特許 7221539 ホウ素中性子捕捉療法の効果を最適化するがん病巣組織評価

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-06

(45)【発行日】2023-02-14

(54)【発明の名称】ホウ素中性子捕捉療法の効果を最適化するがん病巣組織評価

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230207BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230207BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230207BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20230207BHJP

   A61K 33/22 20060101ALN20230207BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20230207BHJP

   A61K 41/00 20200101ALN20230207BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/686 Z

C07K7/06

A61K33/22

A61P35/00

A61K41/00

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2019572306

(86)(22)【出願日】2019-02-08

(86)【国際出願番号】 JP2019005727

(87)【国際公開番号】W WO2019160129

(87)【国際公開日】2019-08-22

【審査請求日】2021-11-17

(31)【優先権主張番号】P 2018025216

(32)【優先日】2018-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504147243

【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】松井 秀樹

(72)【発明者】

【氏名】藤村 篤史

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１３－０８７０９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－０２０３１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第１７／１６４３３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第１７／０２６２７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】GABEL, D. et al.，BSH Accumulates Selectively in GFAP-positive Cells，Research and Development in Neutron Capture Therapy, Proceedings of the International Congress on Ne，2002年，pp.419-423

【文献】DIO MEO, C. et al.，Hyaluronan as Carrier of Carboranes for Tumor Targeting in Boron Neutron Capture Therapy，Biomacromolecules，2007年，Vol.8, No.2，pp.552-559

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測する方法。

【請求項2】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが２～２０アミノ酸である請求項１記載の方法。

【請求項3】

免疫染色を用いてＣＤ４４の発現を調べる、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキット。

【請求項5】

試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に対するがん細胞の感受性を予測する方法。

【請求項6】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが２～２０アミノ酸である請求項５記載の方法。

【請求項7】

免疫染色を用いてＣＤ４４の発現を調べる、請求項５または６記載の方法。

【請求項8】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測する方法であって、試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べ、ＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することを含む方法。

【請求項9】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキット。

【請求項10】

下記工程：
（ａ）試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現、およびＬＡＴ１の発現を調べ、次いで、
（ｂ）ＣＤ４４の発現が、ＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを含むホウ素製剤を選択し、ＬＡＴ１の発現が、ＣＤ４４の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する
を含む、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のためのホウ素製剤の選択方法。

【請求項11】

ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択に用いられるキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段およびＬＡＴ１の発現を調べるための手段を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）の効果を予測する方法およびそのためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＢＮＣＴは、ホウ素を含んだ薬剤（ホウ素薬剤）をがん患者に投与し、がん細胞にホウ素原子を選択的に取り込ませ、中性子を患部に照射することによりがん治療を行う方法である。この方法において、ホウ素薬剤中のホウ素原子が中性子を捕捉し、α粒子（ヘリウム原子核）とリチウム原子核に分裂する。このα粒子のエネルギーによってがん細胞が選択的に破壊される。現在、主にｐ－ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）がホウ素薬剤としてＢＮＣＴに用いられている。しかし、従来のＢＰＡを用いたＢＮＣＴでは十分な成果が得られないことが判明している癌腫や、これまでＢＮＣＴの良い適応とされていなかった癌腫が多く存在する。

【0003】

ＢＰＡの投与効果を予測するために、フッ素の放射性同位体が化学結合されたＦ－ＢＰＡがＢＰＡと同様にＬＡＴ１などのアミノ酸トランスポーターから取り込まれることを利用して、Ｆ－ＢＰＡの組織集積性をＰＥＴによるイメージングにて評価することが行われている（非特許文献１～５等参照）。しかし、ＰＥＴイメージングを行える施設が限られており、薬剤の価格も高いので、手軽に効果を予測することができない。また、ＢＰＡ以外のホウ素薬剤の細胞への取り込みを評価する有効な手段は見つかっていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】ＥＪＮＭＭＩ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ ２０；４（１）：７０．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３５５０－０１４－００７０－２．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４ Ｄｅｃ．

【文献】Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２００４ Ｆｅｂ；４５（２）：３０２－８．

【文献】Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２００５ Ｎｏｖ；４６（１１）：１８５８－６５．

【文献】Ａｎｎ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２０１６ Ｄｅｃ；３０（１０）：７４９－７５５．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ １．

【文献】Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔ．２００９ Ｊｕｌ；６７（７－８ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３４８－５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｐｒａｄｉｓｏ．２００９．０３．０６１．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｒ ２７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来のＢＰＡを用いたＢＮＣＴでは十分な成果が得られないことが判明している癌腫や、これまでＢＮＣＴの良い適応とされていなかった癌腫に対しても有効なＢＮＣＴを行うことが求められている。そのためにはＢＰＡとは異なるホウ素薬剤の効果を簡単に予測するための方法が必要とされている。さらに、癌腫・症例ごとに最適なホウ素製剤を選択することも求められている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとメルカプトウンデカハイドロデカボレート（ＢＳＨ）を含む複合体、および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨについて、これらのホウ素薬剤がＣＤ４４を介した経路でがん細胞に取り込まれること、ならびにＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体が細胞内の翻訳システムを標的化することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測する方法。
（２）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが３～１３アミノ酸である（１）記載の方法。
（３）免疫染色を用いてＣＤ４４の発現を調べる、（１）または（２）記載の方法。
（４）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキット。
（５）試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に対するがん細胞の感受性を予測する方法。
（６）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが２～２０アミノ酸である（５）記載の方法。
（７）免疫染色を用いてＣＤ４４の発現を調べる、（５）または（６）記載の方法。
（８）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性を判定するためのキットであって、抗ＣＤ４４抗体の発現を調べるための手段を含むキット。
（９）試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べることを含む、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体のがん細胞内での滞留時間を予測する方法。
（１０）翻訳関連因子がｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＥＦ２、ｅＲＦ３、ｐＳ６およびＰＡＢＰｃ１からなる群より選択される１種以上のものである、（９）記載の方法。
（１１）ＢＳＨ誘導体が塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨである、（９）または（１０）記載の方法。
（１２）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが２～２０アミノ酸である（１１）記載の方法。
（１３）免疫染色を用いて翻訳関連因子の発現を調べる、（９）～（１２）のいずれか記載の方法。
（１４）ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体のがん細胞内での滞留時間を予測するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキット。
（１５）試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べることを含む、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性を予測する方法。
（１６）翻訳関連因子がｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＥＦ２、ｅＲＦ３、ｐＳ６およびＰＡＢＰｃ１からなる群より選択される１種以上のものである、（１４）記載の方法。
（１７）ＢＳＨ誘導体が塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨである、（１５）または（１６）記載の方法。
（１８）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがアルギニン残基および／またはリジン残基を含み、長さが２～２０アミノ酸である（１７）記載の方法。
（１９）免疫染色を用いて翻訳関連因子の発現を調べる、（１５）～（１８）のいずれか記載の方法。
（２０）ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性を判定するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキット。
（２１）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測する方法であって、試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べ、ＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することを含む方法。
（２２）塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキット。
（２３）ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測する方法であって、試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べ、翻訳関連因子の発現が高いほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することを含む方法。
（２４）ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキット。
（２５）下記工程：
（ａ）試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現、およびＬＡＴ１の発現を調べ、次いで、
（ｂ）ＣＤ４４の発現が、ＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを含むホウ素製剤を選択し、ＬＡＴ１の発現が、ＣＤ４４の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する
を含む、ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択方法。
（２６）ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択に用いられるキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段およびＬＡＴ１の発現を調べるための手段を含むキット。
（２７）下記工程：
（ａ）試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現、およびＬＡＴ１の発現を調べ、次いで、
（ｂ）翻訳関連因子の発現が、ＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、および／またはＢＳＨ誘導体を含むホウ素製剤を選択し、ＬＡＴ１の発現が、翻訳関連因子の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する
を含む、ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択方法。
（２８）ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択に用いられるキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段およびＬＡＴ１の発現を調べるための手段を含むキット。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨをホウ素薬剤として用いた場合のＢＮＣＴの効果を予測するための方法やキットが提供される。そのため、従来のＢＰＡを用いたＢＮＣＴでは十分な成果が得られないことが判明している癌腫や、これまでＢＮＣＴの良い適応とされてこなかった癌腫に対して、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いることで、ＢＮＣＴ適応症例の拡大およびＢＮＣＴ奏功率の向上が可能となる。また、本発明の方法やキットは、特殊な器具や手技を必要とせず、一般的な病院や検査機関で簡単に使用することができる。さらに、本発明によれば、癌腫・症例ごとに最適なホウ素製剤を選択するための方法およびキットが提供される。すなわち、各種ホウ素製剤の初期標的タンパク質の発現様式を調べることで、癌腫・症例ごとに最適なホウ素製剤の組み合わせおよび投与量を決定することができ、ＢＮＣＴの奏効率を向上させることができる。それゆえ、本発明によれば、ＢＮＣＴの可能性を拡大し、症例の取りこぼしを低下させることができ、ＢＮＣＴの個別化医療を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、ＣＤ４４発現がん細胞およびＣＤ４４をノックダウンしたがん細胞に対するＢＳＨ－３Ｒ、ＢＳＨ－１１ＲおよびＢＳＨ／Ａ６Ｋ複合体の取り込みを示す図である。ｓｈＣｏｎｔｒｏｌはＣＤ４４遺伝子をノックダウンしていない悪性脳腫瘍細胞株（コントロール）、ｓｈＣＤ４４＃１およびｓｈＣＤ４４＃２はＣＤ４４遺伝子をノックダウンした悪性脳腫瘍細胞亜株を示す。上段は、ＣＤ４４のノックダウンを確認した結果である。中段は、コントロールおよびＣＤ４４ノックダウン細胞亜株のＢＳＨ抗体による蛍光免疫染色像である。下段は、ＢＳＨ－１１Ｒを用いた場合のコントロールおよびＣＤ４４ノックダウン細胞亜株におけるＢＳＨ抗体染色強度の内訳（相対数）である。

【図2】図２は、ＢＳＨ－１１Ｒががん細胞内の翻訳システムを標的化することを示す免疫沈降パターンである。

【図3】図３は、ＢＳＨ－１１Ｒががん細胞内の翻訳システムを標的化することを示す免疫沈降パターンである。

【図4】図４は、がん細胞をＢＳＨ－１１Ｒにて前処理し、ＢＮＣＴを施行した場合の翻訳システムの破壊を示すグラフである。実線は１８ＳリボソームＲＮＡの相対量の対数、破線はＣＤ４４ ｍＲＮＡ相対量の対数、点線はＴＡＺｍＲＮＡ相対量の対数を示す。

【図5】図５は、各種癌腫瘍検体におけるＬＡＴ１およびＣＤ４４の発現を調べた結果を示す（上段の図）。悪性脳腫瘍についてはタイプごとにＬＡＴ１およびＣＤ４４の発現を調べた（下段の図）。図５において、発現強度が高いほど赤色が強く、発現強度が低いほど緑色が強い。発現強度は中程度であれば黒色で表示される。図中、１本の線は１検体における発現を示す。

【図6】図６は、乳がんのタイプごとにＬＡＴ１およびＣＤ４４の発現を調べた結果を示す。図６において、発現強度が高いほど赤色が強く、発現強度が低いほど緑色が強い。発現強度は中程度であれば黒色で表示される。図中、１本の線は１検体における発現を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、第１の態様において、試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測する方法を提供する。

【0011】

ＣＤ４４は、細胞接着、細胞運動、がん細胞の増殖、浸潤、転移などに関与する細胞膜タンパク質である。本発明者らは、ＣＤ４４が、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨの細胞内導入のための標的であることを初めて見出した。すなわち、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨは、ＣＤ４４の発現が高いがん細胞に導入されやすいことがわかった。したがって、上記方法において、がん細胞のＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率が高いと予測することができる。

【0012】

試料は、がん細胞を含むものであればいずれの試料であってもよい。例えば病理検体、バイオプシー検体であってもよい。あるいは血液などの体液試料であってもよい。

【0013】

がんの種類はいずれの種類であってもよい。例えば、乳癌、膵臓癌、口腔癌などを含む上皮系癌や、脳腫瘍、骨軟部腫瘍などの難治性がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0014】

この態様の方法において、がん細胞のＣＤ４４の発現量を調べる。本明細書において、ＣＤ４４という場合は、ＣＤ４４遺伝子、ＣＤ４４タンパク質のいずれか一方または両方を意味する。ＣＤ４４の発現は公知の方法により調べることができる。例えば、抗ＣＤ４４抗体を用いる免疫染色によりがん細胞のＣＤ４４タンパク質を検出してもよく、あるいはノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲによりがん細胞のＣＤ４４遺伝子の発現を調べてもよい。がん細胞のＣＤ４４の発現を調べる手段・方法はこれらに限定されない。

【0015】

ＣＤ４４の発現を調べるための好ましい方法の例として、抗ＣＤ４４抗体を用いた免疫染色が挙げられる。抗ＣＤ４４抗体は公知の方法により得ることができ、市販もされている。抗ＣＤ４４抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体が好ましい。免疫染色は公知の手法である。蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位元素などの検出可能な標識を付した抗ＣＤ４４抗体を免疫染色に用いることが好ましい。また二次抗体を用いて抗ＣＤ４４抗体を検出してもよい。抗ＣＤ４４抗体はＣＤ４４タンパク質またはその一部に対するものであってもよく、ＣＤ４４タンパク質またはその一部をコードする遺伝子に対するものであってもよい。

【0016】

ノーザンブロット解析またはリアルタイムＰＣＲも、ＣＤ４４の発現を調べるために好ましく用いられる。これらの方法については当業者に公知である。

【0017】

ＣＤ４４の発現が高いかどうかの判定も公知の方法にて行うことができる。例えば、正常対象由来の細胞、または良性腫瘍などの良性疾患の患者由来の細胞におけるＣＤ４４の発現を基準にして、ＣＤ４４の発現が高いかどうかを判定してもよい。あるいは、例えばグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やβ－アクチンなどのハウスキーピング遺伝子またはその産物の発現量を基準にして、ＣＤ４４の発現が高いかどうかを判定してもよい。

【0018】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体は、水溶液中で塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを混合して抱合させることによって得ることができる。所望により、例えば適切なポアサイズを有するエクストルーダーを用いて複合体のサイズを調節してもよい。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体の製造方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１８／０９７３３５Ａ１（参照により本明細書に一体化させる）に記載の方法と同様の方法であってもよい。

【0019】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨは、公知の方法により得ることができる。例えばＢＳＨのＳＨ基を介して塩基性アミノ酸残基を含むペプチドを共有結合させてもよい。

【0020】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドは、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含む。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドを構成するアミノ酸残基は、天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基のいずれであってもよく、Ｌ－体、Ｄ－体のいずれであってもよい。塩基性アミノ酸残基は公知であり、アルギニン残基、リジン残基およびヒスチジン残基が典型例として挙げられる。他の塩基性アミノ酸残基としては、オルニチン残基、シトルリン残基などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい塩基性アミノ酸残基はアルギニン残基およびリジン残基である。したがって、本発明において好ましい塩基性アミノ酸残基を含むペプチドは、アルギニン残基および／またはリジン残基を含むものである。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの長さは特に限定されないが、一般的には２～２０アミノ酸、好ましくは３～１６アミノ酸、より好ましくは４～１４アミノ酸、さらにより好ましくは６～１３アミノ酸である。

【0021】

ＢＳＨと複合体を形成する、塩基性アミノ酸残基を含む好ましいペプチドは、塩基性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基を含むものである。塩基性アミノ酸残基については上で説明したとおりである。疎水性アミノ酸残基も公知であり、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、メチオニン残基、システイン残基が例示されるが、これらに限定されない。

【0022】

ＢＳＨと複合体を形成する、塩基性アミノ酸残基を含むより好ましいペプチドはアルギニン残基および／またはリジン残基を含むものである。ＢＳＨと複合体を形成する、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの例としては（アミノ酸１文字表記）、ＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＲＲ、ＡＡＡＡＡＡＲＲ、ＡＡＡＡＡＡＡＲＲが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＳＨと複合体を形成する、さらに好ましい塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの例としてはＡＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

ＢＳＨと共有結合する、塩基性アミノ酸残基を含む好ましいペプチドは、アルギニン残基および／またはリジン残基を含むものである。好ましくは、ＢＳＨと共有結合する、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの等電点は７よりも高い。あるいはＢＳＨと共有結合する、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドを構成するアミノ酸残基の好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、そのうえさらに好ましくは８０％以上が塩基性アミノ酸残基である。そのような塩基性アミノ酸残基を含む好ましいペプチドの例としては、アルギニンの３～１６量体、リジンの３～１６量体が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＳＨと共有結合する、より好ましい塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの例としてはアルギニンの４～１４量体あるいはリジンの４～１４量体、さらに好ましくはアルギニンの６～１３量体あるいはリジンの６～１３量体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本発明は、第２の態様において、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞への導入効率を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第１の態様の方法を実施することができる。ＣＤ４４の発現を調べるための手段は当業者に公知であり、特に限定されないが、好ましい手段として、抗ＣＤ４４抗体を用いる免疫染色、ノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲを用いるＣＤ４４遺伝子の発現解析などが挙げられる。したがって、上記キットは、抗ＣＤ４４抗体を用いる免疫染色を行うための試薬や器具を含んでいてもよい。あるいは上記キットは、ＣＤ４４の発現を調べるためのノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲに使用する試薬や器具を含んでいてもよい。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0025】

本発明は、第３の態様において、試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べることを含む、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に対するがん細胞の感受性を予測する方法を提供する。

【0026】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、および塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨは、ＣＤ４４の発現が高いがん細胞に導入されやすいので、ＣＤ４４の発現が高いがん細胞は、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体および／または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに対する感受性が高い。したがって、上記方法において、がん細胞のＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性が高いと予測することができる。

【0027】

本発明は、第４の態様において、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性を判定するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第３の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0028】

本発明の第３の態様の方法および第４の態様のキットによれば、患者のがんが塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体および／または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに適した症例であるかどうかを知ることだけでなく、ＢＮＣＴにおける適切なホウ素製剤の種類（例えば塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体および／または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨが有効であるか、ＢＰＡが有効であるか、あるいはそれらの組み合わせが有効であるか等）を最適化すること、およびホウ素製剤の投与量や配合量を最適化することも可能となる。

【0029】

本発明の第３の態様の方法および第４の態様のキットに関するその他の説明については、本発明の第１の態様の方法および第２の態様のキットに関する説明が適用される。

【0030】

本発明は、第５の態様において、試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べることを含む、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体のがん細胞内での滞留時間を予測する方法を提供する。

【0031】

ＢＳＨを含む複合体は、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水結合など共有結合以外の様式によってＢＳＨと他の物質が複合体を形成しているものである。ＢＳＨを含む複合体の例としては、上で説明したような塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体が挙げられるが、これに限定されない。ＢＳＨ誘導体は、ＢＳＨのいずれの原子を介して他の分子が共有結合したものである。ＢＳＨ誘導体の例としては、上で説明したような塩基性アミノ酸残基を含むペプチドがＢＳＨと共有結合したものが挙げられるが、これに限定されない。ＢＳＨを含む複合体の例としては、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体が挙げられるがこれに限定されない。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体の例としては、ＢＳＨ／Ａ６Ｋが挙げられるがこれに限定されない。ＢＳＨ誘導体の例としては、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨが挙げられるがこれに限定されない。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨの例としては、ＢＳＨ－３ＲおよびＢＳＨ－１１Ｒなどが挙げられるがこれらに限定されない。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドについては上で説明したとおりである（ＢＳＨ／Ａ６Ｋ、ＢＳＨ－３Ｒ、ＢＳＨ－１１Ｒについては実施例１参照のこと）。

【0032】

本発明者らは、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨが細胞内の翻訳関連因子を標的化することを初めて見出した。細胞内標的である翻訳関連因子の発現が高いということは、細胞内において翻訳関連因子が豊富であることを意味する。そのため、翻訳関連因子の発現が高いがん細胞において、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨの滞留時間が長くなる。したがって、がん細胞の翻訳関連因子の発現が高いほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体のがん細胞内での滞留時間が長いと予測することができる。

【0033】

この態様の方法において、がん細胞の翻訳関連因子の発現量を調べる。翻訳関連因子は、細胞において遺伝情報の翻訳に関与する因子であり、それらは公知である。本明細書において、翻訳関連因子という場合には、翻訳関連因子をコードする遺伝子およびその産物のいずれか一方または両方をいう。発現を調べる翻訳関連因子は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。翻訳関連因子の例としては、ｅＩＦ４Ａ（含ｅＩＦ４Ａ１）、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇなどの翻訳開始因子、ｅＥＦ２などの翻訳伸長因子、ｅＲＦ３などの翻訳終結因子、ｐＳ６などのリボソームタンパク質、ＰＡＢＰｃ１などのｍＲＮＡ結合因子が挙げられるが、これらに限定されない。この態様の方法において、１種類の翻訳関連因子の発現を調べてもよいが、複数種類の翻訳関連因子の発現を調べることが好ましい。

【0034】

翻訳関連因子のうち、ｅＩＦ４Ａ（含ｅＩＦ４Ａ１）、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＥＦ２、ｅＲＦ３、ｐＳ６などは、ＢＳＨに共有結合した塩基性アミノ酸残基を含むペプチドによって標的化される。ＰＡＢＰｃ１については、ＢＳＨ単体を含めどのような性状のＢＳＨ製剤によっても標的化される。

【0035】

翻訳関連因子の発現は公知の方法により調べることができる。例えば、翻訳関連因子に対する抗体を用いる免疫染色によりがん細胞の翻訳関連因子を検出してもよく、あるいはノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲによりがん細胞の翻訳関連因子の遺伝子の発現を調べてもよい。がん細胞の翻訳関連因子の発現を調べる手段・方法はこれらに限らない。

【0036】

好ましくは、翻訳関連因子に対する抗体を用いた免疫染色により翻訳関連因子の発現を調べる。翻訳関連因子に対する抗体は公知の方法により得ることができ、市販もされている。翻訳関連因子に対する抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体が好ましい。免疫染色は公知の手法である。蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位元素などの検出可能な標識を付した翻訳関連因子に対する抗体を免疫染色に用いることが好ましい。また二次抗体を用いて翻訳関連因子に対する抗体を検出してもよい。翻訳関連因子に対する抗体は、タンパク質としての翻訳関連因子またはその一部に対するものであってもよく、タンパク質としての翻訳関連因子またはその一部をコードする遺伝子に対するものであってもよい。

【0037】

ノーザンブロット解析またはリアルタイムＰＣＲを用いて翻訳関連因子の発現を調べることも好ましい。これらの方法については当業者に公知である。

【0038】

翻訳関連因子の発現が高いかどうかの判定も公知の方法にて行うことができる。例えば、正常対象由来の細胞、または良性腫瘍などの良性疾患の患者由来の細胞の翻訳関連因子の発現を基準にして、翻訳関連因子の発現が高いかどうかを判定してもよい。あるいは、例えばグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やβ－アクチンなどのハウスキーピング遺伝子またはその産物の発現量を基準にして、翻訳関連因子の発現が高いかどうかを判定してもよい。

【0039】

本発明は、第６の態様において、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体のがん細胞内での滞留時間を予測するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第５の態様の方法を実施することができる。ＣＤ４４の発現を調べるための手段は当業者に公知であり、特に限定されないが、好ましい手段として、翻訳関連因子に対する抗体を用いる免疫染色、ノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲを用いる翻訳関連因子遺伝子の発現解析などが挙げられる。したがって、上記キットは、翻訳関連因子に対する抗体を含んでいてもよい。上記キットは、翻訳関連因子に対する抗体を用いる免疫染色を行うための試薬や器具を含んでいてもよい。上記キットは、翻訳関連因子の発現を調べるためのノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲに使用する試薬や器具を含んでいてもよい。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0040】

第５の態様の方法および第６の態様のキットに関するその他の説明については、本発明の第１～第４の態様に係る発明に関する説明が適用される。

【0041】

本発明は、第７の態様において、試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べることを含む、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性を予測する方法を提供する。

【0042】

塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨのがん細胞内での滞留時間が長ければ、細胞内濃度が高く保たれ、がん細胞のＢＮＣＴに対する感受性が高まる。したがって、がん細胞の翻訳関連因子の発現が高いほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対するがん細胞の感受性が高いと予測することができる。

【0043】

本発明は、第８の態様において、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対するがんの感受性を判定するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第７の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0044】

本発明の第７の態様の方法および第８の態様のキットによれば、患者のがんがＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに適した症例であるかどうかを知ることだけでなく、ＢＮＣＴにおける適切なホウ素製剤の種類（例えばＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、および／またはＢＳＨ誘導体が有効であるか、ＢＰＡが有効であるか、あるいはそれらの組み合わせが有効であるか等）を最適化すること、およびホウ素製剤の投与量や配合量を最適化することも可能となる。

【0045】

本発明の第７の態様の方法および第８の態様のキットに関するその他の説明について、本発明の第５の態様の方法および第６の態様のキットに関する説明が適用される。

【0046】

上で述べたように、ＣＤ４４の発現が高いがん細胞ほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨの導入効率が高い。そして、ＣＤ４４の発現が高いがん細胞ほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴに対する感受性が高い。したがって、がん細胞のＣＤ４４の発現を調べ、ＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することができる。したがって、本発明は、第９の態様において、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測する方法であって、試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現を調べ、ＣＤ４４の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することを含む方法を提供する。

【0047】

さらに本発明は、第１０の態様において、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測するためのキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第９の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0048】

上で述べたように、翻訳関連因子の発現が高いがん細胞ほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体の滞留時間が長い。そして、翻訳関連因子の発現が高いがん細胞ほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴに対する感受性が高い。したがって、がん細胞の翻訳関連因子の発現を調べ、翻訳関連因子の発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することができる。したがって、本発明は、第１１の態様において、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測する方法であって、試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現を調べ、翻訳関連因子の発現が高いほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することを含む方法を提供する。

【0049】

さらに本発明は、第１２の態様において、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、またはＢＳＨ誘導体を用いるＢＮＣＴを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性を予測するためのキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第１１の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0050】

第９～第１２の態様に係る本発明の方法およびキットについては、第１～第８の態様に係る方法およびキットに関する説明があてはまる。

【0051】

ＢＰＡは、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ＡＴＢ^０，＋などのアミノ酸トランスポーターを経由して細胞内に取り込まれるため、これらのアミノ酸トランスポーターの発現が高いがん細胞ほど、ＢＰＡが多く取り込まれる。したがって、がん細胞のＢＰＡは、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ＡＴＢ^０，＋などのアミノ酸トランスポーターの発現を調べ、これらのアミノ酸トランスポーターの発現が高いほど、ＢＰＡを用いるＢＮＣＴが奏効する可能性が高いと予測することができる。

【0052】

上で述べたことを総合すると、以下のことが言える。がん細胞におけるＣＤ４４発現が高いほど、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを含むホウ素製剤を選択することが適切である。そして、がん細胞におけるＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ＡＴＢ^０，＋などのアミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１が好ましい）の発現が高いほど、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択することが適切である。したがって、本発明は、第１３の態様において、下記工程：
（ａ）試料中のがん細胞のＣＤ４４の発現、およびＬＡＴ１の発現を調べ、次いで、
（ｂ）ＣＤ４４の発現が、ＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを含むホウ素製剤を選択し、ＬＡＴ１の発現が、ＣＤ４４の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する
を含む、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のためのホウ素製剤の選択方法を提供する。

【0053】

さらに本発明は、第１４の態様において、ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択に用いられるキットであって、ＣＤ４４の発現を調べるための手段およびＬＡＴ１の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第１３の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0054】

また、がん細胞における翻訳関連因子の発現が高いほど、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、および／またはＢＳＨ誘導体を含むホウ素製剤を選択することが適切であるといえる。そして、がん細胞におけるＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ＡＴＢ^０，＋などのアミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１が好ましい）の発現が高いほど、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択することが適切である。したがって、本発明は、第１５の態様において、下記工程：
（ａ）試料中のがん細胞の翻訳関連因子の発現、およびＬＡＴ１の発現を調べ、次いで、
（ｂ）翻訳関連因子の発現が、ＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、および／またはＢＳＨ誘導体を含むホウ素製剤を選択し、ＬＡＴ１の発現が、翻訳関連因子の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する
を含む、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のためのホウ素製剤の選択方法を提供する。

【0055】

さらに本発明は、第１６の態様において、ＢＮＣＴのためのホウ素製剤の選択に用いられるキットであって、翻訳関連因子の発現を調べるための手段およびＬＡＴ１の発現を調べるための手段を含むキットを提供する。該キットを用いて第１５の態様の方法を実施することができる。上記キットには、通常、取扱説明書が添付される。

【0056】

第１３～第１６の態様に係る本発明の方法およびキットにおいて、がん細胞のＣＤ４４、翻訳関連因子、ＬＡＴの発現量を調べる。ＣＤ４４、翻訳関連因子の発現量を調べることについては、すでに説明したとおりである。本明細書において、ＬＡＴ１という場合は、ＬＡＴ１遺伝子、ＬＡＴ１タンパク質のいずれか一方または両方を意味する。ＬＡＴ１の発現は公知の方法により調べることができる。例えば、抗ＬＡＴ１抗体を用いる免疫染色によりがん細胞のＬＡＴ１タンパク質を検出してもよく、あるいはノーザンブロット解析やリアルタイムＰＣＲによりがん細胞のＬＡＴ１遺伝子の発現を調べてもよい。がん細胞のＬＡＴ１の発現を調べる手段・方法はこれらに限定されない。

【0057】

ＬＡＴ１の発現を調べるための好ましい方法の例として、抗ＬＡＴ１抗体を用いた免疫染色が挙げられる。抗ＬＡＴ１抗体は公知の方法により得ることができ、市販もされている。抗ＬＡＴ１抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体が好ましい。免疫染色は公知の手法である。蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位元素などの検出可能な標識を付した抗ＬＡＴ１抗体を免疫染色に用いることが好ましい。また二次抗体を用いて抗ＬＡＴ１抗体を検出してもよい。抗ＬＡＴ１抗体はＬＡＴ１タンパク質またはその一部に対するものであってもよく、ＬＡＴ１タンパク質またはその一部をコードする遺伝子に対するものであってもよい。

【0058】

ＬＡＴ１の発現が高いかどうかの判定も公知の方法にて行うことができる。例えば、正常対象由来の細胞、または良性腫瘍などの良性疾患の患者由来の細胞におけるＬＡＴ１の発現を基準にして、ＬＡＴ１の発現が高いかどうかを判定してもよい。あるいは、例えばグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やβ－アクチンなどのハウスキーピング遺伝子またはその産物の発現量を基準にして、ＬＡＴ１の発現が高いかどうかを判定してもよい。

【0059】

ＬＡＴ１の発現に加えて、あるいはＬＡＴ１の発現に代えて、ＬＡＴ２および／またはＡＴＢ^０，＋などのチロシンやフェニルアラニンに特異的なアミノ酸トランスポーターの発現を調べてもよい。

【0060】

ＣＤ４４の発現とＬＡＴ１の発現を比較する手段、方法は当業者に公知である。例えば、互いに識別可能な標識を付したこれらのタンパク質に対する抗体を用いてもよい。例えばＣＤ４４に対する抗体に緑色蛍光タンパク質を標識として付し、ＬＡＴ１に対する抗体に赤色蛍光タンパク質を標識として付して、視覚的に両者の発現を比較してもよい。また例えば、がん細胞でのＣＤ４４の発現と正常細胞でのＣＤ４４の発現との隔たりと、がん細胞でのＬＡＴ１の発現と正常細胞でのＬＡＴ１の発現との隔たりを、例えば統計学的手法を用いて比較してもよい。翻訳関連因子の発現とＬＡＴ１の発現との比較も同様に行うことができる。

【0061】

第１３～第１６の態様の方法およびキットにおいて、ＣＤ４４の発現がＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを含むホウ素製剤を選択する。翻訳関連因子の発現がＬＡＴ１の発現よりも高い場合に、ＢＳＨ、ＢＳＨを含む複合体、および／またはＢＳＨ誘導体を含むホウ素製剤を選択する。ＬＡＴ１の発現がＣＤ４４の発現よりも高い場合、およびＬＡＴ１の発現が翻訳関連因子の発現よりも高い場合に、ＢＰＡを含むホウ素製剤を選択する。これらの態様の方法およびキットを用いて選択したホウ素製剤を用いてＢＮＣＴを行う際に、選択したホウ素製剤のみを用いてもよく、他のホウ素製剤を併用または配合してもよい。例えば、ＢＰＡを選択した場合は、ＢＰＡのみを用いてもよく、ＢＰＡにＢＳＨを含む複合体を配合したものを用いてもよい。ホウ素製剤の用量、他のホウ素製剤との配合比などは、医師が容易に決定することができる。

【0062】

第１３～第１６の態様に係る本発明の方法およびキットの上記以外の事項については、第１～第１２の態様に係る方法およびキットに関する説明があてはまる。

【0063】

本明細書における用語の意味は、特に断らない限り、医学、薬学、生物学などの分野において通常に理解されている意味と同じである。

【0064】

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解すべきでない。

【実施例1】

【0065】

実施例１．ＣＤ４４発現がん細胞およびＣＤ４４をノックダウンしたがん細胞に対する、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨおよび塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体の取り込み
３個のアルギニンからなるペプチドが共有結合したＢＳＨ（ＢＳＨ－３Ｒという）、１１個のアルギニンからなるペプチドが共有結合したＢＳＨ（ＢＳＨ－１１Ｒという）およびＡｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＬｙｓとＢＳＨを含む複合体（ＢＳＨ／Ａ６Ｋという）の細胞内取込みとＣＤ４４発現との関係を調べるために、まずＣＤ４４を多く発現している悪性脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧに対してＣＤ４４－ｓｈＲＮＡレンチウイルスを導入し、ＣＤ４４のノックダウン細胞亜株を作成した。ノックダウン効率は抗ＣＤ４４抗体（ＣＳＴ社製）を用いてウェスタンブロッティング法にて確認した。その後、ＢＳＨ－１１ＲおよびＢＳＨ／Ａ６Ｋの導入効率とＣＤ４４の発現レベルが相関することを検証するために、前述の方法で作成したＣＤ４４ノックダウン細胞亜株に対して、ＢＳＨに対する抗体を用いて蛍光免疫染色を行うことにより、ＢＳＨ－１１ＲおよびＢＳＨ／Ａ６Ｋの細胞内取込を調べた。使用抗体はマウスモノクローナル抗ＢＳＨ抗体（大阪府立大学 切畑博士ご提供）であった。ＢＳＨ－３ＲおよびＢＳＨ－１１Ｒは化学合成により得た。ＢＳＨ／Ａ６Ｋは国際特許出願公開ＷＯ２０１８／０９７３３５Ａ１（参照により本明細書に一体化させる）に記載の方法により得た。

【0066】

結果を図１に示す。図１の上段に示すウェスタンブロッティングからわかるように、作製した２つの細胞亜株においてＣＤ４４は確実にノックダウンされていた。図１の中段に示すように、ＣＤ４４の発現量が少ないほど、ＢＳＨ－３Ｒ、ＢＳＨ－１１ＲおよびＢＳＨ／Ａ６Ｋの細胞内取込が減少することが確認された（図１の下段は、ＢＳＨ－１１Ｒを用いた場合の結果を棒グラフにしたものである）。換言すれば、ＣＤ４４の発現量が多いほど、ＢＳＨ－３Ｒ、ＢＳＨ－１１ＲおよびＢＳＨ／Ａ６Ｋの細胞内取込が増加することが確認された。

【実施例2】

【0067】

実施例２．塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨによる翻訳関連因子の標的化
悪性脳腫瘍細胞株Ｕ２５１の細胞破砕液にＢＳＨ単体（ＢＳＨという）（５０μＭ）あるいはＢＳＨ－１１Ｒ（５０μＭ）を加え、抗ＢＳＨ抗体（１０μｇ）を用いてＢＳＨおよびＢＳＨ－１１Ｒと結合するタンパク質を免疫沈降法にて探索した。

【0068】

結果を図２に示す。ＢＳＨと比較してＢＳＨ－１１Ｒで翻訳関連因子がより多く共沈されたことから、ＢＳＨ－１１Ｒのペプチド部分（１１Ｒ）が翻訳関連因子への結合に必要であることがわかった。結合様式は、翻訳関連因子によってｍＲＮＡ非依存的なものと、ｍＲＮＡ依存的なものがあることもわかった。

【0069】

ＢＳＨ－１１Ｒと翻訳関連因子との結合が直接的なものであるか間接的なものであるかを検討するために、ｓｈＲＮＡレンチウイルスにより翻訳関連因子のノックダウンを行った悪性脳腫瘍細胞株Ｕ２５１の亜株を準備した。それらの細胞破砕液にＢＳＨ－１１Ｒ（５０μＭ）を加え、抗ＢＳＨ抗体（１０μｇ）を用いてＢＳＨ－１１Ｒと結合する翻訳関連因子を解析した。

【0070】

結果を図３に示す。ＢＳＨ－１１ＲはｅＩＦ４ＡおよびｅＲＦ３と直接的に（ＲＮＡを介さずに）結合し、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４ＧはｅＩＦ４Ａを介してＢＳＨ－１１Ｒと間接的に結合することがわかった。また、ＰＡＢＰｃ１は、図２の結果と合わせると、ＲＮＡ依存的にＢＳＨに結合すると結論づけられた。

【実施例3】

【0071】

実施例３．塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを用いるＢＮＣＴ
ＢＳＨ－１１Ｒは翻訳関連因子と結合するため、翻訳機構を選択的に標的化できると考えられた。そこで、ＢＳＨ－１１Ｒを用いてＢＮＣＴを行うこととした。悪性脳腫瘍細胞株Ｕ８７ΔＥＧＦＲを１００μＭのＢＳＨ－１１Ｒで前処理した（照射２４時間前）。照射当日にトリプシンにて当該細胞を剥離し、１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの分量でチューブに分注したものを、加速器（於 放射線医学研究所）を用いて中性子線を照射した。照射時間は０分、１５分、４５分、６０分であり、実質的なＧｙ（グレイ）はいずれも１Ｇｙ以下と推定・算出された。

【0072】

照射後の細胞を回収し、ＲＮＡ抽出を行ったのち等量のＲＮＡ（１０００ｎｇ）を鋳型にｃＤＮＡを作成し定量ＰＣＲを行ったところ、図４に示すように、中性子線の照射時間に応じて１８Ｓ リボソームＲＮＡおよびｍＲＮＡの割合が顕著に低下することがわかった。コントロール実験として行ったＸ線による高線量照射（１０Ｇｙ）ではそうした変化は観察されなかった。これらのことから、ＢＳＨ－１１Ｒを用いたＢＮＣＴは極めて効率的に翻訳機構を破壊することが可能であると判断できた。

【実施例4】

【0073】

実施例４．各種癌腫におけるＬＡＴ１およびＣＤ４４の発現レベルの比較
メラノーマ、頭頸部がん、膵がん、悪性脳腫瘍、乳がんの検体（ＴＣＧＡデータベースに登録されている臨床検体）についてＣＤ４４およびＬＡＴ１の発現強度を免疫染色法によって調べた結果を図５に示す。

【0074】

メラノーマおよび頭頸部がんにおいては、ＣＤ４４、ＬＡＴ１ともに高発現である症例が多かった。これらの結果から、メラノーマおよび頭頸部がんのＢＮＣＴにおいては、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨ、およびＢＰＡのいずれを選択しても奏効する症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨと、ＢＰＡとを併用した場合に効果的である症例が多いと考えられた。

【0075】

膵がんにおいては、ＣＤ４４が高発現ないし中程度の発現である症例が多かった。ＬＡＴ１については、中程度の発現である症例が高発現である症例よりも多かった。これらの結果から、膵がんのＢＮＣＴにおいては、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを選択して奏効する症例が多く、ＢＰＡを選択した場合に一定の奏効が得られる症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドと、ＢＰＡを併用する場合は、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの配合比を多くすると効果的である症例が多いと考えられた。

【0076】

乳がんにおいては、ＣＤ４４、ＬＡＴ１ともに中程度の発現である症例が多かった。これらの結果から、乳がんのＢＮＣＴにおいては、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨ、およびＢＰＡのいずれを選択しても一定の奏効が期待される症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨと、ＢＰＡとを併用した場合も一定の奏効が期待される症例が多いと考えられた。

【0077】

悪性脳腫瘍においては、ＣＤ４４が中程度である症例が多く、低発現である症例もかなり多かった（高発現である症例は少なかった）。ＬＡＴ１については中程度の発現である症例が多かった。これらの結果から、悪性脳腫瘍のＢＮＣＴにおいては、ＢＰＡを選択した場合に一定の奏効が期待される症例が多いと考えられた。塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを選択した場合は、ＢＰＡを選択した場合に比べて奏効が期待できる症例が少ないと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドと、ＢＰＡを併用する場合は、ＢＰＡの配合比を多くすると効果的である症例が多いと考えられた。

【0078】

悪性脳腫瘍についてタイプ別に検討を行った。結果を図５の下欄に示す。間葉系脳腫瘍および古典的脳腫瘍の場合は、ＬＡＴ１よりもＣＤ４４のほうが高発現である症例が多く（図中矢印で示す）、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨを選択して奏効する症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドと、ＢＰＡを併用する場合は、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの配合比を多くすると効果的である症例が多いと考えられた。神経脳腫瘍の場合は、ＣＤ４４、ＬＡＴ１ともに中程度の発現である症例が多かった。前神経脳腫瘍の場合は、ＣＤ４４よりもＬＡＴ１のほうが高発現である症例が多く（図中矢印で示す）、ＢＰＡを選択して奏効する症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨと、ＢＰＡを併用する場合は、ＢＰＡの配合比を多くすると効果的である症例が多いと考えられた。

【0079】

乳がんについてもタイプ別に検討を行った。結果を図６に示す。ＨＥＲ２、エストロゲン受容体およびプロゲストロン受容体のすべてが陰性である最も悪性度の高い症例では、ＬＡＴ１のほうがＣＤ４４よりも高発現である症例が多く、ＢＰＡを選択して奏効する症例が多いと考えられた。また、塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体、または塩基性アミノ酸残基を含むペプチドが共有結合したＢＳＨと、ＢＰＡを併用する場合は、ＢＰＡの配合比を多くすると効果的である症例が多いと考えられた。

【0080】

癌腫ごとに全般的なＣＤ４４およびＬＡＴ１の発現を調べてもよく、症例ごとにＣＤ４４およびＬＡＴ１の発現を解析してもよい。症例ごとの解析によって、ＢＮＣＴの個別化医療を実現することができる。

【0081】

以上の結果から、本発明の方法やキットを用いれば、癌腫・症例ごとに最適なホウ素製剤の選択、組み合わせ、配合比を決定することができ、これまでＰＢＡを用いるＢＮＣＴの良い適応とされてこなかった癌腫・症例に対しても、ＢＮＣＴの可能性を拡大することができると言える。

【0082】

本願は、２０１８年２月１５日出願の日本国特許出願第２０１８－０２５２１６号に対する優先権の利益を主張するものである。当該日本国出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。また、本明細書にて引用された文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【産業上の利用可能性】

【0083】

本発明は、がんの検査や研究、抗がん剤の研究、開発、製造などにおいて利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】