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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-06
(45)【発行日】2023-02-14
(54)【発明の名称】祖先ウイルス配列およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20230207BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230207BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20230207BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230207BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230207BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230207BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230207BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230207BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230207BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230207BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230207BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20230207BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/015
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N7/01
A61K35/76
A61K38/16
A61K39/00 H
A61P37/00
【請求項の数】
15
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021099934
(22)【出願日】2021-06-16
(62)【分割の表示】P 2018504699の分割
【原出願日】2016-07-29
(65)【公開番号】P2021175397
(43)【公開日】2021-11-04
【審査請求日】2021-07-16
(31)【優先権主張番号】62/199,059
(32)【優先日】2015-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/203,002
(32)【優先日】2015-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】511140770
【氏名又は名称】マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー
(73)【特許権者】
【識別番号】516106623
【氏名又は名称】ザ スケペンス アイ リサーチ インスティテュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンデンベルゲ，ルク エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】ジン，エリック
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０５４６５３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００８－５３８２８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５０７２２３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項2】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項3】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも１００％の配列同一性を有する、請求項２に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項4】
精製されている、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項5】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくとも９８％の配列同一性を有する、核酸分子。
【請求項6】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項7】
配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項9】
請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項10】
請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子。
【請求項11】
導入遺伝子をさらに含む、請求項１０に記載のウイルス粒子。
【請求項12】
導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種するための、ウイルス粒子を含む組成物であって、前記ウイルス粒子が、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む、組成物。
【請求項13】
ワクチン接種するための組成物であって、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドに連結した標的抗原を含む、組成物。
【請求項14】
導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種するための、精製されたウイルス粒子を含む組成物であって、前記精製されたウイルス粒子が、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド及び導入遺伝子を含む、組成物。
【請求項15】
ワクチン接種するための組成物であって、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドに連結した標的抗原を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、ウイルスに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療ベクターに対する中和または毒性免疫応答を逃れ回避することは、全ての遺
伝子移入ベクタータイプを用いる場合に大きな課題である。これまでの遺伝子移入は、ヒ
トおよび動物内を循環するウイルスに基づくベクター、例えば、アデノウイルスおよびア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いることで最も効率的に達成される。しかしながら、対
象がウイルスに自然に感染している場合は、そのウイルスに基づくベクターによるその後
の治療は、細胞性および体液性免疫応答に起因して、安全リスクの増加と遺伝子移入効率
の低下をもたらす。キャプシド抗原は、主に、ウイルス粒子に対する先天性免疫および／
または適応免疫の原因となるが、しかしながら、ウイルス遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドもまた免疫原性であり得る。
伝子移入ベクタータイプを用いる場合に大きな課題である。これまでの遺伝子移入は、ヒ
トおよび動物内を循環するウイルスに基づくベクター、例えば、アデノウイルスおよびア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いることで最も効率的に達成される。しかしながら、対
象がウイルスに自然に感染している場合は、そのウイルスに基づくベクターによるその後
の治療は、細胞性および体液性免疫応答に起因して、安全リスクの増加と遺伝子移入効率
の低下をもたらす。キャプシド抗原は、主に、ウイルス粒子に対する先天性免疫および／
または適応免疫の原因となるが、しかしながら、ウイルス遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドもまた免疫原性であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本開示は、祖先ウイルス配列またはその一部を予測および合成する方法を記載し、さら
に、このような祖先ウイルス配列を含有するウイルス粒子を記載する。本明細書に記載さ
れる方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された；したがって、本開示は、予測
された祖先ＡＡＶ配列、およびこのような祖先ＡＡＶ配列を含有するＡＡＶウイルス粒子
を記載する。本開示はまた、同時代の（contemporary）配列を含有するウイルス粒子と比
較して、祖先配列を含有するウイルス粒子によって示された血清有病率を記載する。
に、このような祖先ウイルス配列を含有するウイルス粒子を記載する。本明細書に記載さ
れる方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された；したがって、本開示は、予測
された祖先ＡＡＶ配列、およびこのような祖先ＡＡＶ配列を含有するＡＡＶウイルス粒子
を記載する。本開示はまた、同時代の（contemporary）配列を含有するウイルス粒子と比
較して、祖先配列を含有するウイルス粒子によって示された血清有病率を記載する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
一態様において、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（
ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、このよう
なＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはこのようなＡＡＶキャプシドポリペプチドを含
むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプ
チドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形
態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはＡＡＶキャプシドポリペ
プチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシ
ドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和
される。いくつかの実施形態では、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは精製され
ている。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、配
列番号４３に示される核酸配列によってコードされる。
ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、このよう
なＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはこのようなＡＡＶキャプシドポリペプチドを含
むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプ
チドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形
態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはＡＡＶキャプシドポリペ
プチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシ
ドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和
される。いくつかの実施形態では、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは精製され
ている。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、配
列番号４３に示される核酸配列によってコードされる。
【0005】
このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子もまた提供さ
れる。いくつかの実施形態において、このような精製されたウイルス粒子は導入遺伝子を
さらに含む。
れる。いくつかの実施形態において、このような精製されたウイルス粒子は導入遺伝子を
さらに含む。
【0006】
別の態様において、配列番号４３に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。いくつかの実施形態
において、このような核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態におい
て、このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。
ＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。いくつかの実施形態
において、このような核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態におい
て、このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0007】
別の態様において、導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種する方
法が提供される。このような方法は、典型的には、遺伝子移入またはワクチン接種を必要
とする対象に本明細書に記載されるウイルス粒子を投与することを含み、ウイルス粒子は
ＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態
において、このようなウイルス粒子は、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程
度にヒト血清によって中和される。
法が提供される。このような方法は、典型的には、遺伝子移入またはワクチン接種を必要
とする対象に本明細書に記載されるウイルス粒子を投与することを含み、ウイルス粒子は
ＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態
において、このようなウイルス粒子は、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程
度にヒト血清によって中和される。
【0008】
別の態様において、対象にワクチン接種する方法が提供される。このような方法は、典
型的には、ワクチン接種を必要とする対象に本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリ
ペプチドに作動可能に連結した標的抗原を投与することを含み、ＡＡＶキャプシドポリペ
プチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す
。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９
キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
型的には、ワクチン接種を必要とする対象に本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリ
ペプチドに作動可能に連結した標的抗原を投与することを含み、ＡＡＶキャプシドポリペ
プチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す
。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９
キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
【0009】
このように、本開示は、同時代のウイルスまたは一部と比較して、現在のヒト集団にお
いて既存の免疫に対する感受性の低減を示す祖先ウイルスまたはその一部を提供する。一
般的に、現在のヒト集団における祖先ウイルスまたはその一部によって示される既存の免
疫に対する感受性の低減は、中和抗体に対する感受性の低減として反映される。
いて既存の免疫に対する感受性の低減を示す祖先ウイルスまたはその一部を提供する。一
般的に、現在のヒト集団における祖先ウイルスまたはその一部によって示される既存の免
疫に対する感受性の低減は、中和抗体に対する感受性の低減として反映される。
【0010】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、対象とす
る方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味
を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、対象とする方法
および組成物の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に
記載する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するも
のではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の
参考文献は、全体として参照により組み込まれる。
る方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味
を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、対象とする方法
および組成物の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に
記載する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するも
のではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の
参考文献は、全体として参照により組み込まれる。
【0011】
特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含有する。カ
ラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要求および必要とされる手数料の
支払いにより特許庁によって提供される。
ラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要求および必要とされる手数料の
支払いにより特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図9】図９Ａ－Ｄは、Ａｎｃ８０Ｌ６５が高力価の粒子をアセンブルし、得ることができることを実証する実験結果の画像である。パネルＡは、Ａｎｃ８０Ｌ６５がＡＡＶ２に相当するベクター収率を生じさせることができることを示す；パネルＢは、Ａｎｃ８０Ｌ６５を含むウイルス粒子のＴＥＭ画像である；パネルＣは、Ａｎｃ８０Ｌ６５を含むウイルス粒子が、変性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに基づいて、ＡＡＶキャップＶＰ１、２および３タンパク質を産生し得ることを示す；パネルＤは、ＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたＡｎｃ８０Ｌ６５のウェスタンブロットを示す。
【図10】図１０Ａ－Ｃは、Ａｎｃ８０Ｌ６５が、読み出し（パネルＡ）またはルシフェラーゼ（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／もしくはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いてインビトロでＨＥＫ２９３細胞上で細胞を感染させることができ、さらに、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコードするＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ：肝臓）、ＧＦＰをコードするＡＡＶの直接的なＩＭ注射後（中段の行、パネルＣ：筋肉）およびＧＦＰをコードするＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ：網膜）効率的に肝臓を標的化することを実証する実験結果の画像である。
【図11A】図１１Ａおよび１１Ｂは、代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ａ）、および代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ｂ）を示すＭＡＦＦＴを用いて生成する配列同一性マトリックスである。
【図11B】図１１Ａおよび１１Ｂは、代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ａ）、および代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ｂ）を示すＭＡＦＦＴを用いて生成する配列同一性マトリックスである。
【図12】図１２は、ＡＡＶベクターが小規模（６ウェルディッシュ）で三連で生成されたことを実証するグラフである。粗ウイルスは、それぞれのベクターの絶対的な生成を決定するために定量ＰＣＲによって評価された。
【図14】図１４は、それぞれのベクターの１．９Ｅ３ ＧＣ／細胞がＨＥＫ２９３細胞に添加された実験結果を示す写真である（Ａｎｃ１２６を除く。この場合、２．５Ｅ２－３．１Ｅ２ ＧＣ／細胞のＭＯＩが達成された。）。６０時間後、感染力を蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【図15】図１５は、図１４と同じ細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現についてアッセイした実験結果を示すグラフである。図１４のように、Ａｎｃ１２６は、他のベクターで制御された力価でなかったが、むしろ２．５Ｅ２－３．１Ｅ２ ＧＳ／細胞のＭＯＩの範囲であった。
【図18】図１８は、ＡＡＶの最大尤度の系統発生および７５種の分離株を用いて作成したＡＡＶ進化の系統発生およびＡＳＲである。赤色の丸は、ＡＳＲによって再構築された進化中間体を表す。青色の丸は、Ａｎｃ８０の周りに設けられた確率的空間のライブラリーを表す。明確にするために、サブクレードは折り畳まれる。完全な系統発生が図２４に示されている。
【図19】図１９は、Ａｎｃ８０ベクターの配列および構造解析を示す。パネルＡは、Ａｎｃ８０（配列番号３７）、ＡＡＶ２（配列番号３８）およびＡＡＶ８（配列番号３９）ＶＰ３タンパク質の配列構造アラインメントである。ＵＣＳＦキメラ（Pettersen et al., 2004, J. Comp. Chem., 25: 1605-12）で生成されたＡＡＶ２（ＰＤＢ １ＬＰ３）およびＡＡＶ８（ＰＤＢ ２ＱＡ０）ＶＰ３の結晶構造、ならびにＡｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３の予測構造に由来する構造的アラインメントを黒いプリントで示す。青色領域は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡｎ８０のＶＰ１／ＶＰ２ドメインの非構造的アライメントである（Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol, 302:205-17）。Ａｎｃ８０ライブラリー中のあいまいな残基は赤で表され、下の位置はＡｎｃ８０Ｌ６５残基に対応する。β鎖およびαヘリックスは、それぞれ緑色および黄色で表される。ＡＡＶ逆平行βバレルを形成する９つのβ鎖の位置はプレーン矢印で示されているが、一方、保存されたコアαヘリックスの位置は点線矢印で示されている。可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸのおおよその位置は、配列アライメントの上のローマ数字で表される。パネルＢは、ＡＡＶキャップ配列多様性マトリックスを示す。対角線より上では、マトリックスは、選択されたＡＡＶ血清型由来のパーセント配列多様性、およびＢＬＡＳＴによって決定される最も相同なＶＰ１配列であるｒｈ．１０を表す。対角線の下では、位置あたりのアミノ酸の相違数が示されている。パネルＣは、Ａｎｃ８０Ｌ００６５ ＶＰ３予測構造を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８ ＶＰ３結晶構造の重ね合わせを示す。カラーコードは、パネルＡの３つの整列された配列間のアミノ酸保存を示す（赤色：最高保存、青色：最低保存）。変数領域Ｉ～ＩＸおよびＣ／Ｍ－末端は黒色で示されている。２倍、３倍および５倍の軸のおおよその位置は、黒の楕円、三角形および五角形でそれぞれ表される。パネルＤは、ＶＰ１三量体上のＡＡＶ２（左）およびＡＡＶ８（右）と比較したアミノ酸変化の構造マッピングであり、ビリオンの外部（上部）および内部（下部）を視覚化する。着色した残基はＡｎｃ８０において多様性である。赤色の残基はＡＳＲによって曖昧であり、従ってＡｎｃ８０Ｌｉｂの二形性である。
【図20】図２０は、Ａｎｃ８０Ｌ６５の生物物理学的および生化学的特徴付けの結果である。パネルＡは、Ａｎｃ８０Ｌ６５の陰性染色透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５が直径約２０～２５ｎｍの粒子を形成することを実証する。パネルＢは、Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ組成物である。精製したＡｎｃ８０Ｌ６５の調製物および３つの現存のウイルスをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。Ａｎｃ８０は、モノマーＶＰ１、２および３の同様の取り込みレベルを実証する。パネルＣは、精製ＡＡＶ調製物の空：完全粒子組成を示す。沈降係数分布は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５の調製物の分析的超遠心分離中に屈折率光学測定システムで得られた沈降プロファイルから導出された。パネルＤはＡＡＶ熱安定性を示す。異なる温度下でのＡＡＶ粒子の内因性トリプトファン蛍光測定は、Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較したＡＡＶ血清型の明確な融解温度を示す。
【図21】図２１は、Ａｎｃ８０Ｌ６５のインビボ評価の結果である。パネルＡの上段パネルは、７．２×１０１０ＧＣの用量で腹腔内送達の２８日後の肝臓におけるＡＡＶ－２、ＡＡＶ－８およびＡｎｃ８０Ｌ６５．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺの肝臓形質導入およびｌａｃＺ導入遺伝子発現比較を示す。パネルＡの中段パネルは、右後大腿部（腓腹筋／大腿二頭筋）に１×１０１０ＧＣの用量で筋肉内送達の２８日後のＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５の筋指向性を示す。パネルＡの下部パネルは、２×１０９ＧＣの用量で網膜下送達後の網膜におけるＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０Ｌ６５の間のｅＧＦＰ導入遺伝子発現の比較を示す。ＡＡＶ２はＲＰＥ細胞に対して高親和性を示し、一方、ＲＰＥと光受容体は両方ともＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターを用いて標的化され、Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡＡＶ２およびＡＡＶ８と比較して高い形質導入効率を示す。パネルＢは、眼窩後洞静脈内送達によるＡＡＶ－８およびＡｎｃ８０Ｌ６５と比較した、１０１１（上段パネル）、１０１０（中段パネル）、および１００９（下段パネル）ＧＣにおける定性的用量応答ｅＧＦＰ発現分析である。ＡＡＶ８とＡｎｃ８０Ｌ６５の両方は、用量範囲の全体にわたって等用量で同等のｅＧＦＰ発現を示す。パネルＣは、ＡＡＶ－８（黒色シンボル：四角－１０１１ＧＣ、丸－１０１０ＧＣ、および正方形－１０９ＧＣ）およびＡｎｃ８０Ｌ６５（灰色シンボル：菱形－１０１１ＧＣ、四角－１０１０ＧＣ、および三角－１０９ＧＣ）からの組換えヒトα１－抗トリプシン（ｈＡ１ＡＴ）導入遺伝子発現のマウス血清レベルを測定する定量的ＡＡＶ用量応答分析を示す。パネルＤは、１×１０１２ＧＣ／ｋｇの用量の伏在静脈注射後のアカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ｒｈＣＧ）を発現するＡＡＶ－８およびＡｎｃ８０Ｌ６５のアカゲザル肝臓遺伝子移入のグラフである。マカク肝葉からゲノムＤＮＡを採取し、ｑＰＣＲアッセイによって二倍体ゲノム（ｄｐｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）を測定した。１匹のＡＡＶ８および全３匹のＡｎｃ８０Ｌ６５動物は、肝尾状葉の二倍体細胞あたり約１～３ｖｇを首尾よく受けたが、一方、２匹のＡＡＶ８動物は、おそらくベクター中和をもたらし、肝臓遺伝子移入を制限する低レベルのＮＡＢを有した。パネルＥは、ＴａｑＭａｎプローブ特異的な定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による、ＮＨＰ肝尾状葉、肝右葉、肝左葉および肝中葉におけるＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５の導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ｒｈＣＧ転写物の定量化は、内因性ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルで標準化した。
【図22】図２２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５を免疫学的に特徴付けた実験結果である。パネルＡは、ウサギ抗ＡＡＶ血清交差反応性を示すグラフである：ＡＡＶ血清型（Ｙ軸）に対して惹起されたウサギ抗血清を、相同性ＡＡＶ血清型に対してＮＡＢ対Ａｎｃ８０Ｌ６５について試験し、血清交差反応性を評価した。値（Ｘ軸）は、５０％中和が達成される最小の希釈を表す。免疫血清型間の系統発生の関係は左に描かれている。パネルＢは、マウスのインビボ遺伝子移入交差中和を示す表である：Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、生理食塩水またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺのいずれかを用いたＩＭ注射の２５日後、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５．ＣＡＳＩ．ＥＧＦＰ．２Ａ．Ａ１ＡＴのＩＶ注射を受けた。２回目の注射の１４日後、血清をｈＡ１ＡＴ発現についてＥＬＩＳＡにより滴定した。表は、免疫化群（ｎ＝５）における２回目の注射の２４時間前に、各ベクターについて非免疫化（％対照）、ならびにＡＡＶ８（ＮＡＢ８）およびＡｎｃ８０Ｌ６５（ＮＡＢ８０）についてのＮＡＢ力価希釈物に対する、予備免疫されたマウスの相対ｈＡ１ＡＴレベルを示す。パネルＡおよびＢの灰色の分岐矢印は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８系統の表現型の進化を模式的に示す。パネルＣは、Ｔ－コーヒーアライメントパッケージを用いて生成した、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡＡＶ２ ＶＰ３配列間の非構造的多重配列アライメントである。ＵＣＳＦキメラを用いてＡＡＶ２三量体構造を作製した。青色残基は、Ａｎｃ８０に対する可変残基を表す。オレンジ色の残基は、ＡＡＶ２上の以前に定義されたＴおよびＢ細胞エピトープを表す。緑色の残基は、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＢ／Ｔ細胞エピトープに対する変異の間の重複である。
【図23】図２３は、ＡＡＶ系統再構築が生成、感染力および熱安定性を調節することを示すデータである。パネルＡは、ｑＰＣＲによって決定される、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する９つの祖先および２つの現存のウイルスベクターの生成を示すグラフである。誤差バーは、３つの生物学的複製の標準偏差を表す。パネルＢは、祖先および現存のウイルスベクターが、１．９×１０３の粒子－細胞比でＨＥＫ２９３細胞に形質導入するために使用されたことを示すグラフである。誤差バーは、３つの異なるロットのベクターの標準偏差を表す。＊Ａｃｎ２６は、ベクターの収量が低いため、２．１×１０２と３．５×１０２ＧＣ／細胞の間の比率で追加された。パネルＣは、選択された祖先および現存のＡＡＶベクターの変性温度を指示するｓｙｐｒｏ－ｏｒａｎｇｅ熱安定性アッセイを示す。
【図24】図２４は、ウイルスベクターの筋肉内注射後のｅＧＦＰ発現を示す（上記の図２１もまた参照されたい）。筋肉標的化ｅＧＦＰ実験のために、マウスは腓腹筋に単回注射を受けた。ｅＧＦＰ発現は、横および縦の筋肉切片（第１および第２のカラム）で観察された。青色染色は核をマークする（ＤＡＰＩ）。筋肉の形態は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片（第３のカラム）に見られるように変化しなかった。
【図25-1】図２５は、祖先配列再構築に用いられるＡＡＶ分離株由来のＶＰ１ポリペプチドの多重配列アラインメントである（上記の図１８および図２３もまた参照されたい）。ＡＡＶ２（配列番号３１）；ＡＡＶ５（配列番号４０）；ＡＡＶ７（配列番号３４）；Ａｎｃ１１３Ｌ１（配列番号５４）；ＡＡＶ８（配列番号２７）；Ａｎｃ８３Ｌ１（配列番号５５）；Ａｎｃ８４Ｌ１（配列番号５６）；ｒｈ１０（配列番号４１）；Ａｎｃ８２Ｌ１（配列番号５７）；Ａｎｃ１１０Ｌ１（配列番号５８）；Ａｎｃ８１Ｌ１（配列番号５９）；Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号６０）；Ａｎｃ１２６Ｌ１（配列番号６１）；ＡＡＶ３（配列番号３２）；ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３３）；Ａｎｃ１２７Ｌ１（配列番号６２）；ＡＡＶ６（配列番号２９）；ＡＡＶ１（配列番号３０）；ＡＡＶ９（配列番号２８）；ＡＡＶ４（配列番号４４）；ｒｈ３２．３３（配列番号４５）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
実験目的または治療目的のための遺伝子移入は、遺伝情報を標的細胞に往復させるため
のベクターまたはベクターシステムを利用する。ベクターまたはベクターシステムは、遺
伝子移入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学および寿命の主要な決定要因であると考
えられる。現在、遺伝子移入を達成するための最も効率的かつ効果的な方法は、複製欠損
がなされているウイルスに基づくベクターまたはベクターシステムの使用を介するもので
ある。
のベクターまたはベクターシステムを利用する。ベクターまたはベクターシステムは、遺
伝子移入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学および寿命の主要な決定要因であると考
えられる。現在、遺伝子移入を達成するための最も効率的かつ効果的な方法は、複製欠損
がなされているウイルスに基づくベクターまたはベクターシステムの使用を介するもので
ある。
【0014】
しかしながら、血清有病率の研究は、世界的なヒト集団のかなりの割合が、現在、遺伝
子移入に使用されている大多数のウイルスに（例えば、自然感染によって）予め曝露され
、したがって、既存の免疫を保有していることを示す。これらの予め曝露された個体中の
ウイルスベクターに対する抗体を中和することは、遺伝子移入の程度を時には有意に制限
し、またはウイルスを標的から離れるように変えることが知られている。例えば、Calced
o et al. （2009, J. Infect. Dis., 199:381-90）、およびBoutin et al. （2010, Huma
n Gene Ther., 21:704-12）を参照されたい。このように、本開示は、祖先ウイルスまた
はその一部が、同時代のウイルスまたはその一部よりも、現在のヒト集団において既存の
免疫に対する感受性の低減（例えば、中和抗体に対する感受性の低減）を示すという認識
に基づく。
子移入に使用されている大多数のウイルスに（例えば、自然感染によって）予め曝露され
、したがって、既存の免疫を保有していることを示す。これらの予め曝露された個体中の
ウイルスベクターに対する抗体を中和することは、遺伝子移入の程度を時には有意に制限
し、またはウイルスを標的から離れるように変えることが知られている。例えば、Calced
o et al. （2009, J. Infect. Dis., 199:381-90）、およびBoutin et al. （2010, Huma
n Gene Ther., 21:704-12）を参照されたい。このように、本開示は、祖先ウイルスまた
はその一部が、同時代のウイルスまたはその一部よりも、現在のヒト集団において既存の
免疫に対する感受性の低減（例えば、中和抗体に対する感受性の低減）を示すという認識
に基づく。
【0015】
図１は、祖先および同時代のウイルス感染と祖先および同時代の宿主免疫応答の間の関
係を示す概略図である。図１は、祖先ＡＡＶが、どのようにして同時代の既存の免疫に不
応性であり得るかを示す。同時代の、現存のウイルス（Ｖｃ）は、免疫回避のメカニズム
を介して、主に宿主免疫の進化的圧力下で祖先種（Ｖａｎｃ）から進化してきたことが推
定される。これらの種ＶａｎｃおよびＶｃの各々は、Ｂ細胞免疫およびＴ細胞免疫（それ
ぞれＩａｎｃおよびＩｃ）を含む適応免疫を誘導する能力を有する。同時代のウイルスに
よって誘導される免疫は、現存のウイルスよりもエピトープ組成の点で実質的に異なる可
能性がある祖先ウイルス種と必ずしも交差反応しないことが仮定され、本明細書において
確認された。
係を示す概略図である。図１は、祖先ＡＡＶが、どのようにして同時代の既存の免疫に不
応性であり得るかを示す。同時代の、現存のウイルス（Ｖｃ）は、免疫回避のメカニズム
を介して、主に宿主免疫の進化的圧力下で祖先種（Ｖａｎｃ）から進化してきたことが推
定される。これらの種ＶａｎｃおよびＶｃの各々は、Ｂ細胞免疫およびＴ細胞免疫（それ
ぞれＩａｎｃおよびＩｃ）を含む適応免疫を誘導する能力を有する。同時代のウイルスに
よって誘導される免疫は、現存のウイルスよりもエピトープ組成の点で実質的に異なる可
能性がある祖先ウイルス種と必ずしも交差反応しないことが仮定され、本明細書において
確認された。
【0016】
本開示は、祖先ウイルスまたはその一部の配列を予測する方法を提供する。本明細書に
記載の方法を用いて予測される祖先ウイルス配列の１つまたは複数が生成され、ウイルス
粒子にアセンブルすることができる。本明細書において実証されるように、予測される祖
先ウイルス配列からアセンブルされるウイルス粒子は、現在の同時代のウイルス粒子より
も少ない、時として有意に低い血清有病率を示し得る。したがって、本明細書に開示され
ている祖先ウイルス配列は、遺伝子移入のためのベクターまたはベクターシステムにおけ
る使用に適している。
記載の方法を用いて予測される祖先ウイルス配列の１つまたは複数が生成され、ウイルス
粒子にアセンブルすることができる。本明細書において実証されるように、予測される祖
先ウイルス配列からアセンブルされるウイルス粒子は、現在の同時代のウイルス粒子より
も少ない、時として有意に低い血清有病率を示し得る。したがって、本明細書に開示され
ている祖先ウイルス配列は、遺伝子移入のためのベクターまたはベクターシステムにおけ
る使用に適している。
【0017】
祖先ウイルス配列を予測および合成する方法
祖先ウイルス配列を予測するために、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最初に複
数の同時代のウイルスまたはその一部から集める。本明細書に記載される方法は、アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド配列を用いて例示されが、同じ方法は、ＡＡＶ由来の
他の配列（例えば、ゲノム全体、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）に適用され、または任意の他
のウイルスまたはその一部に適用され得る。ＡＡＶ以外のウイルスとしては、限定されな
いが、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レ
ンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ワクシニアウイルス、ポックス
ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイル
ス、泡沫状ウイルス、または既存する免疫が問題であると考えられる任意の他のウイルス
が挙げられる。
祖先ウイルス配列を予測するために、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最初に複
数の同時代のウイルスまたはその一部から集める。本明細書に記載される方法は、アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド配列を用いて例示されが、同じ方法は、ＡＡＶ由来の
他の配列（例えば、ゲノム全体、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）に適用され、または任意の他
のウイルスまたはその一部に適用され得る。ＡＡＶ以外のウイルスとしては、限定されな
いが、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レ
ンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ワクシニアウイルス、ポックス
ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイル
ス、泡沫状ウイルス、または既存する免疫が問題であると考えられる任意の他のウイルス
が挙げられる。
【0018】
わずか２つの同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができるが、し
かしながら、同時代のウイルスまたはその一部の大多数の配列は、できるだけ多くの現在
の配列多様性の状況を含むように所望されるが、さらに、大多数の配列が記載され、使用
されるアルゴリズムの予測能力を増加させ得るためであることが理解される。例えば、１
０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、５０個以
上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、または１００個
以上の同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができる。
かしながら、同時代のウイルスまたはその一部の大多数の配列は、できるだけ多くの現在
の配列多様性の状況を含むように所望されるが、さらに、大多数の配列が記載され、使用
されるアルゴリズムの予測能力を増加させ得るためであることが理解される。例えば、１
０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、５０個以
上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、または１００個
以上の同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができる。
【0019】
このような配列は、例えば、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭ
ＢＬ、国際塩基配列データベースコラボレーション（ＩＮＳＤＣ）または欧州ヌクレオチ
ドアーカイブを含む任意の数の公共のデータベースから取得することができる。追加的に
または代替的に、このような配列は、特定の生物に特異的なデータベース（例えば、ＨＩ
Ｖデータベース）から取得することができる。同時代の配列は、ゲノム全体に対応し得、
またはゲノムの一部のみ、例えば、限定されないが、ウイルスキャプシド、複製タンパク
質またはＩＴＲ配列の１つまたは複数の構成成分をコードする配列を使用することができ
る。
ＢＬ、国際塩基配列データベースコラボレーション（ＩＮＳＤＣ）または欧州ヌクレオチ
ドアーカイブを含む任意の数の公共のデータベースから取得することができる。追加的に
または代替的に、このような配列は、特定の生物に特異的なデータベース（例えば、ＨＩ
Ｖデータベース）から取得することができる。同時代の配列は、ゲノム全体に対応し得、
またはゲノムの一部のみ、例えば、限定されないが、ウイルスキャプシド、複製タンパク
質またはＩＴＲ配列の１つまたは複数の構成成分をコードする配列を使用することができ
る。
【0020】
次に、同時代の配列は、複数の配列アラインメント（ＭＳＡ）アルゴリズムを用いて整
列される。図２（ａ）は複数配列のアラインメントを示す概略図である。ＭＳＡアルゴリ
ズムは当技術分野において周知であり、一般的に、異なるサイズのデータセットと異なる
入力（例えば、核酸またはタンパク質）に適用され、および特定の方法（例えば、動的プ
ログラミング、プログレッシブ、ヒューリスティック）で配列を整列するように設計され
、アラインメントにおける異なるスコアリングスキーム（例えば、マトリックスベースま
たは整合性ベース、例えば、最小エントロピー、対の合計、類似性マトリックス、ギャッ
プスコア）を適用する。周知のＭＳＡアルゴリズムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ
（Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90）、Ｋａｌｉｇｎ（Lassmann e
t al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99）、ＭＡＦＦＴ（Katoh et al., 2005, Nuc.
Acids Res., 33:511-8）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113）およ
びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17）が挙げら
れる。
列される。図２（ａ）は複数配列のアラインメントを示す概略図である。ＭＳＡアルゴリ
ズムは当技術分野において周知であり、一般的に、異なるサイズのデータセットと異なる
入力（例えば、核酸またはタンパク質）に適用され、および特定の方法（例えば、動的プ
ログラミング、プログレッシブ、ヒューリスティック）で配列を整列するように設計され
、アラインメントにおける異なるスコアリングスキーム（例えば、マトリックスベースま
たは整合性ベース、例えば、最小エントロピー、対の合計、類似性マトリックス、ギャッ
プスコア）を適用する。周知のＭＳＡアルゴリズムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ
（Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90）、Ｋａｌｉｇｎ（Lassmann e
t al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99）、ＭＡＦＦＴ（Katoh et al., 2005, Nuc.
Acids Res., 33:511-8）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113）およ
びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17）が挙げら
れる。
【0021】
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法において使用するためのＭＳ
Ａアルゴリズムを選択する場合の主な特徴の１つは、アルゴリズムがアラインメント中の
ギャップを処理する方法である。配列アラインメント中のギャップは、ギャップの大きさ
に依存するまたは独立であるペナルティ値を割り当てることができる。本方法において、
本明細書に記載される方法において使用されるＭＳＡアルゴリズムは、ギャップのバイア
スされた非系統発生学的処理とは対照的に、例えば、挿入および／または欠失に起因して
、アラインメント中のギャップが欠失または挿入の結果であるかどうかを予測するために
系統発生学的情報を適用することが好ましい。アラインメント中のギャップを処理する適
切な方法および進化分析は、Loytynoja and Goldman, 2008, Science, 320:1632-5に記載
され、本明細書に記載される方法における使用に適した方法でアラインメント中のギャッ
プを適用する市販のアルゴリズムは、確率的アラインメントキット（ＰＲＡＮＫ；Goldma
n Group Software；Loytynoja and Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62）であり、
ＰＲＡＮＫアルゴリズムのバリエーションである。
Ａアルゴリズムを選択する場合の主な特徴の１つは、アルゴリズムがアラインメント中の
ギャップを処理する方法である。配列アラインメント中のギャップは、ギャップの大きさ
に依存するまたは独立であるペナルティ値を割り当てることができる。本方法において、
本明細書に記載される方法において使用されるＭＳＡアルゴリズムは、ギャップのバイア
スされた非系統発生学的処理とは対照的に、例えば、挿入および／または欠失に起因して
、アラインメント中のギャップが欠失または挿入の結果であるかどうかを予測するために
系統発生学的情報を適用することが好ましい。アラインメント中のギャップを処理する適
切な方法および進化分析は、Loytynoja and Goldman, 2008, Science, 320:1632-5に記載
され、本明細書に記載される方法における使用に適した方法でアラインメント中のギャッ
プを適用する市販のアルゴリズムは、確率的アラインメントキット（ＰＲＡＮＫ；Goldma
n Group Software；Loytynoja and Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62）であり、
ＰＲＡＮＫアルゴリズムのバリエーションである。
【0022】
次に、進化モデルは、予測された祖先系統発生を得るために、得られたアラインメント
に適用される（図２（ｂ）参照）。当技術分野において利用可能な多数の進化モデルが存
在し、その各々は、アミノ酸について代替率のわずかに異なるマトリックスを適用する。
限定されないが、進化のモデルを適用するためのアルゴリズムとしては、Ｄａｙｈｏｆｆ
モデル（例えば、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０；Dayhoff et al., 1978,
In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), pp. 345-52, National B
iomedical Research Foundation, Washington D.C.）、ＪＴＴモデル（Jones et al., 19
92, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）、ＷＡＧモデル（Whelan and Goldman, 2001, Mol
. Biol. Evol., 18:691-9）、およびＢｌｏｓｕｍモデル（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ４５、
Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｂｌｏｓｕｍ８０；Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10
915-9）が挙げられる。
に適用される（図２（ｂ）参照）。当技術分野において利用可能な多数の進化モデルが存
在し、その各々は、アミノ酸について代替率のわずかに異なるマトリックスを適用する。
限定されないが、進化のモデルを適用するためのアルゴリズムとしては、Ｄａｙｈｏｆｆ
モデル（例えば、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０；Dayhoff et al., 1978,
In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), pp. 345-52, National B
iomedical Research Foundation, Washington D.C.）、ＪＴＴモデル（Jones et al., 19
92, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）、ＷＡＧモデル（Whelan and Goldman, 2001, Mol
. Biol. Evol., 18:691-9）、およびＢｌｏｓｕｍモデル（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ４５、
Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｂｌｏｓｕｍ８０；Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10
915-9）が挙げられる。
【0023】
さらに、構造と機能が進化モデルに課す制約はそれ自体、例えば、いくつかの位置は不
変であること（「＋Ｉ」；Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31）、いくつかの位置
は異なる速度の変化を受けること（「＋Ｇ」；Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-
1401）、および／またはヌクレオチドもしくはアミノ酸の平衡頻度がアラインメントと同
じであること（「＋Ｆ」；Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を考慮するこ
とによってモデリングされ得る。
変であること（「＋Ｉ」；Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31）、いくつかの位置
は異なる速度の変化を受けること（「＋Ｇ」；Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-
1401）、および／またはヌクレオチドもしくはアミノ酸の平衡頻度がアラインメントと同
じであること（「＋Ｆ」；Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を考慮するこ
とによってモデリングされ得る。
【0024】
進化の１つまたは複数のモデルの適応度は、赤池情報量規準（ＡＩＣ；Akaike, 1973,
In Second International Symposium on Information Theory, Petrov and Csaki, eds.,
pp 267-81, Budapest, Akademiai Kiado）、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ；Schwarz, 1978
, Ann. Statist. 6:461-4）、またはそれらのバリエーションもしくは組合せを用いて評
価することができる。さらに、ＡＩＣ、ＢＩＣまたはそれらのバリエーションもしくは組
合せは、進化モデルにおける１つまたは複数のパラメータ（例えば、上記で検討した制約
）を含むという相対的な重要性を評価するために使用され得る。
In Second International Symposium on Information Theory, Petrov and Csaki, eds.,
pp 267-81, Budapest, Akademiai Kiado）、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ；Schwarz, 1978
, Ann. Statist. 6:461-4）、またはそれらのバリエーションもしくは組合せを用いて評
価することができる。さらに、ＡＩＣ、ＢＩＣまたはそれらのバリエーションもしくは組
合せは、進化モデルにおける１つまたは複数のパラメータ（例えば、上記で検討した制約
）を含むという相対的な重要性を評価するために使用され得る。
【0025】
以下の実施例の項で説明されるように、ＰｒｏＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bi
oinformatics, 27(8):1164-5）は、最小ＡＩＣに基づいて、ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズム
がＡＡＶ進化のために最も適したモデルであったということを決定するために用いること
ができる。ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズムはまた、ＡＡＶキャプシドポリペプチド以外の祖
先ウイルス配列を予測するために用いられてもよいことが当業者に理解されるであろうが
、しかしながら、また、データセットと適応度スコアに応じて、進化の異なるモデルがよ
り適切であり得ることが当業者に理解されるであろう。
oinformatics, 27(8):1164-5）は、最小ＡＩＣに基づいて、ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズム
がＡＡＶ進化のために最も適したモデルであったということを決定するために用いること
ができる。ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズムはまた、ＡＡＶキャプシドポリペプチド以外の祖
先ウイルス配列を予測するために用いられてもよいことが当業者に理解されるであろうが
、しかしながら、また、データセットと適応度スコアに応じて、進化の異なるモデルがよ
り適切であり得ることが当業者に理解されるであろう。
【0026】
進化のモデルが選択され、その適応度が決定されると、ウイルス配列またはその一部の
系統樹を構築することができる。系統樹を構築することは、当技術分野において公知であ
り、典型的には、最大尤度法を採用し、例えば、ＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 200
3, Systematic Biology, 52:696-704)）、ＭＯＬＰＨＹ（Adachi and Hasegawa, 1996, e
d. Tokyo Institute of Statistical Mathematics）、ＢｉｏＮＪ（Gascuel, 1997, Mol.
Biol. Evol., 14:685-95）、またはＰＨＹＬＩＰ（Felsenstein, 1973, Systematic Bio
logy, 22:240-9）によって実施されるものが挙げられる。当業者は、コンピュータ計算の
複雑さと適応度の有益部分とのバランスがアミノ酸置換のモデルにおいて望ましいことを
理解するであろう。
系統樹を構築することができる。系統樹を構築することは、当技術分野において公知であ
り、典型的には、最大尤度法を採用し、例えば、ＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 200
3, Systematic Biology, 52:696-704)）、ＭＯＬＰＨＹ（Adachi and Hasegawa, 1996, e
d. Tokyo Institute of Statistical Mathematics）、ＢｉｏＮＪ（Gascuel, 1997, Mol.
Biol. Evol., 14:685-95）、またはＰＨＹＬＩＰ（Felsenstein, 1973, Systematic Bio
logy, 22:240-9）によって実施されるものが挙げられる。当業者は、コンピュータ計算の
複雑さと適応度の有益部分とのバランスがアミノ酸置換のモデルにおいて望ましいことを
理解するであろう。
【0027】
所望により、系統樹を有意性について評価することができる。多数の統計的方法が、モ
デルの有意性を評価するために利用可能であり、日常的に使用され、限定されないが、ブ
ートストラップ、ジャックナイフ、交差検定、並べ替え検定またはそれらの組合せもしく
はバリエーションが挙げられる。有意性はまた、例えば、おおよその尤度比検定（ａＬＲ
Ｔ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を用いて評価され
得る。
デルの有意性を評価するために利用可能であり、日常的に使用され、限定されないが、ブ
ートストラップ、ジャックナイフ、交差検定、並べ替え検定またはそれらの組合せもしく
はバリエーションが挙げられる。有意性はまた、例えば、おおよその尤度比検定（ａＬＲ
Ｔ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を用いて評価され
得る。
【0028】
系統発生のいずれかの系統発生的な節（例えば、内部系統発生の節）において、配列は
、配列の各位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を概算することに
よって再構築することができまる（図２（ｃ））。系統発生的な節は、予測された祖先の
系統樹内の中間進化の分岐点を指す。本明細書で使用するとき、「進化の確率」とは、考
慮されないモデル、例えば、コドン使用における進化シフトとは対照的に、進化モデルに
基づいて、特定の位置に特定のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する確率を指す。特定
の位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を考慮する例示的なモデル
は、例えば、限定されないが、最大尤度法による系統発生学的分析（ＰＡＭＬ；Yang, 19
97, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6）または節約法を用いる系統発生学的分析（ＰＡ
ＵＰ；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）を含む
任意の数の最大尤度法を用いて概算され得る。
、配列の各位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を概算することに
よって再構築することができまる（図２（ｃ））。系統発生的な節は、予測された祖先の
系統樹内の中間進化の分岐点を指す。本明細書で使用するとき、「進化の確率」とは、考
慮されないモデル、例えば、コドン使用における進化シフトとは対照的に、進化モデルに
基づいて、特定の位置に特定のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する確率を指す。特定
の位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を考慮する例示的なモデル
は、例えば、限定されないが、最大尤度法による系統発生学的分析（ＰＡＭＬ；Yang, 19
97, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6）または節約法を用いる系統発生学的分析（ＰＡ
ＵＰ；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）を含む
任意の数の最大尤度法を用いて概算され得る。
【0029】
各位置での特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の概算された進化の確率に基づいて
、祖先ウイルスまたはその一部の予測される配列はアセンブルされ、完全または部分的に
合成の核酸またはポリペプチド配列を形成することができる。所望により、任意の残基が
節に沿って所定の節で所定の状態にあった尤度を計算することができ、特定の閾値下に計
算された事後確率を有する配列に沿った任意の位置を同定することができる（図２（ｄ）
）。このようにして、特定の閾値未満の確率を有するそれらの位置でバリエーションを含
み得る祖先足場配列を生成することができる。
、祖先ウイルスまたはその一部の予測される配列はアセンブルされ、完全または部分的に
合成の核酸またはポリペプチド配列を形成することができる。所望により、任意の残基が
節に沿って所定の節で所定の状態にあった尤度を計算することができ、特定の閾値下に計
算された事後確率を有する配列に沿った任意の位置を同定することができる（図２（ｄ）
）。このようにして、特定の閾値未満の確率を有するそれらの位置でバリエーションを含
み得る祖先足場配列を生成することができる。
【0030】
本明細書に記載の方法を用いて予測される祖先配列が核酸配列である場合、配列は、ア
ミノ酸配列に効率的に翻訳され得るように最適化されたコドンであり得る。様々な生物の
コドン使用頻度表は当技術分野において公知である。しかしながら、場合により、コドン
使用頻度表は、祖先足場配列に対する相同性（例えば、少なくとも９０％の配列同一性）
を有する１つまたは複数の同時代の配列に基づいて設計することができ、本明細書に記載
される祖先配列は哺乳動物（例えば、ヒト）コドン使用頻度に向けて最適されたコドンで
あり得る。
ミノ酸配列に効率的に翻訳され得るように最適化されたコドンであり得る。様々な生物の
コドン使用頻度表は当技術分野において公知である。しかしながら、場合により、コドン
使用頻度表は、祖先足場配列に対する相同性（例えば、少なくとも９０％の配列同一性）
を有する１つまたは複数の同時代の配列に基づいて設計することができ、本明細書に記載
される祖先配列は哺乳動物（例えば、ヒト）コドン使用頻度に向けて最適されたコドンで
あり得る。
【0031】
祖先ウイルス配列を予測するための、本明細書に概説されているいずれかまたは全ての
ステップは、プロセッサまたはマイクロプロセッサを使用したコンピュータ（例えば、イ
ンシリコ）上で実行またはシミュレートすることができる。
ステップは、プロセッサまたはマイクロプロセッサを使用したコンピュータ（例えば、イ
ンシリコ）上で実行またはシミュレートすることができる。
【0032】
祖先アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）足場配列
本明細書に記載される方法は、（下記の実施例において詳細に説明される）同時代のキ
ャプシド配列を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された。ＡＡＶは、治療用遺
伝子移入ベクターおよび遺伝子ワクチンビヒクルとして考えられるが、ヒト集団において
高い血清有病率を示す。本明細書に記載される方法を用いて、系統樹は、同時代のＡＡＶ
配列によりアセンブルされ（図３を参照）、予測された祖先足場配列は、指定された系統
発生学的な節で得られた（表１）。本明細書で使用されるとき、祖先足場配列は、本明細
書に記載される方法を用いて（例えば、進化可能性と進化モデリングを用いて）構築され
、自然界に存在していたことが知られていない配列を意味する。本明細書で使用するとき
、祖先足場配列は、典型的には、特定の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の頻度
を用いて構築されるコンセンサス配列とは異なる。
本明細書に記載される方法は、（下記の実施例において詳細に説明される）同時代のキ
ャプシド配列を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された。ＡＡＶは、治療用遺
伝子移入ベクターおよび遺伝子ワクチンビヒクルとして考えられるが、ヒト集団において
高い血清有病率を示す。本明細書に記載される方法を用いて、系統樹は、同時代のＡＡＶ
配列によりアセンブルされ（図３を参照）、予測された祖先足場配列は、指定された系統
発生学的な節で得られた（表１）。本明細書で使用されるとき、祖先足場配列は、本明細
書に記載される方法を用いて（例えば、進化可能性と進化モデリングを用いて）構築され
、自然界に存在していたことが知られていない配列を意味する。本明細書で使用するとき
、祖先足場配列は、典型的には、特定の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の頻度
を用いて構築されるコンセンサス配列とは異なる。
【0033】
【表1】
【0034】
足場ポリペプチドおよび核酸の配列ならびに確率の位置での可能なヌクレオチドまたは
残基のセットを配列表に示す。例えば、Ａｎｃ８０ポリペプチドの足場配列を配列番号１
に示し、これは、配列番号２に示されるＡｎｃ８０核酸の足場配列によってコードされる
。配列表に示されるように、Ａｎｃ８０の足場配列は、２つの残基のいずれかが推定され
た１１位を含有する。したがって、Ａｎｃ８０足場配列は、２０４８（２１１）個の異な
る配列を表す。Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａｎｃ
１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０ポリペプチドの追加の足場配列
を配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および４２に示す；これらのポリペ
プチドは、それぞれＡｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａ
ｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０核酸の足場配列によってコ
ードされ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および４３に示される。
各祖先配列について、確率の各位置における可能なヌクレオチドまたは残基のセットが示
される。
残基のセットを配列表に示す。例えば、Ａｎｃ８０ポリペプチドの足場配列を配列番号１
に示し、これは、配列番号２に示されるＡｎｃ８０核酸の足場配列によってコードされる
。配列表に示されるように、Ａｎｃ８０の足場配列は、２つの残基のいずれかが推定され
た１１位を含有する。したがって、Ａｎｃ８０足場配列は、２０４８（２１１）個の異な
る配列を表す。Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａｎｃ
１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０ポリペプチドの追加の足場配列
を配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および４２に示す；これらのポリペ
プチドは、それぞれＡｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａ
ｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０核酸の足場配列によってコ
ードされ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および４３に示される。
各祖先配列について、確率の各位置における可能なヌクレオチドまたは残基のセットが示
される。
【0035】
ウイルスまたはその一部の祖先配列を予測するための本明細書に記載される方法の有効
性を実証するために、ＡＡＶ Ａｎｃ８０節での２０４８個の予測された祖先配列のライ
ブラリーを作製し、本明細書に記載されるように、同時代のキャプシドポリペプチドでア
センブルされたウイルス粒子と比較して、低い血清有病率、いくつかの例では有意に低い
血清有病率を示す生存するウイルス粒子を形成することが実証された。
性を実証するために、ＡＡＶ Ａｎｃ８０節での２０４８個の予測された祖先配列のライ
ブラリーを作製し、本明細書に記載されるように、同時代のキャプシドポリペプチドでア
センブルされたウイルス粒子と比較して、低い血清有病率、いくつかの例では有意に低い
血清有病率を示す生存するウイルス粒子を形成することが実証された。
【0036】
祖先ウイルス粒子を作製する方法
ウイルスまたはその一部の予測された祖先配列を取得した後、実際の核酸分子および／
またはポリペプチド（単数または複数）を生成することができる。例えばインシリコで得
られた配列に基づいて、核酸分子またはポリペプチドを生成する方法は、当技術分野にお
いて公知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポ
リペプチドを生成するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下によ
り詳細に検討される。
ウイルスまたはその一部の予測された祖先配列を取得した後、実際の核酸分子および／
またはポリペプチド（単数または複数）を生成することができる。例えばインシリコで得
られた配列に基づいて、核酸分子またはポリペプチドを生成する方法は、当技術分野にお
いて公知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポ
リペプチドを生成するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下によ
り詳細に検討される。
【0037】
祖先ポリペプチドが生成されると、または祖先核酸分子が生成され、祖先ポリペプチド
を生成するように発現されると、祖先ポリペプチドは、例えば、パッケージング宿主細胞
を用いて、祖先ウイルス粒子にアセンブルされ得る。ウイルス粒子の構成成分（例えば、
ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列）は、本明細書に記載される１
つまたは複数のベクターを使用してパッケージング宿主細胞に、一過性または安定に導入
することができる。ウイルス粒子の構成成分の１つまたは複数は、本明細書に記載される
予測された祖先配列に基づくことができ、一方、残りの構成成分は同時代の配列に基づく
ことができる。いくつかの例において、ウイルス粒子全体は、予測された祖先配列に基づ
くことができる。
を生成するように発現されると、祖先ポリペプチドは、例えば、パッケージング宿主細胞
を用いて、祖先ウイルス粒子にアセンブルされ得る。ウイルス粒子の構成成分（例えば、
ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列）は、本明細書に記載される１
つまたは複数のベクターを使用してパッケージング宿主細胞に、一過性または安定に導入
することができる。ウイルス粒子の構成成分の１つまたは複数は、本明細書に記載される
予測された祖先配列に基づくことができ、一方、残りの構成成分は同時代の配列に基づく
ことができる。いくつかの例において、ウイルス粒子全体は、予測された祖先配列に基づ
くことができる。
【0038】
このような祖先ウイルス粒子は、通常の方法を用いて精製することができる。本明細書
で使用するとき、「精製された」ウイルス粒子とは、作製された混合物中の構成成分、例
えば、限定されないが、ウイルス構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列）、パッケ
ージング宿主細胞および部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子から取り
除かれるウイルス成分を意味する。
で使用するとき、「精製された」ウイルス粒子とは、作製された混合物中の構成成分、例
えば、限定されないが、ウイルス構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列）、パッケ
ージング宿主細胞および部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子から取り
除かれるウイルス成分を意味する。
【0039】
アセンブルされると、祖先ウイルス粒子は、例えば、複製する能力；遺伝子移入特性；
受容体結合能；および／または集団（例えば、ヒト集団）における血清有病率についてス
クリーニングすることができる。ウイルス粒子が複製し得るかどうかの決定は当技術分野
において通常行われ、典型的には、ある量のウイルス粒子で宿主細胞を感染させ、ウイル
ス粒子が経時的に数が増加するかどうかを決定することを含む。また、ウイルス粒子が遺
伝子移入を行うことができるかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的に
は、導入遺伝子（例えば、以下でより詳細に検討されるレポーター遺伝子などの検出可能
な導入遺伝子）を含有するウイルス粒子で宿主細胞を感染させることを含む。ウイルスの
感染およびクリアランス後、宿主細胞は導入遺伝子の存在または非存在について評価され
得る。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかの決定は当技術分野において通常行
われ、このような方法はインビトロまたはインビボで行うことができる。
受容体結合能；および／または集団（例えば、ヒト集団）における血清有病率についてス
クリーニングすることができる。ウイルス粒子が複製し得るかどうかの決定は当技術分野
において通常行われ、典型的には、ある量のウイルス粒子で宿主細胞を感染させ、ウイル
ス粒子が経時的に数が増加するかどうかを決定することを含む。また、ウイルス粒子が遺
伝子移入を行うことができるかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的に
は、導入遺伝子（例えば、以下でより詳細に検討されるレポーター遺伝子などの検出可能
な導入遺伝子）を含有するウイルス粒子で宿主細胞を感染させることを含む。ウイルスの
感染およびクリアランス後、宿主細胞は導入遺伝子の存在または非存在について評価され
得る。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかの決定は当技術分野において通常行
われ、このような方法はインビトロまたはインビボで行うことができる。
【0040】
ウイルス粒子の血清有病率の決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、個体
の特定の集団からの試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の有病率を決定
するためのイムノアッセイの使用を含む。血清有病率は、血清反応陽性である（すなわち
、特定の病原体または免疫原に曝露されている）集団中の対象の割合を意味することが当
技術分野において理解され、調べられた集団における個体の総数によって割った、特定の
病原体または免疫原に対する抗体を産生する集団における対象の数として計算される。イ
ムノアッセイは、当技術分野において周知であり、限定されないが、イムノブロット、ウ
ェスタンブロット、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。本明細書に示されるように、祖
先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子（すなわち、同時代のウイルス配列またはその
一部を用いてアセンブルされたウイルス粒子）よりも低い血清有病率を示す。単に一例と
して、Xu et al. （2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6）；Paul et al. （19
94, J. Infect. Dis., 169:801-6）；Sauerbrei et al. （2011, Eurosurv., 16(44):3）
；およびSakhria et al. （2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429）を参照されたい。
それぞれは、所定の集団における特定の抗体についての血清有病率を決定した。
の特定の集団からの試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の有病率を決定
するためのイムノアッセイの使用を含む。血清有病率は、血清反応陽性である（すなわち
、特定の病原体または免疫原に曝露されている）集団中の対象の割合を意味することが当
技術分野において理解され、調べられた集団における個体の総数によって割った、特定の
病原体または免疫原に対する抗体を産生する集団における対象の数として計算される。イ
ムノアッセイは、当技術分野において周知であり、限定されないが、イムノブロット、ウ
ェスタンブロット、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。本明細書に示されるように、祖
先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子（すなわち、同時代のウイルス配列またはその
一部を用いてアセンブルされたウイルス粒子）よりも低い血清有病率を示す。単に一例と
して、Xu et al. （2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6）；Paul et al. （19
94, J. Infect. Dis., 169:801-6）；Sauerbrei et al. （2011, Eurosurv., 16(44):3）
；およびSakhria et al. （2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429）を参照されたい。
それぞれは、所定の集団における特定の抗体についての血清有病率を決定した。
【0041】
本明細書に記載されるように、祖先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子よりも低い
程度に中和される。血清試料中の抗体を中和する程度を決定するためにいくつかの方法が
利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を含まない対照試料と
比較して５０％以上の感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。また、Fisher
et al. （1997, Nature Med., 3:306-12）およびManning et al. （1998, Human Gene T
her., 9:477-85）を参照されたい。
程度に中和される。血清試料中の抗体を中和する程度を決定するためにいくつかの方法が
利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を含まない対照試料と
比較して５０％以上の感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。また、Fisher
et al. （1997, Nature Med., 3:306-12）およびManning et al. （1998, Human Gene T
her., 9:477-85）を参照されたい。
【0042】
本明細書において例示される祖先ＡＡＶキャプシドポリペプチドに関して、血清有病率
および／または中和の程度は、例えば、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ
８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子、またはＡＡＶ２キャプシドポリペプチド
もしくはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と比較することができる。
一般的に、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、低いと考えられるヒ
ト集団において、血清有病率および結果として得られる中和を示し、一方、ＡＡＶ２キャ
プシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、高いと考えられるヒト集団において、血清有
病率および結果として中和を示すことが当技術分野において理解される。明らかに、特定
の血清有病率は、調べられる集団と使用される免疫学的方法に依存するが、ＡＡＶ８は約
２２％から最大約３８％の血清有病率を示し、一方、ＡＡＶ２は約４３．５％から最大約
７２％の血清有病率を示す。例えば、Boutin et al. 2010, “Prevalence of serum IgG
and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy po
pulation: implications for gene therapy using AAV vectors,” Hum. Gene Ther., 21
:704-12を参照されたい。さらに、Calcebo et al. 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90
を参照されたい。
および／または中和の程度は、例えば、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ
８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子、またはＡＡＶ２キャプシドポリペプチド
もしくはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と比較することができる。
一般的に、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、低いと考えられるヒ
ト集団において、血清有病率および結果として得られる中和を示し、一方、ＡＡＶ２キャ
プシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、高いと考えられるヒト集団において、血清有
病率および結果として中和を示すことが当技術分野において理解される。明らかに、特定
の血清有病率は、調べられる集団と使用される免疫学的方法に依存するが、ＡＡＶ８は約
２２％から最大約３８％の血清有病率を示し、一方、ＡＡＶ２は約４３．５％から最大約
７２％の血清有病率を示す。例えば、Boutin et al. 2010, “Prevalence of serum IgG
and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy po
pulation: implications for gene therapy using AAV vectors,” Hum. Gene Ther., 21
:704-12を参照されたい。さらに、Calcebo et al. 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90
を参照されたい。
【0043】
予測されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）祖先核酸配列およびポリペプチド配列
Ａｎｃ８０節の予測される祖先キャプシドポリペプチドをコードするライブラリーから
の多数の異なるクローンを配列決定し、代表的なＡＡＶの予測されるキャプシドポリペプ
チドのアミノ酸配列を配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ
５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列
番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａ
ｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示す。当業者は、それぞ
れのアミノ酸配列をコードする核酸配列が容易に決定され得ることを理解する。
Ａｎｃ８０節の予測される祖先キャプシドポリペプチドをコードするライブラリーから
の多数の異なるクローンを配列決定し、代表的なＡＡＶの予測されるキャプシドポリペプ
チドのアミノ酸配列を配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ
５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列
番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａ
ｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示す。当業者は、それぞ
れのアミノ酸配列をコードする核酸配列が容易に決定され得ることを理解する。
【0044】
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に示される配列を有す
る予測される祖先キャプシドポリペプチドに加えて、配列番号１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプ
チドと少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、
少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するポリペプチ
ドが提供される。同様に、祖先キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくと
も９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８
％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有する核酸分子が提供される。
る予測される祖先キャプシドポリペプチドに加えて、配列番号１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプ
チドと少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、
少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するポリペプチ
ドが提供される。同様に、祖先キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくと
も９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８
％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有する核酸分子が提供される。
【0045】
配列同一性パーセントの計算において、２つの配列が整列され、２つの配列間のヌクレ
オチドまたはアミノ酸残基の同一の合致数が決定される。同一の合致数は、整列された領
域の長さ（すなわち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）によって割られ
、パーセント配列同一性の値に到達させるために１００を乗じる。整列された領域の長さ
は、最も短い配列の全長サイズまでの１つまたは両方の配列の一部であり得ることが理解
される。また、単一の配列は、１を超える他の配列と整列させることができ、したがって
、それぞれの整列された領域に対する、異なる配列同一性パーセントの値を有することが
できることが理解される。
オチドまたはアミノ酸残基の同一の合致数が決定される。同一の合致数は、整列された領
域の長さ（すなわち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）によって割られ
、パーセント配列同一性の値に到達させるために１００を乗じる。整列された領域の長さ
は、最も短い配列の全長サイズまでの１つまたは両方の配列の一部であり得ることが理解
される。また、単一の配列は、１を超える他の配列と整列させることができ、したがって
、それぞれの整列された領域に対する、異なる配列同一性パーセントの値を有することが
できることが理解される。
【0046】
配列同一性パーセントを決定するための２つ以上の配列のアラインメントは、ワールド
ワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ（基礎局所
的アラインメント検索ツール）プログラムに組み込まれた、Altschul et al. （1997, Nu
cleic Acids Res., 25:3389-3402）によって記載されるアルゴリズムを用いて行うことが
できる。ＢＬＡＳＴ検索は、Altschul et al.のアルゴリズムを用いて整列された、配列
（核酸またはアミノ酸）と任意の他の配列またはその一部の間の配列同一性パーセントを
決定するために行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を整列させ、核酸配列間の
同一性を比較するために使用されるプログラムであり、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸
配列を整列させ、アミノ酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムである
。配列と別の配列の間の同一性パーセントを計算するためのＢＬＡＳＴプログラムを利用
するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを一般的に使用する。
ワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ（基礎局所
的アラインメント検索ツール）プログラムに組み込まれた、Altschul et al. （1997, Nu
cleic Acids Res., 25:3389-3402）によって記載されるアルゴリズムを用いて行うことが
できる。ＢＬＡＳＴ検索は、Altschul et al.のアルゴリズムを用いて整列された、配列
（核酸またはアミノ酸）と任意の他の配列またはその一部の間の配列同一性パーセントを
決定するために行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を整列させ、核酸配列間の
同一性を比較するために使用されるプログラムであり、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸
配列を整列させ、アミノ酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムである
。配列と別の配列の間の同一性パーセントを計算するためのＢＬＡＳＴプログラムを利用
するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを一般的に使用する。
【0047】
代表的なアラインメントを図４Ａと４Ｂおよび図５Ａと５Ｂに示す。図４Ａと４Ｂは、
祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチドのアラインメントを示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５
（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２
４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（配列番号２６）、Ａｎｃ
８０Ｌ５９（配列番号２０）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）およびＡｎｃ８０Ｌ６
２（配列番号２２）と指定される。図４Ａと４Ｂに示されるアラインメントは、１１部位
のそれぞれで予測されたバリエーションと、クローニングのアーティファクトであり得る
、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）の６０９Ｅ位での１つの非同義突然変異を確認する
。図５Ａと５Ｂは、祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（Ａｎｃ８０Ｌ６５（配
列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）
、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）、Ａｎｃ８０
Ｌ６２（配列番号２２）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（Ｓ配列番号２６）およびＡｎｃ８０Ｌ５９
（配列番号２０））と同時代のＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（ＡＡＶ８（配列
番号２７）、ＡＡＶ９（配列番号２８）、ＡＡＶ６（配列番号２９）、ＡＡＶ１（配列番
号３０）、ＡＡＶ２（配列番号３１）、ＡＡＶ３（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番
号３３）およびＡＡＶ７（配列番号３４））の間のアラインメントを示す。図５Ａと５Ｂ
におけるアラインメントは、祖先ＡＡＶ配列が、同時代のＡＡＶ配列と約８５％～９１％
の配列同一性を有することを示す。
祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチドのアラインメントを示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５
（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２
４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（配列番号２６）、Ａｎｃ
８０Ｌ５９（配列番号２０）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）およびＡｎｃ８０Ｌ６
２（配列番号２２）と指定される。図４Ａと４Ｂに示されるアラインメントは、１１部位
のそれぞれで予測されたバリエーションと、クローニングのアーティファクトであり得る
、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）の６０９Ｅ位での１つの非同義突然変異を確認する
。図５Ａと５Ｂは、祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（Ａｎｃ８０Ｌ６５（配
列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）
、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）、Ａｎｃ８０
Ｌ６２（配列番号２２）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（Ｓ配列番号２６）およびＡｎｃ８０Ｌ５９
（配列番号２０））と同時代のＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（ＡＡＶ８（配列
番号２７）、ＡＡＶ９（配列番号２８）、ＡＡＶ６（配列番号２９）、ＡＡＶ１（配列番
号３０）、ＡＡＶ２（配列番号３１）、ＡＡＶ３（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番
号３３）およびＡＡＶ７（配列番号３４））の間のアラインメントを示す。図５Ａと５Ｂ
におけるアラインメントは、祖先ＡＡＶ配列が、同時代のＡＡＶ配列と約８５％～９１％
の配列同一性を有することを示す。
【0048】
また、ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクターが提供される。発現ベク
ターを含むベクターは市販され、または組換え技術によって生成することができる。核酸
分子を含有するベクターは、このような核酸分子に作動可能に連結した、発現のための１
つまたは複数のエレメントを有することができ、さらに、選択可能なマーカーをコードす
る核酸分子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および／またはポリペプチド（例えば、６
ｘＨｉｓタグ）の精製に使用され得る核酸分子を含むことができる。発現のためのエレメ
ントには、核酸コード配列に指向し、その発現を制御する核酸配列を含む。発現エレメン
トの一例はプロモーター配列である。また、発現エレメントは、１つまたは複数のイント
ロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸分子の発現を調節する誘導可能な
エレメントを含むことができる。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物または
ウイルス起源であってもよく、ベクターは、異なる起源からの発現エレメントの組合せを
含有することができる。本明細書で使用するとき、作動可能に連結したとは、発現のため
のエレメントが、コード配列に指向し、またはその発現を調節するような方法で、コード
配列に対してベクターに配置されることを意味する。
ターを含むベクターは市販され、または組換え技術によって生成することができる。核酸
分子を含有するベクターは、このような核酸分子に作動可能に連結した、発現のための１
つまたは複数のエレメントを有することができ、さらに、選択可能なマーカーをコードす
る核酸分子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および／またはポリペプチド（例えば、６
ｘＨｉｓタグ）の精製に使用され得る核酸分子を含むことができる。発現のためのエレメ
ントには、核酸コード配列に指向し、その発現を制御する核酸配列を含む。発現エレメン
トの一例はプロモーター配列である。また、発現エレメントは、１つまたは複数のイント
ロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸分子の発現を調節する誘導可能な
エレメントを含むことができる。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物または
ウイルス起源であってもよく、ベクターは、異なる起源からの発現エレメントの組合せを
含有することができる。本明細書で使用するとき、作動可能に連結したとは、発現のため
のエレメントが、コード配列に指向し、またはその発現を調節するような方法で、コード
配列に対してベクターに配置されることを意味する。
【0049】
核酸分子、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター）中の核酸分
子は、宿主細胞に導入され得る。「宿主細胞」なる用語は、核酸分子が導入された特定の
細胞（単数または複数）を意味するだけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後
代もまた意味する。多数の適切な宿主細胞は当業者に公知である；宿主細胞は、原核細胞
（例えば、大腸菌（E. coli））または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細
胞、哺乳動物細胞）であり得る。代表的な宿主細胞としては、限定されないが、ヒト、サ
ル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥ
ＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳ
Ｃ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１
２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびに初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細
胞が挙げられる。宿主細胞に核酸分子を導入する方法は当技術分野において公知であり、
限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフ
ェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入（例えば、形質導入
）が含まれる。
子は、宿主細胞に導入され得る。「宿主細胞」なる用語は、核酸分子が導入された特定の
細胞（単数または複数）を意味するだけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後
代もまた意味する。多数の適切な宿主細胞は当業者に公知である；宿主細胞は、原核細胞
（例えば、大腸菌（E. coli））または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細
胞、哺乳動物細胞）であり得る。代表的な宿主細胞としては、限定されないが、ヒト、サ
ル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥ
ＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳ
Ｃ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１
２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびに初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細
胞が挙げられる。宿主細胞に核酸分子を導入する方法は当技術分野において公知であり、
限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフ
ェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入（例えば、形質導入
）が含まれる。
【0050】
ポリペプチドに関して、「精製された」とは、自然にそれに付随する細胞構成成分から
分離または精製されたポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を意味す
る。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％）である場合に「精製された」と考
えられ、ポリペプチドと自然に会合される天然に存在する分子を含まない。化学的に合成
されるポリペプチドは、本質的に、自然にそれに付随する構成成分から分離されるため、
合成ポリペプチドは「精製された」と考えられるが、さらに、ポリペプチドを合成するた
めに使用される構成成分（例えば、アミノ酸残基）から取り除くことができる。核酸分子
に関して、「単離された」とは、通常、ゲノム中で関連付けられる他の核酸分子から分離
された核酸分子を意味する。さらに、単離された核酸分子は、組換えまたは合成の核酸分
子などの遺伝子操作された核酸分子を含むことができる。
分離または精製されたポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を意味す
る。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％）である場合に「精製された」と考
えられ、ポリペプチドと自然に会合される天然に存在する分子を含まない。化学的に合成
されるポリペプチドは、本質的に、自然にそれに付随する構成成分から分離されるため、
合成ポリペプチドは「精製された」と考えられるが、さらに、ポリペプチドを合成するた
めに使用される構成成分（例えば、アミノ酸残基）から取り除くことができる。核酸分子
に関して、「単離された」とは、通常、ゲノム中で関連付けられる他の核酸分子から分離
された核酸分子を意味する。さらに、単離された核酸分子は、組換えまたは合成の核酸分
子などの遺伝子操作された核酸分子を含むことができる。
【0051】
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過および／またはヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィーなどの公知の方法により天然供給源（例えば、生物学的試料）から取
得（例えば、精製）され得る。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターに
核酸分子を発現させることによって、または化学合成によって得ることができる。ポリペ
プチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて測定することができる。同様に、
核酸分子は、通常行われる方法、例えば、限定されないが、組換え核酸技術（例えば、制
限酵素消化およびライゲーション）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、PCR
Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor La
boratory Press, 1995参照）を用いて取得（例えば、単離）され得る。さらに、単離され
た核酸分子は、化学的に合成することができる。
クロマトグラフィーなどの公知の方法により天然供給源（例えば、生物学的試料）から取
得（例えば、精製）され得る。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターに
核酸分子を発現させることによって、または化学合成によって得ることができる。ポリペ
プチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて測定することができる。同様に、
核酸分子は、通常行われる方法、例えば、限定されないが、組換え核酸技術（例えば、制
限酵素消化およびライゲーション）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、PCR
Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor La
boratory Press, 1995参照）を用いて取得（例えば、単離）され得る。さらに、単離され
た核酸分子は、化学的に合成することができる。
【0052】
祖先ウイルスまたはその一部を使用する方法
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部、特に、同時代のウイルスまたはそ
の一部と比較して低減した血清有病率を示すものは、多数の研究および／または治療用途
において使用することができる。例えば、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその
一部は、ヒトまたは動物の医療において、遺伝子治療（例えば、遺伝子移入のためのベク
ターもしくはベクターシステムにおいて）またはワクチン接種（例えば、抗原提示用）の
ために使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される祖先ウイルスまた
はその一部は、遺伝子付加、遺伝子増加、ポリペプチド製剤の遺伝子送達、遺伝子ワクチ
ン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達
、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング、遺伝子免疫、光遺伝学的遺
伝子治療、遺伝子組換え、ＤＮＡワクチン接種またはＤＮＡ免疫のために使用することが
できる。
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部、特に、同時代のウイルスまたはそ
の一部と比較して低減した血清有病率を示すものは、多数の研究および／または治療用途
において使用することができる。例えば、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその
一部は、ヒトまたは動物の医療において、遺伝子治療（例えば、遺伝子移入のためのベク
ターもしくはベクターシステムにおいて）またはワクチン接種（例えば、抗原提示用）の
ために使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される祖先ウイルスまた
はその一部は、遺伝子付加、遺伝子増加、ポリペプチド製剤の遺伝子送達、遺伝子ワクチ
ン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達
、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング、遺伝子免疫、光遺伝学的遺
伝子治療、遺伝子組換え、ＤＮＡワクチン接種またはＤＮＡ免疫のために使用することが
できる。
【0053】
宿主細胞は、インビトロで（例えば、培養下で増殖中に）またはインビボで（例えば、
対象において）祖先ウイルスまたはその一部により形質導入あるいは感染され得る。イン
ビトロで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞は本明
細書に記載される；インビボで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染さ
れ得る宿主細胞としては、限定されないが、脳、肝臓、筋肉、肺、眼（例えば、網膜、網
膜色素上皮）、腎臓、心臓、生殖腺（例えば、精巣、子宮、卵巣）、皮膚、鼻腔、消化器
系、膵臓、膵島細胞、神経細胞、リンパ球、耳（例えば、内耳）、毛包および／または腺
（例えば、甲状腺）が挙げられる。
対象において）祖先ウイルスまたはその一部により形質導入あるいは感染され得る。イン
ビトロで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞は本明
細書に記載される；インビボで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染さ
れ得る宿主細胞としては、限定されないが、脳、肝臓、筋肉、肺、眼（例えば、網膜、網
膜色素上皮）、腎臓、心臓、生殖腺（例えば、精巣、子宮、卵巣）、皮膚、鼻腔、消化器
系、膵臓、膵島細胞、神経細胞、リンパ球、耳（例えば、内耳）、毛包および／または腺
（例えば、甲状腺）が挙げられる。
【0054】
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、（他のウイルス配列とシスまた
はトランスである）導入遺伝子を含むように修飾することができる。導入遺伝子は、例え
ば、レポーター遺伝子（例えば、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）
、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼ、また
は赤血球凝集素もしくはＭｙｃなどの抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）または
治療遺伝子（例えば、ホルモンもしくはそれらの受容体、増殖因子またはその受容体、分
化因子またはその受容体、免疫系調節因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキ
ン）またはその受容体、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害性ＲＮＡもしくは触媒ＲＮＡ）また
は標的抗原（例えば、発癌性抗原、自己免疫抗原）をコードする遺伝子）であり得る。
はトランスである）導入遺伝子を含むように修飾することができる。導入遺伝子は、例え
ば、レポーター遺伝子（例えば、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）
、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼ、また
は赤血球凝集素もしくはＭｙｃなどの抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）または
治療遺伝子（例えば、ホルモンもしくはそれらの受容体、増殖因子またはその受容体、分
化因子またはその受容体、免疫系調節因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキ
ン）またはその受容体、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害性ＲＮＡもしくは触媒ＲＮＡ）また
は標的抗原（例えば、発癌性抗原、自己免疫抗原）をコードする遺伝子）であり得る。
【0055】
特定の導入遺伝子は、少なくとも部分的に、治療される特定の疾患または欠損症に依存
する。単に一例として、遺伝子移入または遺伝子治療は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞
性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム貯蔵障害、先天性代謝異常（例えば、フェ
ニルケトン尿症などのアミノ酸代謝の先天性異常、プロピオン酸血症などの有機酸代謝の
先天性異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）などの脂肪酸代謝の先天異
常）、癌、色覚異常、コーンロッドジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性症
）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満症、炎症性
腸疾患、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠状動脈性心臓病、家
族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルトヤ
コブ病、鎌状赤血球病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不
耐症、脂質蓄積障害（例えば、ニーマンピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠
如、ＩＩ型糖原病（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイバー症候群）、先天性
甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）および／または筋萎縮性側索硬化症（
ＡＬＳ）の治療に適用することができる。
する。単に一例として、遺伝子移入または遺伝子治療は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞
性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム貯蔵障害、先天性代謝異常（例えば、フェ
ニルケトン尿症などのアミノ酸代謝の先天性異常、プロピオン酸血症などの有機酸代謝の
先天性異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）などの脂肪酸代謝の先天異
常）、癌、色覚異常、コーンロッドジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性症
）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満症、炎症性
腸疾患、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠状動脈性心臓病、家
族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルトヤ
コブ病、鎌状赤血球病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不
耐症、脂質蓄積障害（例えば、ニーマンピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠
如、ＩＩ型糖原病（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイバー症候群）、先天性
甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）および／または筋萎縮性側索硬化症（
ＡＬＳ）の治療に適用することができる。
【0056】
また、導入遺伝子は、対象（例えば、ヒト、動物（例えば、コンパニオンアニマル、家
畜、絶滅寸前の動物）の免疫に有用である免疫原であり得る。例えば、免疫原は、生物（
例えば、病原生物）またはその免疫原性部分もしくはその構成成分（例えば、毒素ポリペ
プチドまたはその副生成物）から得ることができる。一例として、免疫原性ポリペプチド
を得ることができる病原生物としては、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロ
ウイルス、オルトミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば
、肺炎球菌（Pneumococci）、ブドウ球菌（Staphylococci）、リステリア菌（Listeria）
、シュードモナス属（Pseudomonas））および真核生物（例えば、アメーバ症、マラリア
、リーシュマニア症、線虫）が挙げられる。本明細書に記載される方法およびこのような
方法によって製造される組成物は、任意の特定の導入遺伝子によって限定されるものでは
ないことが理解される。
畜、絶滅寸前の動物）の免疫に有用である免疫原であり得る。例えば、免疫原は、生物（
例えば、病原生物）またはその免疫原性部分もしくはその構成成分（例えば、毒素ポリペ
プチドまたはその副生成物）から得ることができる。一例として、免疫原性ポリペプチド
を得ることができる病原生物としては、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロ
ウイルス、オルトミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば
、肺炎球菌（Pneumococci）、ブドウ球菌（Staphylococci）、リステリア菌（Listeria）
、シュードモナス属（Pseudomonas））および真核生物（例えば、アメーバ症、マラリア
、リーシュマニア症、線虫）が挙げられる。本明細書に記載される方法およびこのような
方法によって製造される組成物は、任意の特定の導入遺伝子によって限定されるものでは
ないことが理解される。
【0057】
通常、生理学的に適合した担体中に懸濁される祖先ウイルスまたはその一部を対象（例
えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適切な担体としては、様々
な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化されてもよい生理食塩水、
ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチンおよ
び水が含まれる。祖先ウイルスまたはその一部は、細胞に形質導入または感染させ、過度
の副作用なしに治療上の利益を提供するために、遺伝子移入および発現の十分なレベルを
与えるのに十分な量で投与される。従来のおよび医薬として許容される投与経路としては
、限定されないが、例えば、肝臓もしくは肺などの臓器への直接送達、経口、鼻腔内、気
管内、吸入による、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与経路に
よるものが挙げられる。所望により、投与経路を組み合わせることができる。
えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適切な担体としては、様々
な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化されてもよい生理食塩水、
ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチンおよ
び水が含まれる。祖先ウイルスまたはその一部は、細胞に形質導入または感染させ、過度
の副作用なしに治療上の利益を提供するために、遺伝子移入および発現の十分なレベルを
与えるのに十分な量で投与される。従来のおよび医薬として許容される投与経路としては
、限定されないが、例えば、肝臓もしくは肺などの臓器への直接送達、経口、鼻腔内、気
管内、吸入による、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与経路に
よるものが挙げられる。所望により、投与経路を組み合わせることができる。
【0058】
対象に投与される祖先ウイルスまたはその一部の用量は、主に、治療される状態、なら
びに対象の年齢、体重および健康などの因子に依存する。例えば、ヒト対象に投与される
祖先ウイルスまたはその一部の治療的有効量は、一般的に、祖先ウイルスの約１×１０１
～１×１０１２のゲノムコピー（ＧＣ）（例えば、約１×１０３～１×１０９ＧＣ）の濃
度を含有する約０．１ｍｌ～約１０ｍｌの溶液の範囲にある。導入遺伝子の導入および／
または発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質アッセイによって、投与後の種々の時点
でモニターすることができる。いくつかの例において、導入遺伝子の発現レベルは、投薬
の頻度および／または量を決定するためにモニターすることができる。また、治療目的の
ために記載されたものと類似する投薬計画を免疫化のために利用することができる。
びに対象の年齢、体重および健康などの因子に依存する。例えば、ヒト対象に投与される
祖先ウイルスまたはその一部の治療的有効量は、一般的に、祖先ウイルスの約１×１０１
～１×１０１２のゲノムコピー（ＧＣ）（例えば、約１×１０３～１×１０９ＧＣ）の濃
度を含有する約０．１ｍｌ～約１０ｍｌの溶液の範囲にある。導入遺伝子の導入および／
または発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質アッセイによって、投与後の種々の時点
でモニターすることができる。いくつかの例において、導入遺伝子の発現レベルは、投薬
の頻度および／または量を決定するためにモニターすることができる。また、治療目的の
ために記載されたものと類似する投薬計画を免疫化のために利用することができる。
【0059】
また、本明細書に記載される方法は、ウイルスまたはその一部の１つまたは複数の免疫
原性ドメインを修飾または除去するように、前方進化をモデリングするために使用するこ
とができる。
原性ドメインを修飾または除去するように、前方進化をモデリングするために使用するこ
とができる。
【0060】
本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組
換えＤＮＡ技術を採用してもよい。このような技術は、文献に十分に説明されている。本
発明は、特許請求の範囲に記載される、対象とする方法および組成物の範囲を限定するも
のではない以下の実施例においてさらに説明される。
実施例
換えＤＮＡ技術を採用してもよい。このような技術は、文献に十分に説明されている。本
発明は、特許請求の範囲に記載される、対象とする方法および組成物の範囲を限定するも
のではない以下の実施例においてさらに説明される。
実施例
【実施例1】
【0061】
祖先配列のコンピュータ計算による予測
ＡＡＶキャプシドの７５個の異なるアミノ酸配列のセットは、ＧｅｎＢａｎｋなどの多
数の公共データベースから取得し、配列は、ＰＲＡＮＫ－ＭＳＡアルゴリズム、バージョ
ン１２１００２を用いて整列し、オプションは「－Ｆ」である。
ＡＡＶキャプシドの７５個の異なるアミノ酸配列のセットは、ＧｅｎＢａｎｋなどの多
数の公共データベースから取得し、配列は、ＰＲＡＮＫ－ＭＳＡアルゴリズム、バージョ
ン１２１００２を用いて整列し、オプションは「－Ｆ」である。
【0062】
ＰｒｏｔＴｅｓｔ３（例えば、Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5
；ワールドワイドウェブ上のdarwin.uvigo.es/software/prottest3で利用可能である）は
、様々な条件下（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、「＋Ｉ」、「＋
Ｆ」、「＋Ｇ」およびそれらの組合せ）でポリペプチド進化の様々なモデル（例えば、Ｐ
ｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、ＪＴＴ、ＬＧ、ＷＡＧ、ＶＴ、ＣｐＲｅｖ、
ＲｔＲｅｖ、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＤＣＭｕｔ、ＦＬＵ、Ｂｌｏｓｕｍ６２、ＶＴ、ＨＩＶｂ
、ＭｔＡｒｔ、ＭｔＭａｍ）を評価するために使用された。＋Ｇおよび＋Ｆ（Yang, 1993
, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; およびCaoet al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-2
7）を用いたＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）は、
ＰｒｏＴｅｓｔ３において実行されるその赤池情報量規準（ＡＩＣ；Hirotugu, 1974, IE
EE Transactions on Automatic Control, 19:716-23）に基づいて選択した。
；ワールドワイドウェブ上のdarwin.uvigo.es/software/prottest3で利用可能である）は
、様々な条件下（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、「＋Ｉ」、「＋
Ｆ」、「＋Ｇ」およびそれらの組合せ）でポリペプチド進化の様々なモデル（例えば、Ｐ
ｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、ＪＴＴ、ＬＧ、ＷＡＧ、ＶＴ、ＣｐＲｅｖ、
ＲｔＲｅｖ、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＤＣＭｕｔ、ＦＬＵ、Ｂｌｏｓｕｍ６２、ＶＴ、ＨＩＶｂ
、ＭｔＡｒｔ、ＭｔＭａｍ）を評価するために使用された。＋Ｇおよび＋Ｆ（Yang, 1993
, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; およびCaoet al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-2
7）を用いたＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）は、
ＰｒｏＴｅｓｔ３において実行されるその赤池情報量規準（ＡＩＣ；Hirotugu, 1974, IE
EE Transactions on Automatic Control, 19:716-23）に基づいて選択した。
【0063】
ＡＡＶ進化の系統発生をＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 2003, Systematic Biolog
y, 52:696-704）を用いて構築した。図３を参照されたい。系統樹は、ＪＴＴ＋Ｆ置換モ
デルを用いて作成し、４つの離散置換カテゴリと概算ガンマ形状パラメータを有した。得
られた系統樹は、最近隣交換（Nearest Neighbor Interchange）（ＮＮＩ）とサブツリー
枝刈りおよび再移植（Subtree Pruning and Re-Grafting）（ＳＰＲ）を介して改善し、
「ＳＨ様」バリアントを用いて、ブートストラップと近似尤度比テスト（ａＬＲＴ；Anis
imova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を介して有意性について評
価した。
y, 52:696-704）を用いて構築した。図３を参照されたい。系統樹は、ＪＴＴ＋Ｆ置換モ
デルを用いて作成し、４つの離散置換カテゴリと概算ガンマ形状パラメータを有した。得
られた系統樹は、最近隣交換（Nearest Neighbor Interchange）（ＮＮＩ）とサブツリー
枝刈りおよび再移植（Subtree Pruning and Re-Grafting）（ＳＰＲ）を介して改善し、
「ＳＨ様」バリアントを用いて、ブートストラップと近似尤度比テスト（ａＬＲＴ；Anis
imova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を介して有意性について評
価した。
【0064】
次に、上記で構築された系統樹は、系統発生内部の全ての節でＡＡＶキャプシドの祖先
状態を概算するために使用した。祖先キャプシド配列は、Ｌａｚａｒｕｓ（ｓｆ．ｎｅｔ
のＳｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）に含まれる最大尤度の系統発生学的分析（ＰＡＭＬ）ソフト
ウェア（Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6；ワールドワイドウェブ上のaba
cus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlで利用可能である）を介した最大尤度原理を用
いて再構築した。より具体的には、Ｌａｚａｒｕｓ／ＰＡＭＬ再構築は、４ガンマ分布カ
テゴリを用いたＪＴＴ＋Ｆ置換モデルによるアミノ酸再構築を生成するように設定した。
ＡＡＶ５を外集団として使用した。最後に、「Ｉ」オプションは、ＰＡＭＬ再構築を行っ
た後、インデルを配置するために追加した（すなわち、フィッチアルゴリズムを用いた最
大節約を介して二値コード化し、配置した）。
状態を概算するために使用した。祖先キャプシド配列は、Ｌａｚａｒｕｓ（ｓｆ．ｎｅｔ
のＳｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）に含まれる最大尤度の系統発生学的分析（ＰＡＭＬ）ソフト
ウェア（Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6；ワールドワイドウェブ上のaba
cus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlで利用可能である）を介した最大尤度原理を用
いて再構築した。より具体的には、Ｌａｚａｒｕｓ／ＰＡＭＬ再構築は、４ガンマ分布カ
テゴリを用いたＪＴＴ＋Ｆ置換モデルによるアミノ酸再構築を生成するように設定した。
ＡＡＶ５を外集団として使用した。最後に、「Ｉ」オプションは、ＰＡＭＬ再構築を行っ
た後、インデルを配置するために追加した（すなわち、フィッチアルゴリズムを用いた最
大節約を介して二値コード化し、配置した）。
【0065】
再構築が最大尤度法で行われたため、任意の残基を所定の節で所定の位置にあった尤度
を計算することができる。これを行うために、追加のスクリプトは、特定の閾値下に計算
された事後確率を有する配列に沿った全ての位置を同定するために記述した。０．３の閾
値を選択し、これは、０．３を超える計算された事後確率を有する任意のアミノ酸がライ
ブラリーの合成に含まれたことを意味する。これらの残基は、ライブラリー中の目的とす
るバリアントであるように選択した。
を計算することができる。これを行うために、追加のスクリプトは、特定の閾値下に計算
された事後確率を有する配列に沿った全ての位置を同定するために記述した。０．３の閾
値を選択し、これは、０．３を超える計算された事後確率を有する任意のアミノ酸がライ
ブラリーの合成に含まれたことを意味する。これらの残基は、ライブラリー中の目的とす
るバリアントであるように選択した。
【0066】
配列を確定するために、追加の有用性は、コドンを選択するようにコード化されなけれ
ばならなかった。スクリプトは、別のＡＡＶ配列（ＡＮＣ８０足場配列と約９２％の配列
同一性を有するＡＡＶＲｈ１０）と同様のコドンを導き出し、コドン置換マトリックスに
基づく配列の不一致があった場合にコドンを置換するための新規なアルゴリズムを適用す
るように記述した。新規なアルゴリズムを以下に示す：
前提：アミノ酸配列、Ｐｔ、対応するヌクレオチド配列を有する、Ｎｔ、この場合、Ｎ
ｔはＰｔをコードする；およびタンパク質配列、Ｐｉ、この場合、ＰｉはＰｔに強い相同
性を示す。
スコアリングのためのＢｌｏｓｕｍ６２表を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ
によりＰｉとＰｔを整列させる。Ｎｔからの対応するコドンを用いて、タンパク質アライ
ンメントに踏み込むことによって、新しいヌクレオチド配列、Ｎｉを生成する。
この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸はＰｉに正確に合致し、
コドン－ＰＡＭマトリックス（Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6:134）
からの「最良スコアリング」コドン、この場合、置換が存在する、
ギャップ、この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸に対して整列されたＰｉにギャップが存
在する、および
Ｎｔ（所定のアミノ酸をコードする）において最も頻繁に生じるヌクレオチド、この
場合、Ｐｔにおけるギャップに対して整列されるＰｉにアミノ酸が存在する。
ばならなかった。スクリプトは、別のＡＡＶ配列（ＡＮＣ８０足場配列と約９２％の配列
同一性を有するＡＡＶＲｈ１０）と同様のコドンを導き出し、コドン置換マトリックスに
基づく配列の不一致があった場合にコドンを置換するための新規なアルゴリズムを適用す
るように記述した。新規なアルゴリズムを以下に示す：
前提：アミノ酸配列、Ｐｔ、対応するヌクレオチド配列を有する、Ｎｔ、この場合、Ｎ
ｔはＰｔをコードする；およびタンパク質配列、Ｐｉ、この場合、ＰｉはＰｔに強い相同
性を示す。
スコアリングのためのＢｌｏｓｕｍ６２表を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ
によりＰｉとＰｔを整列させる。Ｎｔからの対応するコドンを用いて、タンパク質アライ
ンメントに踏み込むことによって、新しいヌクレオチド配列、Ｎｉを生成する。
この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸はＰｉに正確に合致し、
コドン－ＰＡＭマトリックス（Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6:134）
からの「最良スコアリング」コドン、この場合、置換が存在する、
ギャップ、この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸に対して整列されたＰｉにギャップが存
在する、および
Ｎｔ（所定のアミノ酸をコードする）において最も頻繁に生じるヌクレオチド、この
場合、Ｐｔにおけるギャップに対して整列されるＰｉにアミノ酸が存在する。
【0067】
さらに、２つの単一ヌクレオチド変化は、野生型ＡＡＶにおけるＡＡＶキャプシド遺伝
子内のフレームのうちコードされているアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の転写を
除去するために行った。ＡＡＰ（同時代または祖先）のコーディングは、この再構築の一
部ではなかったので、ＡＡＰの発現はｃａｐ配列中に同義突然変異を作製することによっ
て除去し、ＡＡＰ配列はウイルス生成中にトランスで提供した。
子内のフレームのうちコードされているアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の転写を
除去するために行った。ＡＡＰ（同時代または祖先）のコーディングは、この再構築の一
部ではなかったので、ＡＡＰの発現はｃａｐ配列中に同義突然変異を作製することによっ
て除去し、ＡＡＰ配列はウイルス生成中にトランスで提供した。
【実施例2】
【0068】
祖先ＡＡＶ ＶＰ１配列の発現
実験は、予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列がウイルスベクターを作製するために使
用され得るかどうかを決定するために行った。
実験は、予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列がウイルスベクターを作製するために使
用され得るかどうかを決定するために行った。
【0069】
多数の予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列をクローニングした。祖先キャプシドのラ
イブラリーは、一過性トランスフェクションにおいてウイルス粒子の形成を可能にするよ
うにｒｅｐ－ｃａｐ発現プラスミドに移した。適切な発現レベルならびにＶＰ１、ＶＰ２
およびＶＰ３のスプライシングを維持するために、ライブラリーｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ
コード配列におけるｃａｐの５’に位置したＨｉｎｄＩＩＩと、ｃａｐ終止コドンとポリ
アデニル化シグナルの間で遺伝子操作されたＳｐｅＩとを切断することによってクローニ
ングした。結果として、より従来の「ＲＥＰ／ＣＡＰ」構築物に祖先キャプシドをクロー
ニングするために、継代プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで消化し、ゲル精製し、
同様に消化されたｒｅｐ／ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
イブラリーは、一過性トランスフェクションにおいてウイルス粒子の形成を可能にするよ
うにｒｅｐ－ｃａｐ発現プラスミドに移した。適切な発現レベルならびにＶＰ１、ＶＰ２
およびＶＰ３のスプライシングを維持するために、ライブラリーｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ
コード配列におけるｃａｐの５’に位置したＨｉｎｄＩＩＩと、ｃａｐ終止コドンとポリ
アデニル化シグナルの間で遺伝子操作されたＳｐｅＩとを切断することによってクローニ
ングした。結果として、より従来の「ＲＥＰ／ＣＡＰ」構築物に祖先キャプシドをクロー
ニングするために、継代プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで消化し、ゲル精製し、
同様に消化されたｒｅｐ／ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
【0070】
発現されたポリペプチドを１０％ＳＤＳゲル上で分離した。図６に示されるように、キ
ャプシドポリペプチドは適切に発現し、多数の祖先ＡＡＶ配列（Ａｎｃ８０Ｌ４４、Ａｎ
ｃ８０Ｌ２７およびＡｎｃ８０Ｌ６５）ならびに同時代のＡＡＶ配列のＡＡＶ２／８から
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にスプライシングされた。
ャプシドポリペプチドは適切に発現し、多数の祖先ＡＡＶ配列（Ａｎｃ８０Ｌ４４、Ａｎ
ｃ８０Ｌ２７およびＡｎｃ８０Ｌ６５）ならびに同時代のＡＡＶ配列のＡＡＶ２／８から
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にスプライシングされた。
【実施例3】
【0071】
ウイルス力価
ＡＡＶは、ウイルス粒子アセンブリに必要とされる全てのエレメントをコードするプラ
スミドの一過性共トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中で産生した。簡単に
は、ＨＥＫ２９３細胞を９０％コンフルエントになるまで増殖させ、（ａ）ＡＡＶ２ Ｉ
ＴＲによって挟まれたルシフェラーゼ導入遺伝子（ＣＭＶプロモーターによって発現され
る）をコードするウイルスゲノムプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ２ ｒｅｐと本明細書に開示
されている合成されたキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶパッケージングプラスミ
ド、（ｃ）キャプシドを発現するＡＡＶ２－ＡＡＰ、および（ｄ）ＡＡＶパッケージング
とアセンブルに必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いてトランスフェクトし
た。細胞を３７℃にて２日間インキュベートし、細胞および培地を採取し、回収した。
ＡＡＶは、ウイルス粒子アセンブリに必要とされる全てのエレメントをコードするプラ
スミドの一過性共トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中で産生した。簡単に
は、ＨＥＫ２９３細胞を９０％コンフルエントになるまで増殖させ、（ａ）ＡＡＶ２ Ｉ
ＴＲによって挟まれたルシフェラーゼ導入遺伝子（ＣＭＶプロモーターによって発現され
る）をコードするウイルスゲノムプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ２ ｒｅｐと本明細書に開示
されている合成されたキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶパッケージングプラスミ
ド、（ｃ）キャプシドを発現するＡＡＶ２－ＡＡＰ、および（ｄ）ＡＡＶパッケージング
とアセンブルに必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いてトランスフェクトし
た。細胞を３７℃にて２日間インキュベートし、細胞および培地を採取し、回収した。
【0072】
細胞－培地懸濁液を３回連続した凍結融解サイクルによって溶解した。次に、溶解物を
遠心分離によって清澄化し、徹底的なＤＮＡ消化を行う条件下で酵素、ここではＢｅｎｚ
ｏｎａｓｅ（商標）を用いて処置し、ウイルス粒子の外側に存在する任意のＤＮＡを消化
した。ＡＡＶ調製物は、対照ＤＮＡテンプレート、この場合は、ベクターゲノムと比べて
、同一のＴａｑＭａｎ（商標）プライマーとプローブ結合配列を含む線状化プラスミドの
線形測定範囲に含まれるように希釈した。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、選択したウイ
ルスベクターゲノムにアニーリングするプライマーとプローブを用いて行った。以下の表
２に示すように、ミリリットル（ｍｌ）あたりのゲノムコピー（ＧＣ）におけるＴａｑＭ
ａｎ（商標）測定に基づいて力価を計算した。
遠心分離によって清澄化し、徹底的なＤＮＡ消化を行う条件下で酵素、ここではＢｅｎｚ
ｏｎａｓｅ（商標）を用いて処置し、ウイルス粒子の外側に存在する任意のＤＮＡを消化
した。ＡＡＶ調製物は、対照ＤＮＡテンプレート、この場合は、ベクターゲノムと比べて
、同一のＴａｑＭａｎ（商標）プライマーとプローブ結合配列を含む線状化プラスミドの
線形測定範囲に含まれるように希釈した。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、選択したウイ
ルスベクターゲノムにアニーリングするプライマーとプローブを用いて行った。以下の表
２に示すように、ミリリットル（ｍｌ）あたりのゲノムコピー（ＧＣ）におけるＴａｑＭ
ａｎ（商標）測定に基づいて力価を計算した。
【0073】
【表2】
【0074】
祖先的に再構築されたＡＡＶキャプシド粒子による小規模ベクター生成結果は、ＡＡＶ
２に類似したが、ＡＡＶ８に対して低減した収量を実証し、これらの両方は同時代のＡＡ
Ｖに基づくベクター調製物である。
２に類似したが、ＡＡＶ８に対して低減した収量を実証し、これらの両方は同時代のＡＡ
Ｖに基づくベクター調製物である。
【実施例4】
【0075】
インビトロのウイルス形質導入
インビトロのウイルス形質導入は、細胞を感染させる、予測された祖先ＡＡＶ配列を含
有するウイルスの能力を評価するために行った。
インビトロのウイルス形質導入は、細胞を感染させる、予測された祖先ＡＡＶ配列を含
有するウイルスの能力を評価するために行った。
【0076】
配列のＡｎｃ８０ライブラリーを使用したハイスループットベクター生成後、ＨＥＫ２
９３細胞をそれぞれのウイルスベクターで形質導入した。Ａｎｃ８０配列に加えて、それ
ぞれのウイルスベクターはルシフェラーゼ導入遺伝子を含有した。ルシフェラーゼは、形
質導入細胞または細胞溶解物にルシフェリン基質を添加後、９６ウェルプレートリーダー
で生物発光を定量することによって測定した。定量化後、４つの連結された９６ウェルプ
レートにおけるルシフェラーゼ発現のヒートマップを作製した（各プレートにおいて対照
の列を除く）。ハイスループットベクター生成のプロセスに関連した、大多数の挿入、欠
失および遷移に起因して、多数のベクターは非機能的であった。本明細書の目的のために
、このアッセイにおいて機能的である（すなわち、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、導入
遺伝子を発現することができる）ウイルスだけをさらに評価した。
９３細胞をそれぞれのウイルスベクターで形質導入した。Ａｎｃ８０配列に加えて、それ
ぞれのウイルスベクターはルシフェラーゼ導入遺伝子を含有した。ルシフェラーゼは、形
質導入細胞または細胞溶解物にルシフェリン基質を添加後、９６ウェルプレートリーダー
で生物発光を定量することによって測定した。定量化後、４つの連結された９６ウェルプ
レートにおけるルシフェラーゼ発現のヒートマップを作製した（各プレートにおいて対照
の列を除く）。ハイスループットベクター生成のプロセスに関連した、大多数の挿入、欠
失および遷移に起因して、多数のベクターは非機能的であった。本明細書の目的のために
、このアッセイにおいて機能的である（すなわち、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、導入
遺伝子を発現することができる）ウイルスだけをさらに評価した。
【0077】
ＨＥＫ２９３細胞は、２つの同時代のＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／
８）と３つの予測された祖先ＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およ
びＡｎｃ８０Ｌ６５）を用いて、細胞あたり１×１０４ゲノムコピー（ＧＣ）の等しい感
染の多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。各ベクターは、ルシフェラーゼをコードする導入
遺伝子またはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子のいずれかを含有した。細胞は、６０時間
後、ＡＭＧ ＥｖｏｓＦｌ光学顕微鏡のＧＦＰチャネルを用いて撮像した。図７は、イン
ビトロで形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。祖先ＡＡＶウイルスの各々は、ＨＥＫ
２９３細胞の効率的な形質導入を実証した。
８）と３つの予測された祖先ＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およ
びＡｎｃ８０Ｌ６５）を用いて、細胞あたり１×１０４ゲノムコピー（ＧＣ）の等しい感
染の多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。各ベクターは、ルシフェラーゼをコードする導入
遺伝子またはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子のいずれかを含有した。細胞は、６０時間
後、ＡＭＧ ＥｖｏｓＦｌ光学顕微鏡のＧＦＰチャネルを用いて撮像した。図７は、イン
ビトロで形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。祖先ＡＡＶウイルスの各々は、ＨＥＫ
２９３細胞の効率的な形質導入を実証した。
【実施例5】
【0078】
インビボでのレチナール形質導入
レチナール形質導入は、祖先ＡＡＶベクターがインビボでマウス網膜細胞を標的とする
ことができるかどうかを決定するために行った。
レチナール形質導入は、祖先ＡＡＶベクターがインビボでマウス網膜細胞を標的とする
ことができるかどうかを決定するために行った。
【0079】
マウスの目は、２×１０８個のゲノムコピー（ＧＣ）の３種の異なる祖先ＡＡＶ（Ａｎ
ｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）と同時代のＡＡＶ（ＡＡＶ２
／８）で形質導入し、それらの全てはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子を含んでいた。形
質導入のために、各ＡＡＶベクターは、注射装置を用いたベクターボーラスの送達を介し
て、光受容体と網膜色素上皮層の間に空間を生成することにより網膜下に外科的に送達し
た。ベクターボーラスは網膜下空間に残存し、サブ網膜下の剥離を経時的に解決した。Ｇ
ＦＰ発現は、Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ（商標）を用いた瞳孔拡張後、動物の網膜の眼底撮
影により非侵襲的にモニターした。示された網膜の全ては、網膜への祖先ＡＡＶの、様々
な程度の成功した標的化を実証した。
ｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）と同時代のＡＡＶ（ＡＡＶ２
／８）で形質導入し、それらの全てはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子を含んでいた。形
質導入のために、各ＡＡＶベクターは、注射装置を用いたベクターボーラスの送達を介し
て、光受容体と網膜色素上皮層の間に空間を生成することにより網膜下に外科的に送達し
た。ベクターボーラスは網膜下空間に残存し、サブ網膜下の剥離を経時的に解決した。Ｇ
ＦＰ発現は、Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ（商標）を用いた瞳孔拡張後、動物の網膜の眼底撮
影により非侵襲的にモニターした。示された網膜の全ては、網膜への祖先ＡＡＶの、様々
な程度の成功した標的化を実証した。
【0080】
また、網膜組織学を行い、形質導入された細胞型を同定するために蛍光顕微鏡下で可視
化した。組織学は、上述したＡｎｃ８０Ｌ６５祖先ＡＡＶベクターで形質導入されたマウ
ス網膜上で行った。Ａｎｃ８０Ｌ６５を媒介したｅＧＦＰ発現は、外核層（ＯＮＬ）、内
部セグメント（ＩＳ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において明らかであり、祖先Ａｎｃ
８０Ｌ６５ベクターがマウス光受容体と網膜色素上皮細胞を標的とすることを示した。
化した。組織学は、上述したＡｎｃ８０Ｌ６５祖先ＡＡＶベクターで形質導入されたマウ
ス網膜上で行った。Ａｎｃ８０Ｌ６５を媒介したｅＧＦＰ発現は、外核層（ＯＮＬ）、内
部セグメント（ＩＳ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において明らかであり、祖先Ａｎｃ
８０Ｌ６５ベクターがマウス光受容体と網膜色素上皮細胞を標的とすることを示した。
【実施例6】
【0081】
中和抗体アッセイ
中和抗体アッセイは、祖先ＡＡＶウイルスが、同時代のＡＡＶウイルスよりも抗体中和
に対してより抵抗性であるか否かを評価するために行われる。中和抗体アッセイは、抗体
の不存在下における対照と比較して、５０％以上の感染を中和する抗体濃度（または実験
試料が抗体濃度を含有する力価）を測定する。
中和抗体アッセイは、祖先ＡＡＶウイルスが、同時代のＡＡＶウイルスよりも抗体中和
に対してより抵抗性であるか否かを評価するために行われる。中和抗体アッセイは、抗体
の不存在下における対照と比較して、５０％以上の感染を中和する抗体濃度（または実験
試料が抗体濃度を含有する力価）を測定する。
【0082】
血清試料またはＩＶＩＧ原液（２００ｍｇ／ｍｌ）を連続して２倍希釈し、希釈してい
ない試料および希釈した試料は、１０４のＭＯＩで約３０分間３７℃にて、祖先ＡＡＶウ
イルス、Ａｎｃ８０Ｌ６５、および同時代のＡＡＶウイルス、ＡＡＶ２／８と同時にイン
キュベートされる。各ウイルスはルシフェラーゼ導入遺伝子を含む。次に、混合ベクター
および抗体試料をＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。これらの実験について、使用された
抗体試料は、静注用イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）、１０００を超える血液ドナーの血漿
から抽出し、プールされたＩｇＧ（例えば、Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）またはＧａｍｎｅｘ（商標）（Ｇ
ｒｉｆｏｌｓ；Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）として市販されている）である。形質導
入の開始から４８時間後、細胞は、ルシフェラーゼを検出するために生物発光によりアッ
セイされる。中和抗体力価は、５０％以上の中和（試料の形質導入／試料の不存在下での
対照ウイルスの形質導入）が到達する試料の希釈を同定することによって決定される。
ない試料および希釈した試料は、１０４のＭＯＩで約３０分間３７℃にて、祖先ＡＡＶウ
イルス、Ａｎｃ８０Ｌ６５、および同時代のＡＡＶウイルス、ＡＡＶ２／８と同時にイン
キュベートされる。各ウイルスはルシフェラーゼ導入遺伝子を含む。次に、混合ベクター
および抗体試料をＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。これらの実験について、使用された
抗体試料は、静注用イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）、１０００を超える血液ドナーの血漿
から抽出し、プールされたＩｇＧ（例えば、Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）またはＧａｍｎｅｘ（商標）（Ｇ
ｒｉｆｏｌｓ；Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）として市販されている）である。形質導
入の開始から４８時間後、細胞は、ルシフェラーゼを検出するために生物発光によりアッ
セイされる。中和抗体力価は、５０％以上の中和（試料の形質導入／試料の不存在下での
対照ウイルスの形質導入）が到達する試料の希釈を同定することによって決定される。
【実施例7】
【0083】
Ａｎｃ８０の特徴付け
本明細書に記載される方法に基づいて、最も可能の高いＡｎｃ８０配列（事後確率によ
って決定される）が得られ、Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号３５はＡｎｃ８０Ｌ１キャプシド
の核酸配列を示し、配列番号３６はＡｎｃ８０Ｌ１ ＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列
を示す）と指定された。Ａｎｃ８０確率ライブラリーは、営利企業によって、本明細書に
記載される配列を用いて合成し、発現ベクターにサブクローニングした。
本明細書に記載される方法に基づいて、最も可能の高いＡｎｃ８０配列（事後確率によ
って決定される）が得られ、Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号３５はＡｎｃ８０Ｌ１キャプシド
の核酸配列を示し、配列番号３６はＡｎｃ８０Ｌ１ ＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列
を示す）と指定された。Ａｎｃ８０確率ライブラリーは、営利企業によって、本明細書に
記載される配列を用いて合成し、発現ベクターにサブクローニングした。
【0084】
Ａｎｃ８０ライブラリーは、組合せアッセイにおいてベクター収率および感染力につい
てクローン的に評価した。このスクリーニングのうち、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３
）、およびいくつかの他の変異体をさらに特徴付けた。
てクローン的に評価した。このスクリーニングのうち、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３
）、およびいくつかの他の変異体をさらに特徴付けた。
【0085】
Ａｎｃ８０ライブラリーとＡｎｃ８０Ｌ６５を配列の相違の観点から比較した（図８；
対角線から上は％、下はアミノ酸の相違数）。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、Ａｎｃ８
０Ｌ６５に最も近い公的に利用可能な配列はｒｈ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８
８２０１．１）である。
対角線から上は％、下はアミノ酸の相違数）。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、Ａｎｃ８
０Ｌ６５に最も近い公的に利用可能な配列はｒｈ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８
８２０１．１）である。
【0086】
図９は、Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡＡＶ２に相当するベクター収率を生成したこと（パネル
Ａ）、透過型顕微鏡検査（ＴＥＭ）下でウイルス粒子を生成したこと（パネルＢ）、変性
条件下でのＳＤＳ ｐａｇｅに基づくＡＡＶ ｃａｐとＶＰ１、２および３タンパク質を
生化学的に生成したこと（パネルＣ）、およびＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたウェ
スタンブロット（パネルＤ）を示す。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載され
る。
Ａ）、透過型顕微鏡検査（ＴＥＭ）下でウイルス粒子を生成したこと（パネルＢ）、変性
条件下でのＳＤＳ ｐａｇｅに基づくＡＡＶ ｃａｐとＶＰ１、２および３タンパク質を
生化学的に生成したこと（パネルＣ）、およびＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたウェ
スタンブロット（パネルＤ）を示す。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載され
る。
【0087】
簡単には、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａ
ｎｃ８０Ｌ４４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ｅＧＦＰで構成されるレ
ポーター構築物を含有する小規模において生成し、ＣＭＶプロモーター下のホタルルシフ
ェラーゼは小規模において生成した。次に、ウイルスのこれらの小規模製剤の力価は、定
量ＰＣＲを介して得た。これらの実験に基づいて、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４
およびＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ＡＡＶ２に匹敵するウイルスレベルを生成すること
が見出された（図９Ａ）。
ｎｃ８０Ｌ４４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ｅＧＦＰで構成されるレ
ポーター構築物を含有する小規模において生成し、ＣＭＶプロモーター下のホタルルシフ
ェラーゼは小規模において生成した。次に、ウイルスのこれらの小規模製剤の力価は、定
量ＰＣＲを介して得た。これらの実験に基づいて、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４
およびＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ＡＡＶ２に匹敵するウイルスレベルを生成すること
が見出された（図９Ａ）。
【0088】
Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドタンパク質が、適切な大きさおよび立体構造の完全なウイ
ルス様粒子にアセンブルされていることを確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
を用いて顕微鏡写真を得た。Ａｎｃ８０－Ｌ０６５の大規模の精製された調製物は、フォ
ルムバール被覆した銅グリッドに装填し、次に、酢酸ウラニルで染色した。顕微鏡写真は
、２０～２５ｎｍの直径を有する無傷な六角形の粒子を示した（図９Ｂ）。
ルス様粒子にアセンブルされていることを確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
を用いて顕微鏡写真を得た。Ａｎｃ８０－Ｌ０６５の大規模の精製された調製物は、フォ
ルムバール被覆した銅グリッドに装填し、次に、酢酸ウラニルで染色した。顕微鏡写真は
、２０～２５ｎｍの直径を有する無傷な六角形の粒子を示した（図９Ｂ）。
【0089】
合成祖先キャプシド遺伝子が正常に処理（すなわち、スプライスおよび発現）されたか
どうかを決定するために、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６
５ベクターの大規模で精製された調製物を変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した
（１Ｅ１０ ＧＣ／ウェル）。ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ
３を表すバンドは、明らかに、各ベクター調製物に存在した（図９Ｃ）。ＡＡＶキャプシ
ド抗体Ｂ１を用いたウェスタンブロットにより、さらに、これらのバンドが予測されたタ
ンパク質を表すことを確認した（図９Ｄ）。
どうかを決定するために、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６
５ベクターの大規模で精製された調製物を変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した
（１Ｅ１０ ＧＣ／ウェル）。ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ
３を表すバンドは、明らかに、各ベクター調製物に存在した（図９Ｃ）。ＡＡＶキャプシ
ド抗体Ｂ１を用いたウェスタンブロットにより、さらに、これらのバンドが予測されたタ
ンパク質を表すことを確認した（図９Ｄ）。
【0090】
さらに、図１０は、Ａｎｃ８０Ｌ６５が、読み出し（パネルＡ）またはルシフェラーゼ
（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いて、ＭＯＩ
１０Ｅ４ ＧＣ／細胞でＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで哺乳動物組織および細胞
を感染させたことを示す。また、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコード
する指示されたＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ）、ＧＦＰをコードする指示さ
れたＡＡＶの直接的な筋肉内（ＩＭ）注射後（中段の行、パネルＣ）、およびＧＦＰをコ
ードする指示されたＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ）に肝臓の標的に効
果的であった。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いて、ＭＯＩ
１０Ｅ４ ＧＣ／細胞でＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで哺乳動物組織および細胞
を感染させたことを示す。また、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコード
する指示されたＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ）、ＧＦＰをコードする指示さ
れたＡＡＶの直接的な筋肉内（ＩＭ）注射後（中段の行、パネルＣ）、およびＧＦＰをコ
ードする指示されたＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ）に肝臓の標的に効
果的であった。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
【0091】
祖先ビリオンの感染度の相対的尺度を得るために、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧ
ＦＰ配列とホタルルシフェラーゼ配列を含む二シストロン性の受容体構築物を含有するＡ
ＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４
、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０
Ｌ１２２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２３、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２４およびＡＡＶ
２／Ａｎｃ８０Ｌ１２５を生成した。次に、ＨＥＫ２９３細胞でコンフルエントした９６
ウェルプレートを、１Ｅ４ ＧＣ／細胞のＭＯＩ（上記したｑＰＣＲにより取得された力
価）で各ベクターによる形質導入に供した。４８時間後、蛍光顕微鏡検査により、形質導
入された細胞中のＧＲＰの存在を確認した（図１０Ａ）。次に、細胞をルシフェラーゼの
存在についてアッセイし（図１０Ｂ）、これは、Ａｎｃ８０由来のベクターで形質導入さ
れた細胞におけるルシフェラーゼの発現が、ＡＡＶ８（低レベルの形質導入）とＡＡＶ２
（高レベルの形質導入）の間にあることを決定した。
ＦＰ配列とホタルルシフェラーゼ配列を含む二シストロン性の受容体構築物を含有するＡ
ＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４
、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０
Ｌ１２２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２３、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２４およびＡＡＶ
２／Ａｎｃ８０Ｌ１２５を生成した。次に、ＨＥＫ２９３細胞でコンフルエントした９６
ウェルプレートを、１Ｅ４ ＧＣ／細胞のＭＯＩ（上記したｑＰＣＲにより取得された力
価）で各ベクターによる形質導入に供した。４８時間後、蛍光顕微鏡検査により、形質導
入された細胞中のＧＲＰの存在を確認した（図１０Ａ）。次に、細胞をルシフェラーゼの
存在についてアッセイし（図１０Ｂ）、これは、Ａｎｃ８０由来のベクターで形質導入さ
れた細胞におけるルシフェラーゼの発現が、ＡＡＶ８（低レベルの形質導入）とＡＡＶ２
（高レベルの形質導入）の間にあることを決定した。
【0092】
インビボという事情において遺伝子移入の相対的効率を評価するために、ＡＡＶ２／２
、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された高力価の調製物を得た。
３．９Ｅ１０ ＧＣの各ベクターは、ＴＢＧプロモーターの制御下で核のＬａｃＺをコー
ドする導入遺伝子を封入し、一般的な麻酔後にＩＰ注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（条
件あたり３匹）に注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を回収した。肝臓
は、標準的な組織学的技術により切片にし、β－ガラクトシダーゼについて染色した。次
に、切片を顕微鏡で画像化し、代表的な画像を図１０Ｃの上段の行に示す。
、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された高力価の調製物を得た。
３．９Ｅ１０ ＧＣの各ベクターは、ＴＢＧプロモーターの制御下で核のＬａｃＺをコー
ドする導入遺伝子を封入し、一般的な麻酔後にＩＰ注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（条
件あたり３匹）に注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を回収した。肝臓
は、標準的な組織学的技術により切片にし、β－ガラクトシダーゼについて染色した。次
に、切片を顕微鏡で画像化し、代表的な画像を図１０Ｃの上段の行に示す。
【0093】
続いて、ｐＣＡＳＩプロモーターの制御下でｅＧＦＰおよびｈＡ１ＡＴをコードする二
シストロン性の導入遺伝子を含有する同じ血清型のベクターを得た。マウス骨格筋を形質
導入するＡｎｃ８０Ｌ６５の能力を評価するために、１Ｅ１０ＧＣの各ベクターは、一般
的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり５匹のマウス）の骨格筋に注射した。注
射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を凍結切片し、ｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微
鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色のｅＧＦＰである）。代表的な画像を
図１０Ｃの中段の行に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが筋肉内注射に
よりマウスの骨格筋を形質導入することができたことを実証した。
シストロン性の導入遺伝子を含有する同じ血清型のベクターを得た。マウス骨格筋を形質
導入するＡｎｃ８０Ｌ６５の能力を評価するために、１Ｅ１０ＧＣの各ベクターは、一般
的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり５匹のマウス）の骨格筋に注射した。注
射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を凍結切片し、ｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微
鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色のｅＧＦＰである）。代表的な画像を
図１０Ｃの中段の行に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが筋肉内注射に
よりマウスの骨格筋を形質導入することができたことを実証した。
【0094】
今回、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰ導入遺伝子のみをコードする構築物をキ
ャプシド形成する、同じ血清型のベクターを取得した。２Ｅ９粒子は、一般的な麻酔後、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに網膜下注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、眼を回収
し、凍結切片し、およびｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤ
ＡＰＩであり、緑色はｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの下段に示す。これら
の実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが、ＡＡＶ８ベクターに匹敵するレベルでマウス網
膜に形質導入することができることを実証する。
ャプシド形成する、同じ血清型のベクターを取得した。２Ｅ９粒子は、一般的な麻酔後、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに網膜下注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、眼を回収
し、凍結切片し、およびｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤ
ＡＰＩであり、緑色はｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの下段に示す。これら
の実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが、ＡＡＶ８ベクターに匹敵するレベルでマウス網
膜に形質導入することができることを実証する。
【0095】
簡単には、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼを含む二シ
ストロン性の導入遺伝子を封入するＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／ｒｈ３２．
３３およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ウイルスベクターの精製された高力価調製物を得
る。次に、これらのベクターは、ＩＶＩＧの２倍連続希釈物（１０ｍｇ、５ｍｇ、２．５
ｍｇなど）と共にインキュベートし、またはＩＶＩＧなし（条件あたり１Ｅ９ ＧＣ）で
インキュベートする。インキュベーション後、ベクターを用いて、ウェルあたり１Ｅ４の
ＭＯＩ（ウェルあたり１希釈）でＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。４８時間後、ルシフ
ェラーゼの相対量を発光アッセイによりアッセイする。
ストロン性の導入遺伝子を封入するＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／ｒｈ３２．
３３およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ウイルスベクターの精製された高力価調製物を得
る。次に、これらのベクターは、ＩＶＩＧの２倍連続希釈物（１０ｍｇ、５ｍｇ、２．５
ｍｇなど）と共にインキュベートし、またはＩＶＩＧなし（条件あたり１Ｅ９ ＧＣ）で
インキュベートする。インキュベーション後、ベクターを用いて、ウェルあたり１Ｅ４の
ＭＯＩ（ウェルあたり１希釈）でＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。４８時間後、ルシフ
ェラーゼの相対量を発光アッセイによりアッセイする。
【実施例8】
【0096】
追加の祖先ＡＡＶキャプシドの産生
次に、最も可能性の高い祖先ＡＡＶキャプシド配列（事後確率により決定される）は、
民間の研究所（Ｇｅｎ９）を介して合成し、線形ｄｓＤＮＡとして提供した。続いて、こ
れらのアミノ酸配列は、それらが異なる程度を確認するために、現存のＡＡＶの配列と比
較した（図１１）。各々の祖先ＶＰ１タンパク質は、３．６％～９．３％で選択された代
表的な現存のＡＡＶのものと相違し（図１１Ａ）、一方、祖先ＶＰ３タンパク質は４．２
～９．４％で相違する（図１１Ｂ）。Ａｎｃ１１０は、ＶＰ１について８９％の配列同一
性であり、強力なＣＮＳ形質導入ベクターであるＡＡＶ９に最も近い再構築された祖先ベ
クターである。これらのキャプシドは、それぞれ、制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ＆Ｓｐ
ｅＩ）およびＴ４ライゲーションによりＡＡＶ産生プラスミド（ｐＡＡベクター２／空）
にサブクローニングされた。これらのクローンを制限消化およびサンガー配列決定により
確認し、その後、プラスミドＤＮＡの中規模調製物を生成した。
次に、最も可能性の高い祖先ＡＡＶキャプシド配列（事後確率により決定される）は、
民間の研究所（Ｇｅｎ９）を介して合成し、線形ｄｓＤＮＡとして提供した。続いて、こ
れらのアミノ酸配列は、それらが異なる程度を確認するために、現存のＡＡＶの配列と比
較した（図１１）。各々の祖先ＶＰ１タンパク質は、３．６％～９．３％で選択された代
表的な現存のＡＡＶのものと相違し（図１１Ａ）、一方、祖先ＶＰ３タンパク質は４．２
～９．４％で相違する（図１１Ｂ）。Ａｎｃ１１０は、ＶＰ１について８９％の配列同一
性であり、強力なＣＮＳ形質導入ベクターであるＡＡＶ９に最も近い再構築された祖先ベ
クターである。これらのキャプシドは、それぞれ、制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ＆Ｓｐ
ｅＩ）およびＴ４ライゲーションによりＡＡＶ産生プラスミド（ｐＡＡベクター２／空）
にサブクローニングされた。これらのクローンを制限消化およびサンガー配列決定により
確認し、その後、プラスミドＤＮＡの中規模調製物を生成した。
【0097】
次に、これらのプラスミドの各々を、ｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼの両方をコード
するレポーター遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生成させるために使用した。前述のよ
うに、これらのベクターを小規模で三連で生成した。その後、ウイルスの粗調製物を、ｑ
ＰＣＲを介して力価測定し、ＡＡＶ８と比較して２．７１％～１８３．１％のウイルス粒
子を生成することを見出した（図１２および１３）。Ａｎｃ１１０の産生および感染数は
ＡＡＶ９について報告されたものと同様である。続いて、これらの力価を用いて、相対感
染力を評価するために力価制御実験を設定した。Ａｎｃ１２６は、その産生が有意に低下
したため、力価制御されなかった。その結果、Ａｎｃ１２６の感染力に関するデータは、
この実験における他のウイルスの感染力と正確に比較することができない。他のベクター
を用いて、１．９Ｅ３ ＧＣ／細胞の感染の多重度（ＭＯＩ）でＨＥＫ２９３細胞を形質
導入した。
するレポーター遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生成させるために使用した。前述のよ
うに、これらのベクターを小規模で三連で生成した。その後、ウイルスの粗調製物を、ｑ
ＰＣＲを介して力価測定し、ＡＡＶ８と比較して２．７１％～１８３．１％のウイルス粒
子を生成することを見出した（図１２および１３）。Ａｎｃ１１０の産生および感染数は
ＡＡＶ９について報告されたものと同様である。続いて、これらの力価を用いて、相対感
染力を評価するために力価制御実験を設定した。Ａｎｃ１２６は、その産生が有意に低下
したため、力価制御されなかった。その結果、Ａｎｃ１２６の感染力に関するデータは、
この実験における他のウイルスの感染力と正確に比較することができない。他のベクター
を用いて、１．９Ｅ３ ＧＣ／細胞の感染の多重度（ＭＯＩ）でＨＥＫ２９３細胞を形質
導入した。
【0098】
形質導入から６０時間後、細胞を、蛍光顕微鏡検査によりＧＦＰ発現について評価した
。ｅＧＦＰ陽性細胞は、陰性対照を除き、各条件下で検出された（図１４）。これは、Ａ
ｎｃ１１０を含む、予測され、合成されおよびクローン化された祖先配列の各々が、生存
可能な感染性ウイルス粒子を生成することができることを示す。感染力の相対的レベルと
いう概念を得るために、ルシフェラーゼアッセイをまた、同じ細胞について行った。結果
は、祖先ベクターの各々が、ＡＡＶ８と比較して２８．３％～８５０．８％でＨＥＫ２９
３細胞に形質導入することが可能であることを示す（図１５および１６）。Ａｎｃ１１０
の形質導入効率は、ＡＡＶ９について報告されたものと同様であることに留意されたい。
力価制御されなかったため、Ａｎｃ１２６は相対的な形質導入の分析から除外した。
。ｅＧＦＰ陽性細胞は、陰性対照を除き、各条件下で検出された（図１４）。これは、Ａ
ｎｃ１１０を含む、予測され、合成されおよびクローン化された祖先配列の各々が、生存
可能な感染性ウイルス粒子を生成することができることを示す。感染力の相対的レベルと
いう概念を得るために、ルシフェラーゼアッセイをまた、同じ細胞について行った。結果
は、祖先ベクターの各々が、ＡＡＶ８と比較して２８．３％～８５０．８％でＨＥＫ２９
３細胞に形質導入することが可能であることを示す（図１５および１６）。Ａｎｃ１１０
の形質導入効率は、ＡＡＶ９について報告されたものと同様であることに留意されたい。
力価制御されなかったため、Ａｎｃ１２６は相対的な形質導入の分析から除外した。
【0099】
まとめると、８つの新規な祖先ＡＡＶキャプシド遺伝子を合成し、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２
、Ａｎｃ１１０および前述のＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターと一緒に機能的ウイルスベクター
の生成に用いた。生成および感染力をインビトロで評価し、それらの知見の概要を図１７
に示す。Ａｎｃ１１０のインビトロ産生および感染力は、ＡＡＶ９および血液脳関門を通
過することができる他のウイルスについて期待される範囲内であった。
、Ａｎｃ１１０および前述のＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターと一緒に機能的ウイルスベクター
の生成に用いた。生成および感染力をインビトロで評価し、それらの知見の概要を図１７
に示す。Ａｎｃ１１０のインビトロ産生および感染力は、ＡＡＶ９および血液脳関門を通
過することができる他のウイルスについて期待される範囲内であった。
【実施例9】
【0100】
ベクター免疫予防
ベクター免疫予防において、遺伝子治療用ビヒクル（ＡＡＶなど）は、感染性物質に対
する広範に中和する抗体をコードする導入遺伝子を送達するために使用される。例えば、
Balazs et al. （2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52）； Limberis et al.（2013, Sci
. Transl. Med., 5:187ra72）； Balazs et al.（2012, Nature, 481:81-4）； およびDe
al et al.（2014, PNAS USA, 111:12528-32）を参照されたい。この治療の１つの利点は
、宿主がそれら自体の細胞に抗体を産生することであり、これは、単一の投与が病因物質
に対する保護の寿命を付与する可能性を有することを意味する。
ベクター免疫予防において、遺伝子治療用ビヒクル（ＡＡＶなど）は、感染性物質に対
する広範に中和する抗体をコードする導入遺伝子を送達するために使用される。例えば、
Balazs et al. （2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52）； Limberis et al.（2013, Sci
. Transl. Med., 5:187ra72）； Balazs et al.（2012, Nature, 481:81-4）； およびDe
al et al.（2014, PNAS USA, 111:12528-32）を参照されたい。この治療の１つの利点は
、宿主がそれら自体の細胞に抗体を産生することであり、これは、単一の投与が病因物質
に対する保護の寿命を付与する可能性を有することを意味する。
【実施例10】
【0101】
ドラッグデリバリービヒクル
ＬＵＣＥＮＴＩＳ（ラニビズマブ）およびＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）は共に、血
管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に対して同じヒト化マウスモノクローナル抗体に基づ
く抗血管形成剤である。ベバシズマブは全長抗体であり、ラニビズマブは断片（Ｆａｂ）
であるが、それらは共に、ＶＥＧＦを拮抗することによって、同じメカニズムを介して滲
出型加齢黄斑変性症を治療するように作用する。例えば、Mao et al.（2011, Hum. Gene
Ther., 22:1525-35）； Xie et al.（2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.20
14.07.105）； およびWatanabe et al.（2010, Gene Ther., 17:1042-51）を参照された
い。これらの両分子はタンパク質であるため、それらはＤＮＡにコードされ、導入遺伝子
を含有するベクターを用いて形質導入された細胞において産生され、ＡＡＶベクターにパ
ッケージングされるのに十分小さい。
ＬＵＣＥＮＴＩＳ（ラニビズマブ）およびＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）は共に、血
管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に対して同じヒト化マウスモノクローナル抗体に基づ
く抗血管形成剤である。ベバシズマブは全長抗体であり、ラニビズマブは断片（Ｆａｂ）
であるが、それらは共に、ＶＥＧＦを拮抗することによって、同じメカニズムを介して滲
出型加齢黄斑変性症を治療するように作用する。例えば、Mao et al.（2011, Hum. Gene
Ther., 22:1525-35）； Xie et al.（2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.20
14.07.105）； およびWatanabe et al.（2010, Gene Ther., 17:1042-51）を参照された
い。これらの両分子はタンパク質であるため、それらはＤＮＡにコードされ、導入遺伝子
を含有するベクターを用いて形質導入された細胞において産生され、ＡＡＶベクターにパ
ッケージングされるのに十分小さい。
【実施例11】
【0102】
ＡＡＶキャプシドの祖先配列再構築
祖先キャプシド配列は、Ｆｉｎｎｉｇａｎら（2012, Nature, 481:360-4）のような最
大尤度法を用いて再構築した。７５個のＡＡＶキャプシド（本明細書に提供されるＧｅｎ
Ｂａｎｋ受託番号）のアラインメントは、ＰＲＡＮＫ ｖ．１２１００２を使用して、－
Ｆオプション（Loytynoja & Goldman, 2005, PNAS USA, 102: 10557-62；Loytynoja & Go
ldman, 2008, Science, 320: 1632-5）を用いて生成し、ＪＴＴ＋Ｆ＋Ｇモデルは、Ｐｒ
ｏｔＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinform., 27: 1164-5）において実行される
赤池（Aikake）情報量規準により、最良適合の系統発生モデルであることが決定された。
完全アライメントを図２５に見ることができる。次に、アラインメントおよび最適適合モ
デルを使用して、ＰｈｙＭＬ３．０（Guindon et al ., 2010, System. Biol, 59:307-21
）による系統発生を推測し、ＰｈｙＭＬにおいて実行される近似尤度比検定（ａＬＲＴ）
（Anismova & Gascuel, 2006, Syst. Biol., 55:539-52）により評価した。分析に含まれ
る全てのＡＡＶを有する系統発生の詳細なバージョンを図２６に示す。次に、Ｔｈｏｒｎ
ｔｏｎグループによって開発されたＬａｚａｒｕｓパッケージにより、ＰＡＭＬ４．６（
Yang, 2007, Mol. Biol. Evol., 24: 1586-91）を用いて祖先キャプシド配列を推測した
。本明細書に示されるように、Ａｎｃ１１０再構築祖先ベクターは、進化的に、ＡＡＶ９
およびＲｈ．８に近く、両者は強力なＣＮＳ形質導入ベクターであることが知られている
。
祖先キャプシド配列は、Ｆｉｎｎｉｇａｎら（2012, Nature, 481:360-4）のような最
大尤度法を用いて再構築した。７５個のＡＡＶキャプシド（本明細書に提供されるＧｅｎ
Ｂａｎｋ受託番号）のアラインメントは、ＰＲＡＮＫ ｖ．１２１００２を使用して、－
Ｆオプション（Loytynoja & Goldman, 2005, PNAS USA, 102: 10557-62；Loytynoja & Go
ldman, 2008, Science, 320: 1632-5）を用いて生成し、ＪＴＴ＋Ｆ＋Ｇモデルは、Ｐｒ
ｏｔＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinform., 27: 1164-5）において実行される
赤池（Aikake）情報量規準により、最良適合の系統発生モデルであることが決定された。
完全アライメントを図２５に見ることができる。次に、アラインメントおよび最適適合モ
デルを使用して、ＰｈｙＭＬ３．０（Guindon et al ., 2010, System. Biol, 59:307-21
）による系統発生を推測し、ＰｈｙＭＬにおいて実行される近似尤度比検定（ａＬＲＴ）
（Anismova & Gascuel, 2006, Syst. Biol., 55:539-52）により評価した。分析に含まれ
る全てのＡＡＶを有する系統発生の詳細なバージョンを図２６に示す。次に、Ｔｈｏｒｎ
ｔｏｎグループによって開発されたＬａｚａｒｕｓパッケージにより、ＰＡＭＬ４．６（
Yang, 2007, Mol. Biol. Evol., 24: 1586-91）を用いて祖先キャプシド配列を推測した
。本明細書に示されるように、Ａｎｃ１１０再構築祖先ベクターは、進化的に、ＡＡＶ９
およびＲｈ．８に近く、両者は強力なＣＮＳ形質導入ベクターであることが知られている
。
【0103】
再構築に内在する不確実性を補うために、コンピュータ計算された事後確率を評価して
、あいまいな再構築部位を同定するためのスクリプトを作成した。事後確率が０．３より
大きい１を超えるアミノ酸を有する祖先的に再構築されたキャプシドに沿った全ての位置
が含まれた。１１個のこのような部位を同定し、それぞれ２つの可能性のあるアミノ酸を
有する。次に、これらの１１個の二形性部位は、現代のウイルス由来のコドンを用いてＤ
ＮＡライブラリーに組み込まれた（ｒｈ．１０）。再構築はＡＡＰおよびキャプシドの共
進化を考慮しなかったため、ライブラリー設計中に非標準的ＣＴＧ開始コドンをＣＡＧに
変えることによってＡＡＰオープンリーディングフレームを除去した。さらに、ＡＡＰ
ＯＲＦ中の別の下流ＡＴＧもまた、コドンをＡＡＧに変えることによって除去した。これ
らの修飾は、キャップＯＲＦ中のアミノ酸を変更させなかった。次に、ＤＮＡライブラリ
ーをＤＮＡ２．０により合成し、続いて制限酵素消化およびライゲーションを介して発現
ベクターにサブクローニングした。
、あいまいな再構築部位を同定するためのスクリプトを作成した。事後確率が０．３より
大きい１を超えるアミノ酸を有する祖先的に再構築されたキャプシドに沿った全ての位置
が含まれた。１１個のこのような部位を同定し、それぞれ２つの可能性のあるアミノ酸を
有する。次に、これらの１１個の二形性部位は、現代のウイルス由来のコドンを用いてＤ
ＮＡライブラリーに組み込まれた（ｒｈ．１０）。再構築はＡＡＰおよびキャプシドの共
進化を考慮しなかったため、ライブラリー設計中に非標準的ＣＴＧ開始コドンをＣＡＧに
変えることによってＡＡＰオープンリーディングフレームを除去した。さらに、ＡＡＰ
ＯＲＦ中の別の下流ＡＴＧもまた、コドンをＡＡＧに変えることによって除去した。これ
らの修飾は、キャップＯＲＦ中のアミノ酸を変更させなかった。次に、ＤＮＡライブラリ
ーをＤＮＡ２．０により合成し、続いて制限酵素消化およびライゲーションを介して発現
ベクターにサブクローニングした。
【実施例12】
【0104】
ベクターおよび配列
アデノ随伴ウイルスベクターは、現存または祖先のウイルスキャプシドのいずれかを用
いて偽型とした。現存のキャプシドには、ＡＡＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ２７
７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ５（
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番
号ＥＵ３６８９１０）、Ｒｈ．１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）、
ＡＡＶ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧｅｎＢａｎｋ
受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ
３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶキャプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１
、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、
およびＡｎｃｌ２７（ＧｅｎＢａｎｋ保留中の提出物）が含まれる。ベクター導入遺伝子
カセットには、ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶＰＡ、ＣＭ
Ｖ．ｆｆＬｕｃｉｆｅａｓｅ．ＳＶＰＡ（インビトロ試験）、ＴＢＧ．ＬａｃＺ．ＲＢＧ
（肝臓）、ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（肝臓および筋肉免疫試験）、ＣＡＳＩ
．ｈＡ１ＡＴ．ＦＦ２Ａ．ｅＧＦＰ．ＲＢＧ（肝臓、筋肉）およびＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｗ
ＰＲＥ（網膜）が挙げられる。
アデノ随伴ウイルスベクターは、現存または祖先のウイルスキャプシドのいずれかを用
いて偽型とした。現存のキャプシドには、ＡＡＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ２７
７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ５（
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番
号ＥＵ３６８９１０）、Ｒｈ．１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）、
ＡＡＶ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧｅｎＢａｎｋ
受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ
３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶキャプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１
、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、
およびＡｎｃｌ２７（ＧｅｎＢａｎｋ保留中の提出物）が含まれる。ベクター導入遺伝子
カセットには、ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶＰＡ、ＣＭ
Ｖ．ｆｆＬｕｃｉｆｅａｓｅ．ＳＶＰＡ（インビトロ試験）、ＴＢＧ．ＬａｃＺ．ＲＢＧ
（肝臓）、ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（肝臓および筋肉免疫試験）、ＣＡＳＩ
．ｈＡ１ＡＴ．ＦＦ２Ａ．ｅＧＦＰ．ＲＢＧ（肝臓、筋肉）およびＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｗ
ＰＲＥ（網膜）が挙げられる。
【実施例13】
【0105】
配列－構造分析
ＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ ２ＱＡ０）を鋳型として用いて、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ
構造相同性モデリングサーバー（Biasini et al., 2014, Nucl. Acids Res., 42:W252-8
）を用いてＡｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３の擬似原子モデルを作成した。ＵＣＳＦキメラパッ
ケージ（Pettersen et al ., 2004, J. Comp. Chem., 25: 1605-12）を用いて、ＡＡＶ２
（ＰＤＢ １ＬＰ３）、ＡＡＶ８（ＰＤＢ ２ＱＡ０）およびＡｎｃ８０ ＶＰ３構造を
さらに重ね合わせ、残基保存に従って色分けした。次に、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２およびＡ
ＡＶ８ ＶＰ３の構造的アライメントを生成し、Ｔ－コーヒーアライメントパッケージ（
Notredame et al., 2000, J. Mol . Biol., 302:205-17）で生成されたこれらの３つの血
清型のＶＰ１／２ドメインの非構造的アラインメントによって完成した。Ａｎｃ８０Ｌ６
５およびＡＡＶ８を分離する突然変異の空間分布はまた、ＡＡＶ８三量体構造の内外表面
で視覚化し、この場合、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アラインメン
トにおける可変残基を青で表し、多型残基を赤で表した。
ＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ ２ＱＡ０）を鋳型として用いて、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ
構造相同性モデリングサーバー（Biasini et al., 2014, Nucl. Acids Res., 42:W252-8
）を用いてＡｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３の擬似原子モデルを作成した。ＵＣＳＦキメラパッ
ケージ（Pettersen et al ., 2004, J. Comp. Chem., 25: 1605-12）を用いて、ＡＡＶ２
（ＰＤＢ １ＬＰ３）、ＡＡＶ８（ＰＤＢ ２ＱＡ０）およびＡｎｃ８０ ＶＰ３構造を
さらに重ね合わせ、残基保存に従って色分けした。次に、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２およびＡ
ＡＶ８ ＶＰ３の構造的アライメントを生成し、Ｔ－コーヒーアライメントパッケージ（
Notredame et al., 2000, J. Mol . Biol., 302:205-17）で生成されたこれらの３つの血
清型のＶＰ１／２ドメインの非構造的アラインメントによって完成した。Ａｎｃ８０Ｌ６
５およびＡＡＶ８を分離する突然変異の空間分布はまた、ＡＡＶ８三量体構造の内外表面
で視覚化し、この場合、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アラインメン
トにおける可変残基を青で表し、多型残基を赤で表した。
【実施例14】
【0106】
ＡＡＶ祖先系統ベクターのインビトロにおける特徴付け
Ａｎｃ８０Ｌｉｂ内の機能的ＡＡＶキャプシドを同定および特徴付けるために、サブク
ローニングされたＤＮＡライブラリーからの個々のクローンを単離し、６ウェルまたは９
６ウェルのいずれかにおいて、トランスで提供されるＡＡＰ２を含むルシフェラーゼ含有
ベクターを産生させるために使用した。トランスフェクションから４８時間が経過した後
、細胞溶解物を、０．４μｍフィルターを通してろ過することにより粗ベクターを単離し
た。次に、この粗ベクター調製物の等量をＨＥＫ２９３細胞がコンフルエントである９６
ウェルプレートに添加し、さらに４８時間後にルシフェラーゼ活性について評価した。合
計７７６クローンを評価した。ＣＭＶ由来ルシフェラーゼを含有するベクターの粗調製物
を６ウェルフォーマットの三連トランスフェクションによって産生させ、祖先ＡＡＶベク
ターに対してトランスでＡＡＰを補充した。合計で、３種の独立した異なる生物学的複製
物がベクターごとに産生された。ＤＮＡｓｅＩ耐性導入遺伝子を上記のように定量した。
次に、これらの粗ウイルス調製物は、各々、２．１×１０２～３．５×１０２ＧＣ／細胞
のＭＯＩで添加されたＡｎｃ１２６を除いて、１．９×１０３ＧＣ／細胞のＭＯＩでＨＥ
Ｋ２９３細胞を技術的に三連にして形質導入する粗ウイルス調製物の能力について評価さ
れた。４８時間が経過した後、形質導入された細胞をルミネッセンスアッセイによってル
シフェラーゼについて評価した。
Ａｎｃ８０Ｌｉｂ内の機能的ＡＡＶキャプシドを同定および特徴付けるために、サブク
ローニングされたＤＮＡライブラリーからの個々のクローンを単離し、６ウェルまたは９
６ウェルのいずれかにおいて、トランスで提供されるＡＡＰ２を含むルシフェラーゼ含有
ベクターを産生させるために使用した。トランスフェクションから４８時間が経過した後
、細胞溶解物を、０．４μｍフィルターを通してろ過することにより粗ベクターを単離し
た。次に、この粗ベクター調製物の等量をＨＥＫ２９３細胞がコンフルエントである９６
ウェルプレートに添加し、さらに４８時間後にルシフェラーゼ活性について評価した。合
計７７６クローンを評価した。ＣＭＶ由来ルシフェラーゼを含有するベクターの粗調製物
を６ウェルフォーマットの三連トランスフェクションによって産生させ、祖先ＡＡＶベク
ターに対してトランスでＡＡＰを補充した。合計で、３種の独立した異なる生物学的複製
物がベクターごとに産生された。ＤＮＡｓｅＩ耐性導入遺伝子を上記のように定量した。
次に、これらの粗ウイルス調製物は、各々、２．１×１０２～３．５×１０２ＧＣ／細胞
のＭＯＩで添加されたＡｎｃ１２６を除いて、１．９×１０３ＧＣ／細胞のＭＯＩでＨＥ
Ｋ２９３細胞を技術的に三連にして形質導入する粗ウイルス調製物の能力について評価さ
れた。４８時間が経過した後、形質導入された細胞をルミネッセンスアッセイによってル
シフェラーゼについて評価した。
【実施例15】
【0107】
ＡＡＶベクター調製
ＡＡＶシス、ＡＡＶトランス、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの大規模ポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエント
に近い単層を有する１０層ハイパーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。プラスミドを
２：１：１の比（２６０μｇのアデノウイルスヘルパープラスミド／１３０μｇのシスプ
ラスミド／１３０μｇのトランスプラスミド）でトランスフェクトした。Ａｎｃベクター
の生産のためのトランスフェクションには、ＡＡＶシスプラスミドと同等量のｐＡＡＰ２
を補充した。ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ
）／ＤＮＡ比は１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクションおよび下流
の精製プロセスは、以前に記載されたように行った（Lock et al, 2010, Hum. Gene Ther
., 21 : 1259-71）。ＤＮＡｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピーを用いて、導入遺伝子カセ
ットのプロモーター、導入遺伝子またはポリアデニル化シグナルコード領域を検出するプ
ライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Applied Biosystems
7500, Life Technologies）によってＡＡＶ調製物を滴定した。大規模調製物の純度をＳ
ＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって評価した。
ＡＡＶシス、ＡＡＶトランス、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの大規模ポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエント
に近い単層を有する１０層ハイパーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。プラスミドを
２：１：１の比（２６０μｇのアデノウイルスヘルパープラスミド／１３０μｇのシスプ
ラスミド／１３０μｇのトランスプラスミド）でトランスフェクトした。Ａｎｃベクター
の生産のためのトランスフェクションには、ＡＡＶシスプラスミドと同等量のｐＡＡＰ２
を補充した。ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ
）／ＤＮＡ比は１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクションおよび下流
の精製プロセスは、以前に記載されたように行った（Lock et al, 2010, Hum. Gene Ther
., 21 : 1259-71）。ＤＮＡｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピーを用いて、導入遺伝子カセ
ットのプロモーター、導入遺伝子またはポリアデニル化シグナルコード領域を検出するプ
ライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Applied Biosystems
7500, Life Technologies）によってＡＡＶ調製物を滴定した。大規模調製物の純度をＳ
ＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって評価した。
【実施例16】
【0108】
構造的および生物物理学的ベクターの特徴付け
Ａｎｃ８０Ｌ６５粒子形態を、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの精製調製物５μＬをｆｏｒ
ｍｖａｒ被覆された４００メッシュの銅グリッド上に装填し、酢酸ウラニルで染色して、
透過型電子顕微鏡で評価した。分析用超遠心分離によって空／完全粒子比を決定した。１
０～３０μｇ／ｍＬのグリセロールを含まないＡｎｃ８０Ｌ６５サンプル５００μＬの含
有量は、ＭＩＴ生物物理施設で入手可能なＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析用超遠心分離機を使用して分析した。実験は、８ホール（５
０Ｔｉ）ローターを用いて２０℃、１５，０００ｒｐｍで行った。沈降プロファイルは、
屈折率光学測定によって定期的な時点で得られた。ソフトウェアＳＥＤＦＩＴ（Schuck e
t al., 2002, Biophys. J., 82: 1096-111）を用いてＬａｍｍ方程式を解き、沈降係数分
布分析を行って、ＡＡＶ試料に含まれる異なる種を同定した。ＵＶ蛍光分光法および示差
走査蛍光（ＤＳＦ）によってＡｎｃ８０Ｌ０６５の熱安定性を評価した。各血清型のトリ
プトファン蛍光（Ausar et al., 2006, J. Biol. Chem., 281 : 19478-88）に対して、４
．５μＬのアリコート６個を２００μＬのエッペンドルフチューブで調製し、３０℃、４
５℃、６０℃、７５℃、９０℃または９９℃で５分間インキュベートし、スピンダウンし
、室温で５分間冷却し、二連にして（それぞれ２μＬ）Ｔａｋｅ ３ＴＭ Ｍｉｃｒｏ
Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上に装填した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ Ｈ
ｙｂｒｉｄ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を用いて、試料を２９３ｎｍ
で照射し、発光スペクトルを１ｎｍの解像度で３２３～４００ｎｍで取得した。移動平均
フィルター（スパン：１５）を用いて、サンプルおよびブランク発光スペクトルをさらに
平滑化した。バックグラウンドを差し引いた後、最大発光波長を各血清型および各温度条
件について決定した。その後、これらの波長値を温度の関数としてプロットして、異なる
ＡＡＶ血清型の熱安定性プロファイルを導出した。示差走査蛍光（Rayaprolu et al., 20
13, J. Virol., 87: 13150-60）について、各ＡＡＶ２５μＬは、５×ＳＹＰＲＯ（登録
商標）Ｏｒａｎｇｅ（Life Technologies）で補充され、９６ウェルＰＣＲプレート（Den
ville Scientific Inc）に装填され、２０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿させ、Ｒｅａｐｌ
ｅｘ ２Ｓ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ）（励起：４５０ｎｍ；発光：５５０ｎｍ）を用いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）
Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニターしながら温度勾配（３０～９９℃、０．１℃／６ｓ）
に曝露させた。各アッセイにおいて、共に５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジで補充さ
れた２５μＬのＦＦＢ（２１－０３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）および２５μＬの０．２５ｍｇ
／ｍＬリゾチーム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ陰性対照および陽性対
照として用いた。２５μＬのＡＡＶベクターの蛍光はまた、蛍光バックグラウンド除去の
ための色素の非存在下でモニターした。蛍光強度は０～１００％でさらに標準化し、温度
の関数としてプロットした。
Ａｎｃ８０Ｌ６５粒子形態を、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの精製調製物５μＬをｆｏｒ
ｍｖａｒ被覆された４００メッシュの銅グリッド上に装填し、酢酸ウラニルで染色して、
透過型電子顕微鏡で評価した。分析用超遠心分離によって空／完全粒子比を決定した。１
０～３０μｇ／ｍＬのグリセロールを含まないＡｎｃ８０Ｌ６５サンプル５００μＬの含
有量は、ＭＩＴ生物物理施設で入手可能なＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析用超遠心分離機を使用して分析した。実験は、８ホール（５
０Ｔｉ）ローターを用いて２０℃、１５，０００ｒｐｍで行った。沈降プロファイルは、
屈折率光学測定によって定期的な時点で得られた。ソフトウェアＳＥＤＦＩＴ（Schuck e
t al., 2002, Biophys. J., 82: 1096-111）を用いてＬａｍｍ方程式を解き、沈降係数分
布分析を行って、ＡＡＶ試料に含まれる異なる種を同定した。ＵＶ蛍光分光法および示差
走査蛍光（ＤＳＦ）によってＡｎｃ８０Ｌ０６５の熱安定性を評価した。各血清型のトリ
プトファン蛍光（Ausar et al., 2006, J. Biol. Chem., 281 : 19478-88）に対して、４
．５μＬのアリコート６個を２００μＬのエッペンドルフチューブで調製し、３０℃、４
５℃、６０℃、７５℃、９０℃または９９℃で５分間インキュベートし、スピンダウンし
、室温で５分間冷却し、二連にして（それぞれ２μＬ）Ｔａｋｅ ３ＴＭ Ｍｉｃｒｏ
Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上に装填した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ Ｈ
ｙｂｒｉｄ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を用いて、試料を２９３ｎｍ
で照射し、発光スペクトルを１ｎｍの解像度で３２３～４００ｎｍで取得した。移動平均
フィルター（スパン：１５）を用いて、サンプルおよびブランク発光スペクトルをさらに
平滑化した。バックグラウンドを差し引いた後、最大発光波長を各血清型および各温度条
件について決定した。その後、これらの波長値を温度の関数としてプロットして、異なる
ＡＡＶ血清型の熱安定性プロファイルを導出した。示差走査蛍光（Rayaprolu et al., 20
13, J. Virol., 87: 13150-60）について、各ＡＡＶ２５μＬは、５×ＳＹＰＲＯ（登録
商標）Ｏｒａｎｇｅ（Life Technologies）で補充され、９６ウェルＰＣＲプレート（Den
ville Scientific Inc）に装填され、２０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿させ、Ｒｅａｐｌ
ｅｘ ２Ｓ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ）（励起：４５０ｎｍ；発光：５５０ｎｍ）を用いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）
Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニターしながら温度勾配（３０～９９℃、０．１℃／６ｓ）
に曝露させた。各アッセイにおいて、共に５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジで補充さ
れた２５μＬのＦＦＢ（２１－０３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）および２５μＬの０．２５ｍｇ
／ｍＬリゾチーム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ陰性対照および陽性対
照として用いた。２５μＬのＡＡＶベクターの蛍光はまた、蛍光バックグラウンド除去の
ための色素の非存在下でモニターした。蛍光強度は０～１００％でさらに標準化し、温度
の関数としてプロットした。
【実施例17】
【0109】
マウス実験
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍ
Ａ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（６～８週齢）を購入し、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）動物施設に保管した。全ての動物手
順は、ＳＥＲＩの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ
ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認されたプロトコールに従って行
われた。肝臓標的化遺伝子移入研究について、１００μｌの単回腹腔内注射または１５０
μｌ中の単一の後眼眼窩静脈叢静脈注射を受けた。筋肉標的化ｅＧＦＰ実験について、５
０μｌを右後腓腹筋に注射した。ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ動物ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎ
ｔ, Ｉｎｃ.）を顎下顎のマウス出血に使用した。ブラウンキャップチューブ（マイクロ
チューブ１．１ｍｌ Ｚ－Ｇｅｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清収集に使用した。ベクター
の体内分布研究は、２８ｄｐｉのベクター投与で屠殺にしたマウスからの肝臓、心臓、腎
臓、肺および脾臓を含む組織に対して行われた。肝臓におけるｅＧＦＰ発現を視覚化する
ために、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、リン酸緩衝食塩水
ＰＢＳで３０分間洗浄し、１０％、２０％および３０％スクロース勾配で逐次インキュベ
ートし、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃ
Ａ）において凍結した。ｌａｃＺのマウス肝臓発現をβ－Ｇａｌ染色キット（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。４％：パラホルムアルデヒド固定肝組織
を１０μｍで切片化した。組織切片をＰＢＳで洗浄して残留固定液を除去し、市販の染色
溶液（４００ｍＭフェリシアン化カリウム、４００ｍＭフェロシアン化カリウム、２００
ｍＭ塩化マグネシウム、Ｘ－ｇａｌ ９５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－
Ｄ－ガラクトピラノシド）を用いて０．５～２時間、３７℃で染色した。凍結切片を１０
μｍで調製した。筋肉におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を１０％のトラガ
カントガム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｇ１１２８）を保持するコルク
ディスク上に載せ、液体窒素を用いて－１５０℃に冷却したイソペンタン（Ｓｉｇｍａ－
Ａｌｄｒｉｃｈ ２７、０３４－２）を用いて瞬時凍結した。筋肉の凍結切片を１０μｍ
で調製した。網膜下注射は２μｌの容量で行い、２×１０９ＧＣの動物あたりの絶対用量
を用いた。各ベクターは、分析した血清型あたり合計４つの眼に注射した。注射後４週間
で動物を安楽死させ、組織学的分析のために眼を回収した。除核した眼を４％パラホルム
アルデヒド（ＰＦＡ）中、氷上で１時間固定し、次にＯＣＴに包埋し、凍結し、その後凍
結切片にした。網膜切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で１０分間染色し、共焦点画像化の
ためにスライドに載せた。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍ
Ａ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（６～８週齢）を購入し、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）動物施設に保管した。全ての動物手
順は、ＳＥＲＩの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ
ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認されたプロトコールに従って行
われた。肝臓標的化遺伝子移入研究について、１００μｌの単回腹腔内注射または１５０
μｌ中の単一の後眼眼窩静脈叢静脈注射を受けた。筋肉標的化ｅＧＦＰ実験について、５
０μｌを右後腓腹筋に注射した。ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ動物ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎ
ｔ, Ｉｎｃ.）を顎下顎のマウス出血に使用した。ブラウンキャップチューブ（マイクロ
チューブ１．１ｍｌ Ｚ－Ｇｅｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清収集に使用した。ベクター
の体内分布研究は、２８ｄｐｉのベクター投与で屠殺にしたマウスからの肝臓、心臓、腎
臓、肺および脾臓を含む組織に対して行われた。肝臓におけるｅＧＦＰ発現を視覚化する
ために、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、リン酸緩衝食塩水
ＰＢＳで３０分間洗浄し、１０％、２０％および３０％スクロース勾配で逐次インキュベ
ートし、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃ
Ａ）において凍結した。ｌａｃＺのマウス肝臓発現をβ－Ｇａｌ染色キット（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。４％：パラホルムアルデヒド固定肝組織
を１０μｍで切片化した。組織切片をＰＢＳで洗浄して残留固定液を除去し、市販の染色
溶液（４００ｍＭフェリシアン化カリウム、４００ｍＭフェロシアン化カリウム、２００
ｍＭ塩化マグネシウム、Ｘ－ｇａｌ ９５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－
Ｄ－ガラクトピラノシド）を用いて０．５～２時間、３７℃で染色した。凍結切片を１０
μｍで調製した。筋肉におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を１０％のトラガ
カントガム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｇ１１２８）を保持するコルク
ディスク上に載せ、液体窒素を用いて－１５０℃に冷却したイソペンタン（Ｓｉｇｍａ－
Ａｌｄｒｉｃｈ ２７、０３４－２）を用いて瞬時凍結した。筋肉の凍結切片を１０μｍ
で調製した。網膜下注射は２μｌの容量で行い、２×１０９ＧＣの動物あたりの絶対用量
を用いた。各ベクターは、分析した血清型あたり合計４つの眼に注射した。注射後４週間
で動物を安楽死させ、組織学的分析のために眼を回収した。除核した眼を４％パラホルム
アルデヒド（ＰＦＡ）中、氷上で１時間固定し、次にＯＣＴに包埋し、凍結し、その後凍
結切片にした。網膜切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で１０分間染色し、共焦点画像化の
ためにスライドに載せた。
【実施例18】
【0110】
非ヒト霊長類モデル
アカゲザルを用いた実験は、ニューイングランド霊長類研究センター（Ｈａｒｖａｒｄ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）で行われた。全ての実験手順は、ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃ
ｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒ
ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ（ＨＭＡ） Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏ
ｎ Ａｎｉｍａｌｓ、ハーバード大学医学大学院の動物実験委員会（ｔｈｅ Ｈａｒｖａ
ｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）委員会によって承認された。動物をデキ
サメタゾンと組み合わせてケタミンまたはテラゾールで鎮静させた。分泌型ｒｈＣＧを発
現するウイルスベクターを１ｍｌ／分の速度で２０ｍｌ容量で静脈内投与した。注射から
回復した後、動物を臨床的に一般的な健康状態についてモニターし、２カ月間追跡した。
この間に、定期的な間隔で静脈切開を行い、ＡＡＶに対する免疫応答および毒性を評価し
た。７０日後、サルを安楽死させ、肝臓サンプルを採取した。
アカゲザルを用いた実験は、ニューイングランド霊長類研究センター（Ｈａｒｖａｒｄ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）で行われた。全ての実験手順は、ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃ
ｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒ
ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ（ＨＭＡ） Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏ
ｎ Ａｎｉｍａｌｓ、ハーバード大学医学大学院の動物実験委員会（ｔｈｅ Ｈａｒｖａ
ｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）委員会によって承認された。動物をデキ
サメタゾンと組み合わせてケタミンまたはテラゾールで鎮静させた。分泌型ｒｈＣＧを発
現するウイルスベクターを１ｍｌ／分の速度で２０ｍｌ容量で静脈内投与した。注射から
回復した後、動物を臨床的に一般的な健康状態についてモニターし、２カ月間追跡した。
この間に、定期的な間隔で静脈切開を行い、ＡＡＶに対する免疫応答および毒性を評価し
た。７０日後、サルを安楽死させ、肝臓サンプルを採取した。
【実施例19】
【0111】
ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡ１ＡＴ）の定量化
血清試料中のｈＡ１ＡＴの発現レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。プレートを１
０００ｎｇ／ウェルの一次コーティングウサギ抗Ａ１ＡＴ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティ
ングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、２時間ブロックした。血清
サンプルを５倍に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗
ヒトＡ１ＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ）を２時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダー
ゼ基質を添加した。１時間以内に分光光度計プレートリーダーを用いてＯＤ４０５ｎｍ値
を測定した。
血清試料中のｈＡ１ＡＴの発現レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。プレートを１
０００ｎｇ／ウェルの一次コーティングウサギ抗Ａ１ＡＴ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティ
ングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、２時間ブロックした。血清
サンプルを５倍に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗
ヒトＡ１ＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ）を２時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダー
ゼ基質を添加した。１時間以内に分光光度計プレートリーダーを用いてＯＤ４０５ｎｍ値
を測定した。
【実施例20】
【0112】
組織生体分布
スナップ凍結組織をプロテイナーゼＫで消化し、指示通りにＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮ
Ａ）を抽出した。単離したｇＤＮＡを、ＢｉｏＴｅｋプレート読み取り分光光度計（Ｂｉ
ｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて定
量した。二倍体細胞におけるウイルスゲノム（ｖｇ）分布を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）
ＰＣＲマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を
用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲ
システムおよび先に記載した導入遺伝子特異的プライマー／プローブ（Wang et al., 201
0, Mol. Ther., 18: 118-25）を用いてＱＰＣＲにより検出および定量した。
スナップ凍結組織をプロテイナーゼＫで消化し、指示通りにＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮ
Ａ）を抽出した。単離したｇＤＮＡを、ＢｉｏＴｅｋプレート読み取り分光光度計（Ｂｉ
ｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて定
量した。二倍体細胞におけるウイルスゲノム（ｖｇ）分布を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）
ＰＣＲマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を
用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲ
システムおよび先に記載した導入遺伝子特異的プライマー／プローブ（Wang et al., 201
0, Mol. Ther., 18: 118-25）を用いてＱＰＣＲにより検出および定量した。
【実施例21】
【0113】
ｍＲＮＡ発現
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した
。全ＲＮＡ（１μｇ）をＤＮａｓｅ処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写
キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｍＲＮＡ発現は、
特定のプライマー／プローブ反応混合物；ＧＡＰＤＨ（Ｒｈ０２６２１７４５＿ｇｌ）、
アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（Ｒｈ０２８２１９８３＿ｇｌ）と共に、ＴａｑＭａｎ
（登録商標）ＰＣＲプライマーミックス試薬を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて検出および定量した。Ｔ
ａｑＭａｎカスタムプライマー／プローブの示唆された反応条件を適用した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した
。全ＲＮＡ（１μｇ）をＤＮａｓｅ処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写
キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｍＲＮＡ発現は、
特定のプライマー／プローブ反応混合物；ＧＡＰＤＨ（Ｒｈ０２６２１７４５＿ｇｌ）、
アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（Ｒｈ０２８２１９８３＿ｇｌ）と共に、ＴａｑＭａｎ
（登録商標）ＰＣＲプライマーミックス試薬を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて検出および定量した。Ｔ
ａｑＭａｎカスタムプライマー／プローブの示唆された反応条件を適用した。
【実施例22】
【0114】
中和抗体アッセイ
ＮＡＢは、以下の改変を伴って以前に記載されたように（Calcedo et al, 2009, J. In
fect. Dis., 199:38 1 -90）、インビトロで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、
ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０およびｒｈ３２．３３（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ
ｏ ＣａｌｃｅｄｏおよびＪａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，ＵＰｅｎｎからの親切な贈呈
）（Gao et al, 2004, J. Virol, 78:6381-88）で予備免疫化されたウサギの血清を１：
４０から１：２０，９７１，５２０まで連続希釈し、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ２．ＳＶＰ
Ａトランスジェニック構築物を保有する、一致する血清型またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいず
れかの１０９個のＧＣ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、２４時間前
にヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）のＭＯＩ（感染多重度）＝２０で感染させた、９６
ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に混合物を添加した。細胞を４８時間インキュベ
ートした後、Ｄ－ルシフェリン含有緩衝液を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレ
ートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて発光を測定した。血清
を含まずにインキュベートしたＡＡＶに感染した対照細胞に対して、発光を標準化した。
発光が対照ウェルと比較して＜５０％である希釈で中和力価を決定した。
ＮＡＢは、以下の改変を伴って以前に記載されたように（Calcedo et al, 2009, J. In
fect. Dis., 199:38 1 -90）、インビトロで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、
ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０およびｒｈ３２．３３（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ
ｏ ＣａｌｃｅｄｏおよびＪａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，ＵＰｅｎｎからの親切な贈呈
）（Gao et al, 2004, J. Virol, 78:6381-88）で予備免疫化されたウサギの血清を１：
４０から１：２０，９７１，５２０まで連続希釈し、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ２．ＳＶＰ
Ａトランスジェニック構築物を保有する、一致する血清型またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいず
れかの１０９個のＧＣ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、２４時間前
にヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）のＭＯＩ（感染多重度）＝２０で感染させた、９６
ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に混合物を添加した。細胞を４８時間インキュベ
ートした後、Ｄ－ルシフェリン含有緩衝液を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレ
ートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて発光を測定した。血清
を含まずにインキュベートしたＡＡＶに感染した対照細胞に対して、発光を標準化した。
発光が対照ウェルと比較して＜５０％である希釈で中和力価を決定した。
【実施例23】
【0115】
ＡＡＶキャプシドタンパク質のインシリコ祖先配列再構築
プロウイルスＤＮＡまたは考古学的サンプル由来の無傷の祖先ウイルス配列を単離する
ことを試みる代わりに、ＡＡＶキャップの推定上の祖先アミノ酸配列を推測するために、
現代のＡＡＶ配列データを系統解析および最大尤度ＡＳＲにより統合した。以前のバイオ
マイニング努力からの合計７５個の配列ＡＡＶ血清型単離物および変異体（Gao et al.,
2003, PNAS USA, 100:6081-6; Gao et al., 2004, J. Virol., 78:6381-8; Gao et al.,
2005, Current Gene Ther., 5:285-97）からは、ＡＡＶ５を外れ値として、ＰＨＹＭＬ（
Guindon et al., 2010, System . Biol, 59:307-21）を用いて生成された頑健なＡＡＶキ
ャップ系統発生が得られた。この分析には、（ａ）霊長類集団において天然に存在し、（
ｂ）以前は効率的にアセンブルして感染することが実証されており、および（ｃ）その自
然の経歴において組換え事象により生じたことが知られていない全長ＡＡＶキャプシドだ
けが含まれた。これは、伝統的な系統発生解析およびＡＳＲは、水平的進化事象を説明し
ていないためである。図１８の樹状図は、Ａｎｃ８０と命名された単一節と並行した、Ａ
ＡＶ４および５の血清型の早期分化を伴うＡＡＶの進化的経路をモデル化する。知られて
いる現代のＡＡＶのほとんどがこのＡｎｃ８０から進化した。これらの血清型には、現在
、遺伝子治療試験における臨床開発中のＡＡＶ１、２、８および９が含まれる。この系統
樹の節はＡｎｃと命名され、順番に番号が付けられた。ＡＡＶに対するＡＳＲの本明細書
に記載されるアプローチを検証するために、Ａｎｃ８０を、遺伝子治療ベクターとしての
可能な使用のために組換えウイルスに発生させるための節として選択した。
プロウイルスＤＮＡまたは考古学的サンプル由来の無傷の祖先ウイルス配列を単離する
ことを試みる代わりに、ＡＡＶキャップの推定上の祖先アミノ酸配列を推測するために、
現代のＡＡＶ配列データを系統解析および最大尤度ＡＳＲにより統合した。以前のバイオ
マイニング努力からの合計７５個の配列ＡＡＶ血清型単離物および変異体（Gao et al.,
2003, PNAS USA, 100:6081-6; Gao et al., 2004, J. Virol., 78:6381-8; Gao et al.,
2005, Current Gene Ther., 5:285-97）からは、ＡＡＶ５を外れ値として、ＰＨＹＭＬ（
Guindon et al., 2010, System . Biol, 59:307-21）を用いて生成された頑健なＡＡＶキ
ャップ系統発生が得られた。この分析には、（ａ）霊長類集団において天然に存在し、（
ｂ）以前は効率的にアセンブルして感染することが実証されており、および（ｃ）その自
然の経歴において組換え事象により生じたことが知られていない全長ＡＡＶキャプシドだ
けが含まれた。これは、伝統的な系統発生解析およびＡＳＲは、水平的進化事象を説明し
ていないためである。図１８の樹状図は、Ａｎｃ８０と命名された単一節と並行した、Ａ
ＡＶ４および５の血清型の早期分化を伴うＡＡＶの進化的経路をモデル化する。知られて
いる現代のＡＡＶのほとんどがこのＡｎｃ８０から進化した。これらの血清型には、現在
、遺伝子治療試験における臨床開発中のＡＡＶ１、２、８および９が含まれる。この系統
樹の節はＡｎｃと命名され、順番に番号が付けられた。ＡＡＶに対するＡＳＲの本明細書
に記載されるアプローチを検証するために、Ａｎｃ８０を、遺伝子治療ベクターとしての
可能な使用のために組換えウイルスに発生させるための節として選択した。
【0116】
この節のこの再構築は、この進化中間体からの自然発生したＡＡＶ臨床的に関連する子
孫の豊富さによって非常に知らされていたため、Ａｎｃ８０が部分的に選択された。さら
に、Ａｎｃ８０は、Ａｎｃ８０の種分化に先立って生じた公知のヘルパー依存性霊長類Ａ
ＡＶを有するディペンドパルボビリダエ（Dependoparvoviridae）系統発生に組み込まれ
ており（図１８）、祖先再構築粒子がこのファミリー内で共有される基本特性を保持する
可能性が高くなる。最大尤度法を使用して、特定の位置の各残基の計算された事後確率に
基づいて、Ａｎｃ８０についてタンパク質配列予測を導出した。各位置において適切なア
ミノ酸を選択する際の不確実性を説明するために、ｐ≧０．３の個々のアミノ酸事後確率
を有する位置についての全ての可能な配列置換を生成することが目的であった。このライ
ブラリーＡｎｃ８０Ｌｉｂの表示は、図１９Ａに、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８参照キャプシ
ド配列との部分－構造アラインメントで示されている。実際には、これは図１８に示され
るような確率的な配列空間をもたらした；７３６個のＡｎｃ８０キャプシドのアミノ酸位
置のうちの１１個を除く全てがＡＳＲに固有の残基を占める一方で、１１個の位置につい
て２つのアミノ酸オプションが提供され、結果として２１１＝２０４８個の置換を含む配
列空間が得られた。
孫の豊富さによって非常に知らされていたため、Ａｎｃ８０が部分的に選択された。さら
に、Ａｎｃ８０は、Ａｎｃ８０の種分化に先立って生じた公知のヘルパー依存性霊長類Ａ
ＡＶを有するディペンドパルボビリダエ（Dependoparvoviridae）系統発生に組み込まれ
ており（図１８）、祖先再構築粒子がこのファミリー内で共有される基本特性を保持する
可能性が高くなる。最大尤度法を使用して、特定の位置の各残基の計算された事後確率に
基づいて、Ａｎｃ８０についてタンパク質配列予測を導出した。各位置において適切なア
ミノ酸を選択する際の不確実性を説明するために、ｐ≧０．３の個々のアミノ酸事後確率
を有する位置についての全ての可能な配列置換を生成することが目的であった。このライ
ブラリーＡｎｃ８０Ｌｉｂの表示は、図１９Ａに、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８参照キャプシ
ド配列との部分－構造アラインメントで示されている。実際には、これは図１８に示され
るような確率的な配列空間をもたらした；７３６個のＡｎｃ８０キャプシドのアミノ酸位
置のうちの１１個を除く全てがＡＳＲに固有の残基を占める一方で、１１個の位置につい
て２つのアミノ酸オプションが提供され、結果として２１１＝２０４８個の置換を含む配
列空間が得られた。
【0117】
既存のＡＡＶおよびそれらのＸ線結晶学データと共にＡｎｃ８０Ｌｉｂの構造および配
列アラインメントは、現在知られている循環ＡＡＶからの顕著な相違を強調する。ＢＬＡ
ＳＴ検索によって決定された最も近い相同体は、ｒｈ．１０、霊長類ディペンドパルボビ
リダエ（Dependoparvoviridae）のクレードＥ内のアカゲザル単離物であり、これは最小
８．０％でＡｎｃ８０Ｌｉｂと異なり、５９個の多様なアミノ酸位置を占める（図１９Ｂ
）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ２は、それぞれ９．５％および１２．０％相違し、これらの７
０～８７個の可変部位は、ＶＰ１、２の固有のドメインを含むＶＰ１タンパク質全体に広
がっている（図１９Ａ、１９Ｂ）。多様性は、ＡＡＶ２および８モノマー構造をオーバー
レイしたＡｎｃ８０Ｌｉｂクローンの構造モデリングに基づくだけでなく、配列に関して
も超可変領域ドメインＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおいて最も高い（図１９Ａ、１
９Ｃ）。図１９ＤのＡＡＶ２およびＡＡＶ８の三量体Ｘ線結晶構造モデルへの可変Ａｎｃ
８０残基のマッピングは、ビリオンの外面上の３倍対称軸の周りの突起のピークおよびフ
ランク上で生じるほとんどの変化を強調する。しかしながら、粒子の内部表面上およびＸ
線では解析されない構造であるＣａｐの領域上にある少数の変異に加えて、かなりの数の
可変残基も、３倍軸の外側の表面に露出したドメイン上に認められた。
列アラインメントは、現在知られている循環ＡＡＶからの顕著な相違を強調する。ＢＬＡ
ＳＴ検索によって決定された最も近い相同体は、ｒｈ．１０、霊長類ディペンドパルボビ
リダエ（Dependoparvoviridae）のクレードＥ内のアカゲザル単離物であり、これは最小
８．０％でＡｎｃ８０Ｌｉｂと異なり、５９個の多様なアミノ酸位置を占める（図１９Ｂ
）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ２は、それぞれ９．５％および１２．０％相違し、これらの７
０～８７個の可変部位は、ＶＰ１、２の固有のドメインを含むＶＰ１タンパク質全体に広
がっている（図１９Ａ、１９Ｂ）。多様性は、ＡＡＶ２および８モノマー構造をオーバー
レイしたＡｎｃ８０Ｌｉｂクローンの構造モデリングに基づくだけでなく、配列に関して
も超可変領域ドメインＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおいて最も高い（図１９Ａ、１
９Ｃ）。図１９ＤのＡＡＶ２およびＡＡＶ８の三量体Ｘ線結晶構造モデルへの可変Ａｎｃ
８０残基のマッピングは、ビリオンの外面上の３倍対称軸の周りの突起のピークおよびフ
ランク上で生じるほとんどの変化を強調する。しかしながら、粒子の内部表面上およびＸ
線では解析されない構造であるＣａｐの領域上にある少数の変異に加えて、かなりの数の
可変残基も、３倍軸の外側の表面に露出したドメイン上に認められた。
【実施例24】
【0118】
Ａｎｃ８０合成および基本的特徴
続いて、Ａｎｃ８０Ｌｉｂタンパク質配列を逆翻訳し、プールされたライブラリーフォ
ーマットの遺伝子合成によって作製した。キャプシド遺伝子を、ＡＡＶ２ ＲｅｐをｐＡ
ｎｃ８０ＬｉｂにコードするＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングし、続いて
そのライブラリーをクローン的にデコンボリューションした。個々のクローン（ｐＡｎｃ
８０ＬＸと称し、Ｘは連続番号である）は、最小限多様なライブラリー集団において潜在
的に干渉する競合相互作用を回避するために、単離して評価された。個々のＡｎｃ８０ク
ローンの一部は、完全性および複雑性要件を確認するためにサンガー配列決定された。ク
ローンＡｎｃ８０プラスミドは、ΔＦ６アデノウイルスヘルパープラスミド、ＡＡＶ２由
来のＡＡＰ（ＡＡＰ２）の発現構築物、およびルシフェラーゼをコードするＩＴＲ隣接発
現構築物と共に同時トランスフェクトされた。合計７７６個のライブラリークローンを産
生させ、組み合わせた粒子アセンブリおよび形質移入効率を評価することを目的とした半
ハイスループットアッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞上の等容量のプロデューサー細胞
溶解物に接種した。Ａｎｃ８０クローンの約５０％が、この初歩的スクリーニングアッセ
イにおいてバックグラウンドよりも検出可能なシグナルをもたらした。最も高いルシフェ
ラーゼシグナルを有するいくつかのリード候補が、ＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子（ＧＣ）の
配列決定および滴定、ならびにＨＥＫ２９３細胞上の感染力に進行した。これらの結果に
基づいて、評価された第６５番目のＡｎｃ８０ＬｉｂクローンであるＡｎｃ８０Ｌ６５を
さらなる特徴付けのために選択した。細胞溶解物からのＡｎｃ８０Ｌ６５ベクター収率は
、ＡＡＶ２収率の８２～１６７％であるが、高収率ＡＡＶ８（３～５％相対的ＡＡＶ８収
率）と比較して低下した。ＨＥＫ２９３のインビトロでの感染力はＡＡＶ２より劣るが、
しかしながら、細胞あたりの粒子に基づきＡＡＶ８より優れている。
続いて、Ａｎｃ８０Ｌｉｂタンパク質配列を逆翻訳し、プールされたライブラリーフォ
ーマットの遺伝子合成によって作製した。キャプシド遺伝子を、ＡＡＶ２ ＲｅｐをｐＡ
ｎｃ８０ＬｉｂにコードするＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングし、続いて
そのライブラリーをクローン的にデコンボリューションした。個々のクローン（ｐＡｎｃ
８０ＬＸと称し、Ｘは連続番号である）は、最小限多様なライブラリー集団において潜在
的に干渉する競合相互作用を回避するために、単離して評価された。個々のＡｎｃ８０ク
ローンの一部は、完全性および複雑性要件を確認するためにサンガー配列決定された。ク
ローンＡｎｃ８０プラスミドは、ΔＦ６アデノウイルスヘルパープラスミド、ＡＡＶ２由
来のＡＡＰ（ＡＡＰ２）の発現構築物、およびルシフェラーゼをコードするＩＴＲ隣接発
現構築物と共に同時トランスフェクトされた。合計７７６個のライブラリークローンを産
生させ、組み合わせた粒子アセンブリおよび形質移入効率を評価することを目的とした半
ハイスループットアッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞上の等容量のプロデューサー細胞
溶解物に接種した。Ａｎｃ８０クローンの約５０％が、この初歩的スクリーニングアッセ
イにおいてバックグラウンドよりも検出可能なシグナルをもたらした。最も高いルシフェ
ラーゼシグナルを有するいくつかのリード候補が、ＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子（ＧＣ）の
配列決定および滴定、ならびにＨＥＫ２９３細胞上の感染力に進行した。これらの結果に
基づいて、評価された第６５番目のＡｎｃ８０ＬｉｂクローンであるＡｎｃ８０Ｌ６５を
さらなる特徴付けのために選択した。細胞溶解物からのＡｎｃ８０Ｌ６５ベクター収率は
、ＡＡＶ２収率の８２～１６７％であるが、高収率ＡＡＶ８（３～５％相対的ＡＡＶ８収
率）と比較して低下した。ＨＥＫ２９３のインビトロでの感染力はＡＡＶ２より劣るが、
しかしながら、細胞あたりの粒子に基づきＡＡＶ８より優れている。
【0119】
Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクター調製物は、従来のプロトコールに従ったスケールでイオジキ
サノール勾配上で生成および精製し、種々の生化学的、生物物理学的および構造的分析に
供した。Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された調製物内の粒子を電子顕微鏡（ＥＭ）による陰性
染色下で視覚化した（図２０Ａ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５ビリオンは、他のＡＡＶカプソマー
と異なり、約２０～２５ｎｍの直径を有する比較的均一な六角形の粒子となっている。変
性粒子は、ＳＤＳ電気泳動下で、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８粒子からのＶＰ１－３タンパク
質に対応する約１：１：１０の比で、６０、７２および９０ｋＤａの３つのバンドに分離
した（図２０Ｂ）。分析的超遠心分離（ＡＵＧ）により、ＡＡＶ８（８５．９Ｓ）からわ
ずかに増加した８８．９ＳのＡｎｃ８０Ｌ６５を含むゲノムまたは完全なＡｎｃ８０Ｌ６
５の沈降係数を決定することができた（図２０Ｃ）。この分析は、ベクターゲノムが欠如
していると推定される、空のまたはより低い密度のアセンブルされた粒子の相対存在量な
らびに全体的な純度のさらなる決定を可能にした。１つの懸念は、祖先キャプシド配列の
不正確なモデリングが、ゲノムをパッケージングする能力が不十分である構造をもたらし
得、Ａｎｃ８０Ｌ６５調製物における空対完全比が偏る結果となることであった。結果は
、ＡＡＶ８による観察と一致して、調製物中の約８５％の完全粒子に対して約１６％が空
粒子であることを示した（図２０Ｃ）。さらに、祖先キャプシド組成物の次善のモデル化
により粒子の安定性が低下する可能性があると仮定し、粒子を熱安定性アッセイに供する
と、その指示された予測に対して、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、その推定されるＡＡＶ２および
ＡＡＶ８よりも１５～３０℃熱安定性であることが決定された（図２０Ｄ）。
サノール勾配上で生成および精製し、種々の生化学的、生物物理学的および構造的分析に
供した。Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された調製物内の粒子を電子顕微鏡（ＥＭ）による陰性
染色下で視覚化した（図２０Ａ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５ビリオンは、他のＡＡＶカプソマー
と異なり、約２０～２５ｎｍの直径を有する比較的均一な六角形の粒子となっている。変
性粒子は、ＳＤＳ電気泳動下で、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８粒子からのＶＰ１－３タンパク
質に対応する約１：１：１０の比で、６０、７２および９０ｋＤａの３つのバンドに分離
した（図２０Ｂ）。分析的超遠心分離（ＡＵＧ）により、ＡＡＶ８（８５．９Ｓ）からわ
ずかに増加した８８．９ＳのＡｎｃ８０Ｌ６５を含むゲノムまたは完全なＡｎｃ８０Ｌ６
５の沈降係数を決定することができた（図２０Ｃ）。この分析は、ベクターゲノムが欠如
していると推定される、空のまたはより低い密度のアセンブルされた粒子の相対存在量な
らびに全体的な純度のさらなる決定を可能にした。１つの懸念は、祖先キャプシド配列の
不正確なモデリングが、ゲノムをパッケージングする能力が不十分である構造をもたらし
得、Ａｎｃ８０Ｌ６５調製物における空対完全比が偏る結果となることであった。結果は
、ＡＡＶ８による観察と一致して、調製物中の約８５％の完全粒子に対して約１６％が空
粒子であることを示した（図２０Ｃ）。さらに、祖先キャプシド組成物の次善のモデル化
により粒子の安定性が低下する可能性があると仮定し、粒子を熱安定性アッセイに供する
と、その指示された予測に対して、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、その推定されるＡＡＶ２および
ＡＡＶ８よりも１５～３０℃熱安定性であることが決定された（図２０Ｄ）。
【実施例25】
【0120】
マウスモデルにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５のインビボ遺伝子移入および形質導入
次に、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける３つの臨床的に関連する標的組織および投与経路
（ＲＯＡ）から、送達され、発現されるＡｎｃ８０Ｌ６５パッケージされた導入遺伝子の
能力を評価した：（ａ）全身注射後の肝臓、（ｂ）直接筋肉内注射後の骨格筋、および（
ｃ）網膜外側標的化のための網膜下注射。Ａｎｃ８０Ｌ６５の大規模調製物は、レポータ
ー遺伝子を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８対照と一緒に産生させ、成体雄性Ｃ５７Ｂ１／
６マウスの肝臓、筋肉および網膜指向性遺伝子移入のために等用量で注射した。図２１に
示される発現は、３つの標的組織の全てについて定性的に（ｅＧＦＰおよび／またはＬａ
ｃＺ）モニターされ、様々な時点で分泌されたｈＡ１ＡＴ（肝臓）の血清ＥＬＩＳＡ測定
によって定量的にモニターした。肝臓への遺伝子移入は、２つの投与経路および導入遺伝
子を介して堅牢であることが観察された（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ）。ＡＡＶ８と同様
に、肝細胞は、ＡＡＶ２について許容的に記載される制限（Nakai et al., 2005, J. Vir
ol., 79:214-24; Nakai et al., 2002, J. Virol., 76: 1 1343-9）を超えるＬａｃＺお
よびＧＦＰ染色によって観察されるように効率的に標的化した。定量的に、Ａｎｃ８０は
、細胞内レポーターおよび分泌型血清タンパク質導入遺伝子産物によるＡＡＶ８への形質
導入の同様の効率を実証した。用量範囲決定研究は、１０１０ＧＣ／マウスを上回る用量
での遺伝子移入の線形性を実証したが、ｈＡ１ＡＴについてはある閾値より下では線形性
が維持されない（およびｅＧＦＰによってはあまり明らかではない）（図２１Ｂ、２１Ｃ
）。生体分布試験は、対照としてのＡＡＶ８と共に、Ａｎｃ８０Ｌ６５の肝臓、心臓、脾
臓、腎臓および肺におけるベクターゲノムの組織分布を評価するために、５×１０１１Ｇ
Ｃ／マウスの高用量で注入の７日後および２８日後に行った（表３）。結果は、試験した
組織におけるＡｎｃ８０のＡＡＶ８への遺伝子移入の同様の範囲を示し、脾臓、心臓およ
び肺におけるＡｎｃ８０Ｌ６５について中程度の増加である。直接骨格筋肉内注射により
、Ａｎｃ８０は、注入部位の近位および繊維を縦方向に伸長する筋繊維を効率的に標的化
した（図２１Ａおよび図２４）。網膜下注射後の網膜形質導入は、前述したようにＡＡＶ
２およびＡＡＶ８と同様に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を標的とするのに有効である。ＡＡ
Ｖ２について記載されているように、より難しい細胞標的である光受容体標的化は、ＡＡ
Ｖ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５を用いて観察された。ＡＡＶ８とＡｎｃ８０Ｌ６５の両方が
光受容体細胞の大部分を標的としたが、Ａｎｃ８０Ｌ６５による形質導入は一貫して細胞
あたりより高い発現レベルをもたらす。内網膜の限られた数の細胞はまた、Ａｎｃ８０Ｌ
６５形質導入によってＧＦＰ陽性であることが観察された（図２１Ａ）。
次に、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける３つの臨床的に関連する標的組織および投与経路
（ＲＯＡ）から、送達され、発現されるＡｎｃ８０Ｌ６５パッケージされた導入遺伝子の
能力を評価した：（ａ）全身注射後の肝臓、（ｂ）直接筋肉内注射後の骨格筋、および（
ｃ）網膜外側標的化のための網膜下注射。Ａｎｃ８０Ｌ６５の大規模調製物は、レポータ
ー遺伝子を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８対照と一緒に産生させ、成体雄性Ｃ５７Ｂ１／
６マウスの肝臓、筋肉および網膜指向性遺伝子移入のために等用量で注射した。図２１に
示される発現は、３つの標的組織の全てについて定性的に（ｅＧＦＰおよび／またはＬａ
ｃＺ）モニターされ、様々な時点で分泌されたｈＡ１ＡＴ（肝臓）の血清ＥＬＩＳＡ測定
によって定量的にモニターした。肝臓への遺伝子移入は、２つの投与経路および導入遺伝
子を介して堅牢であることが観察された（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ）。ＡＡＶ８と同様
に、肝細胞は、ＡＡＶ２について許容的に記載される制限（Nakai et al., 2005, J. Vir
ol., 79:214-24; Nakai et al., 2002, J. Virol., 76: 1 1343-9）を超えるＬａｃＺお
よびＧＦＰ染色によって観察されるように効率的に標的化した。定量的に、Ａｎｃ８０は
、細胞内レポーターおよび分泌型血清タンパク質導入遺伝子産物によるＡＡＶ８への形質
導入の同様の効率を実証した。用量範囲決定研究は、１０１０ＧＣ／マウスを上回る用量
での遺伝子移入の線形性を実証したが、ｈＡ１ＡＴについてはある閾値より下では線形性
が維持されない（およびｅＧＦＰによってはあまり明らかではない）（図２１Ｂ、２１Ｃ
）。生体分布試験は、対照としてのＡＡＶ８と共に、Ａｎｃ８０Ｌ６５の肝臓、心臓、脾
臓、腎臓および肺におけるベクターゲノムの組織分布を評価するために、５×１０１１Ｇ
Ｃ／マウスの高用量で注入の７日後および２８日後に行った（表３）。結果は、試験した
組織におけるＡｎｃ８０のＡＡＶ８への遺伝子移入の同様の範囲を示し、脾臓、心臓およ
び肺におけるＡｎｃ８０Ｌ６５について中程度の増加である。直接骨格筋肉内注射により
、Ａｎｃ８０は、注入部位の近位および繊維を縦方向に伸長する筋繊維を効率的に標的化
した（図２１Ａおよび図２４）。網膜下注射後の網膜形質導入は、前述したようにＡＡＶ
２およびＡＡＶ８と同様に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を標的とするのに有効である。ＡＡ
Ｖ２について記載されているように、より難しい細胞標的である光受容体標的化は、ＡＡ
Ｖ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５を用いて観察された。ＡＡＶ８とＡｎｃ８０Ｌ６５の両方が
光受容体細胞の大部分を標的としたが、Ａｎｃ８０Ｌ６５による形質導入は一貫して細胞
あたりより高い発現レベルをもたらす。内網膜の限られた数の細胞はまた、Ａｎｃ８０Ｌ
６５形質導入によってＧＦＰ陽性であることが観察された（図２１Ａ）。
【0121】
【表3】
【実施例26】
【0122】
非ヒト霊長類肝臓におけるＡｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入および発現
マウスにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の強力な肝向性を考慮すると、大型動物モデルにおけ
るＡｎｃ８０Ｌ６５の遺伝子移入を評価することが目的であった。ＡＡＶと無関係の先行
研究に登録された６匹の雌アカゲザルに、伏在静脈からＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５
のいずれかを臨床的に関連する用量１０１２ＧＣ／ｋｇで注射した（表４）。ｒｈＣＧレ
ポーターを使用して、絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアカゲザルｃＤＮＡを発
現させた。この絨毛性ゴナドトロピンは、非自己導入遺伝子免疫応答を回避するために動
物を寛容化する導入遺伝子産物である。この実験に登録された動物は、ＡＡＶ８およびＡ
ｎｃ８０Ｌ６５へのＮＡＢについて予めスクリーニングされた。注射の数週間前のＮＡＢ
血清レベルは、この研究に登録するのに１／４力価以下であった。遺伝子移入は、注射後
の７０～７１日間に全肝臓ＤＮＡ（尾状葉）のｖｇについてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによ
って評価された（図２１Ｄ）。驚くべきことに、対照ＡＡＶ８を注射した３匹の動物のう
ち２匹は、おそらく以前の研究で報告された標準的なＮＡＢアッセイによっては検出され
なかった注射時の低レベルＮＡＢのために、圧倒的な遺伝子移入（＜０．１ｖｇ／ｄｇ）
を示した。おそらくＡＡＶ８に対するＮＡＢがないかまたは最小のＮＡＢを有する１匹の
ＡＡＶ８動物は、期待される０．８１ｖｇ／ｄｇの範囲内の肝臓に対する遺伝子移入レベ
ルを実証した。Ａｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入は、明らかにＮＡＢによって阻害されず（Ａ
ｎｃ８０Ｌ６５ ＮＡＢは注射前に検出しなかった）、３匹の動物は０．７３～３．５６
ｖｇ／ｄｇの範囲の肝臓導入遺伝子のコピー数を生じた。肝臓発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲ
によってモニターした（図２１Ｅ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、ＡＡＶ８よりも優れた発現を
もたらし、全ての肝臓葉において全ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の１３～２６％のｒｈＣＧ転
写産物レベルを達成した。
マウスにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の強力な肝向性を考慮すると、大型動物モデルにおけ
るＡｎｃ８０Ｌ６５の遺伝子移入を評価することが目的であった。ＡＡＶと無関係の先行
研究に登録された６匹の雌アカゲザルに、伏在静脈からＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５
のいずれかを臨床的に関連する用量１０１２ＧＣ／ｋｇで注射した（表４）。ｒｈＣＧレ
ポーターを使用して、絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアカゲザルｃＤＮＡを発
現させた。この絨毛性ゴナドトロピンは、非自己導入遺伝子免疫応答を回避するために動
物を寛容化する導入遺伝子産物である。この実験に登録された動物は、ＡＡＶ８およびＡ
ｎｃ８０Ｌ６５へのＮＡＢについて予めスクリーニングされた。注射の数週間前のＮＡＢ
血清レベルは、この研究に登録するのに１／４力価以下であった。遺伝子移入は、注射後
の７０～７１日間に全肝臓ＤＮＡ（尾状葉）のｖｇについてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによ
って評価された（図２１Ｄ）。驚くべきことに、対照ＡＡＶ８を注射した３匹の動物のう
ち２匹は、おそらく以前の研究で報告された標準的なＮＡＢアッセイによっては検出され
なかった注射時の低レベルＮＡＢのために、圧倒的な遺伝子移入（＜０．１ｖｇ／ｄｇ）
を示した。おそらくＡＡＶ８に対するＮＡＢがないかまたは最小のＮＡＢを有する１匹の
ＡＡＶ８動物は、期待される０．８１ｖｇ／ｄｇの範囲内の肝臓に対する遺伝子移入レベ
ルを実証した。Ａｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入は、明らかにＮＡＢによって阻害されず（Ａ
ｎｃ８０Ｌ６５ ＮＡＢは注射前に検出しなかった）、３匹の動物は０．７３～３．５６
ｖｇ／ｄｇの範囲の肝臓導入遺伝子のコピー数を生じた。肝臓発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲ
によってモニターした（図２１Ｅ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、ＡＡＶ８よりも優れた発現を
もたらし、全ての肝臓葉において全ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の１３～２６％のｒｈＣＧ転
写産物レベルを達成した。
【0123】
【表4】
【実施例27】
【0124】
Ａｎｃ８０Ｌ６５の安全性、免疫学および毒性
治療的適用のための効率的な遺伝子送達ベクターシステムを使用することの検討は、臨
床使用に関してその安全性の広範な評価を必要とする。さらに、ディペンドパルボウイル
スの祖先状態に近似し得る新規な薬剤の使用は、それらの懸念をさらに高め得る。ここで
は、非公式な臨床前の状況において、Ａｎｃ８０Ｌ６５を安全性の観点から制限する可能
性があるいくつかの重要な側面を検討した。動物の発現研究（図２１）は、研究の生存段
階の間、および標的組織特異的毒性について可能な限り、毒性の明白な徴候についてモニ
ターした。ベクター注入と関連した顕著な逆行は見られなかった。簡単には、腹腔内（最
大用量試験［ｍｄｔ］：３．９×１０１０ＧＣ／マウス）、眼窩後静脈注射（ｍｄｔ：５
×１０１１ＧＣ／マウス）、網膜下（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、硝子体内（ｍｄｔ
：２×１０９ＧＣ／眼）、および直接筋肉内（１０１０ＧＣ／マウス）によるベクター投
与は明白な毒性を示さなかった。より直接的な評価は、以下の対照と一緒に、５×１０１
１ＧＣ／マウス（約２×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡｎｃ８０Ｌ６５．ＴＢＧ．ｅＧＦＰの
高用量静脈内注射で行われた：（ａ）同じ導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ８、および
（ｂ）等容量の生理食塩水注射。注射前、注射の２時間後、１日後、３日後、７日後、１
４日後および２８日後にマウスを静脈切開し、血液を細胞血液計数（ＣＢＣ）および血清
化学（Ｃｈｅｍ）について分析した（表５および６）。これはＡｎｃ８０Ｌ６５の対照範
囲内または同等であり、したがって重大な懸念は生じなかった。２時間、２４時間、３日
および７日の時点からの血清は、多重２３サイトカイン分析によってベクター抗原に対す
る自然免疫応答の尺度としてサイトカインについてさらに評価した（表７）。Ａｎｃ８０
Ｌ６５のサイトカインは、生理食塩水およびＡＡＶ８対照血清に対するものと全体的に一
致しており、主要なサイトカインの上昇または低下は観察されなかったが、しかしながら
、いくつかの場合において、ＡＡＶ８よりもＡｎｃ８０Ｌ６５についてより明らかな形で
生理食塩水対照値によって設定された範囲のやや外にあった。図２１Ｄおよび２１Ｅに記
載されたアカゲザルの研究からの血液について同様の分析を行った。マウス研究と同様に
、得られたＣＢＣおよびＣｈｅｍ値から、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５試験品に関す
る毒性の徴候は同定されなかった（表８および９）。
治療的適用のための効率的な遺伝子送達ベクターシステムを使用することの検討は、臨
床使用に関してその安全性の広範な評価を必要とする。さらに、ディペンドパルボウイル
スの祖先状態に近似し得る新規な薬剤の使用は、それらの懸念をさらに高め得る。ここで
は、非公式な臨床前の状況において、Ａｎｃ８０Ｌ６５を安全性の観点から制限する可能
性があるいくつかの重要な側面を検討した。動物の発現研究（図２１）は、研究の生存段
階の間、および標的組織特異的毒性について可能な限り、毒性の明白な徴候についてモニ
ターした。ベクター注入と関連した顕著な逆行は見られなかった。簡単には、腹腔内（最
大用量試験［ｍｄｔ］：３．９×１０１０ＧＣ／マウス）、眼窩後静脈注射（ｍｄｔ：５
×１０１１ＧＣ／マウス）、網膜下（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、硝子体内（ｍｄｔ
：２×１０９ＧＣ／眼）、および直接筋肉内（１０１０ＧＣ／マウス）によるベクター投
与は明白な毒性を示さなかった。より直接的な評価は、以下の対照と一緒に、５×１０１
１ＧＣ／マウス（約２×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡｎｃ８０Ｌ６５．ＴＢＧ．ｅＧＦＰの
高用量静脈内注射で行われた：（ａ）同じ導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ８、および
（ｂ）等容量の生理食塩水注射。注射前、注射の２時間後、１日後、３日後、７日後、１
４日後および２８日後にマウスを静脈切開し、血液を細胞血液計数（ＣＢＣ）および血清
化学（Ｃｈｅｍ）について分析した（表５および６）。これはＡｎｃ８０Ｌ６５の対照範
囲内または同等であり、したがって重大な懸念は生じなかった。２時間、２４時間、３日
および７日の時点からの血清は、多重２３サイトカイン分析によってベクター抗原に対す
る自然免疫応答の尺度としてサイトカインについてさらに評価した（表７）。Ａｎｃ８０
Ｌ６５のサイトカインは、生理食塩水およびＡＡＶ８対照血清に対するものと全体的に一
致しており、主要なサイトカインの上昇または低下は観察されなかったが、しかしながら
、いくつかの場合において、ＡＡＶ８よりもＡｎｃ８０Ｌ６５についてより明らかな形で
生理食塩水対照値によって設定された範囲のやや外にあった。図２１Ｄおよび２１Ｅに記
載されたアカゲザルの研究からの血液について同様の分析を行った。マウス研究と同様に
、得られたＣＢＣおよびＣｈｅｍ値から、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５試験品に関す
る毒性の徴候は同定されなかった（表８および９）。
【0125】
ＡＡＶ血清型に対する既存の免疫は遺伝子移入を遮断することが知られており、一次感
染に関与する天然に存在する野生型ウイルスと共有されるベクター抗原に対する記憶Ｔ細
胞のリコールにより有害な状況が生じるリスクに患者を曝す可能性がある。ＡＡＶ血清型
１、２、５、６．２、８、９およびｒｈ．３２．３３に対して産生された高力価ウサギ抗
血清を使用したが、ｒｈ．１０はまた含まれ、これは、その配列がＡｎｃ８０Ｌ６５と最
も相同であり、８．０％の残基が異なるためである。図２２Ａにおいて、血清は、Ａｎｃ
８０Ｌ６５に対して生じた同種のベクターキャプシドに対するＡｎｃ８０Ｌ６５を中和す
る血清の能力について血清を試験した。結果は、ＡＡＶ５およびｒｈ．３２．３３、構造
的に高い多様性のＡＡＶに対する交差反応性を示さなかったが、一方、ＡＡＶ２、６．２
および８は、Ａｎｃ８０Ｌ６５の子孫であると推定され、相同性の抗血清力価よりも１６
倍またはそれより低いレベルであるにもかかわらず、低レベルの交差反応性を実証した。
Ａｎｃ８０系統のメンバーの中で、ＡＡＶ９およびｒｈ．１０の感度の限界を超える交差
反応は観察されなかった。次に、筋肉内経路を介してＡＡＶ８の動物を前免疫し、免疫化
の２５日後にＡＡＶ８と比較して静脈注射後のＡｎｃ８０Ｌ６５の中和を評価することに
より、中和に関してインビボモデルにおいてこれらの結果を検証することが目的であった
（図２２Ｂ）。中和は、ＡＡＶ８前免疫動物におけるＡＡＶ８について完了した。Ａｎｃ
８０Ｌ６５は、５匹のうち２匹の動物において中和されたが、５匹のうち３匹の動物にお
いては、これらの動物におけるＡＡＶ８ ＮＡＢの実証にもかかわらず、形質導入の６０
～１１７％を示した。これらの結果は、ウサギおよびマウスにおけるＡＡＶ８とのＡｎｃ
８０Ｌ６５の部分的交差反応性を実証する。
染に関与する天然に存在する野生型ウイルスと共有されるベクター抗原に対する記憶Ｔ細
胞のリコールにより有害な状況が生じるリスクに患者を曝す可能性がある。ＡＡＶ血清型
１、２、５、６．２、８、９およびｒｈ．３２．３３に対して産生された高力価ウサギ抗
血清を使用したが、ｒｈ．１０はまた含まれ、これは、その配列がＡｎｃ８０Ｌ６５と最
も相同であり、８．０％の残基が異なるためである。図２２Ａにおいて、血清は、Ａｎｃ
８０Ｌ６５に対して生じた同種のベクターキャプシドに対するＡｎｃ８０Ｌ６５を中和す
る血清の能力について血清を試験した。結果は、ＡＡＶ５およびｒｈ．３２．３３、構造
的に高い多様性のＡＡＶに対する交差反応性を示さなかったが、一方、ＡＡＶ２、６．２
および８は、Ａｎｃ８０Ｌ６５の子孫であると推定され、相同性の抗血清力価よりも１６
倍またはそれより低いレベルであるにもかかわらず、低レベルの交差反応性を実証した。
Ａｎｃ８０系統のメンバーの中で、ＡＡＶ９およびｒｈ．１０の感度の限界を超える交差
反応は観察されなかった。次に、筋肉内経路を介してＡＡＶ８の動物を前免疫し、免疫化
の２５日後にＡＡＶ８と比較して静脈注射後のＡｎｃ８０Ｌ６５の中和を評価することに
より、中和に関してインビボモデルにおいてこれらの結果を検証することが目的であった
（図２２Ｂ）。中和は、ＡＡＶ８前免疫動物におけるＡＡＶ８について完了した。Ａｎｃ
８０Ｌ６５は、５匹のうち２匹の動物において中和されたが、５匹のうち３匹の動物にお
いては、これらの動物におけるＡＡＶ８ ＮＡＢの実証にもかかわらず、形質導入の６０
～１１７％を示した。これらの結果は、ウサギおよびマウスにおけるＡＡＶ８とのＡｎｃ
８０Ｌ６５の部分的交差反応性を実証する。
【実施例28】
【0126】
ＡＡＶの系統分析および再構築
ＡＳＲに基づくＡｎｃ８０Ｌ６５の合成が成功し、遺伝子療法のための生産性が高く、
安定した感染力剤としてのその証拠によって強化されたが、ＡＡＶの系統をさらに再構築
することによって、アプローチおよびモデリング方法論のさらなる検証を提供することが
目的であった。この追加セットの試薬を生成することの野望は、このウイルスファミリー
内の構造－機能関係の実験的評価を可能にし、将来のＡＡＶの合理的設計アプローチに有
益な重要なエピスタシスカップリングを強調する、Ａｎｃ８０および現存のＡＡＶの構造
中間体を提供することであった。ＡＡＶの合計８つの追加の進化中間体をＡＳＲによって
再構成し、実験室で合成した（図１８）：Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ
８４、Ａｎｃ１１０およびＡｎｃ１１３は、ＡＡＶ７、８および／または９に向かう分岐
において分離され、一方、Ａｎｃ１２６およびＡｎｃ１２７は、ＡＡＶ１、２および／ま
たは３の自然の経歴中に位置付けられる。これらの各々について、位置あたりの事後確率
が最も高いアミノ酸を選択することによって配列を決定した。最初に、ＧＣウイルスベク
ター収率は、ベクター成分についてのＨＥＫ２９３標準三重トランスフェクション、およ
びベクターゲノムについてのＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いたアデノウイルスヘルプにお
いて決定した。図２３Ａに示される結果は、ＡＡＶ８などの血清型のより高い産生収率に
一致して、ＡＡＶ７－９系統における推定上の祖先としてのＡｎｃ－８０からの生産性の
増加を実証する。ＡＡＶ１－３分枝は、収率の増加を示さず、Ａｎｃ１２６については非
常に乏しい粒子収率が観察された。Ａｎｃ８０と同様に、統計的空間を活用することでＡ
ｎｃ１２６収率を改善し得ることが可能であるが、しかしながら、ＡＡＶ系統発生のこの
分岐のアンダーサンプリングのためにＡｎｃ１２６ ＡＳＲについては情報が少ない可能
性も同等にある。等しい粒子用量での産生粒子の感染力は、ＧＦＰおよびルシフェラーゼ
によるＨＥＫ２９３においてインビトロでさらに試験した。しかしながら、新しく合成さ
れた全てのＡｎｃベクターは、様々な程度で感染力を示した（図２３Ｂ）。ＡＡＶ７－９
系統において、感染力価は全体的に低下し、Ａｎｃ８０のものよりもＡＡＶ８表現型によ
り類似していた。等量で試験することができるＡｎｃ８０からＡＡＶ２系統の唯一の中間
体であるＡｎｃ１２７は、Ａｎｃ８０とＡＡＶ２の両方と比較して形質導入効率が低下し
ていることを実証した。この系列の両方の分岐において選択された進化中間体の熱安定性
プロファイルをさらに試験した（図２３Ｃ）。興味深いことに、Ａｎｃ８１およびＡｎｃ
８２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較して熱安定性アッセイでは高いが、中程度に低下した融
解温度を示し、これは、おそらくこの分岐における進化年齢と共に熱安定性が徐々に減少
することを示唆している。対照的に、Ａｎｃ１２７は、既に非常に熱安定性の高いＡｎｃ
８０Ｌ６５ベクターからのさらなる増加を実証した。
ＡＳＲに基づくＡｎｃ８０Ｌ６５の合成が成功し、遺伝子療法のための生産性が高く、
安定した感染力剤としてのその証拠によって強化されたが、ＡＡＶの系統をさらに再構築
することによって、アプローチおよびモデリング方法論のさらなる検証を提供することが
目的であった。この追加セットの試薬を生成することの野望は、このウイルスファミリー
内の構造－機能関係の実験的評価を可能にし、将来のＡＡＶの合理的設計アプローチに有
益な重要なエピスタシスカップリングを強調する、Ａｎｃ８０および現存のＡＡＶの構造
中間体を提供することであった。ＡＡＶの合計８つの追加の進化中間体をＡＳＲによって
再構成し、実験室で合成した（図１８）：Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ
８４、Ａｎｃ１１０およびＡｎｃ１１３は、ＡＡＶ７、８および／または９に向かう分岐
において分離され、一方、Ａｎｃ１２６およびＡｎｃ１２７は、ＡＡＶ１、２および／ま
たは３の自然の経歴中に位置付けられる。これらの各々について、位置あたりの事後確率
が最も高いアミノ酸を選択することによって配列を決定した。最初に、ＧＣウイルスベク
ター収率は、ベクター成分についてのＨＥＫ２９３標準三重トランスフェクション、およ
びベクターゲノムについてのＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いたアデノウイルスヘルプにお
いて決定した。図２３Ａに示される結果は、ＡＡＶ８などの血清型のより高い産生収率に
一致して、ＡＡＶ７－９系統における推定上の祖先としてのＡｎｃ－８０からの生産性の
増加を実証する。ＡＡＶ１－３分枝は、収率の増加を示さず、Ａｎｃ１２６については非
常に乏しい粒子収率が観察された。Ａｎｃ８０と同様に、統計的空間を活用することでＡ
ｎｃ１２６収率を改善し得ることが可能であるが、しかしながら、ＡＡＶ系統発生のこの
分岐のアンダーサンプリングのためにＡｎｃ１２６ ＡＳＲについては情報が少ない可能
性も同等にある。等しい粒子用量での産生粒子の感染力は、ＧＦＰおよびルシフェラーゼ
によるＨＥＫ２９３においてインビトロでさらに試験した。しかしながら、新しく合成さ
れた全てのＡｎｃベクターは、様々な程度で感染力を示した（図２３Ｂ）。ＡＡＶ７－９
系統において、感染力価は全体的に低下し、Ａｎｃ８０のものよりもＡＡＶ８表現型によ
り類似していた。等量で試験することができるＡｎｃ８０からＡＡＶ２系統の唯一の中間
体であるＡｎｃ１２７は、Ａｎｃ８０とＡＡＶ２の両方と比較して形質導入効率が低下し
ていることを実証した。この系列の両方の分岐において選択された進化中間体の熱安定性
プロファイルをさらに試験した（図２３Ｃ）。興味深いことに、Ａｎｃ８１およびＡｎｃ
８２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較して熱安定性アッセイでは高いが、中程度に低下した融
解温度を示し、これは、おそらくこの分岐における進化年齢と共に熱安定性が徐々に減少
することを示唆している。対照的に、Ａｎｃ１２７は、既に非常に熱安定性の高いＡｎｃ
８０Ｌ６５ベクターからのさらなる増加を実証した。
【0127】
最後に、既知のエピトープをＡＡＶ２に破壊するＡＳＲの能力が探究した。ほんの僅か
なＢ細胞またはＴ細胞エピトープだけがこれまでにＡＡＶ２上にマッピングされ、その全
ては、ＡＡＶ２系統に相当するＡｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡ
ＡＶ２上にマッピングされた。これらの推定上の進化中間体間の順次変異の導入は、図２
２Ｃにおいて、突然変異と２／４ヒトＴ細胞エピトープと２／２マウスＢ細胞エピトープ
の間の重複を強調する。これらのデータは、ＡＳＲがＡＡＶキャプシド上の抗原性領域を
排除または調節する方法として使用される可能性を強調し、免疫がＡＡＶの自然の経歴に
おける主要な選択的圧力であったことを示唆し得る。
なＢ細胞またはＴ細胞エピトープだけがこれまでにＡＡＶ２上にマッピングされ、その全
ては、ＡＡＶ２系統に相当するＡｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡ
ＡＶ２上にマッピングされた。これらの推定上の進化中間体間の順次変異の導入は、図２
２Ｃにおいて、突然変異と２／４ヒトＴ細胞エピトープと２／２マウスＢ細胞エピトープ
の間の重複を強調する。これらのデータは、ＡＳＲがＡＡＶキャプシド上の抗原性領域を
排除または調節する方法として使用される可能性を強調し、免疫がＡＡＶの自然の経歴に
おける主要な選択的圧力であったことを示唆し得る。
【実施例29】
【0128】
Ａｎｃ１１０のインビボ機能性
Ｃ５７Ｂ１／６マウスのＡＡＶ９と比較して、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２お
よびＡｎｃ１１０によるルシフェラーゼの肝臓形質導入を評価するための実験を行った。
図２７の結果は、指示されたベクターの静脈注射後、Ａｎｃ１１０が、ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子の導入遺伝子発現に基づいて、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＡＡＶ９と
同等レベルの肝臓標的化を示したことを実証する。特に、ＡＡＶ９は、現在臨床研究中で
ある。
Ｃ５７Ｂ１／６マウスのＡＡＶ９と比較して、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２お
よびＡｎｃ１１０によるルシフェラーゼの肝臓形質導入を評価するための実験を行った。
図２７の結果は、指示されたベクターの静脈注射後、Ａｎｃ１１０が、ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子の導入遺伝子発現に基づいて、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＡＡＶ９と
同等レベルの肝臓標的化を示したことを実証する。特に、ＡＡＶ９は、現在臨床研究中で
ある。
【0129】
【表5】
【0130】
【表6】
【0131】
【表7】
【0132】
【表8】
【0133】
【表9】
【0134】
他の態様
対象の方法および組成物は、多数の異なる態様と併せて本明細書に記載されるが、様々
な態様の前述の記載は、説明することを意図しており、対象の方法および組成物の範囲を
限定しないことを理解するべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の
範囲の範囲内である。
対象の方法および組成物は、多数の異なる態様と併せて本明細書に記載されるが、様々
な態様の前述の記載は、説明することを意図しており、対象の方法および組成物の範囲を
限定しないことを理解するべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の
範囲の範囲内である。
【0135】
開示された方法および組成物に使用できるか、それと組み合わせて使用できるか、その調製に使用できるか、またはその生成物である方法および組成物が開示される。これらの物質および他の物質は、本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されていると理解される。すなわち、様々な個々のおよび集合的な組合せならびにこれらの組成物の並べ替えについての具体的な言及は明示的に記載されていない場合もあるが、それぞれは本明細書において具体的に意図され、記載される。例えば、対象の特定の組成物または特定の方法が開示され、検討され、多数の組成物または方法が検討される場合、組成物および方法のそれぞれおよび全ての組合せおよび並び替えは、具体的な記載に反しない限り、具体的に意図される。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組合せもまた、特に意図され、開示される。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
２．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
３．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
４．精製されている、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
５．配列番号４３に示される核酸配列によってコードされる、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
６．配列番号４３に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子。
７．上記６に記載の核酸分子を含むベクター。
８．上記７に記載のベクターを含む宿主細胞。
９．上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子。
１０．導入遺伝子をさらに含む、上記９に記載の精製されたウイルス粒子。
１１．導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種する方法であって、上記１０に記載のウイルス粒子を、遺伝子移入またはワクチン接種を必要とする対象に投与することを含み、前記ウイルス粒子はＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、方法。
１２．前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１１に記載の方法。
１３．対象にワクチン接種する方法であって、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を、ワクチン接種を必要とする対象に投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、方法。
１４．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１３に記載の方法。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
２．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
３．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
４．精製されている、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
５．配列番号４３に示される核酸配列によってコードされる、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
６．配列番号４３に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子。
７．上記６に記載の核酸分子を含むベクター。
８．上記７に記載のベクターを含む宿主細胞。
９．上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子。
１０．導入遺伝子をさらに含む、上記９に記載の精製されたウイルス粒子。
１１．導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種する方法であって、上記１０に記載のウイルス粒子を、遺伝子移入またはワクチン接種を必要とする対象に投与することを含み、前記ウイルス粒子はＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、方法。
１２．前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１１に記載の方法。
１３．対象にワクチン接種する方法であって、上記１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を、ワクチン接種を必要とする対象に投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、方法。
１４．前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、上記１３に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図25-3】
【図25-4】
【図26】
【図27】
【配列表】