特許 7221511 タンパク質標的核酸アプタマー、その製造方法、及び標的タンパク質の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-06

(45)【発行日】2023-02-14

(54)【発明の名称】タンパク質標的核酸アプタマー、その製造方法、及び標的タンパク質の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20230207BHJP

   C12Q 1/6811 20180101ALI20230207BHJP

   G01N 33/532 20060101ALI20230207BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z

C12Q1/6811 Z ZNA

G01N33/532 A

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2018128424

(22)【出願日】2018-07-05

(65)【公開番号】P2020005544

(43)【公開日】2020-01-16

【審査請求日】2021-06-04

(73)【特許権者】

【識別番号】598015084

【氏名又は名称】学校法人福岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100122297

【弁理士】

【氏名又は名称】西下 正石

(74)【代理人】

【識別番号】100145104

【弁理士】

【氏名又は名称】膝舘 祥治

(72)【発明者】

【氏名】福田 将虎

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 慎一

【審査官】中村 俊之

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５３６０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５２７２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Live-Cell Imaging of Endogenous mRNAs with a Small Molecule，Angewandte Chemie International Edition，2015年，Volume 54, Issue 6，pp. 1855-1858

【文献】細胞内エネルギー代謝に関係するタンパク質の細胞内動態観察を可能とする基盤技術の創生，京都大学エネルギー理工学研究所ゼロエミッションエネルギー研究拠点共同利用・共同研究成果報告書平成２９年度，2018年03月，pp. 116-117，http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/zero_emission/docs/2017ze_houkokusho.pdf

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／５３２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第１オリゴヌクレオチドと、該第１オリゴヌクレオチドの５’側に配置される第２オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの３’側に配置される第３オリゴヌクレオチドとを含み、該第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドが協同して標的タンパク質を認識し、
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ループ構造の途中にループ構造から突出する少なくとも１つの第２のステム－ループ構造を形成する塩基配列を有する、タンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。

【請求項2】

前記第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの塩基数は、それぞれ独立して１０から３０塩基である請求項１に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。

【請求項3】

リボ核酸からなる請求項１又は請求項２に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。

【請求項4】

蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブと、
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤と、
を含む標的タンパク質検出用キット。

【請求項5】

蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブの存在下で、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤と、標的タンパク質とを接触させることを含む標的タンパク質の検出方法（但し、ヒトの体内で行われる方法を除く）。

【請求項6】

前記標的タンパク質は、生細胞に由来するタンパク質である請求項５に記載の検出方法。

【請求項7】

ステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第１オリゴヌクレオチドと、該第１オリゴヌクレオチドの５’側及び３’側のそれぞれに配置され、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドとを含み、
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ループ構造の途中にループ構造から突出する少なくとも１つの第２のステム－ループ構造を形成する塩基配列を有する核酸アプタマー候補群を準備することと、
該核酸アプタマー候補群を、標的タンパク質の存在下に、該蛍光クエンチャーを有する担体と接触させて、該標的タンパク質及び蛍光クエンチャーを認識する核酸アプタマーを選択することと、
を含むタンパク質標的核酸アプタマーの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質標的核酸アプタマー、その製造方法、及び標的タンパク質の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞は、核酸、タンパク質などの機能性生体分子の時空間的な発現量を調整することで恒常性を保っている。それら生体分子の時空間的な動態や濃度変化を視覚的に捉えることができれば、複雑な生命現象を解明する上で大きな知見を得ることができる。しかしながら、細胞が生産する特定のタンパク質の動態を生細胞内で観察することは極めて困難である。例えば、化学プローブを利用する内在性タンパク質標識法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。当該方法では、タンパク質のリガンド分子を利用することで、標的に対する選択性を担保している。また、ＲＮＡアプタマーを用いる内在性ｍＲＮＡの検出方法が提案されている（例えば、非特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５，３４１－３４３（２００９）

【文献】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，１８５５－１８５８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

非特許文献１に記載の方法では、リガンドを持たないタンパク質、キナーゼなどの基質特異性が低いタンパク質等を標識化するプローブを設計することは困難である。また、非特許文献２に記載の方法は、標的タンパク質を直接検出するものではない。本発明の一態様は、標的タンパク質を生細胞内で検出可能なタンパク質標的核酸アプタマー及び標的タンパク質の検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

第１態様は、ステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第１オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの５’側に配置される第２オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの３’側に配置される第３オリゴヌクレオチドと、を含み、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドが協同して標的タンパク質を認識する、タンパク質標的核酸アプタマーである。

【0006】

第２態様は、蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブと、前記タンパク質標的核酸アプタマーと、を含む標的タンパク質検出用キットである。

【0007】

第３態様は、蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブの存在下で、前記タンパク質標的核酸アプタマーと、標的タンパク質とを、接触させることを含む標的タンパク質の検出方法である。

【0008】

第４態様は、ステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第１オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの５’側及び３’側のそれぞれに配置され、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む核酸アプタマー候補群を準備することと、核酸アプタマー候補群を、標的タンパク質の存在下に、蛍光クエンチャーを有する担体と接触させて、標的タンパク質及び蛍光クエンチャーを認識する核酸アプタマーを選択することと、を含むタンパク質標的核酸アプタマーの製造方法である。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、標的タンパク質を生細胞内で検出可能なタンパク質標的核酸アプタマー及び標的タンパク質の検出方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】核酸アプタマーによる標的タンパク質の検出方法を説明する模式図である。

【図2】インビトロセレクション法を説明する模式図である。

【図3】蛍光クエンチャーＤＮＢを認識する配列のステム－ループ構造を例示する模式図である。

【図4】タンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質による蛍光プローブからの蛍光回復を示すスペクトル図である。

【図5】タンパク質標的核酸アプタマーとエピトープペプチドによる蛍光プローブからの蛍光強度を示すスペクトル図である。

【図6】タンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質抗体との競合関係を示すスペクトル図である。

【図7】タンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質抗体との競合関係を示すスペクトル図である。

【図8】異なるタンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質抗体との競合関係を示すスペクトル図である。

【図9】部分欠損したタンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質による蛍光プローブからの蛍光回復を示すスペクトル図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、タンパク質標的核酸アプタマー等を例示するものであって、本発明は、以下に示すタンパク質標的核酸アプタマー等に限定されない。

【0012】

タンパク質標的核酸アプタマーは、ステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第１オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの５’側に配置される第２オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチドの３’側に配置される第３オリゴヌクレオチドとを含む。第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドは協同して標的タンパク質を認識する。

【0013】

タンパク質標的核酸アプタマーは、蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブと組合せて標的タンパク質の検出方法に用いられる。蛍光プローブでは蛍光クエンチャーにより蛍光発色団からの蛍光発光が抑制されて消光している。タンパク質標的核酸アプタマーが、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドによって標的タンパク質を認識してこれに結合すると、第１オリゴヌクレオチドがステム－ループ構造を形成する。このステム－ループ構造が蛍光プローブの蛍光クエンチャーを認識して結合することで、蛍光プローブからの蛍光発光が回復して標的タンパク質が位置特異的に検出される。

【0014】

タンパク質標的核酸アプタマーを用いる標的タンパク質の検出方法の概略を、図面を参照して説明する。図１はタンパク質標的ＲＮＡアプタマーを用いる標的タンパク質の検出方法を説明する模式図である。タンパク質標的ＲＮＡアプタマー１０は、タンパク質結合ＲＮＡ配列を有する第２オリゴヌクレオチド１２及び第３オリゴヌクレオチド１３と、第２及び第３オリゴヌクレオチドに挟まれ、プローブ結合配列を有する第１オリゴヌクレオチド１１とを有する。タンパク質標的ＲＮＡアプタマー１０と標的タンパク質２３が接触すると、第２及び第３オリゴヌクレオチドが協同して標的タンパク質２３を認識してこれに結合して第１複合体２０を形成する。このとき第１オリゴヌクレオチド部分は、２塩基対からなるステム構造２２と１７塩基からなるループ構造２１を形成する。蛍光プローブ４０の蛍光クエンチャー部分４１は、第１オリゴヌクレオチドから形成されるループ構造２１に認識され、ループ構造が形成された第１複合体２０に結合して第２複合体３０が形成される。第２複合体３０では、蛍光クエンチャー部分４１と蛍光発色団４２との相互作用が遮断されるため、蛍光発色団４２の蛍光発光が回復して、標的タンパク質を含む第２複合体３０から蛍光発光が観察される。

【0015】

第１オリゴヌクレオチドは、ランダムコイル状態では蛍光クエンチャーを認識せず、ステム－ループ構造を形成するときに蛍光クエンチャーを認識するように選択される。ステム－ループ構造におけるステム構造は、例えば１から５塩基対から形成され、好ましくは２から４塩基対、より好ましくは２から３塩基対から形成される。ステム構造を形成する塩基対は、例えば、少なくとも１対のＧ－Ｃ対又はＧ－Ｕ対を含み、好ましくは２対以上のＧ－Ｃ対を含む。ループ構造を構成する塩基数及び配列は、蛍光クエンチャーの構造に応じて選択される。ループ構造を構成する塩基数は、例えば、１０から６０塩基であり、好ましくは１０から４０塩基、より好ましくは１０から３０塩基である。

【0016】

第１オリゴヌクレオチドは、蛍光クエンチャーを認識するループ構造の途中に、ループ構造から突出する少なくとも１つの第２のステム－ループ構造を形成する塩基配列を有していてもよい。第２のステム－ループ構造は、例えば、蛍光クエンチャーを認識するステム－ループ構造の安定化に寄与すると考えられる。第２のステム－ループ構造におけるステム構造は、蛍光クエンチャーを認識するループ構造の安定化の観点から、例えば、２から１２塩基対から形成され、好ましくは４から８塩基対から形成される。なお、第２のステム－ループ構造におけるステム構造は、１から３塩基程度のミスマッチ配列を含んでいてもよい。また、第２のステム－ループ構造におけるループ構造は、蛍光クエンチャーを直接認識するものではなく、ステム構造を形成する２つの塩基配列を連結するヘアピン構造を形成していてもよい。第２のステム－ループ構造におけるループ構造を構成する塩基数は、例えば、６から１０塩基であり、好ましくは８塩基である。

【0017】

第１オリゴヌクレオチドは、ステム－ループ構造に加えて、ステム構造と第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドとの間に接続配列を有していてもよい。接続配列は、ステム構造を形成する領域の５’側と３’側とにそれぞれ配置され、接続配列間で相補対を形成しない塩基配列を有する。また、接続配列の塩基数はそれぞれ、例えば、１から５塩基であり、好ましくは１から２塩基である。

【0018】

第１オリゴヌクレオチドが認識する蛍光クエンチャーは、蛍光プローブに通常用いられる蛍光クエンチャーから適宜選択される。蛍光クエンチャーとしては、標的タンパク質の検出感度の観点から、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＮＢ、ＺＥＮ、ＩＢＦＱ、ＩＢＱＲ、ＢＢＱ等を挙げることができ、好ましくは、これらからなる群から選択される少なくとも１種であり、より好ましくは、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＢＱ等のダーククエンチャー、ＤＮＢ等からなる群から選択される少なくとも１種である。

【0019】

蛍光クエンチャーを認識する配列は、例えば、インビトロセレクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法（ＳＥＬＥＸ法ともいう）によって選択することができる。例えば、３’側と５’側にそれぞれプライマー領域を有し、所定の塩基数からなるランダム配列の核酸ライブラリーを準備する工程と、準備した核酸ライブラリーを、蛍光クエンチャーを有する担体に接触させて、蛍光クエンチャーを認識する核酸を選択する工程とを含む方法で、蛍光クエンチャーを認識する核酸配列が選択される。当該方法は、選択された核酸配列が複数有る場合、必要に応じて選択された核酸配列から共通する核酸配列を抽出する工程を含んでいてもよい。抽出される核酸配列を、蛍光クエンチャーを認識する核酸配列として選択することで、高い選択性を有し、より短鎖の核酸配列を得ることができる。

【0020】

核酸ライブラリーにおける３’側と５’側のプライマー領域の塩基数は、例えば１０から３０塩基であり、好ましくは１５から２５塩基である。プライマー領域の配列は、選択される核酸をＰＣＲにより増幅することができれば特に限定されない。また、ランダム配列領域の塩基数は、例えば、１０から８０塩基であり、好ましくは１０から３０塩基である。蛍光クエンチャーを認識する核酸を選択する工程は、通常は複数回、例えば５から２０回にわたって行われて、選択性のより高い配列が選択される。各選択工程の後にはＰＣＲによる選択された核酸の増幅が行われてもよい。

【0021】

蛍光クエンチャーを有する担体は、例えば、担体に蛍光クエンチャー分子を固定化して得られる。担体としては、アガロース、デキストラン、合成ポリマー等から形成され、アミノ基、カルボキシ基、チオール基等の官能基を有する担体が挙げられる。担体は、アフィニティクロマトグラフィー用として市販されている担体から適宜選択すればよい。市販の担体として具体的には、ＧＥヘルスケア社製のＥＡＨセファロース４Ｂ、ＮＨＳ－活性化セファロース４、ＣＮＢｒ－活性化セファロース４等が挙げられる。蛍光クエンチャー分子の固定化は、例えば、カルボキシ基を有する蛍光クエンチャー分子を、カルボジイミド、ＤＭＴ－ＭＭ等の縮合剤を用いて、アミノ基を有する担体と結合させることで行われる。また、アミノ基を有する蛍光クエンチャー分子を、活性化されたカルボキシ基を有する担体と結合させて、蛍光クエンチャーを有する担体を得てもよい。

【0022】

蛍光クエンチャーを認識する配列は、具体的には、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，４７，４７１２－４７１４及びその補充情報（ＥＳＩ；ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ１ｃｃ１０３９３ｈ）に記載されている方法に準じて選択することができる。例えば、３’側と５’側に２０塩基のプライマー領域をそれぞれ有する６０塩基のランダム配列の核酸ライブラリーを用意し、蛍光クエンチャーを固定化したアガロースゲルを用いてインビトロセレクションを行うことで、所望の蛍光クエンチャーを認識する配列を選択することができる。第１オリゴヌクレオチドと蛍光クエンチャーの解離定数Ｋｄとしては、例えば、２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下である。蛍光クエンチャーを認識する配列として、具体的には、蛍光クエンチャーがＢＨＱ－１の場合、下表に示す配列を選択することができる。

【0023】

【表1】

【0024】

蛍光クエンチャーを認識する配列は、インビトロセレクション法で選択された複数の配列を比較して、それらが共通して有する配列から選択されてもよい。例えば、上表の配列から、ループ部分の配列として下表に示す配列が選択される。

【0025】

【表2】

【0026】

また、蛍光クエンチャーがＤＮＢの場合、例えば、下表に示す配列を選択することができる。

【0027】

【表3】

【0028】

上表に示す蛍光クエンチャーを認識する配列は、蛍光クエンチャーを認識するループ構造の途中に、ループ構造から突出する第２のステム－ループ構造を形成する。ステム－ループ構造を図３に例示する。また、蛍光クエンチャーを認識する配列は、例えば、上表の配列から、第２のステム－ループ構造を除いたループ部分の配列として下表に示す配列が選択される。

【0029】

【表4】

【0030】

更に、蛍光クエンチャーであるＤＮＢを認識する配列としては、例えば、下表に示す配列を選択することもできる。

【0031】

【表5】

【0032】

第１オリゴヌクレオチドの５’側には第２オリゴヌクレオチドが、３’側には第３オリゴヌクレオチドが連結する。第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドは、協同して標的タンパク質を認識すると共に、第１オリゴヌクレオチドがステム－ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識できるように選択される。すなわち、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドは、例えば、第１オリゴヌクレオチドがステム－ループ構造を形成し得る状態で標的タンパク質を認識するように選択される。

【0033】

第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを構成するそれぞれの塩基数は、例えば、１０から８０塩基であり、好ましくは１０から３０塩基、より好ましくは２０から３０塩基である。第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの塩基数は同じであっても異なっていてもよい。

【0034】

第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの配列は、標的タンパク質に応じてインビトロセレクション法で選択される核酸アプタマーから決定することができる。標的タンパク質を認識する核酸アプタマーは、例えば、第１オリゴヌクレオチドの５’側と３’側にそれぞれランダム配列領域を有する核酸ライブラリーである核酸アプタマー候補群を準備する第１工程と、核酸アプタマー候補群を、標的タンパク質の存在下に、蛍光クエンチャーを有する担体と接触させて、標的タンパク質及び蛍光クエンチャーを認識する核酸アプタマーを選択する第２工程とを含む方法によって選択される。選択される核酸アプタマーの塩基配列を分析することで、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの配列が決定される。

【0035】

第１工程で準備される核酸ライブラリーにおける第１オリゴヌクレオチドの５’側と３’側にそれぞれランダム配列領域の塩基数は、例えば、第２オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドの塩基数と同じにすることができる。

【0036】

標的タンパク質は、細胞が産生し得るタンパク質であれば特に制限はなく、目的に応じて選択されればよい。標的タンパク質は、細胞質に存在するものであっても、細胞膜等の膜構造中に存在するものであっても、細胞外に存在するものであってもよい。また、標的タンパク質は、単一のタンパク質分子であっても、複数のサブユニットからなる多量体タンパク質であってもよく、糖修飾等を受けた複合タンパク質であってもよい。

【0037】

標的タンパク質として、具体的には、アクチン等の構造タンパク質、アミロイド等の疾患関連タンパク質、各種の酵素タンパク質、ＲＡＳ等の癌関連タンパク質等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。

【0038】

第２工程では、いわゆるインビトロセレクション法によって核酸アプタマーが選択される。第２工程では、標的タンパク質の存在下に、核酸アプタマー候補群を、蛍光クエンチャーを有する担体と接触させる。ついで、担体に吸着しない核酸を洗浄・除去した後、標的タンパク質に応じて調製される抗体、特異的リガンド、パートナー結合タンパク質等によって競合的に溶出される核酸を回収する。これにより標的タンパク質の存在下に蛍光クエンチャーを認識する核酸アプタマーを含む核酸ライブラリーが得られる。

【0039】

第２工程で、担体との接触に供される核酸アプタマー候補群は、標的タンパク質の非存在下では蛍光クエンチャーに結合しないことが好ましい。すなわち、第２工程は、核酸アプタマー候補群を標的タンパク質の非存在下で蛍光クエンチャーを有する担体と接触させることと、担体に吸着しない核酸を回収することとを含むネガティブセレクションを更に含んでいてもよい。

【0040】

核酸アプタマーが選択される第２工程は、通常は複数回、例えば５から２０回にわたって行われて、標的タンパク質に対する選択性がより高い配列を有する核酸アプタマーが選択される。また、第２工程のそれぞれで回収される核酸は、必要に応じてＰＣＲで増幅されてから、次の工程に供されてもよい。

【0041】

第２工程では、溶出に用いる抗体等によって、核酸アプタマーが認識する標的タンパク質の領域を制御することができる。すなわち、目的とする領域を特異的に認識する抗体等を用いることで、当該領域を特異的に認識する核酸アプタマーを選択することができる。具体的には、例えば、標的タンパク質のＮ末端ペプチド部分を抗原として作製される抗体を用いて、核酸アプタマーを溶出することで、標的タンパク質のＮ末端領域を認識する核酸アプタマーが選択される。これにより標的タンパク質の高次構造を認識する核酸アプタマーが取得できる。溶出に用いる抗体の抗原は、Ｎ末端ペプチド部分に限られるものではなく、Ｃ末端ペプチドであっても、標的タンパク質の任意の領域に存在するペプチド部分であってもよい。

【0042】

蛍光クエンチャーと標的タンパク質とを認識する核酸アプタマーは、上述した方法で選択される。当該方法にはインビトロセレクション法で用いられる手法を適宜適用することができる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，８１８－８２２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９，５０５－５１０、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，４６７－４６８等に記載の手法から必要に応じて選択される手法を適用して、核酸アプタマーを選択することができる。

【0043】

核酸アプタマーが選択されるインビトロセレクション法の一例を、図面を参照して説明する。図２はＲＮＡに対するインビトロセレクション法を説明する概念図である。インビトロセレクション法では、まずＲＮＡライブラリーが準備される。図２では、最初のＲＮＡライブラリーは、蛍光クエンチャーであるＢＨＱ１に結合するループ構造を形成し得る第１オリゴヌクレオチドの５’側と３’側に２０塩基からなるランダム配列（Ｎ_２０）をそれぞれ有するＲＮＡから構成される。ＲＮＡライブラリーは、ＢＨＱ１が固定化された担体（ＢＨＱ１レジン）と接触させられ、ＢＨＱ１レジンと結合しないＲＮＡが回収される（ネガティブセレクション）。回収されたＲＮＡは標的タンパク質であるβ－アクチンの存在下にＢＨＱ１レジンと接触させられ、非結合のＲＮＡは洗い流される（ポジティブセレクション）。標的タンパク質と共にＢＨＱ１レジンに結合したＲＮＡは、標的タンパク質に対する抗体によって、競合的に溶離させられる。溶離したＲＮＡは、逆転写によってＤＮＡライブラリーを変換される。ＤＮＡライブラリーはＰＣＲによって増幅された後、インビトロ転写によって、ＲＮＡライブラリーに変換される。得られるＲＮＡライブラリーは、最初のＲＮＡライブラリーに比べてＢＨＱ１と標的タンパク質に対する選択性が向上している。このＲＮＡライブラリーを、再びインビトロセレクション法に供することで、選択性がより向上したＲＮＡライブラリーが選択される。

【0044】

本発明のタンパク質標的核酸アプタマーは、上述したように標的タンパク質及び使用する蛍光プローブに応じてインビトロセレクション法で選択されるものであり、選択された核酸アプタマーの塩基配列を分析することで、その構造が特定される。すなわち、本発明のタンパク質標的核酸アプタマーの塩基配列は、蛍光プローブ及び標的タンパク質に依存するものであり、特定の塩基配列に制限されるものではない。

【0045】

タンパク質標的核酸アプタマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基から構成されていても、リボ核酸（ＲＮＡ）塩基から構成されていてもよい。また、化学修飾された修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾核酸塩基は公知のものから適宜選択される

【0046】

タンパク質標的核酸アプタマーと共に用いられる蛍光プローブは、蛍光クエンチャーと蛍光発色団とを含む。蛍光プローブは、例えば、蛍光クエンチャー分子と蛍光発色団を含む化合物とを連結して構成される。

【0047】

蛍光発色団としては、例えば、Ａｌｅｘａ５９４、Ｃｙ３、ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ３、Ｃｙ５、ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５、ＡＴＴＯ４６５、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ－Ｘ、ＤＥＡＣ、マリンブルー、フルオレセイン、オレゴングリーン４８８、ローダミングリーン、ＤＹ５２０、ＤＹ５１０、ＤＹ４８０、ＯＦＡＭ、テキサスレッド等を挙げることができ、好ましくはこれらからなる群から選択される少なくとも１種である。

【0048】

標的タンパク質が細胞内に存在する場合、蛍光発色団はスルホ基、カルボキシ基、アミノ基、アンモニウム基等の親水性基を有さないことが好ましく、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＡｌｅｘａ５９４からなる群から選択される少なくとも１種である。

【0049】

蛍光クエンチャーと蛍光発色団とは、直接連結していてもよく、連結基を介して連結されていてもよい。連結基としては、炭素数１から６のアルキレン基、酸素原子、イミノ基、カルボニル基、チオカルボニル基からなる群から選択される少なくとも１種を含んで構成される連結基を挙げることができる。連結基は、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール等のアルキレングリコール；βアラニン、６－アミノカプロン酸等のアミノ酸；ヒドロキシプロピオン酸等のヒドロキシカルボン酸；エタノールアミン等のアミノアルコールからなる群から選択される少なくとも１種又はこれらの縮合物に由来するものであってもよい。

【0050】

連結基において連結方向に沿って配置される原子数は、例えば、１から６０であり、好ましくは、１から４０、より好ましくは１５から４０である。

【0051】

連結基の具体例を以下に例示するが、これらに限定されるものではなく、これらの組合せであってもよい。なお、式中の＊は、蛍光クエンチャー、蛍光発色団又は他の連結基との結合位置を示す。ｍ及びｎは、それぞれ独立して０から１２の整数を表す。

【0052】

【化1】

【0053】

蛍光プローブの具体例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。

【0054】

【化2】

【0055】

【化3】

【0056】

【化4】

【0057】

【化5】

【0058】

標的タンパク質検出用キットは、蛍光プローブの少なくとも１種と、タンパク質標的核酸アプタマーの少なくとも１種とを含む。キットを構成するタンパク質標的核酸アプタマーは、標的タンパク質に応じて選択される。また、蛍光プローブに含まれる蛍光クエンチャーは、タンパク質標的核酸アプタマーに応じて選択される。

【0059】

標的タンパク質の検出方法は、蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブの存在下で、タンパク質標的核酸アプタマーと標的タンパク質とを接触させることとを含む。蛍光プローブは、蛍光クエンチャーと蛍光発色団との相互作用により蛍光消光された状態となっている。タンパク質標的核酸アプタマーが標的タンパク質を認識して結合すると、タンパク質標的核酸アプタマーに蛍光クエンチャーを認識するステム－ループ構造が形成される。このステム－ループ構造が蛍光クエンチャーと相互作用をすることで、蛍光プローブにおける蛍光発光が回復して、標的タンパク質が蛍光発光により検出される。

【0060】

具体的には、標的タンパク質を含む試料に、蛍光プローブとタンパク質標的核酸アプタマーを添加することで、標的タンパク質の存在位置に蛍光発光が観察される。標的タンパク質を含む試料は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系であっても、細胞を含むインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）系であってもよい。標的タンパク質の検出方法をインビボ系に適用することで、生細胞中における標的タンパク質の存在位置を経時的に検出することが可能になる。

【0061】

標的タンパク質を含む試料に、タンパク質標的核酸アプタマーを添加する方法としては、タンパク質標的核酸アプタマーを直接添加してもよく、タンパク質標的核酸アプタマーを発現するベクター等を添加し、試料中でタンパク質標的核酸アプタマーを発現させてもよい。

【0062】

タンパク質標的核酸アプタマーを発現するベクターは、常法により構築することができる。ベクターは例えば、ｐＳｕｐｅｒ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社）を利用して構築することができる。またベクターは、必要に応じてＵ６プロモーター等のプロモーターを含んでいてもよい。

【0063】

標的タンパク質の検出対象となる細胞は、蛍光顕微鏡で観察可能な状態で培養できるものであればよく、単細胞、２次元又は３次元の細胞集合体、組織等のいずれであってもよい。検出対象となる細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３等の哺乳動物細胞株；生体から採取される初代培養細胞；ＲＥＦ等を挙げることができる。また、標的タンパク質の検出持における細胞の培養条件は、細胞種等に応じて選択される通常の培養条件であってもよく、また目的に応じて選択される培養条件としてもよい。

【実施例】

【0064】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0065】

（合成例１）
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，４７，４７１２－４７１４及びその補充情報（ＥＳＩ；ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ１ｃｃ１０３９３ｈ）に記載された方法に準じて以下に示す蛍光プローブを合成した。合成スキームを以下に示す。

【0066】

【化6】

【0067】

（合成例２）
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，１８５５－１８５８及びそのサポート情報（ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４１０３３９）に記載された方法に準じて、以下に示す構造の蛍光プローブ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １）を合成した。

【0068】

【0069】

（参考例１）
ＢＨＱ１固定化アフィニティレジンの調製
ＥＡＨセファロース４Ｂレジン（ＧＥヘルスケア社製；０．５ｍｌ，５μモルのアミノ基を含む）に、ＢＨＱ－１カルボン酸（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；０．５ｍｇ，１μモル）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ；東京化成社製；２９．５ｍｇ，０．１ｍモル）とトリエチルアミン（０．１ｍモル）をジオキサン－水（３：１，ｖ／ｖ）中で加えた。室温で昼夜振とうした後、レジンを水切りし、ジオキサン－水で洗浄した。レジンの未反応アミノ基をブロックするために、得られたレジンに酢酸（３０ｍｇ，０．５ｍモル）とＤＭＴ－ＭＭ（１４７．４ｍｇ，０．５ｍモル）を加えて昼夜反応させた後、樹脂を水切りし、含水ジオキサン、含水メタノールで洗浄した。得られたレジンは３倍量のメタノール－水（１：３、ｖ／ｖ）中、－２０℃で保存した。

【0070】

（参考例２）
インビトロセレクション法
５’側及び３’側に下表に示すプライマー配列（配列番号１７及び１８）が付加された６０塩基のランダム配列合成オリゴヌクレオチド［５’－ＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣ－Ｎ６０－ＧＴＣＣＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧ－３’］を鋳型として、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、下表に示すプライマー（配列番号１９及び２０）を用いるＰＣＲにより、二重鎖ＤＮＡライブラリーを得た。得られた二重鎖ＤＮＡライブラリーを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて転写して、最初のＲＮＡライブラリーを得た。転写後にＲＱ１ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で処理し、２．５Ｍ酢酸アンモニウム／イソプロパノールで沈殿を得た。得られたＲＮＡをＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア社製）にかけて未反応ＮＴＰを除去し、２．５Ｍ酢酸アンモニウム／イソプロパノールで沈殿させ、遠心してペレット化して、次の選択工程に用いた。選択工程のそれぞれでは、ＲＮＡは、結合用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ｐＨ７．５）中でアニールし、ＢＨＱ１固定化アフィニティレジン上、４℃、３０分インキュベートした。レジンを水切りし、結合用緩衝液で６回洗浄して非結合物を除去した。結合したＲＮＡを、ＢＨＱ－１アミンを飽和させた結合用緩衝液を用いて、それぞれ１０分ずつ３回溶離させた。溶離液を集めてエタノールで沈殿させた。選択されたＲＮＡをＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（タカラバイオ社製）で逆転写して、得られたｃＤＮＡを先のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写して得られたＲＮＡライブラリーを次回の選択工程に供した。１３回の選択工程後、得られたＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって二重鎖ＤＮＡに変換した。得られたＤＮＡを、ＥｃｏＲＩサイト及びＢａｍＨＩサイトでｐＵＣ１９に組み込み、得られたベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。２８クローンが単離され、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて配列決定した。得られたクローンに含まれるＢＨＱ１結合ＲＮＡの例を下表に示す。また、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，４７，４７１２－４７１４の補充情報（ＥＳＩ；ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ１ｃｃ１０３９３ｈ）に記載された方法で測定した解離定数Ｋｄを併せて示す。

【0071】

【表6】

【0072】

【表7】

【0073】

クローンＡ１からＡ４の塩基配列から共通する配列として、下表に示す第１オリゴヌクレオチドのループ部分の配列が選択された。

【表8】

【0074】

（実施例１）
インビトロセレクション法
蛍光クエンチャーを認識するループ部分の配列として配列番号５（下線部）を含み、ステム部分と接続配列を付加した第１オリゴヌクレオチド［ＵＧＧＣＣＵＡＧＡＵＡＡＡＵＵＣＧＧＡＧＣＵＵ］（配列番号２１）に対応するオリゴデオキシヌクレオチドの５’側と３’側のそれぞれに２０塩基のランダム配列及びプライマー領域を付加した合成オリゴヌクレオチド［５’－ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧＣ－Ｎ２０－ＴＧＧＣＣＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴ－Ｎ２０－ＧＣＴＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＴＣ－３’］を得た。この合成オリゴヌクレオチドを鋳型として、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、下表に示すプライマー（配列番号２２及び２３）を用いたＰＣＲにより、二重鎖ＤＮＡライブラリーを得た。得られた二重鎖ＤＮＡライブラリーを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてインビトロ転写して、最初のＲＮＡライブラリーを得た。転写後にＤＮａｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ社製）で処理し、１．２５Ｍ酢酸アンモニウム／イソプロパノールで沈殿を得た。得られたＲＮＡをＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア社製）にかけて未反応ＮＴＰを除去し、０．１３６Ｍ酢酸アンモニウム／イソプロパノールで沈殿させ、遠心してペレット化し、７０％エタノールで洗浄して、次の選択工程に用いた。

【0075】

【表9】

【0076】

【表10】

【0077】

選択工程では、ＲＮＡを結合用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．６）中、８５℃で１０分間加熱した後、氷浴で１０分間冷却した。ＭｇＣｌ_２を１０ｍＭまで加えた後、ＢＨＱ１固定化アフィニティレジン上、４℃、１５分インキュベートした。非結合のＲＮＡを集めて、１０μｇのヒトβ－アクチンを加え、得られた溶液をＢＨＱ１固定化アフィニティレジンと混合し、４℃、３０分間インキュベートした。レジンを水切りし、結合用緩衝液で８回洗浄して非結合物を除去した。結合したＲＮＡを、２μｇの溶離用抗体ＢＡ３Ｒ（Ａｂｃａｍ社製；β－アクチンのＮ末端ペプチドをエピトープペプチドとして作製されたもの）を含む結合用緩衝液を用いて、それぞれ５分ずつ３回溶離させた。溶離液を集めて０．１３６Ｍ酢酸アンモニウム／イソプロパノールで沈殿させた。選択されたＲＮＡをＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ 逆転写酵素（タカラバイオ社製）で逆転写して、得られたｃＤＮＡを先のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＤＮＡを鋳型としてインビトロで転写して得られたＲＮＡを次回の選択工程に供した。１６回の選択工程の繰り返し後、得られたＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって二重鎖ＤＮＡに変換した。得られたＤＮＡを、ＥｃｏＲＩサイト及びＢａｍＨＩサイトでｐＵＣ１９に組み込んでベクターを得た。得られたベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。タンパク質標的ＲＮＡアプタマーとして４００クローンが単離され、配列決定に供した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。得られたタンパク質標的ＲＮＡアプタマーのうちの１つであるＡｐｔ３１１に対応する塩基配列（配列番号２４）を以下に示す。

【0078】

【表11】

【0079】

（実施例２）
溶離用抗体ＢＡ３Ｒに代えて、ＡＣ４０（Ａｂｃａｍ社製；β－アクチンのＣ末端ペプチドをエピトープペプチドとして作製されたもの）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、タンパク質標的ＲＮＡアプタマーを得た。得られたタンパク質標的ＲＮＡアプタマーのうちの１つであるＡｐｔ５６８に対応する塩基配列（配列番号２５）を以下に示す。

【0080】

【表12】

【0081】

（実施例３）
標的タンパク質蛍光標識評価（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１で得られたＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ３１１）によるβ－アクチンの蛍光標識能を以下のようにしてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＲＮＡアプタマー３μＭを８５℃で１０分間変性させ、氷浴上で１０分間冷却した。ついで、５０μＬの緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．６）中でβ－アクチン３μＭと２５℃、３０分間混合した。このＲＮＡ溶液を５０μＬの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ｐＨ７．６）中の蛍光プローブ（conjugate 1；終濃度２μＭ）に加えて室温で１０分インキュベートした。蛍光測定は、励起波長６２０ｎｍ、測定波長６４０ｎｍから８００ｎｍで行った。また、競合実験は、β－アクチンのＮ末端ペプチド（エピトープペプチド）をβ－アクチンの添加時に添加して実施した。このときエピトープペプチドは１％ＤＭＳＯ溶液として０から２０μＭで添加した。結果を図４及び図５に示す。

【0082】

図４に示すように、ＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ３１１）と蛍光プローブ（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ１）は、βアクチンタンパク質存在下で強い蛍光シグナルを示した。また、図５に示すように、ＲＮＡアプタマーと蛍光プローブは、エピトープペプチドの存在下では蛍光シグナルを回復しなかったが、エピトープペプチドにβ－アクチンを共存させると蛍光シグナルの回復が認められた。

【0083】

この結果は、ＲＮＡアプタマーがβ－アクチン上で、蛍光プローブとの結合能を発揮していることを示唆する。また、ＲＮＡアプタマーがβ－アクチンの抗体に対するエピトープペプチド部位を認識しているのではなく、β－アクチンのタンパク質表面を認識していることを示唆する。すなわち、任意の標的タンパク質の立体構造を高選択的に識別して内在性のタンパク質を標識できる革新的タンパク質イメージング法が確立できたことを意味する。

【0084】

（実施例４）
競合実験を、エピトープペプチドに代えて、実施例１のＲＮＡアプタマーの選択時に使用したβアクチンＮ末端抗体ＢＡ３Ｒを用い、抗体の終濃度を３μＭとしたこと以外は、実施例３と同様にして、蛍光標識能を評価した。結果を図６に示す。

【0085】

図６に示すように、ＲＮＡアプタマーのβ－アクチンタンパク質への結合により検出される蛍光シグナルは、β－アクチンＮ末端抗体ＢＡ３Ｒを加えることで完全に失われることが示された。ＲＮＡアプタマーが、先に示したようにβ－アクチン抗体のエピトープペプチドと競合しないにもかかわらず、β－アクチン抗体と競合するという結果は、ＲＮＡアプタマーがβ－アクチンの表面を立体的に捕らえていることを示唆しており、細胞内という分子夾雑下での標的タンパク質への高選択的な標識能が期待できる。

【0086】

（実施例５）
実施例２で選択されたＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ５６８）を用い、競合実験にβ－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０を用いたこと以外は実施例３と同様にして、蛍光標識能を評価した。結果を図７に示す。

【0087】

図７に示すように、実施例２で選択されたＲＮＡアプタマーは、β－アクチン存在下で強い蛍光シグナルを示した。また、ＲＮＡアプタマーのβ－アクチン対する結合能・蛍光標識能は、β－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０を加えることで競合的に失われた。

【0088】

この結果は、実施例２で選択されたＲＮＡアプタマーが、β－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０とβ－アクチンとの結合表面を共有していることを意味する。

【0089】

（実施例６）
実施例１で選択されたＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ３１１）と実施例２で選択されたＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ５６８）を用い、競合実験にβ－アクチンＮ末端抗体ＢＡ３Ｒとβ－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０を用いて、実施例３と同様にして結合交差実験を行った。結果を図８ＡからＤに示す。

【0090】

ＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ３１１）のβ－アクチン蛍光標識能は、β－アクチンＮ末端抗体ＢＡ３Ｒで阻害された（図８Ａ）が、β－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０では影響を受けなかった（図８Ｂ）。一方で、ＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ５６８）のβ－アクチン蛍光標識能は、β－アクチンＮ末端抗体ＢＡ３Ｒを加えても影響を受けず（図８Ｃ）、β－アクチンＣ末端抗体ＡＣ４０で阻害された（図８Ｄ）。

【0091】

これらの結果は、インビトロセレクションで利用する核酸アプタマー溶出用の抗体を適宜選択することで、標的タンパク質の異なる表面を捕らえる核酸アプタマーを取得できることを意味する。生細胞中で、標的タンパク質を蛍光標識することによりタンパク質機能を可視化する場合、タンパク質の活性を維持したり、他のタンパク質との相互作用を妨害したりしないことが重要となる。標的タンパク質の表面を選んで蛍光標識できる本発明の重要性・有用性は極めて高い。

【0092】

（比較例１）
実施例１で選択されたＲＮＡアプタマー（Ａｐｔ３１１）のｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー（配列番号２２と２６、２７と２３）を用いたＰＣＲにより、第１オリゴヌクレオチドの３’側に配置される第３オリゴヌクレオチドが欠損したＲＮＡアプタマー（５’－ａｒｍ）と、５’側に配置される第２オリゴヌクレオチドが欠損したＲＮＡアプタマー（３’－ａｒｍ）とを作製した。

【0093】

得られたＲＮＡアプタマーによるβ－アクチンの蛍光標識能を、実施例３に準じてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。結果を図９に示す。

【0094】

【表13】

【0095】

図９に示すように、ステム－ループ構造を挟んで標的タンパク質を認識する２つのオリゴヌクレオチド部分の一方が欠損することで、蛍光標識能が大きく低下した。

【0096】

（実施例７）
ＨｅＬａ細胞を、１％ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｗｅｓｔ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）中、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータ内に維持した。上記で得られたＲＮＡアプタマー発現プラスミドとｐＳｕｐｅｒ．ｇｆｐをＦｕＧＥＮＥ^（Ｒ）ＨＤ トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、製造者のプロトコールに従ってＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトした。これにより、ＲＮＡアプタマー配列をｐＳｕｐｅｒベクターにクローニングした。

【0097】

（実施例８）
固定化細胞でのタンパク質イメージング
ＨｅＬａ細胞を、ポリ－Ｄ－リジンコートされたガラス底ＶｉｅｗＰｌａｔｅ^（Ｒ）－９６Ｆ マイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に１ウェルあたり７．５×１０^３ｃｅｌｌｓで播種した。２４時間後に４％パラホルムアルデヒド（ムトー純薬社製）を用いて室温１０分で細胞を固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％トリトン－Ｘ１００で１０分透過処理した。細胞を、１０％硫酸デキストラン、２ｍＭバナジル－リボヌクレオシド、０．０１％サーモンＤＮＡ、３０μｇイーストｔＲＮＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＫＣｌを含むアプタマーブロッキング溶液で、室温、１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬの０．３μＭ ＤＮａｓｅ Ｉで、室温、１時間染色した。過剰な溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。次いで１０μＭのＲＮＡａｐｔａｍｅｒと結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．６，１００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中、４℃、１２時間インキュベートし、結合緩衝液を用いて２回洗い流した。細胞を、結合緩衝液５０μＬ中、ＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）で、室温、２０分間染色し、結合緩衝液３０μＬ中、５μＭの蛍光プローブ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １）で室温、５分処理した。過剰の蛍光プローブを結合緩衝液で洗い流し、高感度カメラを備えたＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ^（ＴＭ）ＣＶ１０００共焦点スキャナーボックス（横川電機社製）で細胞を観察した。

【0098】

その結果、Ａｐｔ３１１及びＡｐｔ５６８のいずれの場合でも、蛍光プローブに由来するドット状の蛍光シグナルが観察された。このドット状の蛍光シグナルについて、Ｆアクチンを染色するファロイジンプローブとＧアクチンを染色するＤＮａｓｅ Ｉプローブとの共染色により確認したところ、ＤＮａｓｅ Ｉプローブでの染色と重なることが明らかとなった。すなわち、ＲＮＡアプタマーは、Ｇアクチンに選択的に結合・蛍光標識することが分かった。

【0099】

（実施例９）
生細胞でのタンパク質イメージング
０日目、ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍの４－ウェル Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴＣ ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ細胞培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に１ウェル当たり、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓで播種した。１日目、細胞に、それぞれのＲＮＡアプタマー配列が導入されたｐＳｕｐｅｒベクターとｐＳｕｐｅｒ．ｇｆｐをコトランスフェクトした。２日目、細胞を、完全生育培地（５００μＬ）中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１ｍｇ／ｍＬ，同仁堂社製）で染色し、３７℃で２０分、５％ＣＯ_２インキュベータ中で、インキュベートした。完全生育培地（１００μＬ）中の蛍光プローブ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １）を終濃度５μＭで加えて、３７℃で５分、５％ＣＯ_２インキュベータ中で、インキュベートした。その後、溶液をフレッシュな培地に置換し、ＣＶ１０００で細胞を観察して、生細胞のイメージを得た。経時画像を５分から１時間毎に撮影して取得した。

【0100】

また、以下のようにしてβ－アクチン作用薬の影響を観察した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２と蛍光プローブ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ２）で染色した後、アクチン重合阻害剤（ＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎＢ；４０μＭ）、アクチン重合阻害剤（Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ Ｂ；１μＭ）、又は脱重合阻害剤（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ；０．１４０μＭ）処理した後の画像を、それぞれ１０分間隔で２時間まで、５分間隔で１時間まで、３分間隔で３０分まで取得した。

【0101】

生細胞においても。蛍光プローブに由来するドット状の蛍光シグナルが観察され、時間と共にその蛍光シグナルが移動する様子が１時間にわたって観察された。また、重合阻害剤Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ処理後には、細胞内のドット状の蛍光シグナルは増加することが確認された。一方で、脱重合阻害剤Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅで処理した後は、細胞内のドット状の蛍光シグナルが減少することが確認された。

【0102】

これまでに、生細胞内でのＧアクチンの動態が観察された例は無い。本発明を利用すれば、生細胞内の標的タンパク質をドット状の蛍光シグナルで観察できる。すなわち、細胞内の標的タンパク質量の変化をリアルタイムで観測することが可能になる。また、β－アクチン作用薬を用いた実験から、細胞内の標的タンパク質の濃度変化を視覚的に捉えることが可能であることが示された。このように細胞内の標的タンパク質の濃度変化を視覚的、経時的に捉える方法はなく、本発明の革新性が示されたといえる。

【符号の説明】

【0103】

１０ タンパク質標的ＲＮＡアプタマー
２０ 第１複合体
２３ 標的タンパク質
３０ 第２複合体
４０ 蛍光プローブ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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