特許 7221297 ヒトの線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-03

(45)【発行日】2023-02-13

(54)【発明の名称】ヒトの線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/22 20060101AFI20230206BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20230206BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20230206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 31/77 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 45/08 20060101ALI20230206BHJP

   A61L 27/18 20060101ALI20230206BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20230206BHJP

   A61L 27/48 20060101ALI20230206BHJP

【ＦＩ】

A61L27/22

A61K38/36

A61P19/00

A61P43/00 121

A61K38/48 100

A61K31/77

A61K45/08

A61L27/18

A61L27/52

A61L27/48

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2020556214

(86)(22)【出願日】2018-12-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-03-25

(86)【国際出願番号】 KR2018016892

(87)【国際公開番号】W WO2019132604

(87)【国際公開日】2019-07-04

【審査請求日】2020-06-29

(31)【優先権主張番号】10-2017-0183688

(32)【優先日】2017-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520236745

【氏名又は名称】ビーイーエフ、メディカル、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100188651

【弁理士】

【氏名又は名称】遠藤 広介

(72)【発明者】

【氏名】アン、スン、ウク

【審査官】井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６６７３５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２８８５６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０１３４２９１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００１０１１４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／０２８２５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／００５９７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０２７５９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００５－１７０８１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１１２１７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１２－００４６４３０（ＫＲ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１６８４２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】ASAIO Journal，2010年，Vol.56, No.6，p.563-568

【文献】Acta Biomaterialia，2011年，Vol.7，p.2418-2427

【文献】界面活性剤 製品一覧，株式会社ＡＤＥＫＡ，2013年，p.4

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ、Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ、ＰＥＯ）もしくはポロキサマーと、を含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物。

【請求項2】

前記線維軟骨または弾性軟骨は、椎間板軟骨（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ）、恥骨結合（ｓｙｍｐｈｙｓｉｓ ｐｕｂｉｓ）、半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、関節内の線維軟骨複合体（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、顎関節軟骨、胸鎖関節（ｓｔｅｒｎｏｃｌａｖｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ ）の関節円板、寛骨臼唇（ａｃｅｔａｂｕｌａｒ ｆｏｓｓａ）、外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）、喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）および喉頭軟骨からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物。

【請求項3】

前記ハイドロゲルは、トリプシン分解抵抗性を有することを特徴とする請求項１に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物。

【請求項4】

前記ハイドロゲルは、１００ｒａｄｉａｎ／ｓｅｃの条件下で１５～４０ｋＰａのせん断弾性率または１０～２００ｋＰａの圧縮弾性率を有することを特徴とする請求項１に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物。

【請求項5】

多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物。

【請求項6】

請求項１～５のうちいずれか一項の組成物を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用スキャフォールド。

【請求項7】

フィブリノゲン溶液を含む第１区画と、ならびにトロンビンおよびポリエチレンオキシドもしくはポロキサマーを含む第２区画を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項8】

前記第１区画は、多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項9】

前記フィブリノゲンは、１０～１０００ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする請求項７に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項10】

前記トロンビンは、１００Ｕ／ｍｌ～５０００Ｕ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする請求項７に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項11】

前記ポリエチレンオキシドが、２～２０％（ｗ／ｖ）含まれることを特徴とする請求項７に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項12】

前記ポロキサマーが、２～４０％（ｗ／ｖ）含まれることを特徴とする請求項７に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項13】

前記キットは、ダブルシリンジ型であることを特徴とする請求項７～１２のうちいずれか一項に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用キット。

【請求項14】

１）フィブリノゲン１０～１０００ｍｇ／ｍｌを、第１溶液として準備する段階と、
２）トロンビンおよび生理活性高分子を混合して第２溶液を準備する段階であって、前記生理活性高分子がポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポロキサマーである段階と、を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物の製造方法。

【請求項15】

３）前記第１溶液と第２溶液とを混合し、フィブリンと生理活性高分子が相互侵入高分子ネットワーク（ＩＰＮ）構造を形成する線維軟骨または弾性軟骨再生用ハイドロゲルを製造する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物の製造方法。

【請求項16】

前記１）段階の第１溶液は、多血小板血漿をさらに含み、フィブリノゲンと多血小板血漿を１：１～１：２の体積比で混合する段階を含むことを特徴とする請求項１４に記載の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物の製造方法。

【請求項17】

フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）もしくはポロキサマーを含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項18】

前記線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患は、椎間円板ヘルニア、恥骨間円板損傷、顎関節損傷、胸鎖関節の関節円板損傷、手首関節の三角線維軟骨複合体破裂、尺骨突き上げ症候群、退行性関節炎、半月板損傷、リウマチ関節炎、外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）欠損、および喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）または喉頭軟骨欠損からなる群から選択された１種以上である請求項１７に記載の線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、線維軟骨または弾性軟骨を再生する、並びに治療するための組成物、キット、及びこれを用いた再生方法に関する。

【背景技術】

【0002】

軟骨は、他の結合組織のように結合組織細胞と細胞外基質からなるが、固有結合組織とは異なり、硬いながらも、ある程度柔軟性のある基質を含有した特殊な結合組織である。軟骨は、軟骨基質を構成する繊維の種類と特性に応じて、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）および線維軟骨（ｆｉｂｒｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に分類される。硝子軟骨は、主にＩＩ型コラーゲンを含有しており、最も一般的な種類の軟骨である。ＩＩ型コラーゲンは、ほとんど微細線維（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｓ）の形で表れ、無形質の主成分であるプロテオグリカンと屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘ）がほぼ同じであるので、繊維成分と無形質は、均一な物質であることが観察される。

【0003】

弾性軟骨は、基質内に弾力線維が豊富であるという点で、硝子軟骨と区別される。線維軟骨は、他の軟骨に比べて無形質が少なく、膠原線維が多く、これらの線維は、ほとんど一定方向に配列している。線維軟骨を構成する膠原線維の膠原質は、Ｉ型コラーゲンという相違点がある。硝子軟骨は、骨の関節面（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ）、肋軟骨（ｃｏｓｔａｌ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、器官（ｔｒａｃｈｅａ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｕｓ）喉頭軟骨（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）などで観察される。弾性軟骨は、外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）と喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）および一部喉頭軟骨を構成し、線維軟骨は、推間円板（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ）、恥骨結合（ｓｙｍｐｈｙｓｉｓ ｐｕｂｉｓ）、関節内の半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、および関節内の線維軟骨複合体（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）などに存在する。

【0004】

線維軟骨に属する半月板（Ｍｅｎｉｓｃｕｓ）は、大腿骨と脛骨の関節面の間に位置し、膝関節の機能を維持する上で非常に重要な役割をする構造物の一つである。半月板は、膝関節にかかる荷重やストレスを分散させ、衝撃を吸収し、関節軟骨に潤滑作用をし、外部の衝撃を吸収し、関節軟骨を保護する非常に重要な役割をする。このような半月板は、膝関節の中間に位置する三日月状の軟骨で形成され、軟骨板は、関節との間で緩衝作用をするが、立ったり歩いたり走ったりするとき、体重が上から下にかかる際、関節軟骨が損傷しないよう衝撃を吸収する役割をする。

【0005】

さらに詳しくは、半月板は、膝関節の左右に三日月状の２つの軟骨がそれぞれ対をなしており、これをそれぞれ外側半月板、内側半月板と呼ぶ。その間を前方十字靭帯と後十字靭帯が横切って、上の大腿骨と下の脛骨とをつないでいる。

【0006】

半月板損傷は、運動選手に多く見られる。これを「半月板破裂」と呼び、半月板破裂は、一般的に、運動中に発生する場合が多い。しかし、５０代後半から６０代半ばの中年層では、退行性関節炎がある程度進行している場合には、突然半月板の後方が切れてしまい破裂が好発し、中年女性ではしゃがみこんだり、膝をたくさん曲げ伸ばしする家事を長い間、持続してきたことにより、半月板の部位が破裂する場合もある。このように、半月板が破れたり破損する場合には、薬の服用や手術的治療が行われる 。細胞外基質のコラーゲンの構成要素は、軟骨板の強度を提供するのに役立ち、プロテオグリカンＥＣＭ構成要素は、衝撃吸収機能に寄与する。また、三日月状の組織は、ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄされた外部部分と、内部のａｖａｓｃｕｌａｒ地域を含む。組織の損傷部分が血管が分布された外部にある場合には、縫合術を施すことができる場合があるが、そうでない場合もあり、無血管ａｖａｓｃｕｌａｒ領域にあれば、自然治癒が可能でないので、切除術を施すことになる。現在、手術的治療法としては、軟骨板組織損傷の大きさや部位によって部分切除（ｐａｒｔｉａｌ ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）、亜全切除、または全切除（ｓｕｂｔｏｔａｌ ｏｒ ｔｏｔａｌ ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）などに分けることができ、切除術による組織の除去は、最終的には退行性関節炎を誘発するので、損傷した軟骨板の再生治療のための根本的な治療法の医療技術が求められている。

【0007】

軟骨板欠損に起因する退行性関節炎の発生を防ぐための治療方法として、現在、「同種半月板移植術」と「合成代替物を用いた半月板再生治療」があり、同種半月板移植術は、軟骨板の大きさと形に合った供与インプラントが必要であり、患者の欠損のない軟骨板部位も全部取り除かなければならない問題、およびインプラントの固定等の問題により、まだ臨床的結果が良くない。

【0008】

半月板を再生するための医療機器開発の成果は、現在、世界的にも初期段階であり、現状、医療機器として開発されているＰｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅを利用した医療機器Ａｃｔｉｆｉｔ（Ｏｒｔｅｑ Ｌｔｄ．）と、Ｎｕｓｕｒｆａｃｅ（Ａｃｔｉｖｅ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ＬＬＳ）と、Ｃｏｌｌａｇｅｎを主成分とする医療機器Ｍｅｎａｆｌｅｘ（ＲｅＧｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）が開発されており、製品はいずれも現在、開発された自国でしか使用許可が下りていない状態であり、他地域では未だ臨床試験およびＦＤＡが進行されていない状態である。臨床に適用してからまだ２年以内であるため、かなり初期段階であり、大きさや形を合わす問題、並びにインプラントを縫合器を介して固定しなければならないという技術的問題が大きな欠点となる。

【0009】

支持体基盤の移植術の場合、適切な形に加工した高分子支持体を部分切除した軟骨板と縫合する方式であり、前記同種半月板移植術を代替する技術として評価されているが、安定性および有効性がまだ検証されていない状態である。また、支持体基盤の移植術は、特定の形態の支持体を、軟骨板のところに挿入する必要があるため、膝関節の切開が必要不可欠という問題点がある。

【0010】

したがって、同種半月板移植術でのように不要に全部の軟骨板を取り除く必要がなく、供与軟骨板を必要とせず、さらに、現在試みられているインプラントを用いた軟骨板再生治療のように欠損部位の大きさや形を合わす必要がなく、縫合器を用いることなく、より優れた再生治療を行うことができる技術が必要とされる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明者は、膝関節の切開およびインプラントの挿入が必然的に伴う従来技術の問題点を解決し、より簡便な最小侵襲の膝関節半月板再生方法について研究していたところ、フィブリノゲン、トロンビン、および生理活性高分子を用いて製造されたハイドロゲルを用いると、最小侵襲方法でも線維軟骨である半月板が効果的に再生されることを確認し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明の目的は、フィブリノゲン、トロンビン、および生理活性高分子を用いて製造されたハイドロゲルを含む、線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物、キットを提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記軟骨再生用組成物を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用スキャフォールドを提供する。

【0014】

また、本発明は、フィブリノゲン溶液を含む第１区画と、トロンビンおよび生理活性高分子を含む第２区画と、を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用キットを提供する。

【0015】

また、本発明は、１）フィブリノゲン１０～１０００ｍｇ／ｍｌを第１溶液として準備する段階と、２）トロンビンおよび生理活性高分子を混合して第２溶液として準備する段階と、を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物の製造方法を提供する。

【0016】

また、本発明は、本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を、治療を必要とするオブジェクトに投与する段階を含む、線維軟骨または弾性軟骨再生方法を提供する。

【0017】

また、本発明は、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0018】

また、本発明は、本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を、治療を必要とするオブジェクトに投与する段階を含む、線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の治療方法を提供する。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る軟骨再生用組成物およびキットは、最小侵襲方法で簡便に線維軟骨または弾性軟骨の再生または損傷の回復が必要な部位に注入することが可能で、体内の毒性なしに分解酵素に対する抵抗性を示し、損傷した注入部位に接着あるいは留置されて留まることにより、周囲の細胞の挙動を向上させ、効果的な半月板のような線維軟骨または弾性軟骨欠損組織の再生を誘導することができる。したがって、本発明の組成物は、生体組織欠損部位の再生を助ける媒介体として、バイオ生体材料分野で有用に用いられることができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明に係る線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物およびキットの模式図およびこれにより製造されたハイドロゲルを示す図である。

【図1-A】フィブリノゲンおよびトロンビンとポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、またはプルロニック（Ｆ１２７）の混合物を含む注射器形態のキットと、フィブリンおよびフィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子を用いて製造された本発明のハイドロゲルを示す図である。

【図1-B】フィブリノゲン、多血小板血漿（ＰＲＰ）およびトロンビンとポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、またはプルロニック（Ｆ１２７）の混合物を含む注射器形態のキットとフィブリンおよびフィブリンの相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、 ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子を用いて製造された本発明のハイドロゲルを示す図である。

【図2】トロンビン濃度変化によるハイドロゲルの弾性率を示す図である。

【図2-A】せん断弾性率を示す図である。。

【図2-B】圧縮弾性率を示す図である（ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図3】トロンビン濃度１２５０Ｕ／ｍｌの条件下において、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とプルロニック１２７（Ｆ１２７）の濃度変化によるハイドロゲルの圧縮弾性率およびせん断弾性率の変化を示す図である。

【図3-A】トロンビン、ＰＥＯを用いて製造されたハイドロゲルＰＥＯ濃度による圧縮弾性率の変化を示す図である。

【図3-B】トロンビン、Ｆ１２７を用いて製造されたハイドロゲルＦ１２７濃度による圧縮弾性率の変化を示す図である。

【図3-C】製造されたハイドロゲルのＰＥＯ濃度によるせん断弾性率の変化を示す図である（ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図4】トロンビン濃度１２５０Ｕ／ｍｌ、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）５．０％、プルロニック１２７（Ｆ１２７）１０．０％の条件下で、ＰＲＰの添加によるせん断弾性率の変化を示す図である。

【図4-A】フィブリン－ＰＥＯハイドロゲル（Ｆｂ／ＰＥＯ）とＰＲＰ添加ハイドロゲル（Ｆｂ／ＰＥＯ＋ＰＲＰ）のせん断弾性率を確認した結果を示す図である。

【図4-B】フィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲル（Ｆｂ／Ｆ１２７）とＰＲＰ添加ハイドロゲル（Ｆｂ／Ｆ１２７＋ＰＲＰ）のせん断弾性率を確認した結果を示す図である。

【図4-C】フィブリン、フィブリン－ＰＥＯ、フィブリン－ＰＥＯ－ＰＲＰ、フィブリン－Ｆ１２７、フィブリン－Ｆ１２７－ＰＲＰハイドロゲルのせん断弾性率比較グラフを示す図である（グラフ上段にある＊、＊＊、＊＊＊は、フィブリングループとの比較時の統計学的有意性を示す。）

【図5】作製されたフィブリン－Ｆ１２７、フィブリン－ＰＥＯハイドロゲルおよび対照群フィブリン単独処理群のトリプシン酵素処理時の分解の様相を示す図である。

【図6】作製されたハイドロゲルと混合された細胞の２４時間後の細胞生存率を示す図である。

【図6-A】蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【図6-B】細胞の生存度を示すグラフである。

【図7】ウサギの半月板損傷部位が再生される結果を示す図である。

【図7-A】半月板損傷後１週間、フィブリン、フィブリン－ＰＥＯ、フィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを注入し、４週、８週、１２週に観察された半月板が再生された様子を示す肉眼的結果である。

【図7-B】再生された半月板の面積を測定した結果を示すグラフである。

【図8】ウサギの半月板損傷部位が再生された結果を示す図である。

【図8-A】図８のＡは、半月板損傷後１週間、フィブリン－ＰＥＯ、フィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを注入し、４週、８週、１２週に観察された半月板が再生される様子を示すＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）、Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ染色およびＴｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎに対する免疫染色の結果（ｘ４０）を示す図である。

【図8-B】Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅを示す図である（Ａ．半月板切除術（Ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）、Ｂ．半月板切除術＋フィブリン単独処理群、Ｃ．半月板切除術＋フィブリン＋ＰＥＯ、Ｄ．半月板切除術＋フィブリン＋Ｆ１２７）。

【図9】ウサギの半月板損傷部位が再生された半月板の強度を測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0022】

本発明は、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を提供する。

【0023】

本発明に係るハイドロゲルは、フィブリノゲンとトロンビンの作用で形成されるフィブリン高分子網に生理活性高分子の高分子鎖がランダムに浸透して、相互侵入高分子ネットワークを形成していることを特徴とすることができる。このように、相互侵入高分子ネットワーク構造が形成されたハイドロゲルは、細胞毒性を示さないので、生体適合性に優れているだけでなく、最小侵襲方法でも、線維軟骨または弾性軟骨の再生が必要な部位に注入することが可能である。また、注入部位に長時間分解されず、損傷した部位に接着あるいは留置されて留まることができ、周囲の細胞の挙動を向上させ、線維軟骨または弾性軟骨の再生を効果的に誘導することができるので、線維軟骨および弾性軟骨の再生、さらに好ましくは半月板の再生に効果的である。

【0024】

本発明において、生理活性高分子は、フィブリン高分子網にランダムに浸透して、相互侵入高分子ネットワークハイドロゲルを形成することができる高分子を制限なく含むことができ、例えば、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ＰＬＡ－ＰＧＡ、ＰＬＡ－ＰＥＧ、デキストラン、デキストラン－ＰＥＧ、でん粉、コラーゲン基盤ゲル、アガロース、プルロン酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体（Ｐ（ＥＯ－ｃｏ－ＰＯ））およびプルロニック／ポロキサマーからなる群から選ばれた少なくとも１種以上であることができ、好ましくは、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ、以下、ＰＥＯ）またはプルロニック１２７（ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、以下、Ｆ１２７）からなる群から選択された１種以上であることができる。

【0025】

本発明において、再生の対象となる軟骨は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、線維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）または弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の中、線維軟骨または弾性軟骨であってもよい。線維軟骨は、白い線維性組織と軟骨性組織があらゆる割合で絡まっている軟骨であって、圧迫には強いが、破れ易く緻密状態に配列されている。線維軟骨は、硝子軟骨または結合組織と連結して存在し、ねじれや圧迫が起こる部位で緩衝作用をし、制限のある動きを可能にし、弾力を維持することを特徴とする。硝子軟骨は、主にＩＩ型コラーゲンからなり、線維成分と無形質が均一に観察されるが、弾性軟骨は、基質内に弾力線維が豊富であるという点で硝子軟骨と相違し、線維軟骨は、硝子軟骨および弾性軟骨と比較して無形質が少なく、膠原線維が多く、一定した配列でつながっているという点で明確な違いを持つ。特に線維軟骨を構成する膠原線維のコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンと相違しており、線維軟骨は、弾性軟骨、硝子軟骨とは異なり、明確に軟骨膜といえるものがない。線維軟骨にて層板をなすＩ型コラーゲン線維束は、隣接する層板と直角に配列されていることが知られており、他の軟骨とは異なり、線維軟骨の前記のような特徴的な配列によって椎間円板などにおいて、特別な弾性を有し、体重負荷などによって生成される圧力によく耐えられるようにする。

【0026】

本発明において、好ましい再生、損傷回復の対象となる線維軟骨または弾性軟骨は、椎間円板、関節唇、または関節半月部位に存在するさまざまな線維軟骨、並びに外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）、喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）および一部喉頭軟骨部位に存在するさまざまな弾性軟骨を全部含むことができ、好ましくは、椎間板（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ）、恥骨結合（ｓｙｍｐｈｙｓｉｓ ｐｕｂｉｓ）、半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、関節内の線維軟骨複合体（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、顎関節軟骨、胸鎖関節（ｓｔｅｒｎｏｃｌａｖｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）の関節円板、寛骨臼窩（ａｃｅｔａｂｕｌａｒ ｆｏｓｓａ）、外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）、喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）および喉頭軟骨からなる群から選択された１種以上であることができる。

【0027】

本発明において、半月板とは、大腿骨と脛骨の関節面の間に位置し、膝関節の機能を維持する上で非常に重要な役割をする構造物の一つであり、膝関節にかかる荷重とストレスを分散させ、衝撃を吸収し、関節軟骨に潤滑作用をし、外部の衝撃を吸収し、関節軟骨を保護する非常に重要な役割を果たす。このような半月板は、膝関節の中間に位置する三日月状の軟骨で形成され、軟骨板は、関節の間で緩衝作用をするが、立ったり歩いたり走ったりするとき、体重が上から下にかかる際、関節軟骨が損傷しないように衝撃を吸収する役割をする。したがって、軟骨板は、退行性関節炎の予防において非常に重要であることが知られている。

【0028】

本発明のフィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルは、生体のトリプシンに分解抵抗性を示し、同一条件でフィブリンの分解時間と比較したとき、６０～８４時間以上、さらに分解抵抗性を有し、長時間ゲルの形態を維持することができるので、体内で目的部位に長く残留して線維軟骨の再生をより効果的に誘導することができる。

【0029】

本発明のハイドロゲルは、１００ｒａｄｉａｎ／ｓｅｃの振動数条件下で１５～４０ｋＰａのせん断弾性率を示すことができ、１０～２００ｋＰａの圧縮弾性率を示すことができる。本発明のハイドロゲルは、前記のような弾性率を示すことによって、線維軟骨再生時、硬くなく、柔軟性と弾力性を維持することができ、これにより、線維軟骨欠損部位の大きさと形に関係なく、容易に投与が可能であり、投与されたハイドロゲル内に周囲の細胞が流入され、組織の再生を起こす利点がある。

【0030】

本発明の組成物は、多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）をさらに含むことができる。多血小板血漿は、ハイドロゲルの準備物質であるフィブリノゲンと混合した形で提供されることができ、多血小板血漿をさらに含む場合、１００ｒａｄｉａｎ／ｓｅｃの振動数条件下で、より優れたせん断弾性率を示すことができる。

【0031】

本発明の組成物は、線維軟骨再生のためのハイドロゲル組成物の形態であり、注射器などを用いて、最小侵襲的に線維軟骨または弾性軟骨の再生が必要な部位に効果的に投与することができる。本発明の組成物は、好ましくは、線維軟骨または弾性軟骨再生用であってもよく、線維軟骨または弾性軟骨再生用支持体として使用することができる。

【0032】

したがって、本発明は、本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用スキャフォールドを提供する。

【0033】

また、本発明は、フィブリノゲン溶液を含む第１区画と、トロンビンおよび生理活性高分子を含む第２区画を含む線維軟骨または弾性軟骨再生用キットを提供する。

【0034】

本発明のキットは、２個以上の区画からなり、フィブリノゲン溶液と、トロンビンおよび生理活性高分子をそれぞれ分けて含むことを目的とする。例えば、好ましくは、フィブリン－ＰＥＯまたはフィブリン－Ｆ２１７ハイドロゲルの製造物質をそれぞれ分けて含むことを目的とする。第１区画の第１溶液と第２区画の第２溶液は、ダブルシリンジ（二重注射器）のシリンジ内で混合され得、即時フィブリンの形成および相互侵入高分子ネットワーク構造の形成を通じて３次元的構造のハイドロゲルが形成されうる。

【0035】

第１区画には、フィブリノゲンの他に多血小板血漿をさらに含むことができる。多血小板血漿をさらに含んでハイドロゲルを製造する場合、より優れたせん断弾性率が表れることができ、フィブリノゲンと多血小板血漿は、１：０．１～１：１の体積比、好ましくは１：０．１～１：０．８の体積比で混合して第１区画に含まれることができる。

【0036】

本発明のキットは、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを製造するための製造物質である第１溶液と第２溶液をそれぞれの区画に含むことを目的とし、第１区画は、第１溶液としてフィブリノゲンを１０～１０００ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは１０～５００ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは５０～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。第１区画には、抗線維素溶解剤が、第１溶液に追加で含むことができ、例えば、アプロチニンが好ましくは、０．５ｍｇ／ｍｌ（３～８ＴＩＵ／ｍｇ）になるようにさらに含まれることができ、ＫＴＵ単位に換算時、１００～５５００ＫＩＵ／ｍｌ、好ましくは１９５０～５２００ＫＩＵ／ｍｌの濃度で含まれることができる。第２区画には、第２溶液が含まれることができ、第２溶液には、トロンビンおよび生理活性高分子が含まれることができる。前記トロンビンは、第２溶液内１００～５０００Ｕｎｉｔ（Ｕ）／ｍｌ含まれ得、好ましくは、２５０Ｕ／ｍｌ～３０００Ｕ／ｍｌ濃度、より好ましくは２５０～２８００Ｕ／ｍｌの濃度で含まれることができる。トロンビンは、最終混合組成物内で最終濃度が２５０Ｕ／ｍｌ～１２５０Ｕ／ｍｌであることができ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）が５～５０ｍｇ／ｍｌ含まれることができ、好ましくは、５（ｗ／ｖ）％になるようにさらに含まれることができる。前記生理活性高分子は、フィブリン高分子網にランダムに浸透し、相互侵入高分子ネットワークハイドロゲルを形成することができる高分子を制限なく含むことができ、例えば、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ＰＬＡ－ＰＧＡ、ＰＬＡ－ＰＥＧ、デキストラン、デキストラン－ＰＥＧ、でん粉、コラーゲン基底ゲル、アガロース、プルロン酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体（Ｐ（ＥＯ－ｃｏ－ＰＯ））およびプルロニック／ポロキサマーからなる群から選ばれた少なくとも１種以上であることができ、好ましくは、ＰＥＯまたはＦ１２７
からなる群から選択された１種以上であることができる。前記生理活性高分子がＰＥＯである場合、これは最終混合組成物内でＰＥＯ濃度が１～１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１～５％（ｗ／ｖ）となるように、第２溶液内に２～２０％（ｗ／ｖ）含まれることができ、好ましくは２～１０（ｗ／ｖ）％含まれることができる。また、前記生理活性高分子がＦ１２７である場合、これは最終混合組成物内でＦ１２７濃度が１～２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３～１０（ｗ／ｖ）％になるように、第２溶液内に２～４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは６～２０（ｗ／ｖ）％含まれることができる。

【0037】

本発明において、キットは、医療的な目的で用いられる医療機器と相互交換的に用いることができ、好ましい形態は、ダブルシリンジの形態であることができる。

【0038】

また、本発明は、１）フィブリノゲン１０～１０００ｍｇ／ｍｌを、第１溶液として準備する段階と、２）トロンビンおよび生理活性高分子を混合して第２溶液として準備する段階とを含む、線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物の製造方法を提供する。

【0039】

本発明の製造方法によると、線維軟骨または弾性軟骨再生用ハイドロゲルの準備物質の製造段階を含み、線維軟骨または弾性軟骨再生が必要なオブジェクトに治療／施術が必要な場合、速やかにハイドロゲルを製造し、最小侵襲方法により関節腔内にハイドロゲルを注入することができる。すなわち、本発明の製造方法は、フィブリノゲンを主成分とする第１溶液の準備過程およびトロンビンと生理活性高分子、好ましくはＰＥＯまたはＦ１２７の混合物を主成分とする第２溶液の準備過程、そして第１溶液と第２溶液がダブルシリンジ内で混合されて固形化され、体内に注入される過程を含むことができる。

【0040】

したがって、本発明は、３）前記第１溶液と第２溶液とを混合してフィブリンと生理活性高分子が相互侵入高分子ネットワーク（ＩＰＮ）構造を形成する線維軟骨または弾性軟骨再生用ハイドロゲルを製造する段階と、をさらに含むことができる。

【0041】

また、本発明の製造方法において、第１溶液には多血小板血漿をさらに含むことができ、フィブリノゲンと多血小板血漿を１：１～１：２の体積比で、さらに混合する段階を含むことができる。

【0042】

本発明の第１溶液または第２溶液には、線維軟骨または弾性軟骨再生に必要な生理活性物質がさらに含まれることができ、この生理活性物質は、細胞培養培地または成長因子であることができる。

【0043】

また、本発明は、本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を、治療を必要とするオブジェクトに投与する段階を含む線維軟骨または弾性軟骨を再生する方法を提供する。

【0044】

また、本発明は、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを含む線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0045】

また、本発明は、本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を、治療を必要とするオブジェクトに投与する段階を含む線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の治療方法を提供する。

【0046】

本発明の線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物を投与する段階は、本発明のキットに含まれた第１溶液と第２溶液とが混合され、即形成される、フィブリンと、フィブリンと相互侵入高分子ネットワーク（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ、ＩＰＮ）構造を形成する生理活性高分子と、を含むハイドロゲルを投与することを特徴とし、前記製造されたハイドロゲルは、最小侵襲方法で関節腔に注入され、長い時間注入部位に分解酵素抵抗性を示し、損傷した部位に接着あるいは留置して留まりながら、周囲の細胞の挙動を向上させ、線維軟骨または弾性軟骨、好ましくは、損傷した膝関節半月板を効果的に再生させることができる。再生された半月板は、せん断および圧縮弾性力に非常に優れており、正常な軟骨板の５０～８０％の強度を維持することができ、商用化されたフィブリン単独ハイドロゲルに比べて強度に優れ、線維軟骨または弾性軟骨再生および線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患の治療に非常に効果的である。

【0047】

前記線維軟骨または弾性軟骨欠損とは、線維軟骨、線維軟骨組織および／または関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨など）が機械的刺激や炎症反応によって傷害を受けた線維軟骨の損傷、または他の先天的若しくは後天的な要因による弾性軟骨損傷または欠損をいう。このような線維軟骨または弾性軟骨欠損による疾患は、好ましくは、線維軟骨または弾性軟骨の損傷または欠損により発生する疾患であることができ、より好ましくは、椎間円板ヘルニア、恥骨間円板損傷、顎関節損傷、胸鎖関節の関節円板損傷、手首関節の三角線維軟骨複合体破裂、尺骨突き上げ症候群、退行性関節炎、半月板損傷、リウマチ関節炎、外耳（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅａｒ）欠損、および喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）または喉頭軟骨欠損からなる群から選択された１種以上であることができる。前記椎間円板ヘルニアは、ディスクとも呼ばれ、脊椎体間、あるいは恥骨間でも発生し得る。前記退行性関節炎およびリウマチ関節炎は、線維軟骨または弾性軟骨の損傷により発生あるいは悪化し得る疾患であって、線維軟骨または弾性軟骨の損傷回復および再生を通じて治療もしくは好転することができる。これに関連し、当分野では、初期の変形性膝関節症の治療のために軟骨板切除の際、最小限に切除をしたり、軟骨板欠損が深刻な場合に軟骨板移植術のような手術的方法を行ったりして、線維軟骨または弾性軟骨の消失を最小限に抑える、または代替する方法を通じて退行性骨関節症の発生を減らし得ることが知られている。

【0048】

治療方法としては、組成物を標的部位、例えば、関節に直接注射または移植することが含まれる。組成物の投与は、しばしば、日、週、週当たり数回、隔月、月当たり数回、月単位の頻度で、または症状の軽減を提供するために必要なだけの頻度で行うことができる。関節内での使用の場合、関節の大きさおよび状態の重症度に応じて投与する組成物の量を調節することができる。ただし、関節への後続投与の頻度は、前記関節における症状の再発時間に応じて間隔を置く。

【0049】

任意の特定患者に対する特定の投与量水準は、採用された特定化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄率、薬物の組み合わせ、および治療中の特定疾患の重症度を含む様々な因子に応じて適切に調節することができる。薬学組成物は、投与量単位で製造され投与されうる。しかし、特殊な状況によっては、容量の単位をより多くしたり、より少なくしたりするのが適切な場合もある。前記投与量単位の投与は、前記組成物の一回投与および特定の間隔で分割された容量の複数投与の両方により行うことができる、または、投与は数個のさらに小さい容量の単位で実行するができる。

【0050】

一具体例において、線維軟骨または弾性軟骨欠損疾患は、半月板損傷であり、前記組成物は、例えば、膝のような、関節空間に投与される。

【0051】

例えば、膝半月板損傷を持つオブジェクトは、膝当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｌ以上の注射を１、２、または３回打つことができる。他の関節の場合には、投与される体積は、その関節の大きさに基づいて調整することができる。

【0052】

しかし、任意の特定患者に対する特定投与量水準は、採用された特定化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄率、薬物の組み合わせ、および治療中の特定疾患の重症度を含む様々な因子に依存的に変更されることができる。

【0053】

本発明の組成物は、有効成分として含まれる前記線維軟骨または弾性軟骨再生用組成物に加えて、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。

【0054】

本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記成分の外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

【0055】

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に基づいて、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量形態で製造する、または多容量容器内に内入させて製造することができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であったり、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であったりすることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

【0056】

［発明を実施するための形態］
実施例１．ハイドロゲル製造用第１溶液及び第２溶液の製造
欠損したヒト組織再生を最小侵襲方法だけで達成するために、ハイドロゲル製造物質である第１溶液および第２溶液を製造した。

【0057】

１．１．フィブリンとポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を用いたハイドロゲル製造物質の製造
フィブリンとＰＥＯを用いたハイドロゲルの製造物質である第１溶液および第２溶液を製造した。第１溶液は、フィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１０～１０００ｍｇ／ｍｌ及びアプロチニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１００～５５００ＫＩＵ／ｍｌを混合して製造した。第２溶液は、トロンビン（ＲＥＹＯＮ製薬）粉末が１００～２５００Ｕｎｉｔ（Ｕ）／ｍｌの濃度で溶解された溶剤にＰＥＯと塩化カルシウムを３７ ℃で溶解させて製造しており、ＰＥＯの濃度は、１～１００ｍｇ／ｍｌ、そして塩化カルシウムの濃度は、５～５０ｍｇ／ｍｌにして製造した。このように製造された第１溶液と第２溶液とを混合して製造される相互侵入高分子ネットワーク構造を形成するハイドロゲルを「フィブリン－ＰＥＯ」と命名した。

【0058】

１．２．フィブリンとプルロニック１２７（Ｆ１２７）を用いたハイドロゲル製造物質の製造
フィブリンとＦ１２７を用いたハイドロゲルの製造物質である第１溶液および第２溶液を製造した。第１溶液は、前記実施例１．１にて明示された構成と同様に製造し、第２溶液の準備過程において、Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ２４４３）は、２～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて、０～４℃のｉｃｅ ｂａｔｈでトロンビン溶液に溶解させて製造した。このように製造された第１溶液と第２溶液とを混合して製造される相互侵入高分子ネットワーク構造を形成するハイドロゲルを「フィブリン－Ｆ１２７」と命名した。

【0059】

１．３．ＰＲＰが含有されたフィブリンとＰＥＯを用いたハイドロゲル製造物質の製造
第１溶液としてフィブリンとウサギの血液から分離して得られた多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ ）を含み、第２溶液としてＰＥＯおよびトロンビンを含むＰＲＰが含有されたフィブリン－ＰＥＯハイドロゲル製造物質を製造した。フィブリノゲン溶液と多血小板血漿を１．０：０．１～１．０：０．７の体積比で混合して、第１溶液を製造し、第２溶液は、実施例１．１と同様に製造した。このように製造された第１溶液と第２溶液とを混合して製造される相互侵入高分子ネットワーク構造を形成するハイドロゲルを「フィブリン－ＰＥＯ－ＰＲＰ」と命名した。

【0060】

１．４．ＰＲＰが含有されたフィブリンとＦ１２７を用いたハイドロゲル製造物質の製造
第１溶液としてフィブリンとウサギの血液から分離して得られた多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）を含み、第２溶液としてプルロニック１２７およびトロンビンを含む相互浸透高分子網を製造した。フィブリノゲン溶液と多血小板血漿を１．０：０．１～１．０：０．７の体積比で混合して、第１溶液を製造し、第２溶液は、実施例１．２と同様に製造した。このように製造された第１溶液と第２溶液とを混合して製造される相互侵入高分子ネットワーク構造を形成するハイドロゲルを「フィブリン－Ｆ１２７－ＰＲＰ」と命名した。

【0061】

１．５．即座にゲル化の確認
前記製造された実施例１．１～１．４において、第１溶液と第２溶液をそれぞれダブルシリンジの１区画および２区画に含ませ、施術時、それぞれの溶液が、個々の区画から流れ出て合わさりながら、即座にゲル化され、３次元構造体を形成することができるように製造した。これの模式図および凝固化したハイドロゲルを図１に示した。

【0062】

図１に示すように、本発明において、実施例１．１～１．４におけるハイドロゲル製造物質が、すべて即座にゲル化されることにより３次元構造体ハイドロゲルを形成したことを確認した。このように製造されたハイドロゲルは、フィブリンの間々にＰＥＯまたはＦ１２７が部分浸透し、ＩＰＮ（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ）を形成して製造されることを特徴とする。

【0063】

実施例２．トロンビン濃度によるハイドロゲルの圧縮およびせん断弾性率の確認
フィブリノゲンとトロンビン濃度の組み合わせにより生成されたハイドロゲルの弾性率の変化を確認するために、ハイドロゲルを直径８．０ｍｍの枠に作製してせん断弾性率と圧縮弾性率を測定した。せん断弾性率は、ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＡＲＥＳ－ＬＳ、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定し、ｐｌａｔｅ間隔は、９００μｍに設定し、振動数条件は、０．１～１００Ｈｚに調節した。圧縮弾性率は、万能試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ ５９６６、Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して測定した。応力－変形率グラフで弾性区間を有する区間の傾きを利用して圧縮弾性率（Ｅ）の値を見出した。フィブリノゲンの濃度は、一定の濃度である１００ｍｇ／ｍｌに固定し、トロンビンの最終濃度が２５０Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌ及び１２５０Ｕ／ｍｌになるように混合される前に、第２溶液のトロンビンの濃度を５００、１０００、２５００Ｕ／ｍｌに調節し、ハイドロゲルを製造し、製造後、せん断弾性率と圧縮弾性率を測定し、その結果を図２に示した。

【0064】

図２に示すように、フィブリノゲンおよびトロンビンで製造されたハイドロゲルにおいて、トロンビン濃度変化に伴う構成された単純高分子網ハイドロゲルのせん断弾性率変化グラフ（Ａ）、圧縮弾性率変化グラフ（Ｂ）を確認した結果、トロンビン濃度を２５０、５００、１２５０Ｕ／ｍｌの順に増加させたとき、フィブリンハイドロゲルのせん断弾性率は、１００ｒａｄ／ｓで、それぞれ１４．１±１．０、１４．７±０．７、１５．４±０．６ｋＰａの順に増加したことを確認した。また、圧縮弾性率もまたトロンビンの濃度が増加するほど増加し、トロンビン濃度を２５０、５００、１２５０Ｕ／ｍｌの順に増加させたとき、フィブリンハイドロゲルの圧縮弾性率は、それぞれ２９．９±３．１、４３．１±５．２、９３．６±９．０ｋＰａの順に増加したことを確認した。

【0065】

実施例３．ＰＥＯおよびＦ１２７の追加による圧縮弾性率の確認
第２溶液としてＰＥＯまたはＦ１２７を追加したときのハイドロゲルの圧縮弾性率を測定した。第１溶液のフィブリノゲン濃度は、一定濃度である１００ｍｇ／ｍｌに固定した。最終混合組成物内のトロビン濃度が１２５０Ｕ／ｍｌになるように第２溶液中、トロンビン濃度を２５００Ｕ／ｍｌに固定し、最終混合組成物内のＰＥＯ濃度が１．０、３．０、５．０％（ｗ／ｖ）になるように第２溶液中、ＰＥＯ濃度を２．０、６．０、１０．０％（ｗ／ｖ）に変化させ、最終混合組成物内のＦ１２７濃度が３．０、７．０、１０．０％（ｗ／ｖ）になるように６．０、１４．０、２０．０％（ｗ／ｖ）に変化させ、第２溶液を製造した。各製造例による圧縮弾性率変化を確認し、その結果を図３に示した。

【0066】

図３に示すように、ＰＥＯ濃度を１．０、３．０、５．０％（ｗ／ｖ）で混合し、ハイドロゲルを作製したとき、それぞれ１０３．３ ± ４．９ｋＰａ、１０８．４±４．８ｋＰａ、１２０．１±３．３ ｋＰａの圧縮弾性率（Ａ）を示し、Ｆ１２７の濃度を３．０、７．０、１０．０％（ｗ／ｖ）で混合し、ハイドロゲルを作製したとき、それぞれ７２．０±４．３ｋＰａ、１２２．０±９．６ｋＰａ、１５６．０±９．８ｋＰａの圧縮弾性率（Ｂ）を示した。

【0067】

また、トロンビン濃度１２５０Ｕ／ｍｌの条件下で、ＰＥＯ濃度変化により形成されたフィブリン－ＰＥＯ ハイドロゲルのせん断弾性率変化を確認した結果、ＰＥＯ濃度を１．０、３．０、５．０％の順に増加したとき、製造されたフィブリン－ＰＥＯハイドロゲルのせん断弾性率は、１００ｒａｄ／ｓの条件で、それぞれ１５．４±１．３、１８．５±１．２、２１．５±１．５ｋＰａの順に増加したことを確認した。

【0068】

実施例４．ＰＥＯおよびＦ１２７にＰＲＰの追加による圧縮弾性率の確認
トロンビン２５００Ｕ／ｍｌ、ＰＥＯ １０．０％またはＦ１２７ ２０．０％を混合して第２溶液を製造した。第１溶液は、フィブリノゲンを２００ｍｇ／ｍｌとし、多血小板血漿（ＰＲＰ）を、第１溶液と１：１の体積比で混合し、製造し、最終フィブリノゲン濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるようにし、第１溶液と第２溶液とを混合して即座に固化させることによりハイドロゲルを作製した。作製されたハイドロゲルは、フィブリン－ＰＥＯ－ＰＲＰまたはフィブリン－Ｆ１２７－ＲＰＲと命名した。多血小板血漿がハイドロゲルの物性に及ぼす影響を確認するために、多血小板血漿を含まない実験群（フィブリン－ＰＥＯ、フィブリン－Ｆ１２７）、フィブリン単独を含む実験群によりせん断弾性率の変化を通じて確認をし、その結果を図４および表１に示した。

【0069】

【表1】

【0070】

図４及び表１に示すように、せん断弾性率を測定した結果、フィブリンにＰＥＯ、Ｆ１２７が混在されたグループ全部、同一条件で多血小板血漿が添加されたとき、より高いせん断弾性率を示した。

【0071】

実施例５．体内持続効果を確認するための酵素分解様相の比較
本発明の第１溶液及び第２溶液の混合により、製造されるハイドロゲルの酵素処理下で分解様相をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認すべく、トリプシン０．００１２５％溶液にハイドロゲルを浸させた後、時間別にその重量を測定し、最初の重量と比較して分解速度を測定した。具体的にはフィブリン基盤ハイドロゲルの体内注入時、フィブリン分解様相を予想するために、代表的なフィブリンタンパク質分解酵素であるトリプシンを用いて、体外で分解様相を確認し、０．００１２５％トリプシン／ＥＤＴＡ条件下で、対照群フィブリンハイドロゲルと実施例４で製造したフィブリン＋ＰＥＯ、フィブリン＋ＰＥＯ＋ＰＲＰ、フィブリン＋Ｆ１２７、フィブリン＋Ｆ１２７＋ＰＲＰにより製造されたハイドロゲルの分解様相を確認した結果を図５に示した。

【0072】

図５に示すように、対照群であるフィブリンハイドロゲルは、トリプシン処理１２０時間経過以前に完全に分解されたが、本発明で作製したハイドロゲル中、フィブリン＋ＰＥＯ群は１９２時間、フィブリン＋Ｆ１２７は２６４時間に達して初めて分解されることを確認した。すなわち、本発明で作製したハイドロゲルは、ＰＥＯまたはＦ１２７の部分相互浸透効果により、対照群フィブリンハイドロゲルに比べて平均７２時間分解を遅らせることができることを確認した。したがって、本発明のハイドロゲルを用いれば、より長い時間体内に留まって、目的とする効果を達成することができることを確認した。

【0073】

実施例６．生体適合性の確認
実施例４にて製造したフィブリン－ＰＥＯまたはフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルが治療剤として用いられることへの適否について確認するために、生体適合性を確認する実験を行った。ウサギ軟骨から得られた線維性軟骨細胞（ｆｉｂｒｏｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）をフィブリノゲンを含む第１溶液に１ｘ１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で混合した後、これをＰＥＯまたはＦ１２７を含む第２溶液と混合してハイドロゲルを作製し、ハイドロゲル内部に細胞をカプセル化した。以後、ハイドロゲルを２４時間の間、Ｆ－１２培地で培養し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、生細胞と死細胞をそれぞれ染め分けし、蛍光顕微鏡（ＡＭＦ４３００、ＥＶＯＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて観察した。１０倍率の画像を４個撮影し、以下の式を用いて、細胞生存率を計算し、比較し、その結果を図６に示した。
細胞生存率＝生細胞数／全細胞数 × １００

【0074】

図６に示すように、対照群フィブリンハイドロゲルと比較した結果、ＰＥＯまたはＦ１２７を含んで製造されたハイドロゲルも同様に赤色で染色された死細胞がほとんど観察されず、時間別、ハイドロゲル細胞の生／死の蛍光画像を確認した結果、本発明にて製造したフィブリン－ＰＥＯおよびフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルの両方で対照群フィブリンハイドロゲルと比較した時、細胞の生存に差異がないことを確認した。したがって、本発明にて製造されたハイドロゲルは、すべての生体内投与時、生体に長く残存するにも拘わらず、生体適合性に優れていることを確認した。

【0075】

実施例７．半月板損傷の動物モデルで半月板再生効果の検証
前記実施例４にて製造されたフィブリンとＰＥＯまたはフィブリンとＦ１２７を用いて製造されたハイドロゲルが半月板損傷の動物モデルにおいて、半月板再生の効果を示すか否かを検証するために、以下のような実験を行った。

【0076】

さらに具体的には、ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）関節軟骨損傷の動物モデルを作製するために、健康的なウサギを選び、体重に応じた適切な量のケタミンとロムプンで注射麻酔した後、ウサギが十分に全身麻酔されたことを確認し、両下肢膝関節部位の剃毛を行った後、姿勢を維持させながら絆創膏で固定した。両側膝部位をポビドンで消毒し、膝蓋骨を触知して位置を確認した後、膝関節の上、下、膝蓋骨の内側を通る切開線に沿って傍正中アプローチ（ｐａｒａｍｅｄｉａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）で、膝関節内に到達し、膝蓋骨を外側へ捲って膝関節を屈曲させ、関節内部を観察した。特異な病的所見がないことを確認した後、半月板を３分の２以上切除（ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）した。前記のように半月板損傷を誘発してから、膝蓋骨を元の位置に戻した後、膝蓋骨周囲の軟部組織を吸収性糸で縫合し、皮膚を非吸収性糸で縫合した。ウサギが麻酔から覚めるのを確認した後、自在に動けるよう許容し、術後５日間、感染を防ぐために鎮痛剤と抗生物質を投与した。一週間後、準備したダブルシリンジ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｙｒｉｎｇｅ）注射器１区画には、フィブリノゲン１００ｍｇ／ｍＬ、アプロチニン０．５ｍｇ／ｍＬを、注射器２区画には、トロンビン２５００Ｕ／ｍｌ、塩化カルシウム５（ｗ／ｖ）％、またはトロンビン２５００Ｕ／ｍｌ、塩化カルシウム５（ｗ／ｖ）％とＰＥＯ１０．０％、またはトロンビン２５００Ｕ／ｍｌ、塩化カルシウム５（ｗ／ｖ）％とＦ１２７ ２０．０％を入れた後、前記動物モデルの左側に皮膚を切開せずに、半月板損傷部位に注入した。反対側肢には何ら処理をしなかった。４週間、８週間および１６週間経過した後、各ウサギから損傷および治療を施した半月板を取り除いて肉眼的評価を実施し、これを再生された半月板の面積をｉｍａｇｅ Ｊプログラムを使って測定し評価した。また、組織を固定した後、Ｈ＆Ｅ、Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ染色およびＴｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎに対する免疫染色を行い、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅを利用した定量化を通じて再生された半月板を分析した。その結果を図７及び図８に示した。

【0077】

図７及び図８に示すように、フィブリンのみ単独で含んで製造された対照群のハイドロゲルに比べてフィブリン－ＰＥＯおよびフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを注入した群から、４週から線維組織が生成され始めて１２週には半月板組織と類似した組織が生成されることを確認した。これらの結果は、ウサギの半月板損傷後１週間、フィブリン－ＰＥＯおよびフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを、皮膚を切開せずに注入しても、４週、８週、１２週には半月板が再生されることを示す結果である。したがって、フィブリン－ＰＥＯおよびフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを用いれば、損傷した膝関節半月板部位において、周囲細胞の挙動により軟骨板の細胞を、優れた効率で生成することができ、効果的に半月板損傷を治療することを確認した。

【0078】

実施例８．再生された半月板の圧縮強度試験
半月板支持体の重要な物性は、外部から加えられる力に耐えられる圧縮強度である。したがって、前記実施例７において１２週目に再生された半月板を４ｍｍパンチを使って２カ所にサンプルを切り取った後、引張力測定器で圧縮強度を測定し、本発明のフィブリン－ＰＥＯおよびフィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルを注入して再生された半月板の強度を確認し、その結果を図９に示した。

【0079】

図９に示すように、何も処理していない（ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ｏｎｌｙ）群とフィブリンを単独処理した群に比べてフィブリン－ＰＥＯ、フィブリン－Ｆ１２７ハイドロゲルの注入を通じて再生された組織の圧縮強度が著しく増加したことを確認した。具体的には何も処理していないＭｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ｏｎｌｙにおいて、Ｍｐａ値は、２０３．３±４３．２、フィブリンを単独注入した群では、８４４．９±３２．６の圧縮強度を確認し、フィブリン＋ＰＥＯハイドロゲルを注入した群からは４０８６．７±５４２．１、フィブリン＋Ｆ１２７ハイドロゲルを注入した群からは３４０６．８±３１２．１、そしてＮｏｒｍａｌ ｍｅｎｉｓｃｕｓの場合には、６６８８．６±１０１２．５値を確認した。したがって、本発明のフィブリン＋ＰＥＯハイドロゲルおよびフィブリン＋Ｆ１２７ハイドロゲルを注入して、再生された半月板の強度が正常な軟骨板の６０％以上となることを確認し、軟骨板再生に有効に用いることができることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】