特許 7221353 核酸の送達のための新規脂質および脂質ナノ粒子製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-03

(45)【発行日】2023-02-13

(54)【発明の名称】核酸の送達のための新規脂質および脂質ナノ粒子製剤

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/16 20060101AFI20230206BHJP

   C07C 227/08 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20230206BHJP

   A61K 47/18 20170101ALN20230206BHJP

   A61K 47/22 20060101ALN20230206BHJP

   A61K 47/60 20170101ALN20230206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20230206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20230206BHJP

【ＦＩ】

C07C229/16 CSP

C07C227/08

A61K31/7088

A61K47/18

A61K47/22

A61K47/60

A61K48/00

A61P43/00 105

【請求項の数】 19

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021164898

(22)【出願日】2021-10-06

(62)【分割の表示】P 2019172551の分割

【原出願日】2015-06-05

(65)【公開番号】P2022008909

(43)【公開日】2022-01-14

【審査請求日】2021-10-15

(31)【優先権主張番号】62/016,839

(32)【優先日】2014-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516386834

【氏名又は名称】アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン エム． アンセル

(72)【発明者】

【氏名】シンヤオ ドゥ

【審査官】高橋 直子

(56)【参考文献】

【文献】特開平４－７３６４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２６３２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５６－１５０００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３１０５５５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０８６３７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０１６０５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／０６２３２２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Journal of the Chemical Society [Section] C: Organic，1968年，(10)，1235-43

【文献】Bioconjugate Chem.，2004年，Vol.15，p.754-764

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｃ ２２９／１６

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ４７／１８

Ａ６１Ｋ ４７／２２

Ａ６１Ｋ ４７／６０

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造式：

【化1】

［式中、
Ｘは、ＯＨまたはＣｌであり、
Ｒは、出現ごとに、独立して、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキル、または飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、
ｍは、０または１であり、そして、
ｎは、出現ごとに、独立して、５～２４の整数である］
で示される化合物、またはその医薬的に許容し得る塩。

【請求項2】

Ｘが、ＯＨである、請求項１記載の化合物。

【請求項3】

Ｘが、Ｃｌである、請求項１記載の化合物。

【請求項4】

ｎが、５～２４の整数である、請求項１記載の化合物。

【請求項5】

ｎが、５である、請求項１記載の化合物。

【請求項6】

Ｒが、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキル、または飽和もしくは不飽和のシクロアルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項7】

Ｒが、出現ごとに、独立して、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項8】

Ｒが、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項9】

Ｒが、出現ごとに、独立して、飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項10】

Ｒが、飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項11】

Ｒが、飽和のＣ_１６～Ｃ_２４アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項12】

Ｒが、飽和のＣ_１６アルキル、飽和のＣ_１７アルキル、または飽和のＣ_２０アルキルである、請求項１記載の化合物。

【請求項13】

Ｒが、以下の構造式：

【化2】

の１つで示される、請求項１記載の化合物。

【請求項14】

ｍが、１である、請求項１記載の化合物。

【請求項15】

以下の構造式：

【化3】

の１つで示される、請求項１記載の化合物。

【請求項16】

以下の構造式：

【化4】

の１つで示される、請求項１記載の化合物。

【請求項17】

請求項１記載の化合物の製造方法であって、以下の変換：

【化5】

［式中、
Ｒは、出現ごとに、独立して、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキル、または飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、
ｍは、０または１であり、そして、
ｎは、出現ごとに、独立して、５～２４の整数である］
を含む、該製造方法、

【請求項18】

更に、以下の変換：

【化6】

を含む、請求項１７記載の製造方法。

【請求項19】

更に、以下の変換：

【化7】

を含む、請求項１７記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、中性脂質、コレステロールおよびポリマーコンジュゲート脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成し、治療用核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ）の細胞内送達を促進することができる新規のカチオン性脂質に一般的に関する。

【背景技術】

【0002】

生体系内で所望の応答を生じさせる核酸の送達に関連して、多くの難題が存在する。核酸をベースとする治療薬は、莫大な可能性を有するが、この可能性を実現するためには、細胞または生物内の適当な部位への核酸のより有効な送達の必要性が依然としてある。治療用核酸として、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、免疫刺激核酸、アンタゴミール、抗ｍｉｒ、模倣体、スーパーｍｉｒ、およびアプタマーが挙げられる。ｍＲＮＡまたはプラスミドなどの一部の核酸は、例えば、タンパク質または酵素の欠乏に関係した疾患の処置に有用となるような、特定の細胞産物の発現を生じさせるために使用することができる。その系に常在性であるかどうかに関わらず、構造体を合成することによって、任意の選択されたタンパク質配列を生成することができるので、翻訳可能なヌクレオチド送達の治療的用途は極めて幅広い。核酸の発現産物は、細胞または生物内で、タンパク質の既存レベルを増大させるか、欠損したもしくは非機能的バージョンのタンパク質を置き換えるか、または新規タンパク質および関連する機能性を導入することができる。

【0003】

ｍｉＲＮＡ阻害剤などの一部の核酸は、例えば、タンパク質または酵素の欠乏に関係した疾患の処置に有用となるような、ｍｉＲＮＡにより調節される特定の細胞産物の発現を生じさせるために使用することができる。構造体を合成することによって、１つまたは複数のｍｉＲＮＡを阻害することができ、これがひいてはｍＲＮＡ産物の発現を調節することになるので、ｍｉＲＮＡ阻害の治療的用途は極めて幅広い。内因性ｍｉＲＮＡの阻害は、特定のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの群に関連する疾患を処置するための手段として、細胞または生物内で、その下流の標的内因性タンパク質の発現を増大させ、適切な機能を回復することができる。

【0004】

他の核酸は、特定のｍＲＮＡの細胞内レベルを下方制御することができ、その結果、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはアンチセンスＲＮＡの相補結合などのプロセスを介して対応するタンパク質の合成を下方制御することができる。オリゴヌクレオチド構造体は、標的ｍＲＮＡに向けられた任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるので、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉの治療的用途もまた極めて幅広い。標的として、正常細胞由来のｍＲＮＡ、がんなどの疾患状態に関連するｍＲＮＡ、およびウイルスなどの感染物質のｍＲＮＡを挙げることができる。今日までに、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両モデルにおいて、同族ｍＲＮＡの分解を介して標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造体は、臨床研究において現在評価されている。

【0005】

しかし、治療的状況におけるオリゴヌクレオチドの使用は、現在２つの問題に直面している。第１に、遊離ＲＮＡは、血漿中のヌクレアーゼ消化の影響を受けやすい。第２に、遊離ＲＮＡは、関連する翻訳機構が存在する細胞内区画へのアクセス取得能力が限られている。中性脂質、コレステロール、ＰＥＧ、ペグ化脂質、およびオリゴヌクレオチドなどの他の脂質成分を有するカチオン性脂質から形成された脂質ナノ粒子は、血漿中でのＲＮ
Ａの分解を遮断し、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進するために使用されてきた。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

オリゴヌクレオチド送達のための改善されたカチオン性脂質および脂質ナノ粒子に対する必要性が依然として存在する。好ましくは、これらの脂質ナノ粒子は、薬物：脂質の最適比を提供し、血清中の分解およびクリアランスから核酸を保護し、全身送達に対して適切であり、核酸の細胞内送達を提供する。加えて、これらの脂質－核酸粒子は、核酸の有効用量での患者の処置が、許容不可能な毒性および／または患者に対する危険性を伴わないよう、かなり容認され、十分な治療指数を提供するべきである。本発明は、これらの、および関係する利点を提供する。

【0007】

手短に言えば、本発明は、単独で、あるいは他の脂質成分、例えば、中性脂質、荷電脂質、ステロイド（例えば、すべてのステロールを含む）および／もしくはこれらのアナログ、ならびに／またはポリマーコンジュゲート脂質などと組み合わせて使用することによって、治療剤の送達のための脂質ナノ粒子を形成することができる、その立体異性体、薬学的に許容される塩または互変異性体を含めた、脂質化合物を提供する。ある場合には、脂質ナノ粒子を使用して、アンチセンスおよび／またはメッセンジャーＲＮＡなどの核酸を送達する。様々な疾患または状態、例えば、感染性の実体および／またはタンパク質の不全により引き起こされるものなどの処置のためにこのような脂質ナノ粒子を使用する方法もまた提供される。

【0008】

一実施形態では、以下の式（Ｉ）：

【化1】

（式中、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ａ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｌ^１、Ｌ^２、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは本明細書で定義された通りである）
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体が提供される。

【0009】

前述の式（Ｉ）の化合物の１つまたは複数と、治療剤とを含む医薬組成物もまた提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、中性脂質、荷電脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質から選択される１つまたは複数の構成成分をさらに含む。このような組成物は、治療剤の送達のための脂質ナノ粒子の形成に有用である。

【0010】

他の実施形態では、本発明は、治療剤の投与をそれを必要とする患者に行うための方法であって、式（Ｉ）の化合物および治療剤を含む脂質ナノ粒子の組成物を調製することと、患者に組成物を送達することとを含む方法を提供する。

【0011】

またさらなる実施形態では、本発明は、以下の構造（ＩＩ）：

【化2】

（式中、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびｚは本明細書で定義された通りである）
を有するペグ化脂質またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を対象とする。

【0012】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳述された説明を参照して明らかとなる。

【0013】

図の中で、同一の参照番号は同様の要素を特定している。図の中の要素の大きさおよび相対的位置は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、図の読みやすさを改善するためにこれらの要素のいくつかは、随意に拡大および配置されている。さらに、描かれている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関して任意の情報を伝えることを意図しておらず、図を認識しやすくするために選択されたものにすぎない。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、マウスの肝臓におけるルシフェラーゼ発現の時間経過を示している。

【0015】

【図2】図２は、開示された脂質に関連する代表的な例として、ＭＣ３に対するｐＫａの計算を図示している。

【0016】

【図3】図３は、異なる脂質に対するルシフェラーゼ活性比較データを提供している。

【0017】

【図4】図４は、２種の異なるペグ化脂質を含む組成物に対する比較データを示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下の説明では、本発明の様々な実施形態の十分な理解が得られるよう、ある特定の詳細が記載されている。しかし、当業者であれば、これらの詳細なしに本発明は実施され得ることを理解するであろう。

【0019】

本発明は、哺乳動物の細胞への、核酸などの活性薬剤または治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達のために脂質ナノ粒子において使用した場合に利点をもたらす新規のカチオン性（アミノ）脂質の発見に部分的に基づく。特に、本発明の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、核酸の活性の増加および組成物の耐性の改善を提供し、以前記載された核酸－脂質ナノ粒子組成物と比較した場合、治療指数の顕著な増加をもたらす、本明細書に記載の新規カチオン性脂質の１つまたは複数を含む核酸－脂質ナノ粒子組成物を提供する。

【0020】

特定の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡおよび／または他のオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ送達のための改善された組成物の製剤化を可能にする新規カチオン性脂質を提供する。一部の実施形態では、これらの改善された脂質ナノ粒子組成物は、ｍＲＮＡによってコードされているタンパク質の発現に有用である。他の実
施形態では、これらの改善された脂質ナノ粒子組成物は、１つの標的ｍＲＮＡまたはいくつかのｍＲＮＡを調節する１つの特定のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの群を標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を送達することによって、内因性タンパク質の発現を上方制御するのに有用である。他の実施形態では、これらの改善された脂質ナノ粒子組成物は、標的遺伝子のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルを下方制御（例えば、サイレンシング）するのに有用である。いくつかの他の実施形態では、脂質ナノ粒子はまた、導入遺伝子の発現のためのｍＲＮＡおよびプラスミドの送達にも有用である。さらなる他の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、タンパク質の発現に起因する薬理効果、例えば、適切なエリスロポエチンｍＲＮＡの送達を介した赤血球産生の増加、または適切な抗体をコードしているｍＲＮＡの送達を介した感染からの保護などを誘発するのに有用である。

【0021】

本発明の脂質ナノ粒子および組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、封入されたまたは付随する（例えば、複合体形成された）治療剤、例えば、核酸を細胞に送達することを含めて、様々な目的に使用することができる。したがって、本発明の実施形態は、対象を適切な治療剤を封入または付随している脂質ナノ粒子と接触させることによって、疾患または障害の処置または予防をそれを必要とする対象において行う方法であって、脂質ナノ粒子が、本明細書に記載の新規カチオン性脂質の１つまたは複数を含む方法を提供する。

【0022】

本明細書に記載されているように、本発明の脂質ナノ粒子の実施形態は、例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ阻害剤（アンタゴミール／抗ｍｉｒ）、メッセンジャー－ＲＮＡ－干渉性相補性ＲＮＡ（ｍｉｃＲＮＡ）、ＤＮＡ、多価ＲＮＡ、ダイサー基質ＲＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などを含めた、核酸の送達に特に有用である。したがって、本発明の脂質ナノ粒子および組成物は、細胞を、本明細書に記載の１つまたは複数の新規のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子と接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で所望のタンパク質の発現を誘発させるために使用することができ、脂質ナノ粒子は、所望のタンパク質を生成するために発現される核酸（例えば、所望のタンパク質をコードしているメッセンジャーＲＮＡまたはプラスミド）を封入または付随している。代わりに、本発明の脂質ナノ粒子および組成物は、細胞を、本明細書に記載の１つまたは複数の新規カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子と接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で標的遺伝子およびタンパク質の発現を低減するために使用することができ、脂質ナノ粒子は、標的遺伝子の発現を減少させる核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））を封入または付随している。本発明の脂質ナノ粒子および組成物はまた、異なる核酸（例えば、適切な遺伝子修飾酵素をコードするｍＲＮＡおよび宿主ゲノムへの組込みのためのＤＮＡセグメント（複数可））の共局在化を必要とする作用を提供するために有用であり得るなど、異なる核酸（例えば、ｍＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡ）を別々にまたは組み合わせて共同送達するために使用することができる。

【0023】

本発明での使用のための核酸は、任意の利用可能な技術に従い調製することができる。ｍＲＮＡに関して、調製の主要な方法は、これに限定されないが、長い配列に特異的なｍＲＮＡを生成する最も効率的な方法を現在代表する酵素合成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とも呼ばれる）である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、目的の遺伝子をコードしている下流の配列に連結している上流バクテリオファージプロモーター配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６コリファージからのものを含むが、これらに限定されない）で構成される操作されたＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ分子のテンプレート指示合成のプロセスを記載する。テンプレートＤＮＡは、これらに限定されないが、プラスミドＤＮＡおよびポリメラーゼ連鎖反応増幅を含めた当技術分野で周知である適当な技術を用いて、いくつかの供給源からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために調製することができる（Ｌｉｎｐｉｎｓｅｌ， Ｊ． Ｌ
およびＣｏｎｎ， Ｇ． Ｌ．、Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ、ならびにＢｏｗｍａｎ， Ｊ．Ｃ．、Ａｚｉｚｉ， Ｂ．、Ｌｅｎｚ， Ｔ．Ｋ．、Ｒａｙ， Ｐ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ， Ｌ．Ｄ．、ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ、９４１巻、Ｃｏｎｎ Ｇ．Ｌ．（編）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２年を参照されたい）。

【0024】

ＲＮＡの転写は、生成したｍＲＮＡ転写物の起こり得る分解を最小限に抑えながら、ポリメラーゼ活性を支持する条件下で、対応するＲＮＡポリメラーゼならびにアデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）の存在下で線状化ＤＮＡテンプレートを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、これらに限定されないが、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含めた様々な市販のキットを使用して、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰを含めた市販の試薬を用いて実施することができる。ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための方法は当技術分野で周知である。（例えば、これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｏｓｉｃｋ， Ｒ．、１９７２年、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、４１巻、４０９～４６頁；Ｋａｍａｋａｋａ， Ｒ． Ｔ．およびＫｒａｕｓ， Ｗ． Ｌ．、２００１年、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２：１１．６：１１．６．１～１１．６．１７；Ｂｅｃｋｅｒｔ， Ｂ．およびＭａｓｑｕｉｄａ， Ｂ．、（２０１０年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ＲＮＡ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７０３巻（Ｎｅｉｌｓｏｎ， Ｈ．編）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１０年；Ｂｒｕｎｅｌｌｅ， Ｊ．Ｌ．およびＧｒｅｅｎ， Ｒ．、２０１３年、第５章Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｒ ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５３０巻、１０１～１１４頁を参照されたい）。

【0025】

次いで、所望の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡは、転写または関連する反応の所望しない構成成分（取り込まれなかったｒＮＴＰ、タンパク質酵素、塩、短いＲＮＡオリゴなどを含む）から精製される。ｍＲＮＡ転写物の単離のための技術は当技術分野で周知である。周知の手順として、一価カチオンまたは塩化リチウムの存在下での、アルコール（エタノール、イソプロパノール）によるフェノール／クロロホルム抽出または沈殿が挙げられる。使用することができる精製手順の追加の、非限定的例として、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｌｕｋａｖｓｋｙ， Ｐ．Ｊ．およびＰｕｇｌｉｓｉ， Ｊ．Ｄ．、２００４年、Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－ｆｒｅｅ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＲＮＡ、１０巻、８８９～８９３頁）、シリカベースの親和クロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂｏｗｍａｎ， Ｊ．Ｃ．、Ａｚｉｚｉ， Ｂ．、Ｌｅｎｚ， Ｔ．Ｋ．、Ｒａｙ， Ｐ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ， Ｌ．Ｄ．、ｉｎ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ、９４１巻、Ｃｏｎｎ Ｇ．Ｌ．（編）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）が挙げられる。精製は、これらに限定されないが、Ｓ
Ｖ Ｔｏｔａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ）を含めた、様々な市販のキットを使用して実施することができる。

【0026】

さらに、逆転写は多量のｍＲＮＡを産生することができるが、その産物は、全長ｍＲＮＡの調製物から除去する必要があり得る所望しないポリメラーゼ活性に伴ういくつかの異常なＲＮＡ不純物を含有する可能性がある。これらは、不完全な転写開始ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡテンプレートからの、ＲＮＡをプライマーとした転写、および自己相補性３’伸長により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から生じる短いＲＮＡを含む。ｄｓＲＮＡ構造を有するこれらの混入物は、特定の核酸構造を認識し、強力な免疫応答を誘発するように機能する真核細胞内の様々な生得的免疫センサーとの相互作用を介して所望しない免疫刺激活性をもたらす可能性があることが実証されている。ひいてはこれによって、細胞の生得的免疫応答の間、タンパク質合成は減少するため、ｍＲＮＡ翻訳が劇的に減少する可能性がある。したがって、これに限定されないが、拡張可能なＨＰＬＣ精製を含めた、これらのｄｓＲＮＡ混入物を除去するための追加的技術が開発され、当技術分野で公知である（例えばＫａｒｉｋｏ， Ｋ．、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｈ．、Ｌｕｄｗｉｇ， Ｊ．およびＷｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、２０１１年、Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ， ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍＲＮＡ、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、３９巻、ｅｌ４２；Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、Ｐａｒｄｉ， Ｎ．、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｈ．およびＫａｒｉｋｏ， Ｋ．、ＨＰＬＣ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６９巻（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｐ．Ｈ．編）、２０１３年を参照されたい）。ＨＰＬＣ精製されたｍＲＮＡは、特に一次細胞およびｉｎ ｖｉｖｏでずっとより大きなレベルで翻訳されることが報告されている。

【0027】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡの特定の特性を変化させ、その有用性を改善するために使用されるかなり様々な修飾が当技術分野で記載されている。これらは、ｍＲＮＡの５’および３’末端に対する修飾を含むが、これらに限定されない。内因性真核生物のｍＲＮＡは通常、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）の結合の媒介に重要な役割を果たす（これが、ひいては、細胞内のｍＲＮＡ安定性およびｍＲＮＡ翻訳の効率の増強に関与する）成熟分子の５’－末端上にキャップ構造を含有する。したがって、最高レベルのタンパク質発現が、キャッピングされたｍＲＮＡ転写物を用いて達成される。５’－キャップは、最も５’側のヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間の５’－５’－トリホスフェート結合を含有する。コンジュゲートグアニンヌクレオチドはＮ７位でメチル化されている。追加的修飾は、２’－ヒドロキシル基上の最も５’側のヌクレオチドおよび最も５’側から２番目のヌクレオチドのメチル化を含む。

【0028】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された合成ｍＲＮＡの５’－キャップを生成するために、複数の異なるキャップ構造を使用することができる。合成ｍＲＮＡの５’－キャッピングは、ケミカルキャップアナログとの共転写により実施することができる（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写中のキャッピング）。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、１つのグアニンがＮ７メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基を含有する５’－５’－トリホスフェートグアニン－グアニン結合を含有する。しかし、転写物の２０％までが、この共転写プロセス中にキャッピングされないまま残り、合成キャップアナロ
グは本物の細胞ｍＲＮＡの５’－キャップ構造と同一ではなくなり、翻訳可能性および細胞安定性を潜在的に減少させる。代わりに、合成ｍＲＮＡ分子はまた、転写後に酵素によりキャッピングされてもよい。これらは、キャップ結合タンパク質の結合が増強し、半減期が増加し、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が減少し、および／または５’デキャッピングが減少した内因性５’－キャップを構造的または機能的にさらに厳密に模倣するより本物の５’－キャップ構造を生成することができる。ｍＲＮＡ安定性および翻訳可能性を増強するために、多くの合成用５’－キャップアナログが開発され、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ， Ｅ．、Ｋｏｗａｌｓｋａ， Ｊ．、Ｓｕ， Ｗ．、Ｋｕｈｎ， Ａ．Ｎ．、Ｓｌｅｐｅｎｋｏｖ， Ｓ．Ｖ．、Ｄａｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｅ．、Ｓａｈｉｎ， Ｕ．、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ， Ｊ．およびＲｈｏａｄｓ， Ｒ．Ｅ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６９巻（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｐ．Ｈ．編）、２０１３年を参照されたい）。

【0029】

３’－末端において、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）は通常、ＲＮＡプロセシング中にｍＲＮＡ分子に付加される。転写直後に、転写物の３’末端は切断されて、３’ヒドロキシルを解放し、これに対して、ポリアデニル化と呼ばれるプロセスにおいて、ポリＡポリメラーゼはアデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの翻訳効率と安定性の両方を増強することが広く示されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｐ．およびＲｏｓｓ， Ｊ．、１９８９年、Ｐｏｌｙ （Ａ）、ｐｏｌｙ （Ａ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ Ｓｃｉ、１４巻、３７３～３７７頁；Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ， Ｊ．およびＢｒｅｗｅｒ， Ｇ．、２００１年、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ、Ｇｅｎｅ、２６５巻、１１～２３頁；Ｄｒｅｙｆｕｓ， Ｍ．およびＲｅｇｎｉｅｒ， Ｐ．、２００２年、Ｔｈｅ ｐｏｌｙ （Ａ） ｔａｉｌ ｏｆ ｍＲＮＡｓ： Ｂｏｄｙｇｕａｒｄ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｅｌｌ、１１１巻、６１１～６１３頁を参照されたい）。

【0030】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡのポリ（Ａ）テーリングは、これらに限定されないが、ポリ（Ｔ）領域のＤＮＡテンプレートへのクローニングまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用した転写後の付加を含めた様々な手法を使用して達成することができる。最初のケースは、ポリ（Ｔ）領域の大きさに応じて、定義された長さのポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能にするが、テンプレートの追加操作を必要とする。後者のケースは、アデニン残基の、ＲＮＡの３’末端への組込みを触媒するポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、ポリ（Ａ）テールをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｍＲＮＡに酵素的に付加することを含み、ＤＮＡテンプレートの追加操作は必要ないが、不均一な長さのポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡが結果として生じる。５’－キャッピングおよび３’－ポリ（Ａ）テーリングは、これらに限定されないが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングキット（ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ）、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキットおよびポリ（Ａ）テーリングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含めた様々な市販のキットを使用して、ならびに市販の試薬、様々なＡＲＣＡキャップ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼなどを用いて実施することができる。

【0031】

５’キャップおよび３’ポリアデニル化に加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物の他の修飾が、翻訳の効率および安定性に関係するような利益を提供することが報告されている。病原体ＤＮＡおよびＲＮＡは、真核細胞内の様々なセンサーにより認識され、強力な生得的
免疫応答を引き起こすことができることが当技術分野で周知されている。自然の供給源由来の大部分の核酸は修飾ヌクレオシドを含有するので、病原体ＤＮＡおよびＲＮＡと、自己ＤＮＡおよびＲＮＡとを判別する能力は、少なくとも部分的に構造およびヌクレオシド修飾に基づくことが示されている。対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したＲＮＡは、これらの修飾を欠き、したがって免疫刺激性になり、これが、ひいては、上記に概説されているように有効なｍＲＮＡ翻訳を阻害する可能性がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡへの修飾ヌクレオシドの導入を使用して、ＲＮＡセンサーの認識および活性化を防止し、したがってこの所望しない免疫刺激活性を軽減し、翻訳能力を増強することができる（例えば、Ｋａｒｉｋｏ， Ｋ．およびＷｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、２００７年、Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＲＮＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ、１０巻、５２３～５３２頁；Ｐａｒｄｉ， Ｎ．、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｈ．、Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、Ｋａｒｉｋｏ， Ｋ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６９巻（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｐ．Ｈ．編）、２０１３年；Ｋａｒｉｋｏ， Ｋ．、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｈ．、Ｗｅｌｓｈ， Ｆ．Ａ．、Ｌｕｄｗｉｇ， Ｊ．、Ｋａｔｏ， Ｈ．、Ａｋｉｒａ， Ｓ．、Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、２００８年、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ Ｉｎｔｏ ｍＲＮＡ Ｙｉｅｌｄｓ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６巻、１８３３～１８４０頁を参照されたい）。修飾ＲＮＡの合成に使用される修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、当技術分野で公知の一般的方法および手順を使用して、調製、モニターおよび利用することができる。単独でまたは他の修飾ヌクレオシドと組み合わせて、ある程度ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡに取り込むことができる多種多様のヌクレオシド修飾が利用可能である（例えば、ＵＳ２０１２／０２５１６１８を参照されたい）。ヌクレオシド修飾されたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成は、同時に翻訳能力を増強しながら、免疫センサーを活性化する能力を減少させることが報告されている。

【0032】

翻訳可能性および安定性に関する利益を提供するために修飾することができるｍＲＮＡの他の構成成分として、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）が挙げられる。両方ともまたは独立して、ＵＴＲ（好ましい５’および３’ＵＴＲは細胞またはウイルスＲＮＡから得ることができる）を最適化することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡのｍＲＮＡ安定性および翻訳効率を増加させることが示されている（例えば、Ｐａｒｄｉ， Ｎ．、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｈ．、Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｄ．、Ｋａｒｉｋｏ， Ｋ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６９巻（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｐ．Ｈ．編）、２０１３年を参照されたい）。

【0033】

ｍＲＮＡに加えて、他の核酸ペイロードを本発明に使用することができる。オリゴヌクレオチドに対して、調製の方法として、これらに限定されないが、長い前駆体の化学合成および酵素的、化学的切断、上記のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写などが挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で広く使用され、周知である
（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれている、Ｇａｉｔ， Ｍ． Ｊ．（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８４年；およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ．（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８８巻（Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００５年を参照されたい）。

【0034】

プラスミドＤＮＡに関して、本発明での使用のための調製は、これらに限定されないが、目的のプラスミドを含有する細菌の液体培養物中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラスミドＤＮＡの増大および単離を一般的に利用する。特定の抗生剤（ペニシリン、カナマイシンなど）に対する耐性をコードする目的のプラスミドに遺伝子が存在することにより、目的のプラスミドを含有する細菌を、抗生剤を含有する培養物中で選択的に増殖させることが可能となる。プラスミドＤＮＡを単離する方法は当技術分野で広く使用され、周知である（例えば、Ｈｅｉｌｉｇ， Ｊ．、Ｅｌｂｉｎｇ， Ｋ． Ｌ．およびＢｒｅｎｔ， Ｒ（２００１年）Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．、４１巻：ＩＩ号：１．７：１．７．１～１．７．１６頁；Ｒｏｚｋｏｖ， Ａ．、Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｂ．、Ｇｉｌｌｓｔｒｏｍ， Ｓ．、Ｂｊｏｒｎｅｓｔｅｄｔ， Ｒ．、およびＳｃｈｍｉｄｔ， Ｓ． Ｒ．（２００８年）、Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、９９巻：５５７～５６６頁；およびＵＳ６１９７５５３Ｂ１を参照されたい）。プラスミド単離は、これらに限定されないが、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＧｅｎＪＥＴ プラスミドＭａｘｉＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ ＭａｘｉＰｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを含めた様々な市販のキットを使用して、ならびに市販の試薬を用いて実施することができる。

【0035】

遺伝子およびタンパク質発現をモジュレートする核酸などの活性薬剤または治療剤を送達するための、本発明のカチオン性脂質、これを含む脂質ナノ粒子および組成物、ならびにこれらの使用の様々な例示的な実施形態が、以下にさらに詳細に記載されている。

【0036】

本明細書で使用される場合、他に特定されていない限り、以下の用語は、これらに属する意味を有する。

【0037】

特に文脈上異なって理解されることを要しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む」およびその変形形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などは、開かれた、包括的な意味、すなわち、「～を含むが、これらに限定されない」と解釈されるものとする。

【0038】

本明細書全体にわたり「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、この実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体にわたり様々な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方式で組み合わせてもよい。

【0039】

他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は
、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されているものと同じ意味を有する。明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特に文脈上そうではないことが明確に指示されていない限り、複数の言及を含む。

【0040】

「所望のタンパク質の発現を誘発する」という句は、所望のタンパク質の発現を増加させる核酸の能力を指す。タンパク質発現の程度を調査するため、試験試料（例えば、所望のタンパク質を発現する培養中の細胞試料）または試験哺乳動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどまたは動物モデル、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）などまたはヒト以外の霊長類（例えば、サル）モデル）を核酸（例えば、本発明の脂質と組み合わせた核酸）と接触させる。試験試料または試験動物における所望のタンパク質の発現を、核酸と接触させていない、または核酸が投与されていない対照試料（例えば、所望のタンパク質を発現する培養中の細胞試料）または対照哺乳動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどまたは動物モデル、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）などまたはヒト以外の霊長類（例えば、サル）モデル）中の所望のタンパク質の発現と比較する。所望のタンパク質が対照試料または対照哺乳動物に存在する場合、対照試料または対照哺乳動物中の所望のタンパク質の発現に１．０の値を割り当てることができる。特定の実施形態では、所望のタンパク質の発現の誘発は、試験試料または試験哺乳動物中の所望のタンパク質発現の、対照試料または対照哺乳動物中の所望のタンパク質発現のレベルに対する比が１を超えた場合、例えば、約１．１、１．５、２．０、５．０または１０．０である場合達成される。所望のタンパク質が対照試料または対照哺乳動物中に存在しない場合、所望のタンパク質の発現の誘発は、試験試料または試験哺乳動物中で、任意の測定可能なレベルの所望のタンパク質が検出された場合達成される。当業者であれば、試料中のタンパク質発現レベルを判定するのに適当なアッセイ、例えばドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、および表現型アッセイ、または適当な条件下で蛍光もしくは発光を生成できるリポータータンパク質に基づくアッセイを理解している。

【0041】

「標的遺伝子の発現を阻害する」という句は、標的遺伝子の発現をサイレンシングさせる、減少させる、または阻害する核酸の能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を調査するために、試験試料（例えば、標的遺伝子を発現する培養中の細胞試料）または試験哺乳動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどまたは動物モデル、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）などまたはヒト以外の霊長類（例えば、サル）モデル）を、標的遺伝子の発現をサイレンシングさせる、減少させる、または阻害する核酸と接触させる。試験試料または試験動物中の標的遺伝子の発現を、核酸と接触させていない、または核酸が投与されていない対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する培養中の細胞試料）または対照哺乳動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどまたは動物モデル、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）などまたはヒト以外の霊長類（例えば、サル）モデル）中の標的遺伝子の発現と比較する。対照試料または対照哺乳動物中の標的遺伝子の発現に、１００％の値を割り当てることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害、または減少は、対照試料または対照哺乳動物中の標的遺伝子発現のレベルに対する、試験試料または試験哺乳動物中の標的遺伝子の発現レベルが約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％である場合達成される。言い換えると、核酸は、核酸と接触させていない、または核酸が投与されていない対照試料または対照哺乳動物中の標的遺伝子の発現レベルに対して、試験試料または試験哺乳動物中で標的遺伝子の発現を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％サイレンシング、減少させる、または阻害することが可能である。標的遺伝子の発現レベルを判定するのに適切なアッセイとして、限定
されないが、当業者に公知の技術、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどを使用したタンパク質またはｍＲＮＡレベルの調査が挙げられる。

【0042】

活性薬剤または治療剤、例えば、治療用核酸などの「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果、例えば、核酸の不在下で検出された通常の発現レベルと比較して、標的配列の発現の増加または阻害を生じるのに十分な量である。標的配列の発現の増加は、核酸の不在下では存在しない発現産物のケースでは、任意の測定可能なレベルが検出された場合達成される。核酸との接触以前に発現産物があるレベルで存在するケースでは、発現の増加は、ｍＲＮＡなどの核酸を用いて得た値の倍増が、対照に対して、約１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、５０００、１００００倍またはそれ超である場合達成される。標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸を用いて得た値が、対照に対して、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％である場合達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するのに適切なアッセイとして、例えば、当業者に公知の技術、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、適切なリポータータンパク質の蛍光または発光、ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどを使用したタンパク質またはＲＮＡレベルの調査が挙げられる。

【0043】

本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、またはベクターの形態であってよい。ＲＮＡは、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉｃＲＮＡ、多価ＲＮＡ、ダイサー基質ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびこれらの組合せの形態であってよい。核酸は、合成、天然、および非天然のものであり、基準核酸と同様の結合特性を有する、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基または結合を含有する核酸を含む。このようなアナログの例として、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。具体的に限定されない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有する自然のヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。他に指示されていない限り、特定の核酸配列はまた、伝統的方式で修飾されたその変形（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、単一ヌクレオチド多型、および相補性配列ならびに明示的に示された配列も暗示的に包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６０巻：２６０５～２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ、８巻：９１～９８頁（１９９４年））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して一緒に連結している。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、このプリンおよびピリミジンは、自然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および自然のアナログ、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含み、このプリンおよびピリミジンの合成誘導体は、例えば、これらに
限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハロゲン化物などの新規反応性基を配置する修飾を含むが、これに限定されない。

【0044】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分的長さまたは全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。

【0045】

「遺伝子産物」とは、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。

【0046】

「脂質」という用語は、これらに限定されないが、脂肪酸のエステルを含み、水中では難溶解性であるが、多くの有機溶媒中では溶解性であることを一般的に特徴とする有機化合物の群を指す。脂質は、少なくとも３つのクラスに通常分割される：（１）「単純な脂質」、これは脂肪および油ならびに蝋を含む、（２）「複合脂質」、これは、リン脂質および糖脂質を含む、ならびに（３）「誘導脂質」、例えば、ステロイドなど。

【0047】

「ステロイド」は、以下の炭素骨格：

【化3】

を含む化合物である。ステロイドの非限定的例として、コレステロールなどが挙げられる。

【0048】

「カチオン性脂質」とは、正に帯電することが可能な脂質を指す。例示的なカチオン性脂質は、正電荷を保持する１つまたは複数のアミン基を含む。好ましいカチオン性脂質は、これらが、ｐＨに応じて、正に帯電しているか、または中性の形態で存在できるようにイオン化できる。カチオン性脂質のイオン化は、異なるｐＨ条件下での脂質ナノ粒子の表面電荷に影響を及ぼす。この電荷状態は、血漿タンパク質吸収、血液クリアランスおよび組織分布（Ｓｅｍｐｌｅ， Ｓ．Ｃ．ら、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ、３２巻：３～１７頁（１９９８年））ならびに核酸の細胞内送達に重要な意味を持つエンドソーム溶解性の非二重層構造を形成する能力（Ｈａｆｅｚ， Ｉ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８巻：１１８８～１１９６頁（２００１年））に影響を及ぼし得る。

【0049】

「脂質ナノ粒子」という用語は、式（Ｉ）の化合物または他の特定されたカチオン性脂質の１つまたは複数を含む、少なくとも１つのナノメートル程度の（例えば、１～１，０００ｎｍ）寸法を有する粒子を指す。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官、腫瘍など）に活性薬剤または治療剤、例えば、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）などを送達するために使用することができる製剤に含まれている。一部の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は核酸を含む。このような脂質ナノ粒子は通常、式（Ｉ）の化合物と、中性脂質、荷電脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質から選択される１つまたは複数の賦形剤とを含む。一部の実施形態では、活性薬剤または治療剤、例えば、核酸などは、脂質ナノ粒子の脂質部分または脂質ナノ粒子の脂質部分の一部もしくはすべてにより包まれた水性空間に封入され、これによって、宿主生物または細胞の機構、例えば、有害な免疫応答により誘発される酵素的分解または他の有害作用からこれを保護することができる。

【0050】

様々な実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１
５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍの平均径を有し、実質的に無毒性である。ある特定の実施形態では、核酸は、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸を含む脂質ナノ粒子およびこれらの調製方法は、例えば、すべての目的のために、これら全体においてその完全な開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許公開第２００４／０１４２０２５号、第２００７／００４２０３１号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０１６０５８およびＷＯ２０１３／０８６３７３に開示されている。

【0051】

本明細書で使用される場合、「～が封入された脂質」とは、完全な封入、部分的な封入、または両方を用いて、活性薬剤または治療剤、例えば、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）などを提供する脂質ナノ粒子を指す。ある実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は脂質ナノ粒子内に完全に封入されている。

【0052】

「ポリマーコンジュゲート脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を指す。ポリマーコンジュゲート脂質の例はペグ化脂質である。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知であり、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）などを含む。

【0053】

「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨにおいて、帯電していないか、または中性の双性イオン形態のいずれかで存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。生理学的ｐＨでのこのような脂質として、これらに限定されないが、ホスホチジルコリン、例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｓ）例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、セラミドなど、ステロイド、例えば、ステロールなどおよびこれらの誘導体が挙げられる。中性脂質は、合成でも、または自然由来でもよい。

【0054】

「荷電脂質」という用語は、有用な生理学的な範囲内のｐＨ、例えばｐＨ約３～ｐＨ約９であるかに関係なく、正に帯電または負に帯電した形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。荷電脂質は合成でもまたは自然由来でもよい。荷電脂質の例として、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ステロールヘミスクシネート、ジアルキルトリメチルアンモニウム－プロパン、（例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）、ジアルキルジメチルアミノプロパン、エチルホスホコリン、ジメチルアミノエタンカルバモイルステロール（例えばＤＣ－Ｃｈｏｌ）が挙げられる。

【0055】

本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、水を含む組成物を指す。

【0056】

核酸脂質ナノ粒子に関連して「血清安定している」とは、遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを有
意に分解する、血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後、ヌクレオチドが有意に分解しないことを意味する。適切なアッセイとして、例えば、標準血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが挙げられる。

【0057】

「全身送達」は、本明細書で使用される場合、生物内で活性薬剤の広範囲な曝露をもたらすことができる治療用製品の送達を指す。一部の投与技術は、ある特定の薬剤の全身送達をもたらすことができるが、他の薬剤はできない。全身送達とは、薬剤の有用な、好ましくは治療用の量が身体の大部分に曝露されることを意味する。脂質ナノ粒子の全身送達は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、および腹腔内送達を含めた当技術分野で公知の任意の手段によることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の全身送達は静脈内送達による。

【0058】

「局所送達」とは、本明細書で使用される場合、生物内の標的部位に直接活性薬剤を送達することを指す。例えば、薬剤は、疾患部位、例えば、腫瘍など、他の標的部位、例えば、炎症部位など、または標的器官、例えば、肝臓、心臓、膵臓、腎臓などに直接注射することにより局所的に送達できる。局所送達はまた、局所的適用または局所的注射の技術、例えば、筋肉内、皮下または皮内注射などを含むことができる。局所送達は、全身性薬理効果を妨げない。

【0059】

「アルキル」とは、飽和または不飽和（すなわち、１つまたは複数の二重および／または三重結合を含有する）であり、１～２４個の炭素原子（Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ_１～Ｃ_８アルキル）または１～６個の炭素原子（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）を有し、単結合により残りの分子に結合している炭素および水素原子のみからなる直鎖状または分岐状の炭化水素鎖基、例えば、メチル、エチル、ｎプロピル、１メチルエチル（イソプロピル）、ｎブチル、ｎペンチル、１，１ジメチルエチル（ｔブチル）、３メチルヘキシル、２メチルヘキシル、エテニル、プロパ１エニル、ブタ１エニル、ペンタ１エニル、ペンタ１，４ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを指す。明細書中でそうではないことが具体的に述べられていない限り、アルキル基は任意選択で置換されている。

【0060】

「シクロアルキル」または「炭素環」は、縮合または架橋した環系を含んでもよく、３～１５個の炭素原子を有し、好ましくは３～１０個の炭素原子を有し、飽和または不飽和であり、単結合により残りの分子に結合している、炭素および水素原子のみからなる安定した非芳香族の単環式または多環式炭化水素基を指す。単環式基として、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。多環式基として、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタニルなどが挙げられる。明細書中でそうではないことが具体的に述べられていない限り、シクロアルキル基は任意選択で置換されている。

【0061】

「ヘテロシクリル」または「複素環」は、２～１２個の炭素原子、ならびに窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１～６個のヘテロ原子からなる安定した３～１８員の非芳香族環の基を指す。本明細書中でそうではないことが具体的に述べられていない限り、ヘテロシクリル基は、縮合または架橋した環系を含んでもよい、単環式、二環式、三環式または四環式環系であってよく、ヘテロシクリル基の窒素、炭素または硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子は任意選択で四級化されていてもよく、ヘテロシクリル基は部分的または完全に飽和していてもよい。このようなヘテロシクリル基の例として、これらに限定されないが、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインド
リル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソ－チオモルホリニル、および１，１－ジオキソ－チオモルホリニルが挙げられる。本明細書中でそうではないことが具体的に述べられていない限り、ヘテロシクリル基は任意選択で置換されていてもよい。

【0062】

本明細書で使用される「置換されている」という用語は、少なくとも１個の水素原子が、非水素原子、例えば、これに限定されないが、ハロゲン原子、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなど；オキソ基（＝Ｏ）；ヒドロキシル基（－ＯＨ）；アルコキシ基（－ＯＲ^ａ、式中、Ｒ^ａはＣ_１～Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキルである）；カルボキシル基（－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ａまたは－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ａ、式中、Ｒ^ａは、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキルである）；アミン基（－ＮＲ^ａＲ^ｂ、式中、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキルである）；Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基；ならびにシクロアルキル基との結合により置き換えられている、上記の基のいずれか（例えば、アルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクリル）を意味する。一部の実施形態では、置換基はＣ_１～Ｃ_１２アルキル基である。他の実施形態では、置換基はシクロアルキル基である。他の実施形態では、置換基は、ハロ基、例えば、フルオロなどである。他の実施形態では、置換基はオキソ基である。他の実施形態では、置換基はヒドロキシル基である。他の実施形態では、置換基はアルコキシ基である。他の実施形態では、置換基はカルボキシル基である。他の実施形態では、置換基はアミン基である。

【0063】

「任意選択の」または「任意選択で」（例えば、任意選択で置換されている）は、続いて記載されている状況の事象が起こっても、または起こらなくてもよいことを意味し、記載は、前記事象または状況が起こった場合と、それが起こらない場合とを意味する。例えば、「任意選択で置換されているアルキル」とは、アルキル基は、置換されていても、または置換されていなくてもよいことを意味し、記載は置換アルキル基と置換を有さないアルキル基の両方を含むことを意味する。

【0064】

「プロドラッグ」とは、生理的条件下で、または本発明の生物活性のある化合物への加溶媒分解により、変換することができる化合物を示すことを意図する。したがって、「プロドラッグ」という用語は、薬学的に許容される本発明の化合物の代謝性前駆体を指す。プロドラッグは、それを必要とする対象に投与された時点で不活性であってよいが、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明の活性化合物に変換される。プロドラッグは通常、例えば、血中の加水分解により、ｉｎ ｖｉｖｏで急速に変換されて、本発明の親化合物を産生する。プロドラッグ化合物は、哺乳動物の生物において、溶解性、組織適合性または遅延放出という利点をしばしばもたらす（Ｂｕｎｄｇａｒｄ， Ｈ．、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（１９８５年）、７～９頁、２１～２４頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を参照されたい）。プロドラッグの議論は、Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｔら、Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、１４巻およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｄｗａｒｄ Ｂ． Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年において提供されている。

【0065】

「プロドラッグ」という用語はまた、このようなプロドラッグが哺乳動物の対象に投与された場合に本発明の活性化合物をｉｎ ｖｉｖｏで放出する任意の共有結合した担体を含むことを意図する。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾が、規定通りの操作またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで切断されて本発明の親化合物になるように、本発明の化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグは、ヒ
ドロキシ、アミノまたはメルカプト基が任意の基に結合し、本発明の化合物のプロドラッグが、哺乳動物の対象に投与された場合、この任意の基が切断されて、遊離ヒドロキシ、遊離アミノまたは遊離メルカプト基をそれぞれ形成する本発明の化合物を含む。プロドラッグの例として、これらに限定されないが、本発明の化合物中のアルコールのアセテート、ホルメートおよびベンゾエート誘導体またはアミン官能基のアミド誘導体などが挙げられる。

【0066】

本明細書で開示されている本発明はまた、１個または複数の原子が、異なる原子量または質量数を有する原子で置き換えられることにより同位体標識されている、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物のすべての薬学的に許容される化合物を包含することを意図する。開示化合物に取り込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素、およびヨウ素の同位体、例えば、それぞれ^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^１２３Ｉ、および^１２５Ｉなどが挙げられる。これらの放射標識した化合物は、例えば、作用部位もしくは作用機序、または薬理学的に重要な作用部位への結合親和性を特徴付けることにより、化合物の有効性を判定または測定するのを助けるのに有用であり得る。構造（Ｉ）または（ＩＩ）のある特定の同位体で標識された化合物、例えば、放射性同位体を取り込んでいるものなどは、薬物および／または基質組織分布研究において有用である。放射性同位元素トリチウム、すなわち、^３Ｈ、および炭素１４、すなわち、^１４Ｃは、これらの組込みの容易さおよび素早い検出手段を考慮すると、この目的に特に有用である。

【0067】

より重い同位体、例えば、重水素、すなわち、^２Ｈなどによる置換は、より大きな代謝安定性、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加または必要用量の減少に起因するある特定の治療上の利点をもたらすことができるので、一部の状況では好ましいこともある。

【0068】

ポジトロン発光同位体、例えば、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏおよび^１３Ｎなどによる置換は、基質受容体占有率を調査するためのポジトロン放出トポグラフィー（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。構造（Ｉ）または（ＩＩ）の同位体標識された化合物は、当業者に公知の従来の技術によって、または以前に利用した非標識試薬の代わりに、適当な同位体標識した試薬を使用して、以下に提示されているように、調製および実施例に記載されているものと類似のプロセスにより一般的に調製することができる。

【0069】

本明細書で開示されている本発明はまた、開示化合物のｉｎ ｖｉｖｏ代謝産物を包含することを意図する。このような産物は、主に酵素的プロセスによる、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化などから生じ得る。したがって、本発明は、その代謝産物を産生するのに十分な期間、本発明の化合物を哺乳動物に投与することを含むプロセスにより生成される化合物を含む。このような産物は、本発明の放射標識した化合物を検出可能な用量で、ラット、マウス、モルモット、サル、またはヒトなどの動物に投与し、代謝が起きるだけの十分な時間を割り当て、尿、血液または他の生物試料からその変換産物を単離することによって通常同定される。

【0070】

「安定した化合物」および「安定した構造」とは、反応混合物から有用な程度の純度への単離および効果的治療剤への製剤化に耐え抜くのに十分に強固な化合物を示すことを意図する。

【0071】

「哺乳動物」は、ヒトならびに家畜、例えば、実験動物および家庭のペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）と、非家畜動物、例えば、野生生物などの両方を含む。

【0072】

「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」として、限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味向上剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、または乳化剤が挙げられ、これらは、ヒトまたは家畜における使用が許容されるとして米国食品医薬品局により認可されたものである。

【0073】

「薬学的に許容される塩」は、酸付加塩と塩基付加塩の両方を含む。

【0074】

「薬学的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の点で有害ではなく、無機酸、例えば、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、および有機酸、例えば、これらに限定されないが、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイヒ酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などと一緒に形成される塩を指す。

【0075】

「薬学的に許容される塩基付加塩」とは、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたはその他の点で有害ではない塩を指す。これらの塩は、無機塩基または有機塩基の遊離酸への付加から調製される。無機塩基に由来する塩として、これらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などが挙げられる。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩である。有機塩基に由来する塩として、これらに限定されないが、第一級、第二級、および第三級アミン、天然置換アミンを含めた置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂の塩、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などが挙げられる。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。

【0076】

結晶化は多くの場合、本発明の化合物の溶媒和物を生成する。本明細書で使用される場合、「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物の１個または複数の分子と、溶媒の１個または複数の分子とを含む凝集体を指す。溶媒は水であってよく、このケースでは、溶媒和物は水和物であってよい。代わりに、溶媒は有機溶媒であってよい。したがって、本発明の化合物は、一水和物、二水和物、半水化物、セスキ水和物、三水和物、四水和物などを含めた水和物、ならびに対応する溶媒和形態として存在し得る。本発明の化合物は真の溶媒和物であってよいが、その一方で、他のケースでは、本発明の化合物は、単に外来性
の水を保持してもよいし、または水とある外来性溶媒の混合物であってもよい。

【0077】

「医薬組成物」とは、本発明の化合物と、哺乳動物、例えば、ヒトに生物活性化合物を送達するために当技術分野で一般的に認められた媒体との製剤を指す。このような媒体として、このためのすべての薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤が挙げられる。

【0078】

「有効量」または「治療有効量」とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、哺乳動物、好ましくはヒトにおける処置を実行するのに十分である、本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の脂質ナノ粒子の量は、化合物、状態およびその重症度、投与方式、ならびに処置すべき哺乳動物の年齢に応じて変動することになるが、当業者であれば、自身の知識および本開示を考慮して規定通りに決定することができる。

【0079】

本明細書で使用される「処置する」または「処置」は、目的の疾患または状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトにおける目的の疾患または状態の処置を網羅し、
（ｉ）哺乳動物において、特に、このような哺乳動物がその状態に罹りやすくなっているが、それを有するとまだ診断されていない場合、その疾患もしくは状態が生じるのを防止すること、
（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害する、すなわち、その発症を抑止すること、
（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を緩和する、すなわち、その疾患もしくは状態の退行を引き起こすこと、または
（ｉｖ）疾患もしくは状態に起因する症状を緩和する、すなわち、根底にある疾患もしくは状態に対処することなく疼痛を緩和すること
を含む。本明細書で使用される場合、「疾患」および「状態」という用語は、交換可能に使用してもよいし、または特定の疾病もしくは状態が公知の原因物質を有さないこともあり（そのため、原因がまだ解決されておらず）、したがって疾患としてまだ認識されていないが、望ましくない状態もしくは症候群としてのみ認識され、程度の差はあるが特定の一連の症状が臨床医により確認されているという点で異なる場合もある。

【0080】

本発明の化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、１つまたは複数の不斉中心を含有することができ、したがって、アミノ酸に対して、絶対立体化学の点から（Ｒ）－もしくは（Ｓ）－、または（Ｄ）－もしくは（Ｌ）－と定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマー、および他の立体異性形態を生じることができる。本発明は、すべてのこのような可能な異性体、ならびにこれらのラセミおよび光学的に純粋な形態を含むことを意図する。光学活性（＋）および（－）、（Ｒ）－および（Ｓ）－、または（Ｄ）－および（Ｌ）－異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製してもよいし、または従来技術、例えば、クロマトグラフィーおよび分別再結晶を使用して分割してもよい。個々のエナンチオマーの調製／単離の従来技術は、適切な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、または、例えば、キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用したラセミ体（または塩もしくは誘導体のラセミ体）の分割を含む。本明細書に記載の化合物がオレフィン二重結合または他の幾何的不斉中心を含有する場合、他に特定されていない限り、化合物は、ＥとＺの両方の幾何異性体を含むことが意図される。同様に、すべての互変異性形態もまた含まれることが意図される。

【0081】

「立体異性体」とは、同じ結合により結合した同じ原子で構成されるが、交換可能ではない異なる三次元構造を有する化合物を指す。本発明は、様々な立体異性体およびその混合物を想定し、「エナンチオマー」を含み、「エナンチオマー」とは、その分子が互いに重ね合わせ不可能なミラーイメージである２つの立体異性体を指す。

【0082】

「互変異性体」とは、分子の１個の原子から、同じ分子の別の原子へのプロトン移動を
指す。本発明は任意の前記化合物の互変異性体を含む。

【0083】

化合物
ある態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドと共に脂質ナノ粒子を形成するために、他の脂質成分、例えば、中性脂質、荷電脂質、ステロイドおよび／またはポリマーコンジュゲート脂質などと組み合わせることが可能である新規脂質化合物を提供する。理論に制約されることを望むことなく、これらの脂質ナノ粒子は、血清中でオリゴヌクレオチドを分解から遮蔽し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの細胞への有効な送達を提供すると考えられている。

【0084】

一実施形態では、脂質化合物は、式（Ｉ）：

【化4】

（式中、
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または炭素－炭素二重結合であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^１ａはＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^１ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^２ａおよびＲ^２ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^２ａは、ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^２ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、出現ごとに、独立して（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^３ａはＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^３ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^４ａおよびＲ^４ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^４ａは、ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^４ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６は、それぞれ独立して、メチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ^７は、出現ごとに、独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^８およびＲ^９は、それぞれ独立して、非置換のＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、またはＲ^８およびＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５、６または７員の複素環を形成し、
ａおよびｄは、それぞれ独立して、０～２４の整数であり、
ｂおよびｃは、それぞれ独立して、１～２４の整数であり、
ｅは１または２である）
の構造またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する。

【0085】

式（Ｉ）化合物のある特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａもしくはＲ^４ａの少なくとも１つはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、またはＬ^１もしくはＬ^２の少なくとも１つは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂは、ａが６である場合、イソプロピルではなく、ａが８である場合、ｎ－ブチルではない。

【0086】

またさらなる実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａまたはＲ^４ａの少なくとも１つはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、またはＬ^１もしくはＬ^２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂは、ａが６である場合、イソプロピルではなく、ａが８である場合、ｎ－ブチルではない。

【0087】

式Ｉの化合物では、Ｌ^１またはＬ^２のいずれか１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または炭素－炭素二重結合であってよい。Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であっても、またはそれぞれ炭素－炭素二重結合であってもよい。

【0088】

一部の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の１つは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｌ^１とＬ^２の両方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。

【0089】

一部の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の１つは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｌ^１とＬ^２の両方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

【0090】

一部の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の１つは炭素－炭素二重結合である。他の実施形態では、Ｌ^１とＬ^２の両方は炭素－炭素二重結合である。

【0091】

また他の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ^１またはＬ^２のもう一方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。さらなる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ^１またはＬ^２のもう一方は炭素－炭素二重結合である。またさらなる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２のもう一方は炭素－炭素二重結合である。

【0092】

「炭素－炭素」二重結合とは、以下の構造：

【化5】

の１つを指すと理解されている（式中、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、出現ごとに、独立して、Ｈまたは置換基である）。例えば、一部の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、出現ごとに、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキル、例えばＨまたはＣ_１～Ｃ_１２アルキルである。

【0093】

他の実施形態では、脂質化合物は、以下の構造（Ｉａ）：

【化6】

を有する。

【0094】

他の実施形態では、脂質化合物は、以下の構造（Ｉｂ）：

【化7】

を有する。

【0095】

さらに他の実施形態では、脂質化合物は、以下の構造（Ｉｃ）：

【化8】

を有する。

【0096】

前述のある特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ独立して、２～１２の整数または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ独立して、８～１２または５～９の整数である。一部のある特定の実施形態では、ａは０である。一部の実施形態では、ａは１である。他の実施形態では、ａは２である。さらなる実施形態では、ａは３である。さらに他の実施形態では、ａは４である。一部の実施形態では、ａは５である。他の実施形態では、ａは６である。さらなる実施形態では、ａは７である。さらに他の実施形態では、ａは８である。一部の実施形態では、ａは９である。他の実施形態では、ａは１０である。さらなる実施形態では、ａは１１である。さらに他の実施形態では、ａは１２である。一部の実施形態では、ａは１３である。他の実施形態では、ａは１４である。さらなる実施形態では、ａは１５である。さらに他の実施形態では、ａは１６である。

【0097】

一部の実施形態では、ｂは１である。他の実施形態では、ｂは２である。さらなる実施形態では、ｂは３である。さらに他の実施形態では、ｂは４である。一部の実施形態では、ｂは５である。他の実施形態では、ｂは６である。さらなる実施形態では、ｂは７である。さらに他の実施形態では、ｂは８である。一部の実施形態では、ｂは９である。他の実施形態では、ｂは１０である。さらなる実施形態では、ｂは１１である。さらに他の実施形態では、ｂは１２である。一部の実施形態では、ｂは１３である。他の実施形態では、ｂは１４である。さらなる実施形態では、ｂは１５である。さらに他の実施形態では、ｂは１６である。

【0098】

一部の実施形態では、ｃは１である。他の実施形態では、ｃは２である。さらなる実施形態では、ｃは３である。さらに他の実施形態では、ｃは４である。一部の実施形態では、ｃは５である。他の実施形態では、ｃは６である。さらなる実施形態では、ｃは７である。さらに他の実施形態では、ｃは８である。一部の実施形態では、ｃは９である。他の実施形態では、ｃは１０である。さらなる実施形態では、ｃは１１である。さらに他の実施形態では、ｃは１２である。一部の実施形態では、ｃは１３である。他の実施形態では、ｃは１４である。さらなる実施形態では、ｃは１５である。さらに他の実施形態では、ｃは１６である。

【0099】

一部のある特定の実施形態では、ｄは０である。一部の実施形態では、ｄは１である。他の実施形態では、ｄは２である。さらなる実施形態では、ｄは３である。さらに他の実施形態では、ｄは４である。一部の実施形態では、ｄは５である。他の実施形態では、ｄは６である。さらなる実施形態では、ｄは７である。さらに他の実施形態では、ｄは８である。一部の実施形態では、ｄは９である。他の実施形態では、ｄは１０である。さらなる実施形態では、ｄは１１である。さらに他の実施形態では、ｄは１２である。一部の実施形態では、ｄは１３である。他の実施形態では、ｄは１４である。さらなる実施形態では、ｄは１５である。さらに他の実施形態では、ｄは１６である。

【0100】

一部の他の様々な実施形態では、ａおよびｄは同じである。一部の他の実施形態では、ｂおよびｃは同じである。一部の他の特定の実施形態では、ａおよびｄは同じであり、ｂおよびｃは同じである。

【0101】

ａとｂの合計およびｃとｄの合計は、所望の特性を有する脂質を得るために変化させることができる因子である。一実施形態では、ａおよびｂは、これらの合計が、１４～２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施形態では、ｃおよびｄは、これらの合計が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの合計およびｃとｄの合計は同じである。例えば、一部の実施形態では、ａとｂの合計およびｃとｄの合計は両方とも、１４～２４の範囲であってよい同じ整数である。またさらなる実施形態では、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、ａとｂの合計およびｃとｄの合計が１２またはそれ超となるように選択される。

【0102】

一部の実施形態では、ｅは１である。他の実施形態では、ｅは２である。

【0103】

Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａにおける置換基は特に限定されていない。ある特定の実施形態ではＲ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａは出現ごとにＨである。ある特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａの少なくとも１つはＣ_１～Ｃ_１２アルキルである。ある特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａの少なくとも１つはＣ_１～Ｃ_８アルキルである。ある特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａの少なくとも１つはＣ_１～Ｃ_６アルキルである。前述の実施形態の一部では、Ｃ_１～Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチル
である。

【0104】

前述のもののある特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^４ａおよびＲ^４ｂは、出現ごとにＣ_１～Ｃ_１２アルキルである。

【0105】

前述のもののさらなる実施形態では、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂおよびＲ^４ｂの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂおよびＲ^４ｂは出現ごとにＨである。

【0106】

前述のもののある特定の実施形態では、Ｒ^１ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^１ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。前述のものの他の実施形態では、Ｒ^４ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^４ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

【0107】

Ｒ^５およびＲ^６における置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。ある特定の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の１つまたは両方はメチルである。ある特定の他の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の１つのまたは両方は、シクロアルキル、例えば、シクロヘキシルである。これらの実施形態では、シクロアルキルは、置換されていても、または置換されていなくてもよい。ある特定の他の実施形態では、シクロアルキルは、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、例えばｔｅｒｔ－ブチルで置換されている。

【0108】

Ｒ^７における置換基は、前述の実施形態では特に限定されていない。ある特定の実施形態では少なくとも１つのＲ^７はＨである。一部の他の実施形態では、Ｒ^７は出現ごとにＨである。ある特定の他の実施形態では、Ｒ^７はＣ_１～Ｃ_１２アルキルである。

【0109】

前述の実施形態のある特定の他の実施形態では、Ｒ^８またはＲ^９の１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ^８とＲ^９の両方はメチルである。

【0110】

一部の異なる実施形態では、Ｒ^８およびＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５、６または７員の複素環を形成する。前述のものの一部の実施形態では、Ｒ^８およびＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員の複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。

【0111】

様々な異なる実施形態では、化合物は、以下の表１に記載の構造の１つを有する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【0112】

上に記載されているような式（Ｉ）の化合物の任意の実施形態、および上に記載されているような式（Ｉ）の化合物における任意の特定の置換基および／または変数は、式（Ｉ）の化合物の他の実施形態ならびに／または置換基および／もしくは変数と独立して組み合わせることによって、上に具体的に記載されていない本発明の実施形態を形成することができることが理解されている。加えて、特定の実施形態および／または請求項において、置換基および／または変数の一覧が任意の特定のＲ基、Ｌ基または変数ａ～ｅに対して列挙されている場合、それぞれ個々の置換基および／または変数は、特定の実施形態および／または請求項から削除されてもよく、置換基および／または変数の残りの一覧は、本発明の範囲内にあると考えられることが理解されている。

【0113】

本記載では、示されている式の置換基および／または変数の組合せは、このような寄与が安定した化合物をもたらす場合のみ許容できることが理解されている。
様々な実施形態では、以下の化合物：

【化9】

【0114】

は、本発明の範囲内に含まれないことが理解されている（式中、各Ｒ^ｃおよびＲ^ｄはＨであるか、またはＲ^ｃおよびＲ^ｄは結合してオキソを形成し、ｘおよびｙは、それぞれ独立して、０～６の整数である）。

【0115】

様々な実施形態では、ペグ化脂質もまた提供される。例えば、ある実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造（ＩＩ）：

【化10】

（式中、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つまたは複数のエステル結合により、任意選択で分断されており、
ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する）
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有する。

【0116】

ペグ化脂質（ＩＩ）の前述の実施形態の一部では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ｚが４２である場合、両方がｎ－オクタデシルではない。一部の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～１８個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。一部の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。一部の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１２個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。一部の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１４個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。他の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１６個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。またさらなる実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１８個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。また他の実施形態では、Ｒ^１０は、１２個
の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、Ｒ^１１は、１４個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。

【0117】

様々な実施形態では、ｚは、（ＩＩ）のＰＥＧ部分が約４００～約６０００ｇ／モルの平均分子量を有するように選択された範囲に及ぶ。一部の実施形態では、ｚの平均は約４５である。

【0118】

他の実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：

【化11】

（式中、ｎは、ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌであるような範囲に及ぶ）
の１つを有する。

【0119】

（ＩＩ）およびカチオン性脂質を含む組成物もまた提供される。カチオン性脂質は、任意のカチオン性脂質から選択することができる。様々な実施形態では、カチオン性脂質とは、表１の下位構造および特定の化合物のいずれかを含む、上記のような構造（Ｉ）を有する化合物である。

【0120】

一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のいずれか１つまたは複数を含む組成物が提供される。例えば、一部の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）の化合物のいずれかと、治療剤と、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質から選択される１つまたは複数の賦形剤とを含む。他の薬学的に許容される賦形剤および／または担体もまた、組成物の様々な実施形態に含まれている。

【0121】

ある特定の実施形態では、治療剤は、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはメッセンジャーＲＮＡを含む。一部の実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される。様々な実施形態では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。

【0122】

様々な実施形態では、組成物は、ステロイドまたはステロイドアナログをさらに含む。ある特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイドアナログはコレステロールである。これらの実施形態の一部では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１～１：１の範囲である。

【0123】

様々な実施形態では、組成物はペグ化脂質を含む。例えば、一部の実施形態はＰＥＧ－ＤＭＧを含む。様々な実施形態では、化合物とペグ化脂質とのモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。

【0124】

一部の実施形態では、組成物は、以下の構造（ＩＩ）：

【化12】

（式中、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つまたは複数のエステル結合により、任意選択で分断されており、
ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する）
を有するペグ化脂質またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を含む。

【0125】

一部の実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する、直鎖状の飽和アルキル鎖である。他の実施形態では、ｚの平均は約４５である。

【0126】

前述の組成物の一部の実施形態では、治療剤は核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、核酸は、アンチセンス、プラスミドＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡから選択される。

【0127】

投与の目的のために、本発明の化合物（通常、治療剤と組み合わせた脂質ナノ粒子の形態で）は、原末（ｒａｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ）として投与してもよいし、または医薬組成物として製剤化してもよい。本発明の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物と、１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む。式（Ｉ）の化合物は、例えば、目的の特定疾患または状態を処置するために、脂質ナノ粒子を形成し、治療剤を送達するのに有効である量で、組成物中に存在する。適当な濃度および投薬量は、当業者により容易に決定することができる。

【0128】

本発明の組成物の投与は、同様の有用性を果たすための薬剤の容認された投与モードのいずれかを介して行うことができる。本発明の医薬組成物は、固体、半固体、液体または気体の形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、懸濁剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびエアゾール剤に製剤化することができる。このような医薬組成物を投与する典型的な経路として、限定されないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、口腔内頬側、直腸、経膣、および鼻腔内が挙げられる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内注射または注入技術を含む。本発明の医薬組成物は、組成物を患者に投与すると、その中に含有されている活性成分が生物学的に利用可能となるように製剤化される。対象または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の用量単位の形態をとり、この場合、例えば、錠剤は、単一用量単位であってよく、エアゾール剤形態の本発明の化合物の容器は、複数の用量単位を保持することができる。このような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者には明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい。投与される組成物は、いずれにしても、本発明の教示に従って、目的の疾患または状態の処置のための本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を含有する。

【0129】

本発明の医薬組成物は、固体または液体の形態であってよい。一態様では、担体（複数可）は微粒子であり、これによって、組成物は、例えば、錠剤または散剤の形態である。担体（複数可）は液体であってよく、組成物は、例えば、経口シロップ剤、注射液または、例えば、吸入投与に有用であるエアゾール剤である。

【0130】

経口投与が意図される場合、医薬組成物は、好ましくは、固体または液体のいずれかの形態であり、半固体、半液体、懸濁剤およびゲル剤の形態は、本明細書で固体または液体のいずれかと考えられる形態に含まれる。

【0131】

経口投与のための固体組成物として、医薬組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、カシェ剤などの形態に製剤化することができる。このような固体組成物は、通常１種または複数の不活性希釈剤または食用担体を含有する。加えて、以下の１つまたは複数が存在し得る：結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリンなど；崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックスなど；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンなど；香味剤、例えば、ペパーミント、サルチル酸メチルまたはオレンジ香味料など；および着色剤。

【0132】

医薬組成物がカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態である場合、医薬組成物は、上記タイプの材料に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコールまたは油などを含有してもよい。

【0133】

医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤などであってよい。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達のためのものであってよい。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤および香味向上剤の１種または複数を含有する。注射による投与が意図される組成物では、界面活性薬剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤および等張剤の１種または複数が含まれてもよい。

【0134】

本発明の液体医薬組成物は、これらが、液剤、懸濁剤または他の同様の形態であろうと、以下のアジュバントの１種または複数を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射用の水、食塩水、好ましくは生理的食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウムなど、不揮発性油、例えば、溶媒または懸濁媒としての役目を果たすことができる合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒など；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など、および張性調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど；抗凍結剤として作用する薬剤、例えば、スクロースまたはトレハロースなど。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。生理的食塩水は好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。

【0135】

非経口または経口投与のいずれかを意図する本発明の液体医薬組成物は、適切な投薬量が得られるように、ある量の本発明の化合物を含有すべきである。

【0136】

本発明の医薬組成物は局所投与を意図してもよく、この場合、担体は、液剤、乳剤、軟膏剤またはゲル基剤を適切に含むことができる。基剤は例えば、以下の１種または複数を含むことができる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば、水およびアルコールなど、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤は、局所投与用医薬組成物中に存在し得る。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオントホレーシスデバイスを含むことができる。

【0137】

本発明の医薬組成物は、例えば、直腸内で融解して、薬物を放出する坐剤の形態で、直腸投与を意図することができる。直腸投与用組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有してもよい。このような基剤として、限定されないが、ラノリン、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

【0138】

本発明の医薬組成物は、固体または液体用量単位の物理的形態を改変する様々な材料を含むことができる。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する材料を含むことができる。コーティングシェルを形成する材料は通常不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶コーティング剤から選択することができる。代わりに、活性成分をゼラチンカプセル剤に入れることができる。

【0139】

固体または液体形態の本発明の医薬組成物は、本発明の化合物に結合し、これによって、化合物の送達を補助する薬剤を含むことができる。この能力で作用することができる適切な薬剤として、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはタンパク質が挙げられる。

【0140】

本発明の医薬組成物は、エアゾール剤として投与することができる用量単位からなってもよい。エアゾール剤という用語は、コロイド状の性質のものから加圧パッケージからなる系までにわたって様々な系を表すのに使用される。送達は、液化性もしくは圧縮された気体によるものであっても、または活性成分を分配する適切なポンプシステムによるものであってもよい。本発明の化合物のエアゾール剤は、活性成分（複数可）を送達するために単相、二相、または三相系で送達することができる。エアゾール剤の送達は、一緒になってキットを形成することができる、必要な容器、活性因子、弁、副容器などを含む。当業者は、過度の実験を行わずに、好ましいエアゾール剤を決定することができる。

【0141】

本発明の医薬組成物は、薬学分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射による投与を意図する医薬組成物は、溶液を形成するために、本発明の脂質ナノ粒子を、無菌の、蒸留水または他の担体と組み合わせることによって調製することができる。界面活性剤は、均一溶液または懸濁液の形成を促進するために加えることができる。界面活性剤は、水系送達系において化合物の溶解または均一な懸濁を促進するために、本発明の化合物と非共有結合的に相互作用する化合物である。

【0142】

本発明の組成物またはこれらの薬学的に許容される塩は、治療有効量で投与されるが、この治療有効量は、利用する特定の治療剤の活性、治療剤の代謝安定性および作用期間、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与のモードおよび時間、排出速度、薬物の組合せ、特定の障害または状態の重症度、ならびに治療を受ける対象を含めた、様々な因子に応じて変動することになる。

【0143】

本発明の組成物はまた、１種または複数の他の治療剤の投与と同時に、投与前に、また
は投与後に投与することもできる。このような併用療法は、本発明の組成物と、１種または複数の追加の活性薬剤の単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明の組成物と、それ自体別個の医薬投与製剤である各活性薬剤の投与を含む。例えば、本発明の組成物および他の活性薬剤は、錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与組成物として一緒に患者に投与することができ、または各薬剤を別個の経口投与製剤として投与することができる。別個の投与製剤を使用する場合、本発明の化合物および１種または複数の追加的活性薬剤は、本質的に同じ時間、すなわち、同時に、または時間をずらして別々に、すなわち、逐次的に投与することができ、併用療法は、これらのすべてのレジメンを含むと理解されている。

【0144】

上記化合物および組成物のための調製方法は、本明細書で以下に記載されており、および／または当技術分野で公知である。

【0145】

本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基を適切な保護基で保護することが必要であり得ることは、当業者であれば理解している。このような官能基として、ヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシの適切な保護基として、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが挙げられる。アミノ、アミジノおよびグアニジノの適切な保護基として、ｔ－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。メルカプトの適切な保護基として、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ”（式中、Ｒ”は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐ－メトキシベンジル、トリチルなどが挙げられる。カルボン酸の適切な保護基として、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は、当業者に公知であり、本明細書に記載されているような標準技術に従って付加または除去することができる。保護基の使用は、Ｇｒｅｅｎ， Ｔ．Ｗ．およびＰ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｚ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９年）、３版、Ｗｉｌｅｙにおいて詳細に記載されている。当業者であれば理解しているように、保護基はまた、ポリマー樹脂、例えば、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または２－クロロトリチル－クロリド樹脂などであってもよい。

【0146】

本発明の化合物のこのような保護された誘導体は、そのままでは薬理学的活性を保有し得ないが、これらが哺乳動物に投与され、その後体内で代謝されて、薬理学的活性のある本発明の化合物を形成することができることもまた当業者により理解されている。したがって、このような誘導体は「プロドラッグ」として記載することができる。本発明の化合物のすべてのプロドラッグは、本発明の範囲内に含まれる。

【0147】

さらに、遊離塩基または酸形態で存在するすべての本発明の化合物は、当業者に公知の方法により適当な無機塩基もしくは有機塩基または無機酸もしくは有機酸で処理することによって、これらの薬学的に許容される塩に変換することができる。本発明の化合物の塩は、標準技術によりこれらの遊離塩基または遊離酸の形態に変換することができる。

【0148】

以下の反応スキームは、本発明の化合物、すなわち、式（Ｉ）：

【化13】

の化合物を作製する方法を図示している（式中、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ａ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、本明細書で定義された通りである）。当業者は、同様の方法で、または当業者に公知の他の方法を組み合わせることによりこれらの化合物を作製することができることが理解されている。当業者であれば、適当な開始構成成分を使用し、必要に応じて合成パラメーターを改変することによって、以下に具体的に図示されていない他の式（Ｉ）の化合物を、以下に記載されているものと同様の方式で作製することができることもまた理解されている。一般的に、開始構成成分は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩおよびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ ＵＳＡなどの供給元から得てもよいし、または当業者に公知の情報元に従い合成してもよいし（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５版（Ｗｉｌｅｙ、２０００年１２月）を参照されたい）、または本発明に記載の通り調製してもよい。

【0149】

【化14】

構造（Ｉ）の化合物の実施形態（例えば、化合物Ａ－５）は、一般反応スキーム１（「方法Ａ」）（式中、Ｒは、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは、０または１であり、ｎは、１～２４の整数である）に従い調製することができる。一般的な反応スキーム１を参照すると、構造Ａ－１の化合物は、商業源から購入するか、または当業者に精通している方法に従い調製することができる。Ａ－１、Ａ－２およびＤＭＡＰの混合物をＤＣＣで処理して、臭化物Ａ－３を得る。臭化物Ａ－３、塩基（例えば、Ν，Ν－ジイソプロピルエチルアミン）およびΝ，Ν－ジメチルジアミンＡ－４の混合物は、任意の必要なワークアップおよび／または精製ステップ後、Ａ－５を生成するのに十分な温度で、および十分な時間加熱する。

【0150】

【化15】

構造（Ｉ）の化合物の実施形態（例えば、化合物Ｂ－５）は、一般反応スキーム２（「方法Ｂ」）（式中、Ｒは、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは、０または１であり、ｎは、１～２４の整数である）に従い調製することができる。一般反応スキーム２に示されているように、構造Ｂ－１の化合物は、商業源から購入するか、または当業者に精通している方法に従い調製することができる。Ｂ－１（１当量）の溶液は、酸塩化物Ｂ－２（１当量）および塩基（例えば、トリエチルアミン）で処理する。粗生成物を酸化剤（例えば、クロロクロム酸ピリジニウム（ｐｙｒｉｄｉｎｕｍ））で処理し、中間体生成物Ｂ－３を回収する。次いで、粗製のＢ－３の溶液、酸（例えば、酢酸）、およびΝ，Ν－ジメチルアミノアミンＢ－４は、任意の必要なワークアップおよび／または精製後、還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）で処理して、Ｂ－５を得る。

【0151】

出発物質Ａ－１およびＢ－１は、飽和メチレン炭素のみを含むように上記に示されているが、炭素－炭素二重結合を含む出発物質も、炭素－炭素二重結合を含む化合物の調製のために利用することができることに注目すべきである。

【0152】

【化16】

構造（Ｉ）の化合物の実施形態（例えば、化合物Ｃ－７またはＣ９）は、一般反応スキーム３（「方法Ｃ」）（式中、Ｒは、飽和もしくは不飽和のＣ_１～Ｃ_２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは、０または１であり、ｎは、１～２４の整数である）に従い調製することができる。一般反応スキーム３を参照すると、構造Ｃ－１の化合物は、商業源から購入するか、または当業者に精通している方法に従い調製することができる。

【0153】

以下の実施例は、例示の目的のために提供されるもので、限定ではない。

【実施例】

【0154】

（実施例１）
化合物１の合成
化合物１を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
オクタン－１，８－ジオール（９．８ｇ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中溶液を２－エチルヘキサノイルクロリド（１０ｇ）で処理した。トリエチルアミン（１５ｍＬ）をゆっくりと加え、溶液を３日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液をブラインで洗浄した（２×）。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。塩化メチレンを使用して、粗生成物を、シリカゲル（２０ｇ）を介して濾過し、１５．８ｇの粗生成物を生成した。生成した油状物質を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（１３ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（４００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質を、酢酸エチル／ヘキサン（０～６％）勾配を使用するシリカゲル（７７ｇ）カラムに通した。８－Ｏ－（２’－エチルヘキサノイルオキシ）オクタナール（６．７ｇ）を油状物質として回収した。

【0155】

８－Ｏ－（２’－エチルヘキサノイルオキシ）オクタナール（６．７ｇ）、酢酸（２５滴）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．５４ｇ）の塩化メチレン（４０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．５ｇ）で一晩処理した。溶液を、水性炭酸水素ナトリウム、続いてブラインで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０～１０％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラム、続いて第２のカラム（２０ｇ）
に通すことによって、化合物１（１ｇ）を無色の油状物質として生成した。

【0156】

（実施例２）
化合物２の合成
化合物２を方法Ａに従い以下の通り調製した：
アルゴン雰囲気下で、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中フィトール（５９３ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、６－ブロモヘキサン酸（７８０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（６０ｍｇ）を充填した丸底フラスコに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（９０８ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。沈殿物を濾過により廃棄した。濾液を濃縮し、生成した残渣を、ヘキサン中酢酸エチルの勾配混合物（０％～３％）で溶出したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、（Ｅ）－３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデカ－２－エニル６－ブロモヘキサノエートの無色の油状物質を得た（０．７９ｇ １．６７ｍｍｏｌ、８３％）。

【0157】

（Ｅ）－３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデカ－２－エニル６－ブロモヘキサノエート（０．４２ｇ、０．８８７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．５モル当量、１．３３ｍｍｏｌ、ＭＷ１２９．２５、１７１ｍｇ）およびＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（３９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）中溶液を７７℃で１８時間加熱した。次いで、反応混合物を冷却し、ヘキサン（３×２０ｍＬ）で抽出した。ヘキサン抽出物を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。これを、第２の反応物と合わせた（総量約０．７ｇ）。粗生成物を、ＤＣＭ中のメタノールの勾配混合物（０％～５％）で溶出したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより数回精製した。これにより、所望の生成物のわずかに黄色の油状物質を得た（３９ｍｇ）。

【数1】

【0158】

（実施例３）
化合物３の合成
６－ブロモヘキサン酸ではなくブロモ酢酸から出発して、化合物２と類似の方式で化合物３を調製して、２２ｍｇの濃厚無色油状物質、０．０２９ｍｍｏｌ、６％を生成した。

【数2】

【0159】

（実施例４）
化合物４の合成
化合物４を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ドデカン－１，１２－ジオール（１０ｇ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中溶液を、２－エチルヘキサン酸（７．２ｇ）、ＤＣＣ（１０．５ｇ）、ＤＭＡＰ（３．５ｇ）およびトリエチルアミン（１０ｍＬ）で処理した。溶液を４日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を希釈塩酸で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、一晩静置し、濾過した。溶媒を除去して、１２．１ｇの粗生成物を生成した。

【0160】

粗生成物を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（８ｇ）で、一晩処理した。ジエチルエーテル（４００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質を、酢酸エチル／ヘキサン（０～６％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通した。粗製の１２－Ｏ－（２’－エチルヘキサノイルオキシ）ドデカナール（３．５ｇ）を油状物質として回収した。

【0161】

粗生成物（３．５ｇ）、酢酸（６０滴）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．３０ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．８６ｇ）で一晩処理した。溶液を水性炭酸水素ナトリウム、続いてブラインで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０～８％）勾配を使用するシリカゲル（２０ｇ）カラム、続いて第２のカラム（２０ｇ）に通して、所望の生成物（０．６ｇ）を無色の油状物質として生成した。

【0162】

（実施例５）
化合物５の合成
化合物５を、方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ヘキサン－１，６－ジオール（１０ｇ）の塩化メチレン（４０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を、２－ヘキシルデカノイルクロリド（１０ｇ）およびトリエチルアミン（１０ｍＬ）で処理した。溶液を１時間撹拌し、溶媒を除去した。反応混合物をヘキサン中に懸濁させ、濾過し、濾液を水で洗浄した。溶媒を除去し、残渣を、溶出液としてヘキサン、続いて塩化メチレンを使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通し、６－（２’－ヘキシルデカノイルオキシ）ヘキサン－１－オールを油状物質として生成した（７．４ｇ）。

【0163】

精製した生成物（７．４ｇ）を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（５．２ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質を、酢酸エチル／ヘキサン（０～５％）勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通した。６－（２’－ヘキシルデカノイルオキシ）ドデカナール（５．４ｇ）を油状物質として回収した。

【0164】

生成物（４．９ｇ）、酢酸（０．３３ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．４０ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．１ｇ）で２時間処理した。溶液を水性の水酸化ナトリウムで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０～８％）勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通し、所望の生成物（１．４ｇ）を無色の油状物質として生成した。

【0165】

（実施例６）
化合物６の合成
化合物６を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（１２．６ｇ）の塩化メチレン（８０ｍＬ）中溶液を、２－ヘキシルデカン酸（１０．０ｇ）、ＤＣＣ（８．７ｇ）およびＤＭＡＰ（５．７ｇ）で処理した。溶液を２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、溶媒を除去した。残渣を、温めたヘキサン（２５０ｍＬ）に溶解し、結晶化させた。溶液を濾過し、溶媒を除去した。残渣を塩化メチレンに溶解し、希釈塩酸で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、溶出液として０～１２％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカゲルカラム（７５ｇ）に通し、９－（２’－ヘキシルデカノイルオキシ）ノナン－１－オール（９．５ｇ）を油状物質として生成した。

【0166】

生成物を塩化メチレン（６０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（６．４ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質を、酢酸エチル／ヘキサン（０～１２％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通し、９－（２’－エチルヘキサノイルオキシ）ノナナール（６．１ｇ）を油状物質として生成した。

【0167】

粗生成物（６．１ｇ）、酢酸（０．３４ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．４６ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．９ｇ）で２時間処理した。溶液を塩化メチレンで希釈し、水性の水酸化ナトリウム、続いて水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０～８％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラム、続いて、塩化メチレン／酢酸／メタノール勾配を使用する第２のカラム（２０ｇ）に通した。精製画分を塩化メチレンに溶解し、水酸化ナトリウム希釈水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、所望の生成物（１．６ｇ）を無色の油状物質として生成した。

【0168】

（実施例７）
化合物７の合成
方法Ａに従い、化合物７を３，５，５－トリメチルヘキシル１０－ブロモデカノエートおよびＮ，Ｎ－ジメチルエタン－１，２－ジアミンから調製して、１４４ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．２１ｍｍｏｌ、１１％を生成した。

【数3】

【0169】

（実施例８）
化合物８の合成
化合物８を方法Ａにより１５％収率で調製した。

【数4】

【0170】

（実施例９）
化合物９の合成
化合物９を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（１０．０ｇ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）中溶液を、シトロネリル（ｃｉｔｒｏｎｅｌｏｙｌ）クロリド（１０．１ｇ、シトロネル酸および塩化オキサリルから調製）およびトリエチルアミン（１０ｍＬ）で処理し、３日間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、希釈塩酸で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣をヘキサン中に溶解させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、溶出液としてヘキサン、続いて塩化メチレンを使用する一連のシリ
カゲルカラム（６０～７０ｇ）に通し、９－（シトロネロイルオキシ）ノナン－１－オール（７．６ｇ）を油状物質として生成した。

【0171】

生成物を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（６．４ｇ）で９０分間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。残渣をヘキサン中に溶解し、溶出液としてヘキサンを使用するシリカゲル（２０ｇ）カラムに通し、９－（シトロネロイルオキシ）ノナナール（５ｇ）を油状物質として生成した。

【0172】

粗生成物（５ｇ）、酢酸（０．３３ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．４８ｇ）の塩化メチレン（４０ｍＬ）中溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．２ｇ）で一晩処理した。溶液を塩化メチレンで希釈し、水性の水酸化ナトリウムで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０～１２％メタノール／塩化メチレン勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラム、続いて同じ勾配を使用する第２のシリカゲルカラム（２０ｇ）に通して、所望の生成物（０．６ｇ）を無色の油状物質として生成した。

【0173】

（実施例１０）
化合物１０の合成
方法Ａに従い化合物１０を調製して、１４７ｍｇの無色の油状物質、０．２３ｍｍｏｌ、１７％を生成した。

【数5】

【0174】

（実施例１１）
化合物１１の合成
方法Ａに従い化合物１１を調製して、１５４ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．２２ｍｍｏｌ、１４％を生成した。

【数6】

【0175】

（実施例１２）
化合物１２の合成
方法Ａに従い化合物１２を調製して、１６９ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．２６ｍｍｏｌ、１７％を生成した。

【0176】

【数7】

（実施例１３）
化合物１３の合成
方法Ａに従い化合物１３を調製して、１５２ｍｇの白色のペースト状物質、０．２３ｍｍｏｌ、１６％を生成した。

【数8】

【0177】

（実施例１４）
化合物１４の合成
方法Ａに従い化合物１４を調製して、１１１ｍｇの無色の油状物質、０．１６ｍｍｏｌ、１１％を生成した。

【数9】

【0178】

（実施例１５）
化合物１５の合成
方法Ａに従い化合物１５を調製して、１１６ｍｇの白色のペースト状物質、０．１６ｍｍｏｌ、１０％を生成した。

【数10】

【0179】

（実施例１６）
化合物１６の合成
方法Ａに従い化合物１６を調製して、１１８ｍｇの無色の油状物質、０．１７ｍｍｏｌ、１２％を生成した。

【数11】

【0180】

（実施例１７）
化合物１７の合成
方法Ａに従い化合物１７を調製して、１４５ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．２１ｍｍｏｌ、１３％を生成した。

【数12】

【0181】

（実施例１８）
化合物１８の合成
方法Ａに従い化合物１８を調製して、１１１ｍｇの無色の油状物質、０．１７ｍｍｏｌ、１４％を生成した。

【数13】

【0182】

（実施例１９）
化合物１９の合成
方法Ａに従い化合物１９を調製して、７６ｍｇの無色の油状物質、０．１１ｍｍｏｌ、６％を生成した。

【数14】

【0183】

（実施例２０）
化合物２０の合成
一般的手順Ａに従い化合物２０を調製して、１５７ｍｇの無色の油状物質、０．２２ｍｍｏｌ、１４％を生成した。

【数15】

【0184】

（実施例２１）
化合物２１の合成
一般的手順Ａに従い化合物２１を調製して、１６４ｍｇの無色の油状物質、０．２１ｍｍｏｌ、１４％を生成した。

【数16】

【0185】

（実施例２２）
化合物２２の合成
化合物２２を方法Ａに従い以下の通り調製した：
ステップ１．
６－ブロモヘキサン酸（２０ｍｍｏｌ、３．９０１ｇ）、２－ヘキシル－１－デカノール（１．８当量、３６ｍｍｏｌ、８．７２ｇ）および４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ０．５当量、１０ｍｍｏｌ、１．２２ｇ）のＤＣＭ（８０ｍＬ）中溶液に、ＤＣＣ（１．１当量、２２ｍｍｏｌ、４．５４ｇ）を加えた。生成した混合物を室温で１６時間撹拌した。沈殿物を濾過により廃棄した。濾液を濃縮した。残渣を、ヘキサン中酢酸エチルの勾配混合物（０～２％）で溶出したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、所望の生成物を無色の油状物質として得た（７．８８ｇ、１８．８ｍｍｏｌ、９４％）。
ステップ２．

【0186】

ステップ１で得た臭化物（１．３４当量、７．８８ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．９６当量、２７．４８ｍｍｏｌ、４．７８ｍＬ）およびＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（１当量、１４．０２ｍｍｏｌ、１．２３６ｇ、１．５３１ｍＬ）のアセトニトリル（７０ｍＬ）中混合物を、冷却器を備えた２５０ｍＬフラスコ内で、７９℃（油浴）で１６時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濃縮させた。残渣を、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：９）および水の中に入れた。相を分離し、水（１００ｍＬ）およびブラインで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した（８．７ｇの油状物質）。粗生成物（８．７ｇの油状物質）をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中０～３％ＭｅＯＨ）により精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、濃縮した。残渣を１ｍＬのヘキサンに溶解し、シリカゲルの層（３～４ｍｍ、８ｍＬのヘキサンで洗浄）を介して濾過した。濾液を、Ａｒ流でブロー乾燥し、真空中で一晩よく乾燥させた（１．３０ｇ、ｍｍｏｌ、％、無色の油状物質、所望の生成物）。

【数17】

【0187】

（実施例２３）
化合物２３の合成
一般的手順Ａに従い化合物２３を調製して、２００ｍｇの無色の油状物質、０．２４ｍｍｏｌ、１６％を生成した。

【数18】

【0188】

（実施例２４）
化合物２４の合成
一般的手順Ａに従い化合物２４を調製して、１３８ｍｇの無色の油状物質、０．１８ｍｍｏｌ、１２％を生成した。

【数19】

【0189】

（実施例２５）
化合物２５の合成
一般的手順Ａに従い化合物２５を調製して、２１４ｍｇの無色の油状物質、０．２４ｍｍｏｌ、１７％を生成した。

【数20】

【0190】

（実施例２６）
化合物２６の合成
一般的手順Ａに従い化合物２６を調製して、１７０ｍｇの無色の油状物質、０．２１ｍｍｏｌ、１３％を生成した。

【数21】

【0191】

（実施例２７）
化合物２７の合成
一般的手順Ａに従い化合物２７を調製して、２５５ｍｇの無色の油状物質、０．２９ｍｍｏｌ、１８％を生成した。

【数22】

【0192】

（実施例２８）
化合物２８の合成
一般的手順Ａに従い化合物２８を調製して、２４８ｍｇの無色の油状物質、０．２７ｍｍｏｌ、１９％を生成した。

【数23】

【0193】

（実施例２９）
化合物２９の合成
一般的手順Ａに従い化合物２９を調製して、１８１ｍｇの無色の油状物質、０．２３ｍｍｏｌ、１７％を生成した。

【数24】

【0194】

（実施例３０）
化合物３０の合成
一般的手順Ａに従い化合物３０を調製して、８８ｍｇの無色の油状物質、０．１１ｍｍｏｌ、３％を生成した。

【数25】

【0195】

（実施例３１）
化合物３１の合成
一般的手順Ｃに従い化合物３１を調製して、２７５ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．３０ｍｍｏｌ、３ステップに対して全収率３５％を生成した。

【数26】

【0196】

（実施例３２）
化合物３２の合成
化合物３２を方法Ｃに従い以下の通り調製した：
ステップ１．
２－アミノエタノール（１１６ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、１１５ｕＬ、ＭＷ６１．０８、ｄ１．０１２）の無水ＴＨＦ １５ｍｌ中溶液に、２－ヘキシルデシル６－ブロモヘキサノエート（１．９当量、１．５２ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．９当量、３．６２ｍｍｏｌ、５００ｍｇ）、炭酸セシウム（０．３当量、０．５７ｍｍｏｌ、１８６ｍｇ）およびヨウ化ナトリウム（１０ｍｇ）を加え、Ａｒ下で６日間加熱還流させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をヘキサン中に溶解させ、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させることによって、無色の油状物質を得た。粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２３０～４００メッシュシリカゲル、クロロホルム中ＭｅＯＨ、０～４％）により精製して、９３６ｍｇの無色の油状物質を生成した（１．２７ｍｍｏｌ、７０％）。
ステップ２．

【0197】

ＣＨＣｌ_３ ２ｍＬ中の、ステップ１で得た生成物９３６ｍｇ（１．２７ｍｍｏｌ）の磁気撹拌した、氷冷溶液に、Ａｒ雰囲気下で、クロロホルム１５ｍＬ中の塩化チオニル（２．９当量、３．７０ｍｍｏｌ、４４０ｍｇ、２７０ｕＬ）を滴下添加した。ＳＯＣｌ_２の添加完了後、氷浴を除去し、反応混合物をＡｒ雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。減圧下でＣＨＣｌ_３およびＳＯＣｌ_２を除去することで、濃厚な黄色の油状物質を得た。
ステップ３．

【0198】

ステップ２で得た粗生成物をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ溶液に、ピロリジン（１．６ｍＬ、１．３６ｇ、１９ｍｍｏｌ）を加えた。密閉した混合物を６４℃で一晩加熱した。反応混合物を濃縮した（暗褐色の油状物質）。残渣をシリカゲル（クロロホルム中ＭｅＯＨ、０～４％）上でのフラッシュドライカラムクロマトグラフィーにより精製した。これによって、所望の生成物をわずかに黄色の油状物質として得た（４１９ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、８３％）。

【数27】

【0199】

（実施例３３）
化合物３３の合成
一般的手順Ｃに従い化合物３３を調製して、４１９ｍｇのわずかに黄色の油状物質、０．５４ｍｍｏｌ、３ステップに対する全収率６０％を生成した。

【数28】

【0200】

（実施例３４）
化合物３４の合成
化合物３４を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（１０ｇ）の塩化メチレン（２５０ｍＬ）中溶液を、２－エチルヘキサン酸（４．５ｇ）、ＤＣＣ（７．７ｇ）およびＤＭＡＰ（４．２ｇ）で処理した。溶液を３日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液にヘキサン（２００ｍＬ）を加えた。混合物を撹拌し、沈殿物を沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。残渣をヘキサン（７０ｍＬ）中に懸濁させ、沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。残渣をヘキサンに溶解し、室温で静置し、次いで濾過した。溶媒を除去し、残渣を、０～１０％酢酸エチル／ヘキサン勾配、続いて０～８％メタノール／塩化メチレン勾配を使用するシリカゲルカラム（５０ｇ）に通して、５．６ｇの９－（２’エチルヘキサノイルオキシ）ノナン－１－オールを無色の油状物質として生成した。

【0201】

生成物を塩化メチレン（７０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（５ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質をヘキサンに溶解した。懸濁液を、シリカゲルプラグを介して濾過し、溶媒を除去して、粗製の９－（２’エチルヘキサノイルオキシ）ノナナール（３．４ｇ）を油状物質として生成した。

【0202】

粗生成物（３．４ｇ）、酢酸（０．５２ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．３３ｇ）の塩化メチレン（５０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．８６ｇ）で一晩処理した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去し、油状物質として化合物３４を生成した（０．８６ｇ）。

【0203】

（実施例３５）
化合物３５の合成
化合物３５を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ドデカン－１，１２－ジオール（１８．１ｇ）の塩化メチレン（９０ｍＬ）中溶液を、シトロネル酸（７．５ｇ）、ＤＣＣ（１０．０ｇ）およびＤＭＡＰ（９．５ｇ）で処理した。溶液を一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を希釈塩酸で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、１２．２ｇの粗製の１２－シトロネロイルオキシドデカン－１－オールを生成した。

【0204】

粗生成物を塩化メチレン（６０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（６．８ｇ）で３時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質を、酢酸エチル／ヘキサン（０～１２％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通した。粗製の１２－シトロネロイルオキシドデカナール（６．２ｇ）を油状物質として回収した。

【0205】

粗生成物（６．２ｇ）、酢酸（０．４４ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．５０ｇ）の塩化メチレン（４０ｍＬ）中溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．９ｇ）で一晩処理した。溶液を水性炭酸水素ナトリウム、続いてブラインで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、化合物３５（１．６８ｇ）を油状物質として生成した。

【0206】

（実施例３６）
化合物３６の合成
一般的手順Ｃに従い化合物３６を調製して、１０８ｍｇの無色の油状物質を生成した（０．１４ｍｍｏｌ）。

【数29】

【0207】

（実施例３７）
化合物３７の合成
一般的手順Ｃに従い化合物３７を調製して、３３０ｍｇの無色の油状物質を生成した（０．４０ｍｍｏｌ、３ステップに対して全収率８０％）。

【数30】

【0208】

（実施例３８）
化合物３８の合成
化合物３８を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（１６ｇ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）中溶液を、２－ブチルオクタン酸（１０ｇ）、ＤＣＣ（１０．３ｇ）およびＤＭＡＰ（６．７ｇ）で処理した。溶液を３日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液にヘキサン（２５０ｍＬ）を加えた。混合物を撹拌し、沈殿物を沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。残渣をヘキサン中に懸濁させて、沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した（２回繰り返した）。残渣をヘキサンに溶解し、室温で静置し、次いで濾過した。溶媒を除去し、残渣を、塩化メチレンを使用するシリカゲルカラム（１８ｇ）に通して、粗製の９－（２’－ブチルオクタノイルオキシ）ノナン－１－オール（１７．７ｇ）を油状物質として生成した。

【0209】

粗生成物を塩化メチレン（２５０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（１１．２ｇ）で一晩処理した。ジエチルエーテル（７５０ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質をヘキサン（１５０ｍＬ
）に溶解した。懸濁液を、シリカゲルプラグを介して濾過し、溶媒を除去した。粗生成物を、０～６％酢酸エチル／ヘキサン勾配を使用するシリカゲル（８０ｇ）カラムに通して、９－（２’－ブチルオクタノイルオキシ）ノナナール（５．３ｇ）を油状物質として生成した。

【0210】

生成物（５．３ｇ）、酢酸（０．３７ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．４７ｇ）の塩化メチレン（５０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．３５ｇ）で一晩処理した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（６０ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去し、化合物３８を油状物質として生成した（２．３ｇ）。

【0211】

（実施例３９）
化合物３９の合成
化合物３９を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ヘキサン－１，６－ジオール（１２ｇ）の塩化メチレン（２５０ｍＬ）中溶液を、２－デシルテトラデカン酸（１７．５ｇ）、ＤＣＣ（１１．３ｇ）およびＤＭＡＰ（６．８ｇ）で処理した。溶液を一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、ヘキサンを濾液に加えた。混合物を撹拌し、沈殿物を沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。残渣を、ヘキサン、続いて０～１％メタノール／塩化メチレンを使用するシリカゲルカラム（８０ｇ）に通して、粗製の６－（２’－デシルテトラデカノイルオキシ）ヘキサン－１－オール（５．８ｇ）を油状物質として生成した。

【0212】

粗生成物を塩化メチレン（７０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（２．９ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質をヘキサンに溶解した。懸濁液を、シリカゲルプラグを介して濾過し、溶媒を除去した。粗生成物を、０～５％酢酸エチル／ヘキサン勾配を使用するシリカゲル（１０ｇ）カラムに通して、６－（２’－デシルテトラデカノイルオキシ）ヘキサナール（３．２ｇ）を油状物質として生成した。

【0213】

生成物（３．２ｇ）、酢酸（０．２８ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．１５ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．９８ｇ）で一晩処理した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、化合物３９を油状物質として生成した（１．２ｇ）。

【0214】

（実施例４０）
化合物４０の合成
化合物４０を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（１０．１ｇ）の塩化メチレン（２００ｍＬ）中溶液を、２－オクチルドデカン酸（１０．０ｇ）、ＤＣＣ（８．３ｇ）およびＤＭＡＰ（５．０ｇ）で処理した。溶液を一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、ヘキサン（２００ｍＬ）を濾液に加えた。混合物を撹拌し、沈殿物を沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。このプロセスを２回繰り返した。残渣を、ヘキサン、続いて４～１０％メタノール／塩化メチレンを使用するシリカゲルカラム（７５ｇ）に通して、粗製の９－（２’－オクチル
ドデカノイルオキシ）ノナン－１－オール（約１１ｇ）を油状物質として生成した。

【0215】

粗生成物を塩化メチレン（７０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（８ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（４００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質をヘキサンに溶解した。懸濁液を、シリカゲルプラグを介して濾過し、溶媒を除去して、粗製の９－（２’－オクチルドデカノイルオキシ）ノナナール（８．４ｇ）を油状物質として生成した。

【0216】

生成物（８．４ｇ）、酢酸（０．８４ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．５５ｇ）の塩化メチレン（６０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．９ｇ）で２時間処理した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、化合物４０を油状物質として生成した（３．２ｇ）。

【0217】

（実施例４１）
化合物４１の合成
化合物４１を方法Ｂに従い以下の通り調製した：
ノナン－１，９－ジオール（９．６ｇ）の塩化メチレン（２００ｍＬ）中溶液を、２－デシルテトラデカン酸（８．４ｇ）、ＤＣＣ（８．６ｇ）およびＤＭＡＰ（５．０ｇ）で処理した。溶液を一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、ヘキサン（２００ｍＬ）を濾液に加えた。混合物を撹拌し、沈殿物を沈降させた。上清をデカントし、溶媒を除去した。このプロセスを２回繰り返した。残渣を、ヘキサン、続いて４～１０％メタノール／塩化メチレンを使用するシリカゲルカラム（７５ｇ）に通して、粗製の９－（２’－デシルテトラデカノイルオキシ）ノナン－１－オール（６．４ｇ）を油状物質として生成した。

【0218】

粗生成物を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（５．７ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、上清を、シリカゲル床を介して濾過した。溶媒を濾液から除去し、生成した油状物質をヘキサンに溶解した。懸濁液を、シリカゲルプラグを介して濾過し、溶媒を除去して、粗製の９－（２’－デシルテトラデカノイルオキシ）ノナナール（５ｇ）を油状物質として生成した。

【0219】

生成物（５ｇ）、酢酸（０．４５ｇ）および２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（０．３２ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．６ｇ）で２時間処理した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、酢酸／メタノール／塩化メチレン（２～０％／０～１２％／９８～８８％）勾配を使用するシリカゲル（５０ｇ）カラムに通した。精製画分を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、化合物４１を油状物質として生成した（２．２ｇ）。

【0220】

（実施例４２）
ＰＥＧ脂質の合成

【化17】

ペグ化脂質４２－６（「ＰＥＧ－ＤＭＡ」）を上記反応スキームに従い調製した（式中、ｎは、ペグ化脂質中の一連のエチレンオキシドの繰返し単位の中心を近似している）。４２－１および４２－２の合成

【0221】

ミリスチン酸（６ｇ、２６ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）中溶液に、塩化オキサリル（３９ｍｍｏｌ、１．５当量、５ｇ）を室温で加えた。生成した混合物を７０℃で２時間加熱した後、混合物を濃縮した。残渣をトルエン中に溶解させ、再び濃縮した。シリンジを介して残存する油状物質を濃縮アンモニア溶液（２０ｍＬ）に１０℃で加えた。反応混合物を濾過し、水で洗浄した。白色の固体を真空中で乾燥させた。所望の生成物を白色の固体として得た（３．４７ｇ、１５ｍｍｏｌ、５８．７％）。
４２－３の合成

【0222】

２０－２（３．４７ｇ、１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７０ｍＬ）中懸濁液に、水素化アルミニウムリチウム（１．１４ｇ、３０ｍｍｏｌ）を室温で３０分の期間の間少しずつ加えた。次いで、混合物を穏やかに（６５℃の油浴）一晩加熱還流させた。混合物を５℃に冷却し、硫酸ナトリウム９水和物を加えた。混合物を２時間撹拌し、セライトの層を介して濾過し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の１５％のＭｅＯＨで洗浄した。濾液および洗液を合わせ、濃縮した。残存する固体を真空中で乾燥させた。所望の生成物を白色の固体として得た（２．８６ １３．４ｍｍｏｌ、８９．５％）。
４２－４の合成

【0223】

ミリスチン酸（３．８６ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）のベンゼン（４０ｍＬ）およびＤＭＦ（１滴）中溶液に、塩化オキサリル（２５．３５ｍｍｏｌ、１．５当量、３．２２ｇ）を
室温で加えた。混合物を室温で１．５時間撹拌した。６０℃で３０分加熱した。混合物を濃縮した。残渣をトルエン中に溶解させ、再び濃縮した。残存する油状物質（淡黄色）を２０ｍＬのベンゼン中に入れ、シリンジを介して、２０－３（２．８６ １３．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．５３ｍＬ、１．５当量）のベンゼン（４０ｍＬ）中溶液に１０℃で加えた。添加後、生成した混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、２０％のＨ_２ＳＯ_４でｐＨ６～７に調整した。混合物を濾過し、水で洗浄した。薄色の固体を得た。粗生成物をメタノールから再結晶化した。これによって、所望の生成物をオフホワイト色の固体として得た（５．６５ｇ、１３ｍｍｏｌ、１００％）。
４２－５の合成

【0224】

２０－４（５．６５ｇ、１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）中懸濁液に、水素化アルミニウムリチウム（０．９９ｇ、２６ｍｍｏｌ）を室温で３０分の期間の間少しずつ加えた。次いで、混合物を穏やかに一晩加熱還流させた。混合物を０℃に冷却し、硫酸ナトリウム９水和物。混合物を２時間撹拌し、次いでセライトのパッドおよびシリカゲルを介して濾過し、エーテルで最初に洗浄した。濾液が濁り、沈殿が形成された。濾過により白色の固体を得た。固体をＭｅＯＨから再結晶化し、無色の結晶性固体（２．４３ｇ）。

【0225】

次いで、セライトおよびシリカゲルのパッドをＤＣＭ（４００ｍＬ）中の５％のＭｅＯＨ、次いで１％のトリエチルアミン（３００ｍＬ）を含むＤＣＭ中の１０％のＭｅＯＨで洗浄した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、濃縮した。白色の固体を得た。固体をＭｅＯＨから再結晶化し、無色の結晶性固体（０．７９ｇ）。上記２つの固体（２．４３ｇおよび０．７９ｇ）を合わせて、真空中で乾燥させた（３．２０ｇ、６０％）。

【数31】

４２－６の合成

【0226】

２０－５（７ｍｍｏｌ、２．８７ｇ）およびトリエチルアミン（３０ｍｍｏｌ、４．１８ｍＬ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）中溶液に、ｍＰＥＧ－ＮＨＳ（ＮＯＦ製、５．０ｍｍｏｌ、９．９７ｇ、ＰＥＧ ＭＷおよそ２，０００、ｎ＝約４５）のＤＣＭ（１２０ｍＬ）中溶液を加えた。２４時間後、反応液を水（３００ｍＬ）で洗浄した。水相をＤＣＭ（１００ｍＬ×２）で２回抽出した。ＤＣＭ抽出物を合わせ、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、部分的に濃縮した。濃縮した溶液（約３００ｍＬ）を約－１５℃に冷却した。濾過により、白色の固体を得た（１．０３０ｇ、未反応の開始アミン）。濾過に、Ｅｔ３Ｎ（１．６ｍｍｏｌ、０．２２２ｍＬ、４当量）および無水酢酸（１．６ｍｍｏｌ、１６４ｍｇ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで固体に濃縮した。残存する固体を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～８％メタノール）により精製した。これによって、所望の生成物を白色の固体として得た（９．２１１ｇ）。

【数32】

【0227】

（実施例４３）
ＰＥＧ脂質の合成

【化18】

パルミチン酸（１０ｇ）のベンゼン（５０ｍＬ）中懸濁液を、塩化オキサリル（５ｍＬ）で３時間処理した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解した。溶液を濃縮アンモニア（１００ｍＬ）に撹拌しながらゆっくりと加えた。生成した懸濁液を濾過し、水で洗浄した。沈殿物をメタノール中に懸濁させ、５０℃に温めて、固体を溶解し、次いで、室温に冷却した。再結晶化した粗生成物を濾過し、乾燥させて、ヘキサデカノイルアミドを白色の固体として生成した（８．７ｇ）。

【0228】

粗生成物をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（１．１ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を１時間撹拌した。過剰のメタノール、続いて水（２ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、混合物を濾過した。溶媒を濾液から除去して、粗製のヘキサデシルアミンを生成した（７ｇ）。

【0229】

上記の通り調製したヘキサデカノイル（ｈｅｘａｄｅｃｙａｎｏｙｌ）クロリド（１０．５ｇ）のジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｍｅｔｈａｎｅ）（４０ｍＬ）中溶液を、粗製のヘキサデシルアミン（ｈｅｘｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）のジクロロメタン（４０ｍＬ）中溶液に、撹拌しながらゆっくりと加えた。トリエチルアミン（１５ｍＬ）を加え、溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を濾過し、収集した沈殿物（Ｎ－（ヘキサデカノイル）ヘキサデシルアミド、約１０．７ｇ）を真空下で乾燥させた。

【0230】

粗生成物をＴＨＦ（６０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（１．１ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。過剰のメタノール、続いて水（３ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、溶液を濾過した。溶媒を除去し、粗製のジヘキサデシルアミン（７．６ｇ）を白色の粉末として生成した。

【0231】

ジヘキサデシルアミン（３ｇ）およびモノメトキシ－ＰＥＧ－２０００－アセトイルＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０ｇ）のジクロロメタン（６０ｍＬ）中溶液をトリエチルアミン（３ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。無水酢酸（１ｍＬ）を加え、溶液を３０分間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、ブラインで洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０～８％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通して、４３－１を白色の粉末として生成した（５．２ｇ）。

【0232】

（実施例４４）
ＰＥＧ脂質の合成

【化19】

ステアリン酸（６．５ｇ）のベンゼン（２０ｍＬ）中懸濁液を、塩化オキサリル（７ｍＬ）で３日間処理した。溶媒を除去し、残渣をベンゼン（４０ｍＬ）に溶解した。濃縮アンモニア（５０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加えた。生成した懸濁液を濾過し、水で
洗浄した。沈殿物をメタノール中に懸濁させ、濾過した。収集した沈殿物をメタノールで洗浄し、乾燥させて、オクタデカノイルアミドを白色の粉末として生成した（６．５ｇ）。

【0233】

粗生成物をＴＨＦ（８０ｍＬ）中に懸濁させ、過剰の水素化リチウムアルミニウム（１．６ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を１時間撹拌した。過剰のメタノール、続いて、沈殿物が溶解するまで濃塩酸をゆっくりと加えた。反応混合物を水で希釈し、再結晶させた。溶液を濾過し、収集した沈殿物を乾燥させて、粗製のオクタデシルアミンを生成した（５．９ｇ）。

【0234】

上記の通り調製したオクタデカノイル（ｏｃｔａｄｅｃｙａｎｏｙｌ）クロリド（８ｇ）のジクロロメタン（４０ｍＬ）中溶液を、撹拌しながら粗製のオクタデシルアミンで処理した。トリエチルアミン（１５ｍＬ）およびヘキサン（１００ｍＬ）を加え、溶液を４５℃で１時間撹拌した。溶液を冷却し、濾過し、収集した沈殿物をメタノールで洗浄した。沈殿物をジクロロメタンから再結晶化して、Ｎ－（オクタデカノイル）オクタデシルアミド（６．８ｇ）を白色の粉末として生成した。

【0235】

生成物をＴＨＦ（１５０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（１．５ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を一晩還流させた。過剰のメタノール、続いて、沈殿物が溶解するまで濃塩酸をゆっくりと加えた。溶液を水で希釈し、結晶化させた。溶液を濾過し、収集した沈殿物を水で洗浄した（４×）。沈殿物を真空下で乾燥させ、ジオクタデシルアミン（６．２ｇ）を白色の粉末として生成した。

【0236】

ジオクタデシルアミン（４．５ｇ）およびモノメトキシ－ＰＥＧ－２０００－アセトイルＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（９ｇ）のクロロホルム（９０ｍＬ）中溶液を、トリエチルアミン（４０ｍＬ）で処理し、５０℃で３０分間撹拌した。溶液を濾過した。無水酢酸（１ｍＬ）を濾液に加え、溶液を１５分間撹拌した。アンモニア（１５０ｍＬ）、続いてブライン（１５０ｍＬ）を加えた。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、有機相を希釈塩酸で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０～８％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに通して、４４－１を白色の粉末として生成した（７．４ｇ）。

【0237】

（実施例４５）
ＰＥＧ脂質の合成

【化20】

ラウリン酸（１０ｇ）のベンゼン（２０ｍＬ）中懸濁液を、塩化オキサリル（１０ｍＬ）で１時間処理した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。溶液を濃縮アンモニア（１５０ｍＬ）に撹拌しながらゆっくりと加えた。反応混合物をジクロロメタンで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、粗製のドデカノイルアミドを白色の粉末として生成した（１０ｇ）。

【0238】

生成物をＴＨＦ（１５０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（３ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を１時間撹拌した。過剰のメタノール、続いて水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、生成した懸濁液を濾過した。溶媒を濾液から除去し、残渣を、メタノール／ジク
ロロメタン勾配を使用するシリカゲル（８０ｇ）カラムに通して、ドデカニルアミンを生成した（４．５ｇ）。

【0239】

ラウリン酸（７．３ｇ）、粗製のテトラデシルアミン（４．５ｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４．２ｇ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）中溶液をＥＤＣ（７．０ｇ）、続いてトリエチルアミン（１５ｍＬ）で処理し、溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を濾過して、粗製のＮ－ドデカノイルドデカニルアミド（１ｇ）を粉末として生成した。溶媒を濾液から除去し、残渣をメタノール中に懸濁させ、濾過して、さらに２ｇの粗製のＮ－ドデカノイルドデカニルアミドを生成した。

【0240】

粗生成物（３ｇ）をＴＨＦ（６０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（過剰の量をゆっくりと加えた）で２時間処理した。過剰のメタノール、続いて水（１ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、懸濁液を濾過した。溶媒を濾液から除去し、残渣を、０～１２％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲルカラム（２０ｇ）に通して、Ｎ－ドデカノイルドデカニルアミン（１．４ｇ）を蝋状の固体として生成した。

【0241】

Ｎ－ドデカニルアミン（ｄｏｄｅｃａｎｙｌｄｏｄｅｃａｎｙｌａｍｉｎｅ）（０．５２ｇ）およびモノメトキシ－ＰＥＧ－２０００－アセトイルＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．５ｇ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液を、トリエチルアミン（０．２ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。溶媒を除去し、生成物を、０～６％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。無水酢酸（５滴）およびトリメチルアミン（１０滴）を、回収した生成物のジクロロメタン中溶液に加え、１時間撹拌させた。溶媒を除去し、残渣を、０～４％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲル（２０ｇ）カラムに通して、ＭｅＰＥＧＡ－２０００－ＤＬＡを白色の粉末として生成した（０．４４ｇ）。
（実施例４６）
ＰＥＧ脂質の合成

【化21】

【0242】

ミリスチン酸（３０ｇ）のベンゼン（１００ｍＬ）中懸濁液を塩化オキサリル（１５ｍＬ）で一晩処理した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を濃縮アンモニア（７０ｍＬ）に撹拌しながらゆっくりと加えた。生成した懸濁液を濾過し、水で洗浄した。沈殿物を乾燥させ、粗製のテトラデカノイルアミドを白色の固体として生成した（２７ｇ）。

【0243】

生成物をＴＨＦ（２００ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（４．５ｇ、ゆっくりと加えた）で処理した。反応混合物を１時間撹拌した。過剰のメタノール、続いて水（１０ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、生成した懸濁液を濾過した。溶媒を濾液から除去し、粗製のテトラデシルアミンを生成した（１７．６ｇ）。

【0244】

ラウリン酸（３．５ｇ）、粗製のテトラデシルアミン（３ｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１．９ｇ）のジクロロメタン（４０ｍＬ）中溶液を、ＥＤＣ（３．３ｇ）、続いてトリエチルアミン（４ｍＬ）で処理し、溶液を室温で３日間撹拌した。溶液を濾
過し、収集した沈殿物を乾燥させ、粗製のＮ－ラウロイルテトラデカニルアミン（２．６ｇ）を粉末として生成した。

【0245】

粗生成物をＴＨＦ（６０ｍＬ）中に懸濁させ、水素化リチウムアルミニウム（０．８ｇ、ゆっくりと加えた）で１時間処理した。過剰のメタノール、続いて水（２ｍＬ）をゆっくりと加えた。ジクロロメタンを加え、懸濁液を濾過した。溶媒を除去し、残渣を高温のメタノール（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を冷却し、濾過して、０．５ｇのＮ－ドデカニルテトラデカニルアミンを生成した。溶媒を濾液から除去し、２０ｍＬのメタノールを用いてこのプロセスを繰り返して、第２の収穫物であるＮ－ドデカニルテトラデカニルアミンを生成した（０．９ｇ）。

【0246】

Ｎ－ドデカニルテトラデカニルアミン（０．５ｇ）およびモノメトキシ－ＰＥＧ－２０００－アセトイルＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．５ｇ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液を、トリエチルアミン（０．２ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。溶媒を除去し、生成物を、０～６％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。無水酢酸（５滴）およびトリメチルアミン（１０滴）を、回収した生成物のジクロロメタン中溶液に加え、１時間撹拌させた。溶媒を除去し、残渣を、０～４％メタノール／ジクロロメタン勾配を使用するシリカゲル（２０ｇ）カラムに通して、ＭｅＰＥＧＡ－２０００－ＬＭＡを白色の粉末として生成した（０．７６ｇ）。

【0247】

（実施例４７）
脂質ナノ粒子組成物を使用したルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ評価
カチオン性脂質（ＭＣ３）、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質を、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、エタノール中で可溶化した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、全脂質のｍＲＮＡに対する重量比約１０：１～３０：１で調製した。簡単に説明すると、１０～５０ｍＭのクエン酸塩緩衝剤中で、ｐＨ４で、ｍＲＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。シリンジポンプを使用して、１５ｍｌ／分より上の全流速で、エタノール性脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液を約１：５～１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で混合した。次いで、エタノールを除去し、外部の緩衝剤を透析によりＰＢＳに置き換えた。最後に、脂質ナノ粒を、０．２μｍ細孔の無菌フィルターを介して濾過した。脂質ナノ粒子の粒径は、Ｎｉｃｏｍｐ ３７０サブミクロン粒度計（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用した準弾性光散乱により判定した場合、直径７０～９０ｎｍであった。

【0248】

動物実験委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＣ））およびカナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ））により確立されたガイドラインに従い、６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）において研究を実施した。異なる用量のｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子を尾静脈注射により全身投与し、投与後特定の時点で（１、２、４、８および２４時間）動物を安楽死させた。肝臓および脾臓を、予め計量した管内に採取し、重量を判定し、液体窒素中で直ちに瞬間凍結し、分析用の処理が行われるまで－８０℃で保存した。

【0249】

肝臓に関して、約５０ｍｇを分析用に切開し、２ｍＬのＦａｓｔＰｒｅｐ管（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ ＯＨ）内に入れた。１／４インチのセラミック球（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を各管に加え、室温に平衡化させた５００μＬのＧｌｏ溶解緩衝剤－ＧＬＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を肝臓組織に加えた。ＦａｓｔＰｒｅｐ２４装置（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を、２×６．０ｍ／秒で１５秒間用いて、肝臓組織をホモジナイズした。ホモジネートを室温で５分間インキュベートしてから、ＧＬＢ中で１：４希釈し、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。具体的に、５０μＬの希釈された組織ホモ
ジネートを５０μＬのＳｔｅａｄｙＧｌｏ基質と反応させ、１０秒間振盪させ、これに続いて５分間のインキュベーションを行い、次いで、ＣｅｎｔｒｏＸＳ^３ ＬＢ ９６０照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化した。アッセイしたタンパク質の量をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を使用して決定した。次いで、相対発光単位（ＲＬＵ）をアッセイした全タンパク質（ｕｇ）に正規化した。ＲＬＵをルシフェラーゼ（ｎｇ）に変換するため、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検量線を作成した。図１に提供されているデータに基づき、４時間の時点が脂質製剤の効力評価用に選択された（実施例４８を参照されたい）。

【0250】

Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（Ｌ－６１０７）は、もともとホタル、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓから単離したルシフェラーゼタンパク質を発現する。ＦＬｕｃは、遺伝子発現と細胞生存度の両方を測定するために、哺乳動物細胞培養物に一般的に使用される。これは、基質、ルシフェリンの存在下で生物発光を発光する。このキャッピングおよびポリアデニル化されたｍＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全に置換されている。

【0251】

（実施例４８）
ｉｎ ｖｉｖｏで、ルシフェラーゼｍＲＮＡ発現げっ歯類モデルを使用する、様々なカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子製剤の効力の判定
表２に示されているカチオン性脂質は、以前核酸を用いて試験を行った。比較目的のため、これらの脂質を使用して、実施例４７およびその全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ１０／２２６１４に記載されているような株混合法を使用して、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（Ｌ－６１０７）を含有する脂質ナノ粒子もまた製剤化した。脂質ナノ粒子は、以下のモル比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ脂質（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」、すなわち、（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール、平均ＰＥＧ分子量２０００）を使用して製剤化した。実施例４７に記載の通り尾静脈注射を介した投与の４時間後、肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって、相対活性を決定した。０．３および１．０ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量での活性を比較し、実施例４７に記載の通り、投与の４時間後に測定したルシフェラーゼ（ｎｇ）／肝臓（ｇ）として表現した。

【表8】

【0252】

表３に示されている本発明の新規の脂質を、以下のモル比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ脂質（「ＰＥＧ－ＤＭＡ」化合物４２－６）を使用して製剤化した。実施例４７に記載の通り尾静脈注射を介した投与の４時間後、肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって、相対活性を決定した。０．３および１．０ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量での活性を比較し、実施例４７に記載の通り、投与の４時間後に測定したルシフェラーゼ（ｎｇ）／肝臓（ｇ）として表現した。

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【0253】

（実施例４９）
製剤化した脂質のｐＫａの判定
他の箇所で記載されているように、製剤化したカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関する（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２年）、５１巻（３４号）、８５２９～８５３３頁；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８巻、１７２～１７６頁（２０１０年）を参照されたい）。ｐＫａの好ましい範囲は約５～約７である。２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、各カチオン性脂質のｐＫ_ａを脂質ナノ粒子において決定した。ＰＢＳ中に、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）を総脂質濃度０．４ｍＭで含む脂質ナノ粒子を
、実施例４７に記載されているようなインラインプロセスを使用して調製した。ＴＮＳは、蒸留水中１００μΜストック溶液として調製した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１３０ｍＭ ＮａＣｌ（このｐＨは２．５～１１の範囲である）を含有する２ｍＬの緩衝液中で、ベシクルを２４μΜの脂質に希釈した。アリコートのＴＮＳ溶液を加えて、最終濃度を１μΜにし、ボルテックス混合した後、３２１ｎｍおよび４４５ｎｍの励起および発光波長を使用する、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで、室温で蛍光強度を測定した。シグモイドのベストフィット分析を蛍光データに適用し、最大半量の蛍光強度を引き起こすｐＨとしてｐＫ_ａを測定した（図２を参照されたい）。

【0254】

（実施例５０）
アミノ脂質の活性比較および炭化水素鎖構造の効果
表５に示されているカチオン性脂質を、以下のモル比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ－脂質（４２－６）を使用して製剤化した。実施例４８に記載の通り尾静脈注射を介した投与の４時間後、肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって、相対活性を決定した。０．１、０．３および１．０ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量での活性を比較し、実施例４８に記載の通り、投与の４時間後に測定したルシフェラーゼ（ｎｇ）／肝臓（ｇ）として表現した。データは図３にプロットされている（最高値から最低値：ダイヤモンド形＝化合物６；正方形＝化合物５；三角形＝ＭＣ３；および丸＝化合物Ａ）。化合物Ａ、５および６は、共通の先端基ではあるが、異なる炭化水素鎖構造を有する。

【表13】

【0255】

（実施例５１）
カチオン性脂質の活性比較および先端基鎖長の効果
表６に示されているカチオン性脂質を、以下のモル比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ－脂質（４２－６）を使用して製剤化した。実施例４８に記載の通り尾静脈注射を介した投与の４時間後、肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって、相対活性を決定した。０．１、０．３および１．０ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量での活性を比較し、実施例４８に記載の通り、投与の４時間後に測定したルシフェラーゼ（ｎｇ）／肝臓（ｇ）として表現した。化合物Ａ、ＢおよびＣは、共通の炭化水素鎖構造ではあるが、異なる先端基鎖長を有する。化合物６は、化合物Ａと好ましい先端基を共有し、先端基と炭化水素鎖構造の組合せの予期せぬ利点を明示している。

【表14】

【0256】

（実施例５２）
ＰＥＧ－ＤＭＧおよびＰＥＧ－ＤＭＡ脂質の活性比較
ＰＥＧ－ＤＭＧとＰＥＧ－ＤＭＡ脂質の活性比較が図４に示されている。ＬＮＰを、以下のモル比：５０％ＭＣ３脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ－脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡ）を使用して製剤化した。実施例４８に記載の通り尾静脈注射を介した投与の４時間後、肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって、相対活性を決定した。０．１、０．３および１．０ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量での活性を比較し、実施例４８に記載の通り、投与の４時間後に測定したルシフェラーゼ（ｎｇ）／肝臓（ｇ）として表現した。

【0257】

データは、図４において棒グラフ形態で提示されている。

【0258】

（実施例５３）
チェリーレッド（ＣＲ）ｍＲＮＡと呼ばれる赤色の蛍光性タンパク質を使用したＬＮＰ活性
化合物６を使用したＬＮＰを、チェリーレッド（ＣＲ、例えばＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製品Ｌ－６１１３）と呼ばれる赤色の蛍光性タンパク質をコードしているｍＲＮＡを用いて、実施例４７に記載の通り製剤化する。実施例４７に記載の通りｉｎ ｖｉｖｏ研究を行い、肝臓組織の切片を処理し、投与後、４、６および２４時間の時点で、共焦点蛍光顕微鏡法により観察する。発現レベルは、約６時間でピークに達し、少なくとも２４時間維持された。観察された組織切片は、肝臓全体にわたる均質の発現を明示している。

【0259】

（実施例５４）
ヒトＦＩＸ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏの肝細胞へのＬＮＰ送達が、マウス血漿中に、治療レベルのｈＦＩＸタンパク質を生じる
表７に示されているカチオン性脂質を有するＬＮＰを、実施例４７に記載の通り、以下の脂質モル比：５０％脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％ＰＥＧ－脂質を使用して、ヒトＦＩＸ（例えばＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製品Ｌ－６１１０）をコードしているｍＲＮＡを用いて製剤化する。製造元の指示通り市販のキット（例えば、Ａｂｃａｍ ａｂ１０８８３１）を使用して、ＥＬＩＳＡにより血漿タンパク質を分析する。化合物５および化合物６のＬＮＰに対して表７に与えられたｈＦＩＸ発現の測定レベルは、臨床的に関連し、これらのｈＦＩＸ ｍＲＮＡ ＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、重症の疾患を有する患者を穏やかな疾患状態に変えるのに十分であるｈＦＩＸタンパク質濃度が生じる。これらのレベルのｈＦＩＸの期間は、約１５時間またはこれより長い。

【表15】

【0260】

例示的実施形態は、以下を含む：
実施形態１．式Ｉ：

【化22】

（式中、
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または炭素－炭素二重結合であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^１ａはＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^１ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^２ａおよびＲ^２ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^２ａは、ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^２ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、出現ごとに、独立して（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^３ａはＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^３ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^４ａおよびＲ^４ｂは、出現ごとに、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^４ａは、ＨもしくはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂとそれが結合している炭素原子は、隣接するＲ^４ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６は、それぞれ独立して、メチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ^７は、出現ごとに、独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^８およびＲ^９は、それぞれ独立して、非置換のＣ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、またはＲ^８およびＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５、６または７員の複素環を形成し、
ａおよびｄは、それぞれ独立して、０～２４の整数であり、
ｂおよびｃは、それぞれ独立して、１～２４の整数であり、
ｅは１または２であり、
ただし、
Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａもしくはＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキルであるか、またはＬ^１もしくはＬ^２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂは、ａが６である場合、イソプロピルではなく、ａが８である場合、ｎ－ブチルではない）
の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体。

【0261】

実施形態２．Ｌ^１またはＬ^２の１つが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である、実施形態１の化合物。

【0262】

実施形態３．Ｌ^１またはＬ^２の１つが－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である、実施形態１または２のいずれか１つの化合物。

【0263】

実施形態４．Ｌ^１またはＬ^２の１つが炭素－炭素二重結合である、実施形態１から３のいずれか１つの化合物。

【0264】

実施形態５．以下の構造（Ｉａ）、（Ｉｂ）または（Ｉｃ）：

【化23】

の１つを有する、実施形態１の化合物。

【0265】

実施形態６．ａ、ｂ、ｃおよびｄが、それぞれ独立して、２～１２の整数である、実施形態１から５のいずれか１つの化合物。

【0266】

実施形態７．ａ、ｂ、ｃおよびｄが、それぞれ独立して、５～９の整数である、実施形態１から５のいずれか１つの化合物。

【0267】

実施形態８．Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａの少なくとも１つがＨである、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。

【0268】

実施形態９．Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａが出現ごとにＨである、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。

【0269】

実施形態１０．Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａおよびＲ^４ａの少なくとも１つがＣ_１～Ｃ_８アルキルである、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。

【0270】

実施形態１１．Ｃ_１～Ｃ_８アルキルが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである、実施形態１０の化合物。

【0271】

実施形態１２．Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂおよびＲ^４ｂの少なくとも１つがＨである、実施形態１から１１のいずれか１つの化合物。

【0272】

実施形態１３．Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂおよびＲ^４ｂが出現ごとにＨである、実施形態
１から１１のいずれか１つの化合物。

【0273】

実施形態１４．Ｒ^１ｂとそれが結合している炭素原子が、隣接するＲ^１ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する、実施形態１から１１のいずれか１つの化合物。

【0274】

実施形態１５．Ｒ^４ｂとそれが結合している炭素原子が、隣接するＲ^４ｂとそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する、実施形態１から１１または１４のいずれか１つの化合物。

【0275】

実施形態１６．Ｒ^５またはＲ^６の１つがメチルである、実施形態１から１５のいずれか１つの化合物。

【0276】

実施形態１７．Ｒ^５およびＲ^６のそれぞれがメチルである、実施形態１から１５のいずれか１つの化合物。

【0277】

実施形態１８．Ｒ^５またはＲ^６の１つがシクロアルキルである、実施形態１から１５のいずれか１つの化合物。

【0278】

実施形態１９．Ｒ^５およびＲ^６のそれぞれがシクロアルキルである、実施形態１から１５のいずれか１つの化合物。

【0279】

実施形態２０．シクロアルキルが非置換である、実施形態１８または１９のいずれか１つの化合物。

【0280】

実施形態２１．シクロアルキルが置換されている、実施形態１８または１９のいずれか１つの化合物。

【0281】

実施形態２２．シクロアルキルが、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルで置換されている、実施形態１８または１９のいずれか１つの化合物。

【0282】

実施形態２３．Ｃ_１～Ｃ_６アルキルがｔｅｒｔ－ブチルである、実施形態２２の化合物。

【0283】

実施形態２４．シクロアルキルがシクロヘキシルである、実施形態１８から２３のいずれか１つの化合物。

【0284】

実施形態２５．少なくとも１つのＲ^７がＨである、実施形態１から２４のいずれか１つの化合物。

【0285】

実施形態２６．各Ｒ^７がＨである、実施形態２５の化合物。

【0286】

実施形態２７．少なくとも１つのＲ^７がＣ_１～Ｃ_６アルキルである、実施形態１から２５のいずれか１つの化合物。

【0287】

実施形態２８．ｅが２である、実施形態１から２７のいずれか１つの化合物。

【0288】

実施形態２９．Ｒ^８またはＲ^９の少なくとも１つがメチルである、実施形態１から２８のいずれか１つの化合物。

【0289】

実施形態３０．Ｒ^８およびＲ^９のそれぞれがメチルである、実施形態１から２９の化合物。

【0290】

実施形態３１．表１の化合物から選択される、実施形態１の化合物。

【0291】

実施形態３２．実施形態１から３１のいずれか１つの化合物と、治療剤とを含む組成物。

【0292】

実施形態３３．中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質から選択される１種または複数の賦形剤をさらに含む、実施形態３２の組成物。

【0293】

実施形態３４．ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される１種または複数の中性脂質を含む、実施形態３３の組成物。

【0294】

実施形態３５．中性脂質がＤＳＰＣである、実施形態３４の組成物。

【0295】

実施形態３６．化合物と中性脂質とのモル比が、約２：１～約８：１の範囲である、実施形態３３から３５のいずれか１つの組成物。

【0296】

実施形態３７．ステロイドがコレステロールである、実施形態３２から３６のいずれか１つの組成物。

【0297】

実施形態３８．化合物とコレステロールとのモル比が、約２：１～１：１の範囲である、実施形態３７の組成物。

【0298】

実施形態３９．ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質である、実施形態３２から３８のいずれか１つの組成物。

【0299】

実施形態４０．化合物とペグ化脂質とのモル比が、約１００：１～約２５：１の範囲である、実施形態３９の組成物。

【0300】

実施形態４１．ペグ化脂質がＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態３９または４０のいずれか１つの組成物。

【0301】

実施形態４２．ペグ化脂質が、以下の構造（ＩＩ）：

【化24】

（式中、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つまたは複数のエステル結合により任意選択で分断されており、
ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する）
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有する、実施形態３９または４０のいずれか１つの組成物。

【0302】

実施形態４３．Ｒ^１０およびＲ^１１が、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する直鎖状の飽和アルキル鎖である、実施形態４２の組成物。

【0303】

実施形態４４．ｚの平均が約４５である、実施形態４２または４３のいずれか１つの組成物。

【0304】

実施形態４５．治療剤が核酸を含む、実施形態３２から４４のいずれか１つの組成物。

【0305】

実施形態４６．核酸が、アンチセンスおよびメッセンジャーＲＮＡから選択される、実施形態４５の組成物。

【0306】

実施形態４７．治療剤の投与をそれを必要とする患者に行うための方法であって、実施形態３２から４６のいずれか１つの組成物を調製または提供するステップと、組成物を患者に投与するステップとを含む方法。

【0307】

実施形態４８．以下の構造（ＩＩ）：

【化25】

（式中、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つまたは複数のエステル結合により任意選択で分断されており、
ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有し、
ただし、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ｚが４２である場合、両方がｎ－オクタデシルではない）
を有するペグ化脂質またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体。

【0308】

実施形態４９．Ｒ^１０およびＲ^１１が、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する直鎖状の飽和アルキル鎖である、実施形態４８のペグ化脂質。

【0309】

実施形態５０．ｚが約４５である、実施形態４８または４９のいずれか１つのペグ化脂質。

【0310】

実施形態５１．以下の構造：

【化26】

の１つを有する実施形態４８のペグ化脂質（式中、ｎは、４０～５０の範囲の平均値を有
する）。

【0311】

実施形態５２．実施形態４８から５１のいずれか１つのペグ化脂質と、カチオン性脂質とを含む組成物。

【0312】

実施形態５３．カチオン性脂質が、実施形態１から３１のいずれか１つの化合物である、実施形態５２の組成物。

【0313】

上に記載の様々な実施形態は、組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。これに限定されないが、２０１４年６月２５日に出願された米国仮出願第６２／０１６，８３９号を含めて、本明細書に参照された、および／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公報のすべては、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。実施形態の態様は、必要に応じて修正して、様々な特許、出願および公報の概念を利用し、またさらなる実施形態を提供することができる。これらおよび他の変更は、上記に詳述された記載を考慮して実施形態に行うことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示された特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲の権利が与えられている同等物の全範囲と共に、すべての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】