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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-06
(45)【発行日】2023-02-14
(54)【発明の名称】細胞膜透過ペプチドおよびこれを含む細胞内伝達体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/15 20060101AFI20230207BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230207BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230207BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230207BHJP
【ＦＩ】
C07K14/15 ZNA
C07K19/00
C12N15/11 Z
C12N15/62 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2019529912
(86)(22)【出願日】2017-12-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-06
(86)【国際出願番号】 KR2017014897
(87)【国際公開番号】W WO2018111051
(87)【国際公開日】2018-06-21
【審査請求日】2019-06-03
【審判番号】
【審判請求日】2021-03-09
(31)【優先権主張番号】10-2016-0172548
(32)【優先日】2016-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0173642
(32)【優先日】2017-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517445950
【氏名又は名称】アヴィックスジェン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】イ・ヨン・ペク
(72)【発明者】
【氏名】ミン・ジョン・キム
【合議体】
【審判長】長井 啓子
【審判官】宮岡 真衣
【審判官】高堀 栄二
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００８／００３９５２８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１９８６４８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５１２７８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／００９９２７６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ＰＯＯＮ Ｄ．Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，Ｖｏｌ．７０ Ｎｏ．１０，ｐｐ．６６０７－６６１６
【文献】Ｈ．ｄｅ ＲＯＣＱＵＩＧＮＹ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ＭｏＭｕＬＶ ａｎｄ ＨＩＶ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｌｆｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｊｕｎｅ １６－２１，１９９１，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， Ｕ．Ｓ．Ａ．／ｅｄ． ｂｙ Ｊｏｈｎ Ａ． Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅａｎ Ｅ． Ｒｉｖｉｅｒ，１９９２，ｐｐ．７４５－７４６
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C07K 1/00-19/00
C12N 1/00-15/90
C12P 1/00-41/00
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１０～配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチドのポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体。
【請求項2】
レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のＮＣペプチド末端又はその断片末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体であって、前記ＮＣペプチド又はその断片が、配列番号１０～配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチドを含む、細胞内伝達体。
【請求項3】
前記細胞内輸送対象のカーゴは、化学物質、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質である、請求項１または２に記載の細胞内伝達体。
【請求項4】
前記レトロウイルスは、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）およびＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）からなる群より選択される、請求項２に記載の細胞内伝達体。
【請求項5】
前記ＮＣペプチドは、配列番号１２～配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項２に記載の細胞内伝達体。
【請求項6】
請求項１に記載の細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法に使用するための、請求項１に記載の細胞内伝達体を含む組成物。
【請求項7】
請求項２に記載のレトロウイルスのＮＣペプチド末端又はその断片末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法（但し、ヒトの生体内における方法を除く）。
【請求項8】
前記細胞内輸送対象のカーゴは、化学物質、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記レトロウイルスは、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）およびＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記ＮＣペプチドは、配列番号１２～配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞膜透過ペプチドおよびこれを含む細胞内伝達体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）のヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、以下、「ＮＣ」と称する）は、ウイルス個体を形成するための構造的な役割だけでなく、ウイルスの生活環（ｖｉｒａｌ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ）において機能的にも重要な役割をし、その機能は以下のとおりである。第１に、ＮＣペプチドは、ウイルスのゲノムのカプシド形成（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に関与する。このような機能は独特なＣＣＨＣモチーフからなる２個のジンクフィンガードメイン(ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ)に起因し、前記ドメインは全てのレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）において高い保存性を示し、ＨＩＶ ＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）と感染性ウイルス生産に必須的なものとして知られている。第２に、ＮＣペプチドはウイルスの逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＲＴ）の間、ｔＲＮＡプライマーアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）と鎖転移（ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を促進することが知られており、これよりＮＣペプチドがウイルス複製（ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に重要な機能をするということが分かる。第３に、ＮＣペプチドは、ウイルスの生活環に必要な核酸シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）活性を有する。最近では、ウイルスＤＮＡが宿主細胞染色体に挿入される時にも、ＮＣペプチドが所定の役割を担当すると報告されている。
【0003】
一方、細胞透過ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＰＰ）は、約１０～３０個程度の短いペプチドからなる細胞膜透過性ペプチドであって、大半はＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）やＭＴＳ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から誘導される。外部物質の一般的な細胞内流入経路とは異なり、ＣＰＰは、細胞膜を損傷させることなく細胞内に移動し、細胞膜を通過できないものとして知られているＤＮＡやタンパク質までも細胞内に伝達できることが知られている。ＣＰＰとして最もよく知られたペプチドにはＴａｔペプチドがあり、これは、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）から誘導され、現在、細胞治療剤や診断試薬のような様々な方面で応用されて用いられている。また、ホメオドメイン転写因子のＤＮＡ結合ドメインから誘導されたペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）は、人体に有用なタンパク質を皮膚に伝達する用途として用いられている。トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）は、ガラニン（ｇａｌａｎｉｎ）という神経ペプチドとマストパラン（ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）というスズメバチの毒から分離したペプチドのうち一部を融合して作ったペプチドであって、細胞死を誘導させるペプチドと結合させて細胞死誘導ペプチドとして用いられている。
【0004】
本発明者らは、ＨＩＶ ＮＣペプチドの生理学的活性を研究している最中、ＮＣペプチドが細胞膜透過活性を有しているのを確認し、それにより細胞内物質伝達が可能なドラッグデリバリーシステム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）として利用できるのを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の一つの目的は、次の一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチドを提供することにある：
［一般式Ｉ］
Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ
前記一般式において、Ｘａａ１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ３およびＸａａ４は互いに独立にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択され、
Ｘａａ６およびＸａａ７は互いに独立にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択され、
Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
［一般式Ｉ］
Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ
前記一般式において、Ｘａａ１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ３およびＸａａ４は互いに独立にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択され、
Ｘａａ６およびＸａａ７は互いに独立にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択され、
Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0006】
本発明の他の目的は、前記細胞透過ペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体を提供することにある。
【0007】
本発明のまた他の目的は、前記細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法を提供することにある。
【0008】
本発明のまた他の目的は、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のＮＣペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を提供することにある。
【0009】
本発明のまた他の目的は、レトロウイルスのＮＣペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明の一様態は、次の一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチドを提供する：
［一般式Ｉ］
Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ
前記一般式において、Ｘａａ１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ３およびＸａａ４は互いに独立にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択され、
Ｘａａ６およびＸａａ７は互いに独立にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択され、
Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
［一般式Ｉ］
Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ
前記一般式において、Ｘａａ１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ３およびＸａａ４は互いに独立にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択され、
Ｘａａ６およびＸａａ７は互いに独立にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択され、
Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0011】
本発明の他の様態は、前記細胞透過ペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体を提供することにある。
【0012】
本明細書において、用語、「細胞内伝達体」は、細胞膜を透過して組織まで浸透できる伝達体を意味する。
【0013】
本明細書において、用語、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味し、アミノ酸残基４～７０個、好ましくは４～４０個、より好ましくは４～３０個、最も好ましくは４～２０個からなっている。
【0014】
前記一般式Ｉで表されるポリペプチドは様々なレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＦＩＶ（Ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＥＩＶ（Ｅｑｕｉｎｅ ｉｍｍｕｎｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ））のＮＣペプチド内に存在するジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）の保存配列（Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｈｉｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｃｙｓ）を示すものであり、本発明者らは実験により前記配列を含むポリペプチドが細胞膜透過活性に優れるのを確認し、それにより細胞内物質伝達が可能なドラッグデリバリーシステムとして利用できるということを明らかにした。
【0015】
本発明の一具体例によれば、一般式Ｉ（配列番号１６）において、前記Ｘａａ１は、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＡｌａおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0016】
一具体例によれば、前記Ｘａａ２は、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、塩基性アミノ酸であるＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＬｅｕおよびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0017】
また、一具体例によれば、前記Ｘａａ３およびＸａａ４は、互いに独立に、親水性アミノ酸であるＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ３はＧｌｙ、ＡｓｐおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0018】
また、本発明の一具体例によれば、前記Ｘａａ５は、極性アミノ酸を除いたＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＩｌｅおよびＭｅｔからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0019】
また、一具体例によれば、前記Ｘａａ６およびＸａａ７は、互いに独立に、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎからなる群より選択され、より好ましくは、Ｘａａ６はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ７はＡｌａ、ＭｅｔおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。
【0020】
また、一具体例によれば、前記Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであるアミノ酸であり、Ｘａａ９は酸性アミノ酸であるＡｓｐ、Ｇｌｕ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎである。
【0021】
本発明の一具体例によれば、前記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、レトロウイルスのジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）ドメインを含むポリペプチドとして、配列番号１７～配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されてもよい。
【0022】
本発明の他の様態は、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のＮＣペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を提供する。
【0023】
本明細書において、用語、「ＮＣペプチド」はレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）を構成するポリペプチドを意味し、前記ポリペプチドはレトロウイルスのゲノムＲＮＡに強く結合してリボ核タンパク質コア複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するものとして知られている。
【0024】
本明細書において、用語、「細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）」はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および／またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）上で輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）を細胞内に輸送できる能力を有したペプチドを意味し、細胞透過ペプチドはそのものでリン脂質二重膜の細胞膜を通過できるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【0025】
本発明の一具体例によれば、前記レトロウイルスはＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）およびＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）からなる群より選択されてもよく、最も好ましくはＨＩＶであってもよい。
【0026】
本明細書において、用語、「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」は、細胞膜透過ペプチドとして作用するＮＣペプチドに結合して細胞内に輸送される化学物質、小さい分子化合物、ポリペプチド、核酸などを意味する。
【0027】
本発明において、一般式Ｉで表されるペプチドまたはレトロウイルスのＮＣペプチド末端に結合される物質、すなわち、カーゴ（ｃａｒｇｏ）になりうる物質は様々であり、例えば、タンパク質（ポリペプチド）、核酸（ポリヌクレオチド）、化学物質（薬物）などを含むが、これらに限定されるものではない。
【0028】
例えば、薬物、造影剤（例えば、Ｔ１造影剤、超常磁性物質のようなＴ２造影剤、放射性同位元素など）、蛍光マーカ、染色物質などであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記ポリペプチドは、２またはそれ以上の残基からなるアミノ酸の重合体であって、ペプチドおよびタンパク質を含む。ポリペプチドは、例えば、細胞不死に関与するタンパク質（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびテロメラーゼ）、抗アポトーシスタンパク質（例えば、突然変異ｐ５３およびＢｃｌｘＬ）、抗体、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ、ｍｙｃ、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７およびアデノウイルスＥｌａ）、細胞周期調節タンパク質（例えば、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ）または酵素（例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）であってもよいが、これらに限定されるものではない。また、核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよく、核酸のシーケンスは、暗号化部位配列または非暗号化部位配列（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）であってもよい。核酸カーゴとしてのヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（例えば、アデノシン、シトシン、グアニン、チミン、イノシンおよびウラシル）またはアナログ（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）であってもよい。例えば、核酸カーゴは、ホスホロチオエートヌクレオチドからなるアンチセンスシーケンスまたはＲＮＡｉであってもよい。
【0029】
本発明の一具体例によれば、本発明の一般式Ｉで表されるペプチドまたはＮＣペプチドに結合された物質は、細胞膜を非常に高い効率で透過し、細胞内で細胞質および核に残留するようになる。
【0030】
本発明の一具体例によれば、前記ＮＣペプチドは、一つ以上のジンクフィンガードメインを有してもよく、２個のジンクフィンガードメインを含むことが好ましい。一具体例によれば、前記ＮＣペプチドは、配列番号１２～配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されてもよい。
【0031】
本発明のまた他の様態は、前記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体、またはレトロウイルスのＮＣペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法を提供する。
【0032】
本発明の方法は前記細胞内伝達体を用いるため、両者に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0033】
一方、カーゴが結合された一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはカーゴが結合されたＮＣペプチドがインビトロまたはインビボで細胞膜と接触できる機会が付与されると、ペプチドと結合されたカーゴは細胞内に輸送される。前記細胞内伝達体と細胞膜の接触において特に求められる条件、例えば、制限的な時間、温度および濃度などの条件はなく、当業界で細胞膜透過に適用される一般的な条件で実施できる。
【発明の効果】
【0034】
本発明の一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む細胞内伝達体またはＮＣペプチドを含む細胞内伝達体は、既存のウイルスに由来したペプチドと比較する時、低い濃度でも効率的に物質を細胞内に伝達できるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】ＮＣ－ＥＧＦＰタンパク質の発現有無をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果を示す。
【図2】種々のレトロウイルスのＮＣペプチド配列およびＦＩＴＣが結合された種々のＮＣペプチドの細胞膜透過活性を比較した結果を示す。赤色ボックスはジンクフィンガードメインを示す。
【図4】ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過有無を免疫染色法により確認した結果を示す。
【図5】図５ａ～図５ｅはＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性を濃度依存的にＲＡＷ２６４．７（図５ａ）、ＴＨＰ－１（図５ｂ）、ＣＥＭ（図５ｃ）、ＭＤＣＫ（図５ｄ）および２９３ＦＴ（図５ｅ）において確認した結果を示す。
【図7】ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチド、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチド、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチドおよびＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドの細胞膜透過活性を比較した結果を示す。
【図8】ＦＩＴＣ－１３ＮＣ３５ペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認した結果を示す。
【図9】ＦＩＴＣ－２９ＮＣ５０ペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認した結果を示す。
【図10】ＨＩＶ－ＮＣペプチドの生体内組織への浸透後の組織細胞における分布有無を確認した結果を示す。各写真において、スケールバー（ｓｃａｌｅ ｂａｒ）は５０μｍを示す。
【図11】ＨＩＶ－ＮＣペプチドの眼球組織への浸透後の網膜細胞における分布有無を確認した結果を示す：ＧＣＬは神経節細胞層（ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ）、ＩＮＬは内顆粒層（ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）を意味し、ＯＮＬは外顆粒層（ｏｕｔｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）を意味する。
【図12】ＨＩＶ－ＮＣペプチドと結合されたヘキサペプチドの細胞膜透過活性を示す結果を示す。
【図13】ＨＩＶ－ＮＣペプチドと結合されたＲＮＡの細胞膜透過活性を示す結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
以下では一つ以上の具体例について実施例を通じてより詳しく説明する。但し、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0037】
実験方法
１．ＮＣペプチド発現のための組み換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
ＮＣペプチドとＥＧＦＰが結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された組み換えタンパク質の発現有無を確認し、タンパク質を精製するために次のように組み換えベクターを作製した。
１．ＮＣペプチド発現のための組み換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
ＮＣペプチドとＥＧＦＰが結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された組み換えタンパク質の発現有無を確認し、タンパク質を精製するために次のように組み換えベクターを作製した。
【0038】
ＮＣペプチド遺伝子のＮ－末端に制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢ、米国）であるＮｄｅＩ、Ｃ－末端にＢｓｐＥＩが作用できる制限酵素認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を追加するために制限酵素認識配列を含むプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣＲと称する）を行った。ＰＣＲに用いたプライマー配列（配列番号１および配列番号２）とＰＣＲ条件を下記の表１および表２に示す。
【0039】
【表1】
【0040】
【表2】
【0041】
次に、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のＮ－末端にＢｓｐＥＩ、Ｃ－末端にＨｉｎｄＩＩＩが作用できる制限酵素認識配列を追加するために前記表２と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、プライマーとしては、下記の表３に示す配列番号３および配列番号４のプライマーを用いた。
【0042】
【表3】
【0043】
上記のように制限酵素認識配列を追加したＮＣペプチド遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子を１６℃で１２時間反応させて結合（ライゲーション、ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた。結合されたＮＣペプチド－ＥＧＦＰ遺伝子（以下、「ＮＣ－ＥＧＦＰ遺伝子」と称する）に対しＰＣＲを行って（配列番号１、２、３および４のプライマーを利用）ＮＣ－ＥＦＧＰ遺伝子の全体配列を得た。ＮＣ－ＥＧＦＰ遺伝子結合反応条件を下記の表４に示す。
【0044】
【表4】
【0045】
その後、ｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）ベクターをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素で切断した後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて製造会社のプロトコルに従ってベクター断片を分離した。制限酵素反応は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ＃２を用いて３７℃で２時間行った。前記分離したｐＥＴ２１ａベクター断片とＮＣ－ＥＧＦＰ遺伝子を結合させた後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて組み換えベクターを分離し、ＮＣ－ＥＧＦＰ遺伝子が挿入された組み換えベクターをｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰと命名した。
【0046】
ｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターを複製するために大腸菌ＤＨ５αに前記ベクターを形質転換し、ＬＢ液体培地でＯＤ０．５～０．６になるまで３７℃で振とう培養（ｓｈａｋｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）をした。培養が終わった後、培養液を遠心分離して大腸菌ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を回収し、ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社のプロトコルに従って回収した大腸菌ペレットからｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターを分離した。分離したｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターは、ＵＶ法を用いて濃度を定量した後に確認した。
【0047】
２．ＮＣ－ＥＧＦＰ発現および分離、精製
上記で作製されたｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターのタンパク質発現有無を確認するために下記のように実験した。
上記で作製されたｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターのタンパク質発現有無を確認するために下記のように実験した。
【0048】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）にｐＥＴ２１ａ ＮＣ－ＥＧＦＰベクターを形質転換させ、ＬＢプレートに塗抹して３７℃で１２時間培養した。１２時間後、形成されたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をＬＢ液体培地に接種し、３７℃でさらに培養した。約１２時間後、ＯＤ０．５～０．６に達した培養液をＬＢ液体培地２５０ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ０．５～０．６になるように３時間～４時間培養した。培養液のＯＤが０．５～０．６になった時、培養液にＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）０．５ｍＭを添加し、２５℃で２４時間培養した。２４時間後、培養液を遠心分離してＢＬ２１ペレットを得、得たペレットを溶解バッファ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅおよびｐＨ８．０）に懸濁させた後、超音波破砕機を用いて大腸菌を破砕（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ４０％）した。
【0049】
前記大腸菌破砕物を遠心分離して上清と沈殿物に分離し、上清を０．４５μｍフィルタを用いてチューブに充填した。チューブに充填された上清をＮｉ－ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）レジン（ｒｅｓｉｎ）が充填されたカラムに入れてタンパク質とレジンを互いに結合させた。その後、レジンに結合しない外来タンパク質を除去するために洗浄バッファ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅおよびｐＨ８．０）を添加してレジンを洗浄した。イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が添加されたバッファ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅおよびｐＨ８．０）を用いて移動相勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）で最終タンパク質を得た。次に、イミダゾールを除去するために得たタンパク質をメンブレインチューブに入れ、イミダゾールが含まれていないバッファ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ７．２）を用いて浸透圧作用によるバッファ交換を行った。最後に、イミダゾールが含まれていないバッファに溶解しているタンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙにより濃度を測定してＮＣ－ＥＧＦＰタンパク質発現を確認した。その結果、ＮＣ遺伝子配列に他の配列が結合してもＮＣペプチドの発現には影響がないのを確認した。
【0050】
図１は、ＮＣ－ＥＧＦＰタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果を示すものであり、約３５ｋＤａ大きさのＮＣ－ＥＧＦＰタンパク質が発現されたのを確認することができる。
【0051】
３．ＮＣペプチドの細胞膜透過性の分析
３－１．細胞培養
ＨｅＬａ、ＲＡＷ２６４．７および２９３ＦＴ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ培地で培養し、ＭＤＣＫ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＥＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で培養した。ＴＨＰ－１およびＣＥＭ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で培養した。全ての細胞は、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿恒温器で培養した。
３－１．細胞培養
ＨｅＬａ、ＲＡＷ２６４．７および２９３ＦＴ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ培地で培養し、ＭＤＣＫ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＥＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で培養した。ＴＨＰ－１およびＣＥＭ細胞は、１０％ ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で培養した。全ての細胞は、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿恒温器で培養した。
【0052】
３－２．ＮＣペプチド細胞膜透過性の分析－ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）
前記３－１で培養された様々な種類の細胞を１×１０６細胞／ウェルの密度で６－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養してプレートに細胞を付着させた。その後、ペプチド濃度（０．５、１．０、２．５、５．０および１０μＭ）またはペプチド処理時間に差をおいて、ＦＩＴＣが結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたＮＣペプチド（以下、「ＦＩＴＣ－ＮＣペプチド」と称する）、ＥＧＦＰが結合されたＮＣペプチド（以下、「ＮＣ－ＥＧＦＰペプチド」と称する）またはＥＧＦＰが結合されたＴａｔペプチド（以下、「Ｔａｔ－ＥＧＦＰペプチド」と称する）を各々細胞に処理した。前記ペプチドは、ｃｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ（中国）およびＬｉｆｅ ｔｅｉｎ（米国）に注文して作製した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）－ＥＤＴＡで細胞を分離した後、２％ ＦＢＳ／０．１％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が含まれたＰＢＳに懸濁させた。前記懸濁液を２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞ペレットを得、得た細胞を３．７％ ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で２０分間固定した。その後、２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞ペレットを得、ＰＢＳで２回洗浄した後、２％ ＦＢＳおよび０．１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳに懸濁させた。蛍光活性化セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により分析した。
前記３－１で培養された様々な種類の細胞を１×１０６細胞／ウェルの密度で６－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養してプレートに細胞を付着させた。その後、ペプチド濃度（０．５、１．０、２．５、５．０および１０μＭ）またはペプチド処理時間に差をおいて、ＦＩＴＣが結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたＮＣペプチド（以下、「ＦＩＴＣ－ＮＣペプチド」と称する）、ＥＧＦＰが結合されたＮＣペプチド（以下、「ＮＣ－ＥＧＦＰペプチド」と称する）またはＥＧＦＰが結合されたＴａｔペプチド（以下、「Ｔａｔ－ＥＧＦＰペプチド」と称する）を各々細胞に処理した。前記ペプチドは、ｃｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ（中国）およびＬｉｆｅ ｔｅｉｎ（米国）に注文して作製した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）－ＥＤＴＡで細胞を分離した後、２％ ＦＢＳ／０．１％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が含まれたＰＢＳに懸濁させた。前記懸濁液を２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞ペレットを得、得た細胞を３．７％ ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で２０分間固定した。その後、２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞ペレットを得、ＰＢＳで２回洗浄した後、２％ ＦＢＳおよび０．１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳに懸濁させた。蛍光活性化セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により分析した。
【0053】
３－３．ＮＣペプチド細胞膜透過性の分析－免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）
ＨｅＬａ細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度でガラスが入った１２－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をガラスに付着させた。その後、ＦＩＴＣ－ＮＣペプチドを３ｍＭ濃度で細胞に３時間処理した。３時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３．７％ ホルムアルデヒドで２０分間細胞を固定させ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳを処理して細胞膜透過性を増加させた。その後、３％ ＢＳＡで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた後、ラミン（ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）と常温で２時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、Ｃｙ３二次抗体（Ｃｙ３－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で１０分間染色した。ＨｅＬａ細胞が付着したガラスを取り外してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＬＳＭ ７００、Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
ＨｅＬａ細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度でガラスが入った１２－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をガラスに付着させた。その後、ＦＩＴＣ－ＮＣペプチドを３ｍＭ濃度で細胞に３時間処理した。３時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３．７％ ホルムアルデヒドで２０分間細胞を固定させ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳを処理して細胞膜透過性を増加させた。その後、３％ ＢＳＡで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた後、ラミン（ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）と常温で２時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、Ｃｙ３二次抗体（Ｃｙ３－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で１０分間染色した。ＨｅＬａ細胞が付着したガラスを取り外してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＬＳＭ ７００、Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
【0054】
また、ＮＣペプチドと他の細胞透過ペプチドの透過性を比較するために下記のような方法を用いた。
【0055】
ＨｅＬａ細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度でガラスが入った１２－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をガラスに付着させた。その後、ＦＩＴＣ－ＮＣペプチド、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチド（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチド、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ－ｙｓ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチド（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ ｐｅｐｔｉｄｅ）およびＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドをＨｅＬａ細胞に３時間処理した。３時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３．７％ ホルムアルデヒドで２０分間細胞を固定させた。０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳを処理して細胞膜透過性を増加させ、３％ ＢＳＡで１時間ブロッキングさせた。その後、チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と常温で２時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｃｙ３二次抗体を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩで１０分間染色した。ＨｅＬａ細胞が付着したガラスを取り外してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
【0056】
また、ＦＩＴＣ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過活性の変化を確認するために前記と同様の方法により、ヘキサペプチド（ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）、ＦＩＴＣ－ヘキサペプチド、ＦＩＴＣ－ＮＣ－ヘキサペプチド、ＦＩＴＣ－１３ＮＣ３５ペプチドおよびＦＩＴＣ－２９ＮＣ５０ペプチドをＨｅＬａ細胞に３時間処理し、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。一方、上記で用いられたヘキサペプチド、ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＴＬＭペプチド、ＴＤ１ペプチド、ＮＣ－ヘキサペプチド、１３ＮＣ３５ペプチドおよび２９ＮＣ５０ペプチドのアミノ酸配列は下記の表５のとおりである。
【0057】
【表5】
【0058】
３－４．ＮＣペプチド細胞膜透過性の分析－蛍光分析器（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）
ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０４細胞／ウェルの密度で２４－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をプレートに付着させた。その後、Ｔａｔ－ＥＧＦＰペプチドおよびＮＣ－ＥＧＦＰペプチド各々を互いに異なる濃度で１時間処理した。１時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）バッファ１００ｍｌを添加して４℃で３０分間細胞を溶解させた。前記細胞溶解液１００ｍｌを蛍光分析器用の９６－ウェルプレートに移した後、蛍光分析器（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＭＸ、ＢＩＯＴＥＫ、米国）を用いてＧＦＰ蛍光を測定した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０４細胞／ウェルの密度で２４－ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をプレートに付着させた。その後、Ｔａｔ－ＥＧＦＰペプチドおよびＮＣ－ＥＧＦＰペプチド各々を互いに異なる濃度で１時間処理した。１時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）バッファ１００ｍｌを添加して４℃で３０分間細胞を溶解させた。前記細胞溶解液１００ｍｌを蛍光分析器用の９６－ウェルプレートに移した後、蛍光分析器（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＭＸ、ＢＩＯＴＥＫ、米国）を用いてＧＦＰ蛍光を測定した。
【0059】
また、前記と同様の方法により、ＦＩＴＣが結合されたＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）およびＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）のＮＣペプチド（以下、各々、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣ、ＦＩＴＣ－ＭＬＶ－ＮＣ、ＦＩＴＣ－ＳＩＶ－ＮＣ、ＦＩＴＣ－ＲＳＶ－ＮＣ）とＴａｔペプチドを１．０μＭの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に１時間処理した後に蛍光信号を測定した。
【0060】
３－５．ＮＣペプチドによるＲＮＡ透過（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の変化
ＭＴ４細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で２４－ウェルプレートに接種し、３７℃および５％ ＣＯ２の加湿恒温器で２４時間培養した。互いに異なる濃度のＮＣペプチド２μｌとｓｉＧＬＯ（Ｇｒｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ－００１６３０－０１－０５）４０ｎＭを混合して常温で３０分間反応させた後、ＭＴ４細胞に処理した。２４時間さらに培養した後、ＭＴ４細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光活性化セルソーターを用いてフローサイトメトリーにより分析した。また、蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。
ＭＴ４細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で２４－ウェルプレートに接種し、３７℃および５％ ＣＯ２の加湿恒温器で２４時間培養した。互いに異なる濃度のＮＣペプチド２μｌとｓｉＧＬＯ（Ｇｒｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ－００１６３０－０１－０５）４０ｎＭを混合して常温で３０分間反応させた後、ＭＴ４細胞に処理した。２４時間さらに培養した後、ＭＴ４細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光活性化セルソーターを用いてフローサイトメトリーにより分析した。また、蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。
【0061】
４．ＮＣペプチドの生体内組織への浸透および組織細胞における分布有無
３．２ｍｇ／１００μｌ濃度のＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドおよびＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチドを３０ゲージ（ｇａｕｇｅ）注射器を用いてマウス尾静脈に各々注射した。ペプチド投与して２時間後、マウスの腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、肺（ｌｕｎｇ）、心臓（ｈｅａｒｔ）および脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出して４％ パラホルムアルデヒドで１時間固定し、組織が沈むまで３０％ スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸しておいた。その後、ＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて各組織を冷凍させ、冷凍切片機で組織切片スライドを作製した。当業界で周知の方法により組織切片スライドをＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
３．２ｍｇ／１００μｌ濃度のＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドおよびＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチドを３０ゲージ（ｇａｕｇｅ）注射器を用いてマウス尾静脈に各々注射した。ペプチド投与して２時間後、マウスの腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、肺（ｌｕｎｇ）、心臓（ｈｅａｒｔ）および脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出して４％ パラホルムアルデヒドで１時間固定し、組織が沈むまで３０％ スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸しておいた。その後、ＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて各組織を冷凍させ、冷凍切片機で組織切片スライドを作製した。当業界で周知の方法により組織切片スライドをＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
【0062】
また、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド１００μＭストック（ｓｔｏｃｋ）を硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）に１μｌ、網膜下（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ）に２μｌ投与し、２４時間後、マウス眼球組織を摘出して前記と同様の方法により眼球組織切片スライドを作製した。スライドをＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
【0063】
実験結果
１．様々なレトロウイルスＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認
ＮＣペプチド配列の類似（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）程度に応じて細胞膜透過活性の程度の差があるか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドとＴａｔペプチドを１．０μＭの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に１時間処理した。その結果、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドが細胞膜透過性に優れるのをＦＩＴＣ蛍光明るさを通じて確認し、ＦＡＣＳ分析でもＨＩＶのＮＣペプチドが９６．８％、ＳＩＶのＮＣペプチドが５４．０％、ＲＳＶのＮＣペプチドが２４．２％、ＭＬＶのＮＣペプチドが５．７％の細胞において蛍光が現れるのを確認した。前記実験結果は、ＨＩＶをはじめとする種々のレトロウイルスのＮＣペプチドが既存のＴａｔペプチドに比して細胞膜透過活性に優れることを意味する。また、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドは、ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）ドメインが保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として含まれているのを確認することができた。
１．様々なレトロウイルスＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認
ＮＣペプチド配列の類似（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）程度に応じて細胞膜透過活性の程度の差があるか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドとＴａｔペプチドを１．０μＭの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に１時間処理した。その結果、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドが細胞膜透過性に優れるのをＦＩＴＣ蛍光明るさを通じて確認し、ＦＡＣＳ分析でもＨＩＶのＮＣペプチドが９６．８％、ＳＩＶのＮＣペプチドが５４．０％、ＲＳＶのＮＣペプチドが２４．２％、ＭＬＶのＮＣペプチドが５．７％の細胞において蛍光が現れるのを確認した。前記実験結果は、ＨＩＶをはじめとする種々のレトロウイルスのＮＣペプチドが既存のＴａｔペプチドに比して細胞膜透過活性に優れることを意味する。また、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドは、ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）ドメインが保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として含まれているのを確認することができた。
【0064】
一方、上記で用いられたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドのアミノ酸配列は下記の表６のとおりである。
【0065】
【表6】
【0066】
２．ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認
前記実験において、細胞膜透過活性の最も高いＨＩＶ－ＮＣペプチド（配列番号１２）を対象に細胞膜透過活性を濃度別に確認するために、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを０．５、１、２．５、５．０および１０μＭの濃度で１時間ＲＡＷ２６４．７マクロファージに処理した。１時間後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）で細胞の蛍光程度を確認した結果、図３ａに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、ペプチドの細胞膜透過性が高くなるのを確認することができた。また、蛍光分析器により確認した結果、図３ｂに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、蛍光信号が増加するのを確認して細胞膜透過性が増加することが分かった。
前記実験において、細胞膜透過活性の最も高いＨＩＶ－ＮＣペプチド（配列番号１２）を対象に細胞膜透過活性を濃度別に確認するために、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを０．５、１、２．５、５．０および１０μＭの濃度で１時間ＲＡＷ２６４．７マクロファージに処理した。１時間後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）で細胞の蛍光程度を確認した結果、図３ａに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、ペプチドの細胞膜透過性が高くなるのを確認することができた。また、蛍光分析器により確認した結果、図３ｂに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、蛍光信号が増加するのを確認して細胞膜透過性が増加することが分かった。
【0067】
また、処理時間に応じたＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過程度を確認するために、２．５μｍの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に２０分、４０分および６０分間ペプチドを処理した。その結果、図３ｃに示すように、ＦＩＴＣーＨＩＶ－ＮＣペプチドを処理した時間が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認することができた。
【0068】
また、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過性を確認するために、ＨｅＬａ細胞に免疫染色を行って共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。その結果、図４に示すように、多数のＨＩＶ－ＮＣペプチドが細胞膜、細胞質および核膜に満遍なく分布しており、一部のＨＩＶ－ＮＣペプチドは核内側に分布するのを確認することができた。前記結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが低い濃度で細胞膜を透過することができ、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過が速い時間内でなされることを意味する。
【0069】
３．様々な細胞におけるＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認
細胞の種類に応じてＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性に差があるか否かを確認するために、ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ－１、ＣＥＭ、ＭＤＣＫおよび２９３ＦＴ細胞にＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを１．０、２．５および５．０μＭの濃度で１時間または２時間処理した。その結果、図５ａ～５ｅに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認することができた。図５ａはＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）、図５ｂはＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）細胞の結果であり、図５ｃはＣＥＭ、図５ｄはＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、イヌ腎臓由来細胞）および図５ｅは２９３ＦＴ（ヒト胎児腎臓細胞由来）の結果である。前記結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが癌細胞、免疫細胞、上皮細胞などの様々な細胞膜を透過できることを意味する。
細胞の種類に応じてＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性に差があるか否かを確認するために、ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ－１、ＣＥＭ、ＭＤＣＫおよび２９３ＦＴ細胞にＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを１．０、２．５および５．０μＭの濃度で１時間または２時間処理した。その結果、図５ａ～５ｅに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認することができた。図５ａはＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）、図５ｂはＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）細胞の結果であり、図５ｃはＣＥＭ、図５ｄはＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、イヌ腎臓由来細胞）および図５ｅは２９３ＦＴ（ヒト胎児腎臓細胞由来）の結果である。前記結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが癌細胞、免疫細胞、上皮細胞などの様々な細胞膜を透過できることを意味する。
【0070】
４．ＨＩＶ－ＮＣペプチドとＴａｔペプチドの細胞膜透過活性の比較
ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認するために、既存の細胞透過タンパク質として知られたＴａｔペプチドとの比較実験を行った。緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）が結合されたＨＩＶ－ＮＣペプチド（以下、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド）を０．２５、０．５、１．０、２．５および５．０μＭの濃度で、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドを１．０、２．５、５．０および１０μＭの濃度で、各々１時間ＲＡＷ２６４．７細胞に処理し、１時間後、ペプチドの蛍光程度を確認した。その結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは０．２５μＭの低い濃度で蛍光が現れる反面、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは１０μＭの高い濃度でも蛍光が微小に現れるのを確認することができた。また、細胞を回収してＦＡＣＳで分析した結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは１μＭの濃度で９９．９％の細胞が蛍光を示すが、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは同一の濃度で４．３％の細胞が蛍光を示すのを確認した。
ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認するために、既存の細胞透過タンパク質として知られたＴａｔペプチドとの比較実験を行った。緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）が結合されたＨＩＶ－ＮＣペプチド（以下、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド）を０．２５、０．５、１．０、２．５および５．０μＭの濃度で、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドを１．０、２．５、５．０および１０μＭの濃度で、各々１時間ＲＡＷ２６４．７細胞に処理し、１時間後、ペプチドの蛍光程度を確認した。その結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは０．２５μＭの低い濃度で蛍光が現れる反面、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは１０μＭの高い濃度でも蛍光が微小に現れるのを確認することができた。また、細胞を回収してＦＡＣＳで分析した結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは１μＭの濃度で９９．９％の細胞が蛍光を示すが、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは同一の濃度で４．３％の細胞が蛍光を示すのを確認した。
【0071】
また、蛍光分析器により確認した結果、図６ｃに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは、濃度が増加するに伴い、細胞膜透過性も増加するが、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは、処理濃度に関係なく、細胞膜透過性が非常に低いのを確認することができた。前記実験結果は、既存の細胞透過タンパク質としてよく知られたＴａｔペプチドに比して、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが高効率の細胞透過ペプチドであることを意味する。
【0072】
５．ＨＩＶ－ＮＣペプチドと他の細胞透過ペプチドの細胞透過活性の比較
ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチド、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチド、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドをＨｅＬａ細胞に処理した後、各ペプチドの細胞膜透過程度を確認した。
ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチド、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチド、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドをＨｅＬａ細胞に処理した後、各ペプチドの細胞膜透過程度を確認した。
【0073】
その結果、図７に示すように、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチドおよびＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドは、２０μＭの高濃度で処理したにもかかわらず、細胞膜をほぼ透過することができなかったが、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは、３μＭで処理しても、蛍光信号が強く現れて、細胞膜透過活性に顕著に優れるのを確認することができた。また、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性は、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチドに比して約２．５倍、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチドに比して約７倍、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチドに比して約１０倍ほど優れるのを確認することができた。
【0074】
６．ＮＣペプチド内のジンクフィンガードメインの細胞膜透過活性の確認
実験結果１において多数種のレトロウイルスＮＣペプチドが細胞膜透過活性があるのを確認し、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶは２個、ＭＬＶは１個のジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）があるのを確認した。
実験結果１において多数種のレトロウイルスＮＣペプチドが細胞膜透過活性があるのを確認し、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶは２個、ＭＬＶは１個のジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）があるのを確認した。
【0075】
そこで、細胞膜透過活性が種々のＮＣペプチド内の保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であるジンクフィンガードメインによって表れるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの１３番目のアミノ酸～３５番目のアミノ酸からなる１番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（１３ＮＣ３５ペプチド、配列番号１０）と、２９番目のアミノ酸～５０番目のアミノ酸からなる２番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（２９ＮＣ５０ペプチド、配列番号１１）を対象にＦＩＴＣを結合させ、ＨｅＬａ細胞における細胞膜透過活性を確認した。
【0076】
その結果、図８および図９に示すように、１３ＮＣ３５ペプチドと２９ＮＣ５０ペプチドの両方とも濃度に比例して蛍光信号が増加するのを確認することができた。これは、ＮＣペプチドのジンクフィンガードメインが細胞膜透過活性を示す重要な部分であることを意味する結果である。
【0077】
一方、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドのジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は下記の表７に示す。
【0078】
【表7】
【0079】
７．ＨＩＶ－ＮＣペプチドの生体内組織への浸透および組織細胞における分布有無の確認
【0080】
ＮＣペプチドが生体内組織に浸透して組織細胞に満遍なく分布するか否かを確認するために、マウス尾静脈にＨＩＶ－ＮＣペプチドを投与した結果、図１０に示すように、腎臓、肝臓、肺、心臓および脾臓組織細胞に満遍なく分布することが分かった。特に腎臓、肝臓および肺組織細胞に対する分布効率が顕著に優れていた。その反面、Ｔａｔペプチドは、腎臓を除いた他の組織にはほぼ分布しないのを確認することができた。
【0081】
また、眼球の硝子体内と網膜下への投与経路を通じてＨＩＶ－ＮＣペプチドを投与した結果、図１１に示すように、蛍光信号が強く現れるのを確認して、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが眼球投与経路を通じて眼球組織を浸透して網膜細胞に満遍なく分布することが分かった。
【0082】
８．ＨＩＶ－ＮＣペプチドによるポリペプチドの細胞膜透過有無の確認
ポリペプチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドにヘキサペプチドを結合して細胞に処理して蛍光信号を観察した。その結果、図１２に示すように、ヘキサペプチドそのものは細胞膜を透過することはできないが、ＨＩＶ－ＮＣペプチドと結合した場合には細胞膜透過が可能であり、濃度に比例して細胞膜透過活性が増加するのを確認することができた。
ポリペプチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドにヘキサペプチドを結合して細胞に処理して蛍光信号を観察した。その結果、図１２に示すように、ヘキサペプチドそのものは細胞膜を透過することはできないが、ＨＩＶ－ＮＣペプチドと結合した場合には細胞膜透過が可能であり、濃度に比例して細胞膜透過活性が増加するのを確認することができた。
【0083】
９．ＨＩＶ－ＮＣペプチドによるポリヌクレオチドの細胞膜透過有無の確認
ポリヌクレオチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドとｓｉＧＬＯ ＲＮＡを結合してＭＴ４細胞に処理した後に細胞を観察した。その結果、図１３に示すように、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの処理濃度に応じてＧＦＰ蛍光信号が増加するのを確認し、ｓｉＧＬＯの細胞膜透過程度が増加したことが分かった。この結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドがポリヌクレオチドの細胞膜透過程度を顕著に改善できることを意味する。
ポリヌクレオチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドとｓｉＧＬＯ ＲＮＡを結合してＭＴ４細胞に処理した後に細胞を観察した。その結果、図１３に示すように、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの処理濃度に応じてＧＦＰ蛍光信号が増加するのを確認し、ｓｉＧＬＯの細胞膜透過程度が増加したことが分かった。この結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドがポリヌクレオチドの細胞膜透過程度を顕著に改善できることを意味する。
【0084】
今まで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者であれば、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲内で変形した形態に実現できることを理解することができるであろう。したがって、開示された実施例は限定的な観点でなく説明的な観点で考慮しなければならない。本発明の範囲は前述した説明でなく特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は本発明に含まれたものとして解釈しなければならない。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【配列表】