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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-13
(45)【発行日】2023-02-21
(54)【発明の名称】生体適合性ポリマー組成物及びその用途
(51)【国際特許分類】
C08L 39/00 20060101AFI20230214BHJP
C08K 5/19 20060101ALI20230214BHJP
C08F 8/06 20060101ALI20230214BHJP
C08F 20/34 20060101ALI20230214BHJP
C08F 20/36 20060101ALI20230214BHJP
C08F 26/06 20060101ALI20230214BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230214BHJP
【ＦＩ】
C08L39/00
C08K5/19
C08F8/06
C08F20/34
C08F20/36
C08F26/06
C12N1/00 G
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022135524
(22)【出願日】2022-08-29
【審査請求日】2022-09-09
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000222118
【氏名又は名称】東洋インキＳＣホールディングス株式会社
(72)【発明者】
【氏名】荻原 直人
(72)【発明者】
【氏名】金井 勇樹
(72)【発明者】
【氏名】田尾 文哉
(72)【発明者】
【氏名】馬場 航希
(72)【発明者】
【氏名】高橋 洸洋
【審査官】吉田 早希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０１０１４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００６－５１３２７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－３１０９１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－２３８３２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０４１４７８５１（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｋ ３／００ － １３／０８
Ｃ０８Ｌ １／００ － １０１／１４
Ｃ０８Ｃ １９／００ － １９／４４
Ｃ０８Ｆ ６／００ － ２４６／００
Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）（ただし、界面活性剤及びモノマーを除く）、並びに水を含み、前記ビニル系ポリマー（Ａ）１００部に対して、前記化合物（Ｂ）の割合が、０．５～１０部であり、前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、下記一般式１～３で示される少なくともいずれかの構造を有し、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍである、生体適合性ポリマー組成物。【化1】
【化2】
【化3】
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ１は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ４は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ５～Ｒ９のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ５～Ｒ９のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表し、
＊はビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表す。］
【請求項2】
１％水溶液での浸透圧が１～２０ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１に記載の生体適合性ポリマー組成物。
【請求項3】
化合物（Ｂ）が、下記一般式４～９で示される少なくともいずれかの構造を有する、請求項１又は２に記載の生体適合性ポリマー組成物。一般式４
【化4】
一般式５
【化5】
一般式６
【化6】
一般式７
【化7】
一般式８
【化8】
一般式９
【化9】
［一般式４～９中、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３はそれぞれ独立して炭素数１～５のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を表す。Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のいずれか２つが連結し、環を形成してもよい。
Ｒ１４は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｚは－ＣＯＯ－又はＳＯ ３ －、
Ｒ１５は水素原子又はメチル基、
Ｒ１６は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｒ１７～Ｒ２１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、
Ｒ２２は炭素数１～４のアルキレン基を表す。）
【請求項4】
請求項１又は２に記載の生体適合性ポリマー組成物を含む、タンパク質安定化剤。
【請求項5】
請求項４記載のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることを特徴とする、タンパク質の安定化方法。
【請求項6】
請求項１又は２に記載の生体適合性ポリマー組成物を含む、ブロッキング剤。
【請求項7】
請求項６記載のブロッキング剤を用いた、体外診断による検体中の標的物質の検出方法。
【請求項8】
請求項１又は２に記載の生体適合性ポリマー組成物を含む、細胞培養培地添加剤。
【請求項9】
請求項８記載の細胞培養培地添加剤を含む、細胞培養培地。
【請求項10】
細胞培養培地における前記生体適合性ポリマー組成物の濃度が０．０１質量％以上１質量％以下である、請求項９に記載の細胞培養培地。
【請求項11】
請求項９に記載の細胞培養培地で細胞を培養することを特徴とする、細胞凝集塊又は生理活性物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体適合性ポリマー組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質はポリペプチド鎖内のファンデルワールス相互作用、水素結合、静電的相互作用などの非共有結合性の弱い極性相互作用によって高次構造が維持されており、このような高次構造により様々な機能が発現されている。これらの結合は外的なさまざまな要因（温度、ｐＨ、塩濃度、タンパク質自身の濃度、界面活性剤、変性剤、二価金属、プロテアーゼの共存）によって変化し、場合によってはタンパク質の構造が壊れて本来の機能が失われた状態となる。そのためタンパク質の安定性は機能的な高次構造を維持する能力と言い換えることができる。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる必要があり、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存するなど保管条件の最適化や、安定化剤（アルブミンなど他のタンパク質、グリセロース・ポリエチレングリコール・スクロースなどの多価アルコール、グルタミン酸・リジンなどのアミノ酸、グルタチオン・ジチオトレイトールなどの還元剤、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤、クエン酸などの有機酸塩、重金属塩、基質、補酵素）を単独又は併用しての使用が検討されている（非特許文献１）。特に合成化合物の安定化剤としては、例えば、特許文献１にはホスホリルコリン基を有する重合体、特許文献２にはポリエチレングリコール部位を有する高分子化合物、特許文献３には低分子アミンオキシド化合物、特許文献４には低分子スルホベタイン化合物を使用する方法が開示されている。また、特許文献５には高分子アミンオキシド化合物を使用する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる必要があり、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存するなど保管条件の最適化や、安定化剤（アルブミンなど他のタンパク質、グリセロース・ポリエチレングリコール・スクロースなどの多価アルコール、グルタミン酸・リジンなどのアミノ酸、グルタチオン・ジチオトレイトールなどの還元剤、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤、クエン酸などの有機酸塩、重金属塩、基質、補酵素）を単独又は併用しての使用が検討されている（非特許文献１）。特に合成化合物の安定化剤としては、例えば、特許文献１にはホスホリルコリン基を有する重合体、特許文献２にはポリエチレングリコール部位を有する高分子化合物、特許文献３には低分子アミンオキシド化合物、特許文献４には低分子スルホベタイン化合物を使用する方法が開示されている。また、特許文献５には高分子アミンオキシド化合物を使用する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
【0003】
バイオアッセイでは、抗原抗体反応による特異吸着を利用し、ＤＮＡやタンパク質を検出し可視化する方法が、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等として広く知られている。抗体は、標的タンパク質以外とも非特異的な吸着反応を起こす。このような非特異的吸着を防ぐために、検出・測定対象表面を、非特異的な吸着は防ぐが特異的吸着は妨げないように、ブロッキング剤を覆うような前処理が行われる。
ブロッキング剤としては、例えば、特許文献６、非特許文献２には正常血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルクのような生体由来のタンパク質が開示されている。
また、特許文献７、８、９には、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども開示されている。また、特許文献１０、非特許文献３にはホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体、特許文献５には高分子アミンオキシド化合物を使用する方法が開示されている。しかし、特許文献６や非特許文献２に開示されるような生体由来のタンパク質は、性能にばらつきが生じやすいという潜在的な課題を有している。更に、特許文献５，７，８，９，１０に開示されるような化合物は、抗原抗体反応の増感効果という観点では満足できるものではなく、さらなる改良が求められている。また、特許文献１０に開示される共重合体は、原料のモノマー合成時に複数の反応やそれに伴う精製が必要であるなど生産性に問題を有していた。
ブロッキング剤としては、例えば、特許文献６、非特許文献２には正常血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルクのような生体由来のタンパク質が開示されている。
また、特許文献７、８、９には、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども開示されている。また、特許文献１０、非特許文献３にはホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体、特許文献５には高分子アミンオキシド化合物を使用する方法が開示されている。しかし、特許文献６や非特許文献２に開示されるような生体由来のタンパク質は、性能にばらつきが生じやすいという潜在的な課題を有している。更に、特許文献５，７，８，９，１０に開示されるような化合物は、抗原抗体反応の増感効果という観点では満足できるものではなく、さらなる改良が求められている。また、特許文献１０に開示される共重合体は、原料のモノマー合成時に複数の反応やそれに伴う精製が必要であるなど生産性に問題を有していた。
【0004】
動物細胞の細胞培養では、大量培養することにより、モノクローナル抗体をはじめ有用な生理活性物質（ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ビタミンやミネラル、酵素、核酸など）を工業的に量産することが多くなってきている。その際には増殖因子として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清が頻繁に使用される。具体的にはＲＰＭ１１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１２などの合成基礎培地に１０～２０％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられる。しかしながら、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清は、その供給に制限があり、一般的に高価なものである。これにより、培地のコスト上昇を招き、生理活性物質の製造コストの上昇へとつながる。また、血清由来のタンパク質を含む培養液から目的とする生理活性物質を単離することが困難になる欠点にもつながる。更に、血清にはロット間に品質のばらつきがみられる。そこで血清の使用に先立ってロットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要する。それに加え、動物由来の血清に関しては、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳、更にはクロイツフェルト・ヤコブ病といったプリオン関連の疾患に関する問題点の他、動物由来の血清はオートクレーブなどで滅菌できないため、ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があり、感染症などのリスク（安全性面）の問題が生じる。このような問題を解決すべく、血清を用いない培地（無血清培地）の検討が行われてきた。例えば、特許文献１１には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献１２には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献１３には、疎水性Ｄ－アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。しかし、このような培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性及び抗体生産性の面でさらなる改良が求められている。更に血清代替物も天然物由来のものが多く、供給制限があり、一般的に高価である。以上のことから、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に代わる血清代替物の開発が期待されている。特許文献５には、高分子アミンオキシド化合物を有する培地で細胞培養した場合に、細胞凝集塊の形成が良好であったり、抗体産生細胞の増殖性、生存性が高くなったりすることが開示されているが、上記抗体産生細胞の性能に改善の余地がある上に、泡立ちによるハンドリング性悪化の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開平１０－４５７９４号公報
【文献】特開平１０－２３７０９４号公報
【文献】特表２００７－５０９１６４号公報
【文献】特表２００７－５１６２８１号公報
【文献】特開２０２０－３８０５９号公報
【文献】国際公開第２０１６／０５２６９０号
【文献】特開２００４－２１９１１１号公報
【文献】特開平０４－０１９５６１号公報
【文献】特開２００８－２０９１１４号公報
【文献】特開平０７－０８３９２３号公報
【文献】特開平７－２３７８０号公報
【文献】特開平４－３０４８８２号公報
【文献】特開２０１５－０２７２６５号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ 分離・精製・性質 １６章
【文献】「渡辺・中根 酵素抗体法」学際企画株式会社刊 ２００２年
【文献】高分子論文集 第３５巻 ７号 ４２３（１９７８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、タンパク質安定化能に優れたタンパク質安定化剤、増感効果に優れたブロッキング剤、並びに、抗体生産性及び細胞活性に優れた抗体産生細胞を培養能な細胞培養培地添加剤となる、ハンドリング性に優れた生体適合性ポリマー組成物を提供することにある。
及び更に
及び更に
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明は以下の〔１〕～〔１４〕に関する。
〔１〕アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍである、生体適合性ポリマー組成物。
〔２〕１％水溶液での浸透圧が１～２０ｍＯｓｍ／ｋｇである、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔３〕更に、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）（ただし、界面活性剤及びモノマーを除く）を含む、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔４〕ビニル系ポリマー（Ａ）１００部に対して、化合物（Ｂ）の割合が、０．５～１０部である、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔５〕アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）が、下記一般式１～３で示される少なくともいずれかの構造を有する、上記の生体適合性ポリマー組成物。
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ１は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ４は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ５～Ｒ９のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ５～Ｒ９のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表し、＊はビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表す。］
〔６〕化合物（Ｂ）が、下記一般式４～９で示される少なくともいずれかの構造を有する、上記の生体適合性ポリマー組成物。
一般式４
一般式５
一般式６
一般式７
一般式８
一般式９
［一般式４～９中、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３はそれぞれ独立して炭素数１～５のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を表す。Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のいずれか２つが連結し、環を形成してもよい。
Ｒ１４は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｚは－ＣＯＯ－又はＳＯ３－、
Ｒ１５は水素原子又はメチル基、
Ｒ１６は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｒ１７～Ｒ２１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、
Ｒ２２は炭素数１～４のアルキレン基を表す。）
〔７〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、タンパク質安定化剤。
〔８〕上記のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることを特徴とする、タンパク質の安定化方法。
〔９〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、ブロッキング剤。
〔１０〕上記のブロッキング剤を用いた、体外診断による検体中の標的物質の検出方法。
〔１１〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、細胞培養培地添加剤。
〔１２〕上記の細胞培養培地添加剤を含む、細胞培養培地。
〔１３〕細胞培養培地における前記生体適合性ポリマー組成物の濃度が０．０１質量％以上１質量％以下である、上記の細胞培養培地。
〔１４〕上記の細胞培養培地で細胞を培養することを特徴とする、細胞凝集塊又は生理活性物質の製造方法。
〔１〕アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍである、生体適合性ポリマー組成物。
〔２〕１％水溶液での浸透圧が１～２０ｍＯｓｍ／ｋｇである、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔３〕更に、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）（ただし、界面活性剤及びモノマーを除く）を含む、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔４〕ビニル系ポリマー（Ａ）１００部に対して、化合物（Ｂ）の割合が、０．５～１０部である、上記の生体適合性ポリマー組成物。
〔５〕アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）が、下記一般式１～３で示される少なくともいずれかの構造を有する、上記の生体適合性ポリマー組成物。
【化1】
【化2】
【化3】
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ１は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ４は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ５～Ｒ９のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ５～Ｒ９のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表し、＊はビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表す。］
〔６〕化合物（Ｂ）が、下記一般式４～９で示される少なくともいずれかの構造を有する、上記の生体適合性ポリマー組成物。
一般式４
【化4】
一般式５
【化5】
一般式６
【化6】
一般式７
【化7】
一般式８
【化8】
一般式９
【化9】
［一般式４～９中、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３はそれぞれ独立して炭素数１～５のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を表す。Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のいずれか２つが連結し、環を形成してもよい。
Ｒ１４は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｚは－ＣＯＯ－又はＳＯ３－、
Ｒ１５は水素原子又はメチル基、
Ｒ１６は炭素数１～４のアルキレン基、
Ｒ１７～Ｒ２１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、
Ｒ２２は炭素数１～４のアルキレン基を表す。）
〔７〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、タンパク質安定化剤。
〔８〕上記のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることを特徴とする、タンパク質の安定化方法。
〔９〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、ブロッキング剤。
〔１０〕上記のブロッキング剤を用いた、体外診断による検体中の標的物質の検出方法。
〔１１〕上記の生体適合性ポリマー組成物を含む、細胞培養培地添加剤。
〔１２〕上記の細胞培養培地添加剤を含む、細胞培養培地。
〔１３〕細胞培養培地における前記生体適合性ポリマー組成物の濃度が０．０１質量％以上１質量％以下である、上記の細胞培養培地。
〔１４〕上記の細胞培養培地で細胞を培養することを特徴とする、細胞凝集塊又は生理活性物質の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、タンパク質安定化能に優れたタンパク質安定化剤、増感効果に優れたブロッキング剤、並びに、抗体生産性及び細胞活性に優れた抗体産生細胞を培養能な細胞培養培地添加剤となる、ハンドリング性に優れた生体適合性ポリマー組成物を提供することが可能になった。
【発明を実施するための形態】
【0010】
＜生体適合性ポリマー組成物＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ～５０ｄｙｎ／ｃｍである。上記のような構成とすることで、優れたタンパク質の安定化効果やブロッキング剤、細胞培養培地添加剤としての効果を発現する。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ～５０ｄｙｎ／ｃｍである。上記のような構成とすることで、優れたタンパク質の安定化効果やブロッキング剤、細胞培養培地添加剤としての効果を発現する。
【0011】
＜ビニル系ポリマー（Ａ）＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む。
【0012】
ビニル系ポリマー（Ａ）としては、具体的には、上記一般式１～３で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式１で表される構造を含むものが特に好ましい。アミンオキシド基が下記式で表されるものであることによって、ポリマーが好適な水溶性を発現することができる。
ビニル系ポリマー（Ａ）は、共重合体であることが好ましく、ブロック共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
ビニル系ポリマー（Ａ）は、共重合体であることが好ましく、ブロック共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
【0013】
アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ）は、例えば以下のような方法で得ることができる。
（１）３級アミノ基含有モノマー（ａ）と、必要に応じてその他のモノマーとを重合しビニル系ポリマーを得た後、前記３級アミノ基と酸化剤との反応生成物として得る方法。
（２）３級アミノ基含有モノマー（ａ）と酸化剤との反応生成物モノマー（アミンオキシド基含有モノマー）と、その他のモノマーとの共重合体として得る方法。
３級アミノ基に酸化剤（以下、オキシド化剤ともいう）を反応させることで、ポリマー又はモノマーにアミンオキシド基を導入することができる。この反応を以下「オキシド化」ともいう。
（１）３級アミノ基含有モノマー（ａ）と、必要に応じてその他のモノマーとを重合しビニル系ポリマーを得た後、前記３級アミノ基と酸化剤との反応生成物として得る方法。
（２）３級アミノ基含有モノマー（ａ）と酸化剤との反応生成物モノマー（アミンオキシド基含有モノマー）と、その他のモノマーとの共重合体として得る方法。
３級アミノ基に酸化剤（以下、オキシド化剤ともいう）を反応させることで、ポリマー又はモノマーにアミンオキシド基を導入することができる。この反応を以下「オキシド化」ともいう。
【0014】
上記方法の中でも、副反応を生じ難いという点で（１）の方法が好ましい。（１）の方法においては３級アミノ基含有モノマー（ａ）以外のその他モノマーを重合させることが好ましい。
【0015】
＜３級アミノ基含有モノマー（ａ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（ａ）のうち、一般式１の構造を形成するためものとしては、例えば、
Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を表し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」及び「メタクリレート」の両者を表すものとする。
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（ａ）のうち、一般式１の構造を形成するためものとしては、例えば、
Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を表し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」及び「メタクリレート」の両者を表すものとする。
【0016】
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、２－ラウリル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾールが挙げられる。
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、２－ラウリル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾールが挙げられる。
【0017】
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、
２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－ラウリル－４－ビニルピリジン、２－ラウリル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジンが挙げられる。
２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－ラウリル－４－ビニルピリジン、２－ラウリル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジンが挙げられる。
【0018】
＜その他モノマー＞
ビニル系ポリマー（Ａ）を得る際に、前記３級アミノ基含有モノマー（ａ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他モノマーを用いることができる。その他モノマーに基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、溶媒溶解性等を制御することができる。
例えば、
炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー；
メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアクリルエステル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
Ｎ－ビニル－２－ピロリドンなどの１～３級アミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレンなどの芳香族ビニルモノマー；
（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；
酢酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；
ブチルビニルエーテル、などのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー；
が挙げられる。
中でも疎水性基を導入するという観点から、炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー（ｂ）を用いることが好ましい。ビニル系ポリマー（Ａ）が、炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー（ｂ）に基づく構造単位を含む場合、その含有量は、ビニル系ポリマー（Ａ）を構成する単量体単位の合計１００質量％に対して、５～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることがより好ましく、１５～５０質量％であることが更に好ましい。
ビニル系ポリマー（Ａ）を得る際に、前記３級アミノ基含有モノマー（ａ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他モノマーを用いることができる。その他モノマーに基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、溶媒溶解性等を制御することができる。
例えば、
炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー；
メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアクリルエステル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
Ｎ－ビニル－２－ピロリドンなどの１～３級アミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレンなどの芳香族ビニルモノマー；
（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；
酢酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；
ブチルビニルエーテル、などのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー；
が挙げられる。
中でも疎水性基を導入するという観点から、炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー（ｂ）を用いることが好ましい。ビニル系ポリマー（Ａ）が、炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー（ｂ）に基づく構造単位を含む場合、その含有量は、ビニル系ポリマー（Ａ）を構成する単量体単位の合計１００質量％に対して、５～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることがより好ましく、１５～５０質量％であることが更に好ましい。
【0019】
＜オキシド化＞
３級アミノ基含有モノマー（ａ）に由来する３級アミノ基は、各種酸化剤を使用することでアミンオキシド基化することができる。これによりビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を導入することができる。オキシド化は、ビニル系ポリマー（Ａ）の重合前、重合後のいずれであってもよく、重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合したビニル系ポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
３級アミノ基含有モノマー（ａ）に由来する３級アミノ基は、各種酸化剤を使用することでアミンオキシド基化することができる。これによりビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を導入することができる。オキシド化は、ビニル系ポリマー（Ａ）の重合前、重合後のいずれであってもよく、重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合したビニル系ポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
【0020】
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。
【0021】
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００である。分子量が上記範囲であることにより、水溶液にした際に適切な表面張力に調整することができ、更に、水溶液としてタンパク質や細胞培養用培地に添加する際に消泡性の観点から取り扱いが容易になる。
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００である。分子量が上記範囲であることにより、水溶液にした際に適切な表面張力に調整することができ、更に、水溶液としてタンパク質や細胞培養用培地に添加する際に消泡性の観点から取り扱いが容易になる。
【0022】
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、タンパク質や抗体、細胞などの物質に添加して使用されるため、物質間の界面に生じる作用が重要である。本発明では生体適合性ポリマー組成物を１％水溶液にした際の表面張力を適した範囲にすることにより、タンパク質安定性、ブロッキング性及び細胞培養時のモノクローナル抗体や生理活性物質の産生性を向上させることができる。詳細は定かではないが、適切な表面張力が、ビニル系ポリマー（Ａ）とタンパク質又は細胞との相互作用を助けるものと考察している。
【0023】
＜水＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、上記アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ）のほかに水を含む。水としては、例えば、滅菌精製水、精製水、イオン交換水、蒸留水、純粋、超純水等、特に限定されないが、好ましくは、滅菌精製水である。使用する水は、生体適合性ポリマー組成物に含有される他の成分の働きが阻害されることを防ぐため、例えばイオン交換樹脂による不純物異音の除去、フィルターによる異物の除去、上流等の操作によって水の純度を高めることが好ましい。なお、以下の説明において水は、特に断りがない限り滅菌精製水を意味する。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、上記アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ）のほかに水を含む。水としては、例えば、滅菌精製水、精製水、イオン交換水、蒸留水、純粋、超純水等、特に限定されないが、好ましくは、滅菌精製水である。使用する水は、生体適合性ポリマー組成物に含有される他の成分の働きが阻害されることを防ぐため、例えばイオン交換樹脂による不純物異音の除去、フィルターによる異物の除去、上流等の操作によって水の純度を高めることが好ましい。なお、以下の説明において水は、特に断りがない限り滅菌精製水を意味する。
【0024】
＜表面張力（ｄｙｎ／ｃｍ）＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、１％水溶液にした際の２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍの範囲であり、３０～４８ｄｙｎ／ｃｍの範囲であることがより好ましい。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、１％水溶液にした際の２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍの範囲であり、３０～４８ｄｙｎ／ｃｍの範囲であることがより好ましい。
【0025】
表面張力は物質間の界面に影響を与える因子であり、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのイオン性化合物、プロピレングリコール、グリセリンなどの非イオン性化合物、界面活性剤などの添加によって調節することが可能であるが、本発明の一実施形態では、後述する、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）が使用される。
【0026】
液体の表面の分子は、内部の分子の強い引力を受ける。その結果生じる力は、可能な限り小さな液体表面を作るように働く。この力の大きさは表面張力と呼ばれ、単位長さ当たりの力の単位で表される。なお、本発明において表面張力は、液温が２５℃である場合の表面張力であるものとする。このとき、水の表面張力は７２ｄｙｎ／ｃｍである。すなわち、生体適合性ポリマー組成物は、表面張力を低下させる作用を有する。
【0027】
（表面張力の測定方法）
表面張力の測定方法としては、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法（プレート法、垂直板法）、ｄｕＮｏｕｙ法（リング法、輪環法）、懸滴法（ペンダント・ドロップ法）、最大泡圧法、接触角を測定してヤングの式から算出する方法などが挙げられる。いずれの方法でもよいが、本発明ではＷｉｌｈｅｌｍｙ法を用い、生体適合性ポリマー組成物が２５℃１％水溶液状態における表面張力を測定した。
表面張力の測定方法としては、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法（プレート法、垂直板法）、ｄｕＮｏｕｙ法（リング法、輪環法）、懸滴法（ペンダント・ドロップ法）、最大泡圧法、接触角を測定してヤングの式から算出する方法などが挙げられる。いずれの方法でもよいが、本発明ではＷｉｌｈｅｌｍｙ法を用い、生体適合性ポリマー組成物が２５℃１％水溶液状態における表面張力を測定した。
【0028】
＜浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、１％水溶液にした際の浸透圧が１～２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることが好ましく、２～１７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることがより好ましい。浸透圧が上記範囲であると、ビニル系ポリマー（Ａ）及び上記表面張力と相乗的に作用し、タンパク質安定性、ブロッキング性及び細胞培養時のモノクローナル抗体や生理活性物質の産生性を更に向上させることができる。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、１％水溶液にした際の浸透圧が１～２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることが好ましく、２～１７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることがより好ましい。浸透圧が上記範囲であると、ビニル系ポリマー（Ａ）及び上記表面張力と相乗的に作用し、タンパク質安定性、ブロッキング性及び細胞培養時のモノクローナル抗体や生理活性物質の産生性を更に向上させることができる。
【0029】
浸透圧は粒子の数ｍｏｌ÷溶質の容量（Ｌ）で、浸透圧の単位はオスモル濃度Ｏｓｍ／Ｌで表される。水溶液の場合、オスモル濃度はＯｓｍ／ｋｇと表すことができる。特に細胞内外の水分移動には、浸透圧が関与し、電解質、糖質、アミノ酸のような溶質によって生じる。本発明の一実施形態では、後述する化合物（Ｂ）の含有により調整される。１％水溶液にした際の浸透圧が１ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であることで、細胞への障害を防ぐことができる。また、１％水溶液にした際の浸透圧が２０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であることで、細胞内脱水を生じるリスクを低下させる。
【0030】
＜化合物（Ｂ）＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、更に、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）を含むことが好ましい。ただし、細胞毒性の観点から、化合物（Ｂ）からは、界面活性剤及びモノマーは除かれる。しかし、本発明の要旨を逸脱しない限り、残留モノマー等の意図しない混入を阻むものではない。本発明において、化合物（Ｂ）の量はビニル系ポリマー（Ａ）１００部に対し０．５～１０部であることが好ましく、１～５部であることがより好ましい。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、更に、両性イオン構造を有し、かつ分子量が５００以下の化合物（Ｂ）を含むことが好ましい。ただし、細胞毒性の観点から、化合物（Ｂ）からは、界面活性剤及びモノマーは除かれる。しかし、本発明の要旨を逸脱しない限り、残留モノマー等の意図しない混入を阻むものではない。本発明において、化合物（Ｂ）の量はビニル系ポリマー（Ａ）１００部に対し０．５～１０部であることが好ましく、１～５部であることがより好ましい。
【0031】
化合物（Ｂ）は、具体的には、上記一般式４～９で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式４及び／又は一般式５で表される構造を含むものが特に好ましい。化合物（Ｂ）が下記式で表されるものであることによって、生体適合性ポリマー組成物を好適な表面張力にすることができる。
【0032】
化合物（Ｂ）は、例えば、３級アミノ基を有する化合物を出発原料として合成することができる。
例えば、アミンオキシド構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物に前述の過酸化物又はオゾン等のオキシド化剤を用いる。
また、カルボキシベタイン構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物にβ－プロピオラクトン、γ－ブチロラクトン、δ－バレロラクトンなどの環状カルボン酸エステルや２－クロロ酢酸ナトリウム、２－ブロモ酢酸ナトリウム、３－クロロプロピオン酸ナトリウム、３－ブロモプロピオン酸ナトリウム、４－クロロ酪酸ナトリウム、４－ブロモ酪酸ナトリウム、５－クロロペンタン酸ナトリウム、５－ブロモペンタン酸ナトリウムなどのω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩を用いる。
また、スルホベタイン構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物に１，２－エタンスルトン、１，３－プロパンスルトン、１，４－ブタンスルトンなどの環状スルホン酸エステルや、２-クロロエタンスルホン酸ナトリウム、２-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、３-クロロプロパンスルホン酸ナトリウム、３-ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、４-クロロブタンスルホン酸ナトリウム、４-ブロモブタンスルホン酸ナトリウムなどのω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩を用いる。
例えば、アミンオキシド構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物に前述の過酸化物又はオゾン等のオキシド化剤を用いる。
また、カルボキシベタイン構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物にβ－プロピオラクトン、γ－ブチロラクトン、δ－バレロラクトンなどの環状カルボン酸エステルや２－クロロ酢酸ナトリウム、２－ブロモ酢酸ナトリウム、３－クロロプロピオン酸ナトリウム、３－ブロモプロピオン酸ナトリウム、４－クロロ酪酸ナトリウム、４－ブロモ酪酸ナトリウム、５－クロロペンタン酸ナトリウム、５－ブロモペンタン酸ナトリウムなどのω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩を用いる。
また、スルホベタイン構造を有する化合物を得る場合、３級アミノ基を有する化合物に１，２－エタンスルトン、１，３－プロパンスルトン、１，４－ブタンスルトンなどの環状スルホン酸エステルや、２-クロロエタンスルホン酸ナトリウム、２-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、３-クロロプロパンスルホン酸ナトリウム、３-ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、４-クロロブタンスルホン酸ナトリウム、４-ブロモブタンスルホン酸ナトリウムなどのω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩を用いる。
【0033】
一般式４、５の構造を形成するためのものとしては、例えば、
トリメチルアミンＮ－オキシド、ジメチル－２－ヒドロキシエチルアミンＮ－オキシド、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホン酸、ジメチル－２－ヒドロキシエチルアンモニウムプロパンスルホン酸、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホン酸、３－（１－メチルピペリジウム）－１－プロパンスルホン酸が挙げられる。
トリメチルアミンＮ－オキシド、ジメチル－２－ヒドロキシエチルアミンＮ－オキシド、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホン酸、ジメチル－２－ヒドロキシエチルアンモニウムプロパンスルホン酸、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホン酸、３－（１－メチルピペリジウム）－１－プロパンスルホン酸が挙げられる。
【0034】
一般式６、７の構造を形成するためのものとしては、例えば、
イミダゾールＮ－オキシド、２-メチルーイミダゾールＮ－オキシド、イミダゾリニウムベタイン、３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩が挙げられる。
イミダゾールＮ－オキシド、２-メチルーイミダゾールＮ－オキシド、イミダゾリニウムベタイン、３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩が挙げられる。
【0035】
一般式８、９の構造を形成するためのものとしては、例えば、
ピリジンＮ－オキシド、１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、１－（４－スルホブチル）ピリジニウム内部塩が挙げられる。
ピリジンＮ－オキシド、１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、１－（４－スルホブチル）ピリジニウム内部塩が挙げられる。
【0036】
以下に、タンパク質安定化剤、ブロッキング剤及び細胞培養培地添加剤を含む各種用途について詳細を述べる。
【0037】
＜タンパク質安定化剤＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、タンパク質を共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質は、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。安定化剤とタンパク質を共存させる溶媒は水系の溶媒が好ましい。例えば、水やトリス緩衝生理塩水（ＴＢＳ）、リン酸緩衝生理塩水（ＰＢＳ）があげられる。水はメタノールやエタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフランなど水と混合できる有機溶剤を一部含んでもよい。タンパク質に対して本発明の安定化剤は質量で好ましくは１００倍、更に好ましくは１００００倍加えて使用する。安定化剤の添加量が不十分な場合、安定化効果が発現できない可能性がある。同じ理由から、安定化剤は溶液の全量に対して好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．１％以上加えて使用する。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、タンパク質を共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質は、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。安定化剤とタンパク質を共存させる溶媒は水系の溶媒が好ましい。例えば、水やトリス緩衝生理塩水（ＴＢＳ）、リン酸緩衝生理塩水（ＰＢＳ）があげられる。水はメタノールやエタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフランなど水と混合できる有機溶剤を一部含んでもよい。タンパク質に対して本発明の安定化剤は質量で好ましくは１００倍、更に好ましくは１００００倍加えて使用する。安定化剤の添加量が不十分な場合、安定化効果が発現できない可能性がある。同じ理由から、安定化剤は溶液の全量に対して好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．１％以上加えて使用する。
【0038】
＜ブロッキング剤＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、ブロッキング剤として用いることができる。ブロッキング剤とは、抗原が存在しない部位への抗体タンパク質の非特異的な吸着を防ぎ、特異的な抗原抗体反応を増強するためのものであり、生体適合性ポリマー組成物をブロッキング剤として用いる場合、その濃度は好ましくは０．０１％以上５％以下、より好ましくは０．０１％以上１％以下である。生体適合性ポリマー組成物の濃度が低い場合、抗原抗体反応効率向上又は非特異的反応の低減に対する効果がなく、濃度が高い場合、抗原抗体反応に対して阻害的に作用する。ここで言うブロッキング剤とは、抗体が抗原の存在しない部位への非特異的吸着を防止するために、抗体反応の前に抗原を含む検体を前処理する場合や、抗体の非特異的な反応を防止するために、抗体反応用の希釈液への添加に用いられるものであって、その形態は特に限定されない。
これらはいずれも、適当な緩衝液に該ブロッキング剤抗体を添加し、該組成物を、免疫反応を利用する実験手法に適用したときの非特異反応の程度を比較することにより判断することができる。より好ましくは、酵素免疫測定（ＥＩＡ）において、該ブロッキング剤を一般的に用いられる緩衝液、例えば、ＴＢＳやＰＢＳ等により希釈したものを、抗体反応前の抗原を含む検体へ滴下し、３７℃で１時間インキュベートした後に、抗体反応を行うことにより、抗体の非抗原への非特異的吸着の度合いを定量的に測定することができる。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、ブロッキング剤として用いることができる。ブロッキング剤とは、抗原が存在しない部位への抗体タンパク質の非特異的な吸着を防ぎ、特異的な抗原抗体反応を増強するためのものであり、生体適合性ポリマー組成物をブロッキング剤として用いる場合、その濃度は好ましくは０．０１％以上５％以下、より好ましくは０．０１％以上１％以下である。生体適合性ポリマー組成物の濃度が低い場合、抗原抗体反応効率向上又は非特異的反応の低減に対する効果がなく、濃度が高い場合、抗原抗体反応に対して阻害的に作用する。ここで言うブロッキング剤とは、抗体が抗原の存在しない部位への非特異的吸着を防止するために、抗体反応の前に抗原を含む検体を前処理する場合や、抗体の非特異的な反応を防止するために、抗体反応用の希釈液への添加に用いられるものであって、その形態は特に限定されない。
これらはいずれも、適当な緩衝液に該ブロッキング剤抗体を添加し、該組成物を、免疫反応を利用する実験手法に適用したときの非特異反応の程度を比較することにより判断することができる。より好ましくは、酵素免疫測定（ＥＩＡ）において、該ブロッキング剤を一般的に用いられる緩衝液、例えば、ＴＢＳやＰＢＳ等により希釈したものを、抗体反応前の抗原を含む検体へ滴下し、３７℃で１時間インキュベートした後に、抗体反応を行うことにより、抗体の非抗原への非特異的吸着の度合いを定量的に測定することができる。
【0039】
＜細胞培養培地添加剤＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、細胞培養培地添加剤として用いることができる。細胞培養培地としては、従来公知のものを使用することができる。例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）や、これらの組み合わせが挙げられる。細胞培養培地添加剤である水溶性ビニル重合体（Ａ）の培地中の濃度は０．００１～１質量％が好ましく、０．０１～１質量％がより好ましい。０．１～１質量％が更に好ましい。細胞培養培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノール等）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清等）、血清代替物などを添加するのが好ましい。
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、細胞培養培地添加剤として用いることができる。細胞培養培地としては、従来公知のものを使用することができる。例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）や、これらの組み合わせが挙げられる。細胞培養培地添加剤である水溶性ビニル重合体（Ａ）の培地中の濃度は０．００１～１質量％が好ましく、０．０１～１質量％がより好ましい。０．１～１質量％が更に好ましい。細胞培養培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノール等）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清等）、血清代替物などを添加するのが好ましい。
【0040】
＜生理活性物質、スフェロイドの製造方法＞
本発明の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地中で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。また、本発明の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地中で細胞を培養することで、スフェロイドを形成することができる。
本発明の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地中で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。また、本発明の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地中で細胞を培養することで、スフェロイドを形成することができる。
【0041】
＜生理活性物質＞
本実施形態に係る生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質（以下抗体という）やアルブミン、薬物代謝酵素などである。ここで産生される抗体は特に限定されず、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体又はヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）である。また、産生される薬物代謝酵素は特に限定されず、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、エポキシドヒドラーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０などが挙げられる。
本発明の培養方法又は製造方法において、培養を行う際、通常培養に用いられている容器又は装置を使用することができる。例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ジャーファーメンター、ファーメンター、ローラーボトル、ホローファイバー、マイクロキャリアーが挙げられる。
本実施形態に係る生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質（以下抗体という）やアルブミン、薬物代謝酵素などである。ここで産生される抗体は特に限定されず、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体又はヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）である。また、産生される薬物代謝酵素は特に限定されず、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、エポキシドヒドラーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０などが挙げられる。
本発明の培養方法又は製造方法において、培養を行う際、通常培養に用いられている容器又は装置を使用することができる。例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ジャーファーメンター、ファーメンター、ローラーボトル、ホローファイバー、マイクロキャリアーが挙げられる。
【0042】
＜細胞＞
本発明の培養方法で培養される細胞は、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、抗体生産可能な細胞として例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞、（ＳＰ２／Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞など）、ハイブリドーマ、昆虫細胞、及び、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられるが、例えばＣＨＯ細胞、ＳＰ２/Ｏ細胞又はＮＳＯ細胞等を細胞融合することによって得られるハイブリドーマ等を採用することができる。薬物代謝酵素を産生可能な細胞として例えば、動物の肝臓から採取された初代肝細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞から分化誘導させた肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞やＨｕＨ-７細胞等の肝がん由来の細胞株等が挙げられる。
本発明の培養方法で培養される細胞は、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、抗体生産可能な細胞として例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞、（ＳＰ２／Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞など）、ハイブリドーマ、昆虫細胞、及び、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられるが、例えばＣＨＯ細胞、ＳＰ２/Ｏ細胞又はＮＳＯ細胞等を細胞融合することによって得られるハイブリドーマ等を採用することができる。薬物代謝酵素を産生可能な細胞として例えば、動物の肝臓から採取された初代肝細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞から分化誘導させた肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞やＨｕＨ-７細胞等の肝がん由来の細胞株等が挙げられる。
【0043】
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５体積％ＣＯ２雰囲気下で、温度３７℃である条件とすることができる。
【0044】
培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例えば、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集める。接着細胞の場合は、例えば０．２５％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ液を添加して細胞を浮遊させた後、遠心分離やろ過により集める。
【0045】
細胞培養によって生産される生理活性物質、特に抗体は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過又は遠心分離により上澄み液を得て、これから採取される。また、細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過又は遠心分離により得た細胞をホモジナイズ、超音波処理、化学薬品処理等を施し、生産物を抽出した上澄み液を得る。
【0046】
上記上澄みから抗体を分離、精製するには、公知の方法を適宜組み合わせて行う。例えば、硫安沈殿、透析、限外ろ過、電気泳動、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどが好ましい。
【実施例】
【0047】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。尚、実施例及び比較例における「部」及び「％」は、「質量部」及び「質量％」を表し、ｍｏｌは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。
【0048】
（質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法）
質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準プルラン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては下記条件１を用いた。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照した。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。また、ビニル系ポリマー（Ａ）の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量とすることができる。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件２によることを基本とした。
質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準プルラン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては下記条件１を用いた。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照した。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。また、ビニル系ポリマー（Ａ）の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量とすることができる。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件２によることを基本とした。
【0049】
（条件１）
カラム：ＯＨｐａｋＳＢ－Ｇ、
ＯＨｐａｋＳＢ－８０６ＭＨＱを３本及び、
ＯＨｐａｋＳＢ－８０２．５ＨＱを連結したもの。
キャリア：１／１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．０リン酸緩衝液
（りん酸緩衝剤粉末１／１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．０（富士フイルム和光純薬（株）製）をイオン交換水１Ｌに溶解させたもの）
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．５質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
カラム：ＯＨｐａｋＳＢ－Ｇ、
ＯＨｐａｋＳＢ－８０６ＭＨＱを３本及び、
ＯＨｐａｋＳＢ－８０２．５ＨＱを連結したもの。
キャリア：１／１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．０リン酸緩衝液
（りん酸緩衝剤粉末１／１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．０（富士フイルム和光純薬（株）製）をイオン交換水１Ｌに溶解させたもの）
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．５質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
【0050】
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
【0051】
（表面張力の測定方法）
生体適合性ポリマー組成物を１％水溶液とし、２５℃においてＷｉｌｈｅｌｍｙ法により測定した。
生体適合性ポリマー組成物を１％水溶液とし、２５℃においてＷｉｌｈｅｌｍｙ法により測定した。
【0052】
（浸透圧の測定方法）
浸透圧の測定方法としては、第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定方法に従い、水の凝固点降下度測定により、生体適合性ポリマー組成物を１％水溶液とし、オスモル濃度を測定した。
浸透圧の測定方法としては、第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定方法に従い、水の凝固点降下度測定により、生体適合性ポリマー組成物を１％水溶液とし、オスモル濃度を測定した。
【0053】
＜ビニル系ポリマー（Ａ）の製造＞
［製造例１］
（Ｐ－１）
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートを７０質量部、ブチルメタクリレートを３０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．３質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間加熱を継続した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を４３部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーを得た。
［製造例１］
（Ｐ－１）
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートを７０質量部、ブチルメタクリレートを３０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．３質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間加熱を継続した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を４３部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーを得た。
【0054】
［製造例２～４、比較製造例１］
（Ｐ－２～５）
表１に示す組成に変更した以外は、Ｐ－１と同様にして、ビニル系ポリマーを得た。
（Ｐ－２～５）
表１に示す組成に変更した以外は、Ｐ－１と同様にして、ビニル系ポリマーを得た。
【0055】
【表1】
【0056】
表１中の略称の詳細は以下の通りである。
ＤＥＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＤＥＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
【0057】
＜生体適合性ポリマー組成物の製造＞
［実施例１－１］
（添加剤１）
上記で得たビニル系ポリマー（Ｐ－１）１００部に対し、トリメチルグリシン（ＴＭＧ）が２部になるように両者を水に溶解し、濃度１質量％の生体適合性ポリマー組成物を得た。表面張力は４３ｄｙｎ／ｃｍ、浸透圧は２ｍＯｓｍ／ｋｇであった。またハンドリングの指標として評価した消泡性評価の結果は○であった。
［実施例１－１］
（添加剤１）
上記で得たビニル系ポリマー（Ｐ－１）１００部に対し、トリメチルグリシン（ＴＭＧ）が２部になるように両者を水に溶解し、濃度１質量％の生体適合性ポリマー組成物を得た。表面張力は４３ｄｙｎ／ｃｍ、浸透圧は２ｍＯｓｍ／ｋｇであった。またハンドリングの指標として評価した消泡性評価の結果は○であった。
【0058】
［実施例１－２～２２、比較例１－１～４］
（添加剤２～２６）
表２に示す組成に変更した以外は、実施例１－１と同様にして調製した。
（添加剤２～２６）
表２に示す組成に変更した以外は、実施例１－１と同様にして調製した。
【0059】
［消泡性評価］
生体適合性ポリマー組成物は使用前に撹拌するが、撹拌時に泡が生じるとハンドリングの観点で不具合をきたす。そこで、撹拌後に生じる泡の消泡性をハンドリングの指標として、以下の方法で評価した。
生体適合性ポリマー組成物は使用前に撹拌するが、撹拌時に泡が生じるとハンドリングの観点で不具合をきたす。そこで、撹拌後に生じる泡の消泡性をハンドリングの指標として、以下の方法で評価した。
【0060】
１５ｍＬ遠沈管に生体適合性ポリマー組成物の１％水溶液を３ｍＬ添加し、手振りで激しく撹拌した後、３０分間静置した。静置後の泡の高さを計測し、下記基準にて評価した。
【0061】
３０分静置後の泡の高さ
○：３ｃｍ未満
×：３ｃｍ以上
○：３ｃｍ未満
×：３ｃｍ以上
【0062】
【表2】
【0063】
表２中の略称の詳細は以下の通りである。
ＴＭＧ：トリメチルグリシン
ＮＤＳＢ１９５：ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホン酸
ＮＤＳＢ２０１：３－（１－ピリジノ）プロパンスルホン酸
ＮＤＳＢ２１１：ジメチル－２－ヒドロキシエチルアンモニウムプロパンスルホン酸
ＴＭＡＯ：トリメチルアミンＮ－オキシド
ＤＭＨＥＡＯ：ジメチル－２－ヒドロキシエチルアミンＮ－オキシド
ＰｙＯ：ピリジンＮ－オキシド
ＴＭＧ：トリメチルグリシン
ＮＤＳＢ１９５：ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホン酸
ＮＤＳＢ２０１：３－（１－ピリジノ）プロパンスルホン酸
ＮＤＳＢ２１１：ジメチル－２－ヒドロキシエチルアンモニウムプロパンスルホン酸
ＴＭＡＯ：トリメチルアミンＮ－オキシド
ＤＭＨＥＡＯ：ジメチル－２－ヒドロキシエチルアミンＮ－オキシド
ＰｙＯ：ピリジンＮ－オキシド
【0064】
＜生体適合性ポリマー組成物のタンパク質安定性試験＞
［実施例２－１～２２］［比較例２－１～４］
表２に示した組成比で各化合物をＰＢＳに溶かし、固形分濃度０．１質量％とした。
［実施例２－１～２２］［比較例２－１～４］
表２に示した組成比で各化合物をＰＢＳに溶かし、固形分濃度０．１質量％とした。
【0065】
＜タンパク質安定化剤の評価＞
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表３に示す。
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表３に示す。
【0066】
［評価用酵素水溶液の調製］
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体（ａｂｃａｍ社製）を８．０ｎｇ／ｍｌとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液１ｍｌで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し４０℃で保管した。
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体（ａｂｃａｍ社製）を８．０ｎｇ／ｍｌとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液１ｍｌで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し４０℃で保管した。
【0067】
［酵素活性評価］
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用い、発色剤（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）を１０ｍｌと基質液（過酸化水素水）１００μｌを混合し発色液を得た。
この発色液１００μｌと、評価用酵素水溶液１００μｌとを９６穴ウェルプレートに加え、３０℃暗所で２０分間静置した。これに停止液（硫酸水溶液）を１００μｌ加え反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒＭｉｔｈｒａｓ２ＬＢ９４３（ＢＥＲＴＨＯＬＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）で測定し、反応により生じたＴＭＢＺ酸化物の量を定量した。ＴＭＢＺの酸化反応はＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用い、発色剤（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）を１０ｍｌと基質液（過酸化水素水）１００μｌを混合し発色液を得た。
この発色液１００μｌと、評価用酵素水溶液１００μｌとを９６穴ウェルプレートに加え、３０℃暗所で２０分間静置した。これに停止液（硫酸水溶液）を１００μｌ加え反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒＭｉｔｈｒａｓ２ＬＢ９４３（ＢＥＲＴＨＯＬＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）で測定し、反応により生じたＴＭＢＺ酸化物の量を定量した。ＴＭＢＺの酸化反応はＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
【0068】
［タンパク質安定化効果の評価］
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と４０℃、３日間保管後の２回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を１００％としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と４０℃、３日間保管後の２回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を１００％としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。
【0069】
４０℃、３日保管後の相対吸光度
◎：７０％以上（極めて良好）
○：５０％以上、７０％未満（良好）
△：３０％以上、５０％未満（使用可能）
×：３０％未満（使用不可）
◎：７０％以上（極めて良好）
○：５０％以上、７０％未満（良好）
△：３０％以上、５０％未満（使用可能）
×：３０％未満（使用不可）
【0070】
【表3】
【0071】
表３に示すように、本発明の生体適合性ポリマー組成物をタンパク質安定化剤として使用することで、高いタンパク質安定化効果が得られた。一方、ビニル系ポリマー（Ａ）を有しないか、水溶液の表面張力が本発明の範囲外である比較例２－１～４、タンパク質と共存させ保管しても十分な安定化効果が得られなかった。
【0072】
＜生体適合性ポリマー組成物のブロッキング剤としての増感効果評価＞
［実施例３－１～２２］［比較例３－１～４］
表２に示した組成比で各化合物をＰＢＳに溶かし、固形分濃度１質量％とした。下記の通り、増感効果評価を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表４に示す。
［実施例３－１～２２］［比較例３－１～４］
表２に示した組成比で各化合物をＰＢＳに溶かし、固形分濃度１質量％とした。下記の通り、増感効果評価を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表４に示す。
【0073】
［抗原抗体反応試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用抗体として抗ＨＳＡ抗体を３μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、４℃で一晩静置した後、溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ－T溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用抗体として抗ＨＳＡ抗体を３μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、４℃で一晩静置した後、溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ－T溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
【0074】
（ブロッキング処理）
上記で調整したブロッキング剤を、前述の抗体処理した９６穴ウェルプレートに２００μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを3回繰り返した。
上記で調整したブロッキング剤を、前述の抗体処理した９６穴ウェルプレートに２００μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを3回繰り返した。
【0075】
（抗原吸着処理）
抗原としてＨＳＡが０,２５，５０,１００ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＳＡ抗原溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
抗原としてＨＳＡが０,２５，５０,１００ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＳＡ抗原溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
【0076】
（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識抗体としてＡ８０－１２９Ｐ（抗ヒトアルブミン抗体）が２０ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＨＳＡ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
ＨＲＰ標識抗体としてＡ８０－１２９Ｐ（抗ヒトアルブミン抗体）が２０ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＨＳＡ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した後、溶液を吸引し除去した後、ＰＢＳ－Ｔ溶液を２００μｌずつ添加し吸引除去することを３回繰り返した。
【0077】
（発色反応）
前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつＡＢＴＳ溶液を添加した。室温で１時間静置した後、各ウェルに停止液１００μｌを添加した。
前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつＡＢＴＳ溶液を添加した。室温で１時間静置した後、各ウェルに停止液１００μｌを添加した。
【0078】
（吸光度測定）
ＨＳＡ抗原濃度が１００ｎｇ／ｍｌの時の４０５ｎｍの吸光度（吸光度Ａとする）とＨＳＡ抗原濃度が０ｎｇ／ｍｌの時の４０５ｎｍの吸光度プロット（吸光度Ｂとする）を測定した。下記基準にてＥＬＩＳＡのブロッキング剤として使用した際の増感効果を評価した。
ＨＳＡ抗原濃度が１００ｎｇ／ｍｌの時の４０５ｎｍの吸光度（吸光度Ａとする）とＨＳＡ抗原濃度が０ｎｇ／ｍｌの時の４０５ｎｍの吸光度プロット（吸光度Ｂとする）を測定した。下記基準にてＥＬＩＳＡのブロッキング剤として使用した際の増感効果を評価した。
【0079】
［評価基準］
◎：１．５≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ） ：良好
○：０．８＜（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜１．５ ：使用可能
×：（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）≦０．８ ：使用不可
◎：１．５≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ） ：良好
○：０．８＜（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜１．５ ：使用可能
×：（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）≦０．８ ：使用不可
【0080】
【表4】
【0081】
表４の結果から、本発明の生体適合性ポリマー組成物をブロッキング剤として使用することで、ＥＬＩＳＡ試験時の増感効果が得られた。一方、ビニル系ポリマー（Ａ）を有しないか、水溶液の表面張力が本発明の範囲外である比較例３－１～４は、ブロッキング剤として十分な増感効果が得られなかった。
【0082】
＜生体適合性ポリマー組成物の細胞培養試験＞
［実施例４－１～２２］［比較例４－１～４］
表２に示した組成比で各化合物を細胞培養用培地に溶かし、以下の評価を実施した。結果を表５に示す。以下に述べる（１）生理活性物質の生産量の評価、（３）細胞の活性の評価は、それぞれの基礎培地に細胞用培地添加剤を所定量添加し、ピペッティングをすることで培地組成物を調整し、最終濃度０．０１質量％から１質量％の範囲で評価した。
［実施例４－１～２２］［比較例４－１～４］
表２に示した組成比で各化合物を細胞培養用培地に溶かし、以下の評価を実施した。結果を表５に示す。以下に述べる（１）生理活性物質の生産量の評価、（３）細胞の活性の評価は、それぞれの基礎培地に細胞用培地添加剤を所定量添加し、ピペッティングをすることで培地組成物を調整し、最終濃度０．０１質量％から１質量％の範囲で評価した。
【0083】
（１）生理活性物質の生産量の評価
【0084】
＜抗体産生性評価＞
培地はＤｙｎａｍｉｓＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎを１．０質量％になるように添加した。以後、これを基礎培地と呼ぶ。これを２セット用意し、得られた生体適合性ポリマー組成物を含む細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞用培地添加剤の濃度が異なる２種の培地にそれぞれＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３～４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．３以上（非常に良好）
○：１以上～１．３未満（良好）
×：１未満（不良）
培地はＤｙｎａｍｉｓＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎを１．０質量％になるように添加した。以後、これを基礎培地と呼ぶ。これを２セット用意し、得られた生体適合性ポリマー組成物を含む細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞用培地添加剤の濃度が異なる２種の培地にそれぞれＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３～４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．３以上（非常に良好）
○：１以上～１．３未満（良好）
×：１未満（不良）
【0085】
＜アルブミン産生性評価＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製ＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのアルブミン生産量として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１以上～１．２未満（良好）
×：１未満（不良）
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製ＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのアルブミン生産量として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１以上～１．２未満（良好）
×：１未満（不良）
【0086】
＜薬物代謝酵素活性の評価＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後、薬物代謝酵素の活性評価を実施した。薬物代謝酵素活性はＰ４５０－ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４ＡｓｓａｙＫｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて評価し、基質としてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを用いた。基質を含む１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に入れ替え、４時間インキュベートした。インキュベート後の培地を発光測定用黒色プレートに移し、検出試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ）を加え、室温で２０分間静置した。このプレートをプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）にて発行量測定した。また、細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの薬物代謝酵素活性値として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０以上１．２未満（良好）
×：１未満（不良）
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後、薬物代謝酵素の活性評価を実施した。薬物代謝酵素活性はＰ４５０－ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４ＡｓｓａｙＫｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて評価し、基質としてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを用いた。基質を含む１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に入れ替え、４時間インキュベートした。インキュベート後の培地を発光測定用黒色プレートに移し、検出試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ）を加え、室温で２０分間静置した。このプレートをプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）にて発行量測定した。また、細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの薬物代謝酵素活性値として算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０以上１．２未満（良好）
×：１未満（不良）
【0087】
＜ｑＲＴ－ＰＣＲ法による遺伝子発現解析＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで細胞を回収した。回収したＨｅｐＧ２細胞をＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと目的遺伝子（ＣＹＰ３Ａ４とＡｌｂｕｍｉｎ）のＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＹＰ３Ａ４：Ｈｓ００６０４５０６＿ｍ１，Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｈｓ００６０９４１１＿ｍ１)を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。リファレンス遺伝子にはＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）を用いた。各遺伝子の相対発現量はＧＡＰＤＨを基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：２以上（非常に良好）
○：１以上２未満（良好）
×：１未満（不良）
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで細胞を回収した。回収したＨｅｐＧ２細胞をＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと目的遺伝子（ＣＹＰ３Ａ４とＡｌｂｕｍｉｎ）のＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＹＰ３Ａ４：Ｈｓ００６０４５０６＿ｍ１，Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｈｓ００６０９４１１＿ｍ１)を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。リファレンス遺伝子にはＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）を用いた。各遺伝子の相対発現量はＧＡＰＤＨを基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表５に示す。
◎：２以上（非常に良好）
○：１以上２未満（良好）
×：１未満（不良）
【0088】
＜細胞の活性の評価＞
【0089】
＜ＡＴＰ活性＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で５日間培養した。
ＡＴＰ活性は、１、５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表５に示す。
ＡＴＰ活性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
◎：１５０％≦ＡＴＰ活性、ＡＴＰ活性がかなり高い。（非常に良好）
〇：１００％≦ＡＴＰ活性＜１５０％ＡＴＰ活性が高い。（良好）
△：５０％≦ＡＴＰ活性＜１００％ＡＴＰ活性がやや高い。（可）
×：ＡＴＰ活性＜５０％ＡＴＰ活性が低い。（不良）
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記の生体適合性ポリマー組成物を含む細胞培養培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で５日間培養した。
ＡＴＰ活性は、１、５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表５に示す。
ＡＴＰ活性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
◎：１５０％≦ＡＴＰ活性、ＡＴＰ活性がかなり高い。（非常に良好）
〇：１００％≦ＡＴＰ活性＜１５０％ＡＴＰ活性が高い。（良好）
△：５０％≦ＡＴＰ活性＜１００％ＡＴＰ活性がやや高い。（可）
×：ＡＴＰ活性＜５０％ＡＴＰ活性が低い。（不良）
【0090】
【表5】
【0091】
表５の結果から、実施例４－１～４－２２の細胞培養培地添加剤は、優れた抗体産生性やアルブミン産生性、薬物代謝酵素の活性を示すことが分かった。一方で、比較例４－１～４－４の添加剤は、抗体産生性、アルブミン産生性、ＡＴＰ活性ともに実施例４－１～４－２２の細胞培養培地添加剤に劣る結果となった。
【0092】
本発明の生体適合性ポリマー組成物は、タンパク質と共存させることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質安定化剤として使用することができる。
また、ブロッキング剤として使用することで、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法などの抗原抗体反応を利用した分析を行うことが可能になる。
更に、細胞培養培地に添加することにより、生理活性物質の生産量を増大させることができ、製造コストや手間を少なくすることができる点でも有用である。例えば、抗体医薬品等のバイオ医薬品の製造に関して、大量供給に大きく貢献することができる。
また、ブロッキング剤として使用することで、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法などの抗原抗体反応を利用した分析を行うことが可能になる。
更に、細胞培養培地に添加することにより、生理活性物質の生産量を増大させることができ、製造コストや手間を少なくすることができる点でも有用である。例えば、抗体医薬品等のバイオ医薬品の製造に関して、大量供給に大きく貢献することができる。
【要約】
【課題】本発明の目的は、タンパク質安定化能に優れたタンパク質安定化剤、増感効果に優れたブロッキング剤、並びに、抗体生産性及び細胞活性に優れた抗体産生細胞を培養能な細胞培養培地添加剤となる、ハンドリング性に優れた生体適合性ポリマー組成物を提供することにある。
【解決手段】アミンオキシド基を有し、かつ重量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍである、生体適合性ポリマー組成物。
【選択図】なし
【解決手段】アミンオキシド基を有し、かつ重量平均分子量が５，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）及び水を含み、１％水溶液での２５℃における表面張力が３０～５０ｄｙｎ／ｃｍである、生体適合性ポリマー組成物。
【選択図】なし