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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-06
(45)【発行日】2023-02-14
(54)【発明の名称】複数の標的核酸を検出するキットを用いる検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20230207BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230207BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20230207BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230207BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12Q1/689 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2018173434
(22)【出願日】2018-09-18
(65)【公開番号】P2020043789
(43)【公開日】2020-03-26
【審査請求日】2021-07-28
(73)【特許権者】
【識別番号】598034720
【氏名又は名称】株式会社ミズホメディー
(74)【代理人】
【識別番号】100097179
【弁理士】
【氏名又は名称】平野 一幸
(72)【発明者】
【氏名】長野 隆志
(72)【発明者】
【氏名】蛭子 耕一
(72)【発明者】
【氏名】楢原 謙次
(72)【発明者】
【氏名】市丸 和広
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１９４５５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０１１６８７７６（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２００７－２３６２１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－０６８０１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－３０５２１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－１７３１２７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｇ０１Ｎ３３／００－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の標的核酸を検出するキットを用いる検出方法であって、
変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とするとき、
前記キットは、
前記変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液と、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
前記伸長温度Ｔ２において、前記ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、
前記アニーリング温度Ｔ１においては、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、前記第２標的検出温度Ｔ３において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有するものであり、
増幅反応中の特定のサイクル又は全てのサイクル毎に、次の数式による演算を行うことを特徴とする検出方法。
ｆ１［ｎ］＝ｆｈｙｂ．１［ｎ］／ｆｄｅｎ．１［ｎ］ （数１）
ｆ２［ｎ］＝ｆｈｙｂ．２［ｎ］／ｆｄｅｎ．２［ｎ］ （数１’）
Ｆｒ［ｎ］＝（ａ－ｆ２［ｎ］）／（ａ－ｆ１［ｎ］） （数２）
ｆ１［ｎ］：（数１）により算出されたｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの変性ステップにおける蛍光強度値
ｆ２［ｎ］：（数１’）により算出されたｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップ変性ステップにおける蛍光強度値
ａ：Ｆｒが０以下にならないような定数である。
Ｆｒ［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
【請求項2】
Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定され、
しかも、前記第１標識物は前記第２標識物と等しく、且つ、前記第１標識物による前記蛍光シグナルは、前記第２標識物による前記蛍光シグナルに等しい請求項１記載の検出方法。
【請求項3】
さらに、以下の数式による演算を行う請求項２記載の検出方法。Ｆ１［ｎ］＝ｆ１［ｎ］／ｆ１［Ｘ］ （数３）
Ｆ２［ｎ］＝ｆ２［ｎ］／ｆ２［Ｘ］ （数３’）
Ｆｒ’［ｎ］＝（ａ－Ｆ２［ｎ］）／（ａ－Ｆ１［ｎ］） （数２’）
ｆ１［Ｘ］：標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
ｆ２［Ｘ］標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的及び第２標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
Ｆ１［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆ２［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆｒ’［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
【請求項4】
複数の標的核酸を検出するキットを用いる検出方法であって、
変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とするとき、
前記キットは、
前記変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液と、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
前記伸長温度Ｔ２において、前記ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、
前記アニーリング温度Ｔ１においては、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、前記第２標的検出温度Ｔ３において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有するものであり、
融解曲線分析に、次の数式による演算を行うことを特徴とする検出方法。
ｆ１ｍ＝ｆｈｙｂ．１ｍ／ｆｄｅｎ．１ｍ （数４）
ｆ２ｍ＝ｆｈｙｂ．２ｍ／ｆｄｅｎ．２ｍ （数４’）
Ｆｒｍ＝（ａ－ｆ２ｍ）／（ａ－ｆ１ｍ） （数５）
ｆ１ｍ：（数４）により算出された融解曲線の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ解離温度における蛍光強度値
ｆ２ｍ：（数４’）により算出された融解曲線の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ解離温度における蛍光強度値であり、ｆｄｅｎ．１ｍと同じ温度の蛍光強度値（同じ値）
ａ：Ｆｒｍが０以下にならないような定数である。
Ｆｒｍ：第２標的核酸検出のための演算値
【請求項5】
前記蛍光シグナルは、アニールすると消光するか、又は、アニールすると発光する請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項6】
前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸は、マイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の野生型配列と薬剤耐性変異配列、或いは、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌シトシンメチルトランスフェラーゼＣＭＴ遺伝子である請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＣＲ法を改善し、複数の標的核酸を測定する検出キットを用いる検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子検査において、複数の標的遺伝子の測定が必要なことも多い。たとえばインフルエンザのＡ型とＢ型、インフルエンザとＲＳＶ、さらにはヒトメタニューモウイルス、性感染症のクラミジアと淋菌、マイコプラズマとその耐性因子などである。
【0003】
病状が似ている上に同じ時期に同時に感染が拡大する場合などは、これらを鑑別して診断し、治療方針を立てることも考えられる。また、耐性因子の存在は投薬の選定判断などにも使われる。
【0004】
一方、単独の測定項目においても、その測定が本当にうまく進んだかどうかを確認する手段として内部コントロールを設定することも有用である。これは検出目的である標的遺伝子とは関係ない核酸配列を増幅するようにあらかじめ準備しておき、標的遺伝子の有無にかかわらず反応がうまく進んだかどうかを確認できるものである。このことで測定試薬や装置が有効に作用したかどうかを測定内で確認できる。
【0005】
この様に、複数の標的核酸を検出するには、別々の測定を実施するか、或いは、それぞれの標的核酸の検出に異なる標識色素などを用いて識別する手段が考えられる。
【0006】
または、同時に増幅反応を行った後に、緩やかに温度を上昇（または下降）させて、蛍光シグナルの変化率がピークを示す温度と標的核酸の融解温度から識別判断すること（熱融解曲線分析法）も可能である。
【0007】
しかしながら、別々の測定では時間やコストがかかり、異なる標識物を識別することも、複数の標識試薬の準備のみならず分析装置の波長設定などでコストがかかってしまう。
【0008】
熱融解曲線分析法を用いる場合には、コストは低いが緩やかに温度の変化をさせる必要があるため、正確な分析を行うためには５～１０分ほどの時間をかけて温度変化を行わなければならない。
【0009】
特許文献１（特開２００２－１３６３００号公報）では、異なる反応液が入った複数の反応容器を用意し、それぞれ増幅検出する。項目ごとに試薬調製、分注作業があり手間がかかるという問題点がある。
【0010】
特許文献２（特開２００４－２０３号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに標識色素を変えておくことで識別する。用いる標識色素の数だけ、検出する装置の光学系が複数必要になってくるため装置のコストが高くなってしまうという問題点がある。
【0011】
特許文献３（特開２００８－１７３１２７号公報）では、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。項目ごとに、ＰＣＲ産物や標識プローブの解離温度を変え、増幅後に低温側から高温側に徐々に温度を上昇させ蛍光値をモニタリングする解離曲線分析（「熱融解曲線分析」と同義。）を行い、塩基配列に依存するそれぞれの解離温度におけるピークの有無をモニタリングすることによって識別する。
【0012】
融解曲線分析時の温度変化の速度を上げると各項目の融解温度を識別するのが困難になるため、ＰＣＲ反応後５～１０分ほど時間が余計にかかってしまうという問題点がある。
【0013】
特許文献４（特表２０１２－５１３２１５号公報）では、単一の標識を用いて、１個の反応液容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに、ＰＣＲ産物の解離温度とプライマーの融解温度を変え、それぞれの融解温度で蛍光をモニタリングして識別する。
【0014】
通常のＰＣＲプロファイルは１サイクル中に、変性、アニーリング・伸長ステップを設けるが、特許文献４では、項目ごとにＰＣＲ産物の融解温度を変えるため、考慮すべき条件が多く、プロファイルの設計が困難であり、測定時間も長くなる。
【0015】
また、温度変化が激しいため、装置の負担も大きいという問題点がある。
【0016】
前述した、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する方法に共通の課題が、標的遺伝子やプローブの塩基配列によっては蛍光シグナルが互いに干渉して識別できない点である。
【文献】特開２００２－１３６３００号公報
【文献】特開２００４－２０３号公報
【文献】特開２００８－１７３１２７号公報
【文献】特表２０１２－５１３２１５号公報
【文献】国際公開第２０１６／１９４５５２号公報
【文献】特許第４７２４３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
そこで本発明は、１種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸を検出するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0018】
第１の発明に係る検出方法は、複数の標的核酸を検出するキットを用い、増幅反応中の特定のサイクル又は全てのサイクル毎に、次の数式による演算を行うものである。即ち、
【0019】
ｆ１［ｎ］＝ｆｈｙｂ．１［ｎ］／ｆｄｅｎ．１［ｎ］ （数１）
ｆ２［ｎ］＝ｆｈｙｂ．２［ｎ］／ｆｄｅｎ．２［ｎ］ （数１’）
Ｆｒ［ｎ］＝（ａ－ｆ２［ｎ］）／（ａ－ｆ１［ｎ］） （数２）
ｆ１［ｎ］：（数１）により算出されたｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの変性ステップにおける蛍光強度値
ｆ２［ｎ］：（数１’）により算出されたｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップ変性ステップにおける蛍光強度値
ａ：Ｆｒが０以下にならないような定数である。
Ｆｒ［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
但し、本発明におけるサイクルは、図２において、連続する第１標的核酸及び第２標的核酸の検出ステップと第１標的核酸検出ステップとを合わせて、１サイクルとする。従って本発明における「１サイクル」とは、通常のＰＣＲにおける２サイクル分に相当することに留意されたい。
ｆ２［ｎ］＝ｆｈｙｂ．２［ｎ］／ｆｄｅｎ．２［ｎ］ （数１’）
Ｆｒ［ｎ］＝（ａ－ｆ２［ｎ］）／（ａ－ｆ１［ｎ］） （数２）
ｆ１［ｎ］：（数１）により算出されたｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的核酸検出ステップの変性ステップにおける蛍光強度値
ｆ２［ｎ］：（数１’）により算出されたｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップの伸長ステップにおける蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２［ｎ］：ｎサイクル目の第１標的及び第２標的核酸検出ステップ変性ステップにおける蛍光強度値
ａ：Ｆｒが０以下にならないような定数である。
Ｆｒ［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
但し、本発明におけるサイクルは、図２において、連続する第１標的核酸及び第２標的核酸の検出ステップと第１標的核酸検出ステップとを合わせて、１サイクルとする。従って本発明における「１サイクル」とは、通常のＰＣＲにおける２サイクル分に相当することに留意されたい。
【0020】
該複数の標的核酸を検出するキットでは、変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される。
【0021】
該キットは、変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液を用いる。
【0022】
また、該溶液は、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、ＤＮＡポリメラーゼと、伸長温度Ｔ２において、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、アニーリング温度Ｔ１においては、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有する。
【0023】
しかも、以上において、第１標識物は第２標識物と等しく、且つ、第１標識物による蛍光シグナルは、第２標識物による蛍光シグナルに等しい。
【0024】
好ましくは、さらに、以下の数式による演算を行う。即ち、
Ｆ１［ｎ］＝ｆ１［ｎ］／ｆ１［Ｘ］ （数３）
Ｆ２［ｎ］＝ｆ２［ｎ］／ｆ２［Ｘ］ （数３’）
Ｆｒ’［ｎ］＝（ａ－Ｆ２［ｎ］）／（ａ－Ｆ１［ｎ］） （数２’）
ｆ１［Ｘ］：標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
ｆ２［Ｘ］標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的及び第２標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
Ｆ１［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆ２［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆｒ’［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
Ｆ１［ｎ］＝ｆ１［ｎ］／ｆ１［Ｘ］ （数３）
Ｆ２［ｎ］＝ｆ２［ｎ］／ｆ２［Ｘ］ （数３’）
Ｆｒ’［ｎ］＝（ａ－Ｆ２［ｎ］）／（ａ－Ｆ１［ｎ］） （数２’）
ｆ１［Ｘ］：標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
ｆ２［Ｘ］標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定したＸサイクル目の蛍光強度値であり、第１標的及び第２標的核酸検出ステップの蛍光強度値の変化の基準として用いる。
Ｆ１［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆ２［ｎ］：Ｘサイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆｒ’［ｎ］：第２標的核酸検出のための演算値
【0025】
また第２の発明に係る検出方法は、上記複数の標的核酸を検出するキットを用いた、融解曲線分析に、次の数式による演算を行う。即ち、
【0026】
ｆ１ｍ＝ｆｈｙｂ．１ｍ／ｆｄｅｎ．１ｍ （数４）
ｆ２ｍ＝ｆｈｙｂ．２ｍ／ｆｄｅｎ．２ｍ （数４’）
Ｆｒｍ＝（ａ－ｆ２ｍ）／（ａ－ｆ１ｍ） （数５）
ｆ１ｍ：（数４）により算出された融解曲線の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ解離温度における蛍光強度値
ｆ２ｍ：（数４’）により算出された融解曲線の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ解離温度における蛍光強度値であり、ｆｄｅｎ．１ｍと同じ温度の蛍光強度値（同じ値）
ａ：Ｆｒｍが０以下にならないような定数である。
Ｆｒｍ：第２標的核酸検出のための演算値
ｆ２ｍ＝ｆｈｙｂ．２ｍ／ｆｄｅｎ．２ｍ （数４’）
Ｆｒｍ＝（ａ－ｆ２ｍ）／（ａ－ｆ１ｍ） （数５）
ｆ１ｍ：（数４）により算出された融解曲線の第１標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．１ｍ：融解曲線の第１標的用プローブ解離温度における蛍光強度値
ｆ２ｍ：（数４’）により算出された融解曲線の第１標的及び第２標的核酸検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ結合温度における蛍光強度値
ｆｄｅｎ．２ｍ：融解曲線の第２標的用プローブ解離温度における蛍光強度値であり、ｆｄｅｎ．１ｍと同じ温度の蛍光強度値（同じ値）
ａ：Ｆｒｍが０以下にならないような定数である。
Ｆｒｍ：第２標的核酸検出のための演算値
【0027】
好ましくは、第１標識物、第２標識物は、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ、Ｅｘｃｉｔｏｎ ｐｒｏｂｅ、ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｂｅ、からなる群から選択される。
【0028】
蛍光シグナルは、アニールすると消光するもの、アニールすると発光するもののいずれであってもよい。
【0029】
第１標的核酸及び第２標的核酸は、好ましくは、マイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の野生型配列と薬剤耐性変異配列、或いは、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌シトシンメチルトランスフェラーゼＣＭＴ遺伝子である。
【0030】
本発明は、インターカレーター法で実施しても差し支えない。
【発明の効果】
【0031】
以上述べたように、本発明によれば、１種類の標識物を用いて複数の標的核酸を、１種類の混合液で検出できる。複数の標的核酸を識別するプローブ設計に関する制限が大幅に少なく、測定時間や解析時間を短縮でき、実用的効果が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【0032】
本発明では、図２１に示すように、４つの温度、即ち、変性温度Ｔ０（９５℃）、アニーリング温度Ｔ１（７０℃）、伸長温度Ｔ２（７２℃）及び第２標的核酸検出温度Ｔ３（５５℃）を使用する。これらの温度は、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される。勿論、これらの温度数値は、例示に過ぎず、後述するように、種々変更することができる。
【0033】
複数の標的核酸とは、第１標的核酸及び第２標的核酸であるが、必要とあれば、第３標的検出温度Ｔ４（Ｔ３＞Ｔ４）等の設定温度を増やすことにより、第３標的核酸その他の標的核酸を追加することもできる。
【0034】
図２２を参照しながら、本発明の内容について説明する。まず、本発明では、第１標的核酸１０と、第２標的核酸２０とを検出対象とする。以下説明の便宜のため、容器１内の溶液２（詳細は後述する。）には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の両方が含まれている場合（つまり、陽性と陽性である場合）のみを説明する。
【0035】
勿論、片方又は両方が陰性である場合には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の少なくとも一方又は両方が溶液２に含まれていないことになり、以下の説明において、含まれていない標的核酸に関する、蛍光シグナル及び増幅が行われないことになる。
【0036】
図２３（ａ）に示すように、溶液２の温度を上昇させ変性温度Ｔ０になると、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０は、いずれも２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖（第１標的核酸１０は、第１の１本鎖１１と第２の１本鎖１２に、第２標的核酸２０は、第１の１本鎖２１と第２の１本鎖２２に）解離する。
【0037】
図２３（ｂ）に示すように、変性温度Ｔ０から温度を下げてアニーリング温度Ｔ１になると、第１標的核酸１０について、第１標的用Ｆプライマー１３が第１の１本鎖１１の相補的な配列に特異的に結合し、第１標的用Ｒプライマー１４が第２の１本鎖１２の相補的な配列に特異的に結合する。同様に、第２標的核酸２０について、第２標的用Ｆプライマー２３が第１の１本鎖２１の相補的な配列に特異的に結合し、第２標的用Ｒプライマー２４が第２の１本鎖２２の相補的な配列に特異的に結合する。
【0038】
また、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、図２３（ｂ）に示すアニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６は蛍光サインを発生する。しかしながら、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５は、アニーリング温度Ｔ１では第２標的検出温度Ｔ３よりも温度が高いため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１には結合せず、第２標識物２６は蛍光サインを発生しない。
【0039】
図２３（ｃ）に示すように、温度をアニーリング温度Ｔ１から伸長温度Ｔ２に上げると、溶液２に、ＰＣＲサイクルを繰り返すために十分な量の、ＤＮＡポリメラーゼ３０とデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１とが含まれているため、次のように増幅反応が進行する。
【0040】
即ち、第１標的核酸１０について、第１の１本鎖１１に結合する第１標的用Ｆプライマー１３から、また、第２の１本鎖１２に結合する第１標的用Ｒプライマー１４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
【0041】
また、第２標的核酸２０について、第１の１本鎖２１に結合する第２標的用Ｆプライマー２３から、また、第２の１本鎖２２に結合する第２標的用Ｒプライマー２４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
【0042】
【0043】
【0044】
次に、図２４を参照しながら、変性温度Ｔ０から温度を下げて第２標的検出温度Ｔ３となる場合について説明する。
【0045】
【0046】
即ち、図２４（ｂ）に示すように、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６の蛍光シグナルが変化する点では、図２３（ｂ）と同様であるが、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５も、第２標的検出温度Ｔ３となっているため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１に結合し、第２標識物２６の蛍光シグナルが変化する。なお、第１標識物１６と第２標識物２６は同一であるのが好ましい。
【0047】
第１標的用プローブ１５の結合温度Ｔ１では第２標的用プローブ２５の結合が起こらないため、第１標識物１６の蛍光シグナルの変化を捉えることにより、第１標的核酸１０の有無（陽性／陰性）を判定できる。
【0048】
本発明では、Ｔ１における第１標識物１６の蛍光シグナルの変化とＴ３における第２標識物２６による蛍光シグナルの変化との相対的な変化量を捉えることで第２標的核酸２０の有無（陽性／陰性）を判定する。
【0049】
しかも、以上説明したところから明らかなように、１種類の反応液が入った１つの反応容器を用いて一連でとぎれないステップ中に複数の標的核酸を検出できることが理解されよう。
【0050】
以下、さらに具体的に、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅの代表例としてＱＰｒｏｂｅ（登録商標）法を用いた複数核酸を検出する実施例を示す。実施するのに必要なプライマー配列及び各プローブの塩基配列、核酸試料の情報もあわせて示す。
【0051】
（実施例１）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌シトシンメチルトランスフェラーゼＣＭＴ遺伝子の検出＞
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌シトシンメチルトランスフェラーゼＣＭＴ遺伝子の検出＞
【0052】
ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア・トラコマチスとナイセリア・ゴノレアの同時検出を行う。実施例１では、クラミジア・トラコマチスの内在性プラスミドを標的配列としたｐＣＴ、ナイセリア・ゴノレアのシトシンメチルトランスフェラーゼを標的配列としたｐＮＧを、それぞれ核酸試料に用いてＰＣＲを実施し、前記２種類の標的配列に対応する２種類のＱＰｒｏｂｅで鑑別を行う。
【0053】
〈材料及び方法〉
実施例１におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１）に示すとおりである。
実施例１におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１）に示すとおりである。
【0054】
【表1】
【0055】
〔核酸試料〕
実施例１でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
実施例１でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
【0056】
（ＳＴＤ ＣＴ１）
性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミドの遺伝子断片を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミドの遺伝子断片を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
【0057】
（ＳＴＤ ＮＧ１）
淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の遺伝子断片を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の遺伝子断片を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
【0058】
（核酸試料の調製）
上記のプラスミドの長さは、ＳＴＤ ＣＴ１は１２２ｂｐ、ＳＴＤ ＮＧ１は１３７ｂｐである。各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ＳＴＤ ＣＴ１、ＳＴＤ ＮＧ１共に４．４×１０2ｃｏｐｉｅｓ／μｌ又は１．１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈する。
上記のプラスミドの長さは、ＳＴＤ ＣＴ１は１２２ｂｐ、ＳＴＤ ＮＧ１は１３７ｂｐである。各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ＳＴＤ ＣＴ１、ＳＴＤ ＮＧ１共に４．４×１０2ｃｏｐｉｅｓ／μｌ又は１．１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈する。
【0059】
（プローブ）
実施例１におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表２）に示すとおりである。
実施例１におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表２）に示すとおりである。
【0060】
【表2】
【0061】
ＣＴ ＱＰ１は（表１）の配列番号１と配列番号２のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列からＪ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択する。ＮＧ ＱＰ５は（表１）の配列番号３と配列番号４のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、Ｊ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択する。
ＳＴＤ ＣＴ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＣＴ ＱＰ１とＳＴＤ ＮＧ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＮＧ ＱＰ５の蛍光色素にはそれぞれＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬを使用し、それぞれ３‘末端のＣを標識する。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製する。
ＳＴＤ ＣＴ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＣＴ ＱＰ１とＳＴＤ ＮＧ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＮＧ ＱＰ５の蛍光色素にはそれぞれＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬを使用し、それぞれ３‘末端のＣを標識する。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製する。
【0062】
（ＰＣＲ・蛍光測定条件）
実施例１では、１種類の反応液が入った１つの反応容器中で増幅する２つの標的核酸について、第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＣＴ ＱＰ１）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出する。
実施例１では、１種類の反応液が入った１つの反応容器中で増幅する２つの標的核酸について、第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＣＴ ＱＰ１）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出する。
【0063】
次に、第２標的であるＳＴＤ ＮＧ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＮＧ ＱＰ５）のＴｍ値をＣＴ ＱＰ１のＴｍ値よりも低い温度に設定する。従って、ＣＴ ＱＰ１がＳＴＤ ＣＴ１に結合すると期待される温度と、それよりも低い温度とでそれぞれ蛍光強度を測定し、判定に使用する。
【0064】
ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表３）と（表４）に示し、また、混合液の温度変化をグラフ化したものを図１に示す。
【0065】
【表3】
【0066】
【表4】
【0067】
ＰＣＲ及び蛍光測定には、株式会社ミズホメディーが作製したＰＣＲ装置スマートジーン（登録商標）を使用する。
【0068】
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長は中心波長５２５ｎｍに設定する。増幅反応中に第１標的核酸を検出するためのステップ（９５℃と６７℃）と第１標的核酸及び第２標的核酸を検出するためのステップ（９５℃と６０℃）で蛍光値を測定する。
【0069】
増幅反応中の蛍光測定条件を図２に示す。
【0070】
（データの処理方法）
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、特許文献６に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行う。
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、特許文献６に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行う。
【0071】
増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数１）を用いて、ｎサイクル目の第１標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ１［ｎ］を算出する。算出のための値として第１標的検出ステップ６７℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．１［ｎ］と第１標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．１［ｎ］とを使用する。同様に、増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数１’）を用いて、ｎサイクル目の第１標的及び第２標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ２［ｎ］を算出する。算出のための値として第１標的及び第２標的検出ステップ６０℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．２［ｎ］と第１標的及び第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．２［ｎ］とを使用する。
【0072】
次に、増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数３）のＸを１０として、１０サイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値ｆ１［１０］を１とした時のｎサイクル目の相対値Ｆ１［ｎ］を算出する。又、（数３’）のＸを１０として、１０サイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値ｆ２［１０］を１とした時のｎサイクル目の相対値Ｆ２［ｎ］を算出する。
【0073】
増幅反応の最終サイクルのＦ１［ｎ］の値であるＦ１［２３］を、第１標的核酸であるクラミジアの判定に用いる。
【0074】
更に、（数２）の定数ａを１．１として演算を行い、Ｆｒ［ｎ］を算出する。また、（数２'）の定数ａを１．０５として演算を行い、Ｆｒ'［ｎ］を算出する。
【0075】
増幅反応の最終サイクルのＦｒ［ｎ］、Ｆｒ’［ｎ］の値であるＦｒ［２３］、Ｆｒ’［２３］を、第２標的核酸である淋菌の判定に用いる。判定のフローチャートは、図３に示すとおりである。
【0076】
ＣＴ ＱＰ１の配列はＴｍ値を７３．４℃に、ＮＧ ＱＰ５の配列はＴｍ値を５７．６℃に設定する。そのため、増幅反応中の第１標的検出ステップ（９５℃と６７℃）ではＣＴ ＱＰ１だけが第１標的核酸にアニールすると推測される。又、第１標的及び第２標的検出ステップ（９５℃と６０℃）では前述のアニーリングだけでなく第２標的核酸へのＮＧ ＱＰ５のアニーリングも起こると推測される。従って、第１標的及び第２標的検出ステップの測定値はＣＴ ＱＰ１とＮＧ ＱＰ５の消光を同時に検出すると推測される。
【0077】
陰性対照（ＤＮＡの代わりにＴＥ緩衝液を添加した試料）の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する２３サイクル目まで消光が見られない。増幅曲線を図４に示す。
【0078】
４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１は、Ｆ１［ｎ］及びＦ２［ｎ］のどちらも増幅曲線の２０サイクル付近からＣＴ ＱＰ１のアニーリングに伴う消光が観察される。増幅曲線を図５に示す。
【0079】
１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１は、Ｆ１［ｎ］とＦ２［ｎ］のどちらも増幅曲線の１５サイクル付近からＣＴ ＱＰ１のアニーリングに伴う消光が観察される。増幅曲線を図６に示す。
【0080】
４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１は、増幅曲線の２２サイクル付近からＮＧ ＱＰ５のアニーリングに伴うＦ２［ｎ］の消光が観察されたが、ＰＣＲが終了する２３サイクル目までＦ１［ｎ］の消光は見られない。増幅曲線を図７に示す。
【0081】
１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１は、増幅曲線の１６サイクル付近からＮＧ ＱＰ５のアニーリングに伴うＦ２［ｎ］の消光が観察されたが、ＰＣＲが終了する２３サイクル目までＦ１［ｎ］の消光は見られない。増幅曲線を図８に示す。
【0082】
（第１標的核酸の判定）
第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１の有無の判定は、Ｆ１［２３］の値を用いる。判定するための閾値として、陰性対照のＦ１［２３］の平均値－標準偏差の３倍の値０．９８７３（Ｎ＝５）を閾値１として使用する。Ｆ１［２３］＜閾値１の場合、第１標的核酸陽性（クラミジア陽性）とする。
第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１の有無の判定は、Ｆ１［２３］の値を用いる。判定するための閾値として、陰性対照のＦ１［２３］の平均値－標準偏差の３倍の値０．９８７３（Ｎ＝５）を閾値１として使用する。Ｆ１［２３］＜閾値１の場合、第１標的核酸陽性（クラミジア陽性）とする。
【0083】
陰性対照のＦ１［２３］の値１．００２８は閾値１より大きい値となり、第１標的核酸陰性（クラミジア陰性）となる。４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１のＦ１［２３］の値０．９２５５、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１のＦ１［２３］の値０．８１０６は、どちらも閾値１より小さい値となりクラミジア陽性と判定される。又、４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１のＦ１［２３］の値１．００７１と、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１のＦ１［２３］の値０．９９９９とは閾値１より大きい値となりクラミジア陰性と判定される。
【0084】
（第２標的核酸の判定）
次に、本発明を利用した第２標的核酸の判定を、２３サイクル目のＦｒ［ｎ］、Ｆｒ’［ｎ］であるＦｒ［２３］、Ｆｒ’［２３］を用いて行う。
次に、本発明を利用した第２標的核酸の判定を、２３サイクル目のＦｒ［ｎ］、Ｆｒ’［ｎ］であるＦｒ［２３］、Ｆｒ’［２３］を用いて行う。
【0085】
第２標的核酸を判定するための閾値として、陰性試料（Ｎ＝２）、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１（Ｎ＝２）及び４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１（Ｎ＝４）の計８例の演算値Ｆｒ［２３］の平均値＋標準偏差の３倍の値１．２３１２を閾値２とし、演算値Ｆｒ'［２３］の平均値＋標準偏差の３倍の値１．１２７８を閾値２'として使用する。Ｆｒ［２３］＞閾値２又はＦｒ'［２３］＞閾値２'の場合、第２標的核酸陽性（淋菌陽性）とする。
【0086】
４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１のＦｒ［２３］は０．８６３３、Ｆｒ'［２３］は０．９４３３となり、ＳＴＤ ＣＴ１の１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１のＦｒ［２３］は１．１０２０、Ｆｒ'［２３］は１．０６６４となり、それぞれの閾値よりも小さい値のため淋菌陰性と判定される。
【0087】
４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１のＦｒ［２３］は１．３４７２、Ｆｒ'［２３］は１．２８０３となり、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１のＦｒ［２３］は２．２５７８、Ｆｒ'［２３］は３．０２２１となり、それぞれの閾値より大きい値のため淋菌陽性と判定される。Ｆｒ［２３］の値は、第２標的核酸の濃度が高いほど閾値から離れた大きな値になることが示唆される。
【0088】
（比較例１）
実施例1で得られたデータを用いて、特許文献５で開示した第２標的核酸の判定法を利用し、次の数式を用いて比較例による第２標的核酸の判定を行う。
Ｆｓ［２３］＝Ｆ２［２３］－Ｆ１［２３］ （数６）
実施例1で得られたデータを用いて、特許文献５で開示した第２標的核酸の判定法を利用し、次の数式を用いて比較例による第２標的核酸の判定を行う。
Ｆｓ［２３］＝Ｆ２［２３］－Ｆ１［２３］ （数６）
【0089】
演算値Ｆｓ［２３］を第２標的核酸であるＳＴＤ ＮＧ１の判定に用いる。第２標的核酸を判定するための閾値として、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１（Ｎ＝６）の演算値Ｆｓ［２３］の平均値－標準偏差の３倍の値－０．０２９５を閾値３として使用する。Ｆｓ［２３］＜閾値３の場合、第２標的核酸陽性（淋菌陽性）とする。
【0090】
陰性対照の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０００９は閾値３より大きい値となり第２標的核酸陰性（淋菌陰性）となる。４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＣＴ１の演算値Ｆｓ［２３］の値０．００７１、４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０１２０、４．４×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０１２０はいずれも閾値３より大きい値となり淋菌陰性と判定される。１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＮＧ１の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．１０１４は閾値３より小さい値となり淋菌陽性と判定される。
【0091】
２３サイクル目の相対蛍光値Ｆ１［２３］及びクラミジア判定の結果と、比較例１及び実施例１における淋菌の判定結果とを（表５）に示す。
【0092】
以上より、従来例を用いた第２標的の判定法は、低濃度の淋菌を識別できないことが示される。これは、高濃度のＳＴＤ ＣＴ１で生じるＦ１［２３］の変化量と、低濃度のＳＴＤ ＮＧ１で生じるＦ１［２３］の変化量を識別できないことが原因である。一方、本発明を用いることで、第１標的核酸の濃度に影響されることなく、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅して鑑別できることが示される。
【0093】
【表5】
【0094】
（実施例２）
＜ＱＰｒｏｂｅ法における複数標的の同時検出＞
＜ＱＰｒｏｂｅ法における複数標的の同時検出＞
【0095】
クラミジア・トラコマチスとナイセリア・ゴノレアとが混合感染した場合、症状の強い一方の感染だけが診断され、他方が見落とされる可能性がある。クラミジア・トラコマチスとナイセリア・ゴノレアとでは、有効な薬剤が異なるため、遺伝子検査を用いた重複感染の鑑別は臨床的有用性が高いと考えられる。しかし、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時に増幅・検出する場合、各標識プローブの蛍光変化が互いに干渉する可能性があるため、混合感染の鑑別は比較的、難易度が高いと言える。実施例２は、実施例１の材料と方法を使用し、クラミジア・トラコマチス陽性かつナイセリア・ゴノレア陽性の試料を測定し、鑑別を行う。
【0096】
試料として、ＳＴＤ ＣＴ１とＳＴＤ ＮＧ１とがどちらも低濃度である試料１、ＳＴＤ ＣＴ１が高濃度でＳＴＤ ＮＧ１が低濃度である試料２、ＳＴＤ ＣＴ１が低濃度でＳＴＤ ＮＧ１が高濃度の試料３を用いる。
【0097】
試料１は、Ｆ１［ｎ］とＦ２［ｎ］のどちらの増幅曲線も２１サイクル付近から消光が観察される。増幅曲線を図９に示す。
【0098】
試料２は、Ｆ１［ｎ］とＦ２［ｎ］のどちらの増幅曲線も１５サイクル付近から消光が観察される。増幅曲線を図１０に示す。
【0099】
試料３は、Ｆ１［ｎ］の増幅曲線は２０サイクル付近から消光が観察され、Ｆ２［ｎ］の増幅曲線は１６サイクル付近から消光が観察される。増幅曲線を図１１に示す。
【0100】
（第１標的核酸の判定）
第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１の有無の判定は、Ｆ１［２３］の値を用いる。判定するための閾値として、実施例１の閾値１（０．９８７３）を使用する。試料１～試料３のＦ２３［１］の値はそれぞれ０．９４１４、０．８１７４、０．９３２８となり、閾値１より小さい値のため第１標的核酸陽性（クラミジア陽性）と判定される。
第１標的核酸であるＳＴＤ ＣＴ１の有無の判定は、Ｆ１［２３］の値を用いる。判定するための閾値として、実施例１の閾値１（０．９８７３）を使用する。試料１～試料３のＦ２３［１］の値はそれぞれ０．９４１４、０．８１７４、０．９３２８となり、閾値１より小さい値のため第１標的核酸陽性（クラミジア陽性）と判定される。
【0101】
（第２標的核酸の判定）
次に、実施例１と同様の手順で、本発明による判定を行う。
次に、実施例１と同様の手順で、本発明による判定を行う。
【0102】
試料１～３のＦｒ’［２３］はそれぞれ１．１３７８、１．１３６４、１．８５８７となり、実施例１の閾値２’（１．１２７８）より大きい値のため淋菌陽性と判定される。
（比較例２）
比較例１と同様の手順で、次の通り比較例による第２標的核酸の判定を行う。
（比較例２）
比較例１と同様の手順で、次の通り比較例による第２標的核酸の判定を行う。
【0103】
試料１のＦｓ［２３］の値は－０．０１５０となり、実施例１の閾値３（－０．０２９５）より大きい値のため淋菌陰性と判定される。試料２のＦｓ［２３］の値は－０．０３１７、試料３のＦｓ［２３］の値は－０．１００６となり、どちらも閾値３より小さい値となり淋菌陽性と判定される。
【0104】
２３サイクル目の相対蛍光値Ｆ１［２３］及びクラミジア判定の結果と、比較例２及び実施例２における淋菌の判定結果とを（表６）に示す。
【0105】
以上の通り、比較例を用いた第２標的核酸の判定方法では低濃度の淋菌を識別できないが、本発明を用いると、混合感染を想定した試料においても、第１標的核酸の濃度に影響されることなく、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅して鑑別できることが示される。
【0106】
【表6】
【0107】
（実施例３）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一塩基変異の検出 １＞
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一塩基変異の検出 １＞
【0108】
ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し、一塩基変異の鑑別を行う。
【0109】
〈材料及び方法〉
〔プライマー〕
実施例３におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表７）に示すとおりである。
〔プライマー〕
実施例３におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表７）に示すとおりである。
【0110】
【表7】
【0111】
〔核酸試料〕
実施例３でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
実施例３でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
【0112】
マイコプラズマ・ニューモニエの抗菌薬であるマクロライド系薬剤に耐性を持つ株は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に変異を持つことが知られている。２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に変異がない標的配列と２０６３位のＡがＧに変異した標的配列とを核酸試料に用い、それぞれＰＣＲを実施する。実施例３でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
【0113】
（ＳＴＤ ＭＣＲ１）
マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来のリボソームＲＮＡである２３Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子断片（配列番号７と８のプライマー対で増幅される配列）を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡであり、実施例３の第１標的核酸とする。
マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来のリボソームＲＮＡである２３Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子断片（配列番号７と８のプライマー対で増幅される配列）を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡであり、実施例３の第１標的核酸とする。
【0114】
前記遺伝子断片は２３Ｓ ｒＲＮＡの２０６３位及び２０６４位を含む配列であり、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＰ０１０５４６（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＦＨ株由来）の配列を使用する。ＦＨ株はマクロライド感受性株であり、２０６３位の塩基がＡの配列を持つ。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
【0115】
（ＳＴＤ ＭＣＲ２）
前記遺伝子断片の配列としてＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＰ０１４２６７（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｃ２６７株由来）の配列を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡであり、実施例３の第２標的核酸とする。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
前記遺伝子断片の配列としてＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＰ０１４２６７（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｃ２６７株由来）の配列を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡであり、実施例３の第２標的核酸とする。プラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製する。
【0116】
Ｃ２６７株はマクロライド耐性株であり、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の２０６３位のＡがＧに変異した配列を持つ。
【0117】
（核酸試料の調製）
上記のプラスミドの長さは、ＳＴＤ ＭＣＲ１は２８６８ｂｐ、ＳＴＤ ＭＣＲ２は２８６８ｂｐである。
上記のプラスミドの長さは、ＳＴＤ ＭＣＲ１は２８６８ｂｐ、ＳＴＤ ＭＣＲ２は２８６８ｂｐである。
【0118】
各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２はそれぞれ１．１×１０2ｃｏｐｉｅｓ／μｌ又は１．１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈する。
【0119】
（プローブ）
ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２の増幅は、１種類のＱＰｒｏｂｅで識別する。実施例３におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表８）に示すとおりである。
ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２の増幅は、１種類のＱＰｒｏｂｅで識別する。実施例３におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表８）に示すとおりである。
【0120】
【表8】
【0121】
（表８）のプライマー対で増幅し得るＳＴＤ ＭＣＲ１のＰＣＲ産物の塩基配列から、配列番号９はＪ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択する。
【0122】
ＳＴＤ ＭＣＲ１に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＭＣＲ ＱＰ４の蛍光色素にはＢＯＤＩＰＹ ＦＬを使用し、３‘末端のＣを標識する。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製する。
【0123】
ＭＣＲ ＱＰ４は、ＳＴＤ ＭＣＲ１に１００％相同な配列であるが、ＭＣＲ ＱＰ４のＴｍ値より低い温度域では、ＭＣＲ ＱＰ４はＳＴＤ ＭＣＲ１だけでなく、ＳＴＤ ＭＣＲ２にも結合すると期待される。
【0124】
（ＰＣＲ・蛍光測定条件）
実施例３では、第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に特異的に結合するＱＰｒｏｂｅ（ＭＣＲ ＱＰ４）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定する。ＭＣＲ ＱＰ４が第２標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ２に結合する温度は第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に結合する温度よりも低い温度である。そこで、第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に結合すると期待される温度と、それよりも低い温度とでそれぞれ蛍光強度を測定し、判定に使用する。
実施例３では、第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に特異的に結合するＱＰｒｏｂｅ（ＭＣＲ ＱＰ４）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定する。ＭＣＲ ＱＰ４が第２標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ２に結合する温度は第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に結合する温度よりも低い温度である。そこで、第１標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ１に結合すると期待される温度と、それよりも低い温度とでそれぞれ蛍光強度を測定し、判定に使用する。
【0125】
ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表９）と（表１０）に示し、また、混合液の温度変化をグラフ化したものを図１２に示す。
【0126】
ＰＣＲ及び蛍光測定には株式会社ミズホメディーが作製したＰＣＲ装置スマートジーンを使用する。蛍光測定時の励起波長と蛍光波長は中心波長５２５ｎｍに設定する。増幅反応中に第１標的核酸及び第２標的核酸を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）と第１標的核酸を検出するためのステップ（９５℃と６６℃）において蛍光値を測定する。
【0127】
【表9】
【0128】
【表10】
【0129】
（データの処理方法）
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、実施例１と同様の手順で、得られた生データに対して補正演算処理を行う。
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、実施例１と同様の手順で、得られた生データに対して補正演算処理を行う。
【0130】
増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数１）を用いて、ｎサイクル目の第１標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ１［ｎ］を算出する。算出のための値として第１標的検出ステップ６６℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．１［ｎ］と第１標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．１［ｎ］とを使用する。同様に、増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数１’）を用いて、ｎサイクル目の第１標的及び第２標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ２［ｎ］を算出する。算出のための値として第１標的及び第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．２［ｎ］と第１標的及び第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．２［ｎ］とを使用する。
【0131】
次に、増幅反応中の全てのサイクル毎に、（数３）のＸを１０として、１０サイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値ｆ１［１０］を１とした時のｎサイクル目の相対値Ｆ１［ｎ］を算出する。又、（数３’）のＸを１０として、１０サイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値ｆ２［１０］を１とした時のｎサイクル目の相対値Ｆ２［ｎ］を算出する。
【0132】
Ｆ２［ｎ］の値は第１標的核酸の増幅による蛍光シグナルの変化だけでなく、第２標的核酸の増幅による蛍光シグナルの変化をも反映した値である。従って、実施例３では、増幅反応の最終サイクルのＦ２［ｎ］の値であるＦ２［２３］を、第１標的核酸及び第２標的核酸の有無の判定（マイコプラズマ感染の判定）に用いる。
【0133】
更に、（数２’）の定数ａを１．０２として演算を行い、Ｆｒ’［ｎ］を算出する。
【0134】
増幅反応の最終サイクルのＦｒ’［ｎ］であるＦｒ’［２３］の値を、第２標的核酸の有無の判定に用いる。第２標的核酸が陽性の場合、マイコプラズマ陽性かつ標的核酸が薬剤耐性変異を持つことを示す。
【0135】
ＭＣＲ ＱＰ４の配列はＴｍ値を７１℃に設定する。ＰＣＲ中のプローブＭＣＲ ＱＰ４は第１検出ステップ（９５℃と６６℃）ではＳＴＤ ＭＣＲ１だけにアニールし、第２検出ステップ（９５℃と５５℃）ではＳＴＤ ＭＣＲ１とＳＴＤ ＭＣＲ２の両方にアニールすると推測される。増幅反応中のＦ１［ｎ］とＦ２［ｎ］をプロットして増幅曲線を作成する。
【0136】
陰性対照（ＤＮＡの代わりにＴＥ緩衝液を添加した試料）の増幅曲線には、ＰＣＲが終了する２３サイクル目まで消光が見られない。増幅曲線を図１３に示す。
【0137】
１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１は、Ｆ１［ｎ］とＦ２［ｎ］のどちらも増幅曲線の２０サイクル付近からＭＣＲ ＱＰ４のアニーリングに伴う消光が観察される。増幅曲線を図１４に示す。
【0138】
１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１は、Ｆ１［ｎ］とＦ２［ｎ］のどちらも増幅曲線の１２サイクル付近からＭＣＲ ＱＰ４のアニーリングに伴う消光が観察される。増幅曲線を図１５に示す。
【0139】
１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２は、増幅曲線の２２サイクル付近からＭＣＲ ＱＰ４のアニーリングに伴うＦ２［ｎ］の消光が観察されたが、ＰＣＲが終了する２３サイクル目までＦ１［ｎ］の閾値（後述）を超えるような消光は見られない。増幅曲線を図１６に示す。
【0140】
１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２は、増幅曲線の１２サイクル付近からＭＣＲ ＱＰ４のアニーリングに伴うＦ２［ｎ］の消光が観察される。又、増幅曲線の１５サイクル付近からＦ１［ｎ］にもＭＣＲ ＱＰ４のアニーリングに伴う消光が観察される。これは、ＳＴＤ ＭＣＲ２が高濃度の場合、ＭＣＲ ＱＰ４とＳＴＤ ＭＣＲ２との結合による消光がＦ１［ｎ］に干渉してしまうことが原因と推測される。増幅曲線を図１７に示す。
【0141】
（マイコプラズマの判定）
増幅反応の最終サイクルのＦ２［ｎ］の値であるＦ２［２３］を、マイコプラズ感染の判定に用いる。判定の閾値として、陰性対照のＦ２［２３］の平均値－３ＳＤの値０．９９８５（Ｎ＝２４）を閾値４として使用する。Ｆ２［２３］の値と閾値４を比較して、Ｆ２［２３］＜閾値４の場合、マイコプラズマ陽性とする。
増幅反応の最終サイクルのＦ２［ｎ］の値であるＦ２［２３］を、マイコプラズ感染の判定に用いる。判定の閾値として、陰性対照のＦ２［２３］の平均値－３ＳＤの値０．９９８５（Ｎ＝２４）を閾値４として使用する。Ｆ２［２３］の値と閾値４を比較して、Ｆ２［２３］＜閾値４の場合、マイコプラズマ陽性とする。
【0142】
陰性対照のＦ２［２３］の値１．００７０は閾値４を超えていないためマイコプラズマ陰性と判定される。ＳＴＤ ＭＣＲ１又はＳＴＤ ＭＣＲ２を添加した試料のＦ２［２３］の値は全て閾値４より小さい値となり、マイコプラズマ陽性と判定される。
【0143】
（第２標的核酸の判定）
次の通り本発明による判定を行う。
次の通り本発明による判定を行う。
【0144】
実施例３では、Ｆｒ’［２３］＝（１．０２－Ｆ２［２３］）／（１．０２－Ｆ１［２３］）］の演算値を第２標的核酸であるＳＴＤ ＭＣＲ２の判定に用いる。判定のための閾値として、１．１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｒ’［２３］の平均値＋３ＳＤの値２．８９６６（Ｎ＝１０）を閾値５として使用する。Ｆｒ’［２３］＞閾値５の場合、第２標的陽性とする。
【0145】
陰性対照の演算値Ｆｒ’［２３］の値０．９３９８、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｒ’［２３］の値１．６２０９、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｒ’［２３］の値１．６１５３は、いずれも閾値５より小さい値であり、第２標的陰性と判定される。１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２の演算値Ｆｒ’［２３］の値３．８２１０、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２の演算値Ｆｒ’［２３］の値６．１２３６は、いずれも閾値５より大きい値であり、第２標的陽性と判定される。
【0146】
（比較例３）
比較例１と同様の手順で、次の通り比較例による第２標的核酸の判定を行う。
比較例１と同様の手順で、次の通り比較例による第２標的核酸の判定を行う。
【0147】
判定のための閾値として、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｓ［２３］の平均値－３ＳＤの値－０．１７７５（Ｎ＝１０）を閾値６として使用する。Ｆｓ［２３］＜閾値６の場合、第２標的陽性とする。
【0148】
陰性対照の演算値Ｆｓ［２３］の値０．０００８、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０４４８、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０９９０、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．０５６８、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２の演算値Ｆｓ［２３］の値－０．１７３２は、いずれも閾値６より大きい値であり、第２標的陰性と判定される。
【0149】
２３サイクル目の相対蛍光値Ｆ２［２３］及びマイコプラズマ判定の結果と、比較例３及び実施例３におけるマイコプラズマの変異判定の結果とを（表１１）に示す。
【0150】
以上の通り、比較例による解析ではマイコプラズマ陽性であっても、変異の有無を識別できないことが示される。これは、濃度によってＳＴＤ ＭＣＲ１で生じるＦｓ［２３］の変化量と、ＳＴＤ ＭＣＲ２で生じるＦｓ［２３］の変化量を識別できないことが原因である。一方、本発明を用いることで、第１標的核酸の検出温度と第２標的核酸の検出温度とが近接し、各温度の蛍光シグナルの変化が互いに干渉してしまう場合においても、単一の標識を用いて、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅して鑑別できることが示される。
【0151】
【表11】
【0152】
（実施例４）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一塩基変異の検出 ２＞
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一塩基変異の検出 ２＞
【0153】
実施例３において、本発明を用いると第１標的核酸の濃度に影響されることなく、第２標的核酸を識別できることが示唆される。実施例４では、実施例３と同じ条件を使用して、第１標的核酸及び第２標的核酸について、それぞれ３濃度の試料を測定し、比較例による第２標的核酸判定のための演算値Ｆｓ［２３］と本発明による第２標的核酸判定のための演算値Ｆｒ’［２３］とを算出し、演算値の挙動を比較する。
【0154】
〔核酸試料〕
実施例４でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
実施例４でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
【0155】
（核酸試料の調製）
ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２をそれぞれ１０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、４０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ又は１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈し、各試料１０例を測定に用いる。
ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２をそれぞれ１０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、４０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ又は１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈し、各試料１０例を測定に用いる。
【0156】
（マイコプラズマの判定）
実施例３と同じ方法を用いて、増幅反応の最終サイクルのＦ２［ｎ］の値であるＦ２［２３］の値を閾値４と比較してマイコプラズマの有無の判定を行う。データは示さないが、全試料のＦ２［２３］が閾値４より小さい値となり、マイコプラズマ陽性と判定される。
実施例３と同じ方法を用いて、増幅反応の最終サイクルのＦ２［ｎ］の値であるＦ２［２３］の値を閾値４と比較してマイコプラズマの有無の判定を行う。データは示さないが、全試料のＦ２［２３］が閾値４より小さい値となり、マイコプラズマ陽性と判定される。
【0157】
（第２標的核酸の判定）
次に、実施例３と同様の手順で、本発明による判定を行う。Ｆｒ’［２３］の結果を図１８に示す。Ｆｒ’［２３］は、第１標的核酸の濃度に影響されることなく一定の値となり、第２標的核酸の濃度が高いほど大きくなる。
次に、実施例３と同様の手順で、本発明による判定を行う。Ｆｒ’［２３］の結果を図１８に示す。Ｆｒ’［２３］は、第１標的核酸の濃度に影響されることなく一定の値となり、第２標的核酸の濃度が高いほど大きくなる。
【0158】
これは、第１標的核酸を含む試料を測定した場合、Ｆ１［ｎ］及びＦ２［ｎ］の値は、どちらも第１標的核酸の濃度依存的に一定の割合で増減するため、Ｆｒ’［ｎ］は第１標的核酸の濃度に関わらず常に一定の値となり、第２標的核酸を含む試料を測定した場合、Ｆ２［ｎ］の値だけが、第２標的核酸の濃度依存的に変化するため、Ｆｒ’［ｎ］は第２標的核酸の濃度に依存して変化することを示す。
【0159】
（比較例４）
実施例１と同様の手順で、比較例による第２標的核酸の判定を行う。
実施例１と同様の手順で、比較例による第２標的核酸の判定を行う。
【0160】
Ｆｓ［２３］の結果を図１９に示す。ＳＴＤ ＭＣＲ１及びＳＴＤ ＭＣＲ２の演算値は、どちらも濃度が高いほど小さくなり、第１標的核酸のＦｓ［２３］と識別可能な第２標的核酸のＦｓ［２３］は、１×１０6ｃｏｐｉｅｓ／μｌ ＳＴＤ ＭＣＲ２だけである。
【0161】
以上より、本発明を用いると第１標的核酸の有無に影響されることなく第２標的核酸の判定を行うことが可能であることが示される。
【0162】
（実施例５）
＜Ｑｐｒｏｂｅ法における融解曲線分析法＞
＜Ｑｐｒｏｂｅ法における融解曲線分析法＞
【0163】
１種類の反応液が入った１つの反応容器で、単一の標識を用いて複数の遺伝子を同時に検出する方法として、融解曲線分析がある。しかし、ＰＣＲ産物や標識プローブの解離温度を十分に離すことができない場合は、複数の標的の融解温度（融解ピーク）が近接するため識別が困難である。ＰＣＲ中の蛍光シグナルの変化は融解曲線分析時の蛍光シグナルの変化と類似していると考えられるため、本発明は融解曲線分析にも応用できると期待される。
【0164】
（データの処理方法）
実施例３で示した測定は、ＰＣＲ終了後に融解曲線分析を行う。実施例５は、実施例３のＰＣＲ終了後に実施した融解曲線分析のデータを利用して、本発明の方法で融解曲線分析による第１標的核酸と第２標的核酸とを鑑別可能か検証する。
実施例３で示した測定は、ＰＣＲ終了後に融解曲線分析を行う。実施例５は、実施例３のＰＣＲ終了後に実施した融解曲線分析のデータを利用して、本発明の方法で融解曲線分析による第１標的核酸と第２標的核酸とを鑑別可能か検証する。
【0165】
５５℃から８０℃の範囲で融解曲線分析を行い、蛍光強度の生データを取り出し、（数４）を用いて、融解曲線の第１標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ１ｍを算出する。算出のための値として融解曲線の第１標的用プローブ結合温度６６℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．１ｍと第１標的用プローブ解離温度８０℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．１ｍとを使用する。同様に、（数４’）を用いて、融解曲線の第２標的検出ステップにおける蛍光強度値ｆ２ｍを算出する。算出のための値として融解曲線の第１標的用プローブ及び第２標的用プローブの結合温度６６℃の蛍光強度値ｆｈｙｂ．２ｍと第１標的用プローブ及び第２標的用プローブの解離温度８０℃の蛍光強度値ｆｄｅｎ．２ｍとを使用する。
【0166】
温度変化中の蛍光強度を８０℃の蛍光強度を１とした時の相対値（以下、蛍光相対値）として作図し、図２０に示す。
【0167】
ＳＴＤ ＭＣＲ１を添加した試料では６８℃付近から７３℃付近にかけて急激に蛍光相対値が高くなっており、この温度帯でＭＣＲ ＱＰ４がＳＴＤ ＭＣＲ１にアニールして蛍光強度が変化することが示される。又、ＳＴＤ ＭＣＲ２を添加した試料では６２℃付近から６９℃付近にかけて急激に蛍光相対値が高くなっており、この温度帯でＭＣＲ ＱＰ４がＳＴＤ ＭＣＲ２にアニールして蛍光強度が変化することが示される。
【0168】
（マイコプラズマの有無の判定）
５５℃の蛍光相対値であるｆ２ｍの値が８０℃の蛍光相対値１より小さい場合を、マイコプラズマ陽性と判定する。陰性対照のｆ２ｍは１．０５２４となりマイコプラズマ陰性となる。１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のｆ２ｍは０．８８５３、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のｆ２ｍは０．８４１７、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のｆ２ｍは０．９２５１、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のｆ２ｍは０．８４３７となり、いずれもマイコプラズマ陽性と判定される。
５５℃の蛍光相対値であるｆ２ｍの値が８０℃の蛍光相対値１より小さい場合を、マイコプラズマ陽性と判定する。陰性対照のｆ２ｍは１．０５２４となりマイコプラズマ陰性となる。１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のｆ２ｍは０．８８５３、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のｆ２ｍは０．８４１７、１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のｆ２ｍは０．９２５１、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のｆ２ｍは０．８４３７となり、いずれもマイコプラズマ陽性と判定される。
【0169】
（第２標的核酸の判定）
（数５）の定数ａを１．０５２４として演算を行い、Ｆｒｍを算出する。
（数５）の定数ａを１．０５２４として演算を行い、Ｆｒｍを算出する。
【0170】
１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のＦｒｍは２．５５６７となり、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ１のＦｒｍは１．９９４３となる。実施例１から４までと同様に、本実施例においても、Ｆｒｍの値は第１標的核酸の濃度にあまり影響されずほぼ一定の値になることが示唆される。そこで、第２標的核酸を識別するための閾値を２．５５６７（閾値７）とし、Ｆｒｍが閾値７より大きい値の場合を第２標的核酸陽性と判定する。
【0171】
１．１×１０2 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のＦｒｍは５．５７１３であり、１．１×１０6 ｃｏｐｉｅｓ／ｔｕｂｅのＳＴＤ ＭＣＲ２のＦｒｍは６．７２７４である。これらの値は閾値７より大きい値のためＳＴＤ ＭＣＲ２陽性と判定される。
【0172】
各試料のｆ２ｍの値及びマイコプラズマ判定の結果と、ｆｒｍの値及び変異判定の結果とを表１２に示す。
【0173】
以上の結果より、本発明を使用すると、融解の温度ピークを算出するための微分式や近似式などの複雑な演算を実施することなしに、融解曲線分析の蛍光強度のデータから複数の標的を識別できることが示される。
【0174】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【0175】
【図1】本発明の実施例１における混合液の温度変化を示すグラフ
【図2】本発明の実施例１における蛍光測定のタイミング説明図
【図3】本発明の実施例１における判定方法を示すフローチャート
【図4】本発明の実施例１における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図5】本発明の実施例１における低濃度の第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図6】本発明の実施例１における高濃度の第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図7】本発明の実施例１における低濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図8】本発明の実施例１における高濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図9】本発明の実施例２における低濃度の第１標識物、低濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図10】本発明の実施例２における高濃度の第１標識物、低濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図11】本発明の実施例２における低濃度の第１標識物、高濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図12】本発明の実施例３における混合液の温度変化を示すグラフ
【図13】本発明の実施例３における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図14】本発明の実施例３における低濃度の第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図15】本発明の実施例３における高濃度の第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図16】本発明の実施例３における低濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図17】本発明の実施例３における高濃度の第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図18】本発明の実施例４における第１標識物、第２標的核酸のＦｒ演算値の変化を示すグラフ
【図19】比較例４における第１標識物、第２標的核酸のＦｓ演算値の変化を示すグラフ
【図20】本発明の実施例５における融解曲線の蛍光強度変化を示すグラフ
【図21】本発明における温度変化の拡大図
【図22】本発明の実施例１における混合液成分を示す説明図
【図23】（ａ）本発明の実施例１における変性ステップの説明図 （ｂ）本発明の実施例１におけるアニーリングステップの説明図 （ｃ）本発明の実施例１における伸長ステップの説明図 （ｄ）本発明の実施例１における伸長完了ステップの説明図
【図24】（ａ）本発明の実施例１における変性ステップの説明図 （ｂ）本発明の実施例１におけるアニーリングステップの説明図
【符号の説明】
【0176】
１ 容器
２ 溶液
１０ 第１標的核酸
１３ 第１標的用Ｆプライマー
１４ 第１標的用Ｒプライマー
１５ 第１標的用プローブ
１６ 第１標識物
２０ 第２標的核酸
２３ 第２標的用Ｆプライマー
２４ 第２標的用Ｒプライマー
２５ 第２標的用プローブ
２６ 第２標識物
３０ ＤＮＡポリメラーゼ
３１ デオキシリボヌクレオチド３リン酸
Ｔ０ 変性温度
Ｔ１ アニーリング温度
Ｔ２ 伸長温度
Ｔ３ 第２標的検出温度
２ 溶液
１０ 第１標的核酸
１３ 第１標的用Ｆプライマー
１４ 第１標的用Ｒプライマー
１５ 第１標的用プローブ
１６ 第１標識物
２０ 第２標的核酸
２３ 第２標的用Ｆプライマー
２４ 第２標的用Ｒプライマー
２５ 第２標的用プローブ
２６ 第２標識物
３０ ＤＮＡポリメラーゼ
３１ デオキシリボヌクレオチド３リン酸
Ｔ０ 変性温度
Ｔ１ アニーリング温度
Ｔ２ 伸長温度
Ｔ３ 第２標的検出温度
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】