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特許7221510アミロイドβタンパク質におけるプロパノイル化修飾部位特異的測定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-06
(45)【発行日】2023-02-14
(54)【発明の名称】アミロイドβタンパク質におけるプロパノイル化修飾部位特異的測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230207BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230207BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230207BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230207BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
C07K14/47
C07K16/18
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2018037847
(22)【出願日】2018-03-02
(65)【公開番号】P2019152535
(43)【公開日】2019-09-12
【審査請求日】2021-02-26
(73)【特許権者】
【識別番号】599002043
【氏名又は名称】学校法人 名城大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000110
【氏名又は名称】弁理士法人 快友国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日坂 真輔
(72)【発明者】
【氏名】山川 晴香
(72)【発明者】
【氏名】能勢 充彦
(72)【発明者】
【氏名】赤津 裕康
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－１５１５８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２０２９６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／００２９８３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】アミロイドMS ―血液検査によるアルツハイマー病早期検出を目指した分析法―，株式会社島津製作所，2020年08月15日，https://www.shimadzu.co.jp/research_and_development/technology_branding/neurotech/amyloidms.html
【文献】大澤俊彦，アルキルアミド型付加体をプローブとした脳内老化評価システムの確立と応用，科学研究費助成事業 研究成果報告書，2015年，https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-24248024/24248024seika.pdf
【文献】山川晴香，脂質過酸化物由来の翻訳後修飾タンパク質の免疫化学的解析，日本酸化ストレス学会学術集会プログラム・抄録集，2016年08月30日，Vol.69，Page.176
【文献】近藤芳皓，脂質過酸化由来の翻訳後修飾タンパク質を認識するモノクローナル抗体の開発（２），日本酸化ストレス学会学術集会プログラム・抄録集，2015年05月29日，Vol.68，Page.130
【文献】澤野亜矢，タンパク質の非酵素的翻訳後修飾の解析，日本薬学会年会要旨集，2015年，Vol.135th，Page. ROMBUNNO.28PB-PM236S
【文献】Shinsuke Hisaka，288 - Propanoylation Derived from Lipid Peroxides Modulates the Properties of Amyloid Protein，Free Radical Biology and Medicine，2015年10月，Volume 87, Supplement 1，Pages S129-S130
【文献】Shinsuke Hisaka，Propanoylation of Amyloid β is Trigger to the Aggregation and Enhanced its Neurotoxicity，Free Radical Biology and Medicine，2010年，Volume 49, Supplement，Page S80
【文献】Hisaka S, Kato Y, Kitamoto N, Yoshida A, Kubushiro Y, Naito M, Osawa T.，Chemical and immunochemical identification of propanoyllysine derived from oxidized n-3 polyunsatura，Free Radic Biol Med.，2009年，Vol.46,No.11，Page.1463-1471
【文献】Kato Y, Osawa T，Detection of a lipid-lysine adduct family with an amide bond as the linkage: novel markers for lipid，Methods Mol Biol.，2009年，Vol.580，Page.129-141
【文献】日坂真輔, 林佳美，加藤陽二，赤津裕康，丸山和佳子, 大澤俊彦，生体内脂質過酸化による神経傷害機構の化学的解明，生化学，日本，2009年09月25日，抄録CD，Page.ROMBUNNO.2T18P-3
【文献】大澤俊彦、加藤陽二，認知症と機能性食品 2.抗酸化―Overview，Funct Food，日本，2010年02月28日，Vol.3,No.3，Page.197-204
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ｃ０７Ｋ １６／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、アミロイドβ４２の１６位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
【請求項2】
前記第１のプロパノイル化アミロイドβは、１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２のプロパノイル化アミロイドβは、２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記第２のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
脳脊髄液又は血液中のプロパノイル化されたアミロイドβを検出対象とする、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、アルツハイマー病に罹患した個体又はアルツハイマー病モデル動物の脳脊髄液又は血液中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
【請求項8】
前記検出工程は、前記第１のプロパノイル化アミロイドβ及び前記第２のプロパノイル化アミロイドβの双方を検出する工程である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
さらに、前記第１のプロパノイル化アミロイドβに対する前記第２のプロパノイル化アミロイドβの比を算出する工程を備える、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法であって、アルツハイマー病患者の脳脊髄液又は血液中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、アミロイドβタンパク質のプロパノイル修飾部位特異的測定法に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー型認知症（以下、ＡＤともいう。）は、認知症のなかでも最も多くを占め、４０～６０％にものぼることが試算されている。ＡＤの認知機能障害としては近時記憶障害が特徴的であるほか、妄想、うつ症状等の多彩な精神症状が認められ、病初期から認知機能障害や精神症状以外の局所神経症を認めることはまれとされている。ＡＤの病理学的特徴としては、大脳全般性萎縮と大脳皮質神経細胞の減少、老人斑の多発、神経細胞内における神経原繊維変化などが報告されているが、とりわけＡＤにおいては老人斑の形成が特徴付けられている。
【0003】
老人斑を構成する主タンパク質としては、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が同定されている。そのため、ＡＤ発症に関わる原因分子の一つと考えられている。Ａβとしては、アミノ酸残基が３８～４３を有する様々な分子種が産生されている。これらＡβは、そもそも水溶液に可溶性であるものの、ＡＤ患者脳では高度に凝集したかたちで老人斑を形成している。こうした知見により、ＡβをＡＤ発症機序の初発因子とするアミロイド仮説では、この凝集体が、そして近年においては凝集・沈着する前の中間分子Ａβオリゴマーが神経細胞障害を引き起こしているのではないかと考えられている。
【0004】
これまで、ヒト脳内でＡβ中のリジン残基がω－３系の多価不飽和脂肪酸の過酸化体によってプロパノイル（以下、ＰＲＬともいう。）化されることを見出されている（特許文献１）。さらにこのＰＲＬ化されたＡβは、ＰＲＬ修飾前のＡβよりもその凝集性や神経細胞に対する毒性が亢進されることも報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１１－２０２９６４号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】https://www.sciencedirect.com/journal/free-radical-biology-and-medicine/vol/49/suppl/S?page-size=100&page=3 （17th Annual Meeting of SFRBM and SFRR international Biennal Meeting、Propanoylation of amyloid b is trigger to the aggregateon and enhanced its neurotoxicity）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
Ａβはリジン残基を二つ有するところ、ＡβのＰＲＬ化は、非酵素的な反応によるものと考えられており、一般的には、これらは均等にドコサヘキサエン酸などのω－３系多価不飽和脂肪酸の過酸化物によってＰＲＬ化されるものと推測される。したがって、ＰＲＬ化Ａβにおける２つのリジン残基がいずれも修飾されているのか、あるいはいずれか一方のみが修飾されているのかというＰＲＬ化部位については今までのところ全く検討されていない。
【0008】
本明細書は、ＰＲＬ化アミロイドβを、ＰＲＬ化部位特異的に検出し、ひいては定量する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、Ａβ中の二つのリジン残基におけるＰＲＬ化に着目し、ＰＲＬ化部位特異的にＡβを検出することに着目し、種々の検討を行い、二つのリジン残基のうち一方のリジン残基（Ａβ ４２の１６位リジン）がＰＲＬ化されたＡβ（１６ＰＲＬ化Ａβ）に特異的に結合するモノクローナル抗体と他方のリジン残基（Ａβ４２の２８位リジン）がＰＲＬ化されたＡβ（２８ＰＲＬ化Ａβ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を取得した。さらに、ＡＤ及び非ＡＤのヒトから採取した髄液について、これらのモノクローナル抗体を用いて１６ＰＲＬ化Ａβと２８ＰＲＬ化Ａβとをそれぞれ検出し定量できることを見出した。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【0010】
（１）プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、
アミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（２）前記第１のプロパノイル化アミロイドβは、１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、である、（１）に記載の方法。
（３）前記第２のプロパノイル化アミロイドβは、２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記第１のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記第２のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）脳脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のプロパノイル化されたアミロイドβを検出対象とする、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（８）前記検出工程は、前記第１のプロパノイル化アミロイドβ及び前記第２のプロパノイル化アミロイドβの双方を検出する工程である、（７）に記載の方法。
（９）さらに、前記第２のプロパノイル化アミロイドβ／第１のプロパノイル化アミロイドβをアルツハイマー病の発症、重症度、予後及び合併症のいずれかと関連付けを実施する工程を備える、（８）に記載の方法。
（１０）アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
アミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（２）前記第１のプロパノイル化アミロイドβは、１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、である、（１）に記載の方法。
（３）前記第２のプロパノイル化アミロイドβは、２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記第１のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記第２のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）脳脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のプロパノイル化されたアミロイドβを検出対象とする、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（８）前記検出工程は、前記第１のプロパノイル化アミロイドβ及び前記第２のプロパノイル化アミロイドβの双方を検出する工程である、（７）に記載の方法。
（９）さらに、前記第２のプロパノイル化アミロイドβ／第１のプロパノイル化アミロイドβをアルツハイマー病の発症、重症度、予後及び合併症のいずれかと関連付けを実施する工程を備える、（８）に記載の方法。
（１０）アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】アミロイドβ配列中のリジン残基（１６位及び２８位）におけるプロパノイル化のスキームを示す図である。
【図2】プロパノイル化アミロイドβに特異的に結合する抗体作製のための抗原設計を示す図である。
【図3】ｍＡｂＢＳＴ３１についての競合ＥＬＩＳＡによる特異性の解析結果を示す図である。
【図4】ｍＡｂ３Ａ１１についての競合ＥＬＩＳＡによる特異性の解析結果を示す図である。
【図5】ＰＲＬ１６アミロイドβの定量用検量線を示す図である。
【図6】ＰＲＬ２８アミロイドβの定量用検量線を示す図である。
【図7】ヒト髄液中におけるＰＲＬ１６アミロイドβ及びＰＲＬ２８アミロイドβの定量値の比較を示す図である。
【図8】ヒト髄液中におけるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の定量値の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書の開示は、プロパノイル化されたアミロイドβの検出に関し、より具体的には、アミロイドβを、プロパノイル化部位特異的に検出する方法に関する。本発明者らが推測する、アミロイドβ４２の二つのリジン残基のプロパノイル化のスキームを図１に示す。
【0013】
図１に示すように、本方法によれば、従来、全く知られておらず、しかも、着目されていなかったアミロイドβ中の二つのリジン残基に対するプロパノイル化状態を特定し、アミロイドβ４２の１６位のリジン及び当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン及び当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβと、をそれぞれ独立して検出できる。本発明者らによれば、アルツハイマー病患者の脳脊髄液においてこれら２種のプロパノイル化アミロイドβが異なる含有量を示した。また、非アルツハイマー病患者における第１及び第２のプロパノイル化アミロイドβの含有量とも異なっていた。生体内におけるこれら２種のプロパノイル化アミロイドβの分布傾向は、アルツハイマー病の発症等との関係において重要な特徴付けが可能であると考えられる。以下、本明細書に開示される抗体が反応する対象であるアミロイドβについて説明し、本開示の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
【0014】
（プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法）
本明細書に開示されるプロパノイル化されたアミロイドβの検出方法（以下、単に、本検出方法ともいう。）は、アミロイドβの二つのリジン残基がそれぞれプロパノイル基で修飾されたアミロイドβを検出する工程を備えることができる。
本明細書に開示されるプロパノイル化されたアミロイドβの検出方法（以下、単に、本検出方法ともいう。）は、アミロイドβの二つのリジン残基がそれぞれプロパノイル基で修飾されたアミロイドβを検出する工程を備えることができる。
【0015】
アミロイドβは、一般に、アミロイドβ前駆体タンパク質からβ－セクレターゼ及びγ－セレクターゼによる切断によって生成されるとされている。本明細書における「アミロイドβ」は、例えば、ヒトのアミロイドβであって、アミノ酸残基が４０個（配列番号１）のアミロイドβ４０（アミロイドβ (1-40)）、同４２個（配列番号２）のアミロイドβ４２（アミロイドβ (1-42)）ほか、同４３個（配列番号３）のアミロイドβ４３（アミロイドβ (1-43)）が挙げられ、さらに、アミロイドβ (2-42)、アミロイドβ (4-40)等が挙げられるが、特に限定しないで、ヒトなどの生体内において存在する可能性があるアミロイドβを包含する。なお、本明細書におけるアミロイドβは、アミロイドβにおいてアミノ酸置換、欠失等の変異を有する変異体を包含しうる。この場合、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対する変異の個数は、例えば、１～５個であり、また例えば、１個～４個であり、また例えば、１個～３個であり、また例えば１個又は２個である。
【0016】
本検出方法が検出対象とするアミロイドβは、例えば、アミロイドβ４０である。ヒトにおいて、アミロイドβ４０は、アミロイドβ４２の約１０倍量産生されることが知られている。また、本検出方法が検出対象とするアミロイドβは、例えば、アミロイドβ４２である。アミロイドβ４２がアルツハイマー病等に関しアミロイドβ４０よりも悪性であることも知られている。
【0017】
本検出方法の検出工程では、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第１のプロパノイル化アミロイドβ）と、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第２のプロパノイル化アミロイドβ）とのいずれか又は双方を検出する。
【0018】
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４０を意味している。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、アミロイドβ４０以外のアミロイドβであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、当該１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβを意味する。したがって、１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２、同リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４３等が挙げられる。なお、当業者であれば、アライメントは、Protein BLASTのほか、各種公知のデータベースを利用することなどにより実施可能である。
【0019】
同様に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβは、２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４０を意味している。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、アミロイドβ４０以外のアミロイドβであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、当該２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβを意味する。したがって、２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２，同リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４３等が挙げられる。
【0020】
なお、リジン残基がプロパノイル化された構造は、図１に示すとおりである。
【0021】
第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ特異的に検出するには、それぞれに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的手法によることができる。あるいは、液体クロマトグラフィーによる分離、液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析計、MALDI-TOF/MSなどにより可能である。
【0022】
（第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβのそれぞれに特異的に結合する抗体）
本明細書に開示される抗体は、アミロイドβの１６位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第１のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性が、アミロイドβの２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第２のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性よりも高い抗体（以下、当該抗体を第１の抗体ともいう。）である。また、本明細書に開示される他の抗体は、アミロイドβの２８位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第２のアミロイドβともいう。）に対する反応性が、アミロイドβの１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第１のアミロイドβともいう。）に対する反応性よりも高い抗体（以下、第２の抗体ともいう。）である。以下、これらの抗体について、順次説明する。
本明細書に開示される抗体は、アミロイドβの１６位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第１のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性が、アミロイドβの２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第２のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性よりも高い抗体（以下、当該抗体を第１の抗体ともいう。）である。また、本明細書に開示される他の抗体は、アミロイドβの２８位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第２のアミロイドβともいう。）に対する反応性が、アミロイドβの１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第１のアミロイドβともいう。）に対する反応性よりも高い抗体（以下、第２の抗体ともいう。）である。以下、これらの抗体について、順次説明する。
【0023】
（第１の抗体）
第１の抗体は、第１のアミロイドβに対する反応性が、第２のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。また、「第２のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。以下、同様である。
第１の抗体は、第１のアミロイドβに対する反応性が、第２のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。また、「第２のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。以下、同様である。
【0024】
第１の抗体が備える係る反応性は、当業者において周知の方法で決定することができる。任意の抗体が、その第１のアミロイドβに対する反応性が、第２のアミロイドβに対する反応性よりも高ければ、第１の抗体に該当する。
【0025】
第１の抗体が備える反応性は、上記のような反応特性を備えていればよいが、例えば、より具体的には、以下の第１の態様を採ることができる。すなわち、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性が、配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（２８ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い。
【0026】
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の１１位～２１位のアミノ酸配列であり、アミロイドβ４０の１６位のリジンを含んで前後５個のアミノ酸残基を含んでいる。
【0027】
また、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の２３位～３３位のアミノ酸配列であり、アミロイドβの２８位のリジンを含んで前後５個のアミノ酸残基を含んでいる。
【0028】
第１の態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチドに対する反応性が、２８ＰＲＬペプチに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時においては１．６倍以上（また例えば、１．７倍以上、また例えば、１．８倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時においては１．２倍以上（また例えば、１．３倍以上、また例えば、１．４倍以上）高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時においては１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時においては１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば１．２倍以上）高い。
【0029】
第１の抗体が備える反応性は、さらに、例えば、以下の第２の態様を採ることができる。すなわち、配列番号６で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド－ｌｏｎｇ）に対する反応性が、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い態様である。
【0030】
ここで、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の１位～２１位のアミノ酸配列であり、アミロイドβのＮ末端から１６位のリジンよりＣ末端側の５個のアミノ酸残基までを含んでいる。
【0031】
第２の態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチド－ｌｏｎｇに対する反応性が、１６ＰＲＬペプチドに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において５倍以上（また例えば、５．２倍以上、また例えば、５．３倍以上、また例えば、５．４倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において２．５倍以上（また例えば、２．６倍以上、また例えば、２．７倍以上、また例えば、２．８倍以上、また例えば、２．９倍以上）高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１．３倍以上（また例えば、１．４倍以上、また例えば、１．５倍以上、また例えば、１．６倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。
【0032】
第１の抗体は、さらに、例えば、第１のアミロイドβに対する反応性が、アミロイドβの１６位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されていないアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。
【0033】
第１の抗体は、こうした反応特性を備えていればよいが、より具体的には、以下の態様を採ることができる。すなわち、１６ＰＲＬペプチド又は１６ＰＲＬ－ｌｏｎｇに対する反応性が、リジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１６ペプチドともいう。）又はリジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１６ペプチド－ｌｏｎｇともいう。）に対する反応性よりも高い態様である。
【0034】
かかる態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチドに対する反応性が、１６ペプチドに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において１．３倍以上（また例えば、１．４倍以上、また例えば、１．５倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において１．２倍以上（また例えば、１．３倍以上、また例えば、１．４倍以上高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。
【0035】
また例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチド－ｌｏｎｇに対する反応性が、１６ペプチド－ｌｏｎｇに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において７倍以上（また例えば、７．２倍以上、また例えば、７．４倍以上、また例えば、７．７倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において３．５倍以上（また例えば、３．６倍以上、また例えば、３．８倍以上）以上高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１．５倍以上（また例えば、１．６倍以上、また例えば、１．７倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。
【0036】
（第２の抗体）
第２の抗体は、第２のアミロイドβに対する反応性が、第１のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第２のアミロイドβに対する反応性」、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、既に説明したとおりである。
第２の抗体は、第２のアミロイドβに対する反応性が、第１のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第２のアミロイドβに対する反応性」、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、既に説明したとおりである。
【0037】
第２の抗体が備える係る反応性は、当業者において周知の方法で決定することができる。任意の抗体が、その第２のアミロイドβに対する反応性が、第１のアミロイドβに対する反応性よりも高ければ、第２の抗体に該当する。
【0038】
第２の抗体が備える反応性は、上記のような反応特性を備えていればよいが、例えば、より具体的には、以下の第１の態様を採ることができる。すなわち、配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（２８ＰＲＬペプチド）に対する反応性が、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い。
【0039】
第１の態様の反応性は、例えば、第２の抗体の２８ＰＲＬペプチドに対する反応性が、１６ＰＲＬペプチドに対する反応性よりも、各濃度５０ｎＭ時において４．５倍以上（また例えば、４．６倍以上、また例えば４．７倍以上）以上高く、また例えば、同１６．７ｎＭ時において２．５倍以上（また例えば、２．６倍以上、また例えば２．７倍以上、また例えば２．８倍以上）高く、また例えば、同５．５６ｎＭ時において１．７倍以上（また例えば、１．８倍以上、また例えば、１．９倍以上）高く、また例えば、同１．８５ｎＭ時において１．５倍以上（また例えば、１．６倍以上、また例えば、１．７倍以上）高い。
【0040】
第２の抗体は、さらに、例えば、第２のアミロイドβに対する反応性が、アミロイドβの２８位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されていないアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。
【0041】
第２の抗体は、こうした反応特性を備えていればよいが、より具体的には、以下の態様を採ることができる。すなわち、２８ＰＲＬペプチドに対する反応性が、リジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、２８ペプチドともいう。）に対する反応性よりも高い態様である。
【0042】
以上説明した、第１及び第２の抗体についての反応性の比較は、それぞれの抗体について、当該抗体が本来結合する抗原を、対比すべき物質を競合物質として用いる競合ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。
【0043】
こうした抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、こうした抗体は、ビオチン化されることにより、ストレプトアビジン等で複合化可能に構成されていてもよい。また、ヒト型抗体であるほか、由来がヒトでない場合には、当業者に周知の方法によるヒト化抗体であってもよい。
【0044】
（抗体の作製）
当業者であれば、上記の反応性を有する抗体を、当業者に周知の方法を適宜採用して作製することができるが、例えば、以下の方法により作製することができる。
当業者であれば、上記の反応性を有する抗体を、当業者に周知の方法を適宜採用して作製することができるが、例えば、以下の方法により作製することができる。
【0045】
（抗原の作製）
抗原の作製の概要を、図２に示す。第１のプロパノイル化アミロイドβと特異的に結合する抗体（以下、単に、第１の抗体ともいう。）を作製するための抗原は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１６位リジン（以下、１６Ｌｙｓともいう。）に用いるための予めプロパノイル化したリジンを準備しておき、かかるプロパノイル化リジンを用いて、例えば前後３～８アミノ酸残基程度、典型的には５アミノ酸残基を含むアミノ酸配列のペプチドを合成する。なお、リジンのプロパノイル化は、例えば、以下のとおりに実施することができる。
抗原の作製の概要を、図２に示す。第１のプロパノイル化アミロイドβと特異的に結合する抗体（以下、単に、第１の抗体ともいう。）を作製するための抗原は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１６位リジン（以下、１６Ｌｙｓともいう。）に用いるための予めプロパノイル化したリジンを準備しておき、かかるプロパノイル化リジンを用いて、例えば前後３～８アミノ酸残基程度、典型的には５アミノ酸残基を含むアミノ酸配列のペプチドを合成する。なお、リジンのプロパノイル化は、例えば、以下のとおりに実施することができる。
【0046】
８３％メタノール５００μｌ中に溶かしたＮα-[(9-fluorenylmethoxy)carbonyl]-lysine（Ｎα－Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ）１０５ｍｇに無水プロピオン酸 (Propionic anhydride)を５７μｌ添加し、室温にて４時間反応させる。その後、さらに無水プロピオン酸５７μｌを加え、室温で反応させる。添加後、さらに４時間反応させた反応液から、プロパノイル化されたＦｍｏｃ－Ｌｙｓを高速液体クロマトグラフィーにて精製する。精製条件は、単一溶媒による分離条件で、溶媒は、０．１％トリフルオロ酢酸／５５％アセトニトリル含有Ｈ2Ｏを用いる。分離に用いたカラムは、Ｃ３０－ＵＧ－５（１０φｘ２５０ｍｍ）を用い、流速は２ｍｌ／ｍｉｎとしている。このようにして分取・精製したプロパノイル化Ｆｍｏｃ－ｌｙｓｉｎｅは、ロータリーエバポレーターおよび凍結乾燥により粉体とし、その後、ペプチド合成の素材へと供する。
【0047】
この１６Ｌｙｓプロパノイル化ペプチドを、Ｎ末側に付与したＣｙｓ残基を介して公知のキャリアタンパク質であるＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（ＰＲＬ１６－ＫＬＨ又はＰＲＬ１６－ＢＳＡ）と複合化して、抗体作製のための抗原とすることができる。なお、キャリアタンパク質としては、特に限定するものではなく、ＯＶＡ（オバルブミン）などの蛋白質または高分子体に結合もしくは重合させたものを適宜用いることができるが、必ずしもキャリアーは必要ではない。
【0048】
同様に、第２のプロパノイル化アミロイドβと特異的に結合する抗体（以下、単に、第２の抗体ともいう。）を作製するための抗原も、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２８位リジン（以下、単に、２８Ｌｙｓともいう。）に用いるための予めプロパノイル化したリジンを準備しておき、かかるプロパノイル化リジンを用いて、２８位リジンを含んだ適数個のアミノ酸残基からなるペプチドを合成する。この２８Ｌｙｓプロパノイル化ペプチドを、Ｎ末側に付与したＣｙｓ残基を介して公知のキャリアタンパク質であるＫＬＨ又はＢＳＡと複合化（ＰＲＬ２８－ＫＬＨ又はＰＲＬ２８－ＢＳＡ）して、抗体作製のための抗原とする。
【0049】
なお、第１の抗体の結合特異性を向上させるためにスクリーニングに用いる抗原として、上記１６Ｌｙｓ近傍配列よりも、さらにＮ末端に近い側のアミノ酸配列部分を含み、１６Ｌｙｓ＋５残基程度のｌｏｎｇ配列のＣ末端側にＣｙｓ残基を導入してＣ末側をキャリアタンパク質と複合化したｌｏｎｇ型抗原（ｌｏｎｇ ＰＲＬ１６－ＢＳＡ）も準備することができる。さらに、同様の目的のために、当該ｌｏｎｇ配列で１６Ｌｙｓがプロパノイル化されていない天然のアミノ酸配列からなり、Ｃ末側をキャリアタンパク質と複合したＮａｔｉｖｅ型抗原（Ｎａｔｉｖｅ ＰＲＬ１６－ＢＳＡ）も準備することができる。
【0050】
（免疫）
第１の抗体及び第２の抗体を作製するための免疫用抗原（ＫＬＨ複合体）を、それぞれ、適宜完全アジュバンドとともに、マウスなどの公知の抗体作製用動物に腹腔内投与などにより投与して、初回免疫を行い、その後、一定間隔で不完全アジュバンドとともに追加免疫を行う。適時に、動物から血液を採取し、その血清を一次抗体として使用し、ＢＳＡ複合体である各種抗原を用いたＥＬＩＳＡ法等により、その抗体価を評価し、抗体価の十分な上昇を確認後、屠殺より３日前程度に最終免疫を行って、屠殺して脾臓を摘出する。なお、免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヒト抗体を産生するヒト以外の動物等はいずれも使用できる。
第１の抗体及び第２の抗体を作製するための免疫用抗原（ＫＬＨ複合体）を、それぞれ、適宜完全アジュバンドとともに、マウスなどの公知の抗体作製用動物に腹腔内投与などにより投与して、初回免疫を行い、その後、一定間隔で不完全アジュバンドとともに追加免疫を行う。適時に、動物から血液を採取し、その血清を一次抗体として使用し、ＢＳＡ複合体である各種抗原を用いたＥＬＩＳＡ法等により、その抗体価を評価し、抗体価の十分な上昇を確認後、屠殺より３日前程度に最終免疫を行って、屠殺して脾臓を摘出する。なお、免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヒト抗体を産生するヒト以外の動物等はいずれも使用できる。
【0051】
（ハイブリドーマ細胞の樹立）
屠殺した動物の脾臓から得た脾臓細胞を調製し、その脾臓細胞と選択可能に特定遺伝子を欠損させたミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコ－ル１５００などを用いる公知の方法で融合させる。また不死化の方法としては、細胞融合以外の公知の方法を用いることもできる。例えば、エプスタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus）を用いたトランスフォーム法（D. Kozborら、Eur J Immunol, 14:23 (1984)）により行うこともできる。その後、選択培地を用いてハイブリドーマ細胞のみを選択する。ＰＲＬ１６－ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ１６－ＢＳＡのほか、必要に応じてｌｏｎｇ ＰＲＬ１６－ＢＳＡを用いてスクリーニング及びクローニングを行うことで第１の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。また、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを用いるスクリーニング及びクローニングを行うことで、第２の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。
屠殺した動物の脾臓から得た脾臓細胞を調製し、その脾臓細胞と選択可能に特定遺伝子を欠損させたミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコ－ル１５００などを用いる公知の方法で融合させる。また不死化の方法としては、細胞融合以外の公知の方法を用いることもできる。例えば、エプスタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus）を用いたトランスフォーム法（D. Kozborら、Eur J Immunol, 14:23 (1984)）により行うこともできる。その後、選択培地を用いてハイブリドーマ細胞のみを選択する。ＰＲＬ１６－ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ１６－ＢＳＡのほか、必要に応じてｌｏｎｇ ＰＲＬ１６－ＢＳＡを用いてスクリーニング及びクローニングを行うことで第１の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。また、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを用いるスクリーニング及びクローニングを行うことで、第２の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。
【0052】
（抗体の取得）
第１の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第１の抗体を取得できる。タンパク質の精製法を適宜用いることができるが、アフィニティークロマトグラフィーを用いることが便利である。同様にして、第２の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第２の抗体を得ることができる。
第１の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第１の抗体を取得できる。タンパク質の精製法を適宜用いることができるが、アフィニティークロマトグラフィーを用いることが便利である。同様にして、第２の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第２の抗体を得ることができる。
【0053】
第１の抗体及び第２の抗体については、その特異性を間接ＥＬＩＳＡや競合ＥＬＩＳＡ等により評価することができる。また、第１の抗体及び第２の抗体が有する特徴的な反応性は、実施例に開示される競合ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。
【0054】
なお、第１の抗体は、１６Ｌｙｓを特異的に検出し、第２の抗体は、２８Ｌｙｓを特異的に検出するが、アミロイドβが２つのリジン残基がプロパノイル化された１６Ｌｙｓ＋２８Ｌｙｓのアミロイドβには、第１の抗体及び第２の抗体の双方が結合することになる。
【0055】
ヒト型抗体とは、 非ヒト（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）抗体をヒト型とした抗体（以下ヒト化抗体と称する）とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばFv、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体としては特に、非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変更することによって、ヒト抗体生殖系列由来のアミノ酸配列から部分的に、あるいは全体的に構成される抗体が好ましい。このような変更は、非ヒト抗体定常領域をヒト抗体の定常領域で置換することにより実現され、医薬的使用において許容される程度の低い免疫原性を有するヒト／非ヒトキメラを作製することが可能である。さらに好ましくは、抗体の可変領域およびＣＤＲでさえもまた、現在までに当分野に周知である技術によってヒト化される。可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域により置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に変化がないか、あるいはそのヒトゲノム由来の配列で置換されることもある。
【0056】
ヒト化抗体とはさらに、ヒトフレームワークおよび少なくとも1つの非ヒト抗体由来ＣＤＲを含むものであり、そこに存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であるものを表す。実質的に同一とは、少なくとも８５～１００％、好ましくは９５～１００％のアミノ酸配列が同一であることを表す。すなわち本ヒト化抗体は、ＣＤＲ部分を除いた全ての部分が、１又はそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列に対応する部分と同一となる。
【0057】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、この分野でよく知られている。例えば、Winterらの方法（特許第２９１２６１８号公報）、Jonesらの方法(Nature, 321: 522 (1986))、Riechmannらの方法(Nature, 332: 323 (1988))、Verhoeyenらの方法(Science, 239: 1534 (1988))、Queenらの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869 (1991))などによって実施される。ヒト化抗体取得作業においては、ヒト化抗体を発現させる宿主細胞での発現最適化を目的として、コドンのサイレント変異を行うことが望ましい（例えばNakamuraらの方法：Nuclecic Acid Res 29: 292 (2000)）。このようにして得られた抗体は、本願に記載の特異性を有するものであれば、可変領域において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とするヒト化抗体も本願発明に含まれる。
【0058】
（被験対象）
本検出方法は、アミロイドβが存在する可能性のある生体由来の試料を、特に限定することなく、被験対象とすることができる。例えば、脳漿を含む脳脊髄液、血液、尿、涙液などの体液のほか、脳、眼などの各種神経細胞の存在する組織（切片）が挙げられる。特に、アルツハイマー病などのアミロイドβの蓄積、産生ないしは関与の可能性のある神経変性疾患に罹患した個体又は当該神経変性疾患モデル動物の上記被験対象とすることが好適である。また、鼻汁及び鼻粘膜も被験対象とすることができる。
本検出方法は、アミロイドβが存在する可能性のある生体由来の試料を、特に限定することなく、被験対象とすることができる。例えば、脳漿を含む脳脊髄液、血液、尿、涙液などの体液のほか、脳、眼などの各種神経細胞の存在する組織（切片）が挙げられる。特に、アルツハイマー病などのアミロイドβの蓄積、産生ないしは関与の可能性のある神経変性疾患に罹患した個体又は当該神経変性疾患モデル動物の上記被験対象とすることが好適である。また、鼻汁及び鼻粘膜も被験対象とすることができる。
【0059】
なお、こうした神経変性疾患としては、アルツハイマー病のほか、血管性のアミロイド病変、アミロイドーシス等が挙げられる。
【0060】
本検出方法では、例えば、こうした抗体を用いて第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ検出することができる。例えば、各種の被験対象につき、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡなどの酵素免疫法、ドットブロッティング、ウェスタンブロッティング、アフィニティークロマトグラフィー、組織染色法など、抗体を用いた各種検出法にてこれらのアミロイドβを検出することができる。
【0061】
本検出方法では、これらのプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ検出するが、検出するのみならず、相対的又は絶対的な量を定量することもできる。
【0062】
本検出方法では、第１のプロパノイル化アミロイドβのみを検出してもよいし、第２のプロパノイル化アミロイドβのみを検出してもよいし、双方を検出してもよい。また、これらを同時に検出してもよい。
【0063】
種々の被験対象中の第１のプロパノイル化アミロイドβ及び／又は第２のプロパノイル化アミロイドβを検出することで、アミロイドβの酸化態様に応じて検出し、その神経組織内での分布や脳脊髄液や血液などの体液中での濃度を評価することで、アミロイドβのアシル化（プロパノイル化は、脂質過酸化物に起因する酸化である。）とアルツハイマー病などの神経変性疾患との関係を特徴付けが可能となる。
【0064】
例えば、第１のプロパノイル化アミロイドβの量、第２のプロパノイル化アミロイドβの量、及び第２のプロパノイル化アミロイドβの量／第１のプロパノイル化アミロイドβの量からなる群から選択される１種又は２種以上を、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症、重症度、予後及び合併症のいずれかと関連付けを実施することができる。また、こうした関連付けを利用して、これらの数値のいずれかあるいは２種以上を、こうした神経変性疾患の診断等のマーカーとして使用することができるようになる。
【0065】
（アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法）
本明細書に開示されるアルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法は、方は、アルツハイマー病患者の脊髄液、血液、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備えることができる。この方法によれば、アルツハイマー病の診断に関連してアミロイドβをプロパノイル化部位特異的に検出することで、アルツハイマー病の診断を補助することができる。
本明細書に開示されるアルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法は、方は、アルツハイマー病患者の脊髄液、血液、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備えることができる。この方法によれば、アルツハイマー病の診断に関連してアミロイドβをプロパノイル化部位特異的に検出することで、アルツハイマー病の診断を補助することができる。
【実施例】
【0066】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例1】
【0067】
（抗体作製用の抗原の作製）
アミロイドβには２つ（Ｎ末端より１６番目（Ｌｙｓ１６）と２８番目（Ｌｙｓ２８））のＰＲＬ化されうるリジン残基が存在したため、この２種のＰＲＬ化部位を個別に認識することができる抗体（１６番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂＢＳＴ３１、２８番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂ３Ａ１１）を作製した。まずは、図２にも示ように、上段２種（ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ）に示すように、キャリアタンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）及びｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ））に標的とするリジン残基周辺のアミノ酸５残基をもつペプチドを結合させることで、Ｌｙｓ１６のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））及びＬｙｓ２８のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））を作製した。
アミロイドβには２つ（Ｎ末端より１６番目（Ｌｙｓ１６）と２８番目（Ｌｙｓ２８））のＰＲＬ化されうるリジン残基が存在したため、この２種のＰＲＬ化部位を個別に認識することができる抗体（１６番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂＢＳＴ３１、２８番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂ３Ａ１１）を作製した。まずは、図２にも示ように、上段２種（ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ）に示すように、キャリアタンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）及びｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ））に標的とするリジン残基周辺のアミノ酸５残基をもつペプチドを結合させることで、Ｌｙｓ１６のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））及びＬｙｓ２８のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））を作製した。
【0068】
また、ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎに関しては、より特異な抗体の作製を目的にペプチド鎖が長いＬｏｎｇＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ（Ａβ配列のＮ末端より２１番目のアミノ酸配列を含有する）とその未修飾体であるＮａｔｉｖｅ１６－ａｎｔｉｇｅｎを作製した。すべての抗原に使用したペプチドは、キャリアータンパク質に結合させていない、遊離型のものも作製した。
【実施例2】
【0069】
（抗体の取得）
実施例１で作製した抗原のうち、ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）あるいはＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）の２種の抗原をそれぞれ完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ， ＦＣＡ）と共に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に腹腔内投与し、初回免疫を行った。その後、隔週にて不完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＦＩＡ）と共に追加免疫を行った。具体的には以下のように実施した。
実施例１で作製した抗原のうち、ＰＲＬ１６－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）あるいはＰＲＬ２８－ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）の２種の抗原をそれぞれ完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ， ＦＣＡ）と共に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に腹腔内投与し、初回免疫を行った。その後、隔週にて不完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＦＩＡ）と共に追加免疫を行った。具体的には以下のように実施した。
【0070】
（１）マウス腹腔内投与による免疫
初回免疫は、ＰＲＬ１６－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３５０ μｌ＋ＦＣＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて腹腔内投与した。追加免疫は、初回免疫の2週間後より行った。ＰＲＬ１６－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋ＰＢＳ ３５０μｌ＋ＦＩＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて隔週で腹腔内投与した。
初回免疫は、ＰＲＬ１６－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３５０ μｌ＋ＦＣＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて腹腔内投与した。追加免疫は、初回免疫の2週間後より行った。ＰＲＬ１６－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８－ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋ＰＢＳ ３５０μｌ＋ＦＩＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて隔週で腹腔内投与した。
【0071】
尾静脈より血液を採取し、ＥＬＩＳＡ法にて各種抗原（ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ－ＢＳＡ（ＢＳＡを直接ＰＲＬ化した抗原）、Ｎａｔｉｖｅ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ２８－ＢＳＡ）に対する抗体価の上昇を経時的に確認した。すなわち、各追加免疫を行った一週間後にマウス尾静脈より採血を行い、遠心処理にて得られた血清を一次抗体として使用したＥＬＩＳＡ法により、各種抗原に対する抗体価を検討した。なお、ＥＬＩＳＡ法は以下のように実施した。
【0072】
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｎａｔｉｖｅ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて０．５ μｇ／ｍｌに希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：
抗体価を測定したい血清あるいは、ハイブリドーマ培養上清、精製抗体をＴＰＢＳにて１０００倍希釈したものから、３倍ずつ段階希釈し、それぞれの希釈液を１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。１０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｎａｔｉｖｅ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて０．５ μｇ／ｍｌに希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：
抗体価を測定したい血清あるいは、ハイブリドーマ培養上清、精製抗体をＴＰＢＳにて１０００倍希釈したものから、３倍ずつ段階希釈し、それぞれの希釈液を１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。１０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
【0073】
抗体価の上昇を確認後、屠殺し、脾臓を摘出する３日前にＰＲＬ１６－ＫＬＨ抗原＋滅菌ＰＢＳ懸濁液あるいはＰＲＬ２８－ＫＬＨ抗原＋滅菌ＰＢＳ懸濁液を尾静脈へ投与することで最終免疫を行い、屠殺し脾臓を摘出した。
【0074】
（２）ハイブリドーマ細胞の樹立
次いで、各抗原を免疫したマウス血清中において、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ及びＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ１６－アミロイドβ抗体を、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ２８－アミロイドβ抗体の樹立を行った。すなわち、半永続的に培養維持が可能なミエローマ細胞と各マウスから得られる脾臓細胞との融合を行うことで、抗体を半永続的に産生し続けることが可能なハイブリドーマ細胞を樹立した。具体的には以下のように実施した。
次いで、各抗原を免疫したマウス血清中において、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ及びＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ１６－アミロイドβ抗体を、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ２８－アミロイドβ抗体の樹立を行った。すなわち、半永続的に培養維持が可能なミエローマ細胞と各マウスから得られる脾臓細胞との融合を行うことで、抗体を半永続的に産生し続けることが可能なハイブリドーマ細胞を樹立した。具体的には以下のように実施した。
【0075】
屠殺したマウスの脾臓から脾臓細胞を調製し、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とポリエチレングリコール１５００を介して融合させた。その後、ＨＡＴ培地を用いて融合後の細胞を培養することで、ハイブリドーマとなった細胞のみを選択した。ＨＡＴ培地中では、アミノプテリンがｄｅ ｎｏｖｏ経路を介するＤＮＡ合成経路を阻害し、サルベージ経路でのＤＮＡ合成を進めるため、サルベージ経路に必要なhypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase（ＨＧＰＲＴ）を欠損するＰ３Ｕ１ではｄｅ ｎｏｖｏ経路に依存したＤＮＡ合成ができず、増殖・生存ができない。しかしながら、脾臓細胞自体はこのＨＧＰＲＴを有するため、脾臓細胞と融合したミエローマ細胞、つまりは、ハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中においてＤＮＡ合成が行え、生存できる。このようにしてＨＡＴ培地での選別後、培養上清を用いたＥＬＩＳＡを行うことで、目的の抗体を産生しているハイブリドーマのみを選択した。なお、ＥＬＩＳＡは既述のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従って行った。
【0076】
これら細胞の選別（スクリーニング、クローニング）を繰り返すことで単一のクローンとして当該抗体産生株として樹立した。ＰＲＬ１６－Ａβに対する特異抗体産生クローンとしては「ＢＳＴ３１」と、ＰＲＬ２８－Ａβに対する特異抗体産生クローンとしては「３Ａ１１」と命名した。以下抗体としては、ｍＡｂＢＳＴ３１、ｍＡｂ３Ａ１１とした。
【0077】
なお、本クローンの樹立に関して、細胞融合を行った後のＥＬＩＳＡにおけるスクリーニング時にＰＲＬ１６－ＢＳＡだけでなく、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡを並行してスクリーニングを行うことで、ＰＲＬ１６－ＢＳＡのみでのスクリーニングでは認められたＰＲＬ２８－ＢＳＡにも交差性を有してしまう非特異的な抗体のセレクションが排除された。また、それだけでなく、アミロイドβのアミノ酸配列をより多く有するペプチド中のリジン残基のＰＲＬ化を認識できることから、より「アミロイドβ配列中における１６番目リジン残基のＰＲＬ化」に対して特異性の高い抗体の樹立へとつながったといえる。
【0078】
（３）プロテインＧカラムによる各抗体の精製
抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティー精製により抗体を精製した。各抗体を精製後、タンパク質の定量を行い、抗体濃度として１ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製し、－３０℃あるいは－８０℃下で保存した。なお、アフィニティークロマトグラフィーは以下のようにペリスタポンプあるいは手動にて実施した。
抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティー精製により抗体を精製した。各抗体を精製後、タンパク質の定量を行い、抗体濃度として１ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製し、－３０℃あるいは－８０℃下で保存した。なお、アフィニティークロマトグラフィーは以下のようにペリスタポンプあるいは手動にて実施した。
【0079】
（１）超純水でラインを流しながら、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを接続し平衡化した。
（２）０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＰＢ）に置換し、２０分、平衡化した。
（３）０．０２Ｍ ＰＢにて平衡化後、培養上清へとカラムを置換し、培養上清すべてをカラムに通した。
（４）培養上清をカラムに流し終えた後、０．０２Ｍ ＰＢにて２０分、洗浄した。
（５）洗浄中に１．５ｍｌのチューブ５本分に１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液を７５μｌ加えておいた。
（６）０．０２Ｍ ＰＢにて洗浄後、０．１Ｍ Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）にて溶出した。溶出液は、上記１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液入り１．５ｍｌチューブにそれぞれ１ｍｌずつ回収した（合計５本分の画分として回収）。
（７）各画分のタンパク質含量をＢＣＡ ａｓｓａｙにて測定し、抗体溶出画分を判別した。
（８）抗体溶出画分を回収し、４℃にてＰＢＳに対して透析を２日間行い、１ｍｇ／ｍｌに濃度を調製し、－３０℃あるいは－８０℃に保存した。
（２）０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＰＢ）に置換し、２０分、平衡化した。
（３）０．０２Ｍ ＰＢにて平衡化後、培養上清へとカラムを置換し、培養上清すべてをカラムに通した。
（４）培養上清をカラムに流し終えた後、０．０２Ｍ ＰＢにて２０分、洗浄した。
（５）洗浄中に１．５ｍｌのチューブ５本分に１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液を７５μｌ加えておいた。
（６）０．０２Ｍ ＰＢにて洗浄後、０．１Ｍ Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）にて溶出した。溶出液は、上記１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液入り１．５ｍｌチューブにそれぞれ１ｍｌずつ回収した（合計５本分の画分として回収）。
（７）各画分のタンパク質含量をＢＣＡ ａｓｓａｙにて測定し、抗体溶出画分を判別した。
（８）抗体溶出画分を回収し、４℃にてＰＢＳに対して透析を２日間行い、１ｍｇ／ｍｌに濃度を調製し、－３０℃あるいは－８０℃に保存した。
【実施例3】
【0080】
（樹立したモノクローナル抗体ｍＡｂＢＳＡ３１及びｍＡｂ３Ａ１１の特異性解析）
（１）間接ＥＬＩＳＡ法による検討
精製したモノクローナル抗体を使用して、各抗原に対する交差性を検証した。ｍＡｂＢＳＴ３１に関しては、ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ－ＢＳＡ、Ｎａｔｉｖｅ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを使用し、ｍＡｂ３Ａ１１に関しては、Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ－ＢＳＡ、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを用いて、既述のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従い行った。その結果、ｍＡｂＢＳＴ３１は、ＰＲＬ１６－ＢＳＡに加え、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡの２種に対してのみ交差することが認められ、さらにＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡに対してより強く反応していることが認められた。そのため、よりアミノ酸残基の長く、アミロイドβのおおよそ半分の２１残基を含有するＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μl／ｗｅｌｌ）を競合ＥＬＩＳＡのＣｏａｔｉｎｇ時の抗原として使用することにした。ｍＡｂＢＳＴ３１の抗体濃度としては、０．２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて用いることにした。ｍＡｂ３Ａ１１においては、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対してのみ交差性が認められた。よって、Ｃｏａｔｉｎｇ時の抗原としてはＰＲＬ２８－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）を使用し、ｍＡｂ３Ａ１１の抗体の濃度として０．１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて競合ＥＬＩＳＡに使用することにした。
（１）間接ＥＬＩＳＡ法による検討
精製したモノクローナル抗体を使用して、各抗原に対する交差性を検証した。ｍＡｂＢＳＴ３１に関しては、ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ－ＢＳＡ、Ｎａｔｉｖｅ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを使用し、ｍＡｂ３Ａ１１に関しては、Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ－ＢＳＡ、ＰＲＬ１６－ＢＳＡ、ＰＲＬ２８－ＢＳＡを用いて、既述のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従い行った。その結果、ｍＡｂＢＳＴ３１は、ＰＲＬ１６－ＢＳＡに加え、ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡの２種に対してのみ交差することが認められ、さらにＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡに対してより強く反応していることが認められた。そのため、よりアミノ酸残基の長く、アミロイドβのおおよそ半分の２１残基を含有するＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μl／ｗｅｌｌ）を競合ＥＬＩＳＡのＣｏａｔｉｎｇ時の抗原として使用することにした。ｍＡｂＢＳＴ３１の抗体濃度としては、０．２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて用いることにした。ｍＡｂ３Ａ１１においては、ＰＲＬ２８－ＢＳＡに対してのみ交差性が認められた。よって、Ｃｏａｔｉｎｇ時の抗原としてはＰＲＬ２８－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）を使用し、ｍＡｂ３Ａ１１の抗体の濃度として０．１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて競合ＥＬＩＳＡに使用することにした。
【0081】
（２）競合ＥＬＩＳＡ法による検討
作製した抗体の特異性を検証する実験として競合ＥＬＩＳＡがある。競合ＥＬＩＳＡは、抗体とプレート上にある抗原と、さらに競合物質とを共存させることで、抗体がプレート上の抗原と交差することを競合物質が阻害するかどうかで抗体とその競合物質との交差性を検討できる実験である。用いた各抗原と抗体の条件は、前述の通りであり、以下のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従って行った。結果を図３及び図４に示す。
作製した抗体の特異性を検証する実験として競合ＥＬＩＳＡがある。競合ＥＬＩＳＡは、抗体とプレート上にある抗原と、さらに競合物質とを共存させることで、抗体がプレート上の抗原と交差することを競合物質が阻害するかどうかで抗体とその競合物質との交差性を検討できる実験である。用いた各抗原と抗体の条件は、前述の通りであり、以下のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従って行った。結果を図３及び図４に示す。
【0082】
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ｍＡｂＢＳＴ３１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）、
ｍＡｂ３Ａ１１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて、９６ｗｅｌｌプレートに散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：以下に挙げるペプチドを、各抗体と同時に加えた。
ｍＡｂＢＳＴ３１：ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌｏｎｇ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｎａｔｉｖｅ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ（各抗原のキャリアタンパク質が結合していない遊離型のペプチド）を、５００ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。
ｍＡｂ３Ａ１１：ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅを、５０ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。両者ともに、その後、４℃下で一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
ｍＡｂＢＳＴ３１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）、
ｍＡｂ３Ａ１１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて、９６ｗｅｌｌプレートに散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：以下に挙げるペプチドを、各抗体と同時に加えた。
ｍＡｂＢＳＴ３１：ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌｏｎｇ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｎａｔｉｖｅ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ（各抗原のキャリアタンパク質が結合していない遊離型のペプチド）を、５００ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。
ｍＡｂ３Ａ１１：ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅを、５０ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。両者ともに、その後、４℃下で一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
【0083】
図３に示すように、ｍＡｂＢＳＴ３１は、Ｎａｔｉｖｅ１６－ｐｅｐｔｉｄｅおよびＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅとは交差せず、ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅおよびＬｏｎｇＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅに対してのみ交差し、なかでもＬｏｎｇＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅに対してより強く交差する抗体であることが認められた。また、図４に示すように、ｍＡｂ３Ａ１１に関しては、ＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅには交差せず、ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅに対してのみ交差する抗体であることが認められた。以上のことから、これら抗体は、アミロイドβ配列中のＰＲＬ化を部位特異的に検出することが可能な抗体であると認められた。
【実施例4】
【0084】
（各抗体の高感度化のためのｂｉｏｔｉｎ化）
ｂｉｏｔｉｎは、卵黄中から発見された低分子で、卵白中のａｖｉｄｉｎと強力な非共有結合を形成する性質を有する。そのため、このｂｉｏｔｉｎを抗体に複数結合させることで、ｂｉｏｔｉｎ化された抗体に多くのａｖｉｄｉｎが結合させることができ、ａｖｉｄｉｎを介した検出感度の増加が可能となる。よって、ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１のｂｉｏｔｉｎ標識を行った。なお、ｂｉｏｔｉｎ標識の確認は、抗体の検出に用いるプローブをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することで行った。
ｂｉｏｔｉｎは、卵黄中から発見された低分子で、卵白中のａｖｉｄｉｎと強力な非共有結合を形成する性質を有する。そのため、このｂｉｏｔｉｎを抗体に複数結合させることで、ｂｉｏｔｉｎ化された抗体に多くのａｖｉｄｉｎが結合させることができ、ａｖｉｄｉｎを介した検出感度の増加が可能となる。よって、ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１のｂｉｏｔｉｎ標識を行った。なお、ｂｉｏｔｉｎ標識の確認は、抗体の検出に用いるプローブをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することで行った。
【0085】
（１）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－６－（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）０．００２３ｇを５００μｌ Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）に溶解させた（Ｂｉｏｔｉｎ化試薬）。
（２）ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１を各々２ｍｇ（ＰＢＳ溶液中）に対して上記のＢｉｏｔｉｎ化試薬２７μｌ添加した。
（３）氷上で２時間静置した。
（４）ＰＢＳ１ Ｌに対してセロハン膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ７ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ １００００、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いて２日間、透析を行った。
（５）ＢＣＡ ａｓｓａｙによりタンパク濃度を測定し、ｍＡｂＢＳＴ３１は０．８ｍｇ／ｍｌ、ｍＡｂ３Ａ１１は０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、－３０℃に保存した。
（２）ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１を各々２ｍｇ（ＰＢＳ溶液中）に対して上記のＢｉｏｔｉｎ化試薬２７μｌ添加した。
（３）氷上で２時間静置した。
（４）ＰＢＳ１ Ｌに対してセロハン膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ７ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ １００００、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いて２日間、透析を行った。
（５）ＢＣＡ ａｓｓａｙによりタンパク濃度を測定し、ｍＡｂＢＳＴ３１は０．８ｍｇ／ｍｌ、ｍＡｂ３Ａ１１は０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、－３０℃に保存した。
【実施例5】
【0086】
（ｍＡｂＢＳＴ３１を用いた競合ＥＬＩＳＡ定量法の構築）
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ１６-Aβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図５に示す。
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ１６-Aβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図５に示す。
【0087】
（競合ＥＬＩＳＡ-ＰＲＬ１６-アミロイドβの定量法）
なお、本定量法においては、９６Ｆ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
なお、本定量法においては、９６Ｆ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
【0088】
（手順）
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて５０００００倍に希釈し、９６Ｆ ＭＡＸＩ ＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬの各ｗｅｌｌに１００μｌずつ散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布し、室温にて３０分間、静置した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＬｏｎｇＰＲＬ１６－Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて１０００ｎＭに調製し、これを上限として１０倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂＢＳＴ３１－ｂｉｏｔｉｎ（０．８ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて５００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＴＰＢＳにて１０００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。
その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（９）化学発光：
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μｌ／ｗｅｌｌにて添加し、化学発光させ、添加後１分の発光強度をプレートリーダーにて測定した。
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて５０００００倍に希釈し、９６Ｆ ＭＡＸＩ ＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬの各ｗｅｌｌに１００μｌずつ散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布し、室温にて３０分間、静置した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＬｏｎｇＰＲＬ１６－Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて１０００ｎＭに調製し、これを上限として１０倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂＢＳＴ３１－ｂｉｏｔｉｎ（０．８ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて５００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＬｏｎｇＰＲＬ１６－ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＴＰＢＳにて１０００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。
その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（９）化学発光：
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μｌ／ｗｅｌｌにて添加し、化学発光させ、添加後１分の発光強度をプレートリーダーにて測定した。
【0089】
（ｍＡｂ３Ａ１１を用いた競合ＥＬＩＳＡ定量法の構築）
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ２８－Ａβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図６に示す。
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ２８－Ａβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図６に示す。
【0090】
（競合ＥＬＩＳＡ－ＰＲＬ２８アミロイドβの定量法）
なお、この定量法では、Ｆ９６ ＣＥＲＴ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ Ｐｏｗｄｅｒ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。
なお、この定量法では、Ｆ９６ ＣＥＲＴ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ Ｐｏｗｄｅｒ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。
【0091】
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて８０００倍に希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつを散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ｐｏｗｄｅｒを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＰＲＬ２８－Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて２８０ｎＭに調製し、これを上限として３倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂ３Ａ１１－ｂｉｏｔｉｎ（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて４００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＴＰＢＳにて２００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
ＴＭＢ発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ2Ｏ2＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
ＰＲＬ２８－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて８０００倍に希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつを散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ｐｏｗｄｅｒを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＰＲＬ２８－Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて２８０ｎＭに調製し、これを上限として３倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂ３Ａ１１－ｂｉｏｔｉｎ（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて４００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＰＲＬ２８－ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＴＰＢＳにて２００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
ＴＭＢ発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ2Ｏ2＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
【0092】
【実施例6】
【0093】
（ヒト髄液からのＰＲＬ１６－Ａβ及びＰＲＬ２８－Ａβの定量）
実施例５に記載したように、各修飾部位特異抗体を用いて定量可能なＥＬＩＳＡ法を開発した。この２種のプロトコールから作成した検量線を使用し、ヒト髄液中に含まれるＡβの各ＰＲＬ修飾部位の定量を行った。また、ｎｏｎ ＡＤ患者（ＡＤではない患者）とＡＤ患者間での比較を行った。ＰＲＬ１６－Ａβ及びＰＲＬ２８－Ａβの定量値を図７に示す。また、図８に、同じ髄液中におけるＡβ４０及び４２の定量値の比較も示す。
実施例５に記載したように、各修飾部位特異抗体を用いて定量可能なＥＬＩＳＡ法を開発した。この２種のプロトコールから作成した検量線を使用し、ヒト髄液中に含まれるＡβの各ＰＲＬ修飾部位の定量を行った。また、ｎｏｎ ＡＤ患者（ＡＤではない患者）とＡＤ患者間での比較を行った。ＰＲＬ１６－Ａβ及びＰＲＬ２８－Ａβの定量値を図７に示す。また、図８に、同じ髄液中におけるＡβ４０及び４２の定量値の比較も示す。
【0094】
図７に示すように、開発したＥＬＩＳＡ法によるヒト髄液中におけるＡβの各ＰＲＬ化部位の定量をおこなったところ、１６番目のＰＲＬ化Ａβは、ＡＤ患者の髄液中において未修飾Ａβ（４０及び４２）の定量値（図８参照）と同様に対照群（ｎｏｎ ＡＤ）と比べて「減少」するのに対し、２８番目のＰＲＬ化Ａβは、ＡＤ患者髄液中においてむしろ「増加」する値を示した。このような変化を示すことからも、ＡＤのバイオマーカーとして新たに２種の定量法を提案することで、ＡＤの発症機構の解明や、診断における生化学バイオマーカーになりうると考えられ、これら定量法である本発明は新規性の高いものであると考えられた。
【0095】
また、髄液中のＰＲＬ－Ａβの存在量に関しては、ＰＲＬ２８－Ａβが２００－６００ｐＭであるのに対し、ＰＲＬ１６－Ａβは１０ｐＭ以下であり、ＰＲＬ１６－Ａβ、ＰＲＬ２８－Ａβ間でヒト髄液中の存在量が大きく異なることが明らかとなった。
【0096】
ＡＤ患者では髄液中のＡβ４２が低下し、髄液中のタウが上昇するとされ、これらを組み合わせることで８０％を超える感度・特異度でＡＤの診断が可能（Ｋｎｏｐｍａｎ，ＤＳ； ＤｅＫｏｓｋｙ，ＳＴ； Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ＪＬ；ｅｔ ａｌ，２００１）であることや、ヒト髄液中でＡβオリゴマー体の中でもある特定の構造をもった毒性オリゴマー体とＡβ４２の比が有意に上昇する［入江一浩、村上一馬、実験医学（羊土社）Vol.35 No.12 p52-59 (2017)。］ことが報告されている。本開示によれば、ＡＤ患者で髄液中のＰＲＬ２８－Ａβが増加していたが、これはＡＤ患者で毒性Ａβオリゴマー／Ａβ４２比が上昇することに類似している。この共通点からも、ＡＤ患者ではＡβ中の２８番目のリジン残基のＰＲＬ化がＡＤ発症の過程で亢進しており、ＡＤ発症の何かしらの要因になっている可能性が推察された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】