▶ ナンシャ・バイオロジックス・（ホンコン）・リミテッドの特許一覧
特許7227159酵母における組換えＩＬ－１１の生産のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-13
(45)【発行日】2023-02-21
(54)【発明の名称】酵母における組換えＩＬ－１１の生産のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20230214BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20230214BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 K
C12N15/24
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2019558999
(86)(22)【出願日】2018-01-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-27
(86)【国際出願番号】 US2018013708
(87)【国際公開番号】W WO2018132787
(87)【国際公開日】2018-07-19
【審査請求日】2020-12-08
(31)【優先権主張番号】62/446,762
(32)【優先日】2017-01-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519258725
【氏名又は名称】ナンシャ・バイオロジックス・（ホンコン）・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＳＨＡ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ （ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ） ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】ＦＬＡＴ／ＲＭ １１－１３， ＢＬＫ ０２， １５／Ｆ， ＧＲＡＮＤ ＣＥＮＴＲＡＬ ＰＬＡＺＡ， １３８ ＳＨＡＴＩＮ ＲＵＲＡＬ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ ＲＯＡＤ， ＳＨＡＴＩＮ ＮＴ， ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】チョー，クイ‐リム
(72)【発明者】
【氏名】フォック，マンソン
(72)【発明者】
【氏名】ラウ，ジョンソン，イウ‐ナム
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１５１７１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０２３２９３８８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１２０３９２０（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／０１１１２４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００１－１３９６００（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－００４９８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Hongbo Li et al.，Large-scale production, purification and bioactivity assay of recombinant human interleukin-6 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.，FEMS Yeast Res, 2011, Vol.11, p，2011年03月，Vol.11, No.2，p.160-167，doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00701.x
【文献】吉澤俊祐、白木賢太郎，タンパク質の凝集剤としての塩・有機溶媒・高分子，生物工学，2015年05月25日，第９３巻, 第５号，p.260-263
【文献】浜田寛之、松岡常吉，タンパク質リフォールディングの標準的な方法，タンパク質科学会アーカイブ，2008年06月09日，Vol.1，e035
【文献】Y. S. Huang et al.，[Purification and characterization of recombinant human interleukin 11 which expressed by Pichia oastoris.]，生物工程学報(Chinese Journal of Biotechnology)，2001年05月，Vol.17, No.3，p.250-253
【文献】J. K. Zhu et al.，[Expression and purification of recombinant human interleukin-11 in Pichia pastoris.]，中国医学科学院学報(ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE)，2001年04月，Vol.23, No.2，p.127-131
【文献】T. Y. Wang et al.，[Expression of the recombinant human interleukin-11 in Pichia pastoris.]，生物化学与生物物理学報(ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA)，2001年11月，Vol.33, No.6，p.659-664
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ２１／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えＩＬ－１１をコードする発現ベクターを酵母に導入する工程であって、ここで前記組換えＩＬ－１１は融合タンパク質の形態ではない、ＩＬ－１１の発現を誘導する条件下で培地中で前記酵母を培養する工程、
前記培地の固形物から上澄みを分離する工程、
前記上澄み中の可溶性であるがミスフォールディングされた組換えＩＬ－１１を同定する工程、
沈殿物を含む懸濁液を形成するのに十分な量で、前記上澄みをポリエチレングリコールと接触させる工程、
変性剤を含む溶液中で前記沈殿物を可溶化して、粗ＩＬ－１１溶液を生成する工程、
前記変性剤の濃度を０．７Ｍ以下に下げてリフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する工程、
前記リフォールディングされたＩＬ－１１溶液をイオン交換媒体と接触させる工程、および、
前記イオン交換媒体から精製されたＩＬ－１１を溶出する工程、を含む、ＩＬ－１１を製造する方法。
【請求項2】
前記ポリエチレングリコールが４％（ｗ／ｖ）～１２％（ｗ／ｖ）の最終濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ポリエチレングリコールが２，０００Ｄ～２０，０００Ｄの平均分子量を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記変性剤が、尿素、グアニジン塩酸塩および界面活性剤からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸塩およびＮ－サルコシルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記可溶化する工程において、前記変性剤が４Ｍ～１０Ｍの濃度のグアニジン塩酸塩である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記変性剤の濃度を低下させた後、１８℃～２５℃で１時間インキュベートすることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記イオン交換媒体がカチオン交換媒体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記粗ＩＬ－１１溶液の希釈によって達成される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記粗ＩＬ－１１溶液のバッファー交換によって達成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記リフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する工程が、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法であって、以下のさらなる工程、
前記精製されたＩＬ－１１を疎水性相互作用媒体と接触させる工程、および、
前記疎水性相互作用媒体からポリッシュされたＩＬ－１１を溶出する工程、
ここで、前記ポリッシュされたＩＬ－１１は、前記精製されたＩＬ－１１と比べて低下した含有量の酸化されたＩＬ－１１を有する、を含む方法。
【請求項13】
前記ポリッシュされたＩＬ－１１が少なくとも９５％の純度を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ポリッシュされたＩＬ－１１が５％以下の酸化されたＩＬ－１１を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項15】
前記ポリッシュされたＩＬ－１１が、１％以下のＩＬ－１１の二量体を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記リフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する工程が、共溶質の非存在下で行われる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記リフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する工程が、４～１２のｐＨで行われる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記リフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する工程が、７～１１のｐＨで行われる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
７ＴＤ１細胞ラインを用いて試験した場合、ポリッシュされたＩＬ－１１が４×１０６Ｕ／ｍｇ～１．２×１０７Ｕ／ｍｇの生物学的活性を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４６，７６２号の利益を主張する。これらおよび他のすべての参照された外部材料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み入れられる用語の定義または使用が矛盾する、または本明細書に提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が支配的であるとみなされる。
本出願は、２０１７年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４６，７６２号の利益を主張する。これらおよび他のすべての参照された外部材料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み入れられる用語の定義または使用が矛盾する、または本明細書に提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が支配的であるとみなされる。
【0002】
技術分野
本発明の分野は、特に酵母における、組換えＩＬ－１１の製造およびその後の精製である。
本発明の分野は、特に酵母における、組換えＩＬ－１１の製造およびその後の精製である。
【背景技術】
【0003】
背景の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に提供された情報のいずれもが先行技術であるかまたは現在特許請求されている発明に関連するとは、または具体的にまたは暗黙的に参照されている刊行物が先行技術であるとは認められない。
【0004】
インターロイキンＩＬ－１１はかなりの治療的可能性を有するが、適切な規模および純度でのＩＬ－１１の産生は困難であることが証明されている。グリコシル化が欠如しているために、細菌における組換えＩＬ－１１の発現が試みられてきた。しかしながら、得られたタンパク質は不溶性封入体として発現される傾向があり、その結果収率が悪くなる。これはおそらく不適切なフォールディングによるものである。酵母においてＩＬ－１１を発現させる試みがなされてきたが、今日までそのような方法は低収率を呈し、また有毒な有機溶媒の使用を必要としていた。
【0005】
これに対処するための一つのアプローチは、より望ましい発現特性を有する融合タンパク質として組換えＩＬ－１１を発現させることである。市販のＩＬ－１１は、典型的には大腸菌で発現された融合タンパク質から単離される。残念なことに、融合タンパク質からＩＬ－１１フラグメントを生成するためのエンテロキナーゼの使用は生成物の不均一性をもたらす。同様に、特許文献１；米国特許出願公開第２００９／００１０８７２号（Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ）は、ＩＬ－１１および可溶性ＩＬ－１１受容体配列の両方を組み込んだ組換えＩＬ－１１融合タンパク質、ならびに培地中での昆虫または哺乳動物細胞におけるそのような融合タンパク質の発現を記載している。しかしながら、そのような融合タンパク質からのＩＬ－１１の回収は、融合タンパク質を切断し、生成物ＩＬ－１１フラグメントの長さおよび／または配列の変動をもたらし得る追加の処理工程を必要とする。さらに、そのような細胞は、所望の産物の下流精製を複雑にし得る複雑な培養要件を有する。
【0006】
例えば、特許文献２：米国特許出願公開第２００７／０２７５８８９号は、ＩＬ－１１配列とシャペロニンの両方をコードするプラスミドの使用、および培地中の昆虫または哺乳動物細胞におけるそのようなプラスミドの発現を記載している。シャペロニンは、適切なフォールディングを提供し、発現されたＩＬ－１１の凝集を防ぐのに役立つ。本明細書中の全ての刊行物は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献中の用語の定義または使用が本明細書中に提供されるその用語の定義と矛盾するかまたはそれに反する場合、本明細書中に提供されるその用語の定義が適用され、参照中のその用語の定義は適用されない。しかしながら、上記のように、そのような細胞の培養条件はその後の精製工程を複雑にすることがある。さらに、培養中の哺乳動物細胞および昆虫細胞における発現は一般に細菌または酵母のそれよりはるかに低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】米国特許出願公開第２００９／００１０８７２号
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２７５８８９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従って、実質的に純粋で活性のあるＩＬ－１１を提供するための簡単で、効果的で拡張性のある方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0009】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、場合によっては「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を説明する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は実施可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態において提示される数値は、それらのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。
【0010】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用されているように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈上明らかにそうでないと指示されていない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用されるように、「中」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「中」および「上」を含む。
【0011】
文脈が反対を示さない限り、本明細書に記載のすべての範囲はそれらの終点を含むと解釈されるべきであり、無制限の範囲は商業的に実用的な値のみを含むと解釈されるべきである。同様に、文脈が反対を示さない限り、全ての値のリストは中間値を含むと見なされるべきである。
【0012】
本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に含まれるそれぞれの別々の値を個々に指す簡潔な方法として役立つことを単に意図している。本明細書で別段の指定がない限り、範囲を有する各個々の値は、あたかも本明細書で個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにするためであり、そうでなければ特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定しない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須のあらゆる請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0013】
本明細書に開示された本発明の代替の要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはそのグループの他のメンバーまたは本明細書中に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照および特許請求することができる。利便性および／または特許性の理由から、グループの一つ以上のメンバーをグループに含めることも、グループから削除することもできる。そのような包含または削除が生じたとき、本明細書は修正されたものとして群を含み、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による説明を満たすと見なされる。
【0014】
発明の概要
本発明の主題は、先行技術の方法と比較して二量体および酸化物含量が低減された高純度の組換えＩＬ－１１を提供する装置、システムおよび方法を提供する。
本発明の主題は、先行技術の方法と比較して二量体および酸化物含量が低減された高純度の組換えＩＬ－１１を提供する装置、システムおよび方法を提供する。
【0015】
本発明の概念の一実施形態は、組換えＩＬ－１１をコードする発現ベクターを酵母に導入することを含むＩＬ－１１の製造方法であって、コードされた組換えＩＬ－１１は融合タンパク質の形態ではない。酵母は、ＩＬ－１１の発現を誘導する条件下で培地中で培養され、続いて上澄みが培地の固形物から分離される。次いでこの上澄みを沈殿物を含む懸濁液を形成するのに十分な量のポリエチレングリコールで処理する。例えば、ポリエチレングリコールは、約４％（ｗ／ｖ）～約１２％（ｗ／ｖ）および／または約６％（ｗ／ｖ）～約９％（ｗ／ｖ）の最終濃度で提供され得る。そのようなポリエチレングリコールは、約２，０００Ｄから約２０，０００Ｄ、および／または約４，０００Ｄから約１２，０００Ｄの範囲の分子量を有することができる。
【0016】
この沈殿物は、変性剤を含む溶液に可溶化され、粗ＩＬ－１１溶液を生成する。適切な変性剤としては、尿素、グアニジン塩酸塩、および／または界面活性剤（ドデシル硫酸塩および／またはＮ－サルコシルなど）が挙げられる。例えば、グアニジン塩酸塩の濃度は、そのような可溶化工程において、約４Ｍ～約１０Ｍまたは約５Ｍ～約９Ｍの濃度であり得る。次に変性剤の濃度を低下させ（例えば、グアニジン塩酸塩濃度を０．７Ｍ以下に低下することができる）、リフォールディングされたＩＬ－１１溶液を製造する。いくつかの実施形態では、変性剤の濃度を低下させる工程は、変性剤の濃度を低下させた後に、１８℃～２５℃で約１時間インキュベートすることを含む。変性剤の濃度は、希釈および／またはバッファー交換を含む任意の適切な手段によって低下させることができる。ＩＬ－１１のリフォールディングは、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、および／または約２ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質濃度で実施することができ、共溶質なしで実施することができる。リフォールディングは、約４～約１２のｐＨ、または約７～約１１のｐＨで行うことができる。次いで、リフォールディングされたＩＬ－１１溶液をイオン交換媒体と接触させ、続いて精製されたＩＬ－１１をイオン交換媒体（例えばカチオン交換媒体）から溶出する。
【0017】
いくつかの実施形態では、上記の方法は追加の処理ステップを含む。いくつかの態様において、精製されたＩＬ－１１は疎水性相互作用媒体と接触させられる。適切な疎水性相互作用媒体は、ブチル、ヘキシル、オクチル、および／またはフェニル媒体を含む。精製されたＩＬ－１１と比較して酸化されたＩＬ－１１の含有量が低下したポリッシュされたＩＬ－１１は、その後、疎水性相互作用媒体から溶出される。得られた精製されたＩＬ－１１は、例えば約５％以下の酸化されたＩＬ－１１および／または１％以下のＩＬ－１１の二量体を含む、少なくとも９５％の純度を有することができる。ポリッシュされたＩＬ－１１は、７ＴＤ１細胞ラインを用いて試験した場合、典型的には約４×１０６Ｕ／ｍｇ～約１．２×１０７Ｕ／ｍｇ（例えば、約６×１０６Ｕ／ｍｇ）の生物学的活性を有する。
【0018】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同じ参照番号が同じ構成要素を表す添付の図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】ｒｈＩＬ－１１発現の高密度発酵の結果を示す。図１Ａは、異なる時点にわたる増殖曲線を示す。誘導後の異なる時点で培地を採取し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析した。図１Ｂは、クマシーブルー染色を用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。図１Ｃは、ウエスタンイムノブロッティングからの典型的な結果を示す。Ｍはタンパク質マーカーを表す。
【図1B】ｒｈＩＬ－１１発現の高密度発酵の結果を示す。図１Ａは、異なる時点にわたる増殖曲線を示す。誘導後の異なる時点で培地を採取し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析した。図１Ｂは、クマシーブルー染色を用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。図１Ｃは、ウエスタンイムノブロッティングからの典型的な結果を示す。Ｍはタンパク質マーカーを表す。
【図1C】ｒｈＩＬ－１１発現の高密度発酵の結果を示す。図１Ａは、異なる時点にわたる増殖曲線を示す。誘導後の異なる時点で培地を採取し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析した。図１Ｂは、クマシーブルー染色を用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。図１Ｃは、ウエスタンイムノブロッティングからの典型的な結果を示す。Ｍはタンパク質マーカーを表す。
【図2】水性二相抽出後のｒｈＩＬ－１１の回収を説明する典型的な非還元１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。
【図3】液体二相抽出を用いて発現培地から単離された粗ｒｈＩＬ－１１の遠紫外ＣＤスペクトルを提供する。
【図4】発酵培地から沈殿したｒｈＩＬ－１１のサイズ排除クロマトグラフィーの結果（下のパネル）およびｒｈＩＬ－１１の参照標準の結果（上のパネル）を示す。
【図5】Ｃａｐｔｏ－Ｓカラム（カチオン交換体）を用いた液体クロマトグラフィーによる０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０を含有する発酵培地からのｒｈＩＬ－１１の単離の結果を示す。赤い線はインライン導電率を表し、青い線は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を表す。陰影を付けた領域は、プールに適していると判断された画分を表す。
【図6】変性剤の存在下でリフォールディングされた後のＣａｐｔｏ－Ｓカチオン交換体上でのｒｈＩＬ－１１の単離の結果を示す。図６（Ａ）は、８Ｍ尿素の使用からの結果を示す。図６（Ｂ）は、６Ｍグアニジン塩酸塩の使用からの結果を示す。両図において、赤線はインライン導電率を表し、青線は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を表す。矢印は再生されたｒｈＩＬ－１１の溶出位置を示す。
【図7】７Ｍ ＧｄＨＣｌの存在下で沈殿タンパク質を様々な濃度で溶解することによるリフォールディング収率。
【図8】共溶質の存在下または非存在下でのリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の単離の結果を示す。赤線はインライン導電率を表し、青線は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を表す。
【図9】異なるｐＨにおけるｒｈＩＬ－１１のリフォールディング収率を示す。
【図10】Ｃａｐｔｏ－Ｓカラム（カチオン交換体）を用いた液体クロマトグラフィーによる再生ｒｈＩＬ－１１の単離の結果を示す。赤線はインライン導電率を表し、緑線はｐＨを表し、青線は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を表す。陰影を付けた領域は、プールに適していると判断された画分を表す。
【図11A】ＬＣ／ＭＳによる分子量測定の結果を示す。図１１Ａは典型的なイオンクロマトグラムを示す。図１１Ｂは、デコンボリューション質量１９，０４６．７Ｄａを有する主要ピークを示しており、これは予想分子量１９，０４７と一致する。１９，０６２．５Ｄａのデコンボリューション質量で観察された小さなピークは、追加の１６Ｄａが単一の酸素によって説明されることができるので、おそらく酸化されたＩＬ－１１による。
【図11B】ＬＣ／ＭＳによる分子量測定の結果を示す。図１１Ａは典型的なイオンクロマトグラムを示す。図１１Ｂは、デコンボリューション質量１９，０４６．７Ｄａを有する主要ピークを示しており、これは予想分子量１９，０４７と一致する。１９，０６２．５Ｄａのデコンボリューション質量で観察された小さなピークは、追加の１６Ｄａが単一の酸素によって説明されることができるので、おそらく酸化されたＩＬ－１１による。
【図12】Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムでのイオン交換からの主ピークの溶出画分のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
【図13】ブチルＨＰカラムを用いて酸化されたｒｈＩＬ－１１を除去する、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒｈＩＬ－１１のポリッシュの典型的な結果を示す。赤線はインライン導電率を表し、青線は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を表す。陰影を付けた領域は、プールに適していると判断された画分を表す。
【図14】クマシーブリリアントブルーで染色した非還元１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた、精製ｒｈＩＬ－１１の純度研究の典型的な結果を示す。タンパク質サンプルを、０．２～５．０μｇに負荷した。
【図15】ＲＰ－ＵＰＬＣによってアッセイされたｒｈＩＬ－１１および関連タンパク質の純度研究の典型的な結果を示す。酸化されたｒｈＩＬ－１１は約２．５％で存在し、未知の不純物は約１．６％で存在した。
【図16】ＳＥＣ－ＵＰＬＣによって決定された単量体ｒｈＩＬ－１１の純度研究の典型的な結果を示す。単量体ｒｈＩＬ－１１の純度は約９９．０％であった。
【図17】精製されたＩＬ－１１生成物の質量スペクトルｍ／ｚを提供する。予想された分子量１９，０４７Ｄａと一致する、デコンボリューション質量１９，０４５．７Ｄａが得られた。
【図18】ｒｈＩＬ－１１の加水分解に由来するトリプシンペプチドの典型的な全イオンクロマトグラムを示す。各ペプチドの同定は、ｍ／ｚおよびＭＳ／ＭＳフラグメンテーションによって確認した。
【図19】精製ｒｈＩＬ－１１を用いて行った細胞増殖アッセイの典型的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に提供された情報のいずれもが先行技術であるかまたは現在特許請求されている発明に関連するとは、または具体的にまたは暗黙的に参照されている刊行物が先行技術であるとは認められない。
【0021】
本発明の主題は、組換えヒトＩＬ－１１を酵母中で発現させ、活性な実質的に純粋な単量体タンパク質として培地から回収することができる装置、システムおよび方法を提供する。組み換えタンパク質は、溶媒排除試薬（例えばポリエチレングリコール）を用いて沈殿させ、カオトロープまたは変性剤（例えばグアニジニウム）の存在下で可溶化し、再生して適切なタンパク質フォールディングを提供する。イオン交換（例えばカチオン交換）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えばブチル置換クロマトグラフィー媒体を用いる）などのクロマトグラフィー工程を本発明の概念の方法に組み込むことができる。
【0022】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同じ参照番号が同じ構成要素を表す添付の図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになる。
【0023】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、場合によっては「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を説明する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は実施可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態において提示される数値は、それらのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。
【0024】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用されるように、「中」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「中」および「上」を含む。
【0025】
本明細書における値の範囲の列挙は単に、その範囲内に含まれる各別々の値を個々に指す簡潔な方法として役立つことを意図している。本明細書で別段の指定がない限り、各個別の値は、あたかも個別に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにするためであり、そうでなければ特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定しない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須のあらゆる請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0026】
本明細書に開示された本発明の代替の要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはそのグループの他のメンバーまたは本明細書中に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照および特許請求することができる。利便性および／または特許性の理由から、グループの一つ以上のメンバーをグループに含めることも、グループから削除することもできる。そのような包含または削除が生じたとき、本明細書は修正されたものとして群を含み、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による説明を満たすと見なされる。
【0027】
本発明の概念の方法および組成物を導出する際に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ｒｈＩＬ－１１を分泌する安定なｒｈＩＬ－１１高レベル発現クローンを確立した。このベクターは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα－接合因子プレ配列を発現し、これは組換えタンパク質を細胞外培地に導く短いシグナル伝達ペプチドである。ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）発現システムの特別な特徴は、高コピー数クローンの選択のためのＡＤＥ２遺伝子プロモーターと遺伝子産物の使用である。プリンヌクレオチドのデノボ生合成を担う遺伝子であるＡＤＥ２の突然変異は、形質転換コロニーに赤／ピンク色を与えるプリン前駆体の蓄積をもたらす。発現株は、アデニンを欠く培地上で増殖することができないａｄｅ２栄養要求株である。プラスミドによる発現宿主の形質転換は、アデニンを欠く培地上での株の増殖を可能にし、短いＡＤＥプロモーター配列は、高コピー数を組み込んだクローンのスクリーニングを容易にする。コピー数の少ないコロニーはピンク色に見える。一方、白いコロニーは高コピー数クローンである。
【0028】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて酵母中で組み換えヒトＩＬ－１１を産生する先行技術の方法は、酵母の発現レベルおよび生成物の精製レベルで低い生産収率が欠点である。本発明者らは、高細胞密度発酵の結果が、カチオン交換精製後の不活性ｒｈＩＬ－１１の発現および低い回収率（１～５％）の両方を示唆していることを見出した。培地中の発現レベルのＥＬＩＳＡ定量は、既知量の参照に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析と比較した場合、ＩＬ－１１含有量を過小評価する（約９０％の減少により）ことがわかった。本発明者らは、従来技術の方法は、逆相クロマトグラフィーおよびその後の有機溶媒の除去を使用してある程度までは対処されていたミスフォールディングおよび／または凝集のために低い収率を提供すると結論付けた。
【0029】
ミスフォールディングされたタンパク質は細胞内で凝集するかまたは分解のために回収されると一般に考えられているので、分泌性、可溶性であるがミスフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の存在は以前に報告されていない（９）。本発明の概念の方法は、ピキア・パストリス発現系を用いた組み換えヒトＩＬ－１１の発現および精製、ならびに逆相クロマトグラフィーを用いることなく酵母発酵培地からの単離を利用する。
【0030】
尿素、ＳＤＳ、硫酸アンモニウム、および、グアニジン塩酸塩などのカオトロープ／変性剤の使用を含む、ｒｈＩＬ－１１の再生への代替アプローチが探求された。本発明者らは、高濃度のグアニジン塩酸塩は、ｒｈＩＬ－１１の自己凝集をもたらす相互作用を乱すことができ、変性剤の濃度が減少したときに単量体ｒｈＩＬ－１１が適切にリフォールディングすることを可能にした。
【0031】
培地からのｒｈＩＬ－１１の製造方法は、培地からｒｈＩＬ－１１を沈殿させるための二相抽出から始まる。塩（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム）、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトンなど）および／または親水性ポリマー（例えば、デキストラン、デキストリン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール／ＰＥＧなど）の導入を含む、発酵培地からのｒｈＩＬ－１１の選択的または部分選択的沈殿を提供する任意の適切な手段によって沈殿を行うことができる。例えば、８，０００Ｄａの分子量を有する最終濃度８％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－８０００）を使用することができる。発酵培地から沈殿したタンパク質は、さらなる処理のために発酵培地から分離される。この分離は、沈降、デカンテーション、濾過、および／または遠心分離を含む任意の適切な手段によって達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿タンパク質は、さらなる処理の前に（例えば、沈殿剤を含有する洗浄バッファーを使用して）１回以上洗浄することができる。
【0032】
沈殿した粗タンパク質は、続いて変性剤を含有するバッファーに溶解され、これはタンパク質凝集体を破壊するのを助けることができる。適切な変性剤としては、カオトロピック剤（例えば、尿素、グアニジン塩、イソチオシアネート塩など）および界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸塩などのイオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ－２０および／またはＴｗｅｅｎ－８０などの非イオン性界面活性剤、および両性イオン性界面活性剤）が挙げられる。例えば、最終濃度７Ｍのグアニジン塩酸塩を用いてタンパク質凝集体を破壊し、沈殿したタンパク質を再可溶化することができる。
【0033】
しかしながら、そのような変性剤の使用は必然的に所望のｒｈＩＬ－１１産物の変性をもたらす。変性剤の除去または変性剤の濃度の低下によって、この変性を逆転させて再生された／リフォールディングされたｒｈＩＬ－１１を得ることができる。この除去は迅速または段階的に行うことができる。変性剤の除去は、希釈（例えば、減少量の変性剤を含むまたは変性剤を含まないバッファーを用いる）およびバッファー交換を含む任意の適切な手段によって行うことができる。バッファー交換は、徐々に（例えば、透析により）または比較的迅速に（例えば、透析濾過、サイズ排除クロマトグラフィー等により）行うことができる。このような透析および透析濾過などの方法は、低ＣＭＣの界面活性剤を除去するのには比較的効果がないことが理解されるべきである。いくつかの実施形態で、界面活性剤を含まないバッファーを用いた直接希釈は、ｒｈＩＬ－１１のリフォールディングおよび再生を可能にするのに十分に変性剤の濃度を減少させることができる。
【0034】
驚くべきことに、本発明者らは、グアニジンＨＣｌが、沈殿ｒｈＩＬ－１１の可溶化およびその後のカオトロープの除去または減少時の活性／天然立体配座への再生の両方を提供することにおいて他のカオトロピック剤より有効であることを見出した。グアニジンＨＣｌがこの目的に非常に有効であることが見出されたが、出願人は他のカオトロピック剤（例えば尿素、イソチオシアネート塩など）および／または界面活性剤がそれらの使用に最適化された条件下で同様に有効であり得ると考える。
【0035】
変性ｒｈＩＬ－１１の正しいリフォールディングまたは再生は、変性剤の濃度以外の要因の関数であり得ると理解すべきである。例えば、再生中のタンパク質濃度は、再生が起こる程度および望ましくない副生成物（二量体および高次凝集物など）の形成に影響を及ぼし得る。再生中の高タンパク質濃度はプロセス効率の観点から望ましいが、そのような考慮は最終生成物の収率および純度に対してバランスがとれなければならない。本発明の方法における再生またはリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の産生中のタンパク質濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。驚くべきことに、本発明者らは、リフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の再生または産生が、２ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質濃度で最適な結果をもたらすことを見出した。これは、変性剤を含まないバッファーを用いて希釈することによって変性剤の濃度を低下させることと組み合わせて都合よく達成することができる。
【0036】
同様に、再生工程中のｐＨは、変性ｒｈＩＬ－１１のリフォールディングまたは再生に影響を及ぼし得る。本発明者らは、再生は約４～約１２の範囲のｐＨで実施できることを見出した。好ましい実施形態では、再生は約７～約１１の範囲のｐＨで実施できる。必要ならば、再生前または再生中に、酸（ＨＣｌなど）または塩基（ＮａＯＨなど）を適切に添加することによりｐＨを調整することができる。あるいは、緩衝性化合物（例えば、リン酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなど）を再生溶液に添加することによって、または適切なｐＨの緩衝溶液に対する再生溶液のバッファー交換によってｐＨを調整することができる。
【0037】
再生／リフォールディングに続いて、ｒｈＩＬ－１１は二つのクロマトグラフィー手順に供することができる。これらのうちの第１のものは、カチオン交換体を用いるイオン交換である。適切なカチオン交換体としては、弱カチオン交換体（例えば、カルボキシル基を担持するイオン交換体）および強カチオン交換体（例えば、スルホン酸基を含有するイオン交換体）が挙げられる。このようなカチオン交換は、イオン交換膜、イオン交換樹脂、および／または相間移動溶媒を用いて行うことができる。好ましい態様において、イオン交換はクロマトグラフィーカラムに充填されたカチオン交換樹脂を用いて行われ、これは特定の画分の収集を容易にする。ｒｈＩＬ－１１調製物は、低いイオン強度で適用することができ、それによりｒｈＩＬ－１１がカチオン交換体と会合または結合することが可能になる。適用したバッファーのイオン強度を増加させることにより（例えば、ＮａＣｌまたは他の塩の濃度を増加させることにより）、または適用したバッファーのｐＨを変えることにより、未結合の汚染物質を通過させた後ｒｈＩＬ－１１をカチオン交換体から溶出または遊離できる。溶出はステップでまたはグラジエントで実施することができる。高いサンプル負荷（５ｍｇ／ｍＬを超える）を一部のカチオン交換カラムに適用すると、非特異的結合による損失を減らし、プロセス効率を向上できることを理解すべきである。例えば、Ｃａｐｔｏ－Ｓ強カチオン交換カラムの使用は１３ｍｇ／ｍＬでの負荷を可能にし、４０％～６０％の工程回収率で活性ｒｈＩＬ－１１を提供することができる。
【0038】
いくつかの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用する第２のクロマトグラフィー工程は、さらなる汚染物質を除去し、より高度に精製されたｒｈＩＬ－１１を提供するためにカチオン交換の生成物に適用される。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、適切な疎水性部分を含む膜または樹脂を用いて実施することができる。適切な疎水性部分には、プロピル、ブチル、ヘキシル、オクチル、およびフェニル基が含まれる。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前に塩（硫酸塩またはリン酸塩など）をｒｈＩＬ－１１溶液に添加することができる。そのような塩はまた、前のイオン交換工程においてカチオン交換体からｒｈＩＬ－１１を溶出するのに役立ち得る。好ましい実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーカラムに充填された疎水性相互作用樹脂を用いて行われ、これは溶出中の特定の画分の収集を容易にする。ｒｈＩＬ－１１は、適用されるバッファーのイオン強度を低下させること、および／または適用されるバッファーの有機溶媒および／または界面活性剤濃度を増加させることによって、そのような疎水性相互作用カラムから溶出され得る。バッファー組成のこの変化はステップでの変化であり得るか、またはグラジエントとして適用され得る。ｒｈＩＬ－１１は高いタンパク質添加量でそのような疎水性相互作用カラムに適用することができ、それによってプロセス効率を改善することができると理解すべきである。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを６～８ｍｇ／ｍＬのサンプル負荷で使用して、約９５％を超えるｒｈＩＬ－１１生成物純度（酸化されたｒｈＩＬ－１１および他の不純物の除去による）を、約５０％の工程収率で、得ることができる。次いで、得られた精製ｒｈＩＬ－１１を少なくとも６ｍｇ／ｍＬに濃縮し、冷蔵用に１０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７バッファーとのバッファー交換に供することができる。典型的な総収率は約２０～２５％であり得る。そのような方法からの最終精製バルクは、同一性、純度および効力に関して特徴付けられている。そのような特徴付けは、この方法が強力なｒｈＩＬ－１１を高純度で得ることができることを示している。
【0039】
本発明者らは、ｒｈＩＬ－１１の酸化が生成物汚染の重大な原因であり、酸化されたｒｈＩＬ－１１の存在を減少させるためにクロマトグラフィー工程が行われることが収率に影響を与えることに注目した。組換えタンパク質の酸化は、スーパーオキシド（Ｏ２－）およびそのプロトン化型（ＨＯＯ・）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、およびその他のヒドロキシル（ＯＨ・）を含む活性酸素種の存在により、加工および貯蔵中に大抵は起こる（１７）。硫黄含有残基のタンパク質酸化は、安定性において特に重要な役割を果たす。特にタンパク質治療薬の酸化ストレスは、力価の低下や免疫原性の上昇など、さまざまな医学的影響をもたらす可能性がある（１８）。酸化的損傷は、発酵中の溶存酸素に関係していることが多く、これは好気性発酵には避けられないことである。本発明者らは、発酵プロセスに対する改変は、培養中の酸化タンパク質の生成を最小化し、ならびに酸化タンパク質の選択的除去のための下流のポリッシュプロセスを最適化するために行うことができると考える。
【0040】
そのような方法から得られるｒｈＩＬ－１１調製物は、先行技術の方法によって産生されたｒｈＩＬ－１１と比較して、高い生物学的活性および高い純度のものであることを理解すべきである。７ＴＤ１細胞系を用いて生物学的活性について試験した場合、上記のように疎水性相互作用カラムから溶出したポリッシュされたｒｈＩＬ－１１は、約４×１０６Ｕ／ｍｇタンパク質～約１．２×１０７Ｕ／ｍｇ タンパク質の範囲の生物活性を有し得る。それは典型的には約６×１０６Ｕ／ｍｇ タンパク質である。そのようなｒｈＩＬ－１１調製物の純度は、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、または９９％超であり得る。典型的には、ｒｈＩＬ－１１の純度が上記のように９５％を超えて産生された。上記のように、酸化されたｒｈＩＬ－１１は一般に好気性発酵からの生成物中に見出される。上記のように調製されたｒｈＩＬ－１１の調製物は、典型的には５％以下の酸化されたｒｈＩＬ－１１を含む。同様に、上記のように調製されたｒｈＩＬ－１１の調製物は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満の二量体ｒｈＩＬ－１１（すなわちｒｈＩＬ－１１ダイマー）含有量を含み得る。典型的には、そのような調製物は１％未満の二量体ｒｈＩＬ－１１含有量を含む。
【実施例】
【0041】
以下は本発明の概念の例示的な例であり、限定的であると見なされるべきではない。
【0042】
材料
ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）発現システム（＃Ａ１１１５２、Ａｌ １１５４）はインビトロジェンライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手した。クローン構築のための制限酵素およびポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ酵素から購入した。消泡剤２０４（＃Ａ６４２６）、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（＃Ｙ０６２６）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。酵母由来のｒｈＩＬ－１１の参照標準は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｊｉｕｙｕａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供された（Ｌｏｔ＃２０１２１００５／１００６／１００７／１００８＆２０１５０４０２）。８－１６％グラジエントＳＤＳ ＰＡＧＥ（＃２５２６８）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（＃３７５７９）、Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎ（＃３７５８３）、トランスファーバッファーメタノールフリー（＃３５０４５）、ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０バッファー（＃２８３６０）および１ステップウルトラＴＭＢ（＃３７５７４）、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）２－メルカプトエタノール（＃２１９８５－０２３）およびＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ１６％ポリアクリルアミドゲル（ＸＰ００１６２ＢＯＸ）を含むイムノブロッティング用の試薬および材料はＴｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒトＩＬ－１１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｇｏａｔ ＩｇＧ（＃ＡＦ－２１８－ＮＡ）およびＤｏｎｋｅｙ抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰアフィニティー精製ポリクローナル（＃ＨＡＦ１０９）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。Ｃ５７Ｂ１／６脾臓細胞と融合した７ＴＤ１マウス骨髄腫細胞は、ＤＳＭＺから入手した（Ｎｏ．ＡＣＣ２３）。ウシ膵臓から修飾された配列決定グレードのトリプシン（カタログ番号１１４１８０２５００１）はＲｏｃｈｅダイアグノスティックスから購入した。マウスＩＬ－１１受容体アルファ（カタログ番号ＭＢＳ５５３２７６）はＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．から入手した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（カタログ番号Ｇ５４３０）はＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。ＲＰＭＩ １６４０（＃ＳＨ３０２５５．０１）、ＨＩ ＦＢＳ（Ｈ＃ＳＨ３００７１．０３ＨＩ）およびＳｔｒｅｐ／Ｐｅｎ（ＨＹＣＬＯＮＥ、ＵＳＡ、ＳＶ３００１０）は、ＨＹＣＬＯＮＥ、ＵＳＡから購入した。精製樹脂Ｃａｐｔｏ Ｓ（製品コード１７－５３１６－１０）、Ｃａｐｔｏ Ｑ（製品コード１７－５４４１－０１）およびＢｕｔｙｌ ＨＰ（製品コード１７－５４３２－０１）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＨＰＬＣ操作のためのトリフルオロ酢酸（カタログ番号３０２０３１）およびアセトニトリル（カタログ番号３４９６７）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ポリエチレングリコール８０００（＃４０８０５００１０）、ＤＬ－メチオニン（＃１２５６５２５００）およびグアニジン塩酸塩（＃３６４７９００２５）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃから入手した。硫酸アンモニウム（＃１１５６６）はＡｌｆａ Ａｅｓａｒから入手した。動物由来ではないフィトンペプトン（＃２１０９３１）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手した。
ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）発現システム（＃Ａ１１１５２、Ａｌ １１５４）はインビトロジェンライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手した。クローン構築のための制限酵素およびポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ酵素から購入した。消泡剤２０４（＃Ａ６４２６）、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（＃Ｙ０６２６）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。酵母由来のｒｈＩＬ－１１の参照標準は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｊｉｕｙｕａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供された（Ｌｏｔ＃２０１２１００５／１００６／１００７／１００８＆２０１５０４０２）。８－１６％グラジエントＳＤＳ ＰＡＧＥ（＃２５２６８）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（＃３７５７９）、Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎ（＃３７５８３）、トランスファーバッファーメタノールフリー（＃３５０４５）、ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０バッファー（＃２８３６０）および１ステップウルトラＴＭＢ（＃３７５７４）、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）２－メルカプトエタノール（＃２１９８５－０２３）およびＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ１６％ポリアクリルアミドゲル（ＸＰ００１６２ＢＯＸ）を含むイムノブロッティング用の試薬および材料はＴｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒトＩＬ－１１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｇｏａｔ ＩｇＧ（＃ＡＦ－２１８－ＮＡ）およびＤｏｎｋｅｙ抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰアフィニティー精製ポリクローナル（＃ＨＡＦ１０９）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。Ｃ５７Ｂ１／６脾臓細胞と融合した７ＴＤ１マウス骨髄腫細胞は、ＤＳＭＺから入手した（Ｎｏ．ＡＣＣ２３）。ウシ膵臓から修飾された配列決定グレードのトリプシン（カタログ番号１１４１８０２５００１）はＲｏｃｈｅダイアグノスティックスから購入した。マウスＩＬ－１１受容体アルファ（カタログ番号ＭＢＳ５５３２７６）はＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．から入手した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（カタログ番号Ｇ５４３０）はＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。ＲＰＭＩ １６４０（＃ＳＨ３０２５５．０１）、ＨＩ ＦＢＳ（Ｈ＃ＳＨ３００７１．０３ＨＩ）およびＳｔｒｅｐ／Ｐｅｎ（ＨＹＣＬＯＮＥ、ＵＳＡ、ＳＶ３００１０）は、ＨＹＣＬＯＮＥ、ＵＳＡから購入した。精製樹脂Ｃａｐｔｏ Ｓ（製品コード１７－５３１６－１０）、Ｃａｐｔｏ Ｑ（製品コード１７－５４４１－０１）およびＢｕｔｙｌ ＨＰ（製品コード１７－５４３２－０１）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＨＰＬＣ操作のためのトリフルオロ酢酸（カタログ番号３０２０３１）およびアセトニトリル（カタログ番号３４９６７）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ポリエチレングリコール８０００（＃４０８０５００１０）、ＤＬ－メチオニン（＃１２５６５２５００）およびグアニジン塩酸塩（＃３６４７９００２５）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃから入手した。硫酸アンモニウム（＃１１５６６）はＡｌｆａ Ａｅｓａｒから入手した。動物由来ではないフィトンペプトン（＃２１０９３１）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手した。
【0043】
ｒｈＩＬ－１１発現酵母クローンのクローニングおよび細胞バンキング
組換えヒトＩＬ－１１遺伝子を合成し、α因子シグナルペプチドをコードする遺伝子を含むｐＰＩＮＫα－ＨＣ酵母発現ベクターにクローン化し、ここではＧｌｕ－Ａｌａ反復は欠失していた。得られた組換えベクターをエレクトロポレーションによりプロテアーゼ欠損株に形質転換し、安定なクローンを作製した。各形質転換からの約４０クローンを選択し、クーマシーブルー染色を用いて視覚化して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの発現強度の目視検査によって高ＩＬ－１１発現クローンについてスクリーニングした（データは示さず）。ｒｈＩＬ－１１特異的抗体を用いたウエスタンイムノブロットによりタンパク質の同一性を確認した。リサーチマスターとワーキングセルバンクはそれに応じて準備し、凍結保存した。
組換えヒトＩＬ－１１遺伝子を合成し、α因子シグナルペプチドをコードする遺伝子を含むｐＰＩＮＫα－ＨＣ酵母発現ベクターにクローン化し、ここではＧｌｕ－Ａｌａ反復は欠失していた。得られた組換えベクターをエレクトロポレーションによりプロテアーゼ欠損株に形質転換し、安定なクローンを作製した。各形質転換からの約４０クローンを選択し、クーマシーブルー染色を用いて視覚化して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの発現強度の目視検査によって高ＩＬ－１１発現クローンについてスクリーニングした（データは示さず）。ｒｈＩＬ－１１特異的抗体を用いたウエスタンイムノブロットによりタンパク質の同一性を確認した。リサーチマスターとワーキングセルバンクはそれに応じて準備し、凍結保存した。
【0044】
量および質の一貫した発現を確実にするために、選択したクローンｐＰＩＮＫＳ２－ＩＬ１１～２４の４世代の継代により、クローン化精製した後、細胞マスターバンク、続いてワーキングセルバンクを拡大した。マスターおよびワーキングセルバンクは長期保存のために－８０℃で保存した。
【0045】
高密度発酵
流加発酵を用いた高細胞密度培養における選択されたクローンのｒｈＩＬ－１１発現レベルを評価するために、１リットルの発酵システム（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた。発酵は、ワーキングセルバンクからの解凍したバイアルを用いてアデニンを欠く１５ｍＬのＭＧＭ（最小グリセロール培地；０．２μｍ濾過）培地を接種することから始まった。ＭＧＭの組成は以下の通りである。
流加発酵を用いた高細胞密度培養における選択されたクローンのｒｈＩＬ－１１発現レベルを評価するために、１リットルの発酵システム（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた。発酵は、ワーキングセルバンクからの解凍したバイアルを用いてアデニンを欠く１５ｍＬのＭＧＭ（最小グリセロール培地；０．２μｍ濾過）培地を接種することから始まった。ＭＧＭの組成は以下の通りである。
【0046】
アミノ酸を含まない１．３４％酵母窒素ベース
１％ グリセロール
４ｐｐｍ ビオチン
１％ グリセロール
４ｐｐｍ ビオチン
【0047】
２５０ｒｐｍで２０時間振盪しながら３０℃で培養した後、得られた培地を用いて０．５％フィトンペプトン（ｐＨ５）を含む１００ｍＬのＢＳＭ（発酵基礎塩培地）にさらに４８時間接種した。ＢＳＭの組成は以下のように調製した。
【0048】
ＢＳＭの組成
グリセロール（５０％） ８０ｍＬ
リン酸（２８％） ２６．７ｍＬ
硫酸カルシウム ０．９ｇ
硫酸マグネシウム １４．９ｇ
水酸化カリウム ４．１ｇ
硫酸カリウム １８．２ｇ
フィトンペプトン ５．０ｇ
ＰＴＭ１微量塩 ４．４ｍＬ
水を加えて最終容量を１Ｌとした。
グリセロール（５０％） ８０ｍＬ
リン酸（２８％） ２６．７ｍＬ
硫酸カルシウム ０．９ｇ
硫酸マグネシウム １４．９ｇ
水酸化カリウム ４．１ｇ
硫酸カリウム １８．２ｇ
フィトンペプトン ５．０ｇ
ＰＴＭ１微量塩 ４．４ｍＬ
水を加えて最終容量を１Ｌとした。
【0049】
ブロスのｐＨを５．０に調整し、濾過したＰＴＭ１微量塩を沈殿しないようにゆっくり加えた。ＰＴＭ１微量塩を以下のように調製した。
【0050】
ＰＴＭ１微量塩の組成
硫酸第二銅－５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ
ヨウ化ナトリウム ０．０８ｇ
硫酸マンガン－Ｈ２Ｏ ３．０ｇ
モリブデン酸ナトリウム－２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ホウ酸 ０．０２ｇ
塩化コバルト ０．５ｇ
塩化亜鉛 ２０．０ｇ
硫酸第一鉄－７Ｈ２Ｏ ６５．０ｇ
ビオチン ０．２ｇ
硫酸 ５．０ｍＬ
水を加えて最終容量を１Ｌとした。
硫酸第二銅－５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ
ヨウ化ナトリウム ０．０８ｇ
硫酸マンガン－Ｈ２Ｏ ３．０ｇ
モリブデン酸ナトリウム－２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ホウ酸 ０．０２ｇ
塩化コバルト ０．５ｇ
塩化亜鉛 ２０．０ｇ
硫酸第一鉄－７Ｈ２Ｏ ６５．０ｇ
ビオチン ０．２ｇ
硫酸 ５．０ｍＬ
水を加えて最終容量を１Ｌとした。
【0051】
次に、１Ｌ容器中、０．５％（ｗ／ｖ）のダイズフィトンペプトンを含む発酵基礎塩培地（ＢＳＭ）６００ｍＬを、消泡剤５００μＬと混合し、続いて、同じ培養条件下に、グリセロールバッチ相中、新しく培養したシードセルを接種した。攪拌速度を調整することによって、溶存酸素レベル－ｐＯ２値を８０％に維持し、空気流入口流量を０．３Ｌ／分に設定した。グリセロール供給バッチ相において、増殖を促進するために５０％グリセロールを６ｍＬ／時／Ｌの制限速度で容器に供給した。細胞密度は、ＯＤが約１８０～２００に達するまで異なる時点でＯＤ６００ｎｍを測定することによってモニターした。この相の間、攪拌速度と空気の流入量を増やすことによって、ｐＯ２値を３０％以上に維持した。ｒｈＩＬ－１１の発現は、最初の４～５時間、５．５ｍＬ／時／Ｌで３０％（ｖ／ｖ）メタノール、続いて５．５～９ｍＬ／時／Ｌで５０％（ｖ／ｖ）メタノールを供給することによって、メタノール供給バッチにおいて誘発した。攪拌速度および空気流入量を増加させることによって、ｐＯ２値を２０％以上に維持した。４８～７２時間の誘導後に培地を回収した。
【0052】
ｒｈＩＬ－１１発現クローンの発現レベル
所望の発現レベルでの培地のタンパク質含量は、ミスフォールディングされたＩＬ－１１の存在のためにＥＬＩＳＡによって値が一貫して過小評価されることがわかったので（抗体によってほとんど検出されないことが分かった）、同じＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の参照標準の強度に対して目視検査によって決定した。あるいは、タンパク質含有量は、濃度測定ソフトウェア（ＢｉｏｃｈｅｍＬａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって提供されるＧｅｌＱｕａｎｔ．ＮＥＴ（バージョン１．８．２）など）を用いて定量化することができる。ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて発現レベルの正確な定量化も達成された。培地中の分泌型ｒｈＩＬ－１１を、８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００を添加することにより沈殿させ、遠心分離後に回収した。ペレットを、７Ｍグアニジン塩酸塩を含有するｐＨ８のリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁した。遠心分離によって不溶性微粒子を除去した後、ＲＰ－ＨＰＬＣ操作のための以下のクロマトグラフィー手順を使用して積分面積を既知濃度の参照標準と比較することによって発現生産性を計算した。
所望の発現レベルでの培地のタンパク質含量は、ミスフォールディングされたＩＬ－１１の存在のためにＥＬＩＳＡによって値が一貫して過小評価されることがわかったので（抗体によってほとんど検出されないことが分かった）、同じＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の参照標準の強度に対して目視検査によって決定した。あるいは、タンパク質含有量は、濃度測定ソフトウェア（ＢｉｏｃｈｅｍＬａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって提供されるＧｅｌＱｕａｎｔ．ＮＥＴ（バージョン１．８．２）など）を用いて定量化することができる。ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて発現レベルの正確な定量化も達成された。培地中の分泌型ｒｈＩＬ－１１を、８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００を添加することにより沈殿させ、遠心分離後に回収した。ペレットを、７Ｍグアニジン塩酸塩を含有するｐＨ８のリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁した。遠心分離によって不溶性微粒子を除去した後、ＲＰ－ＨＰＬＣ操作のための以下のクロマトグラフィー手順を使用して積分面積を既知濃度の参照標準と比較することによって発現生産性を計算した。
【0053】
カラム：ＰＬＲＰ－Ｓカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）、８μｍ、２．１×１５０ミリメートル、３００Ａ（オングストローム）孔径、ガードカートリッジを備える
移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ；移動相Ｂ：９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／分
検出：２１５ｎｍ
注入体積：５～１０μＬ
移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ；移動相Ｂ：９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／分
検出：２１５ｎｍ
注入体積：５～１０μＬ
【0054】
グラジエント：典型的な溶媒グラジエントを表１に示す。
【0055】
【表1】
【0056】
精製ｒｈＩＬ－１１のタンパク質濃度
クロマトグラフィー工程後のｒｈＩＬ－１１の濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートおよびキュベット分光光度計（例えば、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定した。水中で測定される２８０ｎｍでのＭ－１ｃｍ－１の単位の消衰係数（Ｅｃ）を、以下の式を用いて１７，９９０と計算した。
Ｅｃ＝数（Ｔｙｒ）×１４９０＋数（Ｔｒｐ）×５５００＋数（Ｃｙｓ）×１２５
クロマトグラフィー工程後のｒｈＩＬ－１１の濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートおよびキュベット分光光度計（例えば、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定した。水中で測定される２８０ｎｍでのＭ－１ｃｍ－１の単位の消衰係数（Ｅｃ）を、以下の式を用いて１７，９９０と計算した。
Ｅｃ＝数（Ｔｙｒ）×１４９０＋数（Ｔｒｐ）×５５００＋数（Ｃｙｓ）×１２５
【0057】
モル単位のタンパク質濃度は以下のように計算される。
濃度＝（２８０ｎｍにおける吸光度）／Ｅｃ
濃度＝（２８０ｎｍにおける吸光度）／Ｅｃ
【0058】
あるいは、タンパク質濃度は、０．１％（すなわち１ｍｇ／ｍｌ）溶液に対して０．９４４の吸光度値を用いて、２８０ｎｍでの紫外分光法によって直接決定することができる。２８０ｎｍの吸光度を用いたタンパク質定量は、トリプトファンおよびチロシンなどの芳香族アミノ酸の吸光度を測定し、ＰＥＧ部分の存在を検出しない。結果として、本明細書に記載のタンパク質の重量濃度は、ＰＥＧ分子の存在を排除する。両方の値は、与えられたタンパク質の物理的および化学的パラメータを計算するためのツールであるＰｒｏｔＰａｒａｍによって計算することができる（１０）。
【0059】
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、染色およびイムノブロッティング
タンパク質の見かけの分子量は、プレキャストゲルと組み合わせたＢｉｏｒａｄのＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮシステムを用いたドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって評価した。得られたポリアクリルアミドゲルを、クーマシーブルーまたは銀染色に従って可視化した。
タンパク質の見かけの分子量は、プレキャストゲルと組み合わせたＢｉｏｒａｄのＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮシステムを用いたドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって評価した。得られたポリアクリルアミドゲルを、クーマシーブルーまたは銀染色に従って可視化した。
【0060】
タンパク質イムノブロッティングは、Ｂｉｏ－Ｒａｄから入手したＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌを用いて行った。タンパク質電気泳動後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を３００ｍＡの電流を用いて１時間ニトロセルロース膜に転写した。続いて、ニトロセルロース膜をブロッキングバッファーを用いて３０分から一晩ブロッキングし、続いてＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで５分ずつ６回洗浄した。目的のタンパク質を、ヒトＩＬ－１１に対するカゼインブロック希釈（１：２，０００）一次抗体（ヤギＩｇＧ）と共に室温で１時間インキュベートすることによって膜上で検出した。膜をＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで４分ずつ６回洗浄した後、膜を、ヤギＩｇＧに対するカゼインブロック希釈（１：３，０００）二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。膜を浅いトレイに移し、製造業者の手順に従って１ステップのウルトラＴＭＢと共にインキュベートした。発色の過程を注意深くモニターし、所望の強度のバンドが達成されたときに水中で短時間洗浄した。
【0061】
ｒｈＩＬ－１１の精製
水性二相抽出
可溶性であるがミスフォールディングされたｒｈＩＬ－１１は、水性二相抽出によって発酵培地から沈殿した。固形ＰＥＧ８０００を発酵培地の濾液に直接添加して、６％～８％（ｗ／ｖ）の最終濃度を得た。固体ポリマーを穏やかに攪拌することによって完全に溶解させ、続いて１０分間４，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿タンパク質を回収した。
水性二相抽出
可溶性であるがミスフォールディングされたｒｈＩＬ－１１は、水性二相抽出によって発酵培地から沈殿した。固形ＰＥＧ８０００を発酵培地の濾液に直接添加して、６％～８％（ｗ／ｖ）の最終濃度を得た。固体ポリマーを穏やかに攪拌することによって完全に溶解させ、続いて１０分間４，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿タンパク質を回収した。
【0062】
ｒｈＩＬ－１１のリフォールディング
沈殿したタンパク質を、７Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｄＨＣｌ）ｐＨ８～９バッファーを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウムに最終濃度２ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、室温で１時間インキュベートした。１１倍容量の４ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）を添加してＧｄＨＣｌを希釈し、溶液を室温で２時間インキュベートすることによって変性タンパク質を適切にリフォールディングさせた。イオン交換クロマトグラフィーに供する前に、得られた溶液を、４ｍＭリン酸バッファーを用いて、限外濾過または透析を用いた単純希釈またはバッファー交換によって希釈して、６．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を得た。
沈殿したタンパク質を、７Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｄＨＣｌ）ｐＨ８～９バッファーを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウムに最終濃度２ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、室温で１時間インキュベートした。１１倍容量の４ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）を添加してＧｄＨＣｌを希釈し、溶液を室温で２時間インキュベートすることによって変性タンパク質を適切にリフォールディングさせた。イオン交換クロマトグラフィーに供する前に、得られた溶液を、４ｍＭリン酸バッファーを用いて、限外濾過または透析を用いた単純希釈またはバッファー交換によって希釈して、６．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を得た。
【0063】
カチオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーは、市販のクロマトグラフィー装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ）を使用して実施した。クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、得られた希釈液を、０．４５または０．２μｍ膜を通して遠心分離または濾過して、微粒子を除去した。混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８を含むバッファーＡで平衡させたＣａｐｔｏ Ｓカラムに負荷した。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８および１Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーＢのグラジエント溶出またはステップ溶出で溶出させた。
イオン交換クロマトグラフィーは、市販のクロマトグラフィー装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ）を使用して実施した。クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、得られた希釈液を、０．４５または０．２μｍ膜を通して遠心分離または濾過して、微粒子を除去した。混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８を含むバッファーＡで平衡させたＣａｐｔｏ Ｓカラムに負荷した。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８および１Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーＢのグラジエント溶出またはステップ溶出で溶出させた。
【0064】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
市販のクロマトグラフィー装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ）を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。カチオン交換体（ＣａｐｔｏＳ）からのｒｈＩＬ－１１を含有する画分をプールし、５ｍＭのＤＬ－メチオニンを含む０．５Ｍの硫酸アンモニウムに添加した。得られた希釈液を、サンプル負荷の前に、０．４５または０．２μｍの膜を通して遠心分離または濾過して微粒子を除去した。混合物を、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファー中に０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび５ｍＭ ＤＬ－メチオニンを含有するバッファーＡで平衡化したＢｕｔｙｌ ＨＰカラムに負荷した。タンパク質を、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーを含有するバッファーＢのステップ溶出またはグラジエント溶出で溶出した。強く結合したｒｈＩＬ－１１を溶出するために、さらに０．２Ｍ酢酸を用いた。
市販のクロマトグラフィー装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ）を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。カチオン交換体（ＣａｐｔｏＳ）からのｒｈＩＬ－１１を含有する画分をプールし、５ｍＭのＤＬ－メチオニンを含む０．５Ｍの硫酸アンモニウムに添加した。得られた希釈液を、サンプル負荷の前に、０．４５または０．２μｍの膜を通して遠心分離または濾過して微粒子を除去した。混合物を、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファー中に０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび５ｍＭ ＤＬ－メチオニンを含有するバッファーＡで平衡化したＢｕｔｙｌ ＨＰカラムに負荷した。タンパク質を、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーを含有するバッファーＢのステップ溶出またはグラジエント溶出で溶出した。強く結合したｒｈＩＬ－１１を溶出するために、さらに０．２Ｍ酢酸を用いた。
【0065】
サイズ排除クロマトグラフィーにより決められる純度
他の高分子量種に加えて、共有結合的および非共有結合的に凝集したｒｈＩＬ－１１の含有量を、ダイオードアレイ検出器を備えた市販のＵＰＬＣシステム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣシステム）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。クロマトグラフィー手順は以下を用いて実施した。
他の高分子量種に加えて、共有結合的および非共有結合的に凝集したｒｈＩＬ－１１の含有量を、ダイオードアレイ検出器を備えた市販のＵＰＬＣシステム（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣシステム）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。クロマトグラフィー手順は以下を用いて実施した。
【0066】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ、３００Ａ（オングストローム）孔径（部品番号１８６００５２２５）、ガードカートリッジ（部品番号１８６００５７９３）を装備
移動相：０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０
流速：０．３ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ
停止時間：１０分
タンパク質５μｇの注入
移動相：０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０
流速：０．３ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ
停止時間：１０分
タンパク質５μｇの注入
【0067】
ＬＣ／ＭＳによって決められる純度および分子量
ｒｈＩＬ－１１の純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４０ ＵＨＤ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦＬＣ／ＭＳシステムに接続されたダイオードアレイ検出器を備えた（ａ）ＵＰＬＣ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＰＬＣシステム）を使用する逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって分析した。クロマトグラフィー手順は以下の手順を用いて実施した。
ｒｈＩＬ－１１の純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４０ ＵＨＤ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦＬＣ／ＭＳシステムに接続されたダイオードアレイ検出器を備えた（ａ）ＵＰＬＣ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＰＬＣシステム）を使用する逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって分析した。クロマトグラフィー手順は以下の手順を用いて実施した。
【0068】
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＰＳＴ Ｃ１８カラム、３００Ａ（オングストローム）孔径、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（部品番号１８６００３６８７）、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－カラム、３００Ａ（オングストローム）孔径、１．７μｍ、２．１×５ｍｍ（部品番号１８６００４６２９）
移動相とグラジエント：移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
流速：０．４ｍｌ／分
カラム温度：周囲温度
検出：２１４ｎｍ
注入量：５μｇ
移動相とグラジエント：移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
流速：０．４ｍｌ／分
カラム温度：周囲温度
検出：２１４ｎｍ
注入量：５μｇ
【0069】
グラジエント－典型的な溶媒グラジエントを表２に示す。
【0070】
【表2】
【0071】
質量分析の操作パラメータは以下の通りであった。
ｍ／ｚ範囲と極性：１５０－３０００陽性
供給元パラメータ：ガス温度３００℃；ガス流量８Ｌ／分
ネブライザー ３５ｐｓｉｇ
シースガス温度３８０℃；シースガス流量 １１Ｌ／分
スキャンソースパラメータ：
ＶＣａｐ＝３５００
ノズル電圧 １，０００Ｖ
フラグメンター １７５
スキマー（Ｓｋｉｍｍｅｒｌ） ６５
ＯｃｔｏｐｏｌｅＲＦＰｅａｋ ７５０
ｍ／ｚ範囲と極性：１５０－３０００陽性
供給元パラメータ：ガス温度３００℃；ガス流量８Ｌ／分
ネブライザー ３５ｐｓｉｇ
シースガス温度３８０℃；シースガス流量 １１Ｌ／分
スキャンソースパラメータ：
ＶＣａｐ＝３５００
ノズル電圧 １，０００Ｖ
フラグメンター １７５
スキマー（Ｓｋｉｍｍｅｒｌ） ６５
ＯｃｔｏｐｏｌｅＲＦＰｅａｋ ７５０
【0072】
細胞ベースのバイオアッセイ
ｒｈＩＬ－１１の生物学的活性は、７ＴＤ１細胞ラインを用いて細胞増殖アッセイにおいて計算された。ＩＬ－１１参照標準および未知のサンプルを無菌的に希釈し、濃度範囲を１０倍の２０，０００ｎｇ／ｍｌ～０．２ｐｇ／ｍｌにした（合計９希釈）。５０μＬのｒｈＩＬ－１１標準またはサンプルを、ウェルあたり４，０００細胞で７ＴＤ１細胞を含有するウェル（例えば、９６ウェルプレートのウェル）に２度添加した。細胞を５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃でインキュベートして、２μｇ／ｍＬのＩＬ－１１受容体の存在下で３日間、異なるＩＬ－１１濃度に対するそれらの応答を特徴付けた（１２）。細胞増殖アッセイのために、マルチチャンネルピペットを用いてウェル当たり２０μＬのＭＴＳ溶液をウェルに分配し、信号発信に応じて、３７℃のインキュベーターにおいて２．５～３時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートおよびキュベット分光光度計（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ）を用いて４９０ｎｍでの吸光度について読み取った。
ｒｈＩＬ－１１の生物学的活性は、７ＴＤ１細胞ラインを用いて細胞増殖アッセイにおいて計算された。ＩＬ－１１参照標準および未知のサンプルを無菌的に希釈し、濃度範囲を１０倍の２０，０００ｎｇ／ｍｌ～０．２ｐｇ／ｍｌにした（合計９希釈）。５０μＬのｒｈＩＬ－１１標準またはサンプルを、ウェルあたり４，０００細胞で７ＴＤ１細胞を含有するウェル（例えば、９６ウェルプレートのウェル）に２度添加した。細胞を５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃でインキュベートして、２μｇ／ｍＬのＩＬ－１１受容体の存在下で３日間、異なるＩＬ－１１濃度に対するそれらの応答を特徴付けた（１２）。細胞増殖アッセイのために、マルチチャンネルピペットを用いてウェル当たり２０μＬのＭＴＳ溶液をウェルに分配し、信号発信に応じて、３７℃のインキュベーターにおいて２．５～３時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートおよびキュベット分光光度計（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ）を用いて４９０ｎｍでの吸光度について読み取った。
【0073】
４パラメータの非線形ロジスティック方程式に対して、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍ６を用いて、シグモイド用量－反応曲線を適合させることにより、ｘ軸の濃度に対してｙ軸の４９０ｎｍの吸光度をプロットすることによって、用量反応曲線のＥＣ５０（最大有効濃度の半分）を決定する。
ｙ＝（（ａ－ｄ）／（ｌ＋（ｘ／ｃ）ｂ））＋ｄ
ここで、
ａは、濃度がゼロに近づくにつれての最小漸近線のｙ軸である；ｂはその曲線のグラジエントを表すグラジエントである
ｃはＥＣ５０である
ｄは、濃度が無限大に近づくにつれての最大漸近線のｙ軸である
ｘは濃度である
ｙは４９０ｎｍにおける吸光度である
比生物活性は以下の式から導かれる。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（基準比活性）×（ＥＣ５０基準／ＥＣ５０サンプル）
ｙ＝（（ａ－ｄ）／（ｌ＋（ｘ／ｃ）ｂ））＋ｄ
ここで、
ａは、濃度がゼロに近づくにつれての最小漸近線のｙ軸である；ｂはその曲線のグラジエントを表すグラジエントである
ｃはＥＣ５０である
ｄは、濃度が無限大に近づくにつれての最大漸近線のｙ軸である
ｘは濃度である
ｙは４９０ｎｍにおける吸光度である
比生物活性は以下の式から導かれる。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（基準比活性）×（ＥＣ５０基準／ＥＣ５０サンプル）
【0074】
円偏光二色性による二次構造の特徴付け
遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、室温で光路長１．０ｃｍの石英セルを用いてＪａｓｃｏＪ－８１５分光偏光計を用いて記録した。タンパク質サンプルを、脱イオン水または５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて約０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した。二次構造を、それぞれ１００ｎｍ／分、１ｎｍおよび２秒に設定された走査速度、帯域幅および反応を含む操作パラメータを用いて遠ＵＶ領域（１９０ｎｍ～２５０ｎｍ）でモニターした。スペクトルは３回の走査の平均から得た。
遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、室温で光路長１．０ｃｍの石英セルを用いてＪａｓｃｏＪ－８１５分光偏光計を用いて記録した。タンパク質サンプルを、脱イオン水または５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて約０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した。二次構造を、それぞれ１００ｎｍ／分、１ｎｍおよび２秒に設定された走査速度、帯域幅および反応を含む操作パラメータを用いて遠ＵＶ領域（１９０ｎｍ～２５０ｎｍ）でモニターした。スペクトルは３回の走査の平均から得た。
【0075】
ペプチドマッピング
タンパク質分解溶液を、配列決定グレードの１／１００（ｗ／ｗ）トリプシンを添加することによって、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファー中で調製した。室温で６時間インキュベートした後、ＴＦＡ（またはギ酸）を導入して最終濃度０．１％にして反応を停止させた。沈殿物を、注入の前に、０．２または０．４μｍの膜を介して遠心分離または濾過によって除去した。Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４０ ＵＨＤ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステムと組み合わせたＬＣ／ＭＳシステム－Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ 無限ＵＰＬＣシステムを用いてペプチド同定を行った。クロマトグラフィー手順は以下のように実施した。
タンパク質分解溶液を、配列決定グレードの１／１００（ｗ／ｗ）トリプシンを添加することによって、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファー中で調製した。室温で６時間インキュベートした後、ＴＦＡ（またはギ酸）を導入して最終濃度０．１％にして反応を停止させた。沈殿物を、注入の前に、０．２または０．４μｍの膜を介して遠心分離または濾過によって除去した。Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４０ ＵＨＤ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステムと組み合わせたＬＣ／ＭＳシステム－Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ 無限ＵＰＬＣシステムを用いてペプチド同定を行った。クロマトグラフィー手順は以下のように実施した。
【0076】
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ８、２．１×１５０ｍｍ、５μｍ、３００Ａ（オングストローム）孔径（Ａｇｉｌｅｎｔ部品番号８８３７５０－９０６）
移動相とグラジエント：移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ；移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／分
検出：２１４ｎｍ
注入量：１０μｇ
移動相とグラジエント：移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ；移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／分
検出：２１４ｎｍ
注入量：１０μｇ
【0077】
グラジエント－典型的な溶媒グラジエントを表３に示す。
【0078】
【表3】
【0079】
質量分析の操作パラメータは以下の通りであった。
ｍ／ｚ範囲と極性：４００－１７００陽性
ソースパラメータ：
ガス温度 ３００℃
ガス流量 ８Ｌ／分
ネブライザー ３５ｐｓｉｇ
シースガス温度 ３５０℃
シースガス流量 １１Ｌ／分
スキャンソースパラメータ：
ＶＣａｐ＝３５００
ノズル電圧 １，０００Ｖ
フラグメンター １７５
スキマー １６５
ｍ／ｚ範囲と極性：４００－１７００陽性
ソースパラメータ：
ガス温度 ３００℃
ガス流量 ８Ｌ／分
ネブライザー ３５ｐｓｉｇ
シースガス温度 ３５０℃
シースガス流量 １１Ｌ／分
スキャンソースパラメータ：
ＶＣａｐ＝３５００
ノズル電圧 １，０００Ｖ
フラグメンター １７５
スキマー １６５
【0080】
【表4】
【0081】
トリプシンによって切断されたタンパク質分解性ペプチドの推定分子量を表１に列挙する。各タンパク質分解性ペプチドの同定は、ｍ／ｚスペクトルでのペプチドの断片化から生じる可能性のある断片イオンを生成するＭＳ Ｐｒｏｄｕｃｔツールを用いて手動で行った。組換えＩＬ－１１から得られたトリプシン処理ペプチドを表５に示す。
【0082】
【表5】
【0083】
アミノ酸組成
アミノ酸組成は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅｄ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｌ－８９００を用いて決定した。これはイオン交換機構とそれに続くニンヒドリンでの誘導体化による加水分解アミノ酸の分離を提供する。加水分解の前に、タンパク質サンプルを１ｍｇ／ｍＬで３回調製し、窒素雰囲気下、６ＮのＨＣｌ、１１０℃の条件下で２２時間加水分解した。８０℃の水浴中で蒸発させた後、加水分解したサンプルを０．０２ＮのＨＣｌに再懸濁した。そのような酸性加水分解条件下で、アスパラギンおよびグルタミンは脱アミド化され、それらのそれぞれの酸を形成する。トリプトファンは完全に分解されている。システインおよびメチオニンは酸化されており、酸加水分解物から容易には検出されない。チロシン、セリンおよびスレオニンは部分的に加水分解されている（１３）。
アミノ酸組成は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅｄ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｌ－８９００を用いて決定した。これはイオン交換機構とそれに続くニンヒドリンでの誘導体化による加水分解アミノ酸の分離を提供する。加水分解の前に、タンパク質サンプルを１ｍｇ／ｍＬで３回調製し、窒素雰囲気下、６ＮのＨＣｌ、１１０℃の条件下で２２時間加水分解した。８０℃の水浴中で蒸発させた後、加水分解したサンプルを０．０２ＮのＨＣｌに再懸濁した。そのような酸性加水分解条件下で、アスパラギンおよびグルタミンは脱アミド化され、それらのそれぞれの酸を形成する。トリプトファンは完全に分解されている。システインおよびメチオニンは酸化されており、酸加水分解物から容易には検出されない。チロシン、セリンおよびスレオニンは部分的に加水分解されている（１３）。
【0084】
高細胞密度発酵
下流精製実行のために研究作業用セルバンクのバイアルから解凍されたプロテアーゼ欠損株（ｐＰＩＮＫＳ１－ＩＬ１１－２４）を接種した１－Ｌ発酵槽中でグリセロール供給バッチ発酵を行った。典型的な細胞増殖曲線を図１Ａに示す。図１Ａは、グリセロールの追加供給後に２００ＯＤを達成した細胞培養物を示す。細胞密度は、メタノール誘導後も２５０ＯＤまで成長し続けたが、おそらく栄養素が不十分なため、誘導後２２時間後には徐々に低下した。発酵ブロスのサンプルを、誘導時点の２２時間後、４６時間後、および７０時間後に採取し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。図１Ｂ図および図１Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングの典型的な結果をそれぞれ示す。この方法は一貫して生産性を過小評価することが見出されたので、発現レベルはＥＬＩＳＡによって決定されなかった。代わりに、ｒｈＩＬ－１１の生産性は、目視検査またはデンシトメトリーのいずれかによって、参照標準のものと比較したクーマシーブルー染色の強度によって推定され、約０．４～０．６ｇ／Ｌを生じることが見出された。クーマシーブルー染色によって行われるＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、約１５ＫＤのｒｈＩＬ－１１（約２０ＫＤ）の位置より下にいくつかの明らかなバンドがあり（図１Ｂ）、ｒｈＩＬ－に対する抗体を用いたイムノブロッティングによって検証されるように分解種であった（図１Ｃ）。ＲＰ－ＨＰＬＣにより決定された発酵培地の発現生産性は、約０．４ｍｇ／ｍＬであった。
下流精製実行のために研究作業用セルバンクのバイアルから解凍されたプロテアーゼ欠損株（ｐＰＩＮＫＳ１－ＩＬ１１－２４）を接種した１－Ｌ発酵槽中でグリセロール供給バッチ発酵を行った。典型的な細胞増殖曲線を図１Ａに示す。図１Ａは、グリセロールの追加供給後に２００ＯＤを達成した細胞培養物を示す。細胞密度は、メタノール誘導後も２５０ＯＤまで成長し続けたが、おそらく栄養素が不十分なため、誘導後２２時間後には徐々に低下した。発酵ブロスのサンプルを、誘導時点の２２時間後、４６時間後、および７０時間後に採取し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。図１Ｂ図および図１Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングの典型的な結果をそれぞれ示す。この方法は一貫して生産性を過小評価することが見出されたので、発現レベルはＥＬＩＳＡによって決定されなかった。代わりに、ｒｈＩＬ－１１の生産性は、目視検査またはデンシトメトリーのいずれかによって、参照標準のものと比較したクーマシーブルー染色の強度によって推定され、約０．４～０．６ｇ／Ｌを生じることが見出された。クーマシーブルー染色によって行われるＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、約１５ＫＤのｒｈＩＬ－１１（約２０ＫＤ）の位置より下にいくつかの明らかなバンドがあり（図１Ｂ）、ｒｈＩＬ－に対する抗体を用いたイムノブロッティングによって検証されるように分解種であった（図１Ｃ）。ＲＰ－ＨＰＬＣにより決定された発酵培地の発現生産性は、約０．４ｍｇ／ｍＬであった。
【0085】
カチオン交換クロマトグラフィーを用いるＩＬ－１１の捕捉
ＩＬ－１１の高い等電点（ｐＩ＝１１）を考慮して、ｐＨ８で発酵培地からｒｈＩＬ－１１を捕捉するためにカチオン交換クロマトグラフィーを試みた。遠心分離によって細胞ペーストを除去した後、数百ミリリットルのブロスを限外濾過によるバッファー交換に供するか、または少なくとも１０容量の水で直接希釈して３ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を得た。ｒｈＩＬ－１１を回収するために、約２ミリグラムのｒｈＩＬ－１１に相当する少量の溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８バッファーで予め平衡化した１ｍＬのＣａｐｔｏ－Ｓカラム（カチオン交換体）に負荷した。結合タンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌまでのＮａＣｌグラジエントで溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングの結果は、ｒｈＩＬ－１１がフロースルー画分中に見出されカラムに結合しなかったことを示した（データは示さず）。カチオン交換体を用いる精製システムの適合性を確実にするために、陽性対照として０．５ｍｇの参照ｒｈＩＬ－１１を１ｍＬ発酵ブロス中にスパイクし、続いて前述の精製手順を行った。約３０％の回収率は、同じ方法でＮａＣｌグラジエントによってうまく溶出されたので、ｒｈＩＬ－１１を単離するためのカチオン交換体の適合性を示唆した。フロースルー物質の回収による陰イオン交換体（Ｃａｐｔｏ－Ｑ）を用いた単離を試みた。約２ミリグラムのｒｈＩＬ－１１に相当する少量の溶液を１ｍＬのＣａｐｔｏ－Ｑカラム（陰イオン交換体）に負荷して、フロースルーでｒｈＩＬ－１１を回収した。カラムは予め２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８バッファーで平衡化した後、１Ｍ ＮａＣｌまでのＮａＣｌグラジエントで溶出した。驚くべきことに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＮａＣｌ含有画分中のｒｈＩＬ－１１の成功した回収を示したが、フロースルー中ではそうではなかった（データ示さず）。この精製プロセスを繰り返して、一貫した再現性のある結果を導き、発現されたｒｈＩＬ－１１の予想外のイオン特性を確認した。
ＩＬ－１１の高い等電点（ｐＩ＝１１）を考慮して、ｐＨ８で発酵培地からｒｈＩＬ－１１を捕捉するためにカチオン交換クロマトグラフィーを試みた。遠心分離によって細胞ペーストを除去した後、数百ミリリットルのブロスを限外濾過によるバッファー交換に供するか、または少なくとも１０容量の水で直接希釈して３ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を得た。ｒｈＩＬ－１１を回収するために、約２ミリグラムのｒｈＩＬ－１１に相当する少量の溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８バッファーで予め平衡化した１ｍＬのＣａｐｔｏ－Ｓカラム（カチオン交換体）に負荷した。結合タンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌまでのＮａＣｌグラジエントで溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングの結果は、ｒｈＩＬ－１１がフロースルー画分中に見出されカラムに結合しなかったことを示した（データは示さず）。カチオン交換体を用いる精製システムの適合性を確実にするために、陽性対照として０．５ｍｇの参照ｒｈＩＬ－１１を１ｍＬ発酵ブロス中にスパイクし、続いて前述の精製手順を行った。約３０％の回収率は、同じ方法でＮａＣｌグラジエントによってうまく溶出されたので、ｒｈＩＬ－１１を単離するためのカチオン交換体の適合性を示唆した。フロースルー物質の回収による陰イオン交換体（Ｃａｐｔｏ－Ｑ）を用いた単離を試みた。約２ミリグラムのｒｈＩＬ－１１に相当する少量の溶液を１ｍＬのＣａｐｔｏ－Ｑカラム（陰イオン交換体）に負荷して、フロースルーでｒｈＩＬ－１１を回収した。カラムは予め２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８バッファーで平衡化した後、１Ｍ ＮａＣｌまでのＮａＣｌグラジエントで溶出した。驚くべきことに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＮａＣｌ含有画分中のｒｈＩＬ－１１の成功した回収を示したが、フロースルー中ではそうではなかった（データ示さず）。この精製プロセスを繰り返して、一貫した再現性のある結果を導き、発現されたｒｈＩＬ－１１の予想外のイオン特性を確認した。
【0086】
本発明者らは、細胞ベースの増殖アッセイにおけるｒｈＩＬ－１１の弱い生物活性および発酵培地のサンプルを使用する場合のＥＬＩＳＡ定量化を用いたｒｈＩＬ－１１含有量の過小評価に注目した。興味深いことに、発酵ブロスを参照ｒｈＩＬ－１１で過剰投与したときに生物活性は回復した（データは示さず）。本発明者らは、イオン交換体への予期せぬ結合（またはその欠如）および生物活性の喪失が発現タンパク質の物理的性質の変化を示していると結論付けた。
【0087】
液体二相抽出
さらなる調査の前に、発現されたタンパク質は単純な水性二相抽出によって発酵培地から回収された。ポリエチレングリコール８０００を添加することにより、抽出を展開して液相から非天然ｒｈＩＬ－１１を沈殿させた。固体ＰＥＧ－８０００を１ｍＬの濾過発酵ブロスに添加して、それぞれ、２．９、３．８、５．０、６．２、７．３および８．２％（ｗ／ｖ）を得た。４℃で１時間インキュベートした後、６．２、７．３および８．２％のＰＥＧ８０００を含有するサンプルにおいてのみ濁りが可視化された。卓上型遠心分離機を用いて最高速度で５分間遠心分離することによって沈殿物を収集し、沈殿したタンパク質を１ｍＬのｐＨ８のリン酸ナトリウムバッファーで再構成した。図２に示すように、わずか６％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００を添加することによって、ほとんど全てのｒｈＩＬ－１１を沈殿物から回収することができた。その後の研究において、特に明記しない限り、ｒｈＩＬ－１１は、ＰＥＧを用いた沈殿によって培地から回収された。
さらなる調査の前に、発現されたタンパク質は単純な水性二相抽出によって発酵培地から回収された。ポリエチレングリコール８０００を添加することにより、抽出を展開して液相から非天然ｒｈＩＬ－１１を沈殿させた。固体ＰＥＧ－８０００を１ｍＬの濾過発酵ブロスに添加して、それぞれ、２．９、３．８、５．０、６．２、７．３および８．２％（ｗ／ｖ）を得た。４℃で１時間インキュベートした後、６．２、７．３および８．２％のＰＥＧ８０００を含有するサンプルにおいてのみ濁りが可視化された。卓上型遠心分離機を用いて最高速度で５分間遠心分離することによって沈殿物を収集し、沈殿したタンパク質を１ｍＬのｐＨ８のリン酸ナトリウムバッファーで再構成した。図２に示すように、わずか６％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００を添加することによって、ほとんど全てのｒｈＩＬ－１１を沈殿物から回収することができた。その後の研究において、特に明記しない限り、ｒｈＩＬ－１１は、ＰＥＧを用いた沈殿によって培地から回収された。
【0088】
発酵培地中の分泌ｒｈＩＬ－１１の構造的特徴
円偏光二色性（ＣＤ）とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて構造特性を研究した。発酵培地に８％のＰＥＧ８０００を添加することによって液体二相抽出から回収された沈殿ｒｈＩＬ－１１を約０．０２ｍｇ／ｍＬで脱イオン水に再懸濁した。典型的なＣＤスペクトルを図３に示す。これは、有意ならせん構造（約２２２ｎｍおよび２１０ｎｍでの負のバンド、および約１９５ｎｍでの正のバンドによって示されるように）を明らかにしている。これは、粗ｒｈＩＬ－１１がらせん状の骨格を維持していたことを示唆している。
円偏光二色性（ＣＤ）とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて構造特性を研究した。発酵培地に８％のＰＥＧ８０００を添加することによって液体二相抽出から回収された沈殿ｒｈＩＬ－１１を約０．０２ｍｇ／ｍＬで脱イオン水に再懸濁した。典型的なＣＤスペクトルを図３に示す。これは、有意ならせん構造（約２２２ｎｍおよび２１０ｎｍでの負のバンド、および約１９５ｎｍでの正のバンドによって示されるように）を明らかにしている。これは、粗ｒｈＩＬ－１１がらせん状の骨格を維持していたことを示唆している。
【0089】
サイズ排除試験のために、ＰＥＧ沈殿タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファー中に約１ｍｇ／ｍＬの濃度に再懸濁した。分子サイズは、１０Ｋ～４５０ＫＤａの範囲の球状タンパク質を分離することができるＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラムを使用してｒｈＩＬ－１１の参照標準と比較した。図４に見られるような結果は、発酵培地からの粗ｒｈＩＬ－１１が予想外に高い分子量を有することを示している。これは分泌されたｒｈＩＬ－１１が培養ブロス中に可溶性凝集体として存在することを示唆している。ＣＤデータと組み合わせると、分泌されたｒｈＩＬ－１１のらせん構造は維持されるが、単量体分子は互いに非共有結合的に会合して分子間らせん状束を形成する傾向があると考えられる。発明者は、理論に縛られることはないが、これが元のプロセスにおける低収率の原因であり、その結果、物理化学的特性の変化および生物活性の喪失をもたらすと考えている。
【0090】
発酵培地中で非イオン性界面活性剤を使用した自己凝集の防止
ピキア・パストリスは真核生物のフォールディング経路を介してタンパク質を発現するが、高密度酵母培養物における自己凝集およびミスフォールディングされた分泌型ｒｈＩＬ－１１はこれまでに報告されていない。凝集形態は、生物活性の喪失および下流の精製工程における低収率などの重大な問題を引き起こす。凝集を防ぐ一つの戦略は、発酵培地に添加物や界面活性剤を導入することである（１４）。これを調べるために、０．１％のＴｗｅｅｎ－８０を１Ｌの高密度流加発酵培地に導入した。回収後、１３０ｍＬの発酵培地に１０倍の水を加えて導電率を下げた。０．４５または０．２μｍの膜を介して単純濾過により粒子状物質を除去した後、得られた溶液を、カチオン交換体（Ｃａｐｔｏ－Ｓ）に負荷して生物活性ｒｈＩＬ－１１を回収した。典型的な精製プロファイルを図５に示す。カラムに負荷した後、カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーで洗浄し、続いてカラム容量の１０倍以上の５０～３００ｍＭ ＮａＣｌグラジエントで洗浄した。ｒｈＩＬ－１１を含む画分を、選択された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定されるように合わせたところ、１３．６％の工程収率が得られた。その知見は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０が発酵中の自己凝集をある程度減少できることを示唆したが、生物活性ｒｈＩＬ－１１の回収は満足できないかもしれない。
ピキア・パストリスは真核生物のフォールディング経路を介してタンパク質を発現するが、高密度酵母培養物における自己凝集およびミスフォールディングされた分泌型ｒｈＩＬ－１１はこれまでに報告されていない。凝集形態は、生物活性の喪失および下流の精製工程における低収率などの重大な問題を引き起こす。凝集を防ぐ一つの戦略は、発酵培地に添加物や界面活性剤を導入することである（１４）。これを調べるために、０．１％のＴｗｅｅｎ－８０を１Ｌの高密度流加発酵培地に導入した。回収後、１３０ｍＬの発酵培地に１０倍の水を加えて導電率を下げた。０．４５または０．２μｍの膜を介して単純濾過により粒子状物質を除去した後、得られた溶液を、カチオン交換体（Ｃａｐｔｏ－Ｓ）に負荷して生物活性ｒｈＩＬ－１１を回収した。典型的な精製プロファイルを図５に示す。カラムに負荷した後、カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーで洗浄し、続いてカラム容量の１０倍以上の５０～３００ｍＭ ＮａＣｌグラジエントで洗浄した。ｒｈＩＬ－１１を含む画分を、選択された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定されるように合わせたところ、１３．６％の工程収率が得られた。その知見は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０が発酵中の自己凝集をある程度減少できることを示唆したが、生物活性ｒｈＩＬ－１１の回収は満足できないかもしれない。
【0091】
ｒｈＩＬ－１１復元のためのリフォールディングの最適化
溶液中のタンパク質のリフォールディングは、イオン強度、ｐＨ、温度、タンパク質濃度などを含む多くの物理化学的要因の結果である。尿素、硫酸アンモニウム、ＳＤＳおよびグアニジン塩酸塩（ＧｄＨＣｌ）は、ｒｈＩＬ－１１のリフォールディングプロセスに有用であり得る変性剤として研究された。ＰＥＧ沈殿後に２ｍＬの発酵培地からタンパク質を沈殿させ、それぞれの変性剤含有バッファー：８Ｍ尿素、１Ｍ硫酸アンモニウム、０．５％ ＳＤＳまたは６Ｍ ＧｄＨＣｌで５ｍｇ／ｍＬに再構成した。５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を達成するために水で希釈した後、天然および生物学的に活性なｒｈＩＬ－１１のみがカチオン交換体に吸着され、ＮａＣｌ塩グラジエントによって溶出されると予想される。結果は、図６に示されるように、６ＭのＧｄＨＣｌを除いて、変性剤がｒｈＩＬ－１１を再生することに失敗したことを示した（これは、６Ｍ ＧｄＨＣｌを含むリフォールディング溶液からのｒｈＩＬ－１１がＮａＣｌグラジエントを用いて首尾よく溶出されたことを示す）。他の研究では、ＰＥＧ沈殿後に２ｍＬの発酵培地から沈殿したタンパク質が、０．１Ｎ ＮａＯＨ、７０％のエタノールを含む０．１Ｎ ＮａＯＨ、または１％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｎ ＮａＯＨからなるアルカリ溶液２ｍＬに溶解した。水で希釈し、ｐＨをｐＨ８に調整した後、カチオン交換体は、そのような溶液から天然ｒｈＩＬ－１１をほとんど回収しなかった。結果は、本発明の概念の好ましい実施形態において、グアニジン塩酸塩を用いてｒｈＩＬ－１１を高収率で首尾よく再生することができることを示唆している。
溶液中のタンパク質のリフォールディングは、イオン強度、ｐＨ、温度、タンパク質濃度などを含む多くの物理化学的要因の結果である。尿素、硫酸アンモニウム、ＳＤＳおよびグアニジン塩酸塩（ＧｄＨＣｌ）は、ｒｈＩＬ－１１のリフォールディングプロセスに有用であり得る変性剤として研究された。ＰＥＧ沈殿後に２ｍＬの発酵培地からタンパク質を沈殿させ、それぞれの変性剤含有バッファー：８Ｍ尿素、１Ｍ硫酸アンモニウム、０．５％ ＳＤＳまたは６Ｍ ＧｄＨＣｌで５ｍｇ／ｍＬに再構成した。５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を達成するために水で希釈した後、天然および生物学的に活性なｒｈＩＬ－１１のみがカチオン交換体に吸着され、ＮａＣｌ塩グラジエントによって溶出されると予想される。結果は、図６に示されるように、６ＭのＧｄＨＣｌを除いて、変性剤がｒｈＩＬ－１１を再生することに失敗したことを示した（これは、６Ｍ ＧｄＨＣｌを含むリフォールディング溶液からのｒｈＩＬ－１１がＮａＣｌグラジエントを用いて首尾よく溶出されたことを示す）。他の研究では、ＰＥＧ沈殿後に２ｍＬの発酵培地から沈殿したタンパク質が、０．１Ｎ ＮａＯＨ、７０％のエタノールを含む０．１Ｎ ＮａＯＨ、または１％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｎ ＮａＯＨからなるアルカリ溶液２ｍＬに溶解した。水で希釈し、ｐＨをｐＨ８に調整した後、カチオン交換体は、そのような溶液から天然ｒｈＩＬ－１１をほとんど回収しなかった。結果は、本発明の概念の好ましい実施形態において、グアニジン塩酸塩を用いてｒｈＩＬ－１１を高収率で首尾よく再生することができることを示唆している。
【0092】
リフォールディングプロセスにおいて使用されるタンパク質濃度は、７Ｍ ＧｄＨＣｌ溶液中に様々なタンパク質濃度でＰＥＧタンパク質沈殿物を溶解することによって最適化された。２ｍＬの発酵培地からのタンパク質をＰＥＧ沈殿後に収集し、７Ｍ ＧｄＨＣｌ緩衝溶液中で様々なタンパク質濃度で再構成した。単純希釈によるリフォールディング後、各調製物のリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１を上記のようにカチオン交換体で単離した。リフォールディングの収率は、図７に示すように、観察されたピーク面積をｒｈＩＬ－１１の参照標準のそれと比較することによって評価した。結果は、試験した全ての濃度でリフォールディングが起こり、約２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で最適な広い収量が得られたことを示している。
【0093】
フォールディング促進剤または凝集抑制剤として作用する多くの共溶質を、タンパク質のリフォールディングを補助するために導入することができる。典型的な共溶質には、ＰＥＧ、シクロデキストリン、アルギニン、プロリン、およびスクロースが含まれる。これらの共溶質に対する作用機序は明らかではない。本発明者らは、リフォールディング溶液に添加された二つの共溶質、０．５Ｍ アルギニンおよび０．４Ｍ スクロースの効果を研究した。希釈によりリフォールディングされた後、各調製物のリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１を上記のようにカチオン交換体で単離した。リフォールディングの収率はピークの高さを評価することによって評価され（典型的な結果は図８に示される）、リフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の同様の収率を示す。本発明者らは、アルギニンもスクロースもｒｈＩＬ－１１のリフォールディングを促進しないこと、および共溶質の使用をｒｈＩＬ－１１精製プロセスから排除できることを見出した。これは下流の精製工程を有利に単純化する。
【0094】
リフォールディングのためのｐＨは、ＰＥＧ処理によって生成されたタンパク質沈殿物を様々なｐＨで溶解することによって最適化された。２ｍＬの発酵培地からのタンパク質を、異なるｐＨ値の７Ｍ ＧｄＨＣｌバッファー中でＰＥＧ沈殿物を２ｍｇ／ｍＬに再構成した後に回収した。対応するｐＨ溶液を用いた単純希釈によるリフォールディング後、各調製物のリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１を上記の手順を用いてカチオン交換体で単離した。リフォールディングの収率は、図９に示されるように、観察されたピーク面積をｒｈＩＬ－１１の参照標準によって生成されたものと比較することによって評価された。研究した全てのｐＨ値でリフォールディングが見られ、約ｐＨ８．５で広い最適値を示した。
【0095】
カチオン交換クロマトグラフィーを用いたリフォールディングされたｒｈＩＬ－１１の単離
カチオン交換培地を用いる単離は、約９４．２ｍｇの分泌型ｒｈＩＬ－１１を含有する２３６ｍＬの発酵培地を用いて調べた。タンパク質を８％ＰＥＧ８０００（ｗ／ｖ）で沈殿させ、４，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により回収した。上澄みを捨てた後、固相を、７Ｍ ＧｄＨＣｌを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファーで２ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度に再構成した。タンパク質溶液を室温で１時間穏やかに撹拌しながらインキュベートして完全に可溶化させた。再生／リフォールディングプロセスは、タンパク質溶液を１０倍容量のグアニジンを含まない４ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファーに注ぐことによって開始した。得られた溶液をさらに室温でさらに１時間インキュベートし、続いて限外濾過を用いてバッファーを交換するか、または追加のバッファーで直接希釈して、６ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を達成した。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを実施し、典型的な結果を図１０に示す。１２ｍｇ／ｍＬ樹脂のサンプル負荷でカラムに負荷した後、カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーを用いて洗浄し、続いて１０倍のカラム容量にわたって５０～３００ｍＭ ＮａＣｌグラジエントを適用した。ｒｈＩＬ－１１を含有する画分（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるように）をプール中で混合し、約４０％～約６０％の工程収率を得た。生成物を質量分析と組み合わせたＲＰ－ＵＰＬＣによっても分析して、精製タンパク質の分子量を解明した（図１１参照）。ＵＰＬＣで観察された主ピークのデコンボリューション質量は１９０４６．７Ｄａであり、１９，０４７ＤａのｒｈＩＬ－１１の理論平均質量と一致していた。液体クロマトグラムにおいてｒｈＩＬ－１１より先の小さなピーク（８．６％を占める）は、そのデコンボリューション質量がおよそ単一の酸素の質量に相当するｒｈＩＬ－１１のものより１５．８Ｄａ大きいため、酸化種を表すと考えられる（１６Ｄａ）。リフォールディングプロセス後の精製ｒｈＩＬ－１１は結果的に細胞ベースのアッセイに供され、再生プロセスによる活性の完全な回復を示唆している（データは示さず）。
カチオン交換培地を用いる単離は、約９４．２ｍｇの分泌型ｒｈＩＬ－１１を含有する２３６ｍＬの発酵培地を用いて調べた。タンパク質を８％ＰＥＧ８０００（ｗ／ｖ）で沈殿させ、４，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により回収した。上澄みを捨てた後、固相を、７Ｍ ＧｄＨＣｌを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファーで２ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度に再構成した。タンパク質溶液を室温で１時間穏やかに撹拌しながらインキュベートして完全に可溶化させた。再生／リフォールディングプロセスは、タンパク質溶液を１０倍容量のグアニジンを含まない４ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８バッファーに注ぐことによって開始した。得られた溶液をさらに室温でさらに１時間インキュベートし、続いて限外濾過を用いてバッファーを交換するか、または追加のバッファーで直接希釈して、６ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を達成した。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを実施し、典型的な結果を図１０に示す。１２ｍｇ／ｍＬ樹脂のサンプル負荷でカラムに負荷した後、カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーを用いて洗浄し、続いて１０倍のカラム容量にわたって５０～３００ｍＭ ＮａＣｌグラジエントを適用した。ｒｈＩＬ－１１を含有する画分（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるように）をプール中で混合し、約４０％～約６０％の工程収率を得た。生成物を質量分析と組み合わせたＲＰ－ＵＰＬＣによっても分析して、精製タンパク質の分子量を解明した（図１１参照）。ＵＰＬＣで観察された主ピークのデコンボリューション質量は１９０４６．７Ｄａであり、１９，０４７ＤａのｒｈＩＬ－１１の理論平均質量と一致していた。液体クロマトグラムにおいてｒｈＩＬ－１１より先の小さなピーク（８．６％を占める）は、そのデコンボリューション質量がおよそ単一の酸素の質量に相当するｒｈＩＬ－１１のものより１５．８Ｄａ大きいため、酸化種を表すと考えられる（１６Ｄａ）。リフォールディングプロセス後の精製ｒｈＩＬ－１１は結果的に細胞ベースのアッセイに供され、再生プロセスによる活性の完全な回復を示唆している（データは示さず）。
【0096】
Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムからの優勢なピークの後に溶出する小さなショルダー部をさらに調べた。ＭＳと組み合わせたＲＰ－ＵＰＬＣ分析は、ｒｈＩＬ－１１参照標準と同じ保持時間およびその理論質量と一致する分子量を有する単一ピークを示した（データは示さず）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析はまた、ｒｈＩＬ－１１参照標準と同一の移動位置を明らかにした（データは示さず）。溶出液として０．５ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、この小さなショルダー部は単一のピークよりもむしろダブレットとして溶出した。ダブレットの一つのピークは、天然のｒｈＩＬ－１１の保持時間と同一時間で溶出し、残りのピークはより早く溶出し、二量体形態であると考えられる（図１２参照）。０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いたその後の精製は潜在的にそのような凝集物を破壊することがあるので、これらの画分を主プールと合わせた。
【0097】
非動物起源のペプトンを発酵培地に添加することによる酸化型ｒｈＩＬ－１１の還元
タンパク質酸化は、好気性発酵中に酸素ラジカルなどの様々な形態の活性酸素種（ＲＯＳ）に絶えずさらされることから生じる、製造プロセス中の製品関連不純物の非常に一般的な原因である（基礎培地と窒素源としての０．９％硫酸アンモニウムを用いて行った）。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムから精製した後、得られた精製ｒｈＩＬ－１１の酸化されたｒｈＩＬ－１１含有量はＲＰ－ＵＰＬＣにより定量すると約１２．６％であった。酸化生成物の含有量を減らすために、硫酸アンモニウムを０．５％フィトンペプトンで置き換えた。フィトンペプトンは、窒素源を提供するだけでなく、発酵中のＲＯＳの形成を排除または減少させることができる硫黄含有アミノ酸を含む大豆ペプトンに由来する。本発明者らは、発酵培地に他の硫黄含有ペプチド、アミノ酸（例えばシステイン、メチオニン）、および／または有機化合物を補給することで同様の効果が得られると考えている。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムによる精製の後、改変発酵培地中で得られた酸化されたｒｈＩＬ－１１の量は、提案された許容基準５．０％に近い約６．６％に減少した。生成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて酸化されたｒｈＩＬ－１１を除去するための第二のクロマトグラフィー工程によりさらにポリッシュした。
タンパク質酸化は、好気性発酵中に酸素ラジカルなどの様々な形態の活性酸素種（ＲＯＳ）に絶えずさらされることから生じる、製造プロセス中の製品関連不純物の非常に一般的な原因である（基礎培地と窒素源としての０．９％硫酸アンモニウムを用いて行った）。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムから精製した後、得られた精製ｒｈＩＬ－１１の酸化されたｒｈＩＬ－１１含有量はＲＰ－ＵＰＬＣにより定量すると約１２．６％であった。酸化生成物の含有量を減らすために、硫酸アンモニウムを０．５％フィトンペプトンで置き換えた。フィトンペプトンは、窒素源を提供するだけでなく、発酵中のＲＯＳの形成を排除または減少させることができる硫黄含有アミノ酸を含む大豆ペプトンに由来する。本発明者らは、発酵培地に他の硫黄含有ペプチド、アミノ酸（例えばシステイン、メチオニン）、および／または有機化合物を補給することで同様の効果が得られると考えている。Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムによる精製の後、改変発酵培地中で得られた酸化されたｒｈＩＬ－１１の量は、提案された許容基準５．０％に近い約６．６％に減少した。生成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて酸化されたｒｈＩＬ－１１を除去するための第二のクロマトグラフィー工程によりさらにポリッシュした。
【0098】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる酸化されたｒｈＩＬ－１１の除去
Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムから溶出した画分の合わせたプールに、約５ｍＭの濃度を達成するために固体ＤＬ－メチオニンを導入し、約０．５Ｍの濃度を得るために固体硫酸アンモニウムを添加した。０．２または０．４５μｍ膜を通して濾過した後、得られたタンパク質溶液を、Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に８ｍｇ／ｍＬ総容積のサンプル負荷で負荷し、続いて、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝溶液で洗った。続いてカラムを、カラム体積の１５倍を超える０．４７５Ｍ硫酸アンモニウム含有バッファーで洗浄した。ポリッシュされたｒｈＩＬ－１１生成物を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーを用いて溶出した（図１３参照）。各画分の酸化されたｒｈＩＬ－１１含有量はＲＰ－ＵＰＬＣによって定量化され、酸化種の含有量の減少を示した。５％未満の酸化種を含む画分をプールし、約４９％の工程回収率を得た。
Ｃａｐｔｏ－Ｓカラムから溶出した画分の合わせたプールに、約５ｍＭの濃度を達成するために固体ＤＬ－メチオニンを導入し、約０．５Ｍの濃度を得るために固体硫酸アンモニウムを添加した。０．２または０．４５μｍ膜を通して濾過した後、得られたタンパク質溶液を、Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に８ｍｇ／ｍＬ総容積のサンプル負荷で負荷し、続いて、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝溶液で洗った。続いてカラムを、カラム体積の１５倍を超える０．４７５Ｍ硫酸アンモニウム含有バッファーで洗浄した。ポリッシュされたｒｈＩＬ－１１生成物を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーを用いて溶出した（図１３参照）。各画分の酸化されたｒｈＩＬ－１１含有量はＲＰ－ＵＰＬＣによって定量化され、酸化種の含有量の減少を示した。５％未満の酸化種を含む画分をプールし、約４９％の工程回収率を得た。
【0099】
バッファーの変化と濃度
Ｂｕｔｙｌ ＨＩＣカラムから溶出して得られた生成物は大量の硫酸アンモニウムを含有しており、続いてそれを１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーに対する入念な透析および／または限外濾過により除去した。冷蔵保管用に濃度を６ｍｇ／ｍＬ以上に調整した。
Ｂｕｔｙｌ ＨＩＣカラムから溶出して得られた生成物は大量の硫酸アンモニウムを含有しており、続いてそれを１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７バッファーに対する入念な透析および／または限外濾過により除去した。冷蔵保管用に濃度を６ｍｇ／ｍＬ以上に調整した。
【0100】
ｒｈＩＬ－１１生成物の特徴付け
最終精製バルクｒｈＩＬ－１１を、同一性、純度および効力を含む様々な分析にかけた。純度および相対分子量を、（図１４に示すように）１６％ゲルを用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、これは高純度で単一のバンドを示した。
最終精製バルクｒｈＩＬ－１１を、同一性、純度および効力を含む様々な分析にかけた。純度および相対分子量を、（図１４に示すように）１６％ゲルを用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、これは高純度で単一のバンドを示した。
【0101】
純度（および関連不純物）は、ＲＰ－ＵＰＬＣによって決定された。図１５に示すように、ｒｈＩＬ－１１の純度は９５％より高かった。ｒｈＩＬ－１１調製物は約２．５％の酸化されたｒｈＩＬ－１１を含有し、これは市販製品（Ｎｅｍｅｇａ）の２．４％含有量に匹敵する。単量体ｒｈＩＬ－１１含有量は、図１６に示すようにＳＥＣ－ＵＰＬＣによって定量し、純度は９９％であった。
【0102】
精製ｒｈＩＬ－１１の分子量はＬＣ－ＭＳによって決定され、１９，０４５．７Ｄａでデコンボリューション質量を示した（図１７参照）。これは、１９，０４７Ｄａの理論平均分子量とよく一致している（偏差－６８．２ｐｐｍ）。さらに、精製ｒｈＩＬ－１１のアミノ酸配列を、ＬＣ－ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングによって特徴付けた。タンパク質をトリプシンによって消化した。トリプシンはリジンおよびアルギニンアミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に加水分解した。各ピークの同一性は、ｍ／ｚ比およびＭＳ／ＭＳフラグメンテーションによって決定された。Ｔ１１、Ｔ１６およびＴ１９を除くすべてのタンパク質分解ペプチドが首尾よく割り当てられ（図１８に示すように）、８８．７％の配列範囲を提供した。
【0103】
Ｎ末端アミノ酸配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＬＣ４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）タンパク質配列決定システムを使用して決定し、最初の１５アミノ酸を以下のように確認した。Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｌａ。加水分解されたアミノ酸組成は、窒素下、１１０℃で２２時間、６Ｎ ＨＣｌ加水分解によるサンプル前処理の後に決定された。このような酸性加水分解条件下で、アスパラギンおよびグルタミンは脱アミド化されてそれぞれの酸を形成する。トリプトファンは完全に分解されている。システインおよびメチオニンは酸化されており、酸加水分解物から容易には検出されない。チロシン、セリンおよびスレオニンは部分的に加水分解されている。アミノ酸組成研究の結果を表６に示す。大部分のアミノ酸のモル比は予想値とよく一致している。本発明者らは、イソロイシン、チロシンおよびフェニルアラニンについて観察された結果はそれらの比較的低い存在量の影響を受けたと考えている。
【0104】
【表6】
ＢＤ：検出限界以下。最適濃度範囲は０．４から１０nmole／20μL。
【0105】
精製ｒｈＩＬ－１１の生物活性を７ＴＤ１細胞増殖アッセイを用いて決定した。典型的な結果を図１９に示す。観察されたＥＣ５０は、参照ｒｈＩＬ－１１および記載された方法によって生成されたｒｈＩＬ－１１についてそれぞれ１．１および２．２ｎｇ／ｍＬであり、同等の効力を示唆した。
【0106】
上記に示したように、本発明の概念は、酵母を用いた高純度ｒｈＩＬ－１１の製造および単離のための新規な方法を提供する。分泌型組換えヒトインターロイキン－１１は、ピキア・パストリスによって首尾よく発現されたが、その発現産物はｒｈＩＬ－１１の自己凝集のために生物学的に不活性であった。高密度流加培養でのＴｗｅｅｎ－８０のような非イオン性界面活性剤の添加は、総ｒｈＩＬ－１１の約１０％の生物活性生成物のみをもたらした。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ－８０を添加すると、発酵プロセス中の攪拌のために発泡が生じる可能性がある。
【0107】
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外のさらに多くの修正が可能であることが当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の趣旨を除いて制限されるべきではない。さらに、明細書と特許請求の範囲の両方を解釈する際に、すべての用語は文脈と矛盾しない最も広い方法で解釈されるべきである。特に、「含む」および「含んでいる」という用語は、非排他的に要素、構成要素、またはステップを指すものとして解釈されるべきであり、これは、参照されている要素、構成要素、またはステップは、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップが存在する、利用される、またはそれらと組み合わされ得ることを意味している。明細書の請求項がＡ、Ｂ、Ｃ・・・およびＮからなる群から選択される少なくとも一つを指す場合、そのテキストはＡ＋ＮまたはＢ＋Ｎではなく、その群からの一つの要素のみを必要とすると解釈されるべきである。
【0108】
参照文献
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【0109】
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】