(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-02
(45)【発行日】2023-02-10
(54)【発明の名称】骨髄異形成症候群の治療のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230203BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20230203BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230203BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230203BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230203BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N ZNA
A61K31/7068
A61P35/02
A61P7/06
A61P43/00 105
A61P43/00 121
C12N15/13
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019529608
(86)(22)【出願日】2017-05-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-16
(86)【国際出願番号】 EP2017060339
(87)【国際公開番号】W WO2018099614
(87)【国際公開日】2018-06-07
【審査請求日】2020-04-06
(31)【優先権主張番号】62/429,313
(32)【優先日】2016-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１６／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ９７９３１．ｈｔｍｌ ギレルモ ガルシア マネロ、ギレルモ モンタルバン ブラボ、フイヤン、ユエ ウェイ、イェシド アルバラド、コートニー ディー ディナルド、ナバル ジー デバー、マリナ コノプレバ、キャサリン ピー ハーン、ロバート ミラー、サラ アルベ－バーンズ、ピーター マック ガーク、タラ カーニー、ブライアン キーオ、ハゴップ エムカンタルジャン、メアリー ライリーが２０１８年１１月３日付で上記アドレスのウェブサイトで上記アドレスのウェブサイトで公開された第５８回米国血液学会の予稿集において、出願に係る発明について公開。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｐｓｏｎａ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｐ＝９８＆ｎ＝１５４＆ａ＝１２９ オプソナ セラピューティクス リミテッドが２０１８年１１月２２日付で、上記アドレスのウェブサイトでサンディエゴでの第５８回米国血液学会において、出願に係る発明についてのプレゼンテーションを行うことを告知。
(73)【特許権者】
【識別番号】520450905
【氏名又は名称】ニューレメディ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(72)【発明者】
【氏名】メアリー ライリー
(72)【発明者】
【氏名】ロバート ミラー
(72)【発明者】
【氏名】ギレルモ ガルシア マネロ
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５３１９２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】A Phase I/II Study of OPN-305 in Second-line Lower Risk Myelodysplastic Syndrome，ClinicalTrials.gov archive，2016年10月11日，NCT02363491，https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT0236491
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ ７／０６
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｋ ３１／７０６
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
低メチル化剤による以前の治療およびトール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストによる以前の治療に対して不応性または抵抗性である対象における低リスク骨髄異形成症候群の治療のための医薬組成物であって、トール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストを含み、かつ、該ＴＬＲ２アンタゴニストは、配列番号３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むＣＤＲ２領域、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、該ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、
前記低リスク骨髄異形成症候群の治療は、前記ＴＬＲ２アンタゴニストとともに、逐次的にまたは同時に投与される治療上有効量の二次治療薬との併用治療であり、
前記二次治療薬がアザシチジンまたはデシタビンである、医薬組成物。
【請求項2】
前記抗体またはその抗原結合断片がＴＬＲ２のロイシンリッチリピート領域１１から１４を含むエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、および／または
配列番号１１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖、および／または
配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖、または
その抗原結合断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記抗体または抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列、もしくは配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号９のアミノ酸配列、もしくは配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記抗体が、抗ＴＬＲ２抗体Ｔ２．５(HyCultBiotechnology製、カタログ番号1054)のヒト化バージョン、またはその抗原結合断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記低メチル化剤は、アザシチジンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨髄異形成症候群、特に低メチル化剤による治療などの治療に対して不応性（難治性）または抵抗性であることが示されている対象の治療方法に関する。また、骨髄異形成症候群、特に低メチル化剤による治療などの治療に対して不応性または抵抗性であることが示されている対象の治療に使用するための組成物が提供される。
【背景技術】
【0002】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄内の未熟な血球が成熟しない、あるいは、健康な血球にならないまれなクローン性造血幹細胞（ＨＳＣ）疾患である。それらは、血球減少症につながる無効な造血によって特徴付けられる骨髄性疾患の複雑なグループである。それらの病態生理学は、細胞遺伝学的または遺伝子の変化および進行した段階での広範な遺伝子の過剰メチル化を含む多段階プロセスである。多くの症例が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行する。
【0003】
血球形成に関する問題は、低赤血球、低血小板、低白血球またはそれらの組み合わせをもたらし、異なるタイプのＭＤＳの発生をもたらす。一部の種類のＭＤＳでは、骨髄内で芽球と呼ばれる未熟血球が増加している。ＭＤＳの種類は、血球と骨髄の特定の変化に基づいている。いくつかのタイプは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に発展することがある。第５染色体の長腕の欠失は、造血幹細胞の異形成異常と関連している（５ｑ症候群）。
【0004】
ＴＬＲ２の過剰発現を含む自然免疫シグナル伝達の変化はＭＤＳにおいて一般的である。
【0005】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫応答を活性化するのに重要な役割を有するパターン認識受容体のファミリーを形成する。これまでに１１のＴＬＲがヒトにおいて同定されている。ＴＬＲファミリーのメンバーは高度に保存されており、ほとんどの哺乳動物種は１０から１５のＴＬＲを有する。各ＴＬＲは、特定の病原体関連分子シグネチャを認識する。トール様受容体２（ＴＬＲ２、ＣＤ２８２、ＴＬＲ－２）は、ペプチドグリカン、リポタンパク質およびリポテイコ酸によって活性化される。ＴＬＲ２は、２つの機能的ヘテロ二量体に二量体化することが知られている。特に、ＴＬＲ２は、トール様受容体１（ＴＬＲ１、ＴＬＲ－１）またはＴｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６、ＴＬＲ－６）のいずれかとヘテロ二量体を形成することが知られている。さらなるヘテロ二量体がトール様受容体４（ＴＬＲ４、ＴＬＲ－４）およびトール様受容体１０（ＴＬＲ１０、ＴＬＲ－１０）を用いて形成される可能性がある。微生物由来成分に加えて、ＴＬＲは損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識することも知られている。これらはストレス、組織損傷および細胞性疾患の後に放出され分布する宿主内在性分子である。ＷＯ２００５／０２８５０９は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCultBiotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA:カタログ番号１０５４、ＯＰＮ－３０１としても知られる）に由来するマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体を開示している。ＷＯ２０１１／００３９２５は、ＯＰＮ－３０５と称されるＴ２．５のヒト化バージョンを記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
現在までにＭＤＳに利用されている治療法には、薬物療法、支持療法および幹細胞移植が含まれる。支持療法は、輸血、赤血球の生成を増やす薬、抗生物質を含み得る。薬物療法は、とりわけ、薬物治療レナリドマイド、赤血球生成促進剤、抗胸腺細胞グロブリン、ならびにアザシチジン（ＡＺＡ）およびデシタビンなどの低メチル化剤を含み得る。一部の人々は化学療法とそれに続くドナーからの幹細胞移植で治療することができる。現在、同種造血幹細胞移植は、ＭＤＳ患者に長期寛解を誘導することができる唯一の治療法である。しかしながら、診断時年齢の中央値が７０歳を超えているため、そのような治療法はほとんどの患者には適用できない。
【0007】
残念ながら、これらの治療法はしばしば失敗する。この場合、通常はそれ以上の治療法はなく、唯一の選択肢は、単に患者の症状を治療することである。したがって、ＭＤＳのさらなる治療、特に以前の治療が失敗した場合に役に立つことができるさらなる治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
実施例に記載されるように、本発明者らは、以前の抗ＭＤＳ治療に対して非応答性であると同定された患者において、その後のＴＬＲ２アンタゴニスト（拮抗薬）による治療が有効であり得ることを示した。
【0009】
本発明の第１の態様によれば、以前の治療に対して不応性または抵抗性である対象において骨髄異形成症候群を治療するための方法が提供され、当該方法は、
前記対象に治療上有効量のトール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストを投与するステップを含む。
前記対象に治療上有効量のトール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストを投与するステップを含む。
【0010】
任意に、前記以前の治療が、低メチル化剤（ＨＭＡ）、赤血球造血刺激剤（ＥＳＡ）、レナリドマイド、免疫療法剤、キナーゼ阻害剤、アクチビン受容体アンタゴニスト、プロテアソーム阻害剤、ステロイド、鉄キレート剤、抗好中球減少剤からなる群から選択される化合物の投与を含む。
【0011】
任意に、前記低メチル化剤が、アザシチジンまたはデシタビンである。任意に、前記低メチル化剤が、アザシチジンである。
【0012】
任意に、前記赤血球造血刺激剤が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはダルベポエチン（ＤＡＲ）である。
【0013】
任意に、前記免疫療法剤が、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、シクロスポリン、またはチェックポイント阻害剤、例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）阻害剤、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤、または細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤からなる群から選択される。
【0014】
任意に、ステロイドはプレドニゾロンである。
【0015】
任意に、鉄キレート剤はエクジェイドである。
【0016】
任意に、抗好中球減少薬はニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）である。
【0017】
任意に、以前の治療は赤血球輸血である。
【0018】
本発明では任意の適切なＴＬＲ２アンタゴニストを使用することとしてもよい。例えば、ＴＬＲ２アンタゴニストは小分子、ペプチド、核酸阻害剤または抗体であることとしてもよい。
【0019】
任意に、本発明の方法は、骨髄異形成症候群の治療に使用するのに適した治療上有効量の二次治療薬を、逐次的に、別々にまたは同時に投与するステップをさらに含む。任意に、前記二次治療薬が低メチル化剤である。任意に、前記低メチル化剤は、アザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストと低メチル化剤との治療の組み合わせは、骨髄異形成症候群の対象において相乗効果を示す。
【0020】
本発明のさらなる態様によれば、以前の治療に対して不応性または抵抗性である対象における骨髄異形成症候群の治療に使用するためのトール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストを含む組成物が提供される。
【0021】
任意に、治療は、前記ＴＬＲ２アンタゴニストと逐次的に、別々にまたは同時に投与される治療有効量の二次治療薬との併用治療である。任意に、前記組成物は二次治療薬を含む。任意に、前記二次治療薬は低メチル化剤である。任意に、前記低メチル化剤が、アザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される。任意に、前記低メチル化剤が、アザシチジンである。
【0022】
本発明のさらなる態様によれば、以前の治療に対して不応性または抵抗性である対象における骨髄異形成症候群の治療のための医薬の製造における、トール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストを含む組成物の使用が提供される。
【0023】
任意に、前記医薬は二次治療薬を含む併用医薬である。任意に、前記二次治療薬は低メチル化剤であり得る。任意に、低メチル化剤はアザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される。任意に、低メチル化剤はアザシチジンである。
【0024】
ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片などのＴＬＲ２アンタゴニストと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバント、並びに低メチル化剤などの二次治療薬とを含む医薬組成物の形態で提供されることとしてもよい。
【0025】
本発明のさらなる態様によれば、ＴＬＲ２アンタゴニストおよび低メチル化剤を含むキットが提供される。
【0026】
任意に、前記低メチル化剤はアザシチジンである。
【0027】
医薬組成物またはキットは骨髄異形成症候群の治療に使用することとしてもよい。
【0028】
本発明のさらなる態様によれば、骨髄異形成症候群の治療方法が提供され、前記方法は、ＴＬＲ２アンタゴニストおよび低メチル化剤の同時、逐次または別々の投与を含む。
【0029】
本発明のさらなる態様によれば、骨髄異形成症候群の治療に使用するためのＴＬＲ２アンタゴニストが提供され、前記治療は、ＴＬＲアンタゴニストと低メチル化剤の同時、逐次または別々の投与を含む併用療法である。
【0030】
本発明のさらなる態様によれば、対象における骨髄異形成症候群の治療のための医薬の製造におけるトール様受容体２（ＴＬＲ２）アンタゴニストの使用が提供され、前記骨髄異形成症候群の治療は、前記ＴＬＲ２アンタゴニストと逐次的に、別々にまたは同時に投与される治療有効量の二次治療薬との併用治療である。
【0031】
任意に、対象は低リスク骨髄異形成症候群を有する。ＭＤＳのリスクは、国際予後判定システム（ＩＰＳＳ）を使用して決定される。任意に、低リスク骨髄異形成症候群は低リスクおよび中程度－１リスクの対象を含む。任意に、対象はより高リスクの骨髄異形成症候群を有する。任意に、対象はＥＳＡナイーブである。任意に、対象はＨＭＡナイーブである。任意に、対象はＡＺＡナイーブである。任意に、レナリドマイドは、染色体の長腕に欠失を有する対象（ｄｅｌ５ｑ対象）における以前の治療として使用される。任意に、対象は低い血球数を有し得る。任意に、低血球数は赤血球、白血球または血小板を含む。任意に、対象は急性骨髄性白血病を発症する危険性がある。
【0032】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストの治療有効量は１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。一実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬の治療有効量は５ｍｇ／ｋｇである。一実施形態において、治療有効量のＴＬＲ２アンタゴニストは１０ｍｇ／ｋｇである。
【0033】
任意に、本発明の治療は、骨髄異形成症候群の進行を減少させ、対象の生存の向上、および／または対象の生活の質の向上をもたらす。
【0034】
上記のように、本発明のいくつかの態様において、本発明は、以前のＭＤＳ治療に対して不応性または抵抗性である対象における骨髄異形成症候群の治療に関する。任意に、前記対象は、例えば単独療法として、前記治療を以前に受けていた。別の態様では、前記対象は前記以前の治療を受けていないが、例えば診断試験または試験によって、前記治療に反応しないと判断されている。
【0035】
任意に、前記以前の治療が、低メチル化剤、赤血球造血刺激剤、レナリドマイド、免疫療法剤、キナーゼ阻害剤、アクチビン受容体アンタゴニスト、プロテアソーム阻害剤、ステロイド、鉄キレート剤、抗好中球減少剤、またはそれらの組み合わせによる治療または療法である。
【0036】
ＭＤＳを有する対象は、ＭＤＳが前記薬剤による治療に積極的に反応しない場合、特定の治療に対して不応性であると考えられ得る。ＭＤＳの治療に対する陽性反応を評価するための任意の適切な基準が利用され得る。例えば、特定の治療に対する反応は、該治療に反応して患者のＩＰＳＳまたはＩＰＳＳ－Ｒスコアに改善がある場合、陽性と見なすことができる。あるいは、特定の治療に対する反応は、該治療に反応して患者の血液学的プロフィールに改善が見られる場合には、陽性とみなすことができる。任意に、特定の治療に対する反応は、患者のヘモグロビンレベルが、例えば前記治療に反応して少なくとも０．５ｇ／ｄＬ、少なくとも１ｇ／ｄＬまたは少なくとも２ｇ／ｄＬ増加した場合に陽性と見なすことができる。別の選択肢では、特定の治療に対する細胞遺伝学的反応がある場合、その治療に対する反応は陽性と見なすことができる。別の選択肢では、特定の治療に対する反応は、該治療に反応して、治療前に赤血球輸血に依存していた対象が、例えば、輸血時に、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％依存性を減少させた場合、または前記治療に応答して輸血と無関係になる場合、陽性と見なされ得る。
【0037】
特定の治療に必要な治療の期間は、使用されている特定の治療によって異なります。
【0038】
ＭＤＳを有する対象は、対象が少なくとも２ヶ月を超える期間、例えば、少なくとも４ヶ月以上、または６ヶ月以上にわたって特定の治療を伴う治療に積極的に反応しない場合、またはそのＭＤＳが特定の治療による治療の完了後６ヶ月以内に進行する場合、特定の治療に対して抵抗性であると考えられ得る。
【0039】
任意に、以前の治療は、過去６ヶ月以内、過去１２ヶ月以内、または対象におけるＭＤＳの発症の任意の段階で生じていてもよい。
【0040】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは小分子である。
【0041】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは抗体またはその抗原結合断片である。
【0042】
任意に、抗体またはその抗原結合断片はＴＬＲ２に特異的に結合する。
【0043】
任意に、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＬＲ２のロイシンリッチリピート領域１１から１４を含むエピトープに特異的に結合する。
【0044】
任意に、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１のアミノ酸残基のＨｉｓ３１８、Ｐｒｏ３２０、Ａｒｇ３２１、Ｔｙｒ３２３、Ｌｙｓ３４７、Ｐｈｅ３４９、Ｌｅｕ３７１、Ｇｌｕ３７５、Ｔｙｒ３７６、およびＨｉｓ３９８を含む非連続エピトープに特異的に結合する。
【0045】
任意に、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸残基のＨｉｓ３１８、Ｐｒｏ３２０、Ｇｌｎ３２１、Ｔｙｒ３２３、Ｌｙｓ３４７、Ｐｈｅ３４９、Ｌｅｕ３７１、Ｇｌｕ３７５、Ｔｙｒ３７６、およびＨｉｓ３９８を含む非連続エピトープに特異的に結合する。
【0046】
任意に、抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、並びに／または
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むＣＤＲ２領域、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１領域、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、並びに／または
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むＣＤＲ２領域、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。
【0047】
任意に、抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号１０のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、および／または
配列番号１１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
配列番号１０のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、および／または
配列番号１１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【0048】
任意に、抗体または抗原結合断片は、ＴＬＲ２に特異的に結合し、かつ、抗体または抗原結合断片のＣＤ３２への結合とは独立してＴＬＲ２機能に拮抗する。
【0049】
任意に、抗体または抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖、および／または
配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖、または
その抗原結合断片を含む。
配列番号１３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖、および／または
配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖、または
その抗原結合断片を含む。
【0050】
任意に、抗体または抗原結合断片は、
配列番号８のアミノ酸配列、もしくは配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号９のアミノ酸配列、もしくは配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号８のアミノ酸配列、もしくは配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号９のアミノ酸配列、もしくは配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0051】
任意に、抗体が、抗ＴＬＲ２抗体Ｔ２．５のヒト化バージョン、またはその抗原結合断片である。
【0052】
任意に、抗体または抗原結合断片が、ＴＬＲ２がＴＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６またはＴＬＲ１０とヘテロ二量体を形成するかどうかにかかわらず、ＴＬＲ２の機能を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【発明を実施するための形態】
【0054】
本発明者らは、ＭＤＳの治療、特に以前の治療が失敗したときに役に立つことができる治療の必要性があることを確認した。
【0055】
本発明者らは、ＴＬＲ２アンタゴニスト、例えば、ＴＬＲ２中和抗体が、以前の治療に対して不応性または抵抗性であることが示されているＭＤＳを有するいくつかの対象を治療するために使用され得ることを示した。
【0056】
以前の治療は赤血球輸血であり得るか、または低メチル化剤（ＨＭＡ）、赤血球造血刺激剤（ＥＳＡ）、レナリドマイド、免疫療法剤、キナーゼ阻害剤、アクチビン受容体アンタゴニスト、プロテアソーム阻害剤、ステロイド、鉄キレート剤、抗好中球減少剤からなる群から選択される化合物の投与を含み得る。
【0057】
以前の治療は、赤血球造血刺激剤（ＥＳＡ）を伴うまたは伴わないアザシチジン（ＡＺＡ）またはデシタビンを用いるなどの低メチル化剤（ＨＭＡ）療法を含み得る。
【0058】
低メチル化剤はアザシチジンまたはデシタビンであり得る。赤血球生成促進剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはダルベポエチン（ＤＡＲ）であり得る。免疫療法剤は、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、シクロスポリンまたはチェックポイント阻害剤であり得る。例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）阻害剤、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤または細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤などである。ステロイドはプレドニゾロンであり得る。鉄キレート剤はエクジェイドであり得る。抗好中球減少薬はニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）であり得る。
【0059】
血液学的改善の形での全体的な奏効率は治療後に増加した。一部の対象が輸血の独立を達成したため、全体の奏効率は５０％増加した。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＴＬＲ２アンタゴニスト、例えばＴＬＲ２中和抗体による治療が、ＭＤＳを有する対象の血液学的プロファイルを改善し得ると予測している。特に、治療が失敗したことのある、リスクが低いまたは中程度－１の対象の血液学的プロファイルが改善されている。その効果は、ＨＭＡ療法を受けた対象などのＴＬＲ２の過剰発現を有する対象において特に観察される。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＭＤＳ対象において見出されるＴＬＲ２の過剰発現は、対象において観察されるＴＬＲ２アンタゴニストに対する応答に直接関係していると予測する。本発明者らはまた、ＭＤＳ対象と関連する様々な突然変異が、対象において観察された応答に直接的かつ個々に関連していると予測する。
【0060】
ＭＤＳの治療におけるＴＬＲ２抗体、特にＯＰＮ－３０５の使用の１つの注目すべき利点は、ＯＰＮ－３０５が既知のＭＤＳの治療と比較してはるかに望ましい安全性プロファイルを有することである。例えば、慢性赤血球輸血は、特に心不全、転倒、疲労、および生活の質の低下の結果として、罹患率の増加をもたらす慢性貧血に関連している。ＥＳＡによる治療は、脳卒中、心血栓塞栓症、血栓塞栓症のリスク増加と関連している可能性がある。アザシチジンによる治療は、好中球減少症、血小板減少症および貧血と関連している可能性がある。レナリドマイドによる治療は、好中球減少症および血小板減少症と関連しており、レナリドマイドは催奇形性物質である。
【0061】
さらに、既知のＭＤＳ治療と比較してＴＬＲ２アンタゴニストの投与頻度の減少を使用することができる。受容体占有データに基づいて、投薬は現在の毎週または毎月の投薬を超えて潜在的に延長され得る。任意に、投与頻度は２ヶ月毎に延長されてもよい。
【0062】
さらに、ＴＬＲ２中和抗体の形態のＴＬＲ２アンタゴニストを二次治療化合物、アザシチジンと組み合わせると、いずれかの薬剤単独での治療と比較して驚くべき相乗効果が観察された。特に、アザシチジンとＴＬＲ２アンタゴニストとの組み合わせは、ＭＤＳを有する対象の血液学的プロファイルを相乗的に改善し、そして生存率を増加させることが見られた。
【0063】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、抗体またはその抗原結合断片、ペプチドミメティック、核酸、炭水化物、脂質および小分子からなる群から選択される。
【0064】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは抗体またはその抗原結合断片である。典型的には、そのような抗体はヒトＴＬＲ２に対して結合特異性を有する。典型的には、抗体は、ＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基を含むエピトープに対する結合特異性を有する。場合により、抗体は、ヒトＴＬＲ２および／またはマウスＴＬＲ２上で上記で同定されたエピトープに結合する。
【0065】
例えば、ヒト型のＴＬＲ２の細胞外ドメインは、５８７個のアミノ酸残基、具体的には配列番号１として示され、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ３４１３３（URL www.ncbi.nlm.nih.gov）として定義される７８４アミノ酸全長ヒトＴＬＲ２配列のアミノ酸１～５８７を含む。抗ＴＬＲ２抗体は、ＴＬＲ２のリガンド結合領域に結合し得る。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２とトール様受容体１（ＴＬＲ１）またはトール様受容体６（ＴＬＲ６）との間の相互作用表面を覆うことによってＴＬＲ２とＴＬＲ１またはＴＬＲ６との二量体化を阻害または防止する。典型的には、結合領域／相互作用表面は、ＴＬＲ２のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）領域１１から１４内に位置する。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２のＬＲＲ領域１１～１４、またはそれに対して少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるエピトープに対する結合特異性を有する。
【0066】
任意に、ＴＬＲ２抗体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）またはＧｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、およびＨｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる不連続エピトープに結合する。
【0067】
任意に、ＴＬＲ２抗体は、配列番号１のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、およびＨｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる非連続エピトープに結合する。
【0068】
【0069】
任意に、ＴＬＲ２抗体は、マウスＴＬＲ２（配列番号２）のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ｇｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、およびＨｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる不連続エピトープに結合する。配列番号２は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３６０３５（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））として定義されるアミノ酸マウスＴＬＲ２配列を示す。
【0070】
【0071】
ヒトまたはマウスにおいて上記で同定されたエピトープは、受容体二量体化またはその阻害のための機能的エピトープである。典型的には、エピトープはＴＬＲ２アンタゴニスト抗体Ｔ２．５またはＯＰＮ－３０５によって結合されてもよい。抗体などの結合要素による同定されたエピトープの結合は、ＴＬＲ２の生物学的機能、特に活性化およびシグナル伝達の拮抗作用をもたらす。特に、結合メンバーによる結合は、ＴＬＲ２ヘテロ二量体が別のＴＬＲ、例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ６、ＴＬＲ４またはＴＬＲ１０と形成されるかどうかにかかわらず、ＴＬＲ２受容体の活性化を阻害するのに役立つ。さらに、このエピトープに結合する抗体は、ヒト、ブタおよびサル由来のＴＬＲ２と交差反応することが示されており、これは、これがＴＬＲ２の高度に保存された領域における重要なエピトープであることを示している。
【0072】
任意に、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ラクダ抗体、サメ抗体およびインビトロ抗体からなる群から選択される。任意に、抗原結合断片を使用することができる。 抗原結合断片は、前述の抗体のいずれに由来してもよい。任意に、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｄＡｂフラグメントからなる群から選択される。任意に、抗体は、２本の完全重鎖および２本の完全軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む。任意に、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ、またはそれらの抗原結合断片のものである。任意に、抗体がアイソタイプＩｇＧのものである場合、抗体はサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３、またはそれらの抗原結合断片のものであり得る。任意に、抗体はサブタイプＩｇＧ４のもの、またはその抗原結合断片である。抗体または抗原結合断片は、約１０－７Ｍ～約１０－１１Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＴＬＲ２上に存在する阻害性エピトープに結合し得る。より具体的には、抗体またはその抗原結合断片は、４×１０－８Ｍ以下のＫＤで哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＬＲ２に結合し得る。さらにより詳細には、抗体またはその抗原結合断片は、３×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＬＲ２に結合することができる。任意に、抗体は単離された抗体またはその抗原結合断片である。
【0073】
任意の適切なＴＬＲ２アンタゴニスト抗体を使用することができる。任意に、抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域相補性領域を含む重鎖可変領域および／またはハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域相補性領域を含む軽鎖可変領域を含む。任意に、抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ（配列番号３）を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）領域、アミノ酸配列Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（配列番号４）を含むＣＤＲ２領域、およびアミノ酸配列Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ（配列番号５）を含むＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、および／または、アミノ酸配列Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号６）を含むＣＤＲ１領域、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むＣＤＲ２領域、およびアミノ酸配列Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ（配列番号７）を含むＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。
【0074】
任意に、抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域および／またはハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域を含む。任意に、重鎖可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列、もしくは、配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも２０、最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むもしくはそれらからなる、および／または軽鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列、もしくは、配列番号９のアミノ酸配列の少なくとも２０、最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むもしくはそれらからなる。
【0075】
任意に、抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）に由来するマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体のヒト化バージョンの重鎖可変領域および／またはハイブリドーマクローンＴ２．５由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体のヒト化型の軽鎖可変領域および／またはヒト化バージョンの軽鎖可変領域（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）を含む。任意に、抗体または抗原結合断片は、ＷＯ２０１１／００３９２５に記載のＯＰＮ－３０５抗体の重鎖可変領域および／またはＷＯ２０１１／００３６２５に記載のＯＰＮ－３０５抗体の軽鎖可変領域を含む。任意に、抗体または抗原結合断片は、配列番号１０のアミノ酸配列、もしくは、配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも２０、および最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またははそれからなる軽鎖可変ドメイン、および／または配列番号１１のアミノ酸配列、もしくは、配列番号１１のアミノ酸配列の少なくとも２０、および最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる重鎖可変ドメインを含む。典型的には、抗体または抗原結合断片はＴＬＲ２に特異的に結合し、ＣＤ３２には結合しない。任意に、抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片のＴＬＲ２への結合とは独立してＴＬＲ２拮抗作用を媒介する。
【0076】
任意に、抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）に由来するマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体のヒト化バージョンの重鎖および／または、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）由来のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体のヒト化バージョンの軽鎖、またはその抗原結合断片を含む。任意に、抗体または抗原結合断片は、ＷＯ２０１１／００３９２５に記載のようなＯＰＮ－３０５抗体の重鎖および／またはＷＯ２０１１／００３９２５に記載のようにＯＰＮ－３０５抗体の軽鎖を含む。任意に、軽鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２の配列の少なくとも２０、および最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。および／または重鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３の配列の少なくとも２０、および最大全部のアミノ酸の長さにわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。任意に、抗体または抗原結合断片は完全ヒト化抗体である。任意に、重鎖の可変ドメインは、サブクラス免疫グロブリンＧ、アイソタイプ４の抗体に由来する定常ドメインに結合している。任意に、重鎖のヒンジ領域のアミノ酸残基２４１はセリン残基からプロリン残基に置換されている。任意に、抗体または抗原結合断片は、１×１０－８Ｍ以下のＫＤで哺乳動物のトール様受容体２に結合する。任意に、抗体または抗原結合断片は、４×１０－８Ｍ以下のＫＤで哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＬＲ２に結合する。任意に、抗体または抗原結合断片は、３×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＬＲ２に結合する。
【0077】
任意に、抗体または抗原結合断片はハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）に由来するか、またはそのヒト化バージョンである。任意に、抗体は、ハイブリドーマクローンＴ２．５（HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA：カタログ番号1054）に由来するマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体、またはそのヒト化バージョンもしくはその抗原結合断片である。任意に、そのヒト化バージョンは、ＷＯ２０１１／００３９２５に記載されているように、ＯＰＮ－３０５抗体である。
【0078】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、上記のような抗体もしくは抗原結合断片をコードする核酸、または該核酸を含むベクターを含む。
【0079】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸の発現を阻害する阻害性核酸である。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される。したがって、任意に、本発明は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）剤などの治療有効量の阻害性核酸、例えば、ＴＬＲ２タンパク質の発現を遮断するために、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）またはその転写鋳型、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡなどの対象への投与を提供する。任意に、阻害性核酸はアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。アンチセンスは遺伝子発現の抑制を引き起こし、そしてｍＲＮＡに物理的に結合し、従ってｍＲＮＡ翻訳を遮断する一本鎖ＲＮＡフラグメントを含む。阻害性核酸の調製技術は当業者に知られている。
【0080】
本発明者らはさらに、ＴＬＲ２の機能の抑制が、膜結合ＴＬＲ２に結合してそれを活性化するのに利用可能であるリガンドの量を減少させることによって達成され得ることを同定した。膜結合ＴＬＲ２を結合するのに利用可能なリガンドの量の減少は、ＴＬＲ２媒介シグナル伝達の下方制御をもたらす。したがって、任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは可溶性形態の組換えＴＬＲ２（ｓＴＬＲ２）、またはその機能的断片である。可溶性形態のＴＬＲ２は、ＴＬＲ２特異的結合リガンドについて膜結合形態のＴＬＲ２と競合する。この競合的結合は、可溶型のＴＬＲ２を有効に利用可能なＴＬＲ２リガンドを「モップアップ（mopping up）」し、それに関連して膜結合ＴＬＲ２の結合および活性化を減少させる。
【0081】
任意に、可溶性形態のＴＬＲ２は組換え技術によって調製される。可溶性形態のＴＬＲ２は、典型的には、ＴＬＲ２の細胞外ドメインのみを含み、したがって、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＣ ３４１３３（配列番号１）に定義されるようなＴＬＲ２の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインは存在しない。任意に、可溶型のＴＬＲ２は配列番号１のアミノ酸１から５８７を含む。可溶性ＴＬＲ２配列は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって改変することができる。したがって、任意に、可溶性形態のＴＬＲ２は、切断型の全長膜結合ＴＬＲ２アミノ酸配列に由来するか、またはＴＬＲ２の膜結合型における細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインに関連するアミノ酸残基の欠失および／もしくは置換に加えて、細胞外ドメインのアミノ酸残基にさらに欠失および／または置換を行ってもよい。ＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基のそのような切断または欠失および／または置換は、修飾型のＴＬＲ２が可溶性であり、ＴＬＲ２の膜結合型に存在する少なくとも１つのエピトープに結合することができるリガンドに結合することができる限り、なされ得る。
【0082】
任意に、可溶性形態のＴＬＲ２などのＴＬＲ２アンタゴニストは、造血細胞または造血細胞上に発現されたＴＬＲ２を標的とする。標的化は、局所送達、送達ベクターの使用、または造血細胞上に発現される細胞表面標的に対して結合特異性を有する抗体などの標的化手段などの当業者に公知の任意の適切な手段によるものであり得る。このようにＴＬＲ２アンタゴニストを標的とすることは、ＴＬＲ２アンタゴニストの全身投与がＴＬＲ２受容体の全体的な免疫抑制をもたらし、したがって場合によっては望ましくないことがあるＴＬＲ２媒介シグナル伝達をもたらすので有利である。可溶性形態のＴＬＲ２などのＴＬＲ２アンタゴニストの標的化は、融合タンパク質の形成を通して提供され得、前記融合タンパク質は、二次ペプチド、典型的には免疫グロブリンの重鎖に由来するＦｃ受容体結合タンパク質、典型的にはヒト免疫グロブリンに結合したＴＬＲ２アンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ２受容体の可溶性部分、典型的には細胞外ドメインまたはその一部）からなる。Ｆｃドメインは治療用タンパク質の循環半減期を延長するために広く使用されてきた。
【0083】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストはＴＬＲ２の細胞外ドメイン上に存在するエピトープに少なくとも１０－６Ｍの親和定数（Ｋａ）で結合する。
【0084】
本発明は、以前の治療による治療に対して不応性または抵抗性である対象における骨髄異形成症候群の治療において使用するための化合物を同定するためのスクリーニング方法におよび、該方法は、以下のステップ：
（ａ）候補化合物、例えば、ＴＬＲ２に対して結合特異性を有する抗体を提供し、
（ｂ）候補化合物をＴＬＲ２と接触させ、
（ｃ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）またはＧｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、Ｈｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）の領域内でＴＬＲ２に結合する化合物を同定することを含み、
ここで、この領域における結合は、以前の治療を受けた対象における骨髄異形成症候群の治療における化合物の有用性を示す。
（ａ）候補化合物、例えば、ＴＬＲ２に対して結合特異性を有する抗体を提供し、
（ｂ）候補化合物をＴＬＲ２と接触させ、
（ｃ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）またはＧｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、Ｈｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）の領域内でＴＬＲ２に結合する化合物を同定することを含み、
ここで、この領域における結合は、以前の治療を受けた対象における骨髄異形成症候群の治療における化合物の有用性を示す。
【0085】
本発明はさらに、以前の治療に対して不応性または抵抗性である対象における骨髄異形成症候群の治療に使用するための化合物を同定するためのスクリーニング方法にもおよび、該方法は、以下のステップ：
（ａ）ＴＬＲ２機能のアンタゴニストである候補化合物を提供し、例えば、ＴＬＲ２に対して結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片を提供し、
（ｂ）候補化合物をＴＬＲ２と接触させ、
（ｃ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）またはＧｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、Ｈｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）の領域内でＴＬＲ２に結合する化合物を同定することを含み、
ここで、この領域における結合は、以前の治療を受けた対象における骨髄異形成症候群の治療における化合物の有用性を示す。
（ａ）ＴＬＲ２機能のアンタゴニストである候補化合物を提供し、例えば、ＴＬＲ２に対して結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片を提供し、
（ｂ）候補化合物をＴＬＲ２と接触させ、
（ｃ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基Ｈｉｓ３１８（Ｈ、ヒスチジン）、Ｐｒｏ３２０（Ｐ、プロリン）、Ａｒｇ３２１（Ｒ、アルギニン）またはＧｌｎ３２１（Ｑ、グルタミン）、Ｔｙｒ３２３（Ｙ、チロシン）、Ｌｙｓ３４７（Ｋ、リジン）、Ｐｈｅ３４９（Ｆ、フェニルアラニン）、Ｌｅｕ３７１（Ｌ、ロイシン）、Ｇｌｕ３７５（Ｅ、グルタミン酸）、Ｔｙｒ３７６（Ｙ、チロシン）、Ｈｉｓ３９８（Ｈ、ヒスチジン）の領域内でＴＬＲ２に結合する化合物を同定することを含み、
ここで、この領域における結合は、以前の治療を受けた対象における骨髄異形成症候群の治療における化合物の有用性を示す。
【0086】
定義
本明細書で定義されるように、「トール様受容体２」はまた、ＴＬＲ２、ＴＬＲ－２またはＣＤ２８２とも呼ばれ得る。典型的には、ＴＬＲ２はヒトＴＬＲ２である。あるいは、ＴＬＲ２はマウスＴＬＲ２である。さらなる実施形態では、ＴＬＲ２は、ヒトまたはマウス以外の任意の哺乳動物、例えばウシまたはラットに由来するヒトＴＬＲ２のホモログまたはオルソログである。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、それが異なる種に由来するＴＬＲ２におけるＴＬＲ２機能の抑制を媒介するという点で交差反応性である。
本明細書で定義されるように、「トール様受容体２」はまた、ＴＬＲ２、ＴＬＲ－２またはＣＤ２８２とも呼ばれ得る。典型的には、ＴＬＲ２はヒトＴＬＲ２である。あるいは、ＴＬＲ２はマウスＴＬＲ２である。さらなる実施形態では、ＴＬＲ２は、ヒトまたはマウス以外の任意の哺乳動物、例えばウシまたはラットに由来するヒトＴＬＲ２のホモログまたはオルソログである。任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、それが異なる種に由来するＴＬＲ２におけるＴＬＲ２機能の抑制を媒介するという点で交差反応性である。
【0087】
本明細書で定義されるように、薬剤がＴＬＲ２の活性化または機能を抑制または遮断する場合、その薬剤は「ＴＬＲ２アンタゴニスト」である。薬剤は、ＴＬＲ２へのリガンドまたは結合化合物の結合を阻害または遮断し得る。ＴＬＲ２リガンド結合のこの阻害は、いくつかの手段、例えば、ＴＬＲ２の細胞外ドメインに結合し、そしてＴＬＲ２リガンド結合部位を部分的または完全に遮断することによって、または既知のＴＬＲ２リガンド結合部位以外の部位で結合し、ＴＬＲ２リガンド結合またはＴＬＲ２活性化を妨げる様式でＴＬＲ２リガンド結合部位が変化する結果となる、結合時の立体構造変化を誘導することにより、達成され得る。さらに、前記薬剤は、リガンド結合および／またはＴＬＲ２活性化後のＴＬＲ２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害または抑制し得る。ＴＬＲ２活性化およびシグナル伝達に続いて媒介される細胞内シグナル伝達は、転写因子の活性化および炎症誘発性免疫応答を媒介する遺伝子の発現をもたらす。薬剤は、例えば、ＴＬＲ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することによって、ＴＬＲ２タンパク質または遺伝子発現を抑制または遮断し得る。
【0088】
本明細書で定義されるように、ＴＬＲ２遺伝子発現に関して使用されるときの用語「ブロック」および「ブロッキング」は、ＴＬＲ２タンパク質の発現をもたらす少なくとも１つの遺伝子の発現をサイレンシングすることを意味する。遺伝子サイレンシングは、遺伝子改変以外のメカニズムによって遺伝子の発現を止めることである。遺伝子サイレンシングは、転写レベルまたは転写後レベルで媒介され得る。転写遺伝子サイレンシングは、転写機構にアクセスできない遺伝子をもたらし得、そして例えば、ヒストン修飾によって媒介され得る。転写後遺伝子サイレンシングは、破壊されている遺伝子のｍＲＮＡに起因し、したがってタンパク質などの活性遺伝子産物、この場合はＴＬＲ２タンパク質を妨げる。
【0089】
用語「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、非標的エピトープに結合するよりも高い親和性でＴＬＲ２上に存在する標的エピトープに結合するＴＬＲ２結合化合物の性能をいう。任意に、特異的結合は、非標的エピトープに対する親和性よりも少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍大きい親和性でＴＬＲ２上に存在する特定の標的エピトープへの結合を指す。結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、動的方法または平衡／溶液方法によって決定され得る。
【0090】
本明細書で定義されるように、「エピトープ」は、リガンド、小分子または抗体などの結合化合物によって認識され、それによって結合されることが可能である複数のアミノ酸残基を指す。エピトープは一般的に化学的に活性な表面基からなり、そしてエピトープの三次元構造に寄与する特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２の機能的活性に拮抗し、そしてそれ自体、阻害エピトープまたは阻害性エピトープとして知られるエピトープに結合する。「阻害」または「阻害性」エピトープとは、小分子または抗体などの結合化合物によって結合されると、例えば、ＴＬＲ２アゴニストによるＴＬＲ２の結合を妨げる結合化合物に起因する、ＴＬＲ２の生物学的活性の喪失をもたらす、ＴＬＲ２上に存在するエピトープを意味する。ＴＬＲ２上に存在し、そしてＴＬＲ２機能をアンタゴナイズするために結合化合物によって結合されるエピトープは、５個以上のアミノ酸残基を含み得る。
【0091】
本発明のＴＬＲ２アンタゴニストは、非隣接エピトープに結合する。「非隣接エピトープ」は、残基がポリペプチド配列の長さに沿って非連続的に間隔を空けてまたはグループ化されるように、整列が非線形である一連のアミノ酸残基からなるエピトープである。本明細書に記載の不連続エピトープは、エピトープに寄与する残基がＴＬＲ２ポリペプチドの長さに沿って配置された３つ以上のグループの直鎖状アミノ酸配列で提供される不連続の散在型エピトープである。
【0092】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」とは、動物、好ましくは哺乳動物、そして特にヒトを指す。
【0093】
本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、本発明が列挙された項目を必ず含み、本発明の基本的および新規な性質に実質的に影響を及ぼさない一覧にない項目を含むことができることを意味する。
【0094】
利用されるポリペプチド構成成分を記載するために使用される命名法は、アミノ基（Ｎ）が各アミノ酸残基の左側にそしてカルボキシル基が右側に示される従来の慣例に従う。
【0095】
本明細書で使用される「アミノ酸」という表現は、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方、およびＤアミノ酸とＬアミノ酸の両方を含むことを意図している。合成アミノ酸はまた、塩およびアミドなどのアミノ酸誘導体を含むがこれらに限定されない化学修飾アミノ酸も包含する。アミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはそれらの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく循環半減期を変えることができる他の化学基による置換によって修飾することができる。
【0096】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、ペプチド結合またはアイソスターなどの修飾ペプチド結合によって共有結合した一連の少なくとも２つのアミノ酸を表す。ペプチドまたはタンパク質を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。さらに、ポリペプチドという用語はペプチドの断片、類似体および誘導体にまで及んでおり、前記断片、類似体または誘導体は、その由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を保持している。
【0097】
さらに、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語はまた、融合ポリペプチド、融合ペプチドなどを意味すると解釈することができ、または免疫複合体とも呼ばれることがある。用語「融合タンパク質」は、２つ以上のサブユニット分子、典型的にはポリペプチドが共有結合または非共有結合している分子を指す。
【0098】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、例えば骨髄異形成症候群の少なくとも１つの症状の重症度を軽減することによって、例えば骨髄中の白血病芽細胞の濃度を下げることによって、血球数を増やすことによって、Ｔ制御性細胞応答を抑制することによって、および／またはＴｈ１応答を促進することによって、組成物またはＴＬＲ２アンタゴニストが投与される対象に利益を示すのに十分な量を意味する。
【0099】
本明細書で使用される場合、用語「治療」および「治療する」および「治療すること」などの関連用語は、例えば、骨髄中の白血病芽細胞の濃度を減少させることにより、血球数を増加させることにより、Ｔ調節細胞応答を抑制することによりおよび／またはＴｈ１応答を促進することにより、骨髄異形成症候群またはその少なくとも１つの症状の進行または重症度の低下を意味する。用語「治療」は、対象に利益をもたらし得る任意の計画を指す。治療は既存の骨髄異形成症候群に関連している可能性がある。治療は、治癒的、軽減的または予防的効果を含み得る。本明細書における「治療的」および「予防的」治療への言及は、それらの最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」とは、必ずしも対象が最終的には病状を縮小しないという意味ではない。
【0100】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0101】
本明細書を通して、文脈が他に要求しない限り、用語「備える（comprise）」もしくは「含む（include）」、または「備える（comprises）」もしくは「備えている」、「含む（includes）」または「含んでいる」などの変形は、述べられた整数または整数のグループの包含を意味すると理解されるが、他の整数または整数のグループを除外するものではない。
【0102】
本明細書で使用されているように、「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」などの用語は、文脈が明らかにそうでないと要求しない限り、単数形および複数形の指示物を含む。したがって、例えば、「活性物質」または「薬理学的活性物質」への言及は、単一の活性物質ならびに２つ以上の異なる活性物質の組み合わせを含み、一方、「担体」への言及は、２つ以上の担体ならびに単一の担体などの混合物を含む。
【0103】
国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）
ＭＤＳでリスクを定義する現在の標準的な方法は、国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）を使用することである。このシステムは、ＭＤＳが低リスクと高リスクのどちらに分類されるかを評価するために３つの基準を使用する。基準は以下のとおりである：
（i）骨髄中の白血病芽細胞、または未熟白血球の割合
（ii）骨髄細胞に染色体の変化があればその種類（細胞遺伝学）
（iii）１つ以上の低血球数（血球減少症）の存在。
ＭＤＳでリスクを定義する現在の標準的な方法は、国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）を使用することである。このシステムは、ＭＤＳが低リスクと高リスクのどちらに分類されるかを評価するために３つの基準を使用する。基準は以下のとおりである：
（i）骨髄中の白血病芽細胞、または未熟白血球の割合
（ii）骨髄細胞に染色体の変化があればその種類（細胞遺伝学）
（iii）１つ以上の低血球数（血球減少症）の存在。
【0104】
これら３つの要因に基づいてスコアが割り当てられる。スコアは４つのカテゴリのいずれかに分類される。これらには、低、中程度－１、中程度－２、および高リスクのカテゴリーが含まれる。低リスクと中程度リスク－１のカテゴリーは低リスクＭＤＳとみなされ、中程度リスク－２と高リスクのカテゴリーは高リスクＭＤＳとみなされる。
【0105】
改訂国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ－Ｒ）
「ＩＰＳＳ－Ｒ」として知られる改訂版のＩＰＳＳは、ＩＰＳＳと同じ病気の要因を網羅しているが、要因はより詳細な方法で特定されている。ＩＰＳＳ－Ｒは５つの疾患因子（芽球、細胞遺伝学、ヘモグロビン、絶対好中球数、血小板数）を示している。患者のＩＰＳＳ－Ｒリスクカテゴリーは、５つの疾患因子内の指定された値について個々のＩＰＳＳ－Ｒスコアを合計することによって決定される。その数は、患者を次の５つのＩＰＳＳ－Ｒリスクカテゴリの１つに一致させる。非常に低い、低い、中程度、高い、非常に高い。
「ＩＰＳＳ－Ｒ」として知られる改訂版のＩＰＳＳは、ＩＰＳＳと同じ病気の要因を網羅しているが、要因はより詳細な方法で特定されている。ＩＰＳＳ－Ｒは５つの疾患因子（芽球、細胞遺伝学、ヘモグロビン、絶対好中球数、血小板数）を示している。患者のＩＰＳＳ－Ｒリスクカテゴリーは、５つの疾患因子内の指定された値について個々のＩＰＳＳ－Ｒスコアを合計することによって決定される。その数は、患者を次の５つのＩＰＳＳ－Ｒリスクカテゴリの１つに一致させる。非常に低い、低い、中程度、高い、非常に高い。
【0106】
抗体
ＴＬＲ２アンタゴニストは抗体またはその抗原結合断片であり得る。「抗体」は、天然のものであれ、部分的または全体的に合成的に製造されたものであれ、免疫グロブリンである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、または抗体結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを包含する。これらは天然源由来とすることができ、あるいはそれらは部分的または全体的に合成的に製造されてもよい。抗体の例は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂまたはＦｄのような抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプサブクラスならびにフラグメント、および二重特異性抗体である。
ＴＬＲ２アンタゴニストは抗体またはその抗原結合断片であり得る。「抗体」は、天然のものであれ、部分的または全体的に合成的に製造されたものであれ、免疫グロブリンである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、または抗体結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを包含する。これらは天然源由来とすることができ、あるいはそれらは部分的または全体的に合成的に製造されてもよい。抗体の例は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂまたはＦｄのような抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプサブクラスならびにフラグメント、および二重特異性抗体である。
【0107】
任意に、抗体はラクダ抗体、特にラクダ重鎖抗体であり得る。さらに、抗体フラグメントは、ラクダ重鎖抗体由来のドメイン抗体またはナノボディであり得る。任意に、抗体はサメ抗体またはサメ由来の抗体であり得る。
【0108】
任意に、抗体は「単離された抗体」であり、これは抗体が（１）それが通常見出されるであろう少なくともいくつかのタンパク質を含まない、（２）同じ供給源由来の他のタンパク質を本質的に含まない、例えば 同じ種、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然には生じないことを意味する。
【0109】
抗体は多くの方法で修飾することができるので、「抗体」という用語は、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合要素または物質を網羅すると解釈されるべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、またはその断片、誘導体、機能的等価物もしくは相同体であり得る。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含み、これは天然のものでも全部または部分的に合成のものでもよい。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインまたは同等物を含むキメラ分子が含まれる。
【0110】
抗体の定常領域は、任意の適切な免疫グロブリンサブタイプのものであり得る。しかしながら、抗体サブタイプはＩｇＧ１であることが好ましい。 代替の実施形態では、抗体のサブタイプは、ヒト免疫グロブリン分子が使用されるクラスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥであり得る。そのような抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のような任意のサブクラスにさらに属し得る。
【0111】
抗体全体の断片は抗原結合の機能を果たすことができる。そのような結合断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１抗体ドメインを含むＦａｂ断片；単一抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメインとＶＬドメインは、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されているもの；二重特異性抗体であって、遺伝子融合によって構築された多価または多特異的断片であり得るものである。
【0112】
本発明で使用するための抗体またはポリペプチドの断片、例えば、ＴＬＲ２特異的抗体の断片は、一般に、少なくとも５～７個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７～９個の連続アミノ酸、典型的には少なくとも約９～１３個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０～３０個またはそれ以上の連続アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約３０～４０個またはそれ以上の連続アミノ酸の一続きのアミノ酸残基を意味する。
【0113】
そのような抗体もしくはポリペプチド、またはＴＬＲ２特異的抗体のフラグメントの「誘導体」は、例えば、タンパク質をコードする核酸の操作によって、またはタンパク質自体を改変することによって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることにより修飾された抗体もしくはポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のそのような誘導体は、好ましくはＴＬＲ２結合活性を有するペプチドを提供しながら、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含み得る。好ましくは、そのような誘導体は、２５個以下、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは４個以下、最も好ましくは１個または２個のアミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【0114】
ヒト化抗体を本発明において利用することができる。ヒト化抗体は、ＴＬＲ２特異的抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾抗体であり得る。従って、結合要素はヒト定常領域を含み得る。超可変領域以外の可変領域も、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、および／またはＴＬＲ２特異的抗体に由来してもよい。他の場合において、可変領域全体はマウスモノクローナルＴＬＲ２特異的抗体に由来し得、そして抗体はキメラ化されていると言われる。
【0115】
モノクローナル抗体および他の抗体を取り入れて、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生するために組換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域に導入することを含み得る。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、産生される抗体の結合特異性を変えても変えなくてもよい遺伝子変異または他の変化を受けやすい。
【0116】
任意に、治療有効量は、１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体を含む。任意に、治療有効量は、約５ｍｇ／ｋｇの量の抗体を含む。任意に、治療有効量は、抗体を約１０ｍｇ／ｋｇの量で含む。
【0117】
本発明は、本明細書に記載のＴＬＲ２抗体の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列の使用に及ぶ。そのような配列またはポリペプチドは、本明細書に記載のＴＬＲ２アンタゴニストのアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に相同な配列を含み得るが、１以上の欠失、挿入または置換のために異なるアミノ酸配列を有し得る。実質的に相同なポリペプチドは、１、２またはそれ以上のアミノ酸改変を含み得る。あるいは、またはさらに、実質的に相同なポリペプチドは、１、２またはそれ以上のアミノ酸によってトランケートされている、本明細書に記載のＴＬＲ２アンタゴニストのトランケート型からなることができる。任意に、配列同一性は、問題のアミノ酸配列の少なくとも２０、２５、３０、３５または４０アミノ酸の長さにわたる。任意に、配列同一性は、問題のアミノ酸配列の全長にわたる（例えば、配列番号８、９、１０、１１、１２および／または１３のうちのいずれか１つ）。
【0118】
所与のアミノ酸は、例えば、類似の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えられてもよい。そのような保存的置換の例には、１つの脂肪族残基の他のものへの置換、例えばｌｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａの相互置換；ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎの間などの、ある極性残基の別のものへの置換；または、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒなどの芳香族残基同士の置換；が含まれる。例えば、類似の疎水性特性を有する全領域の置換を含む、他の保存的置換はよく知られている。
【0119】
同様に、本明細書で使用するための核酸は、１つまたは複数の欠失、挿入または置換のために天然のＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性なポリペプチドをコードする変異体であり得る。
【0120】
本明細書中で使用される場合、パーセントアミノ酸配列同一性は、当業者に公知の任意の方法を使用して、例えば、Devereuxらによって記載されているＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することによって決定され得る（Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) and available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)）。
【0121】
抗体の生産
本発明における使用のための抗体は、多くの技術によって提供され得る。例えば、ファージディスプレイに基づくバイオパニングアッセイのようなコンビナトリアルスクリーニング技術を用いて、上記の結合エピトープに対して結合特異性を有するアミノ酸配列を同定することができる。そのようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面上の抗体結合フラグメントのディスプレイを介して免疫選択を模倣する手順において適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法において利用されるファージディスプレイライブラリーの使用を含む。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージはその後、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生に使用することができる。
本発明における使用のための抗体は、多くの技術によって提供され得る。例えば、ファージディスプレイに基づくバイオパニングアッセイのようなコンビナトリアルスクリーニング技術を用いて、上記の結合エピトープに対して結合特異性を有するアミノ酸配列を同定することができる。そのようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面上の抗体結合フラグメントのディスプレイを介して免疫選択を模倣する手順において適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法において利用されるファージディスプレイライブラリーの使用を含む。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージはその後、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生に使用することができる。
【0122】
さらなる実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であり、これは培養中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の適切な方法を使用して産生され得る。キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体は、本発明における使用のためにさらに提供される。特定の実施形態では、本発明で使用するための抗体は、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現によって産生され得る。
【0123】
任意に、モノクローナル抗体はトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスを用いて産生されるヒト抗体であってよく、トランスジェニックマウスは内因性マウス免疫グロブリン遺伝子の発現を欠失または抑制するように改変され、ヒト重鎖および軽鎖をコードする遺伝子座が優先的に発現され、これにより完全ヒト抗体の産生がもたらされる。
【0124】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、抗体から誘導される結合フラグメント、例えば抗体結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）である。
【0125】
任意に、ＴＬＲ２アンタゴニストは、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、合成された抗体または人工の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメント、天然または合成化合物またはペプチド模倣物を含む。
【0126】
本発明における使用のための抗体または抗原フラグメントはまた、全体的または部分的に化学合成によって生成され得る。抗体は、十分に確立された標準的な液体または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができ、その一般的な説明は広く利用可能であり、そして当業者に周知である。さらに、それらは溶液中で、液相法によって、または固相、液相および溶液化学の任意の組み合わせによって調製することができる。
【0127】
本発明における使用に適した抗体または抗体フラグメントを産生する別の便利な方法は、発現系において核酸を使用することによってそれらをコードする核酸を発現させることである。
【0128】
核酸
本発明に従って使用するための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして全体的または部分的に合成的であり得る。一態様では、本発明で使用するための核酸は、上で定義したような本発明の抗体または抗体断片をコードする。当業者は、本発明における使用に適した抗体または抗体フラグメントを提供するであろうそのような核酸への置換、欠失および／または付加を決定することができるであろう。
本発明に従って使用するための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして全体的または部分的に合成的であり得る。一態様では、本発明で使用するための核酸は、上で定義したような本発明の抗体または抗体断片をコードする。当業者は、本発明における使用に適した抗体または抗体フラグメントを提供するであろうそのような核酸への置換、欠失および／または付加を決定することができるであろう。
【0129】
本発明と共に使用するための抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列は、当業者によって容易に調製され得る。これらの技術は（ｉ）そのような核酸、例えば ゲノム源由来のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製を含む。抗体断片をコードするＤＮＡは、コード化ＤＮＡを採取し、発現させる部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定し、そしてＤＮＡから前記部分を切り出すことを含む、当業者に知られている任意の適切な方法で作製し使用することができる。次いで、その部分は、標準的な市販の発現システムにおいて適切なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。他の組換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅することである。配列に対する修飾は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、修飾ペプチドの発現をもたらすために、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン選択性を考慮に入れるために行うことができる。
【0130】
核酸は、上記のような少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物として含まれてもよい。構築物は、上記のように１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞内に含まれてもよい。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって都合よく達成され得る。発現による産生の後、抗体または抗体フラグメントは、任意の適切な技術を用いて単離および／または精製され、次いで必要に応じて用いられ得る。
【0131】
多種多様な宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系はよく知られている。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスミエローマ細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。 大腸菌のような原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は当該分野で十分に確立されている。培養中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に利用可能である。抗体を産生するための一般的な技術は当業者に周知である。
【0132】
本発明の任意選択で、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸。定義により、そのような核酸は、コーディング一本鎖核酸、前記コーディング核酸およびそれに対する相補的核酸からなる二本鎖核酸、またはこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含み得る。
【0133】
さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に存在する重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、またはそれらの変異体をコードする本物の配列を有する、酵素的または化学的に合成された核酸であり得る。
【0134】
抗体を改良するために組換えＤＮＡ技術を使用することができる。従って、キメラ抗体は、診断的または治療的用途においてその免疫原性を低下させるために構築され得る。さらに、例えばブタのようなトランスジェニック生物内の免疫原性は、ヒト化抗体と類似の技術においてＣＤＲ移植によって抗体を改変することによって最小限にすることができる。ヒトレシピエント内の免疫原性を低下させるために、本発明は、ヒト定常ドメインに融合した抗体の重鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸を使用することができる。同様に、ヒト定常ドメインカッパまたはラムダ領域に融合した抗体の軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも本発明と共に利用することができる。
【0135】
抗体はさらに、抗体の５つの人工レパートリーを産生するための抗体遺伝子の突然変異誘発によって生成され得る。この技術は抗体ライブラリーの調製を可能にする。抗体ライブラリーも市販されている。したがって、本発明は、免疫グロブリンの人工レパートリー、好ましくは人工ｓｃＦｖレパートリーを免疫グロブリン源として有利に使用して、上記のエピトープに対する特異性を有する結合分子を同定する。
【0136】
抗体選択システム
ＴＬＲ２のエピトープに結合することができ、したがって本発明の方法において使用することができる免疫グロブリンは、当業者に知られている任意の技術を使用して同定することができる。そのような免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから都合よく単離することができる。「レパートリー」とは、多数の結合特異性を提供するために、核酸レベルで１つまたは複数の鋳型分子のランダム、セミランダムまたは定方向変動によって生成された分子のセットを指す。レパートリーを生成するための方法は当技術分野において十分に特徴付けられている。
ＴＬＲ２のエピトープに結合することができ、したがって本発明の方法において使用することができる免疫グロブリンは、当業者に知られている任意の技術を使用して同定することができる。そのような免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから都合よく単離することができる。「レパートリー」とは、多数の結合特異性を提供するために、核酸レベルで１つまたは複数の鋳型分子のランダム、セミランダムまたは定方向変動によって生成された分子のセットを指す。レパートリーを生成するための方法は当技術分野において十分に特徴付けられている。
【0137】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術に代表されるように、当該分野において公知である。繊維状バクテリオファージの表面に多様なペプチド配列が提示されているそのような系は、標的抗原に結合する特異的抗体断片のインビトロ選択および増幅のための抗体断片（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であることが証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらをＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に誘導するリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結され、結果として、得られた抗体断片はバクテリオファージの表面に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合物として提示される。あるいは、抗体フラグメントは、ラムダファージキャプシド（ファージ体）上に外部的に提示される。ファージベースのディスプレイシステムの利点は、それらが生物学的システムであるため、選択されたライブラリーメンバーを含むファージを細菌細胞中で増殖させることによって単に選択されたライブラリーメンバーを増幅することができることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列はファージまたはファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作は比較的簡単である。
【0138】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は当技術分野において周知である。
【0139】
ファージまたは他のクローン化ライブラリーの使用に対する代替法は、選択された標的、上記のＴＬＲ２エピトープで免疫された動物のＢ細胞由来の核酸、好ましくはＲＮＡを使用することである。
【0140】
Ｖ領域およびＣ領域のｍＲＮＡの単離は、ＦａｂまたはＦｖのような抗体フラグメントを細胞内で発現させることを可能にする。簡潔には、ＲＮＡを免疫動物のＢ細胞、例えば免疫マウスの脾臓またはラマの循環Ｂ細胞から単離し、ＰＣＲプライマーを用いてＲＮＡプールからＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを選択的に増幅する。このようにして得られたＶＨおよびＶＬ配列を連結してｓｃＦｖ抗体を作製する。ＰＣＲプライマー配列は公表されているＶＨおよびＶＬ配列に基づいてもよい。
【0141】
ペプチド模倣薬
ペプチド模倣薬またはペプチド模倣物などのペプチド類似体は、鋳型ペプチドを代表する特性を有する非ペプチド化合物である。そのようなペプチド類似体は典型的にはコンピュータ化分子モデリングを用いて開発される。上記のＴＬＲ２結合エピトープに対して親和性および結合特異性を有するペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣薬は、類似の診断的、予防的および治療的効果を媒介するために使用され得る。
ペプチド模倣薬またはペプチド模倣物などのペプチド類似体は、鋳型ペプチドを代表する特性を有する非ペプチド化合物である。そのようなペプチド類似体は典型的にはコンピュータ化分子モデリングを用いて開発される。上記のＴＬＲ２結合エピトープに対して親和性および結合特異性を有するペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣薬は、類似の診断的、予防的および治療的効果を媒介するために使用され得る。
【0142】
ペプチド模倣薬は、典型的には鋳型ペプチドと構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法により、１つまたは複数のペプチド結合が代替結合によって置き換えられている。例えば、上記のＴＬＲ２エピトープに対する結合特異性を有するペプチドは、それがアミド結合置換、非ペプチド部分の組み込み、または骨格環化を含むように修飾されてもよい。適切にシステインが存在するならば、この残基のチオールは遊離硫酸基の損傷を防ぐためにキャップされる。ペプチドは、プロテアーゼの攻撃からペプチドを保護するために天然配列からさらに修飾されてもよい。
【0143】
適切には、本発明における使用のためのペプチドは、Ｃおよび／またはＮ末端キャッピング、および／またはシステイン残基キャッピングのうちの少なくとも１つを使用してさらに修飾され得る。適切には、本発明で使用するためのペプチドは、アセチル基でＮ末端残基をキャップすることができる。適切には、本発明において使用するためのペプチドは、アミド基でＣ末端をキャップすることができる。適切には、システインのチオール基はアセトアミドメチル基でキャップされている。
【0144】
ＴＬＲ２のエピトープおよびそのフラグメントを規定するポリペプチドの発現、単離および精製は、任意の適切な技術によって達成され得る。ポリペプチドを産生する方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下でポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、次いで培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、使用される宿主細胞の種類、およびポリペプチドが細胞内型、膜結合型、または宿主細胞から分泌される可溶性型のいずれであるかなどの要因によって変わることを認識するであろう。
【0145】
任意の適切な発現系が使用され得る。ベクターは、哺乳動物、鳥類、微生物、ウイルス、細菌、または昆虫の遺伝子に由来するものなどの適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本発明のポリペプチドまたはフラグメントをコードするＤＮＡを含む。調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列は機能的に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。所望の（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で複製する能力を付与する複製起点、およびそれによって形質転換体が同定される選択遺伝子は、一般に発現ベクターに組み込まれる。
【0146】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、ＤＮＡが最初に転写され、ｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるように、本発明の核酸配列にインフレームで融合させることができる。意図される宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは翻訳中にポリペプチドから切断されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。
【0147】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、高等真核細胞および酵母が含まれる。原核生物系も適している。哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は宿主細胞としての使用に特に好ましい。
【0148】
小分子
ＴＬＲ２受容体のアンタゴニストとして同定された物質は、ペプチドであっても天然では非ペプチドであってもよく、例えば前述のようなペプチド模倣物であってもよい。しかしながら、非ペプチド「小分子」は多くのインビボ医薬用途にしばしば好ましい。したがって、ＴＬＲ２結合化合物の模倣薬または模倣物は、本発明における使用のために設計され得る。
ＴＬＲ２受容体のアンタゴニストとして同定された物質は、ペプチドであっても天然では非ペプチドであってもよく、例えば前述のようなペプチド模倣物であってもよい。しかしながら、非ペプチド「小分子」は多くのインビボ医薬用途にしばしば好ましい。したがって、ＴＬＲ２結合化合物の模倣薬または模倣物は、本発明における使用のために設計され得る。
【0149】
既知の薬学的に活性な化合物に対する模倣物の設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発に対する既知のアプローチである。これは、活性化合物が合成するのが困難であるかまたは高価である場合、またはそれが特定の投与方法に不適切である場合に望ましいかもしれない。例えば、ペプチドは、消化管内に存在するプロテアーゼによって分解されるので、経口組成物および投与のための活性物質としてはあまり適していない。標的特性について多数の分子を無作為にスクリーニングすることを回避するために、模倣物設計、合成および試験を使用することができる。
【0150】
所与の標的特性を有する化合物からの模倣物の設計において一般的にとられるいくつかの工程がある。第一に、標的特性を決定する際に決定的および／または重要である化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変えることにより、例えば各アミノ酸残基を順次置換することにより行うことができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファーマコフォア」として知られている。
【0151】
ファーマコフォアが決定されると、その構造は、その物理的性質、例えば立体化学、結合、大きさおよび／または電荷に従って、例えば分光法、Ｘ線回折データおよびＮＭＲのような一連の情報源からのデータを用いてモデル化される。計算分析、類似性マッピング（原子間の結合ではなくファルマコフォアの電荷および／または体積をモデル化する）、ならびに他の技術もこのモデル化プロセスにおいて使用することができる。
【0152】
このアプローチの変形では、ＴＬＲ２結合化合物の三次元構造がモデル化されている。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが結合時に立体構造を変化させる場合に特に有用であり得、モデルが模倣物の設計を考慮に入れることを可能にする。
【0153】
次いで、ファーマコフォアを模倣する化学基をグラフトすることができる鋳型分子を選択する。鋳型分子およびそれにグラフトされた化学基は、模倣物が合成しやすく、薬理学的に許容されそうであり、そしてリード化合物の生物学的活性を保持しながらインビボで分解しないように都合よく選択され得る。次いで、このアプローチによって見いだされた１つまたは複数の模倣物は、それらが標的特性を有するかどうか、またはそれらがどの程度それを示すかを調べるためにスクリーニングされ得る。次いで、インビボまたは臨床試験のための１つ以上の最終模倣物に到達するためにさらなる最適化または改変を実施することができる。
【0154】
模倣物結合化合物は、薬物スクリーニングプログラムにおいて使用される天然または合成の化学化合物であり得る。いくつかの特徴づけられたまたは特徴付けられていない成分を含む植物の抽出物もまた使用され得る。
【0155】
コンビナトリアルライブラリー技術は、それらがエピトープに結合する能力またはエピトープに結合するリガンドの活性を調節する能力について潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。活性の調節についてスクリーニングされる前に、またはそれと同様に、例えば酵母ツーハイブリッドシステムにおいて、試験物質をポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングすることができる（これは、ポリペプチドおよび試験物質の両方がコード核酸から酵母において発現され得ることを必要とする）。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前の粗いスクリーニングとして使用され得る。
【0156】
アッセイに添加され得る試験物質または化合物の量は、通常、使用される化合物の種類に応じて試行錯誤によって決定されるであろう。典型的には、約０．０１から１００ｎＭの濃度、例えば０．１から１０ｎＭの推定上の阻害化合物を使用することができる。ペプチドが試験物質であるとき、より高い濃度が使用され得る。
【0157】
投与
ＴＬＲ２アンタゴニストは単独で投与することができるが、意図する投与経路に応じて選択される適当な製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を一般に含む医薬組成物として投与するのが好ましい。適切な医薬担体の例には、水、グリセロール、エタノールおよび他のＧＲＡＳ試薬が含まれる。
ＴＬＲ２アンタゴニストは単独で投与することができるが、意図する投与経路に応じて選択される適当な製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を一般に含む医薬組成物として投与するのが好ましい。適切な医薬担体の例には、水、グリセロール、エタノールおよび他のＧＲＡＳ試薬が含まれる。
【0158】
ＴＬＲ２アンタゴニストは、治療を必要とする対象に任意の適切な経路で投与することができる。本明細書に詳述されるように、組成物は注射または注入によって非経口的に投与されることが好ましい。非経口投与のための好ましい経路の例には、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜および経皮が含まれるが、これらに限定されない。組成物は吸入により投与することができる。投与経路はさらに、局所的および経腸的、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、直腸を含み得る。
【0159】
組成物は注射用組成物として送達することができる。静脈内、筋肉内、皮内または皮下適用のためには、活性成分は発熱物質を含まずそして適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形であろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含めることができる。
【0160】
組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達システム、または血液を含む特定の組織に入れられた徐放製剤を介して投与されてもよい。
【0161】
実際に投与される用量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療されている状態の性質および重症度、並びに、治療対象の年齢、性別、体重、投与経路などの要素に依存し、そしてそれらを適切に参照して決定され得る。組成物の特性、例えば、その結合活性およびインビボ血漿寿命、製剤中のアンタゴニストの濃度、ならびに経路、部位および送達速度について、さらに十分な考慮を払うべきである。
【0162】
投与計画は、本発明の組成物の単回投与、または組成物の複数回投与量を含み得る。組成物はさらに、骨髄異形成症候群の治療に使用される他の治療薬および医薬品と順次または別々に投与することができる。
【0163】
組成物は、単回投与または反復投与として投与することができる。対象に投与することができる投与計画の例は、１μｇ／ｋｇ／日～２０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１５ｍｇ／ｋｇ／日、２．５ｍｇ／ｋｇ／日～１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲を含むがこれらに限定されない群から選択することができる。一実施形態において、１日量は約５ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、１日量は１０ｍｇ／ｋｇである。
【0164】
ＴＬＲ２アンタゴニストは、例えば、１日当たり対象の体重の約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に経口投与することができる。場合により、ＴＬＲ２アンタゴニストの用量は５ｍｇ／ｋｇである。場合により、ＴＬＲ２アンタゴニストの投与量は１０ｍｇ／ｋｇである。典型的には、ＴＬＲ２アンタゴニストは、ＴＬＲ２のレベルおよび／または活性を下方制御するのに十分な時間および条件下で対象に投与される。
【0165】
任意に、対象は、単独療法として５ｍｇ／ｋｇのＴＬＲ２アンタゴニストの開始用量を受けることができる。治療は、用量を同じままにするか、または１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇに増やして継続することができる。用量を１．５ｍｇ／ｋｇに減らすか、頻度を４週間から８週間に減らすこともできる。各対象は有効性評価を受けることができ、そして細胞学的反応または輸血の必要性に関して個々の対象において完全な反応／寛解が見られる場合、それらは単独療法としてＯＰＮ－３０５を受け続けることができる。個々の対象が適切に反応したとは考えられない場合は、ＯＰＮ－３０５に加えてＡＺＡなどの低メチル化剤を投与される可能性がある。
【0166】
候補化合物
本発明は、骨髄異形成症候群の治療において使用するための化合物を同定するためのアッセイ方法を提供する。この方法は、Ｔ２．５抗体およびＯＰＮ－３０５抗体によって結合されるのと同じＴＬＲ２上の同じエピトープに結合する化合物を同定することを含む。
本発明は、骨髄異形成症候群の治療において使用するための化合物を同定するためのアッセイ方法を提供する。この方法は、Ｔ２．５抗体およびＯＰＮ－３０５抗体によって結合されるのと同じＴＬＲ２上の同じエピトープに結合する化合物を同定することを含む。
【0167】
場合により、候補化合物は、ペプチド、例えば抗体または抗体フラグメント、化学化合物およびペプチド模倣物からなる群から選択される。任意に、候補化合物は薬物スクリーニングプログラムで使用される天然または合成化合物である。いくつかの特徴づけられたまたは特徴付けられていない成分を含む植物の抽出物を使用することができる。
【0168】
候補化合物スクリーニングアッセイの正確な形式は、日常的な技術および知識を用いて当業者によって変更され得る。コンビナトリアルライブラリー技術は、エピトープに結合する能力について潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。アッセイに添加され得る候補化合物の量は、通常、使用される化合物の種類に応じて試行錯誤によって決定されるであろう。典型的には、約０．０１から１００ｎＭの濃度、例えば０．１から１０ｎＭの候補化合物を使用することができる。候補結合化合物がペプチドである場合、より高い濃度を使用することができる。本明細書に記載の結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有する候補化合物は、骨髄異形成症候群の治療において単離および／または精製、製造および／またはＴＬＲ２機能活性の調節に使用することができる。
【0169】
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は説明の目的で提供されており、本発明を限定するものとして解釈されることを意図しない。
【0170】
実施例
本発明者らは、赤血球刺激剤またはアザシチジンまたはデシタビンの有無にかかわらず、以前の治療が失敗した低リスク（低および中程度－１）ＭＤＳ患者により、患者におけるＯＰＮ－３０５の安全性、耐容性および有効性を評価する二部（two‐part）、単一施設、非無作為化、第Ｉ／ＩＩ相試験を実施した。
本発明者らは、赤血球刺激剤またはアザシチジンまたはデシタビンの有無にかかわらず、以前の治療が失敗した低リスク（低および中程度－１）ＭＤＳ患者により、患者におけるＯＰＮ－３０５の安全性、耐容性および有効性を評価する二部（two‐part）、単一施設、非無作為化、第Ｉ／ＩＩ相試験を実施した。
【0171】
方法
本発明者らは、ＨＭＡを用いた以前の治療に失敗した後のＩＰＳＳによって特徴付けられる低または中等度１のリスクのＭＤＳを有する患者に対するＯＰＮ－３０５の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を設計した。孤立デル（５ｑ）患者はレナリドマイドによる治療を受けていた。ＡＭＬまたは同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏＳＣＴ）の既往歴のある患者は調査から除外した。ＯＰＮ－３０５は血液悪性腫瘍患者ではこれまで使用されていなかったため、この調査では最大９サイクルにわたり４週間ごとに５ｍｇ／ｋｇの用量でＯＰＮ－３０５を使用したＮ＝１０患者の初期フェーズがあった。過剰な毒性または進行が見られない限り、治療を繰り返した。１６週間の治療後も反応がなかった場合は、３日間のスケジュールでアザシチジンをＯＰＮ－３０５に追加した。反応は、改訂された２００６年のＩＷＧ基準に従って評価された。この初期コホートにより、毒性の評価、薬物動態分析、受容体占有率、およびサイトカインプロファイルの逐次分析が可能になった。結果に応じて、毎月１０ｍｇ／ｋｇへの用量漸増がＮ＝５ｐｔｓの第２のコホートで開始された。
本発明者らは、ＨＭＡを用いた以前の治療に失敗した後のＩＰＳＳによって特徴付けられる低または中等度１のリスクのＭＤＳを有する患者に対するＯＰＮ－３０５の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を設計した。孤立デル（５ｑ）患者はレナリドマイドによる治療を受けていた。ＡＭＬまたは同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏＳＣＴ）の既往歴のある患者は調査から除外した。ＯＰＮ－３０５は血液悪性腫瘍患者ではこれまで使用されていなかったため、この調査では最大９サイクルにわたり４週間ごとに５ｍｇ／ｋｇの用量でＯＰＮ－３０５を使用したＮ＝１０患者の初期フェーズがあった。過剰な毒性または進行が見られない限り、治療を繰り返した。１６週間の治療後も反応がなかった場合は、３日間のスケジュールでアザシチジンをＯＰＮ－３０５に追加した。反応は、改訂された２００６年のＩＷＧ基準に従って評価された。この初期コホートにより、毒性の評価、薬物動態分析、受容体占有率、およびサイトカインプロファイルの逐次分析が可能になった。結果に応じて、毎月１０ｍｇ／ｋｇへの用量漸増がＮ＝５ｐｔｓの第２のコホートで開始された。
【0172】
合計１５人の患者が登録され、１１人が最初の５ｍｇの投与量で、４人が１０ｍｇ／ｋｇの投与量であった。
【0173】
すべての患者が毒性について評価可能であり、そして１２人（８０％）が反応について評価可能であった。
【0174】
患者の特徴を表１に示す。年齢の中央値は７３歳（範囲４８～８７）であった。３人（２０％）の患者はＩＰＳＳにより低リスクとして分類され、１２人（８０％）は中程度－１リスクとして分類された。７人の患者は正常核型、２人はｄｅｌ（５ｑ）、２人はトリソミー８、１人はｄｅｌ（２０ｑ）、１人はモノソミーＹおよび２人は他の単一または二重異常を有していた。過去の治療の中央値は２であり（１～４の範囲）、以前の治療の中央期間は２８か月（４～６２の範囲）であった（図１）。
【0175】
登録前に、合計１３人（８７％）の患者が赤血球の輸血依存性であった。
【0176】
【表1】
表１：ＷＢＣ＝白血球数。ＡＮＣ＝絶対好中球数。ＭＤＳ－ＳＬＤ＝単系統異形成を伴うＭＤＳ。ＭＤＳ－ＲＳ＝環状の芽細胞を伴うＭＤＳ。ＭＤＳ－ＭＬＤ＝多系統形成異常を伴うＭＤＳ。ＭＤＳ－ＥＢ＝過剰な芽球（ｂｌａｓｔ）を伴うＭＤＳ。ＭＤＳ－Ｕ＝分類できないＭＤＳ。ＩＰＳＳ＝国際予後スコアリングシステム。ＩＰＳＳ－Ｒ＝改訂国際予後スコアリングシステム。
【0177】
結果
追跡期間中央値は８ヶ月であった。投与されたサイクルの中央値は５（患者２～１７）であり、１６週の治療後にアザシチジンの追加を受けた５人の患者（３３％）がいた。合計５人の患者（４２％）がＯＰＮ－３０５に関連する有害事象（ＡＥ）を発症した。すべての有害事象はグレード１であり、胃腸障害が最も多かった（３３％）。過剰な感染性合併症を伴うことなく、重大な薬物関連毒性は報告されていない。
追跡期間中央値は８ヶ月であった。投与されたサイクルの中央値は５（患者２～１７）であり、１６週の治療後にアザシチジンの追加を受けた５人の患者（３３％）がいた。合計５人の患者（４２％）がＯＰＮ－３０５に関連する有害事象（ＡＥ）を発症した。すべての有害事象はグレード１であり、胃腸障害が最も多かった（３３％）。過剰な感染性合併症を伴うことなく、重大な薬物関連毒性は報告されていない。
【0178】
調査の最初のコホートでは、患者は５ｍｇ／ｋｇのＯＰＮ－３０５を投与された。５／１０の適格患者が反応し、１つの大きな反応と４つの小さな反応であった。
【0179】
調査の第二段階では、患者は１０ｍｇ／ｋｇのＯＰＮ－３０５を投与された。２サイクル以上のＯＰＮ－３０５単独療法を受けた適格患者のうち、２／５人が主要な反応を示し、２／５人が安定した疾患を示し、１／５が軽度の反応を示した。
【0180】
赤血球反応の定義（ＨＩ－Ｅ）
主要な反応：
・治療前のヘモグロビンが１１ｇ／ｄＬ未満の患者では、
ヘモグロビンが２ｇ／ｄＬを超えて増加する。
・ＲＢＣ輸血依存患者に対して、輸血非依存
軽度の反応：
・治療前のヘモグロビンが１１ｇ／ｄＬ未満の患者では、
ヘモグロビンが１～２ｇ／ｄＬ増加する。
・ＲＢＣ輸血依存患者の場合、輸血必要量が５０％減少
安定した疾患
・安定した疾患は、ＩＷＧ０６の基準に従って定義される：
８週間以内に進行しない。
主要な反応：
・治療前のヘモグロビンが１１ｇ／ｄＬ未満の患者では、
ヘモグロビンが２ｇ／ｄＬを超えて増加する。
・ＲＢＣ輸血依存患者に対して、輸血非依存
軽度の反応：
・治療前のヘモグロビンが１１ｇ／ｄＬ未満の患者では、
ヘモグロビンが１～２ｇ／ｄＬ増加する。
・ＲＢＣ輸血依存患者の場合、輸血必要量が５０％減少
安定した疾患
・安定した疾患は、ＩＷＧ０６の基準に従って定義される：
８週間以内に進行しない。
【0181】
図２に示すように、現在３人の患者が赤血球輸血に依存しておらず、さらにヘモグロビンレベルの上昇を示しまたは維持している（図３）。これらの患者の場合、ＩＷＧ０６基準による主要な血液学的反応が、単独療法としてのＯＰＮ－３０５治療で注目されている。２人の患者の場合、ＩＷＧ０６基準による軽度の血液学的反応が、ＯＰＮ－３０５とアザシチジンの併用治療で認められている。
【0182】
これまでの評価可能な患者（ｎ＝１５）における全体的な反応は以下の通りである：
・３／１５（２０％）の主要な反応（輸血とは無関係、
３名の患者すべてに単独療法としてのＯＰＮ－３０５治療）
・５／１５（３３．３％）軽度の反応
（併用療法として２／５ ＯＰＮ－３０５とＡＺＡＡ、
単独療法として３／５ ＯＰＮ－３０５）
・６／１５（４０％）安定した疾患
（併用療法として３／５ ＯＰＮ－３０５とＡＺＡ
単独療法として３／５ ＯＰＮ－３０５）
・３／１５（２０％）の主要な反応（輸血とは無関係、
３名の患者すべてに単独療法としてのＯＰＮ－３０５治療）
・５／１５（３３．３％）軽度の反応
（併用療法として２／５ ＯＰＮ－３０５とＡＺＡＡ、
単独療法として３／５ ＯＰＮ－３０５）
・６／１５（４０％）安定した疾患
（併用療法として３／５ ＯＰＮ－３０５とＡＺＡ
単独療法として３／５ ＯＰＮ－３０５）
【0183】
全体的な反応率（主要＆軽度）：８／１５（５３％）
コンパッショネートユースでの１８サイクルを伴う調査期間中の患者の最大８サイクルの反応期間。
コンパッショネートユースでの１８サイクルを伴う調査期間中の患者の最大８サイクルの反応期間。
【0184】
５～１０ｍｇ／ｋｇの間の平均ＯＰＮ－３０５曝露（ＡＵＣ）には用量に比例した増加があった。Ｎ＝２の対象において５ｍｇ／ｋｇで反復投与した後のＰＫプロファイルおよび他の対象における投与前（トラフ）レベルは、蓄積の可能性におけるいくらかの変動性を示した。血中ＰＢＭＣおよび骨髄吸引液中のＴＬＲ－２受容体の占有は、ＯＰＮ－３０５投与後に採取された実質的にすべての試料において本質的に完全であった。治療に関連する抗薬物抗体の証拠はない。ベースラインと比較して、治療後、レスポンダーまたは非レスポンダー間、またはＯＰＮ－３０５投与に基づいて観察される、ＩＬ－２３、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）およびＩＬ－８レベルの統計的に有意な動的変化はなかった。
【0185】
ＯＰＮ－３０５の単回および反復投与後のＴＬＲ２血液受容体占有率
ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５を単回および反復投与した後のＴＬＲ２血液受容体占有率を測定した。５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後２８日間、完全な受容体占有率が維持された（図４Ａ）。これらの結果は、健康な志願者における同じ用量での結果と一致していた。トラフ（投与前）に４週間毎にＩＶ投与を繰り返す（図４Ｂ）。治療関連の抗薬物抗体の証拠はなかった。
ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５を単回および反復投与した後のＴＬＲ２血液受容体占有率を測定した。５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後２８日間、完全な受容体占有率が維持された（図４Ａ）。これらの結果は、健康な志願者における同じ用量での結果と一致していた。トラフ（投与前）に４週間毎にＩＶ投与を繰り返す（図４Ｂ）。治療関連の抗薬物抗体の証拠はなかった。
【0186】
ＯＰＮ－３０５の反復投与後のＴＬＲ２骨髄受容体占有率
ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５を繰り返し投与した後のＴＬＲ２骨髄受容体占有率を測定した。８および１６週目に５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの両方の用量で完全な受容体占有が示された（図５）。
ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５を繰り返し投与した後のＴＬＲ２骨髄受容体占有率を測定した。８および１６週目に５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの両方の用量で完全な受容体占有が示された（図５）。
【0187】
単回および反復投与後の血清ＯＰＮ－３０５濃度
単回および反復投与後のＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５の血清濃度を決定した。１０ｍｇ／ｋｇでの平均用量正規化暴露は５ｍｇ／ｋｇで見られたそれの２倍である（図６Ａ）。この用量超過比例は健康なボランティアにも見られる。これは、低濃度でのクリアランスが速いことを反映しているようである。トラフ（投与前）血清濃度（４週目と比較して）は５ｍｇ／ｋｇの反復投与で増加した。値を介した個々の対象は血清濃度を超えたままであり、完全な受容体占有率を引き出すと予想される（図６Ｂ）。
単回および反復投与後のＴＬＲ２抗体ＯＰＮ－３０５の血清濃度を決定した。１０ｍｇ／ｋｇでの平均用量正規化暴露は５ｍｇ／ｋｇで見られたそれの２倍である（図６Ａ）。この用量超過比例は健康なボランティアにも見られる。これは、低濃度でのクリアランスが速いことを反映しているようである。トラフ（投与前）血清濃度（４週目と比較して）は５ｍｇ／ｋｇの反復投与で増加した。値を介した個々の対象は血清濃度を超えたままであり、完全な受容体占有率を引き出すと予想される（図６Ｂ）。
【0188】
対象におけるＴＬＲ２の発現レベルの影響
反応しなかった患者と比較して、ＯＰＮ－３０５治療に反応した患者ではＴＬＲ２の発現が増加している。ＴＬＲ２の相対ＲＮＡレベルは、治療に反応しなかった対象に対して治療に反応した対象で増加する（図７）。
反応しなかった患者と比較して、ＯＰＮ－３０５治療に反応した患者ではＴＬＲ２の発現が増加している。ＴＬＲ２の相対ＲＮＡレベルは、治療に反応しなかった対象に対して治療に反応した対象で増加する（図７）。
【0189】
結論
以前に治療された低リスクＭＤＳの患者におけるＯＰＮ－３０５による治療は、有意な毒性がなく、全体の奏効率が５０％で、忍容性は良好であった。相関研究は、反応とサイトカインレベルの間に相関がなく、適切な受容体占有率を示唆している。
以前に治療された低リスクＭＤＳの患者におけるＯＰＮ－３０５による治療は、有意な毒性がなく、全体の奏効率が５０％で、忍容性は良好であった。相関研究は、反応とサイトカインレベルの間に相関がなく、適切な受容体占有率を示唆している。
【0190】
５ｍｇ／ｋｇで５／１０の適格患者が反応を示し（主要１回、軽度４回）、現在１０ｍｇ／ｋｇで２サイクルを超えるＯＰＮ－３０５単独療法を受けた患者が、２／５の適格患者は主要な反応を示した）、２／５は安定した疾患、そして１／５は軽度の反応を示した。
【0191】
本明細書中で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の実施形態に対する修正および変形は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかである本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、本発明によって包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【配列表】