を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、サイクリンアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
【0186】
材料。細胞および対照アゴニスト：研究において使用された細胞および対照アゴニストは、表１に要約されている。
【0187】
【表1】
【0188】
化合物は粉末形態で提供された。化合物をＤＭＳＯ中にて１０ｍＭの濃度で再構成した。
【0189】
環状ＡＭＰアッセイキット：ＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔ（ＣｉｓＢｉｏ、Ｃａｔ番号６２ＡＭ６ＰＥＣ）。
【0190】
機器：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【0191】
方法
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：ＣｉｓＢｉｏのＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモードにおけるＧｓ経路アッセイのため、細胞を化合物で３８４ウェルプレート中にて２０分間３７℃でインキュベートした。溶解緩衝液におけるＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで、室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：ＣｉｓＢｉｏのＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモードにおけるＧｓ経路アッセイのため、細胞を化合物で３８４ウェルプレート中にて２０分間３７℃でインキュベートした。溶解緩衝液におけるＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで、室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
【0192】
データ分析
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータは、平均±ＳＤで表されている。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータは、平均±ＳＤで表されている。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
【0193】
結果
全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０（最大半量応答を与える薬物濃度）値は、表２に表示されている。
全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０（最大半量応答を与える薬物濃度）値は、表２に表示されている。
【0194】
【表2】
【0195】
表２におけるデータは、研究されたプロドラッグの各々が、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１に対してトレプロスチニルよりも有意に強力でなかったことを実証している。本発明はそれの操作の理論によって限定されないが、トレプロスチニルの皮下投与中に観察された部位疼痛は、皮下組織におけるＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に影響するトレプロスチニルによるものであり得る。研究されたプロドラッグは、ＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体の各々に対してトレプロスチニルよりも強力でないので、これらのプロドラッグは、皮下投与された場合、部位疼痛をより少なく引き起こし得る。
【0196】
[実施例５]
ヒトＧタンパク質共役型受容体に対するプロドラッグＸＶの評価
プロドラッグＸＶ（構造については、図１０を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
ヒトＧタンパク質共役型受容体に対するプロドラッグＸＶの評価
プロドラッグＸＶ（構造については、図１０を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
【0197】
材料。細胞および対照アゴニスト：研究において使用された細胞および対照アゴニストは、表１に要約されている。
【0198】
提供された化合物は、粉末形態の２種の化合物であった。化合物をＤＭＳＯ中にて１０ｍＭの濃度で再構成した。
【0199】
環状ＡＭＰアッセイキット：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｔ番号ＭＳＣＭ０１－２５）およびＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔ（ＣｉｓＢｉｏ、Ｃａｔ番号６２ＡＭ６ＰＥＣ）。機器：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【0200】
方法
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモード試験のため、細胞をカスタマー化合物で５分間室温でプレインキュベートした後にフォルスコリンを添加し、プレートを次いで３７℃で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液におけるｔｒＦｌｕｏｒ（商標）Ｅｕ標識化ｃＡＭＰおよびｔｒＦｌｕｏｒ（商標）６５０標識化抗ｃＡＭＰ抗体またはＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍまたは６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモード試験のため、細胞をカスタマー化合物で５分間室温でプレインキュベートした後にフォルスコリンを添加し、プレートを次いで３７℃で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液におけるｔｒＦｌｕｏｒ（商標）Ｅｕ標識化ｃＡＭＰおよびｔｒＦｌｕｏｒ（商標）６５０標識化抗ｃＡＭＰ抗体またはＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍまたは６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
【0201】
データ分析：
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６５／６２０×１０，０００」（６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）または「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータを平均±ＳＤとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６５／６２０×１０，０００」（６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）または「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータを平均±ＳＤとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
【0202】
結果および考察
全ての３つのＧＰＣＲに関する対照アゴニストは、予想ＥＣ５０ｂ（最大半量応答を与える薬物濃度）値で受容体発現細胞において用量依存性刺激を示した。全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０値は、表３に表示されている。
全ての３つのＧＰＣＲに関する対照アゴニストは、予想ＥＣ５０ｂ（最大半量応答を与える薬物濃度）値で受容体発現細胞において用量依存性刺激を示した。全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０値は、表３に表示されている。
【0203】
【表3】
【0204】
結論
表３におけるデータは、プロドラッグＸＶが、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１に対してトレプロスチニルよりも有意に強力でなかったことを実証している。本発明はそれの操作の理論によって限定されないが、トレプロスチニルの皮下投与中に観察された部位疼痛は、皮下組織におけるＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に影響するトレプロスチニルによるものであり得る。プロドラッグＸＶは、ＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体の各々に対してトレプロスチニルよりも強力でないので、それは、皮下投与された場合、部位疼痛をより少なく引き起こし得る。
表３におけるデータは、プロドラッグＸＶが、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１に対してトレプロスチニルよりも有意に強力でなかったことを実証している。本発明はそれの操作の理論によって限定されないが、トレプロスチニルの皮下投与中に観察された部位疼痛は、皮下組織におけるＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に影響するトレプロスチニルによるものであり得る。プロドラッグＸＶは、ＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体の各々に対してトレプロスチニルよりも強力でないので、それは、皮下投与された場合、部位疼痛をより少なく引き起こし得る。
【0205】
[実施例６]
ヒトＧタンパク質共役型受容体に対するプロドラッグＸＩＶの評価
トレプロスチニルプロドラッグＸＩＶ（構造については、図１０を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、サイクリンアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
ヒトＧタンパク質共役型受容体に対するプロドラッグＸＩＶの評価
トレプロスチニルプロドラッグＸＩＶ（構造については、図１０を参照されたい）ならびにトレプロスチニルを、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰについて、サイクリンアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）アッセイを使用して試験した。
【0206】
材料。細胞および対照アゴニスト：研究において使用された細胞および対照アゴニストは、表１に要約されている。
【0207】
提供された化合物は、粉末形態の２種の化合物であった。化合物をＤＭＳＯ中にて１０ｍＭの濃度で再構成した。
【0208】
環状ＡＭＰアッセイキット：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｔ番号ＭＳＣＭ０１－２５）およびＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔ（ＣｉｓＢｉｏ、Ｃａｔ番号６２ＡＭ６ＰＥＣ）。機器：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【0209】
方法
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモード試験のため、細胞をカスタマー化合物で５分間室温でプレインキュベートした後にフォルスコリンを添加し、プレートを次いで３７℃で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液におけるｔｒＦｌｕｏｒ（商標）Ｅｕ標識化ｃＡＭＰおよびｔｒＦｌｕｏｒ（商標）６５０標識化抗ｃＡＭＰ抗体またはＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍまたは６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ＴＲ－ＦＲＥＴ ｃＡＭＰ １．０ Ｎｏ Ｗａｓｈ Ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＨＴＲＦ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコールに従って、ｃＡＭＰアッセイを行った。アゴニストモード試験のため、細胞をカスタマー化合物で５分間室温でプレインキュベートした後にフォルスコリンを添加し、プレートを次いで３７℃で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液におけるｔｒＦｌｕｏｒ（商標）Ｅｕ標識化ｃＡＭＰおよびｔｒＦｌｕｏｒ（商標）６５０標識化抗ｃＡＭＰ抗体またはＤ２標識化ｃＡＭＰおよびクリプテート標識化抗ｃＡＭＰ抗体を逐次添加することによって、反応を停止させた。プレートを次いで室温で６０分間インキュベートした後に、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上にて、３１４ｎｍで励起とともに、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍまたは６６８ｎｍで蛍光発光を読み取った。
【0210】
データ分析：
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６５／６２０×１０，０００」（６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）または「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータを平均±ＳＤで表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ：環状ＡＭＰアッセイ結果は、「比６６５／６２０×１０，０００」（６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）または「比６６８／６２０×１０，０００」（６６８ｎｍおよび６２０ｎｍ×１０，０００での蛍光の比）として示される。グラフにおけるデータを平均±ＳＤで表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４、５または６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、可変勾配を可能にするＳ字形の用量応答曲線と、用量依存性応答をフィットさせた。
【0211】
結果および考察
全ての３つのＧＰＣＲに関する対照アゴニストは、予想ＥＣ５０（最大半量応答を与える薬物濃度）値で受容体発現細胞において用量依存性刺激を示した。全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０値は、表４に表示されている。
全ての３つのＧＰＣＲに関する対照アゴニストは、予想ＥＣ５０（最大半量応答を与える薬物濃度）値で受容体発現細胞において用量依存性刺激を示した。全ての化合物および対照アゴニストは、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１受容体発現細胞において用量応答活性を呈した。用量依存性応答から決定されたＥＣ５０値は、表４に表示されている。
【0212】
【表4】
【0213】
結論
表４におけるデータは、プロドラッグＸＩＶが、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１に対してトレプロスチニルよりも有意に強力でなかったことを実証している。本発明はそれの操作の理論によって限定されないが、トレプロスチニルの皮下投与中に観察された部位疼痛は、皮下組織におけるＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に影響するトレプロスチニルによるものであり得る。プロドラッグＸＩＶは、ＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体の各々に対してトレプロスチニルよりも強力でないので、それは、皮下投与された場合、部位疼痛をより少なく引き起こし得る。
表４におけるデータは、プロドラッグＸＩＶが、ＤＰ１、ＥＰ２およびＩＰ１に対してトレプロスチニルよりも有意に強力でなかったことを実証している。本発明はそれの操作の理論によって限定されないが、トレプロスチニルの皮下投与中に観察された部位疼痛は、皮下組織におけるＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体のうちの１つまたは複数に影響するトレプロスチニルによるものであり得る。プロドラッグＸＩＶは、ＩＰ受容体、ＤＰ受容体およびＥＰ受容体の各々に対してトレプロスチニルよりも強力でないので、それは、皮下投与された場合、部位疼痛をより少なく引き起こし得る。
【0214】
[実施例７]
選択されたビヒクルにおけるトレプロスチニルの８つのプロドラッグについてのＨＰＬＣ分析方法の開発ならびに平衡溶解度および溶液安定性の決定
選択されたビヒクルにおけるトレプロスチニルの８つのプロドラッグについてのＨＰＬＣ分析方法の開発ならびに平衡溶解度および溶液安定性の決定
【0215】
１．目的および要約
この研究の目的は、トレプロスチニルの複数のプロドラッグの分析に適当な分析方法を開発すること、および選択されたビヒクル（１２５ｍＭの塩化ナトリウムとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム）における８つのプロドラッグの平衡溶解度および溶液安定性を決定することであった。
この研究の目的は、トレプロスチニルの複数のプロドラッグの分析に適当な分析方法を開発すること、および選択されたビヒクル（１２５ｍＭの塩化ナトリウムとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム）における８つのプロドラッグの平衡溶解度および溶液安定性を決定することであった。
【0216】
プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶを含めて、トレプロスチニルの８つのプロドラッグを、この研究のために使用した。プロドラッグＶＩＩのために前に開発された分析方法を、特異性を改善するための方法パラメータの微修正後に、他のプロドラッグのために利用した。適切な特異性を達成してすぐに、平衡溶解度研究を各プロドラッグについて行った。溶解度研究を複数の時点にわたって評価することで、選択されたビヒクルにおけるプロドラッグの溶液安定性を判定した。
【0217】
２．実験
２．１装置
フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）が備えられているＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム上で、全ての研究を行った。評価された全てのカラムは、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍであった。
２．１装置
フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）が備えられているＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム上で、全ての研究を行った。評価された全てのカラムは、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍであった。
【0218】
２．２方法条件の開発
２．２．１プロドラッグＶＩＩ方法条件の評価
トレプロスチニルプロドラッグＶＩＩのための前に開発された分析方法は、プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶのクロマトグラフィー特異性のための条件を開発するための出発点であった。プロドラッグＶＩＩ方法条件は、表５に提供されている。
２．２．１プロドラッグＶＩＩ方法条件の評価
トレプロスチニルプロドラッグＶＩＩのための前に開発された分析方法は、プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶのクロマトグラフィー特異性のための条件を開発するための出発点であった。プロドラッグＶＩＩ方法条件は、表５に提供されている。
【0219】
【表5】
【0220】
特異性研究の目標は、トレプロスチニルから各プロドラッグを分割する単一のクロマトグラフィー条件を達成することである。各プロドラッグを個々に調製し、次いで、１０％の公称トレプロスチニルで別々にスパイクすることで、特異性を評価した。プロドラッグＶＩＩ分析方法によって分析されたプロドラッグおよびトレプロスチニルのクロマトグラフィーオーバーレイは、図１１に提供されている。
【0221】
プロドラッグＶＩＩ方法を使用する特異性研究の結果は、トレプロスチニルが、共溶出するプロドラッグＸＩＶを除く全てのプロドラッグからよく分離されることを示している。
【0222】
３つの追加のカラムをスクリーニングすることで、プロドラッグＶＩＩ方法条件を使用してプロドラッグの特異性を評価した。Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム上のトレプロスチニルおよび８つのプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイは、図１２に提供されている。ＡＣＥ Ｃ１８－ＡＲカラム上のトレプロスチニルおよび８つのプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイは、図１３に提供されている。Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨフェニルヘキシルカラム上のトレプロスチニルおよび８つのプロドラッグのクロマトグラフィーオーバーレイは、図１４に提供されている。
【0223】
カラムスクリーニングの結果は、プロドラッグＸＩＶを含めた全てのプロドラッグが、ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ２ Ｃ１８－ＡＲカラム上（Ｒｓ＝２．８、結果ＩＤ２９４９）またはＷａｔｅｒｓ ＣＳＨフェニルヘキシルカラム（Ｒｓ＝２．９、結果ＩＤ３０２８）上のいずれかでトレプロスチニルから適切に分割され得ることを示した。分割はカラム間で本質的に同等であったが、ＣＳＨフェニルヘキシルカラムを平衡溶解度および溶液安定性の研究のために選択した。
【0224】
３．平衡溶解度および溶液安定性
３．１．研究デザイン
１２５ｍＭの塩化ナトリウムとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含有するビヒクル中に、各プロドラッグを溶解した。４ｍＬの透明なガラスバイアル中へ１５～３０ｍｇのプロドラッグを秤量し、適切な体積のビヒクル（０．５～１．０ｍＬ）中に溶解させて、公称飽和濃度の３０ｍｇ／ｍＬを達成することによって、プロドラッグを飽和濃度で調製した。溶液を２３時間、回転ミキサー上で混合した。プロドラッグＸＩＶを除く全ての溶液は、混合した後に固体を呈した。結果として生じた上澄み溶液を、１５０００ＲＰＭで１５分間の遠心分離によって未溶解プロドラッグから単離した。上澄みを透明なガラスバイアルに移し、周囲温度で貯蔵した。溶解度および溶液安定性を評価するため、１５μＬの上澄みをマイクロバイアルに移すこと、ならびに２１０ｕＬの希釈液（２５：７５のアセトニトリル：２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．２）および１００μＬのアセトニトリルを添加することによって、上澄みを２１．７倍に希釈した。結果として生じた試料をトレプロスチニルについてアッセイすることで、プロドラッグ濃度を決定した。各試験間隔（０時間、２４時間、７２時間）で、上澄みをプロドラッグ濃度および面積％による純度についてアッセイした。
３．１．研究デザイン
１２５ｍＭの塩化ナトリウムとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含有するビヒクル中に、各プロドラッグを溶解した。４ｍＬの透明なガラスバイアル中へ１５～３０ｍｇのプロドラッグを秤量し、適切な体積のビヒクル（０．５～１．０ｍＬ）中に溶解させて、公称飽和濃度の３０ｍｇ／ｍＬを達成することによって、プロドラッグを飽和濃度で調製した。溶液を２３時間、回転ミキサー上で混合した。プロドラッグＸＩＶを除く全ての溶液は、混合した後に固体を呈した。結果として生じた上澄み溶液を、１５０００ＲＰＭで１５分間の遠心分離によって未溶解プロドラッグから単離した。上澄みを透明なガラスバイアルに移し、周囲温度で貯蔵した。溶解度および溶液安定性を評価するため、１５μＬの上澄みをマイクロバイアルに移すこと、ならびに２１０ｕＬの希釈液（２５：７５のアセトニトリル：２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．２）および１００μＬのアセトニトリルを添加することによって、上澄みを２１．７倍に希釈した。結果として生じた試料をトレプロスチニルについてアッセイすることで、プロドラッグ濃度を決定した。各試験間隔（０時間、２４時間、７２時間）で、上澄みをプロドラッグ濃度および面積％による純度についてアッセイした。
【0225】
３．２．研究結果
３つの安定性試験間隔にわたる平衡溶解度研究の結果は、表６に要約されている。プロドラッグについての溶液安定性の結果は、表７および表８に要約されている。
３つの安定性試験間隔にわたる平衡溶解度研究の結果は、表６に要約されている。プロドラッグについての溶液安定性の結果は、表７および表８に要約されている。
【0226】
【表6】
【0227】
【表7】
【0228】
【表8】
【0229】
３．３．考察
トレプロスチニルの８つのプロドラッグについての平衡溶解度研究は、選択されたビヒクルにおける化合物にわたる広範囲の溶解度を示している。プロドラッグＸＩＩＩは最少の溶解性（およそ３．５ｍｇ／ｍＬ）であり、プロドラッグＮは最大の溶解性（およそ３０ｍｇ／ｍＬ）であった。プロドラッグは、プロドラッグ純度および残留トレプロスチニルの両方の変化がほとんどないから全くなく、ビヒクルにおいて最大７２時間まで安定であると実証された。プロドラッグＸＩＶは、評価された全てのプロドラッグにわたってビヒクルにおける最も大きいトレプロスチニル形成を示したが、しかしながら、このプロドラッグについては７２時間かけて、０．１５％のみ形成された。
トレプロスチニルの８つのプロドラッグについての平衡溶解度研究は、選択されたビヒクルにおける化合物にわたる広範囲の溶解度を示している。プロドラッグＸＩＩＩは最少の溶解性（およそ３．５ｍｇ／ｍＬ）であり、プロドラッグＮは最大の溶解性（およそ３０ｍｇ／ｍＬ）であった。プロドラッグは、プロドラッグ純度および残留トレプロスチニルの両方の変化がほとんどないから全くなく、ビヒクルにおいて最大７２時間まで安定であると実証された。プロドラッグＸＩＶは、評価された全てのプロドラッグにわたってビヒクルにおける最も大きいトレプロスチニル形成を示したが、しかしながら、このプロドラッグについては７２時間かけて、０．１５％のみ形成された。
【0230】
４．結論
ＵＰＬＣ－ＵＶによるトレプロスチニルの８つのプロドラッグの評価にため、分析方法を開発した。プロドラッグＶＩＩ方法条件を方法最適化微修正のための出発点として使用することで、カラム化学を変化させた（ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ２ Ｃ１８の代わりにＷａｔｅｒｓ ＣＳＨフェニルヘキシル）。トレプロスチニルから適切に各プロドラッグを分割するために、変化を必要とした。平衡溶解度研究は、８種の化合物にわたって、選択されたビヒクルにおけるプロドラッグについて広範囲の溶解度を示した。８つのプロドラッグのうち６つは、６～１３ｍｇ／ｍＬの間のビヒクルにおける溶解度を有していた一方で、１つの低溶解度プロドラッグが観察され（プロドラッグＭ、およそ３．５ｍｇ／ｍＬ）、１つの高溶解度プロドラッグが観察された（プロドラッグＮ、およそ３０ｍｇ／ｍＬ）。示された全てのプロドラッグは、トレプロスチニルの最小形成および面積％純度の軽微な変化に基づき、ビヒクルにおいて最大７２時間まで安定であった。
ＵＰＬＣ－ＵＶによるトレプロスチニルの８つのプロドラッグの評価にため、分析方法を開発した。プロドラッグＶＩＩ方法条件を方法最適化微修正のための出発点として使用することで、カラム化学を変化させた（ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ２ Ｃ１８の代わりにＷａｔｅｒｓ ＣＳＨフェニルヘキシル）。トレプロスチニルから適切に各プロドラッグを分割するために、変化を必要とした。平衡溶解度研究は、８種の化合物にわたって、選択されたビヒクルにおけるプロドラッグについて広範囲の溶解度を示した。８つのプロドラッグのうち６つは、６～１３ｍｇ／ｍＬの間のビヒクルにおける溶解度を有していた一方で、１つの低溶解度プロドラッグが観察され（プロドラッグＭ、およそ３．５ｍｇ／ｍＬ）、１つの高溶解度プロドラッグが観察された（プロドラッグＮ、およそ３０ｍｇ／ｍＬ）。示された全てのプロドラッグは、トレプロスチニルの最小形成および面積％純度の軽微な変化に基づき、ビヒクルにおいて最大７２時間まで安定であった。
【0231】
[実施例８]
目的および要約
この研究の目的は、ヒト、ビーグル犬およびスプラーグドーリーラットの肝臓ミクロソームにおける９つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ）ならびにカニクイザル肝臓ミクロソームにおける４つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＸＩＶ）のインビトロ代謝安定性を決定することであった。別の目標は、時間経過にわたる親化合物（トレプロスチニル）の放出を研究することであった。
目的および要約
この研究の目的は、ヒト、ビーグル犬およびスプラーグドーリーラットの肝臓ミクロソームにおける９つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ）ならびにカニクイザル肝臓ミクロソームにおける４つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＸＩＶ）のインビトロ代謝安定性を決定することであった。別の目標は、時間経過にわたる親化合物（トレプロスチニル）の放出を研究することであった。
【0232】
試験品を肝臓ミクロソームでＮＡＤＰＨの存在下および非存在下でインキュベートした。選択された時点で、インキュベーション反応物のアリコートを除去し、クエンチし、液体クロマトグラフィータンデム質量分光分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分析した。プロドラッグ濃度およびトレプロスチニル濃度の両方を決定し、プロドラッグの半減期を算出した。
【0233】
プロドラッグの半減期は図１５に作表されている。試験持続期間（１２０分）の３倍よりも長い半減期は、「＞３６０」として報告されている。
【0234】
材料
ＳｉｇｍａＦＡＳＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｓ８８３０）；ＨＰＬＣ水（Ｆｉｓｈｅｒ）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード、（Ｆｉｓｈｅｒ）；ギ酸、Ｏｐｔｉｍａ ＬＣＭＳグレード、（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ：Ａ１１７）；ジメチルスルホキシド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ Ｄ１５９－４）；ヒト肝臓ミクロソーム、性別混合、５０のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｈ０６１０）；イヌ肝臓ミクロソーム、ビーグル、雄、８のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｄ１０００）；ラット肝臓ミクロソーム、スプラーグドーリー、雄、５００のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｒ１０００）；サル肝臓ミクロソーム、カニクイザル、雄、１２のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｐ２０００；ロット番号１１１００９０）；マトリックス管、１．４ｍｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ５０８２３８２５）；マトリックス管ラック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ５０８２３９２１）；マトリックス管のためのセプラシールキャップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ＮＣ９９９５４１３）
ＳｉｇｍａＦＡＳＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｓ８８３０）；ＨＰＬＣ水（Ｆｉｓｈｅｒ）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード、（Ｆｉｓｈｅｒ）；ギ酸、Ｏｐｔｉｍａ ＬＣＭＳグレード、（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ：Ａ１１７）；ジメチルスルホキシド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ Ｄ１５９－４）；ヒト肝臓ミクロソーム、性別混合、５０のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｈ０６１０）；イヌ肝臓ミクロソーム、ビーグル、雄、８のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｄ１０００）；ラット肝臓ミクロソーム、スプラーグドーリー、雄、５００のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｒ１０００）；サル肝臓ミクロソーム、カニクイザル、雄、１２のプール（ＸｅｎｏＴｅｃｈ Ｐ／Ｎ：Ｐ２０００；ロット番号１１１００９０）；マトリックス管、１．４ｍｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ５０８２３８２５）；マトリックス管ラック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ５０８２３９２１）；マトリックス管のためのセプラシールキャップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ ＮＣ９９９５４１３）
【0235】
装置
ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ４０００（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム；Ａｇｉｌｅｎｔ １１００二成分ＨＰＬＣポンプ、モデルＧ１３１２Ａ；冷スタックが備えられているＬｅａｐ ＨＴＳ ＰＡＬオートサンプラー；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニルヘキシル ２．７μｍカラム、１００ｍｍ×３ｍｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３３４５－Ｕ）；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニル－ヘキシル ２．７μｍガードカートリッジ、５ｍｍ×３ｍｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３５２６－Ｕ）；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ガードカートリッジホルダー、（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３５００－Ｕ）；Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ１８ Ｄａｓｈ ＨＴＳカラム、５μｍ、２０×２．１ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐ／Ｎ：７７５０５－０２２１５０）；Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ２５Ｒ遠心分離機（Ｐ／Ｎ ３６９３４）；Ｒａｉｎｉｎピペット：０．２～２μＬ、２～２０μＬ、１０～１００μＬ、２０～２００μＬ、および１００～１０００μＬ；リピータ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；Ｒａｉｎｉｎマルチチャネルピペット：１～２０μＬ、２０～２００μＬ、および１００～１０００μＬ
ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ４０００（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム；Ａｇｉｌｅｎｔ １１００二成分ＨＰＬＣポンプ、モデルＧ１３１２Ａ；冷スタックが備えられているＬｅａｐ ＨＴＳ ＰＡＬオートサンプラー；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニルヘキシル ２．７μｍカラム、１００ｍｍ×３ｍｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３３４５－Ｕ）；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニル－ヘキシル ２．７μｍガードカートリッジ、５ｍｍ×３ｍｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３５２６－Ｕ）；Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ガードカートリッジホルダー、（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ：５３５００－Ｕ）；Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ１８ Ｄａｓｈ ＨＴＳカラム、５μｍ、２０×２．１ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐ／Ｎ：７７５０５－０２２１５０）；Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ２５Ｒ遠心分離機（Ｐ／Ｎ ３６９３４）；Ｒａｉｎｉｎピペット：０．２～２μＬ、２～２０μＬ、１０～１００μＬ、２０～２００μＬ、および１００～１０００μＬ；リピータ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；Ｒａｉｎｉｎマルチチャネルピペット：１～２０μＬ、２０～２００μＬ、および１００～１０００μＬ
【0236】
インキュベーション
プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶの投薬用溶液を２０ｍＭの二塩基性リン酸カリウム中で作製した。プロドラッグの濃度は５ｍＭであった。
プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶの投薬用溶液を２０ｍＭの二塩基性リン酸カリウム中で作製した。プロドラッグの濃度は５ｍＭであった。
【0237】
肝臓ミクロソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ）を以下の構成物を有する緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質（酵素）濃度に希釈した：１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、５ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および１ｍＭのβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’－ホスフェート（ＮＡＤＰＨ）。ミクロソーム溶液をガラス管にアリコートし、３７℃で約３分間インキュベートした。各化合物のアリコートを、予備加温されたミクロソーム溶液に５０倍で希釈し、混合することで、反応を開始した。インキュベーション溶液中のプロドラッグの最終濃度は１００μＭであった。
【0238】
第１のアッセイにおいて、全ての９つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ）を、ヒト、ビーグル犬およびスプラーグドーリーラットの肝臓ミクロソームにおいて試験した。第２のアッセイにおいて、４つのプロドラッグ（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＸＩＶ）を、カニクイザル肝臓ミクロソームにおいて試験した。
【0239】
試験化合物に加えて、３つの品質対照化合物（７－エトキシクマリン、プロプラノロールおよびベラパミル）を含むことで、ミクロソームが活性であることを確実にした。品質対照化合物ストック溶液を２５％のメタノール中にて２５μＭで作製したが、最終インキュベーション溶液中の濃度は５００ｎＭであった。
【0240】
陰性対照も含まれており；これらの反応物は、ＮＡＤＰＨを除く上記にリストされている構成成分の全てを含有していた。
【0241】
全ての試験をデュプリケートで行った。全てのレプリケートを別々の反応バイアルにおいて試験した。
【0242】
０分、１５分、３０分、６０分および１２０分の時点は、上に記載されている＋ＮＡＤＰＨ条件で評価したが、０分および１２０分の時点は、－ＮＡＤＰＨ条件で評価した。特定されている時点で、各反応物の１００μＬアリコートを反応物から除去し、深い９６ウェルプレートにおける２００μＬの氷冷アセトニトリルに添加した。このステップは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のための調製において、反応物をクエンチすることおよびタンパク質を沈殿させることの両方を行った。時間経過が完了した時、プレートを密閉し、混合し、４５００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した。結果として得られた上澄み２００μｌを、分析までマトリックス管中にて－８０℃で凍結した。
【0243】
生化学分析用調製手順
試験品
溶液調製。プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ、ならびにトレプロスチニルの一次ストック溶液を９０％のＤＭＳＯ中で作製した。９つのプロドラッグストック溶液を合わせ、９－イン－１標準スパイクイン溶液および９－イン－１ ＱＣスパイクイン溶液に系列希釈した。他方で、トレプロスチニルストック溶液をトレプロスチニル標準スパイクイン溶液およびＱＣスパイクイン溶液に系列希釈した。調製後、全ての溶液を４℃で貯蔵した。化合物がクロストークしないことを確実にするために、希釈ＱＣ（ＱＣ－ｄｉｌｕ）を個々の化合物について試験した。プロドラッグおよびトレプロスチニルの個々の一次ストック溶液をＱＣ－ｄｉｌｕのためのスパイクイン溶液として使用した。
試験品
溶液調製。プロドラッグＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ、ならびにトレプロスチニルの一次ストック溶液を９０％のＤＭＳＯ中で作製した。９つのプロドラッグストック溶液を合わせ、９－イン－１標準スパイクイン溶液および９－イン－１ ＱＣスパイクイン溶液に系列希釈した。他方で、トレプロスチニルストック溶液をトレプロスチニル標準スパイクイン溶液およびＱＣスパイクイン溶液に系列希釈した。調製後、全ての溶液を４℃で貯蔵した。化合物がクロストークしないことを確実にするために、希釈ＱＣ（ＱＣ－ｄｉｌｕ）を個々の化合物について試験した。プロドラッグおよびトレプロスチニルの個々の一次ストック溶液をＱＣ－ｄｉｌｕのためのスパイクイン溶液として使用した。
【0244】
ブランクマトリックス。肝臓ミクロソーム溶液（１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌの酵素、１ｍＭのＮＡＤＰＨ）を調製すること、続いて、沸騰水浴における５分間の熱不活性化によって、ブランクマトリックスを調製した。不明な試料を異なる種について別々に分析した。ブランクマトリックスの調製において使用された肝臓ミクロソームの種は、不明な試料と同じであり、例えば、ヒト試料のみの分析のためのブランクマトリックスを調製するために、ヒト肝臓ミクロソームを使用した。
【0245】
ブランク抽出物。２体積のアセトニトリルおよび１体積のブランクマトリックスを合わせることによって、ブランク抽出物を調製した。混合物を次いで４０００ｇで遠心分離し、上澄みを採取した。
【0246】
標準的、ＱＣおよび未希釈の不明な試料。タンパク質沈殿手順を使用して、試料を抽出した。５μｌの標準的またはＱＣ（ＱＣ－ｄｉｌｕを含める）スパイクイン溶液を、深ウェルプレートにおいて９５μｌのブランクマトリックスにスパイクし、続いて、２００μｌのアセトニトリルを添加した。未希釈の不明な試料（室温で解凍され、よく混合された）を深ウェルプレートに添加し、続いて、２００μｌのアセトニトリルを添加した。標準的／ＱＣおよび未希釈の試料プレートを次いで密閉し、混合し、５５００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した。１００μｌの上澄み（ＱＣ－ｄｉｌｕを除外する）を１００μｌの内部標準作業溶液（ＩＳＷＳ、水中２０ｎｇ／ｍｌのｄ４－トレプロスチニル）と、最終マイクロタイタープレート上で合わせた。
【0247】
希釈ＱＣ追加ステップ。タンパク質沈殿および遠心分離後、１０μｌの上澄みを、９０μｌのブランク抽出物（１０×希釈）が負荷された中間列に添加し、ピペットで混合し、次いで１０μｌの希釈試料を、９０μｌのブランク抽出物（別の１０×希釈）が負荷された最終マイクロタイタープレート上の列に添加した。１００μｌのＩＳＷＳを添加した。
【0248】
希釈された不明な試料。１０μｌの不明な試料を、９０μｌのブランク抽出物（１０×希釈）が負荷された中間プレートに添加し、ピペットで混合し、次いで、１０μｌの希釈試料を、９０μｌのブランク抽出物（別の１０×希釈）が負荷された最終マイクロタイタープレートに添加した。１００μｌのＩＳＷＳを添加した。
【0249】
ダブルブランク。１００μｌのブランク抽出物を１００μｌの水と合わせた。
【0250】
全てのプレートを密閉し、混合し、５５００ｇおよび４℃で５分間遠心分離し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの準備をした。
【0251】
品質対照化合物
不明な試料。全ての品質対照化合物試料を室温で解凍し、よく混合した。６０μｌの試料を、１２０μｌの水および４０μｌのＩＳＷＳ（メタノール中５０ｎｇ／ｍｌのラベタロール）が負荷されたマイクロタイタープレートに添加した。
不明な試料。全ての品質対照化合物試料を室温で解凍し、よく混合した。６０μｌの試料を、１２０μｌの水および４０μｌのＩＳＷＳ（メタノール中５０ｎｇ／ｍｌのラベタロール）が負荷されたマイクロタイタープレートに添加した。
【0252】
ダブルブランク。６０μｌのブランク抽出物（試験品実行からのブランク抽出物を使用した）を、１２０μｌの水および４０μｌのメタノールと合わせた。別々のダブルブランクを各種について作製した。
【0253】
プレートを密閉し、混合し、５０００ｇおよび１０℃で１０分間遠心分離し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの準備をした。
【0254】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムは、Ｌｅａｐ ＨＴＳ ＰＡＬオートサンプラー、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ液体クロマトグラフィーポンプ、および三連四重極モードで操作されるＳｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００質量分析計からなっていた。Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニルヘキシルｌカラム（２．７μｍ、１００ｍｍ×３ｍｍ）またはＡｑｕａｓｉｌ Ｃ１８ Ｄａｓｈ ＨＴＳカラム（５μｍ、２０×２．１ｍｍ）を、４０℃で、移動相Ａとして０．１％のギ酸および移動相Ｂとして無希釈アセトニトリルとともに使用した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムは、Ｌｅａｐ ＨＴＳ ＰＡＬオートサンプラー、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ液体クロマトグラフィーポンプ、および三連四重極モードで操作されるＳｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００質量分析計からなっていた。Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）フェニルヘキシルｌカラム（２．７μｍ、１００ｍｍ×３ｍｍ）またはＡｑｕａｓｉｌ Ｃ１８ Ｄａｓｈ ＨＴＳカラム（５μｍ、２０×２．１ｍｍ）を、４０℃で、移動相Ａとして０．１％のギ酸および移動相Ｂとして無希釈アセトニトリルとともに使用した。
【0255】
質量分析計（ＭＳ）を負または正のＴｕｒｂｏ ＩｏｎＳｐｒａｙ（商標）モードにて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）で操作した。ＭＳパラメータも付属書２に示されている。
【0256】
定量化
試験品
不明な試料中のプロドラッグおよびトレプロスチニルを定量化するため、全ての不明な試料を、別々のバッチにおいて９－イン－１プロドラッグおよびトレプロスチニルの較正曲線を用いて実行した。
試験品
不明な試料中のプロドラッグおよびトレプロスチニルを定量化するため、全ての不明な試料を、別々のバッチにおいて９－イン－１プロドラッグおよびトレプロスチニルの較正曲線を用いて実行した。
【0257】
自動積分アルゴリズムを使用することで、クロマトグラフィーピークを積分した。積分が実行内の全ての標準、品質対照および試料について一貫していることを確実にするのに必要とされる場合のみ、積分を調整した。
【0258】
ピーク面積比を算出した（内部標準ピーク面積によって割られた分析物ピーク面積）。公称濃度と対比したピーク面積比の最小二乗フィッティングプロットを発生させることによって、標準曲線を創出した。最小二乗フィットの結果から、試料濃度を算出した。算出された試料濃度がＬＬＯＱ（定量化の下限）よりも低い場合、「ＢＱＬ」（定量限界未満）が報告されている。
【0259】
許容基準：逆算精度は、全ての標準の少なくとも７５％について、公称濃度の±２０％内であるべきである。全ての品質対照試料の少なくとも３分の２の精度は、公称濃度の±２０％内であるべきであり、各レベルで少なくとも５０％は上記基準を満たさなければならない。最終曲線の相関係数は、≧０．９９でなければならない。
【0260】
１／（ｘ２）加重された二次回帰または線形回帰を使用した。逆算精度について許容基準を満たさない較正標準を除去した。
【0261】
代表的な試料の濃度を概算するため、試験注射を作製し、これを使用することで、希釈または未希釈試料がホルマールバッチに含まれるかどうかを決定した。未希釈試料または希釈試料のいずれかの算出濃度は、試験範囲内でなければならず；そうでなければ、ＬＬＯＱ（定量化の下限）よりも低い濃度を有する試料をＢＱＬ（定量限界未満）として報告し、一方、ＵＬＯＱ（定量化の上限）よりも高い濃度を有する試料を、より高い希釈係数で再試験した。
【0262】
品質対照化合物
時間ゼロでのピーク面積比を１００％に設定し、残りの時点で残っているパーセントを算出した。時間と対比した、残っているパーセントのプロットを最終的に使用することで、各化合物についてｔ１／２値を算出した。
時間ゼロでのピーク面積比を１００％に設定し、残りの時点で残っているパーセントを算出した。時間と対比した、残っているパーセントのプロットを最終的に使用することで、各化合物についてｔ１／２値を算出した。
【0263】
動態分析
速度定数（ｋ）：ｋ＝－β
ここでβは、時間と対比して濃度の半対数プロットをフィットさせることから得られる勾配である。品質対照化合物について、濃度が利用可能でない場合、％の残りが代わりに使用される。
半減期（ｔ１／２）：
速度定数（ｋ）：ｋ＝－β
ここでβは、時間と対比して濃度の半対数プロットをフィットさせることから得られる勾配である。品質対照化合物について、濃度が利用可能でない場合、％の残りが代わりに使用される。
半減期（ｔ１／２）：
【0264】
【数1】
【0265】
結果
試験品
プロドラッグの半減期は、表９に作表されている。
試験品
プロドラッグの半減期は、表９に作表されている。
【0266】
品質対照化合物
品質対照化合物の半減期は、表９に作表されている。
品質対照化合物の半減期は、表９に作表されている。
【0267】
【表9】
【0268】
品質対照化合物は、履歴データに匹敵するｔ１／２値を有しており、これらの試験において使用されたミクロソームが活性であることを示した。
【0269】
考察
より早期の水溶液安定性研究によると、全てのプロドラッグは、飽和濃度（３～３０ｍｇ／ｍｌ）で、１２５ｍＭのＮａＣｌとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムにおいて安定である。その上、方法開発作業において、最も不安定なプロドラッグＩＩＩ、ＩＶおよびＸＩＶは、１μＭの低い濃度で、２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）において安定であることも観察された。これらは、この研究におけるプロドラッグの代謝が化学的不安定性または水溶液不安定性によるものでないことを示唆している。
より早期の水溶液安定性研究によると、全てのプロドラッグは、飽和濃度（３～３０ｍｇ／ｍｌ）で、１２５ｍＭのＮａＣｌとともに２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムにおいて安定である。その上、方法開発作業において、最も不安定なプロドラッグＩＩＩ、ＩＶおよびＸＩＶは、１μＭの低い濃度で、２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）において安定であることも観察された。これらは、この研究におけるプロドラッグの代謝が化学的不安定性または水溶液不安定性によるものでないことを示唆している。
【0270】
一部の場合において、半減期は、ＮＡＤＰＨの有無にかかわらず同様であることが観察された。これは、エステラーゼおよびアミダーゼなど一部のＮＡＤＰＨ非依存性酵素が、プロドラッグの代謝に主に関与し得ることを示している。他の場合において、ＮＡＤＰＨを用いる半減期が、ＮＡＤＰＨを用いない半減期よりもずっと短かった場合、反応は、シトクロムＰ４５０酵素によって媒介（または一部媒介）された可能性が高い。
【0271】
結論
プロドラッグの安定性は種依存性であり、ＩＶ、ＩＩＩおよびＸＩＶは全ての種にわたって最も安定でない。
プロドラッグの安定性は種依存性であり、ＩＶ、ＩＩＩおよびＸＩＶは全ての種にわたって最も安定でない。
【0272】
[実施例９]
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
【0273】
１．要約：
合成プロスタサイクリン類似体のトレプロスチニルは、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎの医薬活性成分である。トレプロスチニルの皮下投与は、注射の部位での疼痛を伴い、この研究の目的は、トレプロスチニルの代替プロドラッグを評価することで、ラット足疼痛モデルにおける疼痛応答を判定することであった。
合成プロスタサイクリン類似体のトレプロスチニルは、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎの医薬活性成分である。トレプロスチニルの皮下投与は、注射の部位での疼痛を伴い、この研究の目的は、トレプロスチニルの代替プロドラッグを評価することで、ラット足疼痛モデルにおける疼痛応答を判定することであった。
【0274】
雄スプラーグドーリーラット（ｎ＝１１２）を８匹／群の１４群に割り当てた。研究を２回のサイクルにおいて連日１サイクル当たり７群で実行した。各サイクルを、対照として働く生理食塩水群、ＰＢＳ群、およびその上トレプロスチニルで、１００μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの用量にて構成した。加えて、全てＰＢＳ中で製剤化された試験項目トレプロスチニル環カルバメート（プロドラッグＩ）、トレプロスチニル側鎖カルバメート（プロドラッグＩＩ）、トレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）およびトレプロスチニルメチルエーテル（プロドラッグＶＩＩＩ）を、２つの用量（１００μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ、１サイクル当たり１つの用量）で試験した。
【0275】
動物に０．１ｍＬの試験材料を肉球（足底内注射）への皮下注射によって時間ゼロで投与した。動物を引き続いて、機械的（ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント）および熱的刺激に対するそれらの応答について、注射の１５分後および９０分後に評価した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を、各動物について数分以内に直ちに続く熱的試験の前に行った。加えて、注射に対する動物の反応の臨床観察のスコア化を行った。図１６は、研究デザインをスキーム的に例示している。
【0276】
１．１ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用する機械的疼痛感受性の測定（図１７および図１８）：
動物の引っ込め力閾値を測定するｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用して、機械的疼痛感受性を試験した。加えられた力が低いほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
動物の引っ込め力閾値を測定するｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用して、機械的疼痛感受性を試験した。加えられた力が低いほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
【0277】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルで処置された動物は、注射後１５分および９０分で、低減された引っ込め力閾値（より高い感受性）を有していた。この増加された感受性は、ＰＢＳ処置群よりも統計的に有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【0278】
両用量にてトレプロスチニル側鎖カルバメート（プロドラッグＩＩ）またはトレプロスチニルメチルエーテル（プロドラッグＶＩＩＩ）で処置された動物は、注射後の両時点でＰＢＳ処置群と比較した場合、統計的に有意な差異を示さなかった。
【0279】
１μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニル環カルバメート（プロドラッグＩ）で処置された動物は、注射後の両時点でＰＢＳ処置群と比較した場合、統計的に有意な差異を示さなかった。１００μｇ／ｍＬのトレプロスチニル環カルバメート（プロドラッグＩ）で処置された動物は、注射後１５分でＰＢＳ処置群と比較した場合、統計的に有意な差異を示さなかったが；しかしながら、注射後９０分でＰＢＳ処置群と比較した場合、感受性の統計的に有意な増加が観察された。
【0280】
１μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）で処置された動物は、注射後の両時点でＰＢＳ群と比較した場合、統計的に有意な差異を示さなかった。１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）で処置された動物は、注射後の両時点でＰＢＳ処置群と比較した場合、感受性の統計的に有意な増加を有していた。
【0281】
１．２熱痛感受性の測定（図１９および図２０）：
熱痛刺激に対する動物の感受性を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に続いて直ちに判定した。熱源からの右注射脚の引っ込めまでの時間を測定し、応答の時間が低い（速い）ほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
熱痛刺激に対する動物の感受性を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に続いて直ちに判定した。熱源からの右注射脚の引っ込めまでの時間を測定し、応答の時間が低い（速い）ほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
【0282】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルで処置された動物は、投与後１５分でＰＢＳ処置群と比較した場合、統計的に有意により速い足引っ込め時間（増加された感受性）を有していた（ｐ＜０．０５）。
【0283】
両用量にて全てのプロドラッグで処置された動物は、ＰＢＳ群と比較した場合、熱的刺激に対する応答において統計的に有意な差異を示さなかった。しかしながら、１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグトレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）で、または両用量にてプロドラッグトレプロスチニルメチルエーテル（プロドラッグＶＩＩＩ）で処置された動物は、両時点でＰＢＳ群と比較して、応答の時間の低減に向かう傾向を示したが、統計的有意性はなかった。
【0284】
【0285】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルを用いる処置は、ＰＢＳ処置群と比較した場合、注射後１５分および９０分での臨床スコアの統計的に有意な増加という結果になった（ｐ＜０．０５）。
【0286】
１μｇ／ｍＬの用量にて全てのプロドラッグを用いる処置は、両時点で、ＰＢＳ群と同様の、臨床スコアを示さなかった。１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグのトレプロスチニル側鎖カルバメート（プロドラッグＩＩ）またはトレプロスチニルメチルエーテル（プロドラッグＶＩＩＩ）で処置された動物は、両時点でＰＢＳ群と統計的に有意に異なってはいなかった。１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグトレプロスチニル環カルバメート（プロドラッグＩ）で処置された動物は、注射後９０分でＰＢＳ群と比較した場合、臨床スコアの統計的に有意な増加を示した。１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグトレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）で処置された動物は、注射後の両時点でＰＢＳ群と比較した場合、臨床スコアの統計的に有意な増加を示した。
【0287】
２．結論：
この研究の条件下で得られるとともに生存中データに限られる所見を考慮すると、トレプロスチニルの代替プロドラッグの投与は、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、疼痛応答の低減を示したが、一部の差異は、個々のプロドラッグおよび異なる試験の間で認められなかった。
この研究の条件下で得られるとともに生存中データに限られる所見を考慮すると、トレプロスチニルの代替プロドラッグの投与は、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、疼痛応答の低減を示したが、一部の差異は、個々のプロドラッグおよび異なる試験の間で認められなかった。
【0288】
例えば、トレプロスチニル側鎖カルバメート（プロドラッグＩＩ）またはトレプロスチニルメチルエーテル（プロドラッグＶＩＩＩ）は、両用量にておよび両時点で、一般に、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、機械的刺激に対する動物の感受性の統計的に有意な低減および臨床スコアの低減と関連した。
【0289】
他方、プロドラッグのトレプロスチニル環カルバメート（プロドラッグＩ）およびトレプロスチニルアミド（プロドラッグＶＩＩ）は一般に、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、注射後の両時点で１μｇ／ｍＬの用量についてのみ、機械的刺激に対する動物の感受性の低減および臨床スコアの低減と関連した。
【0290】
加えて、全てのプロドラッグは、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、両用量にておよび注射後の両時点で、熱的刺激に対する感受性の低減を示した。
【0291】
[実施例１０]
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
１．要約：
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
１．要約：
【0292】
合成プロスタサイクリン類似体のトレプロスチニルは、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎの医薬活性成分である。トレプロスチニルの皮下投与は、注射の部位での疼痛を伴い、この研究の目的は、トレプロスチニルの代替プロドラッグを評価することで、ラット足疼痛モデルにおける疼痛応答を判定することであった。
【0293】
雄スプラーグドーリーラット（ｎ＝５６）を、１群当たり８匹の動物の７群に割り当てた。動物を、１００μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルで、または両用量にて試験項目プロドラッグＶＩＩおよびプロドラッグＸＶで処置した。各群を、対照として働いたリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４で５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いる５０ｍＭのリン酸緩衝液）処置群と比較した（群１）。
【0294】
動物に０．１ｍＬの試験材料を肉球（足底内注射）への皮下注射によって時間ゼロで投与した。次いで、動物を引き続いて、機械的（ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント）および熱的刺激に対するそれらの応答について、注射の１５分後および９０分後に評価した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を、各動物について数分以内に直ちに続く熱的試験の前に行った。加えて、注射に対する動物の反応の臨床観察のスコア化を行った。研究デザインは、図２３においてスキーム的に例示されている。
【0295】
１．１ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用する機械的疼痛感受性の測定（図２４）：
動物の引っ込め力閾値を測定するｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用して、機械的疼痛感受性を試験した。加えられた力が低いほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
動物の引っ込め力閾値を測定するｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を使用して、機械的疼痛感受性を試験した。加えられた力が低いほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
【0296】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルで処置された動物は、注射後１５分および９０分で、低減された引っ込め力閾値（より高い感受性）を有していた。この増加された感受性は、リン酸緩衝液群よりも統計的に有意に大きかった（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１）。
【0297】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグＶＩＩまたはプロドラッグＸＶで処置された動物も、注射後１５分および９０分で、低減された引っ込め力閾値（より高い感受性）を示した。この増加された感受性は、リン酸緩衝液群よりも統計的に有意に大きかった（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０００１）。引っ込め力閾値の差異は、トレプロスチニル処置群と比較した場合、試験項目処置群において見出されなかった。
【0298】
１．２熱痛感受性の測定（図２５）：
熱痛刺激に対する動物の感受性を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に続いて直ちに判定した。熱源からの右注射脚の引っ込めまでの時間を測定し、応答の時間が低い（速い）ほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
熱痛刺激に対する動物の感受性を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に続いて直ちに判定した。熱源からの右注射脚の引っ込めまでの時間を測定し、応答の時間が低い（速い）ほど、刺激に対する感受性がより大きいことを表す。試験を試験項目注射の１５分後および９０分後に行った。
【0299】
１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬの用量にてトレプロスチニルで処置された動物は、投与の１５分後に、リン酸緩衝液処置群と比較した場合、統計的に有意により速い足引っ込め時間（増加された感受性）を有していた（ｐ＜０．０００１）。試験項目注射の９０分後に、より高い用量のトレプロスチニル（１００μｇ／ｍＬ；群２）で処置された動物のみが、ビヒクル（リン酸緩衝液）群と比較して、熱刺激に対して統計的に有意に増加された感受性を示した；ｐ＜０．０５。
【0300】
１００μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグＶＩＩで、または両用量（１μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬ）にてプロドラッグＸＶで処置された動物は、投与の１５分後に、リン酸緩衝液処置群と比較した場合、統計的に有意により速い足引っ込め時間（増加された感受性）を有していた（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１またはｐ＜０．０００１）。
【0301】
興味深いことに、１μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグＶＩＩで処置された動物（群５）は、投与の１５分後に、ベースラインと同様の応答時間を有していた。
【0302】
１．３臨床観察のスコア（図２６）：
発赤、腫脹および足配置を判定することによって、臨床観察のスコアを割り当てた。
発赤、腫脹および足配置を判定することによって、臨床観察のスコアを割り当てた。
【0303】
１μｇ／ｍＬの用量にてプロドラッグＶＩＩで処置した群５における動物を除いて、全ての処置動物は、リン酸緩衝液処置群と比較した場合、注射の１５分後に、臨床スコアの統計的に有意な増加を示した（ｐ＜０．０００１）。９０分時点で、両用量にてトレプロスチニルで処置された動物およびより高い用量（１００μｇ／ｍＬ）にて両試験項目で処置された動物のみが、同じ効果を示した（ｐ＜０．０００１）。
【0304】
２．結論：
この研究の条件下で得られるとともに生存中データに限られる所見を考慮すると、トレプロスチニルの代替プロドラッグの投与は、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、疼痛応答を低減することに有意な効果を示さなかった。しかしながら、１μｇ／ｍＬの用量にて試験項目プロドラッグＶＩＩを用いる処置は、投与後の両時点で、熱的刺激に対する感受性の低減およびより低い値の臨床スコアという結果になったことを記述する価値がある。
この研究の条件下で得られるとともに生存中データに限られる所見を考慮すると、トレプロスチニルの代替プロドラッグの投与は、トレプロスチニルの同様の用量と比較した場合、疼痛応答を低減することに有意な効果を示さなかった。しかしながら、１μｇ／ｍＬの用量にて試験項目プロドラッグＶＩＩを用いる処置は、投与後の両時点で、熱的刺激に対する感受性の低減およびより低い値の臨床スコアという結果になったことを記述する価値がある。
【0305】
[実施例１１]
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
研究デザインは、図１６においてスキーム的に例示されている。図２７および図２８は、それぞれサイクル１および２のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果を表示している。図２９および図３０は、それぞれサイクル１および２の熱的応答試験についての結果を表示している。図３１および図３２は、それぞれサイクル１および２についての平均臨床スコアを表示している。
ラット足底内注射モデルにおけるトレプロスチニルプロドラッグの評価
研究デザインは、図１６においてスキーム的に例示されている。図２７および図２８は、それぞれサイクル１および２のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答試験についての結果を表示している。図２９および図３０は、それぞれサイクル１および２の熱的応答試験についての結果を表示している。図３１および図３２は、それぞれサイクル１および２についての平均臨床スコアを表示している。
【0306】
[実施例１２]
プロドラッグＶＩＩおよびトレプロスチニル：スプラーグドーリーラットへの皮下注射に続く心血管判定
プロドラッグＶＩＩおよびトレプロスチニル：スプラーグドーリーラットへの皮下注射に続く心血管判定
【0307】
１．目的
この研究の目的は、ラジオテレメトリー伝達物質が装着された意識のあるＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットにおける皮下注射に続き、心拍数、血圧（収縮期、拡張期および平均）および体温に対するプロドラッグＶＩＩまたはトレプロスチニル（プロスタサイクリン類似体）の潜在的な急性効果を判定することであった。
この研究の目的は、ラジオテレメトリー伝達物質が装着された意識のあるＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットにおける皮下注射に続き、心拍数、血圧（収縮期、拡張期および平均）および体温に対するプロドラッグＶＩＩまたはトレプロスチニル（プロスタサイクリン類似体）の潜在的な急性効果を判定することであった。
【0308】
２．方法論
ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］１Ｘ）中のトレプロスチニルまたはビヒクル（１２５ｍＭの塩化ナトリウムを用いる２０ｍＭのリン酸緩衝液）中のプロドラッグＶＩＩを、皮下注射を介する単回用量として、４匹の雄スプラーグドーリーラット／群の９群（群１から群９まで）に、用量漸増デザイン（増減手順）に従って投与した。研究デザインは、表１０に示されている。
ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］１Ｘ）中のトレプロスチニルまたはビヒクル（１２５ｍＭの塩化ナトリウムを用いる２０ｍＭのリン酸緩衝液）中のプロドラッグＶＩＩを、皮下注射を介する単回用量として、４匹の雄スプラーグドーリーラット／群の９群（群１から群９まで）に、用量漸増デザイン（増減手順）に従って投与した。研究デザインは、表１０に示されている。
【0309】
【表10】
【0310】
心拍数、動脈血圧（収縮期、拡張期および平均動脈圧）、脈圧および体温を、トレプロスチニルまたはプロドラッグＶＩＩの投与前に少なくとも２時間連続して、および投薬後少なくとも２４時間連続して収集した。投薬の前およそ６時間で、投薬の完了時に、および投薬後およそ４時間で、臨床観察を行った。
【0311】
３．結果
３．１．臨床観察
０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、紅潮した四肢の臨床観察が、一部の動物において投薬後およそ４時間で認められた。紅潮した体および／または四肢、立毛、機能低下、赤くなった前肢および／または後肢、泌尿生殖器部域および腹側体幹上の湿った黄色の物質、ならびに鼻の周辺の乾燥した赤色の物質の臨床観察が、一部の動物において、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いておよそ４時間で認められた。
３．１．臨床観察
０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、紅潮した四肢の臨床観察が、一部の動物において投薬後およそ４時間で認められた。紅潮した体および／または四肢、立毛、機能低下、赤くなった前肢および／または後肢、泌尿生殖器部域および腹側体幹上の湿った黄色の物質、ならびに鼻の周辺の乾燥した赤色の物質の臨床観察が、一部の動物において、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いておよそ４時間で認められた。
【0312】
【0313】
変化の規模は一般にトレプロスチニル群（≧０．０３０ｍｇ／ｋｇ）について同様であったが、変化の持続期間は、増加する用量とともに増加した。心拍数の変化は、投薬後およそ５時間までに解消されると考えられた。
【0314】
それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ；ならびに１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、より高い心拍数の同様の規模が観察され、わずかに高い心拍数が１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇで認められた。心拍数の変化は、トレプロスチニル群との比較において、より長く持続し、全ての群における回復（用量前のベースラインと比較して）が、投薬後およそ１９時間から２０時間で観察された。
【0315】
トレプロスチニルまたはプロドラッグＶＩＩの投与に続く心拍数の増加は、全身血圧の低減に対する応答の代償的増加であると考えられた。
【0316】
３．２．２．収縮期血圧（図３４）
≦０．０３０ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、収縮期血圧の有意義な変化は観察されなかったが、０．０３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、わずかにより低い収縮期血圧が観察された。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて早くも１０分時点で、有意により低い収縮期血圧が観察され、３０分および２０分で最下点があり、それぞれ投薬後９０分および１２０分の間ずっと持続した。
≦０．０３０ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、収縮期血圧の有意義な変化は観察されなかったが、０．０３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、わずかにより低い収縮期血圧が観察された。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて早くも１０分時点で、有意により低い収縮期血圧が観察され、３０分および２０分で最下点があり、それぞれ投薬後９０分および１２０分の間ずっと持続した。
【0317】
０．１ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、収縮期血圧の有意義な変化は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、わずかにより低い収縮期血圧が観察され、５０分で最下点があった。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの投与に続いて早くも２０分時点で、有意により低い収縮期血圧が認められ、４０分で最下点があり、低血圧は、それぞれおよそ４時間および６時間の間ずっと持続した。
【0318】
３．２．３．拡張期血圧（図３５）
拡張期血圧の変化は、観察された収縮期血圧の変化を大きく反映した。
拡張期血圧の変化は、観察された収縮期血圧の変化を大きく反映した。
【0319】
≦０．０３０ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、拡張期血圧の有意義な変化は観察されなかったが、０．０３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、わずかにより低い拡張期血圧が観察された。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、早くも１０分時点で、有意により低い拡張期血圧が観察され、３０分および２０分で最下点があり、それぞれ投薬後９０分および１８０分の間ずっと持続した。
【0320】
０．１ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、拡張期血圧の有意義な変化は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、わずかにより低い拡張期血圧が観察され、５０分で最下点があり、８０分の間ずっと持続した。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの投与に続いて早くも２０分時点で、有意により低い拡張期血圧が認められ、４０分で最下点があり、低血圧は、それぞれおよそ４時間および７時間から８時間の間ずっと持続した。
【0321】
３．２．４．平均動脈圧（図３６）
観察された平均動脈圧の傾向は、観察された収縮期および拡張期血圧の変化の規模および持続期間を反映した。図３６は、プロドラッグＶＩＩについての効力におけるおよそ１００倍の減少、ならびに初期および最大の血管拡張効果に対する時間における１０～２０分の遅延を例示しており、これは、トレプロスチニルへのプロドラッグＶＩＩ変換が、それの血管拡張特性を支配することを示唆し得る。加えて、およそ２～６時間（トレプロスチニルに関する１～２時間と比較して）にわたるプロドラッグＶＩＩの昇圧応答の持続は、トレプロスチニルの薬力学濃度への変換の維持を示唆している。
観察された平均動脈圧の傾向は、観察された収縮期および拡張期血圧の変化の規模および持続期間を反映した。図３６は、プロドラッグＶＩＩについての効力におけるおよそ１００倍の減少、ならびに初期および最大の血管拡張効果に対する時間における１０～２０分の遅延を例示しており、これは、トレプロスチニルへのプロドラッグＶＩＩ変換が、それの血管拡張特性を支配することを示唆し得る。加えて、およそ２～６時間（トレプロスチニルに関する１～２時間と比較して）にわたるプロドラッグＶＩＩの昇圧応答の持続は、トレプロスチニルの薬力学濃度への変換の維持を示唆している。
【0322】
≦０．０３０ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、平均血圧の有意義な変化は観察されなかったが、０．０３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、わずかにより低い平均血圧が観察され、３０分で最下点があった。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、早くも１０分時点で、有意により低い平均血圧が観察され、３０分および２０分で最下点があり、それぞれ投薬後９０分および１８０分の間ずっと持続した。
【0323】
０．１ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、平均血圧の有意義な変化は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、わずかにより低い平均血圧が観察され、５０分で最下点があった。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの投与に続いて、有意により低い平均血圧が認められ、４０分で最下点があり、低血圧は、それぞれおよそ４時間および７時間から８時間の間ずっと持続した。
【0324】
３．２．５．脈圧（図３７）
脈圧の変化は可変であり、応答の一貫した方向および規模が欠如しており、用量応答関係がさらに欠如していた。
脈圧の変化は可変であり、応答の一貫した方向および規模が欠如しており、用量応答関係がさらに欠如していた。
【0325】
０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、投薬後２０分から４０分まで、わずかにより低い脈圧が観察された。調査された任意の他の用量レベルでのトレプロスチニルの投与に続いて、観察された他の一貫した傾向はなかった。
【0326】
１０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、わずかにより高い脈圧が認められた。プロドラッグＶＩＩの任意の他の用量に続いて、他の一貫した傾向は観察されなかった。
【0327】
脈圧は、収縮期および拡張期の血圧の関数である。収縮期および拡張期についての変化の規模および方向は同様であったので、全体的な正味変化（収縮期と拡張期の間の差異）が大きく変わることはなかった。
【0328】
３．２．６．体温（図３８）
０．０００１２５ｍｇ／ｋｇまたは０．００１２５ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、体温の有意な変化は観察されなかった。０．１ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルに続いて、わずかにより低い体温が観察された。この変化は、投薬後およそ３時間の間ずっと持続した。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、有意に低くなった体温が観察された。これらの変化は、それぞれ投薬後およそ３時間および４時間までに解消されると考えられた。
０．０００１２５ｍｇ／ｋｇまたは０．００１２５ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、体温の有意な変化は観察されなかった。０．１ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルに続いて、わずかにより低い体温が観察された。この変化は、投薬後およそ３時間の間ずっと持続した。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのトレプロスチニルの投与に続いて、有意に低くなった体温が観察された。これらの変化は、それぞれ投薬後およそ３時間および４時間までに解消されると考えられた。
【0329】
１ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて、体温の有意な変化は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの投与に続いて、有意により低い体温が観察された。低体温応答は、それぞれ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投与に続いて、４時間および１１時間から１２時間の間ずっと持続した。体温は、３０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＶＩＩの投与に続いて２４時間以内に回復しなかった。
【0330】
体温の変化は、血圧の変化の二次的なものであった。体温減少は、血管拡張に直接関連していた。
【0331】
４．結論
トレプロスチニルの投与は、より高い心拍数（全ての用量）、および有意により低い収縮期、拡張期、平均動脈血圧（≧０．１ｍｇ／ｋｇ）、および体温（≧０．０３０ｍｇ／ｋｇ）という結果になった。プロドラッグＶＩＩの投与は、より高い心拍数（全ての用量）、および有意により低い収縮期、拡張期、平均動脈血圧、および体温（≧３ｍｇ／ｋｇ）という結果になった。
トレプロスチニルの投与は、より高い心拍数（全ての用量）、および有意により低い収縮期、拡張期、平均動脈血圧（≧０．１ｍｇ／ｋｇ）、および体温（≧０．０３０ｍｇ／ｋｇ）という結果になった。プロドラッグＶＩＩの投与は、より高い心拍数（全ての用量）、および有意により低い収縮期、拡張期、平均動脈血圧、および体温（≧３ｍｇ／ｋｇ）という結果になった。
【0332】
[実施例１３]
トレプロスチニル（プロドラッグＩＸ）のジメチルエーテルの合成：
考察：
トレプロスチニル（１）のジメチルエーテルの合成は、室温でＴＨＦ中のＮａＨおよびヨウ化メチルを使用するＯ－メチル化によって達成した。この方法は、プロドラッグＩＸを得るために研究された他の反応条件と比較した場合、短い反応時間および単純な後処理を伴った。
トレプロスチニル（プロドラッグＩＸ）のジメチルエーテルの合成：
考察：
トレプロスチニル（１）のジメチルエーテルの合成は、室温でＴＨＦ中のＮａＨおよびヨウ化メチルを使用するＯ－メチル化によって達成した。この方法は、プロドラッグＩＸを得るために研究された他の反応条件と比較した場合、短い反応時間および単純な後処理を伴った。
【0333】
【化79】
【0334】
実験手順：
５０ｍｌの丸底フラスコに水素化ナトリウム（０．６１ｇ、１５．３６ｍｍｏｌ、鉱物油中６０％）を投入し、これをヘキサン（２×２０ｍｌ）で洗浄することで、鉱物油を除去した。この固体ＮａＨに、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）を添加し、周囲温度でアルゴン下にて撹拌した。この懸濁液に、ＴＨＦ（５．０ｍｌ）中のトレプロスチニル（１）（０．５ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を滴下により添加し、その後、ヨウ化メチル（３．０ｍｌ）が続いた。反応混合物を５時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ／メタノール、９：１）によってモニタリングした。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１．０ｍｌ）でクエンチし、水（１０．０ｍｌ）で希釈した。ｐＨを２ＮのＨＣｌで１～２に調整した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去することで、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって、グラジエント溶媒（ＤＣＭ中０～１０％のメタノール）を使用して精製することで、トレプロスチニルの生成物ジメチルエーテル（プロドラッグＩＸ）（２３０ｍｇ）が得られた。
５０ｍｌの丸底フラスコに水素化ナトリウム（０．６１ｇ、１５．３６ｍｍｏｌ、鉱物油中６０％）を投入し、これをヘキサン（２×２０ｍｌ）で洗浄することで、鉱物油を除去した。この固体ＮａＨに、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）を添加し、周囲温度でアルゴン下にて撹拌した。この懸濁液に、ＴＨＦ（５．０ｍｌ）中のトレプロスチニル（１）（０．５ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を滴下により添加し、その後、ヨウ化メチル（３．０ｍｌ）が続いた。反応混合物を５時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ／メタノール、９：１）によってモニタリングした。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１．０ｍｌ）でクエンチし、水（１０．０ｍｌ）で希釈した。ｐＨを２ＮのＨＣｌで１～２に調整した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去することで、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって、グラジエント溶媒（ＤＣＭ中０～１０％のメタノール）を使用して精製することで、トレプロスチニルの生成物ジメチルエーテル（プロドラッグＩＸ）（２３０ｍｇ）が得られた。
【0335】
[実施例１４]
トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）の合成：
モノ－ＴＥＳトレプロスチニルベンジルエステル（１）から、トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）（５）を合成した。モノ－ＴＥＳトレプロスチニルベンジルエステル（１）をｐ－ニトロフェニルクロロホルメートで処理することで、ｐ－ニトロフェニルのカーボネート（２）を発生させた。カーボネート（２）は、単離することなくテトラヒドロフラン中のメチルアミンで処理することで、ＴＥＳトレプロスチニルベンジルモノメチルカルバメート（３）が良好な収率で得られた。水性テトラヒドロフラン中の塩酸を用いる化合物（３）の脱シリル化は、トレプロスチニルベンジルエステルモノメチルカルバメート（４）を与えた。水素の雰囲気下で炭素上のパラジウムを用いる純粋なカルバメート（４）の脱ベンジル化は、トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）（５）を与えた。
トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）の合成：
モノ－ＴＥＳトレプロスチニルベンジルエステル（１）から、トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）（５）を合成した。モノ－ＴＥＳトレプロスチニルベンジルエステル（１）をｐ－ニトロフェニルクロロホルメートで処理することで、ｐ－ニトロフェニルのカーボネート（２）を発生させた。カーボネート（２）は、単離することなくテトラヒドロフラン中のメチルアミンで処理することで、ＴＥＳトレプロスチニルベンジルモノメチルカルバメート（３）が良好な収率で得られた。水性テトラヒドロフラン中の塩酸を用いる化合物（３）の脱シリル化は、トレプロスチニルベンジルエステルモノメチルカルバメート（４）を与えた。水素の雰囲気下で炭素上のパラジウムを用いる純粋なカルバメート（４）の脱ベンジル化は、トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）（５）を与えた。
【0336】
トレプロスチニルモノメチルカルバメート（プロドラッグＶＩＩＩ）（５）の合成
【0337】
【化80】
ＴＥＳ－トレプロスチニルベンジルエステルモノメチルカルバメート（３）の合成：
【0338】
【化81】
【0339】
トレプロスチニルベンジルエステルモノメチルカルバメート（４）の合成
【0340】
【化82】
【0341】
トレプロスチニルモノメチルカルバメート（５）の合成
【0342】
【化83】
【0343】
[実施例１５]
トレプロスチニルアミノ酸アミドプロドラッグの合成：
考察：
様々なアミノ酸を用いてカップリング剤を使用して、トレプロスチニルをアミド化にかけることで、下記のスキームに示されている通り、トレプロスチニルアミドをプロドラッグとして形成した。
トレプロスチニルアミノ酸アミドプロドラッグの合成：
考察：
様々なアミノ酸を用いてカップリング剤を使用して、トレプロスチニルをアミド化にかけることで、下記のスキームに示されている通り、トレプロスチニルアミドをプロドラッグとして形成した。
【0344】
トレプロスチニルアラニンアミド（プロドラッグＸ）の合成：
【0345】
【化84】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のトレプロスチニル（１）（１．０ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）およびＬ－アラニンベンジルエステルｐ－トルエンスルホネート塩（０．９ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（０．８９ｍＬ、６．４０１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（０．５９ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．４２ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度でアルゴン下にて２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物を水（３０ｍＬ）でクエンチし、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させることで、粗生成物を得た。ヘキサン中の０～７０％の酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して、粗生成物を精製することで、純粋なトレプロスチニルアラニンアミドベンジルエステル（２）（１．３４ｇ、９７．８％の収率）を得た。
【0346】
ステップ２：
酢酸エチル中のトレプロスチニルアラニンアミドベンジルエステル（２）（１．３ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（１３０ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルアラニンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸ）（１．０３ｇ、９１．７％の収率）を得た。
酢酸エチル中のトレプロスチニルアラニンアミドベンジルエステル（２）（１．３ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（１３０ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルアラニンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸ）（１．０３ｇ、９１．７％の収率）を得た。
【0347】
トレプロスチニルバリンアミド（プロドラッグＸＩ）の合成：
【0348】
【化85】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のトレプロスチニル（１）（１．０ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）およびＬ－バリンベンジルエステルｐ－トルエンスルホネート塩（０．９７ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（０．８９ｍＬ、６．４０１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（０．５９ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．４２ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度でアルゴン下にて２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物を水（３０ｍＬ）でクエンチし、１５分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させることで、粗生成物を得た。ヘキサン中の０～５０％の酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して、粗生成物を精製することで、純粋なトレプロスチニルバリンアミドベンジルエステル（２）（１．３ｇ、９０．３％の収率）を得た。
【0349】
ステップ２：
酢酸エチル（１５ｍＬ）中のトレプロスチニルバリンアミドベンジルエステル（２）（１．３ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（１３０ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルバリンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩ）（１．１ｇ、残留の溶媒とともに９７．１％の収率）を得た。
酢酸エチル（１５ｍＬ）中のトレプロスチニルバリンアミドベンジルエステル（２）（１．３ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（１３０ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルバリンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩ）（１．１ｇ、残留の溶媒とともに９７．１％の収率）を得た。
【0350】
トレプロスチニルアスパラギン酸アミド（プロドラッグＸＩＩ）の合成：
【0351】
【化86】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のトレプロスチニル（１）（１．０ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）およびＬ－アスパラギン酸ジベンジルエステルｐ－トルエンスルホネート塩（１．２４ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（０．８９ｍＬ、６．４０１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（０．５９ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．４２ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度でアルゴン下にて２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物を水（３０ｍＬ）でクエンチし、１５分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させることで、粗生成物を得た。移動相として０～５０％の酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して、粗生成物を精製することで、純粋なトレプロスチニルアスパラギン酸アミドベンジルエステル（２）（１．６３ｇ、９７．６％の収率）を得た。
【0352】
ステップ２：
酢酸エチル（２０ｍＬ）中のトレプロスチニルアスパラギン酸アミドベンジルエステル（２）（０．５７ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（５７ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で５時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルアスパラギン酸アミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩＩ）（０．４ｇ、９０．９％の収率）を得た。
酢酸エチル（２０ｍＬ）中のトレプロスチニルアスパラギン酸アミドベンジルエステル（２）（０．５７ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（５７ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で５時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物をセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルアスパラギン酸アミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩＩ）（０．４ｇ、９０．９％の収率）を得た。
【0353】
トレプロスチニルセリンアミド（プロドラッグＸＩＩＩ）の合成：
【0354】
【化87】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のトレプロスチニル（１）（１．０ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）およびＬ－セリンベンジルエステルベンゼンスルホネート塩（０．９ｇ、２．５６１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（０．８９ｍＬ、６．４０１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（０．５９ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．４２ｇ、３．０７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度でアルゴン下にて２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。反応混合物を水（３０ｍＬ）でクエンチし、１５分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させることで、粗生成物を得た。移動相として０～１００％の酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して、これを精製することで、純粋なトレプロスチニルセリンアミドベンジルエステル（２）（０．６２ｇ、４９．３％の収率）を得た。
【0355】
ステップ２：
酢酸エチル（１２０ｍＬ）中のトレプロスチニルセリンアミドベンジルエステル（２）（０．５７ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（５７ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。化合物が反応後に溶液から析出した。炭素上のパラジウムから生成物を可溶化および単離するため、イソプロピルアルコール（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を次いでセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルセリンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩＩＩ）（０．５４ｇ、１００％の収率）を得た。
酢酸エチル（１２０ｍＬ）中のトレプロスチニルセリンアミドベンジルエステル（２）（０．５７ｇ）の溶液に、炭素上の５％パラジウム（５０％ｗ／ｗの水）（５７ｍｇ）を添加した。真空を使用して、これを３回脱気し、水素ガスと置き換え、水素雰囲気下で２時間撹拌した。ＴＬＣ（溶離液：酢酸エチル）に基づき、反応は完了していることが見出された。化合物が反応後に溶液から析出した。炭素上のパラジウムから生成物を可溶化および単離するため、イソプロピルアルコール（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を次いでセライトに通して濾過することで、炭素上のパラジウムを除去した。濾液を真空中で蒸発させることで、トレプロスチニルセリンアミドプロドラッグ（プロドラッグＸＩＩＩ）（０．５４ｇ、１００％の収率）を得た。
【0356】
[実施例１６]
トレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）の合成
ベンズインデントリオール（１）から、トレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）（７）を合成した。トリオール（１）から、トレプロスチニルベンジルエステル（２）を調製した。エステル（２）をｔｅｒｔ－ブチルジメチルトリフルオロメタンスルホンアミド（ＴＢＤＭＳＯＴｆ）でシリル化することで、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルベンジルエステル（３）が得られた。水素の雰囲気で炭素上の５％パラジウムを用いる酢酸エチル中の化合物（３）の脱ベンジル化は、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニル（４）を提供した。ＣＤＩを用いる酸（４）の活性化、続いて、ＤＢＵの存在下でのメタンスルホンアミドとの反応は、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルメタンスルホンアミド（６）を与え、シリカゲルカラムによって精製した。メタノール中の塩化水素を使用するスルホンアミド（６）からのＴＢＤＭＳの脱保護は、所望のトレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）（７）を与えた。
トレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）の合成
ベンズインデントリオール（１）から、トレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）（７）を合成した。トリオール（１）から、トレプロスチニルベンジルエステル（２）を調製した。エステル（２）をｔｅｒｔ－ブチルジメチルトリフルオロメタンスルホンアミド（ＴＢＤＭＳＯＴｆ）でシリル化することで、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルベンジルエステル（３）が得られた。水素の雰囲気で炭素上の５％パラジウムを用いる酢酸エチル中の化合物（３）の脱ベンジル化は、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニル（４）を提供した。ＣＤＩを用いる酸（４）の活性化、続いて、ＤＢＵの存在下でのメタンスルホンアミドとの反応は、ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルメタンスルホンアミド（６）を与え、シリカゲルカラムによって精製した。メタノール中の塩化水素を使用するスルホンアミド（６）からのＴＢＤＭＳの脱保護は、所望のトレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）（７）を与えた。
【0357】
トレプロスチニルメタンスルホンアミド（プロドラッグＸＩＶ）の合成
【0358】
【化88】
トレプロスチニルベンジルエステル（２）の合成
【0359】
【化89】
【0360】
ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルベンジルエステル（３）の合成
【0361】
【化90】
【0362】
ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニル（４）の合成
【0363】
【化91】
【0364】
ジ－ＴＢＤＭＳトレプロスチニルメタンスルホンアミド（６）の合成
【0365】
【化92】
【0366】
トレプロスチニルメタンスルホンアミド（７）の合成
【0367】
【化93】
【0368】
[実施例１７]
様々なプロドラッグに必要とされる出発材料：トレプロスチニルモノ－ＴＥＳベンジルエステル（２ａ）の合成：
様々なプロドラッグに必要とされる出発材料：トレプロスチニルモノ－ＴＥＳベンジルエステル（２ａ）の合成：
【0369】
【化94】
【0370】
[実施例１８]
プロドラッグＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＸＶの単回投与に続く雄スプラーグドーリーラットにおける、親に対する代謝物の平均比は、表１１に表示されている。
プロドラッグＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＸＶの単回投与に続く雄スプラーグドーリーラットにおける、親に対する代謝物の平均比は、表１１に表示されている。
【0371】
【表11】
【0372】
追加の実施形態
１．以下の式：
１．以下の式：
【0373】
【化95】
Ｘは、ＯＨまたは
【0374】
【化96】
Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、または
【0375】
【化97】
を有する化合物または化合物の薬学的に許容される塩。
２．ＸがＯＨである、実施形態１の化合物。
３．Ｒ２およびＲ３の各々が、Ｃ１～４アルキルから独立して選択される、請求項２の実施形態。
４．Ｒ２およびＲ３の各々がメチルである、実施形態２の化合物。
５．Ｒ２およびＲ３の各々が、Ｈ、および
【0376】
【化98】
６．Ｒ２およびＲ３の一方が
【0377】
【化99】
７．ＹがＯＲ４である、実施形態６の化合物。
８．Ｒ４がメチルまたはＨである、実施形態７の化合物。
９．ＹがＮＲ４Ｒ５である、実施形態６の化合物。
１０．Ｒ４およびＲ５の各々が、Ｈまたはメチルから独立して選択される、実施形態９の化合物。
１１．Ｒ４およびＲ５の両方がＨまたはメチルである、実施形態９の化合物。
１２．（Ａ）実施形態１～１１のいずれか１つの化合物および（Ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
１３．経口医薬組成物である、実施形態１２の医薬組成物。
１４．皮下医薬組成物である、実施形態１２の医薬組成物。
１５．実施形態１～１１のいずれか１つの化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺高血圧症を処置する方法。
１６．投与することが経口的に行われる、実施形態１５の方法。
１７．対象がヒトである、実施形態１５の方法。
１８．投与することが注射によって行われる、実施形態１５の方法。
１９．投与することが皮下に行われる、実施形態１８の方法。
２０．前記投与することが連続的に皮下投与することである、実施形態１９の方法。
２１．前記投与することが、トレプロスチニルを投与することと比較して、注射の部位で全くないまたはほとんどない疼痛という結果になる、実施形態１８の方法。
２２．肺高血圧症を患う患者にトレプロスチニルのプロドラッグの有効量を皮下投与することを含む、肺高血圧症を処置する方法。
２３．トレプロスチニルまたはその薬学的に許容される塩の皮下投与で部位疼痛を経験したことがある患者を選択すること、および肺高血圧症を患う患者にトレプロスチニルのプロドラッグの有効量を皮下投与することを含む、肺高血圧症を処置する方法。
＊＊＊
【0378】
前述は、特別な好ましい実施形態を指すが、本発明はそのように限定されないことが理解されるであろう。様々な修飾が開示されている実施形態に行われ得ること、およびこうした修飾は本発明の範疇内であると意図されることが当業者に想起されよう。
【0379】
この明細書において引用されている公報、特許出願および特許の全ては、参照により全体で本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
